contents vacczyme anti-tetanus toxoid igg enzyme ...peramed.com/peramed/docs/mk010_enn.pdf ·...

Insert Code: E010, Version: 28th October 2010, of 12

CONTENTS

Page no.

1 Intended use

2 Background

3 Principle of the assay

4 Precautions

5 Sample collection and storage

6 Materials

7 Assay method

8 Results and quality control

9 Protective levels

10 Typical values

11 Performance characteristics

12 References

Deutsch Siehe Seite

Français Cf. page

Español Página

VaccZyme™ Anti-Tetanus Toxoid IgG Enzyme Immunoassay Kit

For in-vitro diagnostic use

Product code: MK010

Product manufactured by:

The Binding Site Group Ltd, PO Box 11712, Birmingham, B14 4ZB, U.K.

Telephone: +44 (0)121 436 1000 Fax: +44 (0)121 430 7061 e-mail: [email protected]

VaccZyme™ is a trademark of The Binding Site Group Ltd.

1 INTENDED USE

This assay is intended for the in-vitro measurement of specific IgG antibodies against tetanus toxoid (T.Tox.) present in serum, in order to determine protective status. Sufficient materials are supplied to allow a maximum of 39 samples to be tested in duplicate or 87 in single, with a seven point calibration curve and two controls. The seven point calibration curve can be reduced to five points if measurement below 0.09 IU/mL is not required.

2 BACKGROUND

Anti-tetanus toxoid antibodies are raised in response to vaccination with tetanus toxoid protein. A patient‟s response to the immunisation may be assessed, subsequently, by the serological determination of their anti-tetanus toxoid antibody levels using this quantitative enzyme immunoassay technique. Patients with recurrent infections should be investigated for immunodeficiency due to thymic abnormalities, and the consequent inability to respond to specific bacterial antigens (review 1).

3 PRINCIPLE OF THE ASSAY

Microwells are pre-coated with tetanus toxoid antigen. The calibrators, controls and diluted patient samples are added to the wells and antibodies recognising the tetanus toxoid antigen bind during the first incubation. After washing the wells to

remove all unbound proteins, purified peroxidase labelled rabbit anti-human IgG ( chain specific) conjugate is added. The conjugate binds to the captured human antibody and the excess unbound conjugate is removed by a further wash step. The bound conjugate is visualised with 3,3‟,5,5‟ tetramethylbenzidine (TMB) substrate which gives a blue reaction product, the intensity of which is proportional to the concentration of antibody in the sample. Phosphoric acid is added to each well to stop the reaction. This produces a yellow end point colour, which is read at 450nm.

4 PRECAUTIONS

4.1 WARNING

All donors of human serum supplied in this kit have been serum tested and found negative for hepatitis B surface antigen (HBsAg) and antibodies to human immunodeficiency virus (HIV1 and HIV2) and hepatitis C virus. The assays used were either approved by the FDA (USA) or cleared for in vitro diagnostic use in the EU (Directive 98/79/EC, Annex II); however these tests cannot guarantee the absence of infective agents. Proper handling and disposal methods should be established as for all potentially infective material, including (but not limited to) users wearing suitable protective equipment and clothing at all times. Only personnel fully trained in such methods should be permitted to perform these procedures. This product contains sodium azide and ProClin 300 and must be handled with caution; suitable gloves and other protective clothing should be worn at all times when handling this product. Do not ingest or allow contact with the skin (particularly broken skin or open wounds) or mucous membranes. If contact does occur wash with a large volume of water and seek urgent medical advice. Explosive metal azides may be formed on prolonged contact of sodium azide with lead and copper plumbing; on disposal of reagent, flush with a large volume of water to prevent azide build up. The buffers and serum supplied in this kit contain various enzyme inhibitors as listed below. These are hazardous and should be handled with care.

INHIBITOR CONCENTRATION

Kathon Sodium azide ProClin™ 300

Bromonitrodioxane Methylisothiazone

0.02% 0.099% 0.045% 0.002% 0.002%

ProClin™ is a trademark of Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA

Kathon is an irritant and may cause sensitisation by skin contact. The stop solution contains 3M phosphoric acid, which is an irritant. Avoid contact with skin or eyes. Reagent spills should be cleaned up appropriately, observing local and environmental regulations.

4.2 CAUTION

This product should only be used by appropriately trained personnel. Strict adherence to the protocol is recommended. Any deviation may affect assay performance, and the results obtained. Pay attention to specific „Notes‟ and warnings throughout these Instructions for Use. Reagents from different batch numbers of kits are NOT interchangeable. If large numbers of tests are performed care should be taken to ensure that all reagents are from the SAME batch. All strips used must be taken from the same foil pouch.

Substitution of any component may lead to incorrect results.


To avoid reagent contamination, only use new or clean plastic / glassware. Never return unused reagents to the bottles. Do not leave reagent bottles uncapped; any resulting evaporation or contamination will lead to inconsistent results. TMB substrate must not be exposed to light or water. Microbially contaminated, haemolysed or lipaemic serum and specimens containing particulate matter should not be used. Inaccurate sample dilution cannot be checked, as kit controls are ready to use. The use of calibrated pipettes and appropriate internal QC samples is recommended. When using automated assay systems, sample dilutors and other automated equipment, follow the manufacturer‟s instructions carefully. Particular attention should be given to the setup of the equipment and installation and connection to external services. All settings for automatic washers and readers must be followed carefully and equipment must be maintained and serviced according to the manufacturer‟s instructions.

4.3 STORAGE AND STABILITY

The kit should be stored at 2-8°C and should not be frozen. Inappropriate storage

temperatures will affect the results. Wash buffer diluted into a clean container can be stored at room temperature for a maximum of 4 weeks. The expiry date of the kit is shown on the outer label.

5 SAMPLE COLLECTION AND STORAGE

Blood samples should be collected by venepuncture allowed to clot naturally and the serum separated. The serum may be stored at 2-8°C for up to 48 hours prior to assay, or for prolonged storage kept undiluted at -20°C or below. Repeated thawing and freezing should be avoided. Serum samples should not be heat-inactivated, as this may give false positive results.

6 MATERIALS

6.1 MATERIALS SUPPLIED

6.1.1 Instruction Leaflet: Giving full assay details. 6.1.2 QC Certificate: Indicating the expected performance of the batch. 6.1.3 T. Tox. Coated Wells: 12 breakapart 8 well strips coated with tetanus

toxoid derived from the toxin of Clostridium tetani. The plate is packaged in a re-sealable foil bag containing two desiccant pouches.

6.1.4 Sample Diluent: 2 bottles containing 50mL of buffer for sample dilution.

Coloured yellow, ready to use. 6.1.5 Wash Buffer: 1 bottle containing 50mL of a 20-fold concentrated buffer for

washing the wells. 6.1.6 T. Tox. IgG Calibrators: 7 bottles each containing 1.2mL of diluted human

serum, with the following concentrations of anti-tetanus toxoid antibody: 7, 2.33, 0.78, 0.26, 0.09, 0.03, 0.01 IU/mL. Ready to use.

6.1.7 T. Tox. IgG High Control: 1 bottle containing 1.2mL of diluted human

serum. The expected value is given on the QC certificate. Ready to use. 6.1.8 T. Tox. IgG Low Control: 1 bottle containing 1.2mL of diluted human

serum. The expected value is given on the QC certificate. Ready to use. 6.1.9 T. Tox IgG Conjugate: 1 bottle containing 12mL of purified peroxidase

labelled antibody to human IgG. Coloured red, ready to use. 6.1.10 TMB Substrate: 1 bottle containing 14mL TMB substrate. Ready to use. 6.1.11 Stop Solution: 1 bottle containing 14mL of 3M phosphoric acid. Ready to use.

6.2 ADDITIONAL MATERIALS AND EQUIPMENT - not supplied

6.2.1 Automatic microplate plate washer: This is recommended, however, plate washing can be performed manually.

6.2.2 Plate reader: Capable of measuring optical densities at 450nm referenced on air.

6.2.3 Distilled or deionised water: This should be of the highest quality available.

6.2.4 Calibrated micropipettes: For dispensing 1000, 100 & 10L.

6.2.5 Multichannel pipette: Recommended for dispensing 100L volumes of conjugate, substrate and stop solution.

6.2.6 Glass/plastic tubes: For sample dilution.

7 ASSAY METHOD

7.1 PRE-ASSAY STEPS

1. Bring the kit to room temperature The kit is designed for room temperature operation (20-24°C). Remove the kit from storage and stand at room temperature for approximately 60 minutes. Wells must not be removed from the foil bag until they have reached room temperature. Note: The kits may be maintained at room temperature for up to 1 week.

2. Kit components

Gently mix each kit component before use.

3. Wash buffer dilution Add 50mL of the wash buffer concentrate to 950mL of distilled water (1 in 20 dilution) into a clean container and mix. Smaller volumes can be diluted as appropriate. Note: Diluted wash buffer can be stored at room temperature for up to 4 weeks, therefore, only dilute the appropriate amount.

4. Sample dilution

Dilute 10L of each sample with 1000L of sample diluent (1:100) and mix well. Note: Diluted sample must be used within 8 hours.

5. Strip and frame handling Place the required number of wells in the strip holder. Position from well A1, filling columns from left to right across the plate. When handling the plate, squeeze the long edges of the frame to prevent the wells falling out. Note: Return unused wells to the foil bag immediately with the two desiccant pouches

and re-seal tightly to minimise exposure to moisture. Take care not to puncture or tear the foil bag, see below. WARNING: Exposure of wells to moisture or contamination by dust or other particulate matter will result in antigen degradation, leading to poor assay precision and potentially false results.

7.2 ASSAY METHOD

Maintain the same dispensing sequence throughout the assay.

1. Sample addition

Dispense 100L of each calibrator, control and diluted (1:100) sample into the appropriate wells of the plate provided. Note: Samples should be added as quickly as possible to the plate to minimise assay drift, and the timer started after the addition of the last sample. Incubate at room temperature for 30 minutes.

2. Washing The washing procedure is critical and requires special attention. An improperly washed plate will give inaccurate results, with poor precision and high backgrounds.

