cómo se conecta la olfacción

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rEVISIÓN

Introducción: una breve presentación del sistema olfativo y su desarrollo

El circuito básico en el sistema olfativo en los ma-míferos (Fig. 1) comienza en las neuronas sensiti-vas olfativas (NSO) del epitelio olfativo (EO), una estructura que se desarrolla a partir de la placoda olfativa durante la embriogénesis [1,2]. Los axones de las NSO forman el nervio olfativo, que proyecta al bulbo olfativo (BO), una evaginación del telen-céfalo, y establecen sinapsis con las dendritas api-cales y las células mitrales y empenachadas, dando lugar así a los glomérulos del BO. Cada una de las, aproximadamente, cinco millones de NSO presen-tes en la cavidad nasal de un roedor expresa de modo exclusivo uno de los 1.300 distintos genes de los re-ceptores olfativos existentes [1,2], mientras que aque-llas NSO que expresan un mismo gen de receptores olfativos se encuentran distribuidas al azar dentro de la propia cavidad nasal, y sus axones proyectan selectivamente a sólo entre 1 y 4 de los 2.000 glo-mérulos existentes en el BO, reflejando la precisión de la convergencia de los axones de los nervios ol-fativos [1,2].

Los axones primarios de las neuronas de proyec-ción del BO (células mitrales y empenachadas) cre-cen preferentemente hacia una región muy estrecha de la parte ventrolateral del telencéfalo para formar el tracto olfativo lateral (TOL), que se coloca justo bajo la superficie pial [1,2]. Los axones de las célu-las mitrales del bulbo olfativo accesorio (BOA; véa-se más adelante para más detalles) están localizados en la capa más profunda del TOL, segregados de los axones de las neuronas de proyección del BO, las cuales son las primeras generadas tan profunda-mente y que, a su vez, generan nuevas neuronas en la capa más superficial del TOL, entre E11,5 y P1-P3 en el ratón [3,4]. Los axones del TOL emiten ra-mificaciones colaterales que alcanzan sus áreas de destino, en lo que se conoce comúnmente como la corteza olfativa primaria, y que contiene, principal-mente, las siguientes estructuras (de anterior a pos-terior): el núcleo olfativo anterior, el tubérculo olfa-tivo, la corteza piriforme, varios núcleos amigdali-nos y la corteza entorrinal [1,2]. Inicialmente se creía en la existencia de un mapa estereotípico del EO en la corteza olfativa a través del BO, es decir, que las aferencias desde las NSO que expresan el

¿Cómo se conecta la olfacción? Mecanismos celulares y moleculares que dirigen el desarrollo de las conexiones sinápticas desde la nariz a la corteza (I)

Diego García-González, Fernando de Castro

Resumen. Dentro del conjunto del sistema nervioso central, el sistema olfativo resulta fascinante por sus particularidades fisiológicas durante el desarrollo, siendo uno de los modelos más estudiados para entender los mecanismos relacionados con la guía y el crecimiento axonal hacia sus objetivos apropiados. Se conoce una constelación de mecanismos, unos mediados por contacto (lamininas, moléculas de adhesión celular, efrinas, etc.) y otros secretables (semaforinas, slits, factores de crecimiento, etc.), por desempeñar diversas funciones en el establecimiento de las interacciones sinápticas entre el epitelio olfativo, el bulbo olfativo y la corteza olfativa. También se han propuesto al respecto otros mecanismos específicos de este sistema, incluida la increíble familia de cerca de 1.000 receptores olfativos distintos. En los últimos años, diferentes revisiones se han concentrado en los elementos parciales de este sistema, sobre todo en los mecanismos implicados en la formación del nervio olfativo, echándose en falta una revisión detallada de aquellos relacionados con el desarrollo de las conexiones entre las distintas estructuras olfativas (epitelio, bulbo y corteza). En esta primera parte de la revisión, abordamos este tema desde el siguiente enfoque: los diversos mecanismos celulares y moleculares que dirigen la formación del nervio olfativo y el tracto olfativo lateral.

Palabras clave. Bulbo olfativo. Corteza olfativa. Guía axonal. Migración de interneuronas. Moléculas de adhesión celular. Quimiotropismo. Sistema olfativo accesorio.

Grupo de Neurobiología del Desarrollo (GNDe). Hospital Nacional de Parapléjicos. Toledo, España.

Correspondencia: Dr. Fernando de Castro Soubriet. Grupo de Neurobiología del Desarrollo (GNDe). Unidad de Neurología Experimental. Hospital Nacional de Parapléjicos. Finca La Peraleda, s/n. E-45071 Toledo.

E-mail: [email protected]

Financiación:Trabajo financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación- MICINN (SAF2005-28387E, SAF2007-65845), parcialmente con FEDER, la Consejería de Sanidad (ICS06024-00) de la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha y FISCAM (PI2007-66, GCS2006-C24 y G-2008-C8). D.G.G. está contratado por PI2007-66, y F.D.C., por SESCAM.

Aceptado tras revisión externa: 03.09.10.

Cómo citar este artículo:García-González D, De Castro F. ¿Cómo se conecta la olfacción? Mecanismos celulares y moleculares que dirigen el desarrollo de las conexiones sinápticas desde la nariz a la corteza (I). Rev Neurol 2011; 52: 477-88.

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D. García-González, et al

mismo mapa receptor se proyectan con precisión hasta los grupos de neuronas diana en la corteza. Sin embargo, este concepto se encuentra bajo dis-cusión en la actualidad [5]. La definitiva formación de las capas del BO depende de la llegada de los precursores neuronales que migran de forma tan-gencial desde la zona subventricular telencefálica, que darán lugar a las futuras interneuronas del BO, las únicas células de esta estructura que se generan fuera de ella [1,2].

Entre los diferentes elementos de la corteza olfa-tiva primaria se desarrolla un complejo patrón de interconexiones, pudiéndose distinguir los siguien-tes elementos [6]: – Proyecciones corticocorticales locales e intrarre-

gionales asociadas.– Proyecciones extrínsecas desde el núcleo olfati-

vo anterior, la corteza piriforme y la corteza en-torrinal lateral que proyectan de vuelta al BO, tanto ipsi como contralateralmente.

