Colágeno04 2000 Molécula del mes por David Goodsell 

doi: 10.2210/rcsb_pdb/mom_2000_4 ( Versión PDF , ePub Version   )

Palabras clave: vitamina C, el colágeno de triple hélice, hidroxiprolina, el colágeno fibrilar

 

Estructuras Discutidos

colágeno idealizada

colágeno humano

 

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Su proteína más abundanteAlrededor de una cuarta parte del total de la proteína en su cuerpo es colágeno. El colágeno es

una proteína estructural, formando cables moleculares que fortalecen los tendones y hojas

grandes y resistentes que soportan la piel y órganos internos. Huesos y los dientes se hacen

añadiendo cristales minerales al colágeno. El colágeno proporciona estructura a nuestro cuerpo,

proteger y apoyar a los tejidos blandos y conectándolos con el esqueleto.Pero, a pesar de su

función crítica en el cuerpo, el colágeno es una proteína relativamente simple.

La Triple Hélice del colágenoEl colágeno se compone de tres cadenas, enrollados juntos en una triple hélice apretada. La

ilustración incluye aquí muestra sólo un pequeño segmento de la molécula entera - cada cadena

es de más de 1400 aminoácidos de longitud y sólo sobre 20 se muestran aquí. Una secuencia

repetida de tres aminoácidos forma esta estructura robusta. Cada tercer aminoácido es la

glicina, un ácido amino pequeño que encaja perfectamente en el interior de la hélice. Muchas de

las posiciones restantes de la cadena están ocupados por dos ácidos inesperados aminoácidos:

prolina y una versión modificada de hidroxiprolina prolina,. No esperaríamos prolina a ser esta

común, porque forma un estrechamiento en la cadena de polipéptido que es difícil de acomodar

en típicas proteínas globulares. Pero, como se puede ver en la página siguiente, que parece ser

la forma correcta para esta proteína estructural.

Vitamina CHidroxiprolina, que es crítico para la estabilidad del colágeno, se crea mediante la modificación

de los aminoácidos prolina normales después de la cadena de colágeno se construye. La

reacción requiere de la vitamina C para ayudar en la adición de oxígeno. Por desgracia, no puede

producir vitamina C dentro de nuestros cuerpos, y si no conseguimos suficiente en nuestra dieta,

los resultados pueden ser desastrosos. La deficiencia de vitamina C disminuye la producción de

hidroxiprolina y detiene la construcción de colágeno nuevo, provocando finalmente que el

escorbuto. Los síntomas de escorbuto - pérdida de dientes y hematomas - son causados por la

falta de colágeno para reparar el desgaste y desgaste causado por las actividades diarias.

El colágeno en la plataforma de comestiblesEl colágeno de animales de ganado es un ingrediente familiar para cocinar. Como la mayoría de

las proteínas, cuando el colágeno se calienta, pierde la totalidad de su estructura. Los desenrolla

de triple hélice y las cadenas separadas. Luego, cuando esta masa desnaturalizado de las

cadenas enredadas se enfría, se absorbe toda el agua que rodea como una esponja, formando

gelatina.

  

Explorando la EstructuraUna secuencia especial de aminoácidos hace que el colágeno de triple hélice apretada

particularmente estable. Cada aminoácido tercera es una glicina, y muchos de los aminoácidos

restantes son prolina o hidroxiprolina. Un triple hélice clásico se muestra aquí, y puede ser visto

en el fichero PDB 1cag . Note como la glicina forma un codo pequeño lleno dentro de la hélice, y

observe cómo la prolina y la hidroxiprolina suavemente doblar la cadena de vuelta alrededor de

la hélice. En esta estructura, los investigadores colocaron una mayor aminoácido alanina en la

posición normalmente ocupada por glicina, que muestra que no dejan las cadenas vecinas.

 

  

Esta hélice del colágeno contiene un segmento de colágeno humano, y puede verse en el archivo

PDB 1bkv . Observe que la mitad superior es muy uniforme, donde la secuencia es la mezcla

ideal de glicina y prolinas. En la parte inferior, la hélice es menos regular, porque muchos

aminoácidos diferentes se colocan entre las glicinas igualmente espaciados. Estas ilustraciones

fueron creadas en RasMol. Puede crear imágenes similares haciendo clic en los códigos PDB

encima y luego elegir "Estructura View". 

 

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Las cuerdas y escalerasHacemos muchos tipos diferentes de colágeno, que forman las cuerdas largas y hojas duras que

se utilizan para el apoyo estructural en animales maduros y como rutas de movimiento celular

durante el desarrollo.Todos contienen un largo tramo de triple hélice conectado a diferentes

tipos de extremos. El más simple es simplemente una hélice triple de largo, con extremos

romos. Estos "tipo I" moléculas de colágeno asociar lado a lado, como las fibras de un cable,

para formar fibrillas difíciles. Estos atraviesan el espacio entre las fibrillas de casi cada uno de

nuestras células. 