After incubation remove the plate and wash wells 3 times with 250-350L wash buffer per well. Wash the plate either by using an automatic plate washer or manually as indicated below. After the final automated wash, invert the plate and tap the wells dry on absorbent paper.

Plates can be washed manually as follows: a. Flick out the contents of the plate into a sink. b. Tap the wells dry on absorbent paper.

c. Fill each well with 250-350L of wash buffer using a multichannel pipette. d. Gently shake the plate on a flat surface. e. Repeat a-d twice. f. Repeat a and b.

3. Conjugate addition

Dispense 100L of conjugate into each well, blot the top of the wells with a tissue to remove any splashes. Note: To avoid contamination, never return excess conjugate to the reagent bottle. Incubate at room temperature for 30 minutes.

4. Washing Repeat step 2.

5. Substrate (TMB) addition

Dispense 100L of TMB substrate into each well, blot the top of the wells with a tissue to remove any splashes. Note: To avoid contamination never return excess TMB to the reagent bottle. Incubate at room temperature in the dark for 30 minutes.

6. Stopping

Dispense 100L of stop solution into each well. This causes a change in colour from blue to yellow.

7. Optical density measurement

Read the optical density (OD) of each well at 450nm on a microplate reader, within 30 minutes of stopping the reaction.

8 RESULTS AND QUALITY CONTROL

1. Quality control

In order for an assay to be valid, all the following criteria must be met:

Calibrators and controls must be included in each run.

The value obtained for each control should be in the range specified on the QC Certificate.

The curve shape should be similar to the calibration curve, shown on the QC Certificate.

If the above criteria are not met, the assay is invalid and the test should be repeated.

2. Calculate mean optical densities (For assays run in duplicate only) For each calibrator, control and sample calculate the mean OD of the duplicate readings. The percentage coefficient of variation (%C.V.) for each duplicate OD should be less than 15%.

3. Plot calibration curve The calibration curve can be plotted either automatically or manually as follows by plotting the anti-tetanus toxoid antibody concentration on the log scale against the OD on the linear scale for each calibrator:

Automatic - use appropriately validated software, and the curve fit that best fits the data.

Manual - using log/linear graph paper, draw a smooth curve through the points (not a straight line or point to point).

4. Treatment of anomalous points

If any one point does not lie on the curve, it can be removed provided that the overall expected curve shape is maintained (this is normally done automatically when using curve fitting software). If the absence of this point means that the curve has a shape dissimilar to that of the sample calibration curve, or more than one point appears to be anomalous, then the assay should be repeated.

5. Calculation of the control value Read the level of the anti-tetanus toxoid antibody in the controls directly from the calibration curve. The value should fall within the range given on the QC Certificate.

6. Calculation of antibody levels in diluted samples Read the level of the anti-tetanus toxoid antibody in the diluted samples directly from the calibration curve. Note: The calibrator values have been adjusted by a factor of 100 to account for a 1:100 sample dilution. No further correction is required.

7. Assay calibration The assay is calibrated against the NIBSC tetanus antitoxin reference preparation, 76/589 which is supplied by the National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC: www.nibsc.ac.uk).

8. Limitations Pre- and post-vaccination samples should be run simultaneously. This kit may be used to aid diagnosis of immunodeficiency. Results must be confirmed by clinical findings and other serological tests. The results obtained from this assay are not diagnostic proof of lack of protection / protection against tetanus or the presence or absence of immunodeficiency.


9 PROTECTIVE LEVELS

The level of protective antibody in the normal population has been cited in the literature as between 0.01 and 0.15 IU/mL2,3,4. The largest study conducted in the United States2, involved a sample population of 10,618 individuals, ranging from age 6 upwards. Overall 69.7% had protective levels of >0.15 IU/mL, the rate decreased from 87.7% in 6-11 year olds to 27.8% in those 70 years of age and older. The results from two smaller studies3,4, indicate protective levels of 0.01 IU/mL.

Due to the wide ranges quoted above, it is recommended that each laboratory determine its own normal protective range.

10 TYPICAL VALUES

Anti-tetanus toxoid IgG antibody levels were measured in serum from 100 normal adult blood donors (of unknown vaccination and immune status). The results displayed below, are provided for illustration only, and should not be used to calculate a normal range.

Normal ranges have been established using The Binding Site T.Tox kit (MK010). See reference 5.

11 PERFORMANCE CHARACTERISTICS

11.1 PRECISION The intra- and inter-assay precision was measured using three samples within the range of the calibration curve. The concentration and % C.V. for each sample are given below:

INTRA-ASSAY PRECISION

n=16 Concentration (IU/mL) % C.V.

Sample 1 4.05 2.31

Sample 2 1.21 2.65

Sample 3 0.51 5.06

INTER-ASSAY PRECISION

n=18 Concentration (IU/mL) % C.V.

Sample 1 3.77 8.81

Sample 2 0.98 7.99

Sample 3 0.47 5.63

11.2 ANALYTICAL SENSITIVITY Sensitivity was determined as the mean concentration + 2 SD given by 16 determinations of the sample diluent. This equates to 0.0093 IU/mL.

11.3 MEASURING RANGE

The measuring range of the assay is 0.01 - 7 IU/mL.

11.4 INTERFERING SUBSTANCES Various serum types were assayed to test the possible effect of interfering substances using an Interference Check A plus kit (Kokusai, Japan).

Substance Concentration

Bilirubin F (Free) 183mg/mL

Bilirubin C (Conjugate) 190mg/mL

Haemolysed Haemoglobin 4900mg/mL

Chyle 19300 Units

Rheumatoid Factor 500 IU/mL

No interference was observed with free or conjugated bilirubin, haemoglobin, lipid or rheumatoid factor.

12 REFERENCES

1. Berger M. Immunoglobulin G subclass determination in diagnosis and management of antibody deficiency syndromes. The Journal of Paediatrics, 1987:2:325-328.

2. Gergen P. J et al. A population-based serologic survey of immunity to tetanus in the United States. The New England Journal of Medicine, 1995; 332:761-766.

3. Bjorkholm B. et al. Immune status and booster effects of low doses of tetanus toxoid in Swedish medical personnel, Scandinavian Journal of Infectious Diseases, 1994; 26: 471-475.

4. Ramsay M. E. B et al. Persistence of antibody after accelerated immunisation with diphtheria / tetanus / pertussis vaccine. British Medical Journal, 1991; 30 2: 1489-1491

5. Schauer U. et al. Levels of antibody specific to Tetanus toxoid, Haemophilus influenzae type b, and Pneumococcal Capsular Polysaccharide in healthy children and adults. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Mar 2003: 202-207.

INHALT

Seite

1 Verwendungszweck

2 Einführung

3 Testprinzip

4 Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen

5 Probenentnahme und –vorbereitung

6 Materialien

7 Testdurchführung

8 Ergebnisse und Qualitätskontrolle

9 Impfschutz

10 Typische Werte

11 Leistungsdaten

12 Referenzen

Num

be

r of

sa

mp

les

0 5

10 15 20 25 30

Anti-T.Tox IgG IU/mL iu/ml IU/mL


VaccZyme™ Enzym-Immunoassay zur Bestimmung von Tetanus Toxoid-IgG-

Antikörpern

Nur zur in-vitro Diagnostik

MK010

Hergestellt von: The Binding Site Group Ltd, PO Box 11712, Birmingham, B14 4ZB, UK. www.bindingsite.co.uk

Vertrieb in Deutschland und Österreich durch:

The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straße 2A D-68723 Schwetzingen, Deutschland Telefon: +49 (0) 6202 92 62 0 Fax: +49 (0) 6202 92 62 222 e-mail: [email protected]

VaccZyme™ ist ein Warenzeichen von The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK

1 VERWENDUNGSZWECK

Mit diesem in-vitro Testkit können spezifische Antikörper gegen IgG-Tetanus-Toxoid (TTox) im Humanserum nachgewiesen. Mit diesem Test kann der individuelle Impfschutz bestimmt werden.

Der Kit enthält ausreichend Material, um maximal 39 Proben in Doppelbestimmung oder 87 Proben in Einzelbestimmung zu messen sowie eine Kalibrationskurve (7 Punkte) und zwei Kontrollen.

Ist eine Empfindlichkeit von kleiner als 0,09 IU/mL nicht erforderlich, kann die Kalibrationskurve von 7 auf 5 Kalibrationspunkte reduziert werden.

2 EINFÜHRUNG

Anti-Tetanus-Toxoid-Antikörper werden als Reaktion auf die Impfung mit dem Tetanus-Toxoid-Protein gebildet. Der Impferfolg kann anschließend durch die serologische Bestimmung des Anti-Tetanus-Toxoid-Antikörper Titers mit Hilfe dieses quantitativen ELISA Kits beurteilt werden. Patienten mit rezidivierenden Infektionen sollten auf das Vorliegen von Immundefekten, die durch Thymus-Abnormalitäten verursacht sein können und die daraus resultierende Unfähigkeit auf spezifische bakterielle Antigene zu reagieren, untersucht werden (Review 1).

3 TESTPRINZIP

Die Wells (Vertiefungen) der Mikrotiterplatten sind mit dem Tetanus-Toxoid-Antigen beschichtet. Die Kalibratoren, Kontrollen und zu testende Proben werden in den Wells inkubiert, so dass die Anti-Tetanus-Toxoid-Antikörper während der ersten Inkubation an das immobilisierte Antigen binden können. Nach dem Waschen der Wells - zum Entfernen des ungebundenen Protein - gibt man das affinitätsgereinigte,

mit Peroxidase markierte Kaninchen Anti-Human-IgG-Konjugat hinzu (-Ketten-spezifisch). Nach einer weiteren Inkubation und einem weiteren Waschvorgang - um das ungebundene Konjugat zu entfernen - wird das gebundene Konjugat mit Hilfe von 3,3',5,5' - Tetramethylbenzidin (TMB) sichtbar gemacht. TMB ergibt ein blaues Reaktionsprodukt, dessen Intensität proportional zur Antikörperkonzentration der Probe ist. Phosphorsäure wird in jedes Well pipettiert um die Reaktion zu stoppen. Das daraus resultierende gelbe Reaktionsprodukt wird bei 450nm gemessen.

