curs stafilococ bacteriologie
DESCRIPTION
Curs staphylococcus stafilococTRANSCRIPT
Genul Staphylococcus
Caractere generale (minidefiniţie)
• coci sferici gram-pozitivi (0,5-1,5µm Ø), dispuşi
izolat, in diplo, ocazional in scurte lanţuri şi
caracteristic în grămezi neregulate;
• imobili, nepretenţioşi nutritiv, aerobi-facultativ
anaerobi, catalazo-pozitivi şi oxidazo-negativi;
• cultivă pe medii cu concentraţii crescute de NaCl (7,5-
10%);
• testul coagulazei îi clasifică în:
- coagulazo-pozitivi: S.aureus;
- coagulazo-negativi: mai multe specii izolate de la om,
dintre care S. epidermidis, S. saprophyticus, S.
haemolyticus, S. warneri, S. hominis, S. lugdunensis.
Staphylococcus aureus
Importanţa medicală
• determină infecţii comunitare sau nosocomiale care se
remarcă prin frecvenţă şi diversitate, unele cu evoluţie
deosebit de gravă (bacteriemii cu localizări secundare, şoc
septic, şoc toxic stafilococic);
• s-a dovedit capabil să dezvolte rezistenţă la toate
antibioticele folosite în terapie.
Habitat
• 20-70% purtători nazali (procente mai mari la personalul
din spitale);
• prezenţă tranzitorie la nivelul tegumentului;
• contaminează mediul extern prin mâini, scuame, secreţii,
excrete.
Caractere morfo-tinctoriale
• sunt cele caracteristice genului;
• în unele produse patologice poate predomina dispoziţia in
diplo, fiind dificilă diferenţierea de S. pyogenes;
• gram-variabili în frotiul din puroi provenit din colecţii
închise sau din culturi vechi.
Caractere de cultură
• colonii mari, S, de consistenţă untoasă, pigmentate în
galben-portocaliu sau nepigmentate ( alb-cenuşii) pe
geloză nutritivă;
• pe geloză-sânge coloniile pot fi hemolitice;
• dezvoltă colonii manito-pozitive pe mediul Chapman
(mediu hiperclorurat cu manită şi roşu fenol).
Frotiu din produs patologic
• In culturi vechi, unele
bacterii pierd
caracterul Gram (+),
devenind Gram (-)
• Bacterie nepretentioasa nutritiv (creste si pe medii simple)
• Colonii beta-hemolitice
• Colonii S, nehemolitice
(hemoliza este un
caracter inconstant ca si
pigmentogeneza)
• Colonii manito-pozitive pe
mediul Chapman
Rezistenţa la factori de mediu
• rezistent la condiţii de desicaţie;
• rezistent la acţiunea lizozimului şi a acizilor graşi
de la nivelul tegumentului;
• sensibil la acţiunea unor antiseptice şi
dezinfectante: alcool etilic 700 (dupa 60 min),
alcool iodat, hexaclorofen etc;
• distrus în 30 min la temperatura de 600C şi după
15 minute la 121C.
Factori de patogenitate
Virulenţa acestei specii este
rezultatul efectului combinat al mai
multor factori de patogenitate
• Factori asociaţi bacteriei
• Capsulă
• Proteina A
• Adezine
- Proteina de legare a fibronectinei
- Proteina de legare a colagenului
Produşi extracelulari
• Enterotoxine
• Toxina epidermolitică
• Toxina sindromului şocului toxic
(TSSS - 1)
• Hemolizine
• Leucocindine
• Stafilochinază
1. Structuri parietale
• peptidoglicanul manifestă proprietăţi endotoxină-like;
(asigură stabilitatea osmotică; stimulează producerea endogenului pirogen; este chemoatrac-tant pentru leucocite; inhibă fagocitoza şi chemota-xia).
• acidul ribitol teichoic, cu specificitate de specie, are proprietăţi adezive la receptorii celulari şi determină reacţii de sensibilizare după infecţii repetate;
• proteina A leagă IgG prin fragmentul Fc şi impiedică opsonizarea şi fagocitoza; anticorpii anti proteină A sunt prezenţi la persoanele cu infecţii severe.
• adezine la proteine ale gazde: fibrinogen/fibrină (coagulaza legată), fibronectină, colagen;
• microcapsula polizaharidică cu efect antifagocitar.