– Proyecciones contralaterales hacia otras regio-nes de la corteza olfativa primaria, incluso las fi-bras comisurales, principalmente desde las zo-nas más rostrales de la corteza piriforme hacia la corteza contralateral.

– Proyecciones extrínsecas hacia el neocórtex (cor-tezas insular y orbitofrontal), el núcleo talámico mediodorsal y el hipotálamo.

Esta organización del sistema olfativo que aparece durante el desarrollo se ha explicado hasta la fecha por dos hipótesis contrapuestas. Por un lado, la teoría del ‘protomapa’ predice que el EO, el BO y la corteza olfativa primaria se organizan simultánea e independientemente, a través de un programa de desarrollo intrínseco de cada estructura, posible-mente mediante moléculas determinantes de su desarrollo [1,2,7]. Por otro lado, la teoría del proto-córtex afirma que dicho desarrollo depende de ele-mentos extrínsecos [1] y predice que el desarrollo del BO sería un proceso secundario, dependiente de la llegada de las fibras de las NSO desde el EO, y que la consiguiente llegada de fibras del TOL a la corteza olfativa sería necesaria para inducir la dife-renciación en esta región cortical. Hace algunos años revisamos en detalle el conjunto de datos ex-perimentales que sugerían que la hipótesis del pro-tomapa explica cómo se desarrolla la corteza olfa-tiva, bajo una influencia del epitelio olfativo sobre el BO únicamente relevante una vez que las men-cionadas estructuras (epitelio, bulbo y corteza) se han generado independientemente [1,2]. En este mismo sentido, los abordajes genéticos más recien-tes, como ratones con una ‘nariz monoclonal’ (en la cual más del 95% de las NSO expresan un único receptor olfativo), parecen confirmar que los me-canismos intrínsecos del BO son responsables de la formación de los glomérulos [8], y tan sólo se observa una influencia secundaria desde los axo-nes de las NSO, que, al secretar un miembro de la familia de TGF, induce de un modo selectivo el crecimiento de dendritas desde las células mitrales y empenachadas [9].

En los trabajos citados anteriormente, y como una herramienta fundamental para nuestro propó-sito, resumimos los principales acontecimientos propios del sistema olfativo, situándolos en una es-cala temporal relativa para rata y ratón, con el fin de ofrecer de este modo una referencia para posterio-res investigaciones [1,2]. En resumen, la cronología del desarrollo del sistema olfativo en el ratón podría considerarse como se muestra en la figura 1:– La placoda olfativa y las primeras evidencias de

neurogénesis del futuro EO comienzan alrededor

Figura 1. Representación esquemática de la neurogénesis y axonogénesis en el sistema olfativo. La neu-rogénesis de las neuronas sensitivas olfativas, mitrales y en la corteza olfativa comienza a E9-9,5, E11 y E10, respectivamente. La axonogénesis de las células mitrales se desencadena en E11,5, antes de la llega-da de axones del nervio olfativo a la superficie telencefálica (E12). Las células mitrales desarrollan dendri-tas en el momento en que los primeros axones entran en el bulbo olfativo (E13,5). Los axones del tracto olfativo lateral emiten colaterales que invaden sus objetivos corticales sobre E14,5/15. La generación de células en cada compartimento se genera de modo independiente, presumiblemente debido a mecanis-mos de control intrínsecos (hipótesis del protomapa).


Mecanismos celulares y moleculares que dirigen el desarrollo de las conexiones sinápticas desde la nariz a la corteza

de E9,5, mientras que las primeras neuronas se generan en el BO a E11 y en la corteza olfativa a E10, respectivamente.

– Antes de E10,5, los primeros axones de las NSO son claramente identificables, pero no se unen para formar un nervio olfativo ya patente hasta E11 y E12; alrededor de E13,5, el nervio olfativo entra al BO para formar sinapsis.

– El TOL se observa por vez primera como tal en-tre E11,5 y E12, cubre la superficie de la corteza olfativa a E13,5 y emite colaterales para coloni-zarla a E14,5.

Debido a la gran variedad de poblaciones celulares y estructuras, falta por recopilarse una escala tem-poral similar para cada elemento de la corteza olfa-tiva. Los axones del nervio olfativo se distribuyen inicialmente de un modo difuso dentro del BO, aunque, en el ratón, comienzan a asociarse topo-gráficamente en determinadas zonas de la capa glo-merular (los protoglomérulos) a E17,5, los cuales se condensan progresivamente y se separan de los otros hasta alcanzar su aspecto característico final de glomérulos olfativos maduros, en un proceso que comprende entre E18,5 y P14 [2].

El objetivo de esta revisión es sintetizar los me-canismos implicados en la generación de las co-nexiones entre las distintas estructuras en el siste-ma olfativo. En cada epígrafe de esta revisión (el nervio olfativo, el TOL y las conexiones intracorti-cales) se resumirá lo que puede considerarse como mecanismos ‘especiales’ (exclusivos y característi-cos de esa proyección axonal), así como todas las señales mediadas por contacto (permisivas y no per-misivas) y las señales a distancia secretables (atra-yentes y repelentes) relevantes para dichos procesos del desarrollo [1,2]. Aunque otras revisiones parcia-les sobre el tema se han publicado previamente [1,2, 10-12], el presente trabajo aporta una revisión ex-haustiva del proceso de guía axonal que conecta el sistema olfativo entero, desde el EO hasta el BO, desde el BO hasta los diferentes elementos de cor-teza olfativa primaria y dentro de ella. Además, tam-bién se presenta una visión general de las bases mo-leculares del desarrollo de la conectividad en el sis-tema olfativo accesorio.

Todos los datos resumidos en este artículo se presentan en la tabla. Con el fin de añadir agilidad al texto, no nos referiremos a los patrones tempora-les de expresión de las distintas moléculas tratadas a lo largo del texto, excepto en aquellos casos en los que dichos patrones difieran de la escala temporal propia de los principales eventos recopilados en el resto del texto y en previas revisiones [1,2].