4 WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN

4.1 WARNUNGEN

Jede Einzelspende von humanem Serum wurde untersucht und bezüglich Antikörper gegen das Human-Immunschwäche-Virus (HIV 1 & 2), das Hepatitis-C-Virus und gegen das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAG) als negativ befunden. Die hierfür verwendeten Tests sind entweder von der FDA (USA) zugelassen oder für den Gebrauch in der in vitro Diagnostik in der EU freigegeben (Directive 98/79/EC, Annex II). Es gibt aber zur Zeit keine absolut sicheren Testmethoden zum Auschluss dieser und anderer Infektionsträger. Umgangs- und Entsorgungsmethoden sollten denen für potentiell infektiösem Material entsprechen (inklusive dem Tragen entsprechender Schutzkleidung). Der Test sollte nur von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden. Dieses Produkt enthält Natriumazid und ProClin 300 und muss mit den ent-sprechenden Vorsichtsmaßnahmen behandelt werden. Das Tragen von Handschuhen und anderer Schutzkleidung wird während des Umgangs mit diesem Produkt empfohlen. Verschlucken sowie Kontakt mit Haut (v.a. bei Verletzungen) oder Schleimhäuten vermeiden. Nach Kontakt Hautstelle mit viel Wasser abspülen und ärztlichen Rat einholen. Natriumazid kann mit Blei- oder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser, nachspülen um Azidablagerungen zu vermeiden.

Alle Puffer und Seren im Kit enthalten die unten aufgelisteten Enzym-Inhibitoren als Konservierungsmittel. Diese Substanzen sind als Gefahrstoffe anzusehen und müssen mit Vorsicht gehandhabt werden.

INHIBITOR KONZENTRATION

Kathon Natriumazid

ProClin™ 300 Bromonitrodioxan Methylisothiazon

0,02% 0,099% 0,045% 0,002% 0,002%

ProClin™ ist ein Warenzeichen der Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA

Kathon wirkt reizend und kann bei Hautkontakt zu einer Sensibilisierung führen. Die Stopp-Lösung enthält 3M Phosphorsäure, die Reizungen auslösen kann. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen. Verschüttete Reagenzien entsprechend beseitigen, dabei sind ökologische und gesetzliche Bestimmungen zu beachten. 4.2 VORSICHTSMAßNAHMEN Dieser Test sollte nur von entsprechend geschultem Laborpersonal durchgeführt werden. Testdurchführung strikt nach Arbeitsanleitung. Jegliche Abweichung kann die Testqualität und Ergebnisse beeinflussen. Beachten Sie die spezifischen ‚Hinweise„

und Warnungen in dieser Arbeitsanleitung. Reagenzien unterschiedlicher Chargen dürfen NICHT untereinander gemischt oder gemeinsam verwendet werden. Bei großem Testdurchsatz muss darauf geachtet werden, dass alle Reagenzien der GLEICHEN Charge entstammen. Alle

Mikrotiterstreifen müssen aus demselben Folienbeutel entnommen werden Der Austausch einer Testkomponente kann inkorrekte Ergebnisse zur Folge haben. Zur Vermeidung von Kontaminationen der Reagenzien immer saubere Plastik- oder Glasgefäße verwenden. Niemals unbenutztes Reagenz in die Flaschen zurückgeben. Reagenzienflaschen nicht für längere Zeit offen stehenlassen. Die daraus resultierende Verdunstung oder Verunreinigung führt zu widersprüchlichen Ergebnissen. TMB darf weder mit Licht noch mit Wasser in Berührung kommen. Die Verwendung von mikrobiell oder mit Partikeln verunreinigtern hämolytischen oder lipämischen Seren vermeiden. Falsche Probenverdünnungen können nicht erkannt werden, da die Kit-Kontrollen gebrauchsfertig sind. Es wird empfohlen kalibrierte Pipetten und geeignete interne Kontrollen zu verwenden. Bei der Verwendung von automatisierten Testsystemen, Probenverdünnern und anderem automatisierten Zubehör, sind die Anweisungen des Herstellers sorgfältig zu befolgen. Besondere Sorgfalt gilt der Aufstellung und Installation der Geräte und der Verbindung zu externen Systemen. Alle Einstellungen, die die automatisierten Wasch- und Lesegeräte betreffen, müssen sorgsam befolgt werden. Die Geräte müssen den Herstellerangaben entsprechend instand gehalten und gewartet werden. 4.3 LAGERUNG UND STABILITÄT Den Kit bei 2-8°C lagern, nicht einfrieren. Lagerung bei falscher Temperatur

beeinflusst die Ergebnisse. Der verdünnte Waschpuffer ist in einem sauberen Gefäß bei Raumtemperatur bis maximal 4 Wochen haltbar. Die Haltbarkeit des Kits wird auf dem Außenetikett angegeben.

5 PROBENENTNAHME UND VORBEREITUNG

Blutproben über Venenpunktur sammeln und auf natürliche Weise gerinnen lassen. Serum vom Gerinnsel trennen. Die Seren können bei 2-8°C bis zu 48 Stunden vor dem Test gelagert werden. Für eine längere Lagerung empfiehlt es sich, die Seren unverdünnt bei mindestens -20°C einzufrieren. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben vermeiden. Serumproben nicht hitzeinaktivieren, dies kann

zu falsch-positiven Ergebnissen führen.

6 MATERIALIEN

6.1 GELIEFERTE MATERIALIEN 6.1.1 Arbeitsanleitung: mit genauen Angaben zur Testdurchführung. 6.1.2 QC-Zertifikat: mit chargen-spezifischen Angaben zu Kontroll-Sollwerten,

ideale Kalibrationskurve. 6.1.3 T.Tox coated wells (Tetanus-Toxoid-Antigen beschichtete Mikrotiterstreifen):

12 Mikrotiterstreifen mit je 8 vereinzelbaren Wells, die mit von Clostridium tetani abgeleitetem Tetanus Toxoid beschichtet sind. Die Streifen sind in einem wiederverschließbaren Folienbeutel, der ein Trockenmittel enthält, verpackt.

6.1.4 Sample Diluent (Probendiluens): 2 Flaschen mit je 50mL gebrauchs-fertigem Puffer zur Probenverdünnung. Farbcodierung: gelb.

6.1.5 Wash buffer (Waschpuffer): 1 Flasche mit 50mL eines 20-fach konzentrierten

Puffers zum Waschen der Wells. 6.1.6 T. Tox IgG Calibrator (T.Tox IgG-Kalibratoren): 7 Flaschen mit je 1,2mL

gebrauchsfertig verdünntem Humanserum, das folgende Konzentration an Anti-Tetanus-Toxoid-Antikörper enthält: 7; 2,33; 0,78; 0,26; 0,09; 0,03; 0,01 IU/mL.

6.1.7 T.Tox IgG High Control (T.Tox IgG-Kontrolle, High level): 1 Flasche mit 1,2mL verdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegeben. Gebrauchsfertig.

6.1.8 T.Tox IgG Low Control (T.Tox IgG-Kontrolle, Low level): 1 Flasche mit 1,2mL verdünntem Humanserum. Der Sollwert ist auf dem QC-Zertifikat angegeben. Gebrauchsfertig.

6.1.9 T.Tox IgG Conjugate (T.Tox IgG-Konjugat): 1 Flasche mit 12mL gereinigtem, Peroxidase-markiertem Antikörper gegen Human-IgG. Farb-codierung: rot. Gebrauchsfertig.

6.1.10 TMB Substrate (TMB-Substrat): 1 Flasche mit 14mL TMB-Lösung. Gebrauchsfertig.

6.1.11 Stop Solution (Stopp-Lösung): 1 Flasche mit 14mL 3M Phosphorsäure. Gebrauchsfertig.

6.2 Benötigte, nicht im Kit enthaltene Materialien 6.2.1 Automatisches Mikrotiterplatten-Waschgerät: ist empfehlenswert, aber die

Platten können auch manuell gewaschen werden. 6.2.2 Mikrotiterplatten-Reader: Messung der optischen Dichte in den Wells bei

450nm. 6.2.3 Destilliertes Wasser: Es sollte von höchster Qualität und frei von Metallionen

sein.

6.2.4 Kalibrierte Mikropipetten: Zum Pipettieren von 1000, 100 & 10L.

6.2.5 Mehrkanal-Pipette: Zum Pipettieren von Volumina von 100L. 6.2.6 Glas- oder Plastikgefäße: zur Probenverdünnung.


7 TESTDURCHFÜHRUNG

7.1 Testvorbereitung 1. Kit auf Raumtemperatur erwärmen Die optimale Temperatur für die Testdurchführung liegt bei 20-24°C. Den Kit nach Entnahme aus dem Kühlschrank ca. 60 Minuten bei Raumtemperatur erwärmen lassen. Die Wells bis zum tatsächlichen Gebrauch in der Folie belassen! Hinweis: Der Kit kann bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur gelagert werden. 2. Kit-Komponenten

Jede Kit-Komponente vor Gebrauch kurz schütteln. 3. Waschpuffer verdünnen Dazu 50mL Waschpuffer-Konzentrat und 950mL destilliertes Wasser (1/20 Verdünnung) in ein sauberes Gefäß geben und mischen. Es können auch entsprechend kleinere Volumina verdünnt werden. Hinweis: Der verdünnte Puffer ist bei Raumtemperatur bis zu 4 Wochen haltbar;

deshalb nur die benötigte Menge verdünnen. 4. Verdünnung der Proben

10L jeder Probe mit 1000L Probendiluens verdünnen (1:100) und gut mischen. Hinweis: Die verdünnten Proben müssen innerhalb von 8h gemessen werden. 5. Umgang mit Streifen und Rahmen

