OBTENCIÓN DE PLACAS METAFÁSICAS PARA EL ESTUDIO DE LOS CROMOSOMAS HUMANOS A PARTIR DE SANGRE PERIFERICA

Ignacio A. Maureira C

Universidad de ChileFacultad de MedicinaDepartamento de Tecnología Médica

En los organismos eucariontes, las fibras cromatínicas del núcleo interfásico se condensan durante la división celular generando los cromosomas.

Se realizó un cambio en el contraste (aumentando de 0 a 22) y en el color (realizando pequeños cambios)

Las organizaciones y variaciones estructurales del cromosoma metafásico constituyen un tema de gran interés.

Alteraciones cromosómicas numéricas o estructurales están involucradas en diversos trastornos de la reproducción, desarrollo y la viabilidad de muchos organismos.

¿Por qué estudiar los cromosomas?

PROCEDIMIENTO

Antes Después

Se realizó un cambio en el tono y la saturación, aumentando levemente ambos.

CULTIVO

Una vez obtenida la muestra de sangre, se realiza un cultivo con: Medio RPMI (3ml), Suero bovino fetal (0.5 ml), fitohemaglutinina (0.2 mL), antibiótico (0.1 mL).

Se deja incubando por 72 horas a 37°C

COSECHA

3 horas antes del termino del tiempo de incubación se agrega 0.1 ml de colcemid al cultivo.

Una vez finalizado el tiempo de incubaciónse realiza una centrifugación durante 7 minutos a 1700 rpm

Eliminar el sobrenadante. Agregar solución hipotónica de KCL 0.05M a 37°C

Volver a centrifugar a 1700 rpm por 12 minutos.

COSECHA Eliminar el sobrenadante y agregar al pellet 6 ml de ácido

acético 4%.

Centrifugar a 1700 rpm por 7 minutos. Eliminar el sobrenadante.

Agregar 3ml de fijador frío (metanol/ ácido acético , proporión 3:1) y dejar el tubo a 4°C durante 30 minutos.

Centrifugar a 1700 rpm por 10 minutos. Eliminar el sobrenadante y agregar hasta 1 ml de fijador.

Chequear al microscópio de contraste de fase la calidad y concentración de placas metafásicas.

Realizar el goteo en un portaobjeto limpio.

BANDEO G Y TINCIÓN DE LOS CROMOSOMAS.

Soluciones para el bandeo y la tinción con Giemsa:

Tripsina Solución Salina isótonica (Cloruro de sodio al

0.9%) Buffer Fosfato (0,025M, pH:6.7) Colorante Giemsa (disuelto en buffer Fosfato)

BANDEO G Y TINCIÓN DE LOS CROMOSOMAS.

Colocar los portaobjetos en una solución de tripsina a 0.05% de 30 a 90 segundos, a 37°C.

Lavar en solución salina isotónica fría (4°C). 3 lavados de dos minutos.

Teñir con Giemsa, de 2 a 3 minutos.

Lavar con agua destilada y secar al aire.

Observar las placas al microscópio óptico de luz.

Se realizó un cambio en la luminosidad (aumentándola) y en el brillos y contraste (aumentando el brillo y disminuyendo el contraste)