Del epitelio olfativo al bulbo olfativo: mecanismos celulares y moleculares implicados en la formación del nervio olfativo

Como ya se destacó anteriormente, las NSO son las únicas células que proyectan desde el epitelio olfati-vo hacia el BO, y el conjunto de esos axones consti-tuye el nervio olfativo, cuyas terminaciones nervio-sas forman sinapsis con las dendritas apicales de las células mitrales y empenachadas para dar lugar a los glomérulos del BO. Desde su descubrimiento hace casi 20 años [13], los receptores olfativos constitu-yen una de las familias de genes más fascinantes y mejor conocidas. Como ya se mencionó con ante-rioridad, unos 1.300 genes codifican para los recep-tores olfativos en roedores y cada una de las, aproxi-madamente, cinco millones de NSO de la nariz de un roedor expresa un único receptor olfativo [1,2]. Sin embargo, el número de receptores olfativos en los humanos es sólo de 350 y muestra un cociente de convergencia entre glomérulos y receptores olfativos de 16:1, en lugar de la relación 2:1 que ocurre en el ratón [14]. Los receptores olfativos se expresan antes de la maduración final de las NSO, que viene deter-minada por la expresión de la proteína OMP [15], y se ha propuesto que desempeñan un papel dual y complementario en la selección de NSO:– Por un lado, una NSO que no exprese un recep-

tor olfativo termina muriendo. Este hecho indica la existencia de un mecanismo de selección po-sitiva de NSO que expresen al menos un recep-tor olfativo.

– Por otro lado, la identidad de los axones de las NSO que coexpresan dos receptores olfativos en un mismo momento se encuentra alterada, lo cual provoca defectos en su proyección y en la estabilidad de sus contactos, ejerciendo así una selección negativa para las NSO que expresen más de un receptor olfativo [16].

Del mismo modo, esta segunda propiedad sugiere una función para los receptores olfativos implica-dos en la guía axonal.

En los últimos años, los receptores olfativos han sido identificados en los conos de crecimiento de los axones de las NSO, hecho que conduce a la hi-pótesis de que se encuentran implicados en el reco-nocimiento final de su destino e, incluso, en la na-vegación de los axones hacia el BO, la cual se in-vierte a lo largo del eje anteroposterior en respuesta a los cambios en las señales de AMPc derivadas de los receptores olfativos [17]. Sin embargo, se ha de profundizar todavía en este último fenómeno, pues-to que, en la actualidad, no queda del todo claro el



mecanismo por el cual los receptores olfativos po-drían determinar la identidad de los conos de creci-miento de las NSO. Así, los receptores olfativos se encontrarían implicados, como máximo, en los procesos finales de formación de la proyección des-de el epitelio olfativo al BO, por medio de interac-

ciones homofílicas y heterofílicas que pudieran es-tablecer con las dianas, dando lugar así a lo que ha sido bautizado como ‘modelo contextual de creci-miento axonal’ [18,19]. El único medio por el cual los receptores olfativos podrían influir en otros as-pectos del comportamiento de las NSO es a través

Tabla. Efectos comparativos de moléculas en la formación del nervio olfativo, el tracto olfativo lateral y las conexiones intracorticales de la corteza olfativa.

Nervio olfativo Tracto olfativo lateral Intracortical Sistema olfativo accesorio

Mecanismos especiales Receptores olfativos: no claro Lot1 + células guidepost – –

Mecanismos mediados por contacto

OCAM: cambios menores NCAM, NrCAM, OCAM NrCAM: ACa –

NrCAM, CLH1: guía axonal alterada (±TAG-1): no demostrado Desfasciculado y desplazado

Cadherina/Protocadherina-2: no claro – Celsr3: AC formada –

EfrinaA3, EfrinaA5: cambios menores

Efrinas: sin efecto

EphA4: ACa desplazada EphB2: mezclada ACa y ACp Nuk, Sek4 (Eph-relacionadas): sin efecto

–

Sema7A: sugerido (a través de PlexinaC1) y otras

Sema7A: orientación, crecimiento > colateralización

–Sema7A: sugerida en el OVNS (vía PlexinaC1 y otras)

Otros: Glucanlactosamina: guía axonal BIG-2/Contactina-4: sugerido Reelina: sin efecto

Otros: Laminina: crecimiento axonal Fibronectina: crecimiento axonal Anosmina-1: crecimiento axonal, atrayente < colateralización

Otros: COUP-TF1: acumulación de axones en AC, pero no en ACa

Otros: Lectina/carbohidratos: sugeridos en el NVN Reelina: sin efecto en el NVN

Moléculas secretadas

Sema3A (a través de Neuropilina-1)

Sema3A: sin efecto Sema3B: atrayente Sema3F: repelente

Sema3A: sin efecto Sema3B: ACa desfasciculada y desplazada Sema3F: ACa desfasciculada y desplazada vía Neuropilina-2 (no 1) PlexinaA4: ACa ausente

Sema3F (a través de Neuropilina-2): efectos menores en el NVN

Slit-1/Robo-2: segregación zonal Slit-1 + Slit-2 (a través de Robo-1 y Robo-2): importantes

Slit-2: repelente Slit-1−/−; Slit-2−/−: LOT no formado (fenotipo más acusado que Robo-1−/−; Robo-2−/−)

Slit-1−/−; Slit-2−/−: axones mal dirigidos

Slit-1: repelente del NVN, axones dirigidos al BO posterior

Netrina-1/DCC: sin efecto Netrina-1: sin efectoNetrina-1/DCC: AC ausente o gravemente afectado (TRIO involucrado)

–

Ácido retinoico: elongación axonal – –

Wnt5a: elongación axonal – Wnt/Frizzled-3: AC ausente –

IGF-1: atrayente (NSO llegan al BO lateral)

– –

HGF: crecimiento axonal

CXCR4/SDF-1: sin efecto

ACa: parte anterior de la comisura anterior; ACp: parte posterior de la comisura anterior; BO: bulbo olfativo; CA: comisura anterior; HGF: factor de crecimiento hepatocítico; NSO: neurona sensitiva olfativa; NVN: nervio vomeronasal; OVNS: órgano vomeronasal.



de la cascada de señalización de AMPc acoplada a proteínas G [20] o a otros mecanismos que produz-can AMPc a través del nervio olfativo [5]. De este modo, más adelante estudiaremos cómo la activi-dad de una célula puede influir en la formación del nervio olfativo más detalladamente.