Die benötigte Anzahl Wells aus dem Folienbeutel entnehmen und in den Rahmen setzen. Dabei von Position A1 ausgehend die Spalten von links nach rechts auffüllen. Achten Sie darauf, die langen Seiten des Rahmens zusammenzudrücken, damit die Wells nicht herausfallen können. Hinweis: Um die Kontaktzeit mit der Luftfeuchtigkeit zu minimieren, die nicht verwendeten Wells sofort in den wiederverschließbaren Folienbeutel mit dem Trockenmittel geben und gut verschließen. Darauf achten, dass der Folienbeutel nicht beschädigt wird. ACHTUNG: Kontakt mit Feuchtigkeit oder Verunreinigung durch Staub oder andere Partikeln kann einen Antigen-Abbau verursachen. Daraus resultiert eine schlechte Präzision und potentiell falsche Ergebnisse. 7.2 TESTDURCHFÜHRUNG Alle Reagenzien in der gleichen Reihenfolge pipettieren. 1. Pipettieren der Kalibratoren, Kontrolle und Proben und Inkubation

100L von jedem Kalibrator, jeder Kontrolle und jeder verdünnten (1:100) Probe in das dafür laut Plattenschema vorgesehene Well pipettieren. Hinweis: Die Proben müssen so schnell wie möglich pipettiert werden, um eine ‚Assay-Drift‟ zu vermeiden; die Inkubationszeit läuft ab Zugabe der letzten Probe. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

2. Waschen der Platte Sorgfältiges Waschen der Wells ist wichtig für eine hohe Präzision und genaue Testergebnisse. Bei nicht korrekt gewaschenen Wells können ungenaue Ergebnisse mit schlechter Präzision und hohem Hintergrund auftreten. Nach der Inkubation die

Wells dreimal mit 250-350L Waschpuffer waschen. Das Waschen kann mit einem automatischen Platten-Waschgerät oder manuell erfolgen. Nach dem letzten Waschschritt die Wells durch leichtes Klopfen auf eine absorbierende Unterlage (z.B. Papiertücher) trocknen. Manuelles Waschen: a. Den Inhalt der Wells in den Ausguss schütten, dabei die langen Seiten

des Rahmens zusammendrücken. b. Die Wells auf einer absorbierenden Unterlage (z.B. Papiertücher) leicht

ausklopfen. c. 250-350µL Waschpuffer in der Arbeitskonzentration in die Wells pipettieren. d. Die Mikrotiterplatte auf einer flachen Unterlage stehend leicht schütteln. e. Zweimaliges Wiederholen der Schritte a bis d. f. Die Wells wie unter a und b entleeren. 3. Pipettieren des Konjugats und Inkubation

100L Konjugat in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit Filterpapier abtrocknen, um Spritzer zu entfernen. Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges Konjugat in

die Konjugat-Flasche zurückgeben. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 4. Waschen der Platte Siehe Abschnitt 2.

5. Pipettieren von Substrat (TMB) und Inkubation

Nach dem Waschen 100L TMB in jedes Well pipettieren. Die Ränder der Wells mit Filterpapier abtrocknen, um Spritzer zu entfernen. Hinweis: Um Verunreinigungen zu vermeiden, niemals überschüssiges Konjugat in die TMB-Flasche zurückgeben. 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.

6. Reaktionsende

100L Stopp-Lösung in jedes Well pipettieren. Die Farbe schlägt von blau nach gelb um.

7. Farbmessung Die optische Dichte (OD) bei 450nm in jedem Well mit einem Mikrotiterplatten-Reader innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stopp-Lösung bestimmen.

8 ERGEBNISSE UND QUALITÄTSKONTROLLE

1. Qualitätskontrolle Nur, wenn alle nachfolgend aufgeführten Kriterien erfüllt sind, ist der Test gültig.

Kalibratoren und Kontrollen müssen bei jedem Testansatz mitgeführt werden.

Das Ergebnis jeder Kontrolle muss in dem angegebenen Wertebereich (siehe QC-Zertifikat) liegen.

Die berechnete Kalibrationskurve sollte der auf dem QC-Zertifikat abgebildeten Kalibrationskurve ähnlich sein.

Ist dies nicht der Fall, ist der Test ungültig und muss wiederholt werden.

2. Berechnung der mittleren optischen Dichte (nur bei Doppel-bestimmung):

Für jeden Kalibrator und jede Kontrolle und Probe die mittlere optischen Dichte (OD) der Doppelbestimmungen berechnen. Der Variationskoeffizient (%VK) der Doppelbestimmungen sollte jeweils unter 15% liegen.

3. Erstellen der Kalibrationskurve

Die Kalibrationskurve kann entweder automatisch oder manuell erstellt werden. Dazu wird die Anti-Tetanus-Toxoid-IgG-Antikörper Konzentration auf der logarithmischen Skala gegen die OD-Werte auf der linearen Skala für jeden Kalibrator aufgetragen.

Automatisch: Geeignete, validierte Software verwenden. Kalkulationsmodus verwenden, der am besten zu den Daten passt.

Manuell: Halblogarithmisches Millimeterpapier verwenden, eine Ausgleichskurve durch die Punkte legen (keine Gerade oder Punkt-zu-Punkt-Verbindung).

4. Umgang mit abweichenden Kalibrationspunkten

Liegt ein Messpunkt nicht auf der Kalibrationskurve, so kann er weggelassen werden. Der Test sollte wiederholt werden, wenn die daraus resultierende Kalibrationskurve deutlich von der im QC-Zertifikat angegebenen Kurvenform abweicht oder, wenn mehrere Kalibrationspunkte zu starke Abweichungen aufweisen.

5. Berechnung der Antikörper-Konzentrationen in den Kontrollen Die Anti-Tetanus-Toxoid-IgG-Antikörper-Konzentrationen der Kontrollen direkt aus der Kalibrationskurve ablesen. Die Kontrollwerte müssen in den im QC-Zertifikat angegebenen Bereich fallen.

6. Berechnung der Antikörper-Konzentrationen in den Proben Die Anti-Tetanus-Toxoid-IgG-Antikörper-Konzentrationen der Proben direkt aus der Kalibrationskurve ablesen. Hinweis: Die Standard-Probenverdünnung von 1:100 ist in der Kalibrationskurve

bereits berücksichtigt. Es sind keine weiteren Korrekturen nötig.

7. Kalibration des Tests Der Test-Kit ist gegen die NIBSC-Tetantus-Antitoxin-Referenzpräparation 76/589 kalibriert, von der National Institute for Biological Standards and Control geliefert (www.nibsc.ac.uk).

8. Grenzen des Tests Proben zur Testung von Pre- und Post-Impfung sollten immer gemeinsam getestet werden. Dieser Testkit dient nur zur Unterstützung der Diagnose von Immundefekten. Ein positives Ergebnis muss durch den klinischen Befund und andere serologische Untersuchungen bestätigt werden. Die Testergebnisse können nicht als diagnostischen Beweis für das Vorliegen bzw. Nichtvorliegen eines Impfschutzes gegen Tetanus oder eines Immundefektes verwendet werden.

9 IMPFSCHUTZ

In einer normalen Population wird ein Impfschutz bei einer Antikörperkonzentration zwischen 0,01 und 0,15 IU/mL in der Literatur angegeben2,3,4 .Die größte Studie, die in den Vereinigten Staaten2 durchgeführt wurde, untersuchte ein Kollektiv von 10618 Personen ab einem Alter von 6 Jahren. Insgesamt wurde bei 69,7% eine Antikörper-Konzentration von >0,15 IU/mL gefunden, bei der Altersgruppe 6-11 wiesen 87,7% einen Impfschutz auf wohingegen bei der Altersklasse 70 Jahre und älter nur noch 27,8% einen Impfschutz aufwiesen. Die Ergebnisse zweier kleinerer Studien3,4 ergaben einen Impfschutz bei einer Antikörper-Konzentration von >0,01 IU/mL.

Da die oben zitierten Untersuchungen sehr stark voneinander abweichende Ergebnisse erbrachten, empfehlen wir in jedem Labor eigene Normalwerte zu ermitteln.

10 TYPISCHE WERTE

Die Anti-Tetanus-Toxoid-IgG-Antikörperkonzentration wurde im Serum von 100 normalen Blutspendern (mit unbekanntem Impf- und Immunstatus) aus dem Raum Birmingham, England, ermittelt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Grafik zusammengefasst. Diese Werte dienen nur zur Orientierung und sollten nicht zur Berechnung eines Normalbereichs verwendet werden.

Ein Normalverteilung wurde unter Verwendung des The Binding Site Tetanus Toxoid Kits (MK010) ermittelt. Siehe Referenz 5.

11 LEISTUNGSDATEN

11.1 PRÄZISION

Die Intra- und Inter-Assay-Präzision wurde mit drei Proben, deren Antikörper-Konzentrationen innerhalb der Kalibrationskurve liegen, bestimmt. Die mittlere Konzentration und der Variationskoeffizient (%VK) sind nachfolgend angegeben:

INTRA-ASSAY-PRÄZISION

Probe n = 16 Konzentration IU/mL % VK

Probe 1 4,05 2,31

Probe 2 1,21 2,65

Probe 3 0,51 5,06

INTER-ASSAY-PRÄZISION

Probe n = 18 Konzentration IU/mL % VK

Probe 1 3,77 8,81

Probe 2 0,98 7,99

Probe 3 0,47 5,63

0 5

10 15 20 25 30

Anzahl der der Proben

Anti-T.Tox IgG IU/mL


11.2 ANALYTISCHE SENSITIVITÄT DES TESTS Die Sensitivität wird als die mittlere Konzentration plus die zweifache Standardabweichung (2SD) des Probendiluens ausgedrückt. Hierzu wurde dsa Probendiluens 16 mal gemessen und der folgende Wert erhalten: 0,0093 IU/mL. 11.3 MESSBEREICH Der Messbereich dieses Tests liegt zwischen 0,01 – 7 IU/mL. 11.4 INTERFERIERENDE SUBSTANZEN

Der Kit wurde mit verschiedenen Serumtypen (Interference Check A Plus Kit von Kokusai, Japan) auf mögliche Effekte von interferierenden Substanzen getestet.

Substanz Konzentration

Bilirubin F (Frei) 183mg/mL

Bilirubin C (Konjugiert) 190mg/mL

Hämolysiertes Hämoglobin 4900mg/mL

Chylus 19300 Units

Rheumafaktor 500 IU/mL

Freies und konjugiertes Bilirubin, Hämoglobin, Lipide oder Rheumafaktoren zeigten keinerlei Beeinflussung des Tests.

