生化科技學系微生物學組專題討論

題目：Activation of Host Translational Control Pathways by a Viral Developmental Switch 作者：Carolina Arias, Derek Walsh, Jack Harbell, Angus C.Wilson, Ian Mohr 文章來源：PLos Pathog. 5(3): e1000334. 演講人：Hsiang-Hung Huang 黃翔弘 B95B02019 指導老師：Li-Kwan Chang, Ph.D. 張麗冠 博士 演講日期：December 29th, 2009 演講地點：The 6th classroom

摘要

卡波西肉瘤皰疹病毒 (Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus)具有潛伏期(latency)及溶裂期(lytic cycle)，在進入溶裂期時，病毒需要宿主的資源來促進基因表現，過去的研究對病毒基因轉錄(transcription)階層的調控了解較多，而在轉譯(translation)階層著墨較少，轉譯起始因子 (eukaryotes translation initiation factors, eIFs) eIF4F complex*的形成在轉譯起始扮演了最重要的角色，而 eIF4F complex透過 eIF4E與真核生物 mRNA 5’cap 結合，eIF4E 最初會與 eIF4E-binding protein 1 (4E-BP1)結合，但經過 mamalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1)的調控分離而與 eIF4G 結合成 eIF4F[1]，完整的 eIF4F complex 中還包含了 eIF4E-kinase Mnk1**與poly(A)-binding protein (PABP)。此篇研究圍繞在 eIF4F complex 合成對於病毒進入溶裂期的影響，以 TREx BLBL1-RTA (primary effusion lymphoma (PEL)-derived B-cell line)感染 KSHV 做為實驗對象，首先，以 doxycycline (DOX)加上 phorbal ester (TPA)做為誘導藥物，使被感染的細胞產生 RTA 促進病毒基因轉錄，再開始針對前述的轉譯調控因子進行探討。在溶裂期時，eIF4F complex 調控的變化會如何影響病毒溶裂期的進行，分別由 4E-BP1、PABP、Mnk1 三個方面討論，實驗結果發現，當病毒經過誘導後會使 4E-BP1 過磷酸化的情形增加，進而促進 eIF4F的形成，但利用 Rapamycin 抑制 mTORC1 的結果是 4E-BP1 對於溶裂期轉譯的影響有限；另外，PABP 與 eIF4F 結合能力降低，可以發現病毒所使用的 initiation complex 與細胞可能不同，抑制 Mnk1 會讓 RTA 與 K8.1(KSHV late gene)表現降低，但 RTA 的 mRNA 量並不受影響，由上述結果可得到，雖然病毒已經被誘導開始大量產生 mRNA，但是轉譯的調控在病毒從潛伏期進入溶裂期扮演很重要的角色，其中以 Mnk1 磷酸化 eIF4E 的影響最大。 *：eIF4F complex包含cap-binding subunit (eIF4E)與RNA helicase (eIF4A)結合到 eIF4G (是 eIF4F

的 scaffolding protein，會與 eIF3-bound 40S subunit 連結) **: Mnk1對 eIF4E的磷酸化使 eIF4E對 5’ cap的親和力更高且更容易結合成 translation initiation

complex [2]

前言

本實驗之重要性 KSHV 的生命週期可分為潛伏期以及溶裂期，在潛伏期中，KSHV 基因的複製完全隨

著細胞的複製而進行，但在溶裂期時，KSHV 的基因開始大量的複製並大量的表現，進而摧毀細胞，這其中最重要的問題就是，讓 KSHV 從潛伏期轉換到溶裂期是由哪些因素所控制？KSHV 如何活化 transcription 的機制被了解得較多，包含轉譯活化子 RTA 使病毒mRNA 大量表現，但是對於蛋白質表現也是相當重要的 translation 在病毒進入溶裂期時扮演什麼樣的角色的問題尚待解決，本研究從 KSHV 感染對於 translation initiation factors eIF4F complex 的影響開始著手，希望能夠找出當 KSHV 進入溶裂期時，病毒基因在細胞中轉譯的控制機制與潛伏期轉換至溶裂期是否有關。

前人做過的研究 在溶裂期中，KSHV 都是透過細胞 RNA polymerase ΙΙ進行 mRNA 的轉錄，這表示

KSHV 的 mRNA 相似於真核細胞的 mRNA，具有 5’ capped 和 polyadenylated tail[3]，而研究也指出病毒 mRNA 的轉譯完全依賴細胞內 ribosome[4]，並利用 translation initiation factors 如 eIF4F complex 等以確保能夠正確的吸引細胞中 ribosome 的作用。

作者為何要做本研究 雖然已經確定當進入溶裂期的時候，KSHV利用細胞的 ribosome進行mRNA的轉譯，

但是是否轉譯的機制也是病毒進入溶裂期很重要的步驟，到目前為止這個方面的問題的解

是還相當的少，也因此作者從轉譯開始的第一步，eIF4F complex 的形成以及調控 eIF4F complex 結合的各種因子研究。

本研究欲完成之項目 1.找出最佳誘導條件 2.確認進入溶裂期細胞轉譯機制改變 3.4E-BP1 對於溶裂期的影響

5.eIF4F complex 的形成是增加還是減少 6.eIF4E kinase Mnk1 對於溶裂期的影響

材料與方法

細胞株 TREx BCBL1 和 TREx BCBL1-RTA (infected by KSHV)

卡波西肉瘤皰疹病毒(Kaposis’s sarcoma-associated herpesvirus) 屬於 γ-herpesvirus subfamily，具有潛伏期以及溶裂期兩種生活周期，潛伏在免疫系統

中，當免疫系統轉弱時會造成細胞不正常增生形成卡波西肉瘤等症狀。 試劑誘導

使用 TPA,、DOX 誘導被 KSHV 感染的 TREx BCBL1-RTA 進入溶裂期，發現以TPA+DOX 誘導效果最佳且有協同作用。

免疫螢光染色 (Immunofluorescence analysis) 使用免疫螢光染色的方法觀察在細胞中蛋白質的表現情形

TREx BCBL1, TREx BCBL1-RTA 全蛋白質分析

使用藥品誘導一定時間後，將 6×105 的細胞在 7mCi/ml, S35 與加了血清的 DMEM(缺少 Methionine 和 cyctein)培養 30 分鐘，破菌處理後的液體用 SDS-PAG 進行分離，再以X-OMAT X-ray film 曝光過夜。

等電聚焦 (Isoelectric Focusing, IEF) 利用在相同環境 pH 下，蛋白質有修飾或未修飾具有不同帶電量的特性在膠體中通過

電場分離蛋白質。 親和性層析法 (7-Methyl GTP chromatography)

使用48小時誘導的細胞株，破菌之後通過填充7-Methyl GTP sepharose的管柱將eIF4E純化。

免疫轉印 (Immunoblotting, IB) 將 48 小時誘導的細胞破菌後，以 SDS-PAGE 分離，然後轉印到膜上，並用適當的一

次抗體辨識、二次抗體呈色觀察蛋白質的狀況。 Real time Reverse Transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)

Total RNA 從 1x106 TREx BCBL1-RTA 48 小時誘導中取出，初始濃度 250ng，反轉錄後取出 1% cDNA 產物用 PCR 放大，之後以 2% agarose gel 分離，以掃描式光度計測量濃度。

結果與討論

以藥品誘導細胞株 lytic cycle 活化的協同作用

由於 TREx BCBL1 經 KSHV 感染後直接以藥品處理誘導的效果不好，所以另外發展TREx BCBL1-RTA，在 tetracycline-inducible promoter 的控制之下表現 RTA。

將 TREx BCBL1-RTA 分別以 DMSO、TPA+DOX、TPA、DOX 誘導 24 及 48 小時，以免疫螢光染色的方式將 ORF59 (KSHV delayed-early protein) 標上綠色，DNA 以propidium iodide (red signal)染色，若細胞顯示綠色表示細胞有產生 ORF59 進入溶裂期的最後階段，若無則呈現 DNA 染色的結果 (圖一 A)，另外，挑選 1000 個細胞計算誘導數量 (圖一 B) ，再加上 immunoblotting 的結果 (圖一 C) 可以發現 TPA, DOX 和 TPA+DOX雖然都可以誘導細胞，但是 TPA+DOX 的效果最好，且在 immunoblotting 的結果中看見K8.1 (KSHV late gene)，K8.1 做為細胞真正被誘導進入溶裂期而大量複製病毒基因的指標，所以接下來的實驗都採用 TPA+DOX 做為誘導。

從 latency 到 lytic cycle 細胞株內的全蛋白質改變 將 TREx BCBL1 和 TREx BCBL1-RTA 以 TPA+DOX 誘導 24h 及 48h，將細菌的蛋白

質標定上同位素 S35，破菌後的破菌液用 SDS-PAGE 分離之，以 X 光底片曝光一晚(圖二 A)，可以看到TREx BCBL1並沒有太多改變，但被KSHV感染的細胞卻有一些條紋逐漸加深，一些逐漸消失 (加*處)，用 immunoblotting 的方法觀察 RTA 及 K8.1 (圖二 B)。

在誘導時抑制 4E-BP1 轉譯抑制的影響 eIF4F complex 合成的機制如圖二 A 所示[]，為了檢視誘導對於 4E-BP1 過磷酸化

(hyperphosphorylation) 所產生的影響，以 TPA+DOX 誘導 48 小時，並加入 mTORC1 的抑

制物 Rapamycin 觀察，不管是在 KSHV 是否感染的細胞中，過磷酸化的 4E-BP1 都存在，但是在 KSHV 感染且誘導的細胞發現過磷酸化的 4E-BP1 反而增加 (圖二 B, lane2)，可以視為促進 eIF4F 合成的因子之一，但是比較加入 Rapamycin 的細胞，雖然過磷酸化的4E-BP1 有減少(圖二 B, lane1)，但是 ORF59 經過免疫螢光染色以及 RTA、 K8.1 在免疫轉印上的表現與未加 Rapamycin 的並無顯著差異，可以用圖二 C 中以 RT-PCR 測量細胞內相對充足的 mRNA (actin、GAPDH、IL2、β-catenin)，發現被誘導細胞 mRNA 減少的數量大約在 1~5 倍之間，這有可能是加入 Rapamycin 之後免疫轉印無法得到顯著差異的關係。

誘導促進 eIF4F 合成 如果轉譯持續進行，表示 eIF4F 可以正常合成，使用 7-M GTP sepharose 做為管柱填

充物進行親和性層析法分離出與 eIF4E 有關的蛋白質，用 non-ionic detergent 流洗，分離出來的蛋白質以SDS-PAGE分離(圖三A)，可以發現在KSHV感染且誘導的細胞株中eIF4G變多 (lane 2)，而 eIF4E 的數量沒有顯著差異。而圖四 B 的結果顯示，eIF4E、eIF4G、eIF4A、BABP、4E-BP1 在細胞中，不管有沒有誘導這幾種蛋白質的數量都沒有顯著的差別，這表示 eIF4F complex 的增加並非因為構成的蛋白質增加而發生。

雖然 eIF4F complex 變多，但圖四 A 中的 PABP 並隨著出現，於是作者利用免疫螢光染色的方式觀察 PABP 與誘導細胞的關係 (圖四 E)，左邊是誘導 48 小時，可以發現 PABP在細胞內的分布是一樣的，推測造成 PABP 在圖四 A 量過少的原因是病毒的蛋白質改變了 PABP 對於 eIF4G 的吸引力所致。

誘導後 eIF4E 磷酸化的影響 當 eIF4F complex 形成後，eIF4E kinase Mnk1 會結合到 eIF4G 上磷酸化 eIF4E 促進其

結合，為了知道 eIF4E 的磷酸化情形，分別使用誘導 24、48、72 小時的細胞株純化 eIF4E，並利用等電聚焦 (isoelectric focusing, IEF) 的方式分離 phosphorylated-eIF4E 和unphosphorylated-eIF4E (圖五 A)，結果發現誘導後的細胞隨著時間的推移phosphorylated-eIF4E 的數量增加。

於是問題推移到影響 Mnk1 活性的方面，目前已知 MnK1 受到上游信號的影響活化，其中包含了 MAPKs (mitogen-activated protein kinase)、ERKs (extracellular regulated kinase)、p38 (圖五 B)，於是把感染與未感染的細胞株以 TPA、DOX、TPA+DOX 誘導後用 SDS-PAGE分離蛋白質免疫轉印 (圖五 CD)，可以發現當只有 TPA 作用時，不管有沒有感染的細胞ERK 磷酸化的程度都會變高(圖五 C, lane 236)，但 DOX 僅在有感染的細胞有作用 (圖五C,lane 3)，可見得 RTA 的表現會使 ERK 磷酸化程度變高，另外以相同方式觀察 p38 並沒有顯著的差異存在。

eIF4E-kinase Mnk1 與 RTA Mnk1 對於溶裂期的影響還未知，於是作者利用 CGP57380，一種 Mnk1 的抑制物與

誘導物 TPA+DOX 一起加入細胞株誘導 48 小時，之後利用 IEF 或 SDS-PAGE 分離並用免疫轉印偵測，phosphorylated-eIF4E 的量下降了 (圖六 A)，用免疫螢光染色偵測 ORF59 下降了，免疫轉印 RTA 和 K8.1 也都下降 (圖六 B)，另外利用 Real time RT-PCR 的技術，將ORF50 (RTA)用(5’-CACAAAAATGGCGCAAGATGA-3’)和(5’-TGGTAGAGTTGGGCCTTCAGTT-3’)兩段 primer 反轉錄得到，28S RNA 做為控制組，

以 5’AAACTCTGGTGGAGGTCCGT-3’和 5’-CTTACCAAAAGTGGCCCACTA-3’反轉錄得到，實驗結果發現，加入 CGP 並不會使 ORF50 (RTA) mRNA 下降(圖六 C)，並且在最後以RhoGDI做為標準測量RTA蛋白質的表現情況(圖六D)，顯然RTA蛋白質的量由於Mnk1被抑制而有顯著的減少。

參考文獻 1. Raught B, Gingras AC (2007) Signaling to translation initiation. 2. Thompson B, Wickens M, Kimble J (2007) Translation control in development. 3. Bartkoski M, Roizman B(1976) RNA synthesis in cels infected with herpes simple virus. 4. Mohr I, Pe’ey T, Mathews MB(2007) Protein synthesis and translational control during viral

infection. 圖表

圖一. A. 把 TPEx BCBL1-RTA 細胞株用 DMSO、TPA、DOX、TPA+DOX 誘導 24 及 48 小時，經過

免疫螢光法 (Immunofluorescence) 將 ORF59 標定成綠色，DNA 以 propidium iodide 標定成紅色。

B. 將每一種誘導方式取至少 1000 顆細胞並進行三重複實驗得到的誘導百分比。 C. 免疫轉印後觀察 RTA 及 K8.1 在不同誘導條件下的表現情形。

圖二 A. TREx BCBL1-RTA 和 TREx BCBL1 全蛋白質的電泳，打星號的部分是蛋白質表現有隨著時

間增加或減少的情形發生。 B. TREx BCBL1-RTA 和 TREx BCBL1 以 TPA+DOX 誘導 24 及 48 小時觀察誘導情形。 C. 以 RT-DNA 觀察細胞內 mRNA 的表現情況。

圖三. A. 4E-BP1 如何抑制 eIF4E 結合到 eIF4G 的機制。 B. 在不同的誘導條件下 48 小時後，TREx BCBL1-RTA 和 TREx BCBL1 中 4E-BP1 過磷酸化

(hyperphosphorylated)的情形。 C. 免疫螢光染色統計ORF59與免印轉印RTA和K8.1在抑制4E-BP1的情況下是否具有差異。

圖四. A. 細胞經過誘導後將 eIF4E 以親和性管柱純化，經過 SDS-PAGE 分離後免疫轉印偵測 eIF4G

的結果。 B. 細胞內不管是否有誘導各種 translation initiation factor 表現量的觀察。 C. 感染細胞與一般細胞 (primary human dermal fibroblasts, NHDFs)的比較。 D. 4E-BP1 在誘導與非誘導細胞中過磷酸化程度的改變。 E. 取圖 A 中誘導 48 小時的細胞，左邊以 ORF59 (green)及 PABP (red)免疫螢光染色；右邊以

ORF59 (green)、PABP (red)、DAPI (blue)染色。

圖五. A. 將誘導 24、48、72 小時的細胞破菌後觀察 eIF4E 在細胞內磷酸化的情形，利用等電聚焦法

(electric focusing) 分離。 B. Mnk1 調控 eIF4E 磷酸化機制簡圖。 C. 使用不同的誘導條件觀察 ERK 磷酸化的程度。 D. 使用不同的誘導條件觀察 p38 磷酸化的程度。

圖六. A. 利用 CGP57380 抑制 Mnk1 的活性並觀察 eIF4E 的磷酸化情形。 B. 免疫螢光法計算 ORF59 以及免疫轉印觀察 RTA、K8.1 在抑制 Mnk1 活性條件下的表現情

形。 C. RT-PCR 觀察細胞內抑制 Mnk1 並誘導後是否影響 ORF50 (RTA) mRNA 的數量。 D. 以 RhoGDI 做為標準，計算在抑制 Mnk1 與否 RTA 蛋白質所表現的量。