Uno de los enigmas relacionados con la forma-ción de la conectividad entre el epitelio olfativo y el BO es que, cuando los axones de las NSO se aproxi-man al supuesto bulbo (fenómeno que ocurre en E14 en la rata), sólo unos pocos axones pioneros al-canzan su objetivo: la gran mayoría de las fibras nerviosas no invade inmediatamente este tejido, sino que lo consigue tras un retraso de varios días. Este período de espera sería tiempo suficiente para que los axones que llegan se acumulen y esperen hasta que, finalmente, entren en el BO cuando éste se vuelva permisivo a su paso [1,2]. Hasta el mo-mento, hay pocas explicaciones moleculares para esta prolongada espera, así como para las molécu-las quimiotrópicas o los mecanismos mediados por contacto involucrados (como las semaforinas o la Netrina-1 secretada) en este proceso [21-23] (para una revisión detallada acerca del papel de las molé-culas de adhesión y secretadas en el proceso de na-vegación axonal de NSO, véase más adelante).

Mecanismos mediados por contacto y formación del nervio olfativo

Además de lo que podría ser considerado como un mecanismo ‘especial’ para la guía y el desarrollo del nervio olfativo –a través de los receptores olfativos (véase más arriba)–, se ha propuesto que distintos mecanismos mediados por contacto pueden influir en el desarrollo del primer par craneal. Hace más de una década, las uniones célula-célula y diversas moléculas de matriz extracelular (tenascina, cadhe-rina) eran candidatas a desempeñar un papel rele-vante en la formación del nervio olfativo [22,24,25]. Entre estas moléculas, tal vez la más importante sea la Tenascina-C, que inhibe la invasión prematura de la capa glomerular durante cuatro días y permite la correcta formación de los glomérulos olfativos a tiempo [26], y la molécula de adhesión de células olfativas (OCAM), cuya expresión debe disminuir en las dendritas de las células mitrales y empena-chadas para permitir así que los axones OCAM+ del nervio olfativo formen sinapsis, y viceversa [27]. Sin embargo, experimentos recientes han mostrado que, modificando la expresión de OCAM (tanto en animales knock-out como en transgénicos de sobre-expresión), sólo se provocan cambios menores en la compartimentalización de los axones de las NSO

en el propio BO, además de un incremento en el número de glomérulos del BO inervados por axo-nes de NSO heterogéneas, aunque no en su conver-gencia hacia la estructura de destino [28,29].

Se ha propuesto que la forma de NCAM que con-tiene ácido polisiálico, PSA-NCAM, desempeña un papel destacado en el crecimiento de los axones de las NSO inmaduras y en el ensamblaje inicial del nervio olfativo [12,30-32]. La mutación nula de ge-nes que codifican para moléculas de reconocimien-to celular de la familia L1, como CHL1 y NrCAM, alteran la guía axonal del nervio olfativo, aunque en el ratón doble mutante CHL1−/−/NrCAM−/− no se apreció incremento en el fenotipo debido a cada una de las mutaciones [33]. Del mismo modo, la re-ciente detección en el sistema olfativo de moléculas de adhesión dependientes de calcio, como las cad-herinas [24] y, especialmente, la protocadherina-20 en NSO apenas diferenciadas [34], han abierto nue-vas perspectivas a la hora de explicar la formación del nervio olfativo. También se ha mostrado que la mutación defectiva del gen que codifica para la en-zima que produce la glucanlactosamina (β1,3-N’-acetilglucosaminil transferasa 1-GnT1-β3GnT1) re-sulta en un crecimiento normal de los axones olfati-vos hacia el BO, a pesar de que, al menos algunas de ellas (las que inervan los glomérulos P2 e I7), no penetren en el BO [35]. En consecuencia, bajo estas condiciones no se forman sinapsis con los elemen-tos receptores de los glomérulos del BO [35].

Estos descubrimientos parecen ser los más rele-vantes en relación con el papel que tienen los meca-nismos mediados por contacto en la formación de las proyecciones desde el epitelio olfativo hacia el BO. Las efrinas son, sin embargo, otra familia clási-ca de moléculas de adhesión/contacto que podrían cumplir una función secundaria en la formación del nervio olfativo. Efectivamente, la mutación de-fectiva de efrinaA3 y efrinaA5, expresadas ambas en los axones de las NSO, apenas altera la fina con-vergencia de los axones hacia los glomérulos co-rrectos dentro del BO [36], de acuerdo con la fun-ción de estas moléculas en la formación de proyec-ciones topográficas en otros sistemas sensoriales [37,38]. Se ha demostrado recientemente que BIG-2/ contactina-4, una glucoproteína de la superfami-lia de las inmunoglobulinas, está expresada por una subpoblación de NSO, y que dicha expresión se en-cuentra íntimamente correlacionada con la expre-sión de los receptores olfativos. De acuerdo con esto, en ratones BIG-2–/–, las NSO que expresan el mismo receptor olfativo a menudo inervan múlti-ples glomérulos en localizaciones ectópicas, lo que sugiere que dicha molécula axonal desempeña un



papel crucial en la formación y mantenimiento de un mapa de olores funcional en el BO [39]. Resulta interesante que, a partir de la combinación diferen-cial de sólo seis marcadores axonales expresados por las NSO, incluyendo los mencionados anterior-mente [35,36,40] junto con la Neuropilina-1, un re-ceptor de las semaforinas secretadas [41], y Kirrel-2 y Kirrel-3, nuevos miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas [42], surgen 700 combinacio-nes posibles de ‘identidades moleculares’ para los glomérulos del BO, lo que concuerda, casi a la per-fección, con los 1.000 diferentes tipos de receptores olfativos descritos hasta la fecha [11]. Sin embargo, aunque estas moléculas podrían intervenir en el es-tablecimiento de ciertos grandes dominios en el in-terior del BO, no parecen participar en la navega-ción de axones del nervio olfativo hacia los glomé-rulos, con la excepción de la Neuropilina-1 (véase más adelante). Además, una vez ya dentro del BO, es posible que su actividad intrínseca contribuya a reafinar las conexiones iniciales ya establecidas.