12 REFERENZEN

1. Berger M. Immunoglobulin G subclass determination in diagnosis and

management of antibody deficiency syndromes. The Journal of Paediatrics, 1987:2:325-328.





CONTENU

Page no.

1 Indications

2 Présentation générale

3 Principe

4 Précautions

5 Echantillons

6 Matériel

7 Procédure

8 Résultats et contrôle de qualité

9 Taux de protection

10 Valeurs typiques

11 Performances

12 Bibliographie


Coffret ELISA VaccZyme™ Anti-toxine tétanique de type IgG

Pour un usage en diagnostic in vitro uniquement

Référence : MK010

Produit fabriqué en Angleterre par la société : The Binding Site Group Ltd, PO Box 11712, Birmingham, B14 4ZB, U.K. www.bindingsite.co.uk

Distribué en France par la société : The Binding Site France, 14 rue des Glairaux, BP226, 38522 St-Egrève Cedex. Téléphone : 04.38.02.19.19 Fax : 04.38.02.19.20

e-mail : [email protected]

VaccZyme™ est une marque de The Binding Site Group Ltd. UK.

1 INDICATIONS

Ce test est utilisé pour mesurer in-vitro les anticorps IgG spécifiques dirigés contre

la toxine tétanique (Tox.T.) présents dans le sérum afin de déterminer le statut de protection des individus. Ce coffret permet de tester 39 échantillons en double ou 87 échantillons en simple avec une courbe de calibration en 7 points et deux contrôles. La courbe de calibration en 7 points peut être limitée à 5 points si des mesures en dessous de 0,09 UI/mL ne sont pas nécessaires.

2 PRESENTATION GENERALE

Les anticorps anti-toxine tétanique sont produits en réponse à la vaccination avec la protéine de la toxine tétanique. Une réponse de patient à l‟immunisation peut être évaluée par conséquent par la détermination sérologique des taux d‟anticorps anti-toxine tétanique en utilisant une technique ELISA. Chez des patients ayant des infections récurrentes, une immunodéficience due à des anomalies thymiques et par conséquent une incapacité à répondre aux antigènes bactériens spécifiques devraient être recherchées (réf. 1).

3 PRINCIPE

Les micropuits sont recouverts d‟antigène de toxine tétanique. Les calibrateurs, les contrôles et les échantillons de patients dilués sont ajoutés aux puits. Les anticorps reconnaissant l‟antigène de toxine tétanique se lient durant la première incubation. Après le lavage des puits pour enlever toutes les protéines non liées, un conjugué

de lapin purifié anti-IgG humaines (spécifique de la chaîne ) et marqué à la péroxydase est ajouté. Le conjugué se lie aux anticorps humains capturés et le conjugué non lié est éliminé par une étape de lavage. Le conjugué lié est visualisé avec du substrat 3,3‟,5,5‟ tetramethylbenzidine (TMB) qui donne un produit de réaction bleu. L‟intensité de celui-ci est proportionnelle à la concentration en anticorps de l‟échantillon. L‟acide phosphorique est ajouté dans chaque puits pour arrêter la réaction. Ceci produit une coloration jaune qui est lue à 450nm.

4 PRECAUTIONS

4.1 ATTENTION

Tous les sérums humains fournis dans ce coffret ont été testés et trouvés négatifs pour l‟antigène de surface de l‟hépatite B (Ag HBs), pour le virus de l‟hépatite C et pour les anticorps anti-virus de l‟immunodéficience humaine (HIV1 and HIV2). Les tests utilisés ont soit été approuvés par la FDA (USA) ou accepté pour un usage en diagnostic in-vitro par l‟union européenne (Directive 98/79/EC, Annexe II); néanmoins ces tests ne peuvent garantir l‟absence d‟agents infectieux Tous les échantillons doivent donc être manipulés comme des produits potentiellement infectieux. Seul un personnel qualifié dans la manipulation d‟échantillons potentiellement infectieux est autorisé à utiliser ce coffret. Ce produit contient de l’azide de sodium et ProClin 300 et doit être manipulé avec précaution; des gants appropriés et d’autres vêtements de protection doivent être portés lors de toutes manipulation. Ne pas ingérer ou avoir de contact avec la peau (spécialement sur les zones abîmées) ou des muqueuses. S’il y a contact, laver abondamment avec de l’eau et demander un avis médical. Des azides de métaux explosifs peuvent se former par contact prolongé entre de l’azide de sodium et les tuyauteries en plomb et cuivre; pour éliminer les réactifs, rincer avec un large volume d’eau pour prévenir tout dégât. Les tampons et sérums fournis dans ce coffret contiennent plusieurs inhibiteurs d‟enzymes listés ci-dessous. Les manipuler avec précaution. Ils sont dangereux et doivent manipulés avec précaution.

INHIBITEURS CONCENTRATION

Kathon Azide de sodium

ProClin™ 300 Bromonitrodioxane Methylisothiazone

0,02% 0,099% 0,045% 0,002% 0,002%

ProClin™ est une marque déposée par Rohm et Haas Corp. Philadelphie, PA

Le kathon est un irritant et peut induire une sensibilisation en cas de contact avec la peau. La solution stop contient de l‟acide phosphorique 3M qui est irritant. Eviter tout contact avec la peau et les yeux. Les éclaboussures de réactifs doivent être

nettoyées de façon appropriée en observant les réglementations locales et environnementales. 4.2 PRECAUTIONS

Ce réactif doit être utilisé par un personnel entraîné de façon appropriée. Il est recommandé de suivre scrupuleusement le protocole. Toute déviation peut affecter les performances et les résultats obtenus. Faire attention aux „Notes’ spécifiques dans les instructions d‟utilisation. Les réactifs des kits ayant des numéros de lots différents ne sont pas interchangeables. Toutes les barrettes utilisées doivent être issues du même sachet aluminium. Si de grandes séries de tests doivent être réalisées, vérifier que tous les réactifs aient le MÊME numéro de lot. Afin d‟éviter la contamination des réactifs, utiliser uniquement des récipients en plastique ou en verre neufs ou propres. Ne jamais remettre les réactifs non utilisés dans les flacons d‟origine. Ne jamais laisser les flacons non bouchés. Une évaporation ou une contamination peut induire des résultats incorrects. Le substrat TMB ne doit pas exposé à la lumière ou à l‟eau. Les sérums hémolysés, lipidiques ou contaminés par des bactéries ou des particules de matière ne doivent pas être utilisés. Une mauvaise dilution des échantillons ne peut pas être vérifiée car les contrôles sont fournis prêts à l‟emploi. L‟utilisation de pipettes calibrées et d‟échantillons appropriés de contrôle de qualité interne est recommandée. Lorsque vous utilisez des systèmes d‟analyses automatisés, diluteurs d‟échantillons et autres équipements automatisés, suivez les instructions du fabricant avec soin. Une attention particulière devra être accordée à l'installation de l'équipement et à l'installation et la connexion à des services externes. Tous les paramètres pour les laveurs et lecteurs automatisés doivent être suivis attentivement et les équipements doivent être maintenus et entretenus selon les instructions du fabricant.

4.3 STOCKAGE ET STABILITE

Le kit doit être stocké à 2-8°C et ne doit pas être congelé. Des conditions de stockage non appropriées affecteraient les résultats. Le tampon de lavage dilué dans un récipient propre peut être stocké à température ambiante pendant 4 semaines. La date de péremption du kit est indiquée sur l‟étiquette extérieure.

5 ECHANTILLONS

Les échantillons de sang doivent être collectés par ponction veineuse. Laisser coaguler naturellement et séparer le sérum. Le sérum peut être stocké 48 heures à 2-8°C avant le test ou pour un stockage prolongé non dilué à -20°C ou à une température inférieure. Les congélations et décongélations répétées doivent être évitées. Les sérums ne doivent pas être inactivés par la chaleur ce qui peut induire des résultats faux-positifs.

6 MATERIEL

6.1 MATERIEL FOURNI

6.1.1 Une fiche technique : donnant tous les détails de la technique. 6.1.2 Un certificat de contrôle de qualité : indiquant les performances attendues

du lot. 6.1.3 T. Tox. Coated Wells (Des puits recouverts de Tox. T.) : 12 barrettes de 8

puits sécables avec de la toxine tétanique provenant de la toxine de Clostridium tetani. La plaque est emballée dans un sachet réutilisable

contenant 2 dessicateurs. 6.1.4 Sample Diluent (Diluant échantillons) : 2 flacons de 50mL de tampon de

dilution des échantillons. Il est coloré en jaune et prêt à l‟emploi. 6.1.5 Wash Buffer (Tampon de lavage) : 1 flacon de 50mL de tampon concentré

20 fois pour le lavage des puits. 6.1.6 T. Tox. IgG Calibrators (Calibrateurs Tox. T. IgG) : 7 flacons de 1,2mL de

sérum humain dilué avec les concentrations suivantes en anticorps anti-toxine tétanique : 7 ; 2,33 ; 0,78 ; 0,26 ; 0,09 ; 0,03 ; 0 ,01 UI/mL. Ils sont prêts à l‟emploi.

6.1.7 T. Tox. IgG High Control (Contrôle positif haut Tox. T. IgG) : 1 flacon de

1,2mL de sérum humain dilué. La valeur est donnée dans le certificat de contrôle qualité. Il est prêt à l‟emploi.

6.1.8 T. Tox. IgG Low Control (Contrôle bas Tox. T. IgG) : 1 flacon de 1,2mL de sérum humain dilué. La valeur est donnée dans le certificat de contrôle qualité. Il est prêt à l‟emploi.

6.1.9 T.Tox IgG Conjugate (Conjugué Tox. T. IgG) : 1 flacon de 12mL d‟anticorps purifiés anti-IgG humaines et conjugués à la péroxydase. Il est coloré en rouge et est prêt à l‟emploi.

6.1.10 TMB Substrate (Substrat TMB) : 1 flacon de 14mL de substrat TMB. Il est prêt à l‟emploi.

6.1.11 Stop Solution (Solution d‟arrêt) : 1 flacon de 14mL d‟acide phosphorique

3M. Elle est prête à l‟emploi.

