cultivos primarios de células endoteliales aisladas de ... · aunque las especies de enterococos...

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Biomédica 2004;24:456-63CHIRIBOGA C.A., FONTANILLA M.R.

NOTA TÉCNICA

Cultivos primarios de células endotelialesaisladas de cordón umbilical humano:un modelo biológico para el estudio de

los mecanismos de infección por enterococosCarlos Andrés Chiriboga 1, Marta Raquel Fontanilla 2

1 Laboratorio de Biología Molecular, Universidad El Bosque; programa de posgrado interfacultades deMicrobiología, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C., Colombia.

2 Instituto de Biología Molecular, Universidad El Bosque; Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias,Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C., Colombia.

Aunque las especies de enterococos son flora normal del tracto gastrointestinal humano, seencuentran entre los tres agentes patógenos microbianos que más se asocian con infeccionesintrahospitalarias. Tradicionalmente, los enterococos se han considerado bacteriasextracelulares. Sin embargo, es creciente la información que reporta su ingreso a través delíneas celulares epiteliales o macrófagos. A pesar de que estos microorganismos constituyenel tercer grupo de aislamientos obtenido de pacientes con bacteriemia o endocarditis, suinteracción con la célula endotelial no se ha descrito completamente. En el presente trabajoevaluamos si el aislamiento intrahospitalario de Enterococcus faecalis (Ef2880) podía penetraren células endoteliales de la vena de cordón umbilical humano (HUVEC) cultivadas in vitro.Nuestros resultados indican que los cultivos primarios HUVEC después de ser inoculados conEf2890, incubados y tratados con antibióticos bactericidas para las bacterias extracelulares yadheridas a la cara externa de la membrana celular, exhiben bacterias intracelulares quepueden ser recuperadas vivas cuatro horas después de la inoculación. El modelo biológicodesarrollado se puede constituir en una herramienta útil para el estudio de las interaccionesque establecen los enterococos con el endotelio.

Palabras clave: endotelio, cultivo celular, Enterococcus sp., infección enterocócica de cultivosde HUVEC

Primary cultures of human umbilical chord vein endothelial cells: a biological model forstudying enterococcal infection mechanisms

Although enterococcus bacteria are normal human intestinal flora, they rank as the third mostcommon pathogen involved in hospital acquired infections. Generally, these bacteria areconsidered extracellular pathogens; however, an increasing number of reports indicateinvasiveness to epithelial cell lines and macrophages. Despite their importance as nosocomialinfection agents in patients suffering bacteremias and endocarditis, their interaction withendothelial cells has not been fully described. Herein, the nosocomial Enterococcus faecalisisolate Ef2890 from a hospitalized patient was exposed to cultured human venous endothelialcells from the umbilical chord. When the primary cell cultures were inoculated with Ef2890 andtreated with bactericidal antibiotics to kill extracellular and adhered bacteria, intracellular bacteriawere recovered and plated 4 h post-infection. These observations indicate that cell culturesprovide a valuable biological model to study interactions between endothelium and enterococci.

Key words: Enterococcus sp., endothelium, cell culture, enterococcal infection, nosocomialinfections.

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Biomédica 2004;24:456-63 INFECCIÓN DE CULTIVOS HUVEC POR ENTEROCOCCUS SP

Los enterococos son parte de la flora normal deltracto gastrointestinal humano. Sin embargo, lasbacterias de este género son aislamientos denosocomios, principalmente de pacientes conendocarditis, bacteriemias e infecciones urinarias(1-3). Lo anterior se ve agravado por el incremento,incluso en Colombia, del número de aislamientosresistentes a los antibióticos comúnmenteempleados en el tratamiento de estas infecciones(4,5).

La endocarditis infecciosa es una patología delendotelio que afecta generalmente las válvulasnormales, protésicas o patológicas del corazón(6). La lesión característica, denominada"vegetación", es una biopelícula que se formacuando las bacterias circulantes se adhieren alendotelio lesionado y son cubiertas por una capade plaquetas y fibrina. El microambienteproporcionado por la biopelícula esconde elmicroorganismo, y le permite evitar la accióndefensiva del sistema inmune y sobrevivir (6).

Los estudios con bacterias Gram negativas yGram positivas han mostrado su efecto reguladoro de sus productos sobre la expresión por partede las células endoteliales de moléculas deadhesión, factores de crecimiento y citocinasendoteliales en las infecciones sistémicas (7-11).Sin embargo, la investigación sobre los procesosde penetración de cepas de enterococos encélulas endoteliales no está muy desarrollada, enparte, porque estos organismos se consideran floranormal (3).

La emergencia de enterococos con nivelesimportantes de resistencia a los antibióticos hahecho que aumente el interés por entender losmecanismos que estas bacterias usan paralesionar los tejidos de los sitios que colonizan.Ya se ha demostrado que las cepas deEnterococcus faecalis resistentes a losantibióticos son capaces de trasladarse a travésdel epitelio intestinal de ratones (12,13) y losestudios sobre los factores bacterianos

involucrados en las interacciones célula-patógenohan identificado sustancias que desempeñan unpapel importante en el ingreso de la bacteria enenterocitos y macrófagos cultivados (14-16).Como se cree que muchas infeccionesenterocócicas del torrente sanguíneo tienen origenentérico (17), los estudios in vitro se han enfocadoa entender los mecanismos empleados por losenterococos para superar la barrera epitelial ysobrevivir en los macrófagos. Recientemente, sereportó que los aislamientos nosocomiales de E.faecalis se adhieren e invaden células HeLa yque la endocitosis mediada por receptores puedeser uno de los mecanismos utilizados por labacteria para invadir este tipo de célula epitelial(17).

A pesar de que en las vegetaciones caracterís-ticas de la endocarditis los enterococos interactúanestrechamente con las células endoteliales, in vitrono se ha estudiado la relación que establecen lasdiferentes especies enterocócicas con las célulasendoteliales. Tampoco, si estas células en cultivointroducen enterococos ni el papel que esteproceso puede jugar en la recurrencia de lainfección.

El propósito de este trabajo fue establecer si unaislamiento intrahospitalario de enterococo,inoculado en cultivos primarios de célulasendoteliales aisladas de la vena del cordónumbilical humano (HUVEC) es capaz de invadirlas células endoteliales. Con este fin,estandarizamos los procedimientos que se debenseguir para infectar cultivos HUVEC conaislamientos nosocomiales de E. faecalis.Encontramos que al exponer las células a lasbacterias por dos horas y luego tratarlas conantibióticos para eliminar E. faecalisextracelulares o adheridos a la membrana, esposible encontrar bacterias en el interior de lasHUVEC cultivadas.

Materiales y métodos

Aislamientos bacterianos ysus condiciones de cultivo

Para este trabajo se utilizó el aislamiento clínicoE. faecalis Ef 2890. La caracterización y lospatrones de susceptibilidad antimicrobiana de este

Correspondencia:Marta Raquel Fontanilla, Calle 52 B No 4-34, email:[email protected]

Recibido: 01/06/04; aceptado: 13/09/04

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aislamiento se describieron previamente por elInstituto de Genética Molecular Bacteriana de laUniversidad El Bosque (4). La cepa no invasivaEscherichia coli DH5a sirvió como controlnegativo en los experimentos de infección. Lasbacterias se mantuvieron y crecieron en caldo oagar infusión cerebro-corazón (BHI) (Biomedics,Madrid, España). Para preparar los inóculosutilizados en la infección, se inocularonsuspensiones de los aislamientos en agar BHI yse incubaron a 35°C por 24 horas. Luego de laincubación, se resuspendieron 4 o 5 colonias en20 ml de caldo BHI y se incubaron a 35°C por 18horas con agitación constante a 150 rpm en unbaño de María (Shaker Bath, Lab-line, USA).Posteriormente, se tomó 1 ml de este cultivo, seresuspendió en 9 ml de medio RPMI (Gibco,Invitrogen Corporation, Grand Island, NY) y seincubó hasta alcanzar una OD625 de 0,08 a 0,1,equivalente a 1x108 UFC/ml, aproximadamente.Los cultivos así obtenidos se utilizaron comoinóculos en los ensayos de invasión.

Aislamiento y cultivo de células endotelialesde vena umbilical humana

Las células endoteliales de vena umbilical humanase obtuvieron siguiendo el protocolo establecidopor Beekhuizen et al. (7) con algunasmodificaciones introducidas por nosotros.Después de obtener el consentimiento informadofirmado por las pacientes, se tomaron segmentosde cordón umbilical de 15 cm, aproximadamente,obtenidos de partos normales en el Servicio deObstetricia de la Clínica El Bosque. Lossegmentos de cordón se transportaron en solucióntampón salina de fosfatos (PBS, pH 7,4) consuplemento de penicilina/estreptomicina (100 UI-100mg) (GIBCO), se lavaron y se desinfectaronexternamente con etanol al 70%.

En los cordones limpios y desinfectados, selocalizaron y canularon ambos extremos de la venaumbilical con aguja roma 21 fr y se fijaron lasagujas con pinzas de Kelly. La vena umbilical selavó con PBS para eliminar rastros de sangre, sellenó con una solución de tripsina-EDTA (0,25%/0,02% p/v) (GIBCO) y se incubó por 15 minutos a37°C. Pasado este tiempo, las células endotelialesfueron desprendidas lavando la vena con 10 ml,aproximadamente, de medio DMEM (GIBCO) con

suplemento de 10% de suero fetal bovino (SFB)(GIBCO). La suspensión celular obtenida secentrifugó a 1.800g por 10 minutos; el sedimentose resuspendió en medio DMEM co suplementoal 20% de SFB, penicilina-estreptomicina (100 UI-100mg), vitaminas (ICN, Biomedicals Inc.),aminoácidos no esenciales (GIBCO, LifeTechnologies) y piruvato de sodio al 1% (GIBCO,Life Technologies).

La cantidad de células viables presentes en lasuspensión celular obtenida se determinó con unatinción vital (azul de tripano) y se escogieronsuspensiones con viabilidades superiores al 80%para realizar las siembras. El inóculo empleadopor frasco T de 12,5 cm2 (Falcon) fueron lascélulas endoteliales aisladas de venas umbilicalesde tres segmentos de 10 cm. Los cultivos seincubaron en atmósfera controlada con 5% de CO

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y temperatura de 37°C hasta observar confluencia.Para los ensayos de invasión, se utilizaron cultivosde segundo pasaje.

Caracterización de los cultivos HUVECprimarios mediante deteccióninmunohistoquímica de la expresión delfactor von Willebrand

La expresión del factor VIII de la coagulación,factor von Willebrand (vW), en los cultivos HUVECse detectó utilizando como anticuerpo primario unanticuerpo monoclonal de ratón anti-vW humanoen dilución 1:25 (Dako, Dinamarca) y comoanticuerpo secundario, un anticuerpo policlonal decabra anti-ratón, conjugado con peroxidasa (Dako,Dinamarca) en dilución 1:100. Para la inmuno-tinción, se fijó el cultivo con metanol por 5 minutosy la placa sembrada se sometió a la siguienteserie descendente de baños con etanol paradeshidratarla: 100% por 15 minutos, 95% por 10minutos y 70% por 5 minutos. Después de lavarcon PBS por 10 minutos, se bloqueó con gelatinaal 1% por 1 hora, se volvió a lavar con PBS, seincubó con H

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2 por 5 minutos y se lavó con

PBS. Se agregó el anticuerpo mouse anti-humanvon Willebrand factor, se incubó por una hora y selavó varias veces con PBS. Luego, se incubó conel anticuerpo secundario peroxidase conjugatedgoat anti-mouse immunoglobulin por 30 minutos,se lavó con PBS y se incubó con el sustrato de laenzima por 5 minutos. Como tinción de contraste

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se empleó hematoxilina. Para controlar laespecificidad de la tinción se incluyeron doscontroles: un cultivo de células HUVEC al que nose le adicionó anticuerpo primario y un cultivo defibroblastos, que no expresan el factor, conanticuerpos primario y secundario.

Ensayos de detección de E. faecalisintracelular en células HUVEC

El ensayo utilizado para la detección intracelularde E. faecalis se adaptó del procedimiento seguidoen los experimentos de protección a antibióticos(10,11). Se incubaron frascos T de 12,5 cm2 concultivos HUVEC confluentes con tripsina 0,25%por 20 minutos a 37°C en atmósfera húmeda con5% de CO

2. Se adicionó DMEM con suplemento

de SFB al 10% para neutralizar la enzima; secentrifugó y el sedimento obtenido se resuspendióen 1 ml de medio DMEM con suplemento de SFBal 20% y se sembró en platos de cultivo de 24pozos (Falcon), utilizando una densidad desiembra de 5 x 104 células por pozo. Los cultivosse incubaron por 24 horas o hasta alcanzarconfluencia; luego, se lavaron tres veces con PBS;se adicionó medio RPMI sin suplemento y seincubaron por 3 horas en atmósfera húmeda con5% de CO2.

Transcurrido este tiempo, se agregó el inóculobacteriano en medio RPMI a los pozos, utilizandouna multiplicidad de infección de 2.000 bacteriaspor célula endotelial; se incubaron por 2 horas; seretiró el medio y las células se lavaron tres vecescon PBS. Luego, se adicionó medio RPMI consuplemento de gentamicina-penicilina (500 mg-500UI) y se incubaron por 2 horas (5% de CO2 ytemperatura de 37°C) con el fin de matar lasbacterias extracelulares y las adheridas a la caraexterna de la membrana celular. Después detrnascurrido tiempo, los cultivos se lavaron conPBS, se lisaron con una solución de Tritón X-100al 1% (Sigma) y se realizaron diluciones seriadasdel lisado que se sembraron por extensión encajas de agar BHI, se incubaron y se realizó elconteo de UFC.

Paralelamente, se llevó a cabo un experimentoen el cual la infección se hizo con E. coli DH5a,yse incluyó como control negativo. Los datos sepresentan como porcentaje de invasión = 100 x

(UFC recuperadas/UFC del inóculo inicial). Paracomprobar la muer te de las bacteriasextracelulares se sembraron 50 µl delsobrenadante de los cultivos tratados con lamezcla de antibióticos, se incubaron y seobservaron para establecer la aparición de UFCen el agar.

Microscopia óptica de la invasiónde E. faecalis a células HUVEC

Se hicieron pasajes de células HUVEC de cultivosconfluentes en frascos T 12,5 a láminas de vidrioestériles con una densidad de 2 x 104 células porlámina y se incubaron en ambiente húmedo con5% de CO

2 y temperatura de 37°C por 24 horas.

Después de la incubación, se lavaron tres vecescon PBS, se agregó medio RPMI sin suplementoy se incubaron por 3 horas en las mismascondiciones; se adicionó el inóculo bacteriano enmedio RPMI con una multiplicidad de infecciónde 2.000 y se incubaron por 2 horas. Después dela incubación, se retiró el medio, se lavaron tresveces las células con PBS, se adicionó medioRPMI con suplemento de gentamicina-penicilina(500 mg-500 UI) y se incubó por 2 horas en 5%de CO

2 y 37°C.

En este experimento se incluyeron cultivosinfectados con la cepa de E. coli DH5a, comocontrol negativo de la infección. Las láminas conlos cultivos infectados se fijaron en metanolabsoluto (Merck), se tiñeron con Gram o Giemsay se observaron al microscopio.

Microscopia electrónica de la invasión deE. faecalis a células HUVEC

Se prepararon e infectaron cultivos en láminas devidrio estériles de la forma descrita en los ensayosde microscopia óptica. Los cultivos infectados sefijaron en glutaraldehído al 3% en PBS (v/v)(Eufar), y se posfijaron con tetróxido de osmio;se sometieron a deshidratación en seriesascendentes de etanol, embebidos en Epón,cortados finamente con un ultramicrótomo (LKB-Pharmacia), teñidos con una solución acuosasaturada de acetato de uranilo y citrato de plomo.

Las observaciones de los cortes se hicieron enun microscopio electrónico Phillips CM10 a21.000 y 28.500 aumentos.

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Resultados

Aislamiento y cultivo de células endotelialesde vena umbilical humana (HUVEC)

En este trabajo encontramos que la digestiónenzimática con tripsina de la lámina endotelial querecubre la vena del cordón umbilical humano y laagrupación de los productos digeridos provenientesde tres cordones umbilicales cada uno conlongitudes aproximadas de 15 cm permitenestablecer cultivos primarios HUVEC. En estepaso, no se establece el número exacto de célulasendoteliales aisladas y sembradas por frasco T-25 debido a que se obtienen muchos agregadoscelulares lo cual hace muy inexacto el conteo.Establecido el cultivo, los subcultivos se hacen condensidades celulares de 5x104 células por cm2.

En el panel A de la figura 1 se muestra un cultivoincubado por una semana, en el que se destacala presencia de células con morfología poliédricasemejante a la reportada para el endotelio (18).El panel B corresponde a un cultivo con el mismotiempo de incubación que fue sometido a tincióninmunohistoquímica para detectar la expresión delfactor von Willebrand.

Interacción de las células HUVEC conEnterococcus faecalis

La presencia de bacterias viables dentro de lascélulas endoteliales se estableció mediante un

ensayo de protección a antibióticos. En éstos,después de infectar los cultivos con losaislamientos por dos horas, se adicionó unamezcla antibiótica de gentamicina y penicilina paramatar las bacterias extracelulares, cuya muertese comprobó mediante la siembra delsobranadante. Los tiempos de infección y eltamaño del inóculo utilizados se determinaron enexperimentos preliminares. Se escogió en 2 horasel tiempo de incubación con las bacterias, debidoa la excesiva acidificación del medio de cultivoobservada después de las 4 horas. Se observó lapresencia de UFC en el sembrado obtenido a partirdel lisado celular luego de 2 horas de incubaciónen medio sin suplemento y 2 horas más en mediocon suplemento con concentraciones bactericidasde gentamicina- penicilina. Los resultados de losconteos de UFC, expresados como porcentajesde invasión, fueron de 0,18% para el aislamientoenterocóccico Ef 2890 y de 0% para la cepa deE. coli DH5a, usada como control negativo de lainvasión.

Ensayos con microscopia de luz

El panel A de la figura 2 presenta cultivosendoteliales infectados con E. faecalis Ef 2890teñidos con la coloración de Gram; el panel B, loscultivos sometidos a la tinción de Giemsa. Entodos los casos se evidenció la asociación de losenterococos con las células HUVEC. Los

Figura 1. Cultivos confluentes de células HUVEC. A. Microscopía con contraste de fase; se observan células con unionesestrechas y morfología poliédrica que exhiben una organización en “empedrado”. B. Tinción inmunohistoquímica positivapara la expresión de factor de von Willebrand.

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resultados de los tres experimentos realizados portriplicado indican que el aislamiento de E. faecalisEf 2890 se asoció con 69,23% de las célulasendoteliales, mientras que la cepa de E. coli noestableció interacciones con éstas.

Ensayos con microscopía electrónica detransmisión

La microscopía electrónica de transmisión decélulas HUVEC inoculadas con E. faecalis 2890(figura 3) muestra cocos intracelulares, algunosen vacuolas espaciosas (A) otros en vacuolas

Figura 2. Microscopia óptica de la invasión de E. faecalis 2890 a células HUVEC. Los cultivos infectados se tiñeron con (A)Giemsa y (B) Gram y se observaron al microscopio. Las flechas señalan múltiples bacterias intracelulares (de acuerdo conlos resultados del ensayo de protección a antibióticos), algunas en cadenas. E. faecalis 2890, 100X.

Figura 3. Microscopia electrónica de transmisión de lainvasión de E. faecalis 2890 a células HUVEC. Se observancocos intracelulares, algunos en vacuolas espaciosas (A,21.000X) otros en vacuolas que se conforman al tamaño dela célula y en aparente división (B, 28.500X).

ajustadas al tamaño de la célula (B). En algunoscasos se observan bacterias en división (B) yformando tabiques.

Discusión

La investigación detallada de la interacción queestablecen las bacterias de la especie E. faecaliscon las células endoteliales se ve favorecida porla posibilidad de establecer cultivos primarios concélulas endoteliales provenientes de la vena delcordón umbilical humano. Éstos, al formar unamonocapa uniforme, proveen un buen sustrato para

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el estudio detallado de las interacciones bacteria-célula, y simulan la superficie encontrada in vivopor las bacterias que producen endocarditis (19).Aunque este sistema biológico ha sido utilizadopara estudiar la invasión-ingreso de Staphylococcusaureus por medio de la célula endotelial (19,21),no se ha aplicado para analizar las interaccionesE. faecalis-endotelio.

A pesar de que las células endoteliales no soncélulas fagocíticas profesionales, su capacidadpara fagocitar in vitro las bacterias de la especieS. aureus ya ha sido descrita (19-21). La novedadde nuestro trabajo radica en que muestra lapresencia intracelular de E. faecalis Ef 2890 enlos cultivos primarios de HUVEC inoculados conesta bacteria. Las bacterias se observaron dentrode vacuolas endocíticas, algunas empezando aformar tabiques. En los modelos similares deinfección con S. aureus se ha postulado que lapresencia intracelular de estas bacterias puedeser un elemento clave en la génesis de lasvegetaciones en las válvulas sanas (7,19-21). Unaposible inferencia surgida de relacionar nuestrosresultados con los obtenidos con S. aureus esque puede estar ocurriendo este mismo fenómenoin vivo con E. faecalis. Si éste es el caso, lasbacterias estarían entrando a un ambienteintracelular protegido, reproduciéndose y, tal vez,pasando a través de la barrera endotelial.

Un estudio reciente mostró la presencia en sangre,hígado, riñón, corazón y bazo de dos cepas de E.faecalis inoculadas endovenosamente en unmodelo en ratón (22). Los autores sugirieron quela gravedad de las lesiones histopatológicascausadas por la cepa más virulenta podía debersea su habilidad de cruzar la barrera endotelial. Lapresencia de bacterias en vesículas endocíticasintracelulares detectada por nosotros puede ayudara insinuar la hipótesis de que E. faecalis utilizaun mecanismo de transcitosis bacteriana paraatravesar la lámina endotelial y causar daño tisular.Aunque el promedio del porcentaje de invasión(0,18%) obtenido in vitro es bajo, puede tenersignificado biológico. Se ha reportado por otrosautores que los porcentajes de invasión menoresde 1 pueden llegar a ser importantes en unescenario in vivo (12).

Los resultados de este trabajo señalan que elmodelo desarrollado basado en cultivos primariosde HUVEC puede ser una herramienta útil en elestudio de los mecanismos de patogenicidad quesubyacen las patologías infecciosas del endoteliocausadas por E. faecalis. En nuestro grupo,actualmente se están llevando a caboexperimentos tendientes a establecer el papel quela célula endotelial y la bacteria tienen en lainvasión-ingreso descritos. Con ellos se esperaesclarecer si la presencia intracelular deenterococos es debida a procesos de fagocitosisexhibidos por la célula endotelial en respuesta alos factores inductores producidos por la bacteria.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado parcialmente por elInstituto Colombiano para el Desarrollo de laCiencia y la Tecnología Francisco José de Caldas,Colciencias, proyecto número 13080412635. Losautores quieren expresar su agradecimiento alInstituto de Genética Molecular Bacteriana de laUniversidad El Bosque por facilitarnos la cepa E.faecalis 2890 y a María Mercedes Posada por lalectura crítica del documento.

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