Moléculas secretadas implicadas en el desarrollo del nervio olfativo

Datos recientes parecen apuntar a lo necesarias que son las señales secretables en la formación del ner-vio olfativo desde el BO [43]. Los primeros estudios relacionados con la importancia que las moléculas secretables tienen en la formación del nervio olfati-vo se concentraron en una potente semaforina qui-miorrepelente, la Sema3A, en cuya ausencia se dis-torsiona la convergencia de los axones de las NSO hacia sus respectivos glomérulos, efecto que parece mediado por Neuropilina-1 [41,44,45]. La actividad conjunta de otros dos quimiorrepelentes, Slit-1 y Slit-2, parece controlar la correcta convergencia de los axones olfativos en el BO [46,47], probablemente vía sus receptores Robo-1 y Robo-2 (expresados en un gradiente dorsomedial-ventrolateral decreciente a través del EO). Efectivamente, la mutación de Slit-1 o Robo-2 produce alteraciones regionales lateroven-trales en la proyección del nervio olfativo hacia el BO, mientras que una única mutación de los otros miembros de estas familias sólo genera anomalías menores, quizá por el alto grado de redundancia [46].

En Drosophila, se ha propuesto que el código de los tres robos controla el patrón de las proyecciones de las NSO a los glomérulos del lóbulo olfativo [48]. No obstante, Robo-2 no se expresa en mamíferos en todas las NSO, células en las que todavía no se ha identificado un código combinatorio de robos. Además, aunque Robo-1 no se exprese en las NSO, su knock-out, junto con el de Robo-2, presenta un

fenotipo más pronunciado [46,47]. Por todo ello, estos datos sugieren un papel relevante del sistema Slit/Robo en la guía de los axones de los nervios ol-fativos durante el desarrollo.

Dos morfógenos potentes activos durante el de-sarrollo temprano del sistema nervioso central, el ácido retinoico y Wnt5a, se ha visto recientemente que son necesarios para que las NSO extiendan sus axones. Mientras que el primero de ambos fue es-tudiado en ratones a E14 [43], el segundo se vio que desempeña un papel relevante en este proceso des-de los primeros instantes de la formación del nervio olfativo (E10 en ratón) hasta el adulto [49]. La lista se ve completada con dos factores de crecimiento que, recientemente, se ha demostrado que actúan en el desarrollo del nervio olfativo; mientras que el factor de crecimiento hepatocítico (HGF) es nece-sario para el correcto crecimiento de los axones de las NSO [50], el factor de crecimiento de insulina (IGF) atrae selectivamente los axones de las NSO para que inerven el BO lateral [51].

Cabe destacar que otras moléculas que desem-peñan importantes papeles en migración celular y guía axonal durante el desarrollo del sistema ner-vioso central para nada afectan a la formación del nervio olfativo, como la quimiocina CXCR4/SDF-1 [52]. Sin embargo, esta molécula modula la migra-ción de las neuronas GnRH+ a lo largo de este ner-vio hacia el hipotálamo [53]. Éste es el caso también de la Netrina-1, la cual está expresada en el sistema olfativo durante el desarrollo y que, a través de DCC, influye en la migración de neuronas GnRH+ por el nervio olfativo, aunque aún no se haya de-mostrado fehacientemente que esta molécula dirija el crecimiento de axones de las NSO [44].

Finalmente, la activación de los receptores de ácido γ-aminobutírico del tipo B por las NSO desde E16 hasta la etapa adulta es un mecanismo fisioló-gico que limita el crecimiento de los axones de las NSO según entran al BO, y son activados por el áci-do γ-aminobutírico liberado por las células yuxta-glomerulares [54].

Los datos más relevantes relacionados con este epígrafe se resumen en la figura 2.

Actividad y desarrollo del nervio olfativo

El papel de la actividad de los conos de crecimiento axonales en la guía axonal ha sido estudiado extensi-vamente en la última década [55]. Respecto al ner-vio olfativo, su actividad ha sido analizada a través de distintos ratones knock-out, aunque aún no se han extraído conclusiones claras [20]. En este senti-do, los axones de las NSO convergen normalmente



en los glomérulos del BO en el ratón mutante knock-out de la subunidad GOLF de la proteína G [56], ha-biendo sido observados defectos menores sólo cuan-do la subunidad activable por nucleótidos cíclicos (OCN1) se encuentra delecionada [57]. La deleción de la adenililciclasa 3 (Ac3) produce una desorgani-zación mayor de la convergencia de las fibras olfati-vas hacia los glomérulos correctos [58,59], lo que podría deberse, al menos en parte, al hecho de que las NSO de estos ratones Ac3–/– carezcan de Neuro-pilina-1 [58]. Del mismo modo, se ha propuesto que se requiere la producción de AMPc debido a la acti-vación de la proteína G para la convergencia de NSO hacia el glomérulo apropiado [20].

Otros efectos contradictorios se han apreciado bloqueando distintos canales de potasio. Mientras que la mutación defectiva del canal de potasio shaker, Kvi.3, apenas altera la precisión de la pro-yección de las NSO al BO durante el desarrollo postnatal (P0-P41), pero no su guía hacia el BO [60], la sobreexpresión del canal rectificativo de corrien-te interna Kir2.1 bloquea la actividad del receptor olfativo y produce importantes cambios en el desa-rrollo del nervio olfativo [61].