6.2 MATERIEL NECESSAIRE ET NON FOURNI

6.2.1 Laveur automatique de microplaques : il est recommandé mais le lavage peut se faire manuellement.

6.2.2 Lecteur de plaques : capable de mesurer des densités optiques de 450nm en référence à l‟air.

6.2.3 Eau distillée ou désionisée : elle doit être de bonne qualité. 6.2.4 Micropipette calibrées : pour des dépots de 1000, 100 et 10µL. 6.2.5 Pipette multicanaux : recommandée pour des dépôts de 100µL de

conjugué, de substrat et de solution d‟arrêt. 6.2.6 Tubes en plastique ou en verre : pour la dilution des échantillons.

7 PROCEDURE

7.1 ETAPES PREALABLES

1. Ramener le kit à température ambiante

Le kit fonctionne à température ambiante (20-24°C). Sortir le kit du réfrigérateur et le laisser à température ambiante approximativement 60 minutes. Les puits ne doivent pas être sortis de leur emballage avant qu‟ils ne

soient à température ambiante. Note : Les kits peuvent être maintenus à température ambiante 1 semaine.

2. Composants du kit Mélanger doucement chaque composant du kit avant utilisation.


3. Dilution du tampon de lavage Ajouter les 50mL de tampon de lavage concentré à 950mL d‟eau distillée (dilution au 1/20) dans un recipient propre et mélanger. Note : Le tampon de lavage dilué peut être stocké à température ambiante pendant 4 semaines, par conséquent ne diluer que la quantité nécessaire. 4. Dilution des échantillons

Diluer 10L de chaque échantillon avec 1000L de diluant échantillon (1:100) et bien mélanger. Note : Les échantillons dilués doivent être utilisés dans les 8 heures. 5. Manipulation de la plaque

Placer le nombre requis de puits sur la trame. Remplir les colonnes de gauche à droite à partir du puits A1. Lors de la manipulation de la plaque, maintenir les bords de la trame afin d‟éviter que les puits ne tombent. Note : Remettre immédiatement les puits non utilisés dans leur emballage afin de

minimiser l‟exposition des puits à l‟humidité. Faire attention à ne pas percer ou déchirer l‟emballage. ATTENTION: L’exposition des puits à l’humidité ou leur contamination par la poussière ou par d’autres particules de matière induit une dégradation de l’antigène conduisant à une mauvaise précision ou à des résultats faux. 7.2 PROCEDURE

Maintenir la même séquence de dépôt tout le long du test. 1. Dépôt de l’échantillon

Déposer 100L de chaque calibrateur, contrôle et échantillon dilué (1:100) dans les puits appropriés de la plaque. Note : Les échantillons doivent être déposés sur la plaque aussi rapidement que

possible afin de minimiser les écarts, et le décompte du temps commence après l‟addition du dernier échantillon. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. 2. Lavage La procédure de lavage est importante et requiert une attention spéciale. Un lavage imparfait peut induire de résultats faussés avec une mauvaise précision et du bruit

de fond. Après incubation, laver 3 fois les puits avec 250 à 350L de tampon de lavage par puits. Laver la plaque avec un laveur automatique de plaque ou manuellement comme indiqué ci-dessous. Après le lavage final automatique, retourner la plaque et taper les puits sur du papier absorbant. Les plaques peuvent être lavées manuellement comme suit : a. Renverser le contenu de la plaque dans un récipient. b. Taper les puits sur du papier absorbant.

c. Remplir chaque puits avec 250 à 350L de tampon de lavage en utilisant une pipette multi-canaux.

d. Agiter doucement la plaque sur une surface plane. e. Répéter les étapes a à d 2 fois. f. Répéter a et b. 3. Addition du conjugué

Déposer 100L de conjugué par puits, nettoyer le haut des puits avec un tissu pour enlever les éclaboussures. Note : Afin d‟éviter les contaminations, ne jamais remettre le conjugué en excès dans le flacon d‟origine. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. 4. Lavage Répéter l‟étape 2. 5. Addition du substrat (TMB)

Déposer 100L de substrat TMB dans chaque puits, nettoyer le haut des puits avec un tissu pour enlever les éclaboussures. Note : Afin d‟éviter les contaminations, ne jamais remettre l‟excès de TMB dans le flacon d‟origine. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes à l’obscurité. 6. Arrêt

Déposer 100L de solution d‟arrêt dans chaque puits. Ceci induit un changement de couleur du bleu au jaune. 7. Mesure de la densité optique Lire la densité optique (DO) de chaque puits à 450nm à l‟aide d‟un lecteur de microplaques dans les 30 minutes suivant l‟arrêt de la réaction.

8 RESULTATS ET CONTROLE DE QUALITE

1. Contrôle de qualité Pour valider le test, tous les critères suivants doivent être respectés :

Les calibrateurs et les contrôles doivent être inclus dans chaque série de tests.

La valeur obtenue pour chaque contrôle doit être dans la gamme spécifiée dans le certificat de contrôle de qualité.

La forme de la courbe doit être similaire à la courbe de calibration fournie dans le certificat de contrôle qualité.

Si les critères ci-dessus ne sont pas respectés, le test est invalide et doit être répété.

2. Calculer les densités optiques moyennes (pour des tests réalisés en

double) Pour chaque calibrateur, contrôle et échantillon, calculer la moyenne des DO du duplicat. Le coefficient de variation (CV en %) pour chaque duplicat doit être inférieur à 15%. 3. Courbe de calibration La courbe de calibration peut être tracée de façon automatique ou manuellement en appliquant la concentration d‟anticorps anti-toxine tétanique sur une échelle logarithmique contre les densités optiques sur une échelle linéaire pour chaque calibrateur.

Automatique – utiliser un logiciel validé approprié et une courbe qui suit les données.

Manuelle – utiliser du papier graphique log/lineaire, tracer une courbe qui passe par les points (pas une droite ni une courbe point à point).

4. Traitement des points anormaux Si un point ne passe pas par la courbe, il peut être enlevé. Si en l‟absence de ce point, la forme de la courbe est différente de celle du certificat de contrôle de qualité ou si plus d‟un point apparaît anormal, alors le test doit être répété. 5. Calcul de la valeur des contrôles Lire la concentration d‟anticorps anti-toxine tétanique dans les contrôles directement à partir de la courbe de calibration. La valeur doit être dans la gamme donnée sur le certificat de contrôle de qualité. 6. Calcul du taux d’anticorps dans les échantillons dilués Lire le taux d‟anticorps anti-toxine tétanique dans les échantillons dilués directement à partir de la courbe de calibration. Note: Les valeurs des calibrateurs ont été ajustées d‟un facteur de 100 pour tenir compte de la dilution au 1:100 des échantillons. Aucune autre correction n‟est nécessaire. 7. Calibration du test Le test est calibré par rapport à la préparation de référence anti-toxine tétanique NIBSC 76/589, fournis de National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC : www.nibsc.ac.uk). 8. Limites

Les échantillons avant et après vaccination doivent être testés simultanément. Ce kit peut être utilisé pour aider au diagnostic des immunodéficiences. Les résultats doivent être confirmés par la clinique et d‟autres tests sérologiques. Les résultats obtenus à partir de ce test ne sont pas une preuve diagnostique de la protection ou du manque de protection contre le tétanos ou de la présence ou absence d‟immunodéficience.

9 TAUX DE PROTECTION

Le taux d‟anticorps protecteurs dans la population normale a été citée dans la littérature entre 0,01 et 0,15 UI/mL (réfs. 2, 3 et 4). L‟étude la plus large a été réalisée aux Etats-Unis (réf. 2) sur une population de 10618 individus agés de plus de 6 ans. 69,7% avaient des taux d‟anticorps protecteurs > à 0,15 UI/mL, le taux diminue de 87,7% entre 6 et 11 ans jusqu‟à 27,8% pour des personnes agées de 70 ans et plus. Les résultats de deux plus petites études (réfs. 3 et 4) indiquent des taux protecteurs à 0,01 UI/mL. A cause des différences indiquées ci-dessus, il est recommandé à chaque laboratoire de déterminé sa propre gamme normale de protection.

10 VALEURS TYPIQUES

Les taux d‟anticorps anti-toxine tétanique ont été mesurés dans le sérum de 100 donneurs de sang adultes sains (de vaccination et de status immunitaires inconnus). Les résultats illustrés ci-dessous ne doivent pas être utilisés pour calculer une gamme normale.

Ces gammes ont été établies en utilisant le coffret de Binding Site MK010. Voir réf. 5.

11 PERFORMANCES

11.1 PRECISION La précision intra- et inter-essai ont été mesurées en utilisant 3 échantillons dans la gamme de la courbe de calibration. La concentration et le %C.V. pour chaque échantillon sont donnés ci-dessous :

PRECISION INTRA-ESSAI

n=16 Concentration (UI/mL) C.V. en %

Echantillon 1 4,05 2,31



PRECISION INTER-ESSAI

n=18 Concentration (UI/mL) C.V. en %




11.2 SENSIBILITE ANALYTIQUE La sensibilité a été déterminée comme étant la concentration moyenne + 2 déviations standards données par 16 déterminations du diluant échantillon. Elle est égale à 0,0093 UI/mL. 11.3 GAMME DE MESURE

La gamme de mesure du test est 0,01 à 7 UI/mL.

0 5

10 15 20 25 30

Nombre d‟échantillons

Anti-T.Tox IgG UI/mL

IU/mL


11.4 SUBSTANCES INTERFERENTES Différents types de sérum ont été testés pour évaluer l‟effet possible de substances interférentes en utilisant le coffret Interference Check A plus (Kokusai, Japon).

Substances Concentration

Bilirubine (libre) 183mg/mL

Bilirubine (conjuguée) 190mg/mL

Hémoglobine hémolysée 4900mg/mL

Chyle 19300 unités

Facteur rhumatoïde 500 UI/mL

Aucune interférence n‟a été observée avec la bilirubine libre ou conjuguée, l‟hémoglobine, les lipides ou le facteur rhumatoïde.

