C.I. MEDICINA DI LABORATORIOMicrobiologia ClinicaCL Medicina e Chirurgia – AA 2014-2015

Modulo 8: TUBERCOLOSI

Giovanni Di Bonaventura, PhD

Università “G. d’Annunzio” di Chieti-PescaraDipartimento di Scienze Mediche, Orali e Biotecnologiche

Nuovo Polo Farmacia, corpo D, III livello (tel 0871 3554812)Centro Scienze dell’Invecchiamento (Ce.S.I.), V livello (tel 0871 541519)E-mail: gdibonaventura@unich.it

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Tubercolosi

Infezione batterica

– Mycobacterium tuberculosis

– Mycobacterium avian

• tubercolosi “disseminata” nei pazienti con AIDS

Tipologie

– Primaria

– Secondaria

– Disseminata

M. tuberculosis

Lenta crescita (tempo di generazione medio: 15-20 h) Acidi micolici e superficie cerosa Primaria

– Tubercoli, caseosa, reazione alla tubercolina Secondaria (riattivazione)

– Consolidamento Disseminazione

– TB extrapolmonare (linfonodi, rene, ossa, tratto genitale, cervello, meningi)

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Il tubercolo polmonare consiste in un granuloma formato da un nucleo centraledi necrosi caseosa contenente batteriall’interno di macrofagi giganti, e da unaparete esterna formata da fibroblasti, linfociti e neutrofili.

TubercolosiEpidemiologia

Le infezioni causate da Mycobacterium tuberculosis complex rappresentano uno dei piùimportanti argomenti di salute pubblica mondiale:

prevalenza: 14 milioni di casi di TB

incidenza: 9.4 milioni di casi di TB (soprattutto Africa sub-sahariana e sud-est asiatico per elevato numero HIV e scarso accesso ai servizi sanitari)

1.7 milioni di morti

4World Health Organization. Global Tuberculosis Control: Surveillance, Planning, Financing: WHO Report 2010. Geneva, Switzerland: WHO Press; 2011.

TubercolosiImportanza della diagnostica

Resistenza alla terapia:

Nel 2008 notificati 440.000 casi di multidrug-resistant TB (MDRTB), ossia il 3.3% dei nuovicasi, causando 150.000 morti.

Paesi a più alta incidenza di MDRTB sono distribuiti su tutto il globo (Europa, Asia, Africa).

1995-2005: 49 milioni di pazienti trattati, salvate oltre 6 milioni di vite.

Necessità di una diagnosi “improved”:

detection rate globale: 63%.

L’adozione di programmi di controllo sanitario richiede una diagnostica rapida edaccurate, soprattutto in quei Paesi dove difficile è l’accesso ai servizi sanitari e dove non è possibile attendere i risultati dai laboratory di riferimento prima di avviare una terapiaanti-TB.

Spesso la diagnostica si basa soltanto sull’osservazione microscopica, senza ottenerealcun dato sulle resistenze.

I tests di sensibilità (AST) sono alquanto problematici: difficile esecuzione, elevato TAT (mesi), risultati discordanti per alcune molecule (etambutolo), mancanza di standardizzazione per i farmaci di “seconda linea”.

E’ assolutamente indispensabile sviluppare strategie diagnostiche “rapide”, al fine di individuare nuovi casi di TB ed i pazienti infettati con ceppi MDR.

5World Health Organization. Global Tuberculosis Control: Surveillance, Planning, Financing: WHO Report 2010. Geneva, Switzerland: WHO Press; 2011.

TubercolosiAST: tecniche rapide

MDR-XDRTB Colour Test.

Utilizza una tecnologia “thin-layer agar” inuna capsula Petri divisa in 4 quadranti: 1 (senzaantibiotico, quale controllo di crescita batterica); 2 (contenente isoniazide), 3 (contenente rifampicina), 4 (contenente ciprofloxacina).

Il campione di espettorato viene collezionato in un contenitore contenente un terreno di trasporto con disinfettante (per limitare la crescita della flora accessoria).

La miscela viene seminata in ogni quadrante.

Concettualmente semplice ed a basso costo, l’utilizzo richiede un laboratorio con infrastrutture “dedicate”.

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http://www.finddiagnostics.org/programs/tb/find_activities/rapid_colorimetric_dst.html

TubercolosiSintomatologia

Non tutti i pazienti con TB sono sintomatici; tuttavia, la maggior parte dei pazienti TB presenta uno o più sintomi.

