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CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE GENETICHE

- Malattie Monogeniche (Mendeliane) A.D., A.R., X-L. - Malattie Cromosomiche (Anomalie di numero e di struttura) - Malattie Multifattoriali (o Poligeniche)

- Malattie da Mutazioni delle Cellule Somatiche

- Malattie da Mutazioni nel Genoma Mitocondriale

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LA CITOGENETICA E LE ANOMALIE

CROMOSOMICHE


Che cos’e’ la citogenetica? Lo studio della: •  Struttura, funzione ed evoluzione dei cromosomi •  Comportamento dei cromosomi durante la divisione somatica e

germinale

La citogenetica nasce nel 1956 quando Tjio e Levan svilupparono tecniche per l’analisi cromosomica e stabilirono che il numero di cromosomi umani in condizioni di normalita’ era 46.


•  Le malattie cromosomiche costituiscono una grossa categoria di malattie genetiche. Spesso sono associate alle seguenti caratteristiche cliniche:

– Perdita della capacita’ riproduttiva – Malformazioni congenite – Ritardo mentale – Fenomeni oncologici


•  Le malattie cromosomiche costituiscono una grossa categoria di malattie genetiche

– Responsabili di > 100 differenti sindromi

genetiche definite ed identificabili – Sono piu’ comuni di tutte le malattie genetiche

mendeliane da alterazione di un singolo gene – Colpiscono l’1% dei nati vivi – Colpiscono il 2% delle gravidanze


MALATTIE CROMOSOMICHE

- Dovute alla deficienza od all’eccesso di interi cromosomi o frammenti di cromosoma (non un singolo gene ma molti geni)

- Rare (trisomia 21 frequente) se prese individualmente ma frequenti come gruppo

- Rischio di ricorrenza familiare molto variabile, secondo il tipo (da 1:2 a 1:1000)

- Sintomi frequenti : ritardo mentale, bassa statura, segni dismorfici

- Frequente causa di aborto - Frequenza: ~ 7/1000 neonati


Cromatidi

fratelli

Cromatidi non fratelli

Paio di cromosomi omologhi

Centromero

Telomero

Centromero

Telomero

p

q


•  Centromero unisce i due cromatidi fratelli per un’appropriata segregazione alla mitosi ed alla meiosi •  e’ il sito di formazione del cinetocoro, la struttura che lega i microtubuli del fuso e regola i movimenti dei cromosomi durante la divisione cellulare

•  I telomeri proteggono le estremita’ dei cromosomi dalla degradazione e dalla fusione coda-coda con altri

cromosomi


LE FASI DELLA MITOSI

•  Interfase •  Profase •  Metafase •  Anafase •  Telofase


meiosi

•  La meiosi è il processo che porta alla formazione dei game@

•  I game@ sono cellule aploidi: hanno la metà dei cromosomi delle cellule diploidi

•  23 è il numero di cromosomi dei game@ •  46 è il numero di cromosomi di ogni altra cellula umana

•  La meiosi consiste in due divisioni cellulari meiosi I (riduzionale) e meiosi II (equazionale) che producono quaFro cellule aploidi


meiosi

Meiosi I Replicazione del DNA

46 cromosomi 92 Croma@di / 92 dsDNA

Divisione riduzionale separazione delle coppie di cromosomi 23 cromosomi 46 croma@di / 46 dsDNA

Meiosi II Separazione dei croma@di

23 cromosomi 23 croma@di / 23 dsDNA


Oogonium

Primary oocyte

Secondary oocyte

Polar Body I

Fertilized Ovum

Polar Body II

maschio

spermatogonio

spermatocita primario

spermatocita Secondario

4 spermatidi

4 spermatozoi

Mitosi alla pubertà

Per tutta la vita

Meiosi in

64gg


Mitosis Periodo fetale

alla nascita o prima

dopo la nascita

dopo la pubertà

Alla fertilizzazione

Meiosi in progress

Si arresta al diplotene

della meiosi I

Meiosi I completa

Si arresta alla metafase II

Meiosi II completa

Oogonio

oocita primario

oocita secondario e corpo polare I

Fertilized Ovum & Polar body II

femmina


Come distinguiamo i cromosomi

I cromosomi possono essere definiti (diverse nomenclature) in base alla dimensione, alla posizione del centromero ed al pattern di bande (bandeggio).


0750


Morfologia dei cromosomi

- Metacentrico = cromosoma con area centromerica nel tratto centrale della sua lunghezza. I due bracci p e q risultano di uguale lunghezza (1,3,16,19,20) - Submetacentrico = cromosoma con area centromerica non equidistante dalle due estremità. I due bracci risultano pertanto di ineguale lunghezza (p < di q) (2,4,5,6,7,8,9,10,11,12,17,18,X,Y) - Acrocentrico = cromosoma con centromero in posizione subterminale (13,14,15,21,22)


Le bande dei cromosomi Le bande cromosomiche si definiscono sulla base del contenuto

di DNA delle diverse porzioni del cromosoma. Diversa risoluzione e diverse tecniche Per quello che riguarda la nomenclatura le bande di ciascun cromosoma sono numerate per convenzione a partire dal centromero, verso l’estremita’ del braccio corto e del braccio lungo.


Tecnica Procedura Banding pattern

bandeggio G Proteolisi limitata seguita dalla colorazione Giemsa

Le bande scure sono ricche in AT Le bande chiare sono ricche in GC

bandeggio R denaturazione al calore seguita dalla colorazione con Giemsa

Le bande scure sono ricche in GC Le bande chiare sono ricche in AT

bandeggio Q digestione enzimatica e colorazione con un colorante fluorescente, cioè la Quinacrina

Le bande scure sono ricche in AT Le bande chiare sono ricche in GC

bandeggio C denaturazione con idrossido di bario e poi colorazione con Giemsa

Le bande scure sono ricche in eterocromatina costitutiva


Bandeggio Giemsa o bandeggio G1(G-bands trattamento bland con tripsina seguito da colorazione Giemsa). Bande chiare e scure alternate


Nomenclatura del bandeggio

Pattern di bande G del cromosoma 7 ad alta risoluzione. Tecniche piu’ recenti permettono di esaminare i cromosomi in prometafase (maggiore risoluzione).


Cariotipo: patrimonio cromosomico di una cellula o di un individuo, e’ costituito da cromosomi visualizzati con tecniche citogenetiche (in prometafase).


In condizioni normali e’ costituito da 22 coppie di autosomi piu’ i due cromosomi sessuali XX, XY

46, XX 46, XY

Cariotipo


Cariotipo

Un cariotipo viene descritto indicando prima di tutto il numero di cromosomi, seguito dalla costituzione dei cromosomi sessuali e da qualsiasi anomalia di numero e di struttura per le quali ci sono delle nomenclature convenzionali.

47, XY, +21 indica maschio XY con 47 cromosomi di cui 1 cromosoma 21 in piu’ (sindrome di Down) 45, XY, der (14;21) (q10;q10) indica maschio XY con 45 cromosomi ed al posto di 1 cromosoma 14 e 21 normali si trova un cromosoma derivativo dalla traslocazione del braccio lungo (q) del 21 sul braccio lungo del 14.


Quali tessuti si possono utilizzare per studiare i cromosomi?

•  Adulti e bambini – Linfociti estratti da sangue

(3-5 ml) – Fibroblasti ottenuti mediante biopsia cutanea


•  Korf (2000) Figure 5-4

- sangue periferico

Isolamento di cromosomi umani da campioni ematici


Piastra metafasica preparata da linfociti umani di sangue periferico

Campione sangue periferico+ fitoemoagglutinina (agglutina globuli rossi e stimola linfociti). Cellule vengono bloccate in mitosi con inibitore microtubuli (es. colchicina). Cellule vengono lisate e e cromosomi metafasici colorati ed esaminati al microscopio.


•  In epoca prenatale: – Liquido amniotico (15-20 ml) – Villi coriali – Prodotto di concepimento

Quali tessuti si possono utilizzare per gli studi clinici ?


Origine dei tessuti (2)

•  Cancro: – Midollo osseo (~1 ml) –  tumori


Anomalie cromosomiche Sono responsabili del •  50% degli aborti del primo trimestre di gravidanza •  5% dei bambini/feti nati morti •  sono presenti in circa 0.5-1% delle nascite

- Trisomia 21 - Sindrome di Down - Sindrome dell’X Fragile

•  Anomalie cromosomiche cellule somatiche sono presenti nei tumori


Tipi di anomalie cromosomiche •  1) Numeriche

a) Alterazioni della ploidia b) Aneuploidia: Monosomie, Trisomie •  2) Strutturali


1a) Alterazioni della ploidia

Diploide: un set completo di materiale genetico consistente in coppie di cromosomi ognuno dei quali derivante da uno dei genitori. La maggioranza delle cellule animali, con eccezione dei gameti, sono diploidi. Il genoma umano diploide ha 46 cromosomi Aploide: Il corredo cromosomico presente nelle cellule germinali mature (spermatozoi ed ovociti). Nella specie umana il corredo cromosomico aploide corrisponde a 23 cromosomi.


Triploidie e tetraploidie Cellule che presentano un numero triploide (3n) di cromosomi sono identificate come 69,XYY; 69,XXX; o 69,XXY. La triploidia puo’ derivare dalla fecondazione di un singolo ovocita da parte di due spermatozoi (dispermia) o da una difettosa meiosi nel corso della produzione di un gamete diploide. Si puo’ verificare anche la tetraploidia (92 cromosomi o 4n) che e’ di solito il risultato di un difetto verificatosi nella prima divisione zigotica. Sia triploidie che tetraploidie sono in genere letali e risultano in aborto spontaneo.


TRIPLOIDIA Frequenza alla nascita = 1/10.000 Frequenza negli aborti = 1/14

Cariotipo 69,XXY 57%

Cariotipo 69,XXX 40%

Cariotipo 69,XYY 3%


1b) Aneuploidie

•  Acquisizione di un cromosoma: trisomia •  Perdita di un cromosoma: monosomia


Cause dell’aneuploidia


Conseguenze cromosomiche di una non-disgiunzione che si verifichi alla prima o alla seconda divisione

meiotica


Monosomie e trisomie sono compatibili con la vita?

Le monosomie come le trisomie sono quasi sempre letali a meno che non interessino un cromosoma sessuale. Vi sono tuttavia nell’uomo tre trisomie autosomiche compatibili con la vita: •  la trisomia 21 (sindrome di Down) •  la trisomia 13 (sindrome di Patau) •  la trisomia 18 (sindrome di Edwards)


Il 70% delle gravidanze non giunge a termine

trisomia 21 Down


Pazienti osservati da J.Langdon Down

Royal Earlswood Asylum for Idiots in 1880


Jerome Lejeune collego’ il fenotipo ad una trisomia del

cromosoma 21


1/800 nati vivi


Quali sono le cause della trisomia 21 •  90-95% dei casi la Sindrome di Down e’ dovuta ad una non

disgiunzione meiotica –  80% la non disgiunzione si verifica nella meiosis I –  Nel 95% dei casi il cromosoma 21 in piu’ e’ di origine materna –  Stretta correlazione con l’eta’ materna

•  1-4% e’ dovuta a traslocazioni sbilanciate (di cui il 50% de novo ed il 50% ereditarie> Down familiare) –  9% bambini Down nati da madri con eta’<30 anni; –  solo 2% quelli nati da madri con eta’ >35 anni –  Nel 60% braccio lungo cromosomi 14 (13 e 15); 40% cromosomi gruppo G

(21 e 22; 90% 21q;21q maggior parte de novo)

•  1-3% dei casi si tratta di mosaico con contemporanea presenza di linea 47,+21, insieme alla linea normale euploide –  Manifestazioni cliniche attenuate


Sindrome di Down da traslocazione


anomalie cromosomiche riscontrate

925 15

6

5 17

3 2

27

1 10

100

1000 Numero

free T21

t14;21

t13;21

t15;21

t21;21

t21;22

altre t

mosaicism

Anom

alia

q

p 11.2

11.1

11.1

11.2

21

22.1

22.2

22.3

12

13

D21S17

ETS2

MX1

DSC

R

HC21


  Neurologici : –  Ritardo mentale 100%

–  Alzheimer dopo i 35anni 100%

  Ipotonia muscolare 100%

  Bassa statura 70%

  Testa :

–  Brachicefalia 75%

–  Epicanto 60%

–  brushfield spots iride 55%

–  lingua protrudente 45%

–  orecchie displastiche 50%

trisomia 21 Down

40.000 casi in Italia


  Arti corti, mani larghe 65%

  Mignolo corto 60%

  Solco palmare trasverso 60%

  Cuore

–  Difetti cardiaci congeniti 40%

–  Canale atrioventricolare 16%

  Anomali gastrointestinali

–  Atresia/stenosi duodenale 250x

–  ano imperforato 50x

–  Hirschsprung 300x

  Sangue:

–  Leucemia acuta megacariocitica 300x

–  Leucemia (ALL e AML) 10-20x

trisomia 21 Down


Ancora clinica sindrome di Down

I bambini Down hanno un rischio di sviluppare leucemie 15-20 volte maggiore, un’aumentata suscettibilita’ alle infezioni, un’aumentata frequenza di cataratta, disfunzioni tiroidee e segni d’invecchiamento precoce. Praticamente tutti gli individui affetti dalla sindrome di Down che sopravvivono oltre i 35 anni mostrano le caratteristiche patologiche del morbo di Alzheimer. Con il miglioramento delle terapie mediche e chirurgiche l’aspettativa di vita e’ passata dai 9 anni del 1930 ai quasi 60 di oggi.


trisomia 18 Edwards

• (1/6.500 nati) • 90% dei casi nondisgiunzione materna • M/F = 1/4 • Giunge a termine solo il 2.5% dei concepimenti • Di questi il 33% muore nel primo mese, il 50% entro 2 mesi • Oltre 100 anomalie

• Peso sotto la norma, difficoltà suzione • Ipotonia • Idrocefalo, epilessia • Malformazioni cardiache • sinclinodattilia, unghie poco sviluppate • piedi a calcagno prominente • Gambe incrociate


trisomia 13 Patau

• (1/12.000-20.000 nati) • 90% dei casi nondisgiunzione materna • Giunge a termine solo il 2.5% dei concepimenti • Di questi il 33% muore nel primo mese, il 50% entro 2 mesi

• Peso sotto la norma, difficoltà suzione • Oloprosencefalia, microcefalia • Cecità e sordità • Occhi che possono fondersi • Labiopalatoschisi 80% • epilessia • Malformazioni cardiache • sinclinodattilia • piedi a calcagno prominente

http://www.livingwithtrisomy13.org


Anomalie numeriche di cromosomi sessuali

•  Sindrome di Turner, monosomia cromosoma X

•  Sindrome di Klinefelter, XXY


XX o XY

•  Il sesso maschile è determinato dalla presenza del

cromosoma Y

•  Si sono evoluti meccanismi per compensare la differenza di dosaggio genico del cromosoma X, presente in 2 copie nelle femmine e in 1 copia nei maschi


1.  il cromosoma X raddoppia l’espressione di tutti i geni contenuti, cioè si produce 2 volte più RNA

2.  nelle femmine uno dei due cromosomi X è inattivato casualmente in ciascuna cellula allo stadio di blastocisti

2 cromosomi X nelle donne,

1 solo negli uomini


Sindrome di Klinefelter (47,XXY) 1:900-1:600 maschi

•  Il 50% delle gravidanze giunge a termine

•  Fenotipo maschile •  Caratteristiche principali: •  Statura alta

–  Ipogonadismo, bassi livelli di testosterone, mancata produzione di spermatozoi (azoospermia) e quindi sterilità

–  Ginecomastia –  Sia l’intelligenza sia l’attesa di vita sono

quasi normali


Altre forme citogenetiche

•  Ma ci sono anche Klinefelter 48,XXYY and 48,XXXY in 1 caso su 17,000 e 1 su 50,000 mnati maschi

•  49,XXXXY in 1 caso su 85,000 -100,000 •  Ci sono maschi 46,XX in cui avviene una

traslocazione di parte di cromosoma Y sul cromosoma X che include la sex determining region (SRY)

•  mosaici


Trisomia X (47,XXX) 1:1.200

•  Il 70% delle gravidanze giunge a termine •  Errore nella disgiunzione materna e correla

con l’età materna •  Caratteristiche principali:

– Statura alta – Fertilità normale, irregolarità ciclo – Sia l’intelligenza sia l’attesa di vita sono

normali


Maschio (47,XYY) 1:1.000 maschi

•  Fenotipo maschile •  Caratteristiche principali:

– Statura alta – Fertilità normale – Non vi è correlazione con l’età paterna – Sia l’intelligenza sia l’attesa di vita sono

perfettamente normali


Monosomia X (45,X0) Turner

Prende il nome dall’endocrinologo Henry Turner che la descrisse nel 1938

La sindrome di Turner (TS) definisce un complesso fenotipo umano femminile, dovuto a completa o parziale assenza del secondo cromosoma sessuale

Dipende da un errore nella spermatogenesi nell’80% dei casi e non correla con l’età dei genitori

Un precedente figlio con TS non aumenta il rischio riproduttivo previsto per una coppia di pari età



È l’unica monosomia compatibile con la vita, ma il 98% di tutti i feti monosomici TS va incontro ad aborto spontaneo

L’incidenza negli aborti è circa il 7-10%, mentre alla nascita è 1/2500 femmine.

Non è chiaro perché il cariotipo 45, X0 sia letale in utero ed invece compatibile con la sopravvivenza postnatale

La vera monosomia del cromosoma X è responsabile del 45% dei casi TS; gli altri hanno mosaicismo (45, X0/46, XX) e/o un anormale cromosoma X o Y

Un basso livello di mosaicismo somatico Turner, inferiore al 2%, è di normale riscontro nella popolazione



Le ovaie sono allungate e formate da tessuto stromale privo di follicoli:gli oociti sono spesso andati in apoptosi prima dei 2 anni di vita L’insufficienza ovarica prepuberale porta ad amenorrea primaria, sterilità e carenza di estrogeni In meno del 10% dei casi, la pubertà può verificarsi e sono possibili gravidanze con un aumentato rischio di perdita fetale Anche in rapporto all’eterogeneità del genotipo, il fenotipo si manifesta in modo molto variabile


Monosomia X (45,X0) Turner 1:2.500

•  patologie dell’orecchio medio (otite media ricorrente) •  Linfedema con rigonfiamento delle mani e dei piedi •  pterigio del collo (presenza di pliche cutanee con •  aspetto di sfinge) •  il quarto metacarpo (anulare) più corto •  una mandibola più piccola (micrognazia) •  torace largo con aumento degli •  spazi intercostali •  l’attaccatura bassa delle orecchie e dei capelli •  Si possono anche riscontrare cardiopatia sinistra

(valvola aortica dicuspide, coartazione aortica), ipertensione e anomalie renali


Le regioni PAR presenti sui cromosomi sessuali contengono geni che non sono inattivati, perché il doppio dosaggio è

assicurato comunque

PAR1 ha 24 geni, PAR2 ha solo 4 geni


Il gene SHOX Short stature HOmeoboX-containing

•  Mutazioni o delezioni del gene SHOX nella regione PAR1 causa ritardo di crescita e bassa statura.

•  La bassa statura di donne con sindrome di Turner Syndrome (X0) è il risultato di una sola copia di SHOX (ma anche il quarto metacarpo corto)

•  La maggiore statura nel Klinefelter (XXY) e nella tripla X (XXX) potrebbe essere il risultato di 3 copie di SHOX


2) Anomalie strutturali cromosomiche

Riguardano cellule con uno o piu’ cromosomi anormali contenenti

riarrangiamenti strutturali Delezioni Duplicazioni

Inserzioni Traslocazioni (reciproche e robertsoniane) Inversioni (pericentriche e paracentriche) Cromosomi ad anello Isocromosomi


Delezioni cromosomiche

Una delezione causa la perdita di una porzione di cromosoma

Delezione terminale Delezione interstiziale


Esempio di sindrome da delezione


Duplicazioni •  La duplicazione causa l’aumento del

numero di copie di una particolare regione cromosomica


Inversioni

L’inversione si verifica per duplice rottura seguita da rotazione di 180o del frammento compreso tra i punti di rottura e reinserimento dello stesso nel cromosoma. L’ordine dei geni nel tratto reinserito risulta pertanto invertito. Se la regione compresa tra i punti di rottura non include il centromero l’inversione si dice paracentrica; se invece comprende anche la regione centromerica, l’inversione si dice pericentrica.


inversioni

Paracentrica, braccio corto

Paracentrica, braccio lungo

Pericentrica


Gli isocromosomi derivano da una fissione anomala dei centromeri e causano o duplicazione del braccio corto con delezione del braccio lungo (ISO p) o duplicazione del braccio lungo con delezione di quello corto (ISO q). In pratica si viene a costituire un cromosoma metacentrico costituito da due bracci identici (corti oppure lunghi).

Isocromosoma


Traslocazioni

Aberrazioni cromosomiche associate col trasferimento di un segmento cromosomico in una nuova posizione del genoma e quindi su un altro cromosoma. Si possono riconoscere due tipi principali di traslocazioni: •  Reciproche •  Robertsoniane (fusioni centriche) - coinvolgono cromosomi acrocentrici


traslocazioni bilanciate

•  lo scambio di segmenti cromosomici

avviene senza perdita di alcuna informazione genetica

•  nessuna regione cromosomica è assente, ma è solo trasferita su un altro cromosoma

•  ma un gene di fusione tra due geni altrimenti separati, un evento che è comune nelle cellule maligne

traslocazione reciproca


Traslocazioni

Reciproca Robertsoniana

La traslocazione Robertsoniana avviene tra due cromosomi acrocentrici. Questi cromosomi (13, 14, 15, 21 e 22) hanno solo il braccio lungo (q) che contiene geni, mentre il telomero è posizionato all’estremità del cromosoma.


traslocazioni robertsoniane (rob)

•  coinvolgono i cromosomi acrocentrici 13, 14, 15,

21 e 22 •  nessuna regione cromosomica è assente, perché

questi contengono un braccio corto privo di geni che può risultare perduto con la fusione dei bracci q di due cromosomi acrocentrici

•  La più frequente traslocazione Robertsoniana è la rob(13q14q) che rappresenta il 75% di tutte le rob

•  segue poi la rob(14q21q) e la rob(21q21q) •  si formano in genere durante la meiosi femminile e

comportano infertilità maschile o abortività ripetuta.

rob


Effetti delle traslocazioni In entrambi i casi di traslocazioni (reciproche e robertsoniane) se non si ha perdita di materiale essenziale e non vengono danneggiati geni dalla rottura e dalla successiva riunione, gli individui sono clinicamente normali, ma hanno un rischio aumentato di avere figli con riarrangiamenti cromosomici sbilanciati. In generale si parla di traslocazione bilanciata quando non c’è perdita di materiale genetico e di traslocazione sbilanciata quando c’è perdita di materiale genetico. Le traslocazioni sbilanciate sono ovviamente associate ad un fenotipo clinicamente osservabile


Crosomoma ad anello

La rottura riguarda le porzioni telomeriche del cromosoma. La perdita di queste porzioni rende molto appiccicose le estremita’ realizzando la formazione di un’anello. Spesso si trova sotto

forma di mosaico. La sintomatologia dipende dal grado di

mosaicismo e dalla quantita’ di materiale genetico perduto durante la formazione

dell’anello.


Tecniche per evidenziare anomalie cromosomiche

•  Studio del Cariotipo (>5 Mb) •  Fluorescent in situ hybridization FISH (locus specifica, painting)

• Comparative genomic hybridization (CGH)


Prometaphase spread cariotipo ad alta risoluzione


Indicazioni al cariotipo

•  Anomalie congenite multiple soprattutto se associate a ritardo mentale •  Disordini della differnziazione sessuale •  Ritardo mentale senza diagnosi apparente •  Neoplasie ematologiche e malattie associate ad instabilita’ cromosomica •  Abortivita’ ripetuta •  Familiarita’ per malattie cromosomiche •  Gravidanza in donne in eta’ avanzata


Fluorescence in situ hybridization FISH


Locus-specific probes. Esempio Prader- Willi

Diagnosi mediante FISH di una delezione interstiziale nella sindrome di Prader- Willi utilizzando una sonda specifica per la regione critica sul cromosoma 15. Ch 15 centromere (green) Ch 15 PWS critical region (red)


disordine genomico submicroscopico

un disordine genomico submicroscopico è una patologia causata da •  acquisizione •  perdita •  alterazione

di uno o più geni contigui le cui variazioni di dosaggio possono produrre effetti fenotipici

La base molecolare è rappresentata da riarrangiamenti genomici, quali duplicazioni, delezioni, inversioni, senza alterazioni apparenti del cariotipo (<5Mb)


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