12 BIBLIOGRAPHIE







Contenido

Página

1 Propósito

2 Introducción

3 Principio del método

4 Precauciones

5 Obtención y conservación de las muestras

6 Materiales

7 Procedimiento

8 Resultados y control de calidad

9 Nivel de protección

10 Valores tipicos

11 Caracteristicas del ensayo

12 Referencias


VaccZyme™ kit EIA para la determinación de anticuerpos IgG anti-tétanos toxoide

Para uso diagnóstico in-vitro

Código producto: MK010 Fabricado por: The Binding Site Group Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. www.bindingsite.co.uk The Binding Site Spain S.L.U., C/ Balmes 243 4º 3ª, 08006 Barcelona Teléfono 902027750 Fax: 902027752 e-mail: [email protected]

web: www.bindingsite.es VaccZyme™ es una marca de The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK

1 UTILIZACÍON

Este kit está preparado para la medición in vitro de anticuerpos anti-tétanos toxoide (TTox) IgG específicos presentes en el suero, con el fin de determinar el estado de protección del individuo. El kit contiene suficiente material para realizar máximo 39 tests en duplicado u 87 en tests simples junto con una curva de calibración de 7 puntos y 2 controles. En caso de no requerir una sensibilidad inferior a 0,09 IU/mL puede reducirse los puntos de calibración de la curva de calibración de 7 a 5.

2 INTRODUCCIÓN

Los anticuerpos anti-tétanos-toxoide se forman como reacción a la vacuna con la proteína del tétanos toxoide. La respuesta a la vacunación puede entonces cuantificarse por la determinación en suero de anticuerpos anti-tétanos toxoide por medio de este kit. Pacientes con infecciones recurrentes deberán ser investigados a un posible defecto inmunológico debido a anormalidades del timo y consecuentemente la incapacidad de responder a los antígenos bacterianos específicos1.

3 PRINCIPIO DEL MÉTODO

Los micropocillos están impregnados con antígeno tétanos toxoide. Los calibradores, controles y muestras de paciente diluidas son aplicados a los pocillos y los anticuerpos reconociendo el antígeno de tétanos toxoide se fijan en la primera incubación. Tras el lavado de los pocillos para eliminar todas las proteínas no fijadas, se añade IgG purificada de conejo anti-humano marcada con peroxidasa. El conjugado se fija al anticuerpo humano capturado y el exceso de conjugado no fijado se elimina mediante un segundo lavado. El conjugado fijado se visualiza con tetrametilobenzidina 3,3‟,5,5‟ (TMB) dando un color azul. La intensidad es proporcional a la concentración de anticuerpos en la muestra. Para parar la reacción se añade a cada pocillo ácido fosfórico. Esto produce un color amarillo a punto final, legible a 450nm.

4 PRECAUCIONES

4.1 ADVERTENCIA Los sueros humanos suministrados en el kit han sido sometidos a screening para donantes, resultando negativos a la presencia del antígeno de superficie de la hepatitis B y a la presencia de los anticuerpos de la ante los virus HIV1, HIV2 y HCV. Las técnicas usadas están aprobadas por la FDA (USA) o para el diagnóstico in vitro por la UE (Directiva 98/79/EC, Anexo II). Sin embargo los sobredichos ensayos no garantizan la ausencia de agentes infecciosos. Por lo tanto, deben tratarse los reactivos como potencialmente infecciosos. Tanto la manipulación como los métodos de eliminación de desechos deberán realizarse conforme a la normativa de materiales infecciosos y solo personal adecuadamente instruido deberá efectuar el test. Los componentes del kit contienen azida sódica y ProClin 300 y debe ser manipulados con precaución; use guantes y vestuario protector adecuado en todo momento al manipular este producto. No trague ni permita el contacto con la piel o las mucosas (especilamente si hay heridas). En caso de contacto, lave con abundante agua y consulte a un médico. Con el plomo y el cobre pueden formarse azidas metálicas explosivas. Cuando se elimine el reactivo, lave con mucha agua los recipientes para evitar la acumulación de azida. Los tampones y sueros suministrados con este kit contienen diferentes inhibidores enzimáticos según sigue. Son productos peligrosos y se deben manipular con precaución.

INHIBIDOR CONCENTRACIÓN

Kathon Azida sódica ProClin™ 300

Bromodinitrodioxano Metilisotiazona

0,02% 0,099% 0,045% 0,002% 0,002%

ProClin™ es una marca de Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA

Kathon es un producto irritante y puede producir sensibilización en contacto con la piel. La solución de parada contiene ácido fosfórico 3M. Es irritante y debe evitarse el contacto con la piel y ojos. Los métodos de eliminación de desechos deberán realizarse conforme a la normativa local de materiales infecciosos.

4.2 MEDIDAS DE SEGURIDAD

La manipulación de este producto deberá realizarse solo por personal adecuadamente instruido. Se recomienda seguir estrictamente el procedimiento descrito en estas instrucciones de empleo. De no seguir estas instrucciones, no se pueden garantizar los resultados. Tener especial atención a las “Notas” y advertencias descritas en estas instrucciones. NO SE PUEDEN mezclar reactivos con diferentes números de lote ni utilizar

conjuntamente. En caso de realizar gran cantidad de pruebas, deberá tenerse en cuenta que todos los reactivos sean del MISMO LOTE. Todas las tiras deben proceder del mismo paquete. La sustitución de alguno de los componentes puede conllevar a unos resultados erróneos. Para evitar contaminación utilizar solo fungibles o vidrio nuevos o esterilizados. Nunca volver a echar los reactivos no utilizados a las botellas. No dejar las botellas de reactivos destapadas. La posible evaporación o

contaminación puede conllevar a resultados erróneos. El substrato TMB no se debe exponer a luz o agua. No deben emplearse suero contaminado microbiologicamente, hemolizado o muy lipémico así como aquellas muestras que contengan partículas en suspensión. La dilución incorrecta no se puede comprobar ya que los controles del kit están listos para usar. Se recomienda utilizar pipetas calibradas y muestras internas con Control de Calidad. Al usar sistemas de ensayo automatizados, diluyentes de muestra y otros equipos automáticos, siga con atención las instrucciones del fabricante. Se debe tener especial cuidado con la configuración e instalación del equipo y la conexión a servicios externos. Se deben seguir con atención todos los parámetros de los lectores y de los aclaradores automáticos y seguir las instrucciones del fabricante para el mantenimiento del equipo. 4.3 Almacenamiento y estabilidad El kit debe almacenarse entre 2 y 8ºC y no debe congelarse. Un almacenamiento

inapropiado afectará a los resultados. El tampón de lavado diluido puede almacenarse en un recipiente limpio a temperatura ambiente por un tiempo máximo de 4 semanas. La fecha de caducidad del kit se indica en la etiqueta exterior.

5 OBTENCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS

Las muestras de sangre deben provenir de extracciones venosas, se dejan coagular naturalmente, separando después el suero. El suero debe almacenarse entre 2-8°C hasta 48 horas antes del análisis. Para una conservación más prolongada se recomienda congelar las muestras sin diluir a -20°C o menos. Evitar repetidas congelaciones y descongelaciones. Las muestras de suero no deben

inactivarse por calor, ya que esto daría resultados falsos positivos.

6 MATERIALES

6.1 MATERIALES SUMINISTRADOS 6.1.1 Hoja de instrucciones: Detallada. 6.1.2 Certificado QC: Indicando los resultados esperados del lote. 6.1.3 T.Tox Coated Wells (Pocillos tapizados con T.Tox): 12 tiras de 8 pocillos

cada una separables impregnados con tétanos toxide derivado de Clostridium tetani. Cada placa está envasada en una bolsa reutilizable conteniendo 1 desecante.

6.1.4 Sample Diluent (Diluyente muestra): 2 botellas (amarillas) con 50mL cada una de tampón para diluir las muestras. Listo para usar.

6.1.5 Wash Buffer (Tampón de lavado): 1 botella con 50mL de tampón con una concentración 20 veces para el lavado de los pocillos.

6.1.6 T.Tox IgG Calibrators (Calibrador(es) IgG T. Tox): 7 botellas con 1,2mL

cada una de suero humano diluido con las siguientes concentraciones de anticuerpo anti-tétanos toxoide: 7; 2,33; 0,78; 0,26; 0,09; 0,03; 0,01 IU/mL. Listo para usar.

6.1.7 T.Tox IgG High Control (Control alto IgG T.Tox): 1 botella conteniendo

1,2mL de suero humano diluido. El valor esperado se indica en el certificado QC. Listo para usar.

6.1.8 T.Tox IgG Low Control (Control bajo IgG T.Tox): 1 botella conteniendo

1,2mL de suero humano diluido. El valor esperado se indica en el certificado QC. Listo para usar.

6.1.9 T.Tox IgG Conjugate (Conjugado IgG T.Tox): 1 botella (roja) conteniendo 12mL de anticuerpo purificado marcado con peroxidasa anti IgG humana. Listo para usar.

6.1.10 TMB Substrate (Substrato TMB): 1 botella conteniendo 14mL de substrato TMB. Listo para usar.

6.1.11 Stop Solution (Solución de parada): 1 botella conteniendo 14mL de ácido fosfórico 3M. Listo para usar.

6.2 MATERIAL ADICIONALMENTE NECESARIO, pero no suministrado 6.2.1 Lavador automático de microplacas: Es sólo una recomendación, ya que

puede realizarse manualmente. 6.2.2 Lector de placas: Capaz de medir densidades ópticas a 450nm calibrado

al aire. 6.2.3 Agua destilada o desionizada: esta debe ser de la máxima calidad posible.

6.2.4 Micropipetas calibradas: Para dispensar 1000, 100 & 10L.

6.2.5 Pipeta multicanal: Recomendada para dispensar volúmenes de 100L. 6.2.6 Tubos de vidrio/plástico: Para dilución de las muestras.

7 PROCEDIMIENTO

7.1 PASOS PREVIOS

1. Atemperar a temperatura ambiente El kit está diseñado para trabajar a temperatura ambiente (20-24°C). Sacar el kit de su embalaje y dejar a temperatura ambiente durante aproximadamente 60 minutos. Los pocillos no deben sacarse de su embalaje antes de alcanzar la temperatura ambiente. Nota: Este kit puede mantenerse a temperatura ambiente hasta 1 semana.