Aunque la supervivencia de las NSO dependa de su actividad, no parece ser determinante el papel que las NSO podrían cumplir en el desarrollo del nervio olfativo y en la correcta navegación de los axones de las NSO hacia los glomérulos del BO [19]. Este hecho es más marcado cuando considera-mos que la actividad de las NSO regula la expresión de receptores del tipo Neuropilina-1 (tanto me-diante niveles citoplasmáticos de AMPc como por la deleción de Ac3) [58,62]. Efectivamente, los cam-bios en la expresión de los receptores de moléculas quimiotrópicas o de contacto podrían ser una res-puesta directa a los cambios observados en mode-los carentes de esta actividad.

Finalmente, las neuronas postsinápticas (células mitrales y empenachadas en los glomérulos del BO) controlan la convergencia del nervio olfativo dentro del BO. Aunque la transactivación no produce una alteración significativa de dicha convergencia, la distribución de las aferencias a P2 se encuentra alta-mente alterada cuando las neuronas postsinápticas han sido selectivamente eliminadas [63]. Tal efecto concuerda con el hipotético papel que podrían cum-plir las señales extrínsecas, producidas por las dia-nas postsinápticas de las NSO, en la regulación de sus tasas de supervivencia y renovación [64]. En re-sumen, a pesar de que la actividad de las NSO no resulta relevante en la navegación de sus axones ha-cia el BO, sí interviene en la precisión final de sus conexiones una vez que se encuentran dentro de él.

Del bulbo olfativo a la corteza olfativa: mecanismos celulares y moleculares que guían a los axones del tracto olfativo lateral

Los axones emitidos por las neuronas de proyección del BO conforman el TOL, el único camino seguido por dichos axones para extenderse y, posteriormen-te, colonizar las distintas estructuras de la corteza olfativa primaria. Se ha sugerido que los axones pro-venientes de las neuronas de proyección del bulbo olfativo accesorio se encuentran en las capas inter-nas del TOL y que actúan como pioneros para los demás axones que provienen de las neuronas de pro-yección del BO. Este hecho ha sido demostrado me-diante estudios de seguimiento temporal de la for-mación del TOL y de la llegada de los axones de las células mitrales a sus áreas de destino dentro de la corteza olfativa [1,2]. No obstante, los axones de las células mitrales forman el TOL en ausencia de los axones del bulbo olfativo accesorio [1,2], lo que su-giere que las señales intrínsecas desde el telencéfalo tienen más probabilidades de dirigir la formación del TOL [1,2]. Asimismo, en ausencia de Pax6, un factor de transcripción implicado en el desarrollo inicial del BO y del TOL, el BO remanente se desarrolla sin evaginarse macroscópicamente, lo que se ha deno-minado estructura similar al BO, debido a la falta de migración de los precursores de células mitrales [1,2].

En estos mutantes hemos demostrado que los axones de las células mitrales y empenachadas pro-yectan hacia la corteza olfativa y forman el TOL [1,2]. Por el contrario, cuando se elimina la expresión de Lhx2, una estructura similar al BO se forma, pero los axones de sus neuronas de proyección no consi-guen formar un TOL y apenas alcanzan unas pocas micras de longitud [65]. Así, los mecanismos inter-nos desde las neuronas de proyección del BO pare-cen permitir el crecimiento de sus axones y, conse-cuentemente, las señales externas presentes en el medio deben orientar este crecimiento hacia las dis-tintas células diana de la corteza olfativa primaria.

Mecanismos mediados por contacto en el desarrollo del tracto olfativo lateral

Obviamente, las moléculas de adhesión celular son buenas candidatas para actuar como señales me-diadas por contacto en la formación del TOL, como, por ejemplo, moléculas como NCAMH, OCAM, Nr-CAM y PSA-NCAM [1,2]. Estas moléculas po-drían actuar conjuntamente, además de combinar-se con TAG-1/axonina-1, aunque hasta la fecha no se ha descrito su implicación directa en la forma-ción del TOL. Otras moléculas de contacto relevan-



tes, como la reelina o miembros del sistema de se-ñalización efrina/Eph, no parecen participar en la formación/guía del TOL [1,2]. También hemos mos-trado que distintos componentes de la matriz extra-celular, como la laminina, la fibronectina y la Anos-mina-1, promueven un diferente grado de creci-miento axonal de neuronas mitrales in vitro [66]. Finalmente, la falta de la semaforina anclada a la membrana GPI (Sema7A) conduce a un crecimien-to rostrocaudal de axones del TOL, a pesar de que no se encuentren orientados y sus colaterales no se formen correctamente [67].

Un mecanismo singular mediado por contacto se ha propuesto como guía de axones de células mitra-les y empenachadas, las llamadas células guidepost, específicas del TOL en el marco general del sistema olfativo [68]. Tales células son identificables con el anticuerpo monoclonal lot1, como un subgrupo de neuronas de generación temprana formadas exclusi-vamente en el neocórtex y que migran a su posición en el telencéfalo basal cuando acompañan al TOL [69]. Las células positivas a lot1 parecen formar un área de restricción en la corteza olfativa que los axo-nes del TOL no consiguen superar [69]. Así, estas células lot1+ podrían producir factores que atraigan o den soporte al crecimiento axonal [69]. No obstan-te, el auténtico papel fisiológico que las células guide-post lot1+ desempeñan en el desarrollo del TOL debe dilucidarse, puesto que su bloqueo con el anticuerpo lot1 no altera la formación del TOL en cultivos orga-notípicos [69]. Además, en el ratón knock-out, para el factor de transcripción Lhx2 se producen defectos graves en la localización de las células lot1+ en el te-lencéfalo basal (junto con la práctica ausencia del TOL, véase más arriba), debiéndose tanto a la propia mutación de Lhx2 como, indirectamente, a las molé-culas secretadas Netrina-1 y Sema3F. Estas dos mo-léculas quimiotrópicas determinan la posición fisio-lógica de las células lot1 positivas en el cerebro, aun-que en sus respectivos mutantes el TOL se forma sin mayores problemas [65,70,71]. Por lo tanto, teniendo en cuenta la poca heterogeneidad esperada en la proyección del TOL en relación con el nervio olfati-vo, parece más probable que tales mecanismos me-diados por contacto contribuyan menos a la forma-ción del primer tracto que en el caso del nervio olfa-tivo [72,73]. En la figura 3 se incluyen los mecanis-mos revisados en este epígrafe más importantes.

