cultura tec bas3

RODRIGO ROCHA LATADO

*PRINCIPAIS TCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS

*MICROPROPAGAO DE PLANTAS

* PROPAGAO DE PLANTAS

Semente (via sexuada): espcies com poucas sementesespcies sem sementesperda da germinaoprognie heterognea

Vegetativa (via assexual)in vivo: estaca, enxertia, borbulhaprocesso lentopropagao de doenassazonalidadeespao fsico

in vitro: meristema apicalsegmento nodal estmulo a gemas axilares

*MICROPROPAGAO: propagao clonal de gentipos selecionados, utilizando tcnicas de cultura de tecidos, visando a produo de plantas em massa, a um preo competitivo uso de explantes com meristemas pr-existentes

meristema apical: dome com clulas totipotentes diviso constante no tem conexo com xilema e floema

pice meristemtico: dome meristemtico + primrdios foliares

Vantagens: > nmero de mudasrapidezrejuvenescimentolivre de doenasespao fsico reduzidosazonalidadeDesvantagens: variao somaclonalcontaminaoaclimatizaocustoprotocolo

*

meristema x pice meristemtico

*MICROPROPAGAO: descoberta das citocininas descrio do meio MS

EXPLANTES

pice meristemtico

segmento nodal: alongamento de ramo com vrios ns

proliferao de gemas axilares: quebra de dominncia apical brotos axilares so explantes secundrios para prximos ciclos

Principais culturas: Banana, Cana-de-acar, Eucalipto, Pinus, Mandioca, Morango, Batata, Plantas ornamentais

*ETAPAS DA MICROPROPAGAO Introduo do explanteInduo de brotaesAclimatizaodas plantasAlongamento, desenvolvimento e enraizamento das plantas in vitro

*Micropropagao de baunilhaMicropropagao de mandioca

* MICROPROPAGAO

Estdio 0: seleo da planta matrizsanidadeestdio fisiolgicoestado nutricional

Estdio 1: estabelecimento da cultura assptica e vivelpoca de retirada do explanteposio do explante na planta matrizbaixa [ ] de citocinina; baixa [ ] de auxina

Estdio 2: multiplicaoalta [ ] de citocininanmeros de subcultivosEstdio 3: alongamento e enraizamentocido giberlico, auxinas (IBA, NAA)

Estdio 4: aclimatizaocontrole de umidade e luz

*MICROPROPAGAO

Meio de Cultura Slido: gar, gelmelhor aeraoabsoro de nutrientes deficiente

Meio de Cultura Lquido: estacionrio, agitaomaior disponibilidade de nutrientesmaior disponibilidade de guaoxigenaosuporte: papel de filtro, espuma

Imerso Temporria: alternncia de meio de cultura lquido com ausncia de meio de cultura melhor aerao maior contato com meio de cultura ex. banana (20min. / 2h)

*CULTIVO DE MERISTEMAS PARA LIMPEZA DE VRUS

* LIMPEZA DE VRUS

Doenas de Plantas: fungos, bactrias, vrustransmitidas na propagao vegetativa

White (1934): vrus esto distribudos de maneira desuniforme em raiz de fumoreduo da concentrao em direo extremidadepice radicular livre de vrus

Limasset & Cormet (1949): gradiente de concentrao de vrus na parte area

Morel & Martin (1952): plantas de dlia livres de vrus

*LIMPEZA DE VRUS - SequnciaPrincipais culturas: Cana-de-acar, Mandioca, Morango, Batata, Plantas ornamentais

*LIMPEZA DE VRUS - Sequncia

* LIMPEZA DE VRUS

termoterapia + cultura do pice meristemtico

ex: vrus do mosaico da cana-de acarcultura de meristema: explante 0,3 mmcultura pice meristemtico (1 2,5 cm) + termoterapia (45oC / 8 horas)

quimioterapia + cultura do pice meristemticoincorporao de antivirais no meio de cultura

Indexao: avaliao da presena do vrusensaios biolgicosmicroscopia eletrnicaserologia (ELISA)hibridao com cido nucleico

*CULTURA DE CALOS

*CULTURA DE CALOS

FASES 1. ASSEPSIA

2. EXPLANTES (discos de folhas, raiz, caule, sementes, etc...)

3. INTRODUO AO MEIO DE CULTIVO - INDUO DE CALOS (geralmente meio contendo auxinas)Calos em citros (meio contendo BAP)

4. DESDIFERENCIAO CELULAR - retorno das clulas ao estado meristemtico

Depende de: competncia e habilidade para responder ao estmulo

*CULTURA DE CALOS5. SUBCULTIVOS MENSAIS

- mesmo meio de induo

- outros meios

6. DIFERENCIAO CELULAR- utilizando uma das duas vias,

- Organognese somtica

- Embriognese somtica

7. REGENERAO DE PLANTAS

8. ACLIMATIZAO AO MEIO AMBIENTE

*CULTURA DE CLULAS EM SUSPENSO


FASES

1. EXPLANTES (calos - clulas meristemticas, alta taxa de diviso celular)

2. INTRODUO AO MEIO DE CULTIVO LQUIDO - geralmente no mesmo meio de cultivo de calos

3. AGITAO CONSTANTE (100 rpm) E ESCURO - oxigenao do meio

4. SUBCULTIVOS SEMANAIS OU QUINZENAIS - duplica ou triplica o volume celular em 7 dias


SELEO in vitro - adio de agentes seletivos: herbicidas, toxinas purificadas, NaCl (sal), alumnio, PEG (seca) e outros