2. Componentes del kit Mezclar con cuidado cada componente del kit antes de usar. 3. Dilución tampón de lavado Añadir 50mL del tampón de lavado concentrado a 950mL de agua destilada (dilución 1 en 20) en un contenedor limpio y mezclar. Se pueden diluir volúmenes más pequeños según sea adecuado. Nota: El tampón de lavado diluido debe conservarse a temperatura ambiente durante un máximo de 4 semanas; diluya, por lo tanto, solamente la cantidad necesaria. 4. Dilución de muestra

Diluir 10L de cada muestra con 1000L de diluyente (1:100) y mezclar bien. Se pueden diluir volúmenes más pequeños según sea adecuado. Nota: Las muestras diluidas tienen que emplearse dentro de 8 horas. 5. Manipulación de las tiras y el marco Colocar el número necesario de pocillos en el contenedor de tiras. Desde la posición del pocillo A1 rellenar las columnas de izquierda a derecha. Mientras se manipula la placa, apretar los cantos largos del marco para evitar que los pocillos se salgan. Nota: Devolver inmediatamente a la bolsa los pocillos no utilizados con los desecantes y cerrar fuertemente con el fin de minimizar la exposición a la humedad. Tener cuidado de no punzar o rasgar la bolsa. ADVERTENCIA: La exposición de los pocillos a la humedad o contaminación por polvo u otras partículas conlleva a una degradación del antígeno llegando a obtener resultados imprecisos y potencialmente falsos. 7.2 PROCEDIMIENTO Mantener la misma secuencia de dispensación durante todo el test. 1. Adición de la muestra

Aplicar 100L de cada de calibrador, control y muestra diluida (1:100) a los pocillos correspondientes. Nota: Las muestras deben aplicarse lo más rápido posible para minimizar la deriva del análisis, y poner en marcha el cronómetro después de la adición de la última muestra. Incubar 30 minutos a temperatura ambiente. 2. Lavado El proceso de lavado es crítico y requiere una atención especial. Una placa lavada impropiamente conlleva a obtener unos resultados inexactos con escasa precisión y elevados valores de fondo.

Tras la incubación sacar la placa y lavar los pocillos 3 veces con 250-350L de tampón de lavado por cada pocillo. Lavar la placa con un lavador de placas automático o manualmente según las siguientes indicaciones. Si se realiza el lavado automático, invertir la placa al final del lavado y sacudir los pocillos sobre papel absorbente. Las placas pueden lavarse manualmente según sigue: a. Verter el contenido de placa al fregadero. b. Sacudir los pocillos sobre papel absorbente hasta que se sequen.

c. Echar en cada pocillo 250-350L de tampón de lavado utilizando una pipeta multicanal.

d. Con cuidado agitar la placa sobre una superficie plana. e. Repetir a-d dos veces. f. Repetir a y b. 3. Adición del conjugado

Pipetear 100L de conjugado a cada pocillo, secar la parte superior del pocillo con un pañuelo de papel para eliminar salpicaduras. Nota: Para evitar contaminación, nunca devolver el exceso de conjugado a la botella. Incubar 30 minutos a temperatura ambiente. 4. Lavado

Repetir punto 2. 5. Adición del substrato (TMB)

Pipetear 100L de substrato TMB en cada pocillo, secar la parte de arriba de los pocillos con un pañuelo de papel para eliminar salpicaduras. Nota: Para evitar contaminación, nunca devolver el exceso de TMB a la botella. Incubar 30 minutos a oscuras y a temperatura ambiente.

6. Parada

Pipetear 100L de la solución de parada en cada pocillo. Esto dará un cambio de color de azul al amarillo. 7. Medición de la densidad óptica

Leer la densidad óptica (DO) de cada pocillo a 450nm en un lector de microplacas en los siguientes 30 minutos a la reacción.

8 RESULTADOS Y CONTROL DE CALIDAD

1. Control de calidad Para que el test sea válido este debe cumplir con los siguientes criterios:

Cada serie debe incluir los controles positivo y negativo.

Los valores obtenidos deben estar dentro los rangos especificados en el Certificado QC.

La forma de la curva debe ser similar a la curva de calibración indicada en el Certificado QC.

Si no se cumplen los criterios anteriormente citados, el test no es válido y se debe repetir. 2. Cálculo de la medias de las densidades ópticas (Solo para ensayos

que se lleven a cabo en duplicado) Calcular la media de la DO para cada calibrador, control y muestra. El porcentaje del coeficiente de variación (% CV) para cada DO en duplicado debe ser inferior de 15%.

3. Trazado de la curva de calibración La curva de calibración puede trazarse automática o manualmente según sigue trazando la concentración de anticuerpo anti-tétanos toxoide IgG sobre la escala logarítmica contra la DO de la escala lineal para cada calibrador:

Automáticamente – usar un software validado apropiado y la curva será la más idónea a los datos que correspondan.

Manualmente – utilizando papel logarítmico dibujar una línea suave a través de los puntos (no una línea recta o punto a punto).

4. Tratamiento de puntos anómalos En caso de que alguno de los puntos esté fuera de la línea, este se puede eliminar. Si la ausencia de este punto significa que la forma de la curva no es similar a la curva de calibración de la muestra o si más de un punto aparece anómalo, el test debe repetirse. 5. Cálculo de los valores de control Leer el nivel de auto anticuerpo anti-tétanos toxoide IgG de la curva de calibración. Los valores deben estar dentro de los rangos indicados en el Certificado QC. 6. Cálculo de los niveles de autoanticuerpos en muestras diluidas Leer el nivel de auto anticuerpo anti-tétanos toxoide IgG de las muestras diluidas directamente de la curva de calibración. Nota: Los valores del calibrador han sido ajustados con un factor 100 considerando una dilución de muestra del 1:100, por lo tanto no se requiere una posterior conversión. 7. Calibración del test El test se ha calibrado contra un calibrador de referencia NIBSC 79/589 suministrada de Nacional Institute for Biological Standards and Control (NIBSC: nibsc.ac.uk). 8. Limitaciones

Muestras de pacientes con vacunación previa o posterior deberán ser testadas simultáneamente. El kit es para el apoyo en el diagnostico. Un resultado positivo sugiere determinada enfermedad que debe confirmarse con otros análisis serológicos y clínicos. Los resultados obtenidos con este test no es una prueba confirmatoria de falta de protección / protección de tétanos o la presencia o ausencia de inmunodeficiencia.

9 NIVEL DE PROTECCIÓN

En una población normal, la literatura indica un nivel de anticuerpos de protección de entre 0,01 y 0,15 IU/mL2,3,4. El estudio más grande realizado en EE.UU.2, incluyó un colectivo de 10618 individuos con una edad de a partir de 6 años. En su totalidad, el 69,7% tenían una concentración de anticuerpos de >0,15 IU/mL. En el tramo de edad de 6 a 11 años el 87,7% mostraban anticuerpos y los mayores de 70 años solo el 27,8% tenían anticuerpos. Los resultados de otros dos estudios3,4 dieron una protección con una concentración de anticuerpos de 0,01 IU/mL. Dado a las grandes diferencias citadas, recomendamos que cada laboratorio establezca su propio rango normal de protección.

10 VALORES TÍPICOS

La concentración de anticuerpos anti-tétanos toroide IgG se determinó en sueros de 100 donantes de sangre normales (con desconocimiento si existía vacunación o estado inmunológico). Los resultados se han resumido en el grafico siguiente. Estos valores son a titulo orientativo y no deberán emplearse para determinar el rango normal. Se determinó un rango normal empleando el kit tétanos toxoide (MK010) de The Binding Site. Ver referencia 5.

11 CARACTERÍSTICAS DEL ENSAYO

11.1 PRECISIÓN

La intra- e inter-precisión se midieron utilizando tres muestras dentro del rango de la curva de calibración. La concentración media y el % C.V. para cada muestra se indica seguidamente:

PRECISIÓN INTRA-ENSAYO

Muestra n = 16 Concentración media IU/mL % CV

Muestra 1 4,05 2,31

Muestra 2 1,21 2,65

Muestra 3 0,51 5,06

PRECISIÓN INTER-ENSAYO

Muestra n = 18 Concentración media IU/mL % CV

Muestra 1 3,77 8,81

Muestra 2 0,98 7,99

Muestra 3 0,47 5,63

11.2 SENSIBILIDAD ANALÍTICA La sensibilidad analítica se determinó de la concentración media +2 SD de 16 determinaciones de diluyente de muestra. Esto equivale a 0,0093 IU/mL.

0 5

10 15 20 25 30

Cantidad der de muestras

Anti-T.Tox IgG IU/mL


11.3 RANGO DE MEDICIÓN El rango de medición del test es de 0,01 – 7 IU/mL. 11.4 SUBSTANCIAS INTERFERENTES Se han añadido una serie de sustancias interferentes en algunos sueros para probar los posibles efectos interferentes. El método utilizado para verificar estas

substancias se basó en el kit Interference Check A plus - Kokusai Shiyaku, Japón.

Sustancia Concentración

Bilirrubina F (libre) 183mg/mL

Bilirrubina C (conjugado) 190mg/mL

Hemoglobina hemolizada 4900mg/mL

Quilo 19300 unidades

Factor reumatoide 500 IU/mL

No se observaron interferencias con bilirrubina F o C, hemoglobina hemolizada, lípidos o factores reumatoides.

12 REFERENCIAS





4. Ramsay M. E. B et al. Persistence of antibody after accelerated immunisation with diphtheria / tetanus / pertussis vaccine. British Medical Journal, 1991; 30 2: 1489-1491.

5. Schauer U. et al. Levels of antibody specific to Tétanos toxoid, Haemophilus influenzae type b, and Pneumococcal Capsular Polysaccharide in healthy children and adults. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Mar 2003: 202-207.

contents vacczyme anti-tetanus toxoid igg enzyme ...peramed.com/peramed/docs/mk010_enn.pdf ·...

Documents