Esta ilustración representa una membrana basal, que forma una superficie dura que soporta la

piel y muchos órganos. Un colágeno diferente - "Tipo IV" - forma la base estructural de esta

membrana. El colágeno tipo IV tiene una cabeza globular en un extremo y una cola extra en el

otro. Las cabezas se unen fuertemente juntos, de cabeza a cabeza, y cuatro moléculas de

colágeno se asocian juntos a través de sus colas, formando un complejo en forma de X. El uso de

estos dos tipos de interacciones, el colágeno tipo IV forma una red extendida, que se muestra

aquí en azul claro. Dos otras moléculas - en forma de cruz laminina (azul-verde) y proteoglicanos

largos y serpenteantes (verde) - llenar los espacios, formando una lámina densa

Estructura microfibrilar de colágeno tipo I in situJoseph PRO Orgel , * † ‡ Thomas C. Irving , * Andrew Miller , § y Tim J. Wess   ¶

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ABSTRACTO

Los colágenos fibrosos son ubicuos en animales y forman la base estructural de todos los tejidos conectivos de mamíferos, incluyendo las del corazón, los vasos sanguíneos, piel, córnea, huesos y tendones. Sin embargo, en comparación con lo que se sabe de su estructura de producción, volumen de ventas y fisiológicas, muy poco se sabe acerca de la disposición tridimensional de las moléculas de colágeno en forma natural fibrillas. Este conocimiento puede dar una idea de los principales procesos biológicos como la fibrillo-génesis y la remodelación tisular y en enfermedades tales como enfermedad cardíaca y el cáncer. Aquí presentamos una determinación cristalográfica del colágeno de tipo I estructura supramolecular, donde ha sido la conformación molecular de cada segmento de colágeno que se encuentra dentro de la celda unidad cristalográfica de origen natural definido (P1, un ≈ 40,0 Å, b ≈ 27,0 Å, c ≈ 678 Å , α ≈ 89,2 °, 94,6 ° β ≈, γ ≈ 105,6 °; reflexiones: 414, superpuestos, 232, y no superpuestas, 182; resolución, 5,16 Å axial y ecuatorial 11,1 a). Esta estructura muestra que la topología de empaquetamiento molecular de la molécula de colágeno es tal que los vecinos de embalaje están dispuestas para formar un supertwisted (discontinuo) de mano derecha de microfibrillas que interdigita con microfibrillas vecinos. Esta interdigitación establece la superretícula cristalográfica, que está formado de moléculas de colágeno quasihexagonally envasados. Además, la estructura molecular de embalaje de colágeno que se muestra aquí ofrece información relativa a los posibles modos de acción de dos moléculas importantes implicados en la salud humana y la enfermedad: decorina y la matriz metaloproteinasa (MMP) de colagenasa.Palabras clave: x-ray, fibra, cristalografía, fibrilla, matriz extracelular

Aunque las características generales de la estructura de colágeno de tipo I se han conocido durante mucho tiempo, la disposición específica de embalaje de moléculas de colágeno in situ ha seguido siendo difícil de definir, a pesar de una gran cantidad de esfuerzo por muchos investigadores ( 1- 16 ) (a la organización general de colágeno de tipo I se

resumen en la Fig. 5, que se publica como información de apoyo en el sitio web PNAS).. Recientemente, hemos abordado este problema estructural difícil mediante el empleo de técnicas convencionales de cristalográficos de rayos X en experimentos de difracción de fibra ( 13 , 17 , 18 ), que culmina en un mapa de densidad electrónica inicial ( 13 , 19 ) que permite una mirada crudo en algunos aspectos de la disposición supramolecular de las moléculas de colágeno in situ . Desafortunadamente, el alto grado de desorden observado en la región de hueco de la densidad de electrones asignar impedido la colocación de un modelo molecular de la densidad de electrones, la región de hueco era en gran medida no interpretable. Sin la estructura de la región de hueco, que era imposible determinar la disposición global molecular de moléculas de colágeno in situ , y por lo tanto su potencial para mejorar nuestra comprensión de la función estructural, de desarrollo y patológica de la fibrilla de colágeno a nivel molecular permaneció no realizada . Posteriormente hemos integrado adicionales (no superpuestos) datos de intensidad en el proceso de determinación estructural (por reemplazo isomorfo múltiple), que, junto con la escala de mejora de los datos de intensidad y, por lo tanto, mejores estimaciones de fase, produjo una densidad de electrones mucho mejor y ahora claramente interpretable mapa de moléculas de colágeno in situ . Un modelo que incluye todos los residuos de aminoácidos de la molécula de colágeno a continuación, se ajustó a este mapa de densidad de electrones determinado experimentalmente, que verificó la correcta solución del problema de la fase y la ayuda en la interpretación del mapa nativo. Colectivamente, este trabajo presenta una estructura de resolución molecular de moléculas de colágeno enteros in situ que no se ha descrito previamente.

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RESULTADOS Y DISCUSIÓNResumen de los resultados.

El mapa de densidad electrónica nuevo ahora muestra claramente todos los segmentos moleculares dentro de una célula sola unidad [de la longitud axial D , donde D es uno 670-una repetición tal como se define por el axial Hodge-Petruska esquema ( 20 )], incluyendo la molecular cuatro segmentos dentro de la región brecha previamente sin resolver. Este mapa no sólo permite que la ruta completa de cada cadena de colágeno para ser visualizados y así determinar la naturaleza de la topología de empaquetamiento molecular (que se describe aquí como interdigitada microfibrillas), pero proporciona datos específicos espaciales relevantes

para posibles interacciones moleculares dentro de la matriz de mamífero extracelular (ECM ).Un modelo de acompañamiento que describe esta estructura fue ajustado a la densidad de electrones de una manera directa y tiene un total de R factor de 9,55% ( Fig. 1. ; véase también la Tabla 1, que se publica como información de apoyo en el sitio web PNAS). Aunque anteriores, de alta resolución de los estudios cristalográficos describir con precisión las características electrostáticas de triple hélice y el potencial dentro de la molécula, y han sido muy importantes en estos aspectos, ( 15 , 16 ), este trabajo proporciona una visualización de la general, la estructura nativa, molecular y su arreglo de empaque.

La figura.   1.

Antecedentes resta fuera de meridiano patrón de difracción de tendón de la cola de rata ( superior ) y el patrón de difracción de modelo simulado derivados de intensidades ( Baja ). R sim ( R factor de entre el modelo generado y observó patrón de difracción) se determinó que el 16,7%, ...

Aunque de baja resolución, el mapa de densidad de electrones permite la asignación de la secuencia de aminoácidos a las coordenadas molecular de cada cadena ( Fig. 2 ), debido a que el N y C se pueden identificar por el etiquetado átomo pesado ( 13 ). Identificación de los segmentos restantes moleculares (2- 4 ) se consigue siguiendo una sola molécula de colágeno desde el término N a través de varias células unitarias sucesivas a la terminal C ( Fig. 3. ), los resultados de los cuales se encontró que de acuerdo con las posiciones del retículo determinados a partir de los mapas de diferencia de Fourier ( 13 ) .

La figura.   2.

Mapas de densidad electrónica. Elementos de mapa de A y B han sido comprimidos cinco veces a lo largo de la dirección paralela a lac -eje para mayor claridad. ( A ) Superposición región de repetición 1D, que muestra la

inclinación común de los cinco segmentos de colágeno dentro de la región de solapamiento. La ...

La figura.   3.

El colágeno organización y estructura. Los segmentos de colágeno están etiquetados como sigue para B , C , y E : 1, gris, amarillo 5,; 2, rojo; 3, verde; 4, azul. Parte del segmento 1 es de color cian (el extremo N), y parte del segmento 5 es de color magenta (el extremo C terminal) ...

La extensión de las regiones ordenadas (los cristalitos) dentro de las fibrillas de colágeno se ha medido desde el pico de Bragg ampliación en el plano lateral del patrón de difracción de tendón, después de que el método de Williamson-Hall ( 21 ) (véase la fig. 6, que se publica como información de apoyo en el sitio web PNAS). El tamaño de los cristalitos se muestra como 429 Å, un valor que se corresponde bien con el valor deducido por Hulmes et al. ( 22 ) de ≈ 450 Å.Hulmes et al. ( 22 ) propusieron un modelo de cristal líquido de fibrillas compuestas de dominios de cristalitos bien ordenados organizados aleatoriamente dentro de cada fibrilla de colágeno. El tamaño del cristalito sugiere que hay un promedio de 10 o 11 células por unidad de dominio organizada, y dado el rango normal de tamaño de fibrillas siendo ≈ 3,000-5,000 Å, habría ≈ 10 dominios de cristalitos por fibrillas. El método de Williamson-Hall también proporciona una estimación de la distorsión de celosía, que en este caso se calcula para ser 1,55 Å (Fig. 6). Este resultado puede interpretarse en el sentido de un factor general de la temperatura media de ≈ 190 Å 2 de la molécula de colágeno, aunque este valor no es uniforme debido a que la región de diferencia es relativamente más desordenado que el solapamiento (aproximadamente dos veces; promedio q factor de solapamiento es 0,89 y 0,49 para la región de hueco).Características de la estructura y su interpretación.

La inspección del mapa de densidad electrónica y modelo ajustado muestra que cada molécula de colágeno está dispuesto dentro de un enrejado quasihexagonal largo de la superposición y regiones de interfaz (el nivel axial de los telopéptidos) y se observa que se inclina a través de la región de solapamiento ( 11 , 13 ) ( las Figs. 2 y y 3).3 ). Un hallazgo inesperado es

que esta disposición quasihexagonal ( Fig. 3 A ) se ve que continúe en y en toda la región de hueco, a pesar de la ausencia de la molécula de colágeno uno por celda unidad y el hecho de que, en esta región, cada uno de los cuatro segmentos moleculares adopta una conformación única ( Fig. 2 D ), mientras que en la región de superposición de los segmentos tienen prácticamente la misma conformación ( Fig. 2 A ). Además, hay un cambio general de la dirección entre solapamiento y regiones brecha, dando lugar a una disposición de plegado de las moléculas de colágeno 1D escalonados ( Fig. 3 Ey F ).El punto de inflexión para cada "pliegue" se encuentra dentro de ambas regiones telopéptido, los lugares donde se cree que se produzca unión intermolecular enlaces cruzados a través de la lisina y la hidroxi-lisina. Esta estructura soporta esta hipótesis, aunque la resolución del estudio no permite una delimitación específica de la larga lisina / hidroxi-lisina cadenas laterales. Varios grupos de lisina / hidroxi-lisina residuos que se encuentran dentro de los telopéptidos se encontraron dentro de distancias de enlace plausibles entre los telopéptidos y sus vecinos helicoidales ( Fig. 2. C , véase también la Tabla 2, que se publica como información de apoyo en el sitio web de PNAS ).El colágeno Molecular embalaje y la Estructura microfibrilar.

A "microfibrilla" se cree que es el bloque de construcción básico de la fibrilla de colágeno. La disposición específica de las moléculas de colágeno que constituyen la supuesta microfibrilla mucho tiempo se ha buscado, y numerosos modelos que se han propuesto describir su estructura sea posible (ver más abajo y las Figs. 7 y 8, que se publican como información de apoyo en el sitio web PNAS). Podemos identificar la estructura microfibrilar en nuestra determinación múltiple sustitución isomorfa de la in situ estructura de embalaje de colágeno mediante el trazado de la ruta completa de una sola molécula de colágeno a través de varias celdas unitarias sucesivos y observando el eje central que él y sus vecinos girar alrededor ( Fig. 3 B y E ). Se puede observar que las moléculas de colágeno de cuatro (plano lateral) células vecinas unitarias comprenden una auto-contenido, cuerda-como unidad que se repite ( Fig. 3 E ). De las diferentes hipótesis anteriormente, las disposiciones estructurales, la que más se parece esta estructura observada es la microfibrilla comprimido ( 7 , 9 , 11 , 13 ). Sin embargo, este modelo teórico se ve que es ligeramente simplista, porque no se puede obtener una unidad pentamérica autónomo de acuerdo con las definiciones anteriores, cíclicos ( 7 , 9 , 11 , 13 ) (debido a la progresión molecular, aunque de carácter cíclico, se se describe mejor como espiral) sin la adición de al menos una molécula "extra" colágeno para llenar posiciones no ocupadas dentro de la

red (véase la fig. 8 y también la fig. 9, que se publica como información de apoyo en el sitio web PNAS). En contraste, la disposición repetitiva de moléculas de colágeno pentaméricos presentados aquí es consistentemente auto-satisfactorio con respecto a la red de colágeno de envasado y puede describirse con precisión como una microfibrilla, que consta de cinco 1D escalonados, las moléculas de colágeno plisadas, con un supertwist diestro .Microfibrillas vecinos están entrelazados uno con el otro ( figuras. 3 F , 6 D , 8 F , y 9 D ).Específicamente, el embalaje quasihexagonal de las moléculas de colágeno es continua y sin interrupciones porque la vecina N-y C-terminales que contienen segmentos moleculares están contenidas dentro de las microfibrillas de vecinos, en lugar de ser dirigido internamente dentro de la microfibrilla. Esta disposición indica por qué microfibrilla-como las estructuras aún no se han extraído de muestras de tejido ( 23 ), porque, a pesar de que pueden ser identificados como entidades topológicas, no son separables unidades estructurales en la forma madura. Cada microfibrilla contiene por lo menos dos a tres intermicrofibrillar reticulación ( 7 , 24 ), sino también una unión intramicrofibrillar; por lo tanto, la interrupción de los N-y C-terminal bonos durante la extracción de colágeno no sólo altera la fibrilar sino también la estructura microfibrilar de la muestra . Esta característica también puede ayudar a explicar la capacidad de los tejidos fibrilares de absorber y transmitir fuerza mecánica, es decir, puede ser la estructura de colágeno considera que una cuerda de red en el que cada elemento de la matriz transmite la fuerza para el resto de la matriz a través de la lisina-hidroxi -lisina reticulaciones mediadas ( Figs. 2 C y AND33 F ), mientras que los elementos microfibrilar mismos mantienen la estabilidad estructural a través de la supertwist de mano derecha ( la fig. 3 ). Esta supertwist (que parece muy exagerada en estas figuras, debido a la compresión a lo largo de la c -eje, aproximadamente paralelo al colágeno de triple hélice, véase la Fig. 10, que se publica como información de apoyo en el sitio web PNAS, para no comprimida de vista. una única molécula de colágeno) puede permitir que la estructura para absorber los efectos de torsión, sin interferir con la superhélice de la molécula de colágeno en sí. La torsión sobre el supertwist se transforma en una fuerza que se transmite en tres dimensiones a través de la matriz reticulada molecular de moléculas de colágeno vecinos en cables vecinos microfibrilar. Estas reticulaciones se encuentran tanto en el N (axialmente contraído) - telopéptido y la (doblado) telopéptido C-terminal, que se reticula con el vecino 1D escalonados C-y N-terminal de los segmentos de colágeno, respectivamente ( 7 , 25 ) ( figuras. 2 C , , 33 D , y and44 ).

La figura.   4.

Mapas de densidad electrónica. Los elementos de mapa han sido comprimidos cinco veces en la dirección paralela a la c -eje. El colágeno de triple hélice se muestra como un estilizado C α rastro. (A ) La densidad de electrones (2 F o - F c P m ) Mapa y el modelo de estructura ...

Implicaciones para interacciones moleculares dentro de la ECM.

La estructura de embalaje de colágeno tal como se presenta aquí ofrece la penetración en la unión de macromoléculas importantes, tales como el arquetipo de pequeños ricos en leucina proteoglicanos (SLLP) decorina con colágeno de tipo I. La decorina se ha encontrado que es un potente regulador de colágeno fibrilar-génesis, al parecer por la inhibición de la asociación lateral de moléculas de colágeno por su unión anterior ( 26- 28 ). En un modelo animal de enfermedad donde se interrumpió el gen de la decorina, los ratones por lo demás viables poseía piel frágil con resistencia a la tracción reducida, y fibrillas de colágeno anormalmente grandes y de forma irregular se observaron ( 29 ), rasgos similares a los observados en la enfermedad de tejido conectivo humano Ehlers- Danlos. Estos datos han sido aceptados como una clara demostración de la importancia de la interacción colágeno-decorina en el desarrollo y mantenimiento del tejido conjuntivo sano, y cualquier visión ofrecida en la naturaleza de la interacción de decorina-colágeno in situ es probable que sea valioso para comprender la patología de estas enfermedades del tejido conectivo.En el mapa de densidad electrónica, dos segmentos de colágeno (segmentos moleculares 2 y 3 de nuestro modelo) hacer giros relativamente agudos en la región de hueco, desocupar dos grandes espacios moleculares en el arreglo de empaque a ≈ 0,6 D y ≈ 0,8 D ( Figs. 2 B y y 4).4 ). Estos segmentos contienen dos de los varios sitios que han sido implicados para decorina unión, a 0,8 D y 0,6 D (1,6 y D ) de la longitud molecular colágenos '( 30 , 31 ) (también equivalente a 0,8 D y 0,6 D dentro de la 1 D tambaleó embalaje del sistema). Si las moléculas de colágeno en la superficie de la fibrilla tienen una estructura similar, entonces estos lugares están claramente adecuado para acomodar el gran núcleo decorina proteína, ya sea en forma monomérica ( 32 ) o dimérica ( 25 , 33 ) forma, aunque este hallazgo ciertamente no excluye la viabilidad de otros sitios propuestos de unión a lo largo de la superficie de la fibrilla de colágeno. La importancia de la 0,6 D y 0,8 D sitios reveladas por el mapa de

densidad de electrones y el modelo presentado aquí es que cada uno puede proporcionar un "nicho" (agujero poco profundo) en el crecimiento de fibrillas de superficie que proporcione una mayor proteína-proteína área de contacto , y por lo tanto potencialmente la asociación más fuerte entre la decorina y el colágeno, que en otros sitios de decorina posible (y más plana) de unión, mientras que todavía permite decorina a "sobresalir" de la superficie de la fibrilla suficiente como para ser eficaces en la regulación del diámetro de las fibrillas.Dos pequeños parches de densidad de electrones se observaron inicialmente en el 0,6 D y 0,8 D sitios en el mapa de densidad de electrones determinado experimentalmente ( Fig. 2 B ). Ninguno de los parches descritos constituyen cualquier parte de la ruta de las moléculas de colágeno, pero ambos son lo suficientemente grandes como para acomodar dos o más repeticiones ricas en leucina (LRR) del núcleo de la proteína decorina. Dos LRRs, IV-VI, han sido previamente implicadas en la unión a colágeno ( 34). Sin embargo, no hay evidencia directa conocida de la decorina se encuentra dentro de la fibrilla de colágeno, y este escenario parece poco probable, ya que requeriría un reordenamiento pequeño pero significativo de la disposición de embalaje en al menos 4% de las células de la unidad dentro de cada fibrilla de colágeno [hay ≈ 0,043 son moléculas de decorina por colágeno monómero ( 35 )]. O este escenario pueda interrumpir el crystallineity del sistema o formarían parte del mecanismo que limita el diámetro de las fibrillas durante el crecimiento normal. También es posible que la densidad a 0,6 D y 0,8D representa alguna otra molécula unido a baja ocupación.La colagenasa (MMP1) interviene en la regulación homeostática de la ECM y está fuertemente implicado en la patología de la enfermedad cardíaca y el cáncer (metástasis) y una serie de otras enfermedades. El mecanismo de reconocimiento del sitio de escisión por colagenasa no se entiende completamente, pero se cree que depender de los aspectos de la disposición supramolecular del sustrato, es decir, colágeno nativo, además de reconocer la secuencia de escisión tripéptido ( 36 ). Su expresión también está regulado por la presencia de colágeno fibrilar nativo ( 37 ). El sitio de escisión de sustrato se encuentra dentro de la región de solapamiento a 0,316 D , pero no hay espacio suficiente para la enzima para entrar en esta matriz de empaquetamiento denso en el interior de la fibrilla de colágeno.Dependiendo de la naturaleza de la unión trimolecular complejo (dominios catalíticos y la hemopexina de MMP1 y el sustrato de colágeno molécula), el acceso al sitio también puede estar restringido a la enzima en el exterior de la fibrilla de colágeno debido a la proximidad de la bulbosa C- terminal de telopéptido ( 18 , 38 ) para el sitio de escisión. Una

escisión antes de la plegado C-telopéptido ( Figs. 2 C yAND33 D ) reduciría esta constricción, aunque las moléculas de colágeno todavía tendría que ser movido a un lado al menos 10 Å para el dominio catalítico y un 20 por la hemopexina dominio similar para acomodar la enzima en el interior de la fibrilla. Alternativamente, parece muy posible que el modo de acción de la enzima es proteolyse cadenas de colágeno exclusivamente desde el exterior hacia el interior de las fibrillas. En ambos casos, la estructura 3D de la disposición de colágeno todavía sería determinar la unión al sustrato y el sitio de reconocimiento para la enzima, ya que proteolyses desde el exterior hacia el interior de la fibrilla.En conclusión, hemos presentado aquí una no descrita previamente, la estructura objetivamente determinado que muestra el embalaje de la molécula de colágeno completo in situ . Esta estructura proporciona una fuerte evidencia de una subestructura específica para microfibrilar la fibrilla de colágeno y conocimientos importantes con respecto a la unión de colágeno por las macromoléculas de ECM tales como decorina y colagenasa. La disponibilidad de este modelo determinado experimentalmente deben ser muy útil para los investigadores que investigan la organización y la biología molecular de la ECM.

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MÉTODOSRecopilación de datos, Estimación Intensidad y Validación.

Los métodos utilizados para la preparación de muestras, etiquetado derivado, y de rayos X de difracción de protocolos se han descrito (11 , 13 , 18 ), al igual que los de la sustracción de fondo y la intensidad de estimación ( 13 , 19 ).Brevemente, datos de rayos X de difracción de fibras se obtuvieron a partir de tendones enteros, intactos de cola de rata a temperatura ambiente, y los tendones se mantuvieron en un estado hidratado bien dentro de una celda de muestra sellada. Los datos fueron recogidos a partir de dos muestras nativas y aquellos derivados utilizando cloruro de oro y yoduro de potasio. Debido a un número significativo de superposición de reflexiones, las intensidades de reflexión individuales se calcularon mediante el ajuste de un modelo de difracción simulado a la observada fondo-resta patrón de difracción utilizando un procedimiento de recocido simulado ( 13 , 19 ). Debido a que el 677,9 Å- c -eje de la celda unidad 3D es aproximadamente paralelo con el eje de la fibra (véase la Tabla 1), tanto las intensidades meridional y ecuatorial de los tendones derivados contienen información complementaria con respecto a la separación axial entre los sitios de átomos pesados de etiquetado en el N-y C-telopéptido regiones. Un estudio anterior ( 18 ) usando sólo datos

meridionales (001 índices) produjo una estructura 1D detallado de la estructura de embalaje del colágeno mediante reemplazo isomorfo múltiple y dio la separación específica axial de los sitios de etiquetado átomos pesados (una unidad de distancia células fraccionadas de w = 0,33- 0,41). Por lo tanto, la contribución vectorial para el mapa de Patterson correspondiente a lac dirección del eje, que se calcula a partir de los datos de intensidad cercanas al ecuador, que se correlacionan con los vectores observados de la serie meridional. Este hallazgo ayudó a verificar que los procedimientos de ajuste de indexación y la intensidad producido una estimación precisa de los datos, y no sólo una casualidad que produce un bajo valor rms residual.Las fases iniciales.

Las fases iniciales se obtuvieron mediante la búsqueda a través de una matriz dispersa de posibles sitios de átomos pesados etiquetado, basándose en la diferencia 3D Patterson y el conocimiento de la estructura 1D. Bidimensional diferencia Patterson mapas ( 13 ) se generaron a nivel axial de los sitios de unión de átomos pesados determinados a partir de la estructura 1D ( 18 ). Estos fueron comparados con los nativos mapas de Patterson de las escalas misma longitud axial y, utilizados en conjunto, proporcionan una matriz de posiciones posibles de etiquetado en tres dimensiones. Dos principales vectores se utilizaron en la determinación de la ubicación de los átomos pesados: el vector de yoduro de ( U = 0,2, v = 0,4) y el vector de oro ( u = 0,05, v = 0,25), lo que representa la distancia 2D (uv plano) entre el átomo pesado etiquetado telopéptidos no helicoidal. Las posiciones de los átomos pesados de etiquetado se mantuvo constante después de varias rondas de cálculos de fase: yoduro de estar centrado en las ubicaciones N-y C-telopéptido ( U = 0,23, V = 0,51, W = 0,04, y U = 0,45, V = 0,93, W = 0,45, los segmentos 1 y 5, respectivamente) y el oro en esencialmente los lugares opuestos ( U= 0,37, V = 0,09, W = 0,04, y U = 0,31, V = 0,31, W = 0,45, segmentos 5 y 1, respectivamente).Otros detalles de la construcción de modelos, refinamiento y validación se describen en los métodos de apoyo , que se publica como información de apoyo en el sitio web de PNAS (ver también Figs. 11 y 12 y en la Tabla 3, que se publican como información de apoyo en el sitio web de PNAS ).Modelo de Validación.

El R factor para las amplitudes integrados y amplitudes finales del modelo se encontró que era 9,55% y 16,7%, respectivamente, por comparación de los patrones de difracción observados y simulados ( R factor y R sim ; ver la figura 1. ; R w era 21,73%). El modelo es claramente consistente con el mapa de densidad de electrones determinado experimentalmente ( Figs.

2 y y 4),4 ), y las fases experimentales y el modelo se diferencian por ≈ 62 ° [equivalente a una figura de mérito (FOM) de 0,47].Las coordenadas para el modelo monomérico decorin ( 39 ), el dímero recombinante decorina [Protein Data Bank (PDB) Identificación códigos 1XKU , 1XEC y 1XCD ] ( 25 ), y el modelo de fibroblastos colagenasa (AP código ID 1FBL ) ( 40 ) se utilizaron para llevar a cabo estudios iniciales de colágeno y decorina interacciones de colagenasa de colágeno dentro del contexto de la estructura presentada aquí.Todas las estructuras del modelo fueron vistos usando SPOCK ( http://quorum.tamu.edu ) ( 41 ) y X-FIT (42 ). Ambos modelos de colágeno (pasos 3 y 4) comunicados a la AP han sido depositadas como C αtraza como se muestra en las Figs.   2 2- 4 debido a la relativamente baja resolución de este estudio (5.16/11.1 Å). Los factores de estructura observados acompañar la entrada de AP código ID 1Y0F .

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MATERIAL COMPLEMENTARIO

Información de apoyo:

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AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a los Dres. Reed y Iozzo de proporcionar una copia de las coordenadas de su modelo de decorina, Olga Antipova para la comprobación de secuencia crítica, el personal del Equipo de Acceso Biofísica en colaboración (Biocat) (Institutos Nacionales de la Salud con apoyo del Centro de Investigación RR08630), y el personal del Equipo de Biología Estructural del Centro de Colaboración de acceso (SBC-CAT) (apoyado por el Departamento de Energía de Grant W-31-109-ES-38) y el sureste del Equipo Regional de Acceso colaboración (SER-CAT) (instituciones de apoyo se puede encontrar enwww. ser-cat.org/members.html ) líneas de luz por su ayuda en el desarrollo de este proyecto. Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association Gran Medio Oeste afiliado 0435339Z Grant (a JPROO). AM fue apoyado por una beca Leverhulme Investigador Emérito. TJW recibió el apoyo de la Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación Beca BBS/B/09643. El uso de la Fuente Avanzada de Fotones fue apoyada por el Departamento de Energía de EE.UU., Ciencias Básicas de Energía, Oficina de Investigación de la Energía, en virtud del Contrato W-31-109-SP-38.

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ABREVIATURA

ECM

matriz extracelular.

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NOTAS AL PIE

Declaración de conflicto de intereses: No hay conflictos declarados.

Este documento fue presentado directamente (Track II) a la oficina de PNAS.

Depósito de datos: Factores de las coordenadas atómicas y estructura han sido depositadas en el Protein Data Bank,www.pdb.org (AP ID códigos 1Y0F y 1YGV ).

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NOTAS AL PIE‖ Estos dos parches aislados de densidad a 0,6 D y 0,8 D se observaron en el mapa de densidad electrónica inicial ( F o P o ) y no forma parte alguna de las moléculas de colágeno. Sin embargo, los intentos de construir en esta densidad (utilizando dos ricas en leucina de las proteínas de la estructura del modelo de decorina como un modelo genérico para esta densidad; datos no mostrados) resultó en un deterioro significativo de la R factor cuando se modela dentro de los rangos normales de ocupación, y la disminución de la efectos de las ocupaciones moleculares significativamente más bajos hacía difícil evaluar la precisión de la posición relativa del modelado repeticiones ricas en leucina y la orientación dentro de la matriz de colágeno de embalaje. Estos parches de densidad disminuyen en tamaño en la 2 Fo - F c mapa.

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REFERENCIAS

1. Hulmes DJ, Miller A. Naturaleza. 1979; 282 . :878-880 [ PubMed ]

2. Norte de CA, Cowan PM, JT Randall Nature. 1954; 174 . :1142-1143 [ PubMed ]

. 3 JW Smith Nature. 1968; 219 :157-158. [ PubMed ]

. 4 A. Miller Bioquímica de colágeno. New York: Plenum, 1976.

5. Bornstein P., W. Traub las proteínas. London: Academic, 1979.

6. Fraser RDB, MacRae TP Int. J. Biol.. Macromol. 1981; 3 : 193-200.

7. Piez KA, Trus BL Biosci. Rep. 1981; 1 . :801-810 [ PubMed ]

8. Fraser RD, MacRae TP, A. Miller, Suzuki E. J. Mol. . Biol. 1983; 167 : 497-521. [ PubMed ]

9. Fraser RD, MacRae TP, Miller A. J. Mol. Biol.. 1987, 193 .: 115-125 [ PubMed ]

10. Wess TJ, Hammersley A., Wess L., A. Miller J. Mol. Biol.. 1995; 248 .: 487-493 [ PubMed ]

11. Wess TJ, Hammersley AP, Wess L., A. Miller J. Mol. Biol.. 1998, 275 .: 255-267 [ PubMed ]

12. Holmes DF, CJ Gilpin, C. Baldock, U. Ziese, AJ Koster, Kadler KE Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU..2001; 98 . :7307-7312 [ PMC libres artículo ] [ PubMed ]

13. Orgel JP, A. Miller, TC Irving, RF Fischetti, AP Hammersley, Wess TJ Estructura (Londres) 2001; 9:1061-1069.

14. Venturoni M., Gutsmann T., Fantner GE, Kindt JH, Hansma PK Biochem. Biophys. Res. Commun.2003; 303 . :508-513 [ PubMed ]

15. Bella J., M. Eaton, Brodsky B., Berman HM Science. 1994; 266 . :75-81 [ PubMed ]

16. Kramer RZ, Bella J., B. Brodsky, Berman HM J. Mol. . Biol. 2001; 311 :131-147. [ PubMed ]

17. Bradshaw JP, A. Miller, Wess TJ J. Mol. . Biol. 1989; 205 :685-694. [ PubMed ]

18. Orgel JP, TJ Wess, Miller A. Struct. Folding Des. , 2000; 8 : 137-142.

19. Orgel JPRO, Miller A. Irving TC, Wess TJ Fibre Difracción Rev. 2002; 10 :40-50.

20. Petruska JA, AJ Hodge Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.. 1964; 51 . :871-876 [ PMC libres artículo ][ PubMed ]

21. Williamson GK, Hall WH Acta Metall. 1953; 1 :22-31.

22. Hulmes DJ, Wess TJ, Prockop DJ, Fratzl P. Biophys. J. 1995; 68 . :1661-1670 [ PMC libres artículo ][ PubMed ]

23. Hulmes DJ J. Struct. . Biol. 2002; 137 :2-10. [ PubMed ]

24. Nakamura I. Int. J. Biol.. Macromol. 1987; 8 :281-290.

25. Scott, PG, PA McEwan, Dodd CM, Bergmann EM, Obispo PN, Bella J. Proc. Natl. Acad. Sci.EE.UU.. 2004; 101 :15633-15638. [ PMC libres artículo ] [ PubMed ]

26. Vogel KG, Trotter JA colágeno Relat. Res. 1987; 7 :105-114.

27. Birk DE, Nurminskaya MV, Zycband IE Dev. Dyn. 1995; 202 . :229-243 [ PubMed ]

28. Birk DE, Hahn RA, Linsenmayer CY, Zycband EI Matrix Biol. 1996; 15 . :111-118 [ PubMed ]

29. Danielson KG, Baribault H. Holmes DF, Graham H., Kadler KE, Iozzo RV J. Biol. Cell. 1997, 136 .: 729-743 [ PMC libres artículo ] [ PubMed ]

30. Lan Y., C. Cummings, Sheehan JK, Kadler KE, Holmes DF, JA Chapman . proteoglicanos sulfato de dermatán Londres: Portland, 1993.

31. Tenni R., Viola M., F. Welser, Sini P., C. Giudici, Rossi A., ME Tira euros. J. Biochem. 2002; 269 . :1428-1437 [ PubMed ]

32. S. Goldoni, RT Owens, DJ McQuillan, Z. Shriver, R. Sasisekharan, DE Birk, S. Campbell, Iozzo RVJ. Biol.. Chem. 2004; 279 . :6606-6612 [ PubMed ]

33. Scott, PG, Grossmann JG, Dodd CM, Sheehan JK, PN Obispo J. Biol.. Chem. 2003; 278 . :18353-18359 [ PubMed ]

34. Svensson L., Heinegard D., Oldberg A. J. Biol.. Chem. 1995; 270 . :20712-20716 [ PubMed ]

35. Nareyeck G., Seidler DG, D. Troyer, Rauterberg J., H. Kresse, Schonherr E. euros. J. Biochem. 2004,271 .: 3389-3398 [ PubMed ]

36. Brandstetter H., F. Grams, Glitz D., A. Lang, Huber R., W. Bode, Krell HW, Engh RA J. Biol.. Chem.2001; 276 . :17405-17412 [ PubMed ]

37. Nakamuta M., Kotoh K., Enjoji M., H. Nawata Mundial J. Gastroenterol. 2005; 11 . :2264-2268[ PubMed ]

38. Bozec L., M. Horton Biophys. J. 2005; 88 . :4223-4231 [ PMC libres artículo ] [ PubMed ]

39. IT Weber, Harrison RW, Iozzo RV J. Biol.. Chem. 1996; 271 . :31767-31770 [ PubMed ]

40. J. Li, Brick P., MC O'Hare, Skarzynski T., Lloyd LF, Curry VA, Clark IM, Bigg HF, Hazleman BL, TE Cawston, et al. Estructura (Londres) 1995; 3 : 541 - 549.

41. Christopher JA, R. Swanson, Baldwin A Comput. Chem. 1996; 20 . :339-345 [ PubMed ]

42. McRee DE J. Struct. Biol.. 1999; 125 :156-165. [ PubMed ]