Moléculas secretadas implicadas en la formación del tracto olfativo lateral

Estudios de guía axonal de neuronas de proyección del BO dieron lugar a la primera descripción de un

Figura 2. En esta figura se representa un esquema global del sistema olfativo de roedores, del que se ex-traen tres vistas (sagital, horizontal y transversal) de distintas estructuras. A) La corriente migratoria rostral une la ZSV, un importante nicho neurogénico en roedores adultos, y el BO, el lugar de destino donde se in-tegran las interneuronas generadas en la ZSV. En el panel izquierdo se ilustra dicha integración en las capas del BO, así como una visión simplificada de la circuitería del BO; B) Esquema general de las conexiones del sistema olfativo principal y del sistema olfativo accesorio. Los axones de las NSO del EO proyectan al BO, constituyendo el nervio olfativo. Las neuronas de proyección desde el BO envían sus axones, constituyendo el tracto olfativo lateral, a distintas estructuras de la corteza olfativa, entre las que se encuentra el nervio ol-fativo accesorio, el tubérculo olfativo, la corteza piriforme, el complejo amigdalino, la corteza entorrinal y el núcleo del tracto olfativo lateral (nTOL, asterisco rojo). Las neuronas de la corteza olfativa proyectan de vuelta al BO. Las principales conexiones intracorticales se dirigen a zonas del neocórtex, hipocampo, tálamo e hipotálamo, así como a la corteza olfativa contralateral, formando la comisura anterior (no representa-da). Los axones generados del órgano vomeronasal forman el nervio vomeronasal y proyectan al bulbo olfa-tivo accesorio. Las neuronas de proyección de éste mandan sus axones (como parte del TOL) al NOA y al nTOL (asterisco azul), y al complejo amigdalino, mientras que los axones de las neuronas de estas tres es-tructuras corticales proyectan de vuelta al bulbo olfativo accesorio. Las proyecciones desde la corteza olfativa accesoria alcanzan el hipotálamo y el nTOL; C) Esquema detallado de las conexiones axonales entre el EO y el BO. Las NSO del EO emiten sus axones, que son quimioatraídos por moléculas que se encuentran fuera del BO, como factor de crecimiento hepatocítico, AR y Wnt5a, hacia su destino final, los glomérulos del BO. Una vez en el BO, una combinación de otras moléculas quimioatrayentes (IGF-1) y quimiorrepelentes (Se-ma3A, Slit-1 y Slit-2) regulará la correcta llegada de cada axón a su glomérulo adecuado. A: complejo amig-dalino; BO: bulbo olfativo; BOA: bulbo olfativo accesorio; CE: corteza entorrinal; CMR: corriente migratoria rostral; CP: corteza piriforme; EO: epitelio olfativo; NO: nervio olfativo; NOA: nervio olfativo accesorio; NSO: neurona sensitiva olfativa; OVN: órgano vomeronasal; TOL: tracto olfativo lateral; ZSV: zona subventricular.



efecto quimiorrepelente en el sistema nervioso cen-tral de mamíferos, repulsión ejercida por el septo del cerebro anterior [74]. A partir de ese momento, se asumió la relevancia de las moléculas secretadas para la formación del TOL, aunque se desconoce la naturaleza de la molécula responsable de este efec-to [74]. El primer quimiorrepelente candidato iden-tificado por los axones del TOL fue Slit-2, cuyo ori-gen sugerido fue el septo; Slit-2 actúa a través de su receptor funcional Robo-1 y es el dominio N-ter-minal el fragmento activo de la proteína [47]. Al cabo de los años en los que el efecto de Slit perma-necía confuso, estudios in vivo del mutante hetero-cigoto y, en especial, de los dobles mutantes de Slit-1 y Slit-2 demostraron sustanciales alteraciones en la formación del TOL (Slit-1−/−; Slit-2−/−), inclu-yendo el cruzamiento contralateral de algunos axo-nes. Estas alteraciones son menos importantes cuando sólo falta Slit-2 (Slit-1+/−; Slit-2−/−), caso en el que ningún axón del TOL cruza al hemisferio con-tralateral [75]. Cabe destacar que el doble mutante para los ligandos (Slit-1−/−; Slit-2−/−) muestra unos rasgos fenotípicos más marcados que el doble mu-tante de sus receptores robo (Robo1−/−; Robo2−/−), y que en ninguno de los dobles mutantes se ve afecta-do el crecimiento axonal a lo largo del eje rostro-caudal [75]. Estos datos tal vez reflejen la implica-ción de otros factores en el crecimiento y guía de los axones de proyección del BO, tal y como se su-girió anteriormente [1,2], y limitan las observacio-nes previas que apuntaban a que los Slit afectarían no sólo direccionalmente, sino también a otros as-pectos del crecimiento axonal, como la elongación y la ramificación [1,2].

Los receptores funcionales de otras moléculas quimiotrópicas relevantes, como los receptores para la familia de las netrinas (DCC o Unc5H3) y los de las semaforinas secretadas de la clase Semaforina-3 (Neuropilina-1 y -2), se encuentran muy expresa-dos por las neuronas de proyección del BO y los axones del TOL [1]. No obstante, ni las netrinas (Netrina-1 secretada y las ancladas a la membrana celular Netrina-G1) ni algunas de las semaforinas secretadas (incluyendo la Sema3A, el quimiorrepe-lente más potente) influyen en el crecimiento de axones del BO [35,45,71]. Dicha falta de capacidad de la Sema3A de afectar al crecimento axonal se ve reforzada por la falta de alteraciones del TOL en desarrollo en el ratón defectivo de su único recep-tor funcional conocido, Neuropilina-1. Sin embar-go, hemos demostrado que los axones del TOL res-ponden selectivamente a otras dos semaforinas se-cretadas: mientras que la Sema3F repele los axones del TOL e impide que invadan la placa cortical y la

eminencia ganglionar, por el contrario, la Sema3B atrae a los axones del TOL y los mantiene en la su-perficie del telencéfalo basal [76]. En ese mismo trabajo, probamos que el epitelio olfativo secreta un factor quimiorrepelente para los axones del BO y sugerimos que la Sema3F podría ser responsable de este efecto [76]. Además, encontramos que el frag-mento procesado difusible N-terminal de Anosmi-na-1 promueve el crecimiento y atrae los axones del BO, y que esta molécula se produce fisiológicamen-te por la diana de estos axones del BO, la corteza olfativa [66].