Tutti i soggetti sintomatici per TB o risultati positivi ad un test indicativo di infezione da M. tuberculosis (tuberculin skin test, TST; interferon-gamma release assay, IGRA), dovrebberoessere soggetti a valutazione medica per escludere la malattia TB.

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TubercolosiValutazione medica

La valutazione medica della malattia tubercolare si articola nelle seguenti fasi:

1. Valutazione anamnestica

2. Esame fisico

3. Test per rilevare la presenza dell’infezione da M. tuberculosis

4. Radiografia del torace

5. Esame batteriologico di campioni clinici

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TubercolosiAnamnesi

Presenza di uno o più sintomi suggestivi per TB; nel caso, da quanto tempo persistono.

Esposizione ad un soggetto con TB.

Diagnosi pregressa di infezione tubercolare latente (LTBI) or malattia TB.

In caso di trattamenti inadeguati o per scarsa compliance del paziente, TB può ricorrerecon emergenza di isolati multi-resistenti. Considerare I fattori demografici (paese di origine, età, etnia, gruppo razziale, occupazione) che possono rappresentare fattori di rischio per l’infezione tubercolare.

Considerare la presenza di malattie concomitanti (HIV, diabete) che aumentino il rischiodi progressione della malattia nei soggetti con infezione latente da M. tuberculosis.

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TubercolosiTests per l’infezione da M. tuberculosis

La scelta del test più adatto per la ricerca dell’infezione da M. tuberculosis deve tener conto di:

motivi e contesto clinico

disponibilità

rapporto costo-efficacia

Attualmente, esistono due metodi disponibili per la ricerca del microrganismo:

Mantoux tuberculin skin test (TST)

Interferon-gamma release assays (IGRAs)

QuantiFERON-TB Gold In-Tube test (QFT-GIT)

T-SPOT®.TB test

Questi tests consentono di differenziare i soggetti infetti con M. tuberculosis da quelli non infetti.

Tuttavia, un risultato negativo non esclude la diagnosi di malattia tubercolare o infezione latente(Latent Tuberculosis Infection, LTBI).

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TubercolosiTest cutaneo per la tubercolosi: reazione alla tubercolina

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TubercolosiEsame radiografico

Le alterazioni osservate all’esame radiografico del torace potrebbero essere suggestive, ma maidiagnostiche, per TB.

RX può essere utilizzato per escludere la TB polmonare in un soggetto normoreattivo, positivo a TST o IGRA, ed asintomatico per TB.

Presenti soprattutto nei segmenti apicale e posteriore del lobo superiore o dei segmentisuperiori del lobo inferiore, le lesioni potrebbero essere localizzate ovunque e differire per dimensioni, forma e cavitazione, soprattutto nell’immunocompromesso (es. HIV).

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Soprattutto nei ragazzi, le alterazioni radiografiche sono minime; indicato un RX laterale per diagnosi differenziale con linfoadenopatia.La tomografia computerizzata può fornire informazioni aggiuntive, sebbene più costosa.

Lesioni fibrotiche: possibile presenza di bacilli tubercolari in divisione con un alto potenziale per la progressione verso la malattia TB. Poichè RX non può differenziare una pregressa TB da una forma attiva, i soggetti con un quadro radiografico suggestivoper una TB pregressa e TST+ oppure IGRA+ dovrebbero esseresottoposti a terapia per LTBI soltanto dopo aver escluso unainfezione in atto previa indagine colturale.

Al contrario, lesioni nodulari non fibrotiche, pienamentecalcificate e discrete, suggestive per la presenza di granuloma, indicano un basso rischio per la progressione verso la malattia TB.

TubercolosiEsame batteriologico

E’ necessario che tutti i soggetti sospetti per TB debbano essere sottoposti ad indaginebatteriologica.

L’indagine, effettuata su campioni di differente tipologia (escreato, urine, liquor), si articola nelleseguenti fasi:

Prelievo del campione

Osservazione microscopica per la presenza di micobatteri (AFB, Acid-Fast Bacilli)

Ricerca diretta di M. tuberculosis utilizzando tests di amplificazione degli acidi nucleici(Nucleic Acid Amplification, NAA tests)

Indagine colturale ed identificazione

Tests di sensibilità agli antibiotici

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TubercolosiPrelievo dei campioni – TB polmonare

La tecnica più frequentemente utilizzata prevede la raccolta di espettorato a seguito di colpi di tosse.

E’ necessario prelevare almeno 3 campioni consecutivi di espettorato ad intervalli di 24 h; il campionedeve essere raccolto al mattino, a digiuno, perché le secrezioni durante la notte si accumulano nelle vie respiratorie.

PREPARAZIONE DEL PAZIENTE

istruire il paziente su come espettorare, facendo precedere tre respiri profondi ad un energico colpo di tosse;

sottolineare il fatto che escreato non è sinonimo di saliva o secrezioni mucose nasali o faringee.

MODALITA’ DI PRELIEVO.

praticare la pulizia del cavo orale (denti, gengive, lingua e parte interna delle guance) con acqua distillata sterile; sciacquare il cavo orale sempre con acqua distillata sterile, per limitare contaminazioni;

raccogliere 5-10 ml di materiale di provenienza polmonare dopo un energico colpo di tosse;

utilizzare un contenitore sterile, a bocca larga, in plastica, con tappo a vite;

In caso di tosse non produttiva, si può ricorrere ad induzione con aerosol, facendo inalare unasoluzione salina ipertonica (3-5%), sterile e riscaldata. Contrassegnare il campione come “indotto”, in quanto la secrezione in questo caso è altamente idratata e potrebbe pertanto essere scambiata come saliva.

Qualora non fosse possibile produrre un campione di espettorato, è possible ricorrere allabroncoscopia o effettuare un aspirato gastrico per ottenere un campione adeguato.

TRASPORTO: entro 1 ora dalla raccolta.

CONSERVAZIONE: fino a 48 ore in frigorifero. Non congelare. 14

TubercolosiPrelievo dei campioni – TB polmonare

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Durante la raccolta del campione, il paziente produce un aerosol altamente contagioso per operatori sanitari/pazienti in prossimità. La raccolta andrebbe pertanto effettuata in un ambiente dedicato dotato di ventilazione controllata (stanza di isolamento AII), in grado di contenere il rischio biologico aerogeno. Il personale sanitario deve dotarsi di mascherina.

TubercolosiPrelievo dei campioni – TB extra-polmonare

Nel caso si sospetti una TB extra-polmonare, debbono essere considerate altre tipologie di campione.

Trasporto: entro 1 ora dalla raccolta.

Conservazione: fino a 48 ore in frigorifero. Non congelare. 16

campione condizioni modalità contenitore

Urine(In alternativa, è possibile prelevare l’urina direttamente da catetere)

Raccogliere 3 campioni in giorni consecutivi.

raccogliere la prima minzione completa del mattino, preferibilmente scartando il primo getto.

sterile, a bocca larga, in plastica, con tappo a vite.

Liquor prelevare, mediante rachicentesi, la maggior quantità possibile di liquor (minimo 2 ml).

Provetta sterile

Pus disinfettare la cute con alcool prima della raccolta utilizzare per la raccolta una siringa; se non è

possibile il prelievo con siringa, usare un tampone con terreno di trasporto Amies o Stuart.

sterile, a bocca larga, in plastica, con tappo a vite.

tampone in terreno di trasporto

Biopsia raccogliere, asetticamente, almeno 1 gr di tessuto. non avvolgere in garza, immergere in fissativi o

conservanti. aggiungere una minima quantità di soluzione salina

sterile, per evitare l’essicamento.

sterile, a bocca larga, in plastica, con tappo a vite.

TubercolosiOsservazione microscopica per AFB

I Micobatteri, una volta colorati, resistono alla decolorazione con alcol/acido. Per questo motivo vengono anche denominati Acid-Fast Bacilli (AFB).

La ricerca microscopica di AFB nello striscio colorato allestito da un campione può fornire una iniziale e rapida evidenza batteriologica dellapresenza di Micobatteri in un campione clinico.

Due sono le tecniche più frequentemente impiegate a tal fine:

– microscopia diretta, previa colorazione con carbolfucsina (Ziehl-Neelsen, Kinyoun);

– microscopia in fluorescenza, previa colorazione con auramina-O oppure auramina-rodamina.

La sensibilità dell’indagine microscopica è scarsa (5.000 – 10.000 bacilli/ml di campione), significativamente minore rispetto a quella dell’isolamentocolturale (10 - 100 bacilli/ml).

Di contro, la ricerca di AFB è tecnica rapida (risultati disponibili entro le 24h dal prelievo).

Tale tecnica consente soltanto una identificazione presuntiva della malattiaTB poichè M. tuