COLORACIÓN

Objetivos:

1) Familiarizarse con los conceptos generales relacionados con el

proceso de coloración.

2) Aplicar distintas técnicas de coloración tanto topográficas,

específicas como histoquímicas.

SOLUCIONES COLOREADAS

PREPARADOS FRESCOS U OBTENIDOS POST MORTEM

Se diferencian sólo los elementos que poseen distinto índice de

refracción (ir). Aquellos componentes con un (ir)

semejante aparecerán iguales al observador, por lo tanto serán

confundidos en uno solo.

(M.O)

Se unen selectivamente a ciertas estructuras,

coloreándolas.

Determinados detalles estructurales se hacen visibles

El estudio del preparado se realiza mediante el análisis

cromático

Ej. Orceína Fibras elásticas

Carmín de Best Glucógeno

¿POR QUÉ ES NECESARIO COLOREAR

UN CORTE HISTOLÓGICO?

CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES

POR SU ORIGEN

NATURALES

ARTIFICIALES

VEGETALES

Hematoxilina

Orceína

Safranina

ANIMALES

Carmín

Colorantes de anilina

Derivados de la destilación de la hulla

(carbón)

Son sales

Cuando una sustancia es incolora (no tiene absorción en el espectro visible), agregando algunos grupos no saturados (con doble ligadura) denominados CROMÓFOROS se pueden desplazar esas bandas hacia el espectro visible, entonces la sustancia presenta color.

C O

carbonilo

N O

nitroso

N N

azoico

RESUMIENDO: Sustancia incolora + Cromóforos = CROMÓGENO

CROMÓGENO + AUXOCRÓMO = COLORANTE

No implica que la sustancia ya sea un colorante

AUXOCRÓMOS: son radicales químicos que aumentan el color y adquieren la capacidad de colorear. Estos hacen que el cromógeno se ionice. Grupos aminos, hidroxilos, halógenos.

COLOR Y COLORANTES

Orange G

Azul de anilina

Fucsina ácida

Ácido pícrico

Eosina (Eosianato de Na)

Azul de metileno

Hematoxilina

Fucsina básica

Azul de toluidina

2. ÁCIDO:

1. BÁSICO

CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES SINTÉTICOS SEGÚN SU CARGA

Na+

Na+

Posee un grupo catiónico (R+=cromógeno) que se une a grupos ácidos de los tejidos: SO4= (sulfato); PO4= (fosfato).

Posee un grupo aniónico (R-) que se une a grupos básicos de los tejidos: NH3+ (grupo amino protonado).

3. NEUTROS son colorantes que presentan una parte ácida y una parte básica. Eosianato de azul de metileno (May Grünwald)

Teniendo en cuenta la afinidad de un colorante por determinados grupos químicos presentes en el tejido diremos que:

COMPONENTES TISULARES BASÓFILOS

Heterocromatina y nucléolos (grupos fosfato ionizados de los ácidos nucleicos).

RER (grupo fosfato ionizados del ARN). Matriz extracelular del cartílago ( hidratos de carbono con grupos

sulfatos.

COLORANTE BÁSICO Formará uniones con componentes tisulares cargados (-) por ej. grupos ácidos

COMPONENTES TISULARES ACIDÓFILOS

COLORANTE ÁCIDO Carga (-) aniónica

Formará uniones con componentes tisulares cargados (+) por ej. grupos básicos

Filamentos citoplasmáticos (Ej. Actina, miosina). Componentes membranosos intracelulares. Citoplasma en general. Fibras extracelulares (grupos aminos ionizados).

MECANISMOS DE COLORACIÓN ¿POR QUÉ SE COLOREA?

FÍSICOS:

a) Por disolución del colorante en distintas sustancias o componentes tisulares. Ej. Sudan III se disuelve en lípidos.

b) Por impregnación metálica: precipitación de sales metálicas sobre estructuras con diferente densidad. Ej. Sales de Ag (Técnica de Río Hortega), Hg (Técnica de Ramón Moliner).

FÍSICOQUÍMICA (la mayoría)

El colorante se une a la sustancia coloreable específica combinándose íntimamente con ella debido a la presencia de agrupaciones moleculares básicas y ácidas en los tejidos que se unirán con los grupos ácidos y básicos de los colorantes.

QUÍMICA:

Detección de una sustancia determinada a través de una unión química específica.

Ej: Técnicas histoquímicas

Reacción del ácido periódico-reactivo de Schiff (PAS)

Reacción del azul alcian (AB) (detección de glicoconjugados)

Técnica con Carmín de Best (detección de glucógeno).

Clasificación de las coloraciones

SIMPLE: se utiliza un solo colorante y por ende se colorea solamente algunos elementos del preparado. Ej:tionina, colorea núcleos.

H & E T. de Masson modificado

COMBINADA O COMPUESTA: se utilizan dos o más colorantes, se recurre al empleo de colorantes básicos y ácidos. Ej: Hematoxilina-eosina

• Sucesiva: Tricrómico de Masson; H&E

•Simultánea: Tricrómico de Mallory: azul de anilina-orange G

Van Gieson: fucsina ácida-ápido pícrico

Tricrómico de Mallory H - E – OG - F

PROGRESIVA: se deja actuar al colorante hasta obtener una coloración óptima. Ej: Orceína, para fibras elásticas (Técnica de Fränkel).

REGRESIVA: se realiza primero una sobrecoloración y luego se elimina el exceso del colorante por medio de diferenciadores. Este proceso se denomina diferenciación. Ej: Coloración de Mallory-Heidenhain (AZAN): el azocarmín (colorante ácido) tiñe tantos núcleos como citoplasma. Diferenciador: 0.1% de aceite de anilina en ROH 96º.

DIRECTA: existe una verdadera afinidad entre la sustancia a colorear y el colorante. Ej: Eosina

INDIRECTA: requiere la intervención de

intermediarios o mordientes para que la coloración tenga

lugar.

En un tiempo: Ej. Hematoxilina de Carazzi

Hemateína + Alumbre de K o Fe

LACA O HEMALUMBRE

Hematoxilina al oxidarse con la luz o una sustancia oxidante

En dos tiempos: Ej: Hematoxilina de Regaud

(mordiente)

1º actúa el mordiente directamente en el tejido y luego el colorante. La laca se forma en el tejido.

PANÓPTICA: es una coloración combinada realizada sucesivamente por colorantes neutros. Ej. Coloración de May Grünwald-Giensa

PANCRÓMICA: en un solo colorante actúan todos los colorantes neutros que se necesitan.

Ej. Coloración de Pappenheim

Se mezcla en una solución colorante: ácido fénico, verde de metilo y pironina en

agua destilada.

ORTOCROMÁTICA: el tejido toma el mismo color que el colorante.

Ej. la fucsina, hematoxilina.

METACROMÁTICA: un componente celular o una sustancia se tiñe de un color diferente al del colorante. Ej. azul de metileno, azul de toluidina

Componentes tisulares inducen a que el colorante se polimerice y modifique su color. Se da con colorantes básicos

TÉCNICAS DE COLORACIÓN

Coloraciones pueden ser:

GENERALES O TOPOGRÁFICAS

• H & E

• Tricrómico de Masson

• AZAN

ESPECIALES

• Fränkel

• Sudan III

• Klüver-Barrera

• Impregnaciones argénticas

HISTOQUÍMICAS

• APS

• Azul Alcian

INMUNOHISTOQUÍMICAS

PROTOCOLO GENERAL DE COLORACIÓN PARA CORTES EN PARAFINA

• Desparafinado: coplin con xilol (5 min).

• Hidratación (hasta el diluyente del colorante)

ROH 96º: 1 min.

COLODIONAR

ROH 70º: 1 min.

ROH 50º: 1 min.

AGUA DESTILADA: 1 min.

• Coloración propiamente dicha

VER PROTOCOLOS

• Deshidratación

ROH 96º: un pasaje

Secar con papel de filtro o estufa.

• Aclaración

Coplin con xilol (ATENCIÓN!!!)

• Montado

Utilización de un medio químicamente

anhidro.

COLORACIÓN

ACLARACIÓN

SET DE COLORACIÓN

Coloraciones topográficas en cortes en parafina Hematoxilina-Eosina

Tricrómico de Masson modificado

PROTOCOLO GENERAL DE COLORACIÓN PARA CORTES EN RESINA

•Hidratación

AGUA DESTILADA: 10 min

• Coloración propiamente dicha

HEMATOXILINA DE CARAZZI Lavado en H2O destilada EOSINA ACUOSA IODADA Controlar bajo microscopio Lavar con H2O destilada

• Deshidratación

Dejar secar bajo campana o en estufa a 40ºC

• Montaje

Utilización de un medio químicamente anhidro.

Hematoxilina-Eosina

Hematoxilina -Eosina

Agradecimiento Dra. J. Gimenez

Hematoxilina -Eosina

Agradecimiento a Dra. J. Gimenez

Tricrómico de Masson modificado

Agradecimiento a Lic. M. Ojeda

Tricrómico de Masson modificado Agradecimiento Lic. M. Ojeda

Development of the Follicle Complex and Oocyte taging in Red Drum, Sciaenops ocellatus Linnaeus, 1776 (Perciformes, Sciaenidae). Dr. Harry J. Grier JOURNAL OF MORPHOLOGY 273:801–829 (2012)

Coloración de semifinos

Cortes de 1 µm de

espesor previo a la

obtención de cortes

ultrafinos para MET.

Una vez localiza la zona de interés se procede al retallado del taco.

Contraste de cortes ultrafinos

para MET