Las señales secretadas con una función impor-tante en la formación del TOL se representan en la figura 3.

Colonización de la corteza olfativa por los axones del tracto olfativo lateral: moléculas implicadas en la formación de las colaterales axónicas

Una vez que el TOL se ha formado correctamente, estos axones primarios germinan y generan colate-

Figura 3. Moléculas de guía del crecimiento axonal desde las neuronas de proyección del bulbo olfativo. Las secciones horizontal (a) y coronal (b) del cerebro en etapa embrionaria muestran las estructuras olfa-tivas. Diferentes moléculas quimiorrepelentes impiden que los axones del tracto olfativo lateral entren en distintas estructuras (septo, eminencia ganglionar y placa cortical), llevándolos a ocupar una posición en la superficie de la vesícula telencefálica. BO: bulbo olfativo; CO: corteza olfativa; EG: eminencia gan-glionar; EO: epitelio olfativo; PC: placa cortical; S: septo; TOL: tracto olfativo lateral.

a b



rales axónicas que proyectan a sus neuronas diana dentro de distintas regiones de lo que se conoce como corteza olfativa [66,69]. Esta estrategia de dispersión es utilizada por los axones en crecimien-to para invadir sus áreas de destino en todo el siste-ma nervioso en desarrollo, y es el único modo fisio-lógico para las células mitrales y empenachadas para proyectar a neuronas específicas de la corteza olfativa [69]. Después de un período de espera (un día aproximadamente) en el que los axones prima-rios del TOL no germinan [69], las colaterales co-mienzan a formarse en un orden preciso, siguiendo un gradiente rostrocaudal en la rata y otro caudo-rrostral en el ratón [1,2]. Así, las primeras colatera-les del TOL colonizan la amígdala a E15,5 y, un día después, hacen lo propio en la corteza piriforme y las regiones más rostrales de la corteza olfativa en el ratón [1,2]. Es un hecho ampliamente aceptado que las mismas señales implicadas en el proceso de navegación y de crecimiento del axón también po-drían ser responsables de la colaterización. Por ejem-plo, un conocido quimiorrepelente en la guía axonal, como Slit-2, parece regular positivamente la ramifi-cación axonal sensorial [69]. Sin embargo, este caso podría ser excepcional, ya que también se ha suge-rido que las señales que inducen ramificación de colaterales axonales difieren de aquellas involucra-das en la guía axonal [69].

Las señales fisiológicas que dirigen la ramifica-ción/colateralización todavía no se encuentran bien definidas y, en el caso de las colaterales axonales del TOL, pocos estudios se han llevado a cabo hasta la fecha. Por ejemplo, ni las células lot1+ ni las Slit (Slit-1 y Slit-2 por separado o en conjunto) parecen estar relacionadas con procesos de ramificación de colaterales de células de la capa mitral del BO [69, 75]. Sin embargo, identificamos la Anosmina-1 (au-sente en el síndrome de Kallmann, que cursa anos-mia junto con hipogonadismo hipogonadotrópico) como una proteína directamente implicada en la formación de estas colaterales del TOL [66], función que hemos corroborado recientemente en otras neuronas de proyección, las células de Purkinje del cerebelo, cuyos axones también emiten colaterales en un preciso lapso de tiempo [77]. Después de un prolongado período de espera, posiblemente con el fin de facilitar la neutralización de inhibidores de la ramificación de colaterales [78], la Anosmina-1 au-menta el número de ramificaciones axonales, sin que por ello se vea afectado el crecimiento de axo-nes primarios del BO. Resulta interesante que, como se mencionó más arriba, la Anosmina-1 parece contribuir a la orientación del crecimiento de axo-nes primarios del BO en etapas tempranas del de-

sarrollo (en rata, a E15), pero sin desencadenar pro-cesos de sprouting [66]. Junto con la Anosmina-1, la Sema7A es otra señal relevante que se encuentra implicada en la emisión de colaterales de axones del TOL [67]. De un modo significativo, y aunque las neurotrofinas sean moléculas prometedoras involu-cradas en la formación de colaterales, no se ha visto que influyan en dicho proceso en el TOL [69]. En la figura 3 se refleja el papel de ambas, Anosmina-1 y Sema7A, en la formación de colaterales del TOL.

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How is the sense of smell connected? Cellular and molecular mechanisms guiding the development of the synaptic connections from the nose to the cortex (I)

Summary. The physiological particularities that occur during the development of the olfactory system make it one of the most fascinating parts of the central nervous system and one of models that has been most widely studied in order to understand the mechanisms related with axonal growth and guidance towards the right targets. A variety of mechanisms are known, some mediated by contact (laminins, cell adhesion molecules, ephrins, etc.) and others that are secreted (semaphorins, slits, growth factors, etc.), to play diverse roles in establishing the synaptic interactions among the olfactory epithelium, the olfactory bulb and the olfactory cortex. In relation to this, other specific mechanisms for this system have also been proposed, including the incredible family of close to 1000 different olfactory receptors. In recent years, different reviews have focused on the partial elements of this system, especially on the mechanisms involved in the formation of the olfactory nerve. However, no detailed review of those related with the development of the connections between the different olfactory structures (epithelium, bulb and cortex) has been put forward to date. In this first part of the review, we address this topic from the following perspective: the different cellular and molecular mechanisms that guide the formation of the olfactory nerve and the lateral olfactory tract.

Key words. Accessory olfactory system. Axonal guidance. Cell adhesion molecules. Chemotropism. Interneuron migration. Olfactory bulb. Olfactory cortex.

cómo se conecta la olfacción

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