5. ALTA TAXA DE CONTAMINAO - motivo: meio lquido

6. TRANSFERNCIA PARA MEIO SLIDO - obteno de calos

7. REGENERAO DE PLANTAS

8. ACLIMATIZAO AO MEIO AMBIENTE

*CULTURA DE CLULAS EM SUSPENSOClulasClulas em meio contendoalta osmolaridadeClulas em suspensoAgitador orbital

*CULTURA DE CLULAS HAPLIDES

*CULTURA DE CLULAS HAPLIDES

FASES 1. ASSEPSIA

2. EXPLANTES (anteras (micrsporo), plen, vulos, ovrios vegetais)

3. INTRODUO AO MEIO DE CULTIVO (pr-tratamento)

4. INDUO DE ORGANOGNESE OU MBRIOGNESE - direta (sem passar pela fase de calos)

- indireta (com passagem pela fase de calos)

Depende de: competncia e habilidade para responder ao estmulo

*CULTURA DE PLANTAS HAPLIDES

FASES

5. DESENVOLVIMENTO DAS PLANTAS in vitro

- alongamento das plantas - enraizamento - aclimatizao

6. OBTENO DE PLANTAS HAPLIDES OU DUPLO-HAPLIDES

- duplicao cromossmica natural ou com utilizao de drogas antimitticas

- drogas (colchicina, oryzalina, hidroxiquinolina, etc... )

*CULTURA DE PLANTAS HAPLIDESFlorAnterasMicrsporogerminandoEmbriognesesomticaMultiplicaoAclimatizao

*CULTURA DE PLANTAS HAPLIDESFlor - OvriovulosCalosOrganognesesomticaObteno de plantasMultiplicao

*CULTURA DE PROTOPLASTOSVEGETAIS

*CULTURA DE PROTOPLASTOS

- Clulas vegetais isoladas e sem parede celular (removidas por enzimas)

Enzimas Hemicelulases - digerem hemicelulose Celulases - digerem celulose Pectinases - digerem pectinas

- sensveis a modificao na osmolaridade do meio e a luz

- meio mais concentrado protoplastos perdem gua para o meio

- meio mais diludo protoplastos absorvem gua do meio

meios geralmente entre 0,4 e 0,8M


- usam manitol ou sacarose para ajustar a osmolaridade do meio

- A ausncia de parede celular possibilita a fuso de protoplastos

- Isolamento, purificao e cultivo de protoplastos utilizando meios contendo a mesma osmolaridade

MEIOSMeios CPW - Cell Protoplast Wash, MS 0,4M e MS 0,4M (2X)

Soluo de enzimas 0,4M

Soluo de Polietileno glicol a 50%

Agarose tipoVII (baixo ponto de fuso) - 1,2%

* MEIO CPW (para protoplastos vegetais ( Gilmour et al., 1989)Composio mg/L

1. CaCl2*2H2O 1.4802. MgSO4*7H2O 2463. KNO3 1014. KH2PO4 27,25. KI 0,16

- acrescentar Manitol para o controle da osmolaridade (0,4 M)- ajustar o pH 6,0- esterilizar

SOLUES ESTOQUE CONC. VOLUME USADO / L

A. CaCl2*2H2O 50x 20 mL/L

B. OUTROS SAIS 100x 10 mL/L


Material esterilizado

- placas de Petri

- peneiras com poros de 50 m

- tubos 8 ml com tampa

- pipetas Pasteur


FASES1. EXPLANTES - (folhas, calos, suspenso celular, ptalas, anteras)

2. ISOLAMENTO DOS PROTOPLASTOS - Agitao 50 rpm, escuro, 27o C, durante 8 a 16 h.

3. PURIFICAO - peneiramento, centrifugao, retirada da soluo, lavagem com CPW

4. FUSO - adio de PEG ou eletrofuso

5. RETIRADA DO PEG

6. CULTIVO DOS PRODUTOS DA FUSO - meio MS 0,4M(2X) e agarose

*CULTURA DE PROTOPLASTOSExplanteProtoplastosViabilidade deprotoplastosFusoFusoFuso mltipla

*CULTURA DE PROTOPLASTOSPrimeira divisoMicrocaloMicrocolniaCalos e embries somticosEmbrio somticoEmbriogerminando

*CULTURA DE PROTOPLASTOSPlantasin vitroPlaca com embries germinandoDesenvolvimento das plantase enraizamentoAclimatizao ao meio ambiente

cultura tec bas3

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