2. Exoenzime
• coagulaza liberă
- se leagă de protombină şi determină conversia fibrinogenului în
fibrină;
- înglobează cocii în trama de fibrină, protejându-i de fagocite;
- formează trombi, implicaţi în patogenia tromboflebitelor septice;
• stafilokinaza (fibrinolizina)
- activează plasminogenul, determinând disoluţia cheagurilor de
fibrină; prin liza trombilor septici intravenoşi ar putea realiza
diseminarea infecţiei cu apariţia septicopioemiei.
• hialuronidaza
- hidrolizează matricea intercelulară;
• lipaze
- active pe lipidele din plasmă şi sebum, explicând tropismul pentru
unitatea pilo-sebacee.
3. Exotoxine
• citotoxine
- hemolizine α, β, γ şi δ, active pe eritrocite provenite de
la diferite specii animale; cel mai bine caracterizată este
hemolizina α, incriminată în manifestări ale şocului
septic;
- leucocidina care are efect leucolitic, prezentă în special
la tulpini izolate din leziuni dermonecrotice;
• toxine exfoliative (A şi B)
- au activitate proteazică, determinănd ruperea
desmozomilor de la nivelul stratului granulos, cu
formare de bule epidermice;
- implicate în sindromul pielii opărite (boala Ritter la
copil sau Lyell la adolescent şi adult);
3. Exotoxine • toxina 1 a sindromului şocului toxic (TSST-1)
- funcţionează ca superantigen, stimulând nespecific limfocitele T cu eliberare de citokine în cantitate mare;
- determină febră, erupţie eritematoasă cu descuamare, hipotensiune şi insuficienţe funcţionale multiorgan;
- manifestările au fost asociate cu utilizarea tampoanelor hiperabsorbante intravaginale dar şi cu infecţii extragenitale;
• enterotoxine
- mai multe tipuri antigenice (A – G);
- funcţionează de asemena ca superantigene;
- termorezistente;
- determină toxiinfecţii alimentare; enterotoxinele B şi C pot determina şi manifestări sistemice (şoc toxic stafilococic).
lactamazele
• lactamazele, în număr de patru, explică rezistenţa stafilococilor la penicilină şi antibiotice penicilin-like.
• Producerea acestor enzime, de peste 90% dintre tulpinile de S. aureus, poate fi inductibilă (rezistenţa ce apare numai în prezenţa antibioti-celor lactam)
• Genele care codifică sinteza acestor enzime sunt de tip plasmidic (pentru A, C si D) sau cromozomal (pentru B), ele fiind şi carrier-ul rezistenţei pentru alte antibiotice, cum ar fi eritromicina sau tetraciclinele.
Superantigens and the non-specific stimulation of T cells.
Superantigens bind directly to MHC calss II of antigen-presenting cells
outside the normal antigen-binding groove. Up to one in five T cells
may be activated. Cytokines are released in large amounts, causing
the symptoms of TS
Manifestări clinice ale infecţiilor stafilococice
supurative
• infecţii cutanate şi ale glandelor anexe: foliculite,
impetigo, furuncul, carbuncul, hidrosadenite, panariţii etc;
• infecţii ale mucoaselor: otite, sinusite;
• infecţii ale părţilor moi: abcese, flegmoane;
• infecţii profunde: osteomielite, osteoartrite, pneumonii,
abcese hepatice, cerebrale, meningite, endocardite;
• bacteriemii cu sepsis sever sau şoc septic.
Imunitatea antistafilococică
• fagocitoza este mecanismul major de apărare;
• cu excepţia Ac antileucocidină, nu există o corelaţie între
receptivitatea la infecţie şi titrul Ac.
Diagnosticul de laborator al infecţiilor supurative
• se bazează pe examen bacteriologic;
• produsul patologic variază în raport cu localizarea infecţiei;
• examenul microscopic are în special valoare în cazul
produselor provenite din zone normal sterile;
• izolarea S. aureus o realizăm prin însămânţare pe geloză-
sânge iar în cazul produselor contaminate pe mediul
selectiv Chapman;
• identificarea se bazează pe caracterele de cultivare,
microscopice, testul catalazei şi coagulazei;
• în investigaţii epidemiologice (izbucniri epidemice) se
poate recurge la lizotipare sau tipare moleculară.
Principii de terapie a infecţiilor
stafilococice
• în infecţii cutanate ca şi în colecţii purulente profunde, drenajul chirurgical este esenţial;
• antibioterapia infecţiilor sistemice este ghidată de rezultatele antibiogramei.
• Tulpini neproducătoare de penicilnază: penicilina
• Tulpini producătoare de penicilinază (90%): meticilina sau izoxazolilpeniciline: oxacilina, cloxacilina;
• Alte antibiotice utile: eritromicina, lincomicina (infecţii osoase), pristinamicina, fucidina, vancomicina;
• De păstrat antibiotice “de rezervă”: vancomicina, lincomicina.
Fenotipuri de rezistenţă
• antibiotice beta-lactamice
- rezistenţă la peniciline prin producere de
penicilinază;
- rezistenţă omogenă sau heterogenă la oxacilină
prin prezenţa unei PLP 2a suplimentară, care se
extinde la toate antibioticele beta-lactamice (tulpini
meticilino-rezistente - SARM);
• macrolide şi lincosamide
- rezistenţa inductibilă la eritomicină antrenează
rezistenţă la macrolide cu 14 şi 15 atomi de C;
- pot fi înregistrate eşecuri terapeutice şi la
clindamicină;
Fenotipuri de rezistenţă (continuare)
• aminoglicozide
- testare curentă la kanamicină, tobramicină şi gentamicină;
- rezistenţa enzimatică la kanamicină se extinde la amikacină;
- rezistenţa la kanamicină, tobramicină şi gentamicină este predictivă pentru rezistenţa la amikacină şi netilmicină;
• fluorochinolone
- rezistenţa frecvent prezentă la tulpinile meticilino-rezistente;
- utilizarea în monoterapie favorizează emergenţa rezistenţei;
• noi fenotipuri de rezisenţă
- recent raportate tulpini cu rezistenţă intermediară sau înaltă la glicopeptide (ex. vancomicina);
- necesită confirmarea prin teste cantitative şi trimiterea tulpinii la un centru de referinţă.
S. aureus
Penicillin
[1950s]
Penicillin-resistant
S. aureus
Evolution of Drug ResistanS. aureus
Methicillin
[1970s]
Methicillin-resistant
S. aureus (MRSA)
Vancomycin-resistant
enterococci (VRE)
Vancomycin
[1990s]
[1997]
Vancomycin
intermediate- resistant S. aureus
(VISA)
Vancomycin-
resistant S. aureus
• Pana in prezent CDC a raportat 8 tulpini de VRSA documentate bacteriologic si genetic:
• 1. tulpina Michigan 1 izolata de la un pacient cu diabet zaharat, boala vasculara periferica si insuficienta renala cronica, care din aprilie 2001 a primit numeroase scheme de antibiotice pentru o infectie cutanata cronica (picior diabetic), inclusiv vancomicina.
• In aprilie 2002 s-a semnalat bacteriemie cu MRSA dupa amputatia halucelui, pacientul primind vancomicina si rifampicina.
• In iunie 2002 se diagnosticheaza infectie de cateter cu o tulpina de stafilococ rezistenta atat la oxacilina, cat si la vancomicina (CMI oxacilina peste 16 mg/l, CMI vancomicina peste 128 mg/l).
• Concomitent, s-au izolat VRSA si VRE de la nivelul piciorului
Sievert DM, Boulton ML, Stoltman G et al - Staphylococcus aureus Resistant to Vancomycin - United States, 2002. MMWR, 2002; 51: 565-567
• “tulpina 2”: Pensylvania a fost izolata in octombrie 2002 de la un pacient cu ulcer cronic al piciorului si posibila osteomielita.
• Metoda difuzimetrica utilizata a aratat o zona de inhibitie de 12 mm, iar pe mediu BHI agar cu adaos de vancomicina s-a semnalat cresterea stafilococului.
• Determinarea sensibilitatii la vancomicina a continuat prin efectuare de E-test (CMI, 64 mg/l), precum si prin metoda microdilutiilor in bulion (CMI, 32 mg/l).
Miller D et al- Public Health Dispatch: Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus - Pennsylvania, 2002. MMWR, 2002; 51: 902
• 3 tulpina New York a fost raportata in aprilie 2004, fiind izolata din urocultura la un pacient asistat intrun azil.
• Desi la testarea prin MicroScan, CMI la vancomicina fusese de 4 mg/l, efectuarea unui E-test a indicat CMI/ peste 256 mg/l.
• Metoda microdilutiilor in bulion a confirmat tulpina drept VRSA (CMI, 64 mg/l).
Kacica M, McDonald LM - Brief Report: Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus - New York, 2004 MMWR, 2004; 53: 322-3
• 4. tulpina Michigan 2 a fost raportata in februarie 2005 la un barbat diabetic, 78 ani, care primise timp de 9 saptamani tratament cu vancomicina dupa protezare de valva aortica.
• Ulterior a avut o infectie de parti moi de unde s-a izolat VRSA cu CMI-256 mg/l (microdilutii si E-test); concomitent, s-a descoperit VRE din coprocultura.
• De mentionat ca Vitek2 a incadrat tulpina de stafilococ in mod eronat ca VSSA (CMI sub 1 mg/l).
CDC Atlanta/ www.cdc.gov/ncidod/hip/vanco.htm
• 5. tulpina Michigan 3 a fost raportata in
noiembrie 2005 la o pacienta care prezenta
infectie de parti moi dupa o paniculectomie
pentru obezitate.
• Pacienta avusese initial infectie cu MRSA
pentru care a primit cel putin 2 luni de
vancomicina. Ulterior, s-a izolat VRE si apoi
VRSA (CMI, 512 mg/l) de la nivelul zonei
infectate.
J. Rudrick – www.michigan.gov/mdchlab
• 3 tulpina New York a fost raportata in aprilie 2004, fiind izolata din urocultura la un pacient asistat intrun azil.
• Desi la testarea prin MicroScan, CMI la vancomicina fusese de 4 mg/l, efectuarea unui E-test a indicat CMI/ peste 256 mg/l.
• Metoda microdilutiilor in bulion a confirmat tulpina drept VRSA (CMI, 64 mg/l).
Kacica M, McDonald LM - Brief Report: Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus - New York, 2004 MMWR, 2004; 53: 322-3
• 4. tulpina Michigan 2 a fost raportata in februarie 2005 la un barbat diabetic, 78 ani, care primise timp de 9 saptamani tratament cu vancomicina dupa protezare de valva aortica.
• Ulterior a avut o infectie de parti moi de unde s-a izolat VRSA cu CMI-256 mg/l (microdilutii si E-test); concomitent, s-a descoperit VRE din coprocultura.
• De mentionat ca Vitek2 a incadrat tulpina de stafilococ in mod eronat ca VSSA (CMI sub 1 mg/l).
CDC Atlanta/ www.cdc.gov/ncidod/hip/vanco.htm
• 5. tulpina Michigan 3 a fost raportata in
noiembrie 2005 la o pacienta care prezenta
infectie de parti moi dupa o paniculectomie
pentru obezitate.
• Pacienta avusese initial infectie cu MRSA
pentru care a primit cel putin 2 luni de
vancomicina. Ulterior, s-a izolat VRE si apoi
VRSA (CMI, 512 mg/l) de la nivelul zonei
infectate.
J. Rudrick – www.michigan.gov/mdchlab
• Aparent, VRSA nu se coreleaza cu
administrarea de vancomicina pentru al
doilea si al treilea caz (Tenover)
Testarea sensibilitatii – criterii
CLSI • Conditii de testare
• Agar Mueller-Hinton
• Inoculum – suspensie de colonii, echivalent al standardului 0.5 McFarland
• Incubare: 35ºC - 16-18 ore (24 ore pentru: oxa, meticilina, nafcilin, vancomicina)
• Testarea la peste 35ºC – poate sa nu deceleze tulpinile de stafilococi rezistenti la oxacilina (atat S aureus cat si SCN)
Consideratii generale
• SARM, sau SRM , raman denumirile cele mai
frecevente pentru S aureus rezistent la
meticilina sau stafilococi rezistenti la meticilina,
desi meticilina nu este antibioticul utilizat in
terapiei sau/si testare
• In multe articole se utilizează denumirile din
engleza (MRSA, MRS), toate cu aceeasi
semnificatie a rezistentei la oxacilina/meticilina
Consideratii generale
• Pentru tulpinilie de S aureus si de
stafilococi coagulaza negativi (SCN)
sensibile la oxacilina, rezultatele pentru
cefeme orale sau parenterale, β-
lactamice – inhibitori de β-lactamaze,
carbapeneme trebuie raportate conform
criteriilor interpretative.
• Pentru SARM si SRM ca si pentru
stafilococi rezistenti si la alti agenti
antimicrobieni (e.g. peniciline, β-
lactamice – inhibitori de β-lactamaze,
cefeme, carbapeneme), rezultatele in
vitro pot indica “sensibilitate”, iar
antibioticele sa nu fie actiev in vivo.
Detectarea rezistentei la
oxacilina • Testarea rezistentei la oxa prin:
- Gena mecA
- Evidentierea produsului genei mecA (PLP2a)
* Sunt testele cele mai utile pentru confirmarea
rezultatelor obtinute prin metoda difuzimetrica
in cazul infectiilor severe stafilococice
• Nu se testeaza de rutina tulpinile de S
saprophyticus izolate din infectii urinare
deoarece infectiile de acest tip raspund
bine la concentratiile urinare atinse de
antibiotice (in cazul infectiilor fara
complicatii).
• E.g: nitrofurantoin, cotrimoxazol,
fluorochinolone
• Stafilococii sensibili la penicilina sunt S si la
alte peniciline, asocierea β-lactamice –
inhibitori de β-lactamaze, carbapeneme
(aprobate de catre FDA pentru tratamentul
infectiilor severe).
• Tulpinile R la P si S la oxa, sunt R la
penicilinele inactivate de catre penicilinze si S
la alte peniciline stabile la penicilinaze,
asocierea β-lactamice – inhibitori de β-
lactamaze, si carbapeneme.
Comentarii*
• Daca pentru S aureus obtinem pentru oxacilina, un rezultat intermediar, recurgem la:
- evidientierea genei mecA sau PLP2a
- testul cu discul de cefoxitin
- determinarea CMI a oxacilinei
- testarea pe mediu cu oxa/sare
• Se raporteaza rezultatele la testele alternative si nu rezultatul “IR”!
• Sensititre® Automated System Accurately Detects VRSA
•
• TREK Diagnostic Systems supplies Sensititre automated AST/ID instrumentation to clinical diagnostic laboratories throughout the world.
• Sensititre susceptibility plates can be read automatically using the ARIS® 2X or AutoReader instruments.
• Recently, the Sensititre automated system accurately detected four Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus (VRSA) strains at the Centers for Disease Control (CDC).* A brief summary is presented here, full details can be obtained from Trek Diagnostics.
Epidemiologie
În infecţii nosocomiale se urmăresc
• rezervorul
- bolnavi,
- pacienţi sau personal de spital colonizaţi;
• transmiterea
- direct, prin picături Flugge ;
- indirect, vehiculare prin obiecte, alimente sau mâini
contaminate.
Profilaxie
- măsuri riguroase de asepsie şi antisepsie;
- sterilizarea purtătorilor nazali prin aplicaţii topice de
unguente cu antibiotice antistafilococice (mupirocin);
- în experiment un vaccin antistafilococic (StaphVAX).
Stafilococii coagulazo-negativi
• constituienţi ai florei bacteriene rezidente de la nivelul
tegumentului şi mucoaselor colonizate;
• pot determina infecţii legate de prezenţa unor implante protetice şi catetere, grave în special la imunodepresaţi;
• sinteza unor exopolizaharide favorizează ataşarea la suprafaţa acestor dispozitive;
• cea mi frecventă specie implicată este S.epidermidis:
- infecţii de cateter, infecţii de pace-maker, infecţii ale grefei vasculare, endocardită subacută a valvelor protezate;
- patogen primar în infecţii asociate cu şunturile LCR, protezele articulare, dispozitivele ortopedice sau la cei cu dializă peritoneală cronică ambulatorie (infecţii ale tractusului urinar – cistită, uretrită, pielonefrită).
Stafilococii coagulazo-negativi
• S. saprophyticus ocupă o nişă specială, fiind cauza unor infecţii ale tractusului urinar in special la femeia tânără; sensibil la majoritatea antibioticelor, inclusiv benzil-penicilină (rezistenţă naturală la novobiocină);
• S. haemolyticus: endocardite subacute (chiar în absenţa protezelor valvulare), septicemii, peritonite, infecţii ale tractusului urinar, ale plăgilor chirurgicale, ale oaselor sau articulare;
• S. lugdunensis: endocardite subacute pe valve protetice sau native, infecţii de cateter, septicemii, abcese cerebrale, infecţii profunde, osteite, etc.
• S. shleiferi: empiem cerebral, infecţii ale plăgilor, bacteriemii, osteite ale rahisului şi infecţii de cateter;
Stafilococii coagulazo-negativi
• diagnosticul bacteriologic impune criterii care să
stabilească semnificaţia clinică a izolatului, eliminând o
posibilă contaminare;
• se impune izolarea repetată, existenţa unui “teren”
deficitar (ex. diabet, imunosupresaţi, vârste extreme);
• stafilococii coagulazo-negativi sunt frecvent meticilino-
rezistenţi;
Coci gram-pozitivi
facultativ anaerobi
+
catalaza
Staphylococcus
− Streptococcus
coagulaza
+ − S.aureus Stafilococi coagulazo-negativi
sensibilitate la novobiocină
R S
S. saprophyticus alţi stafilococi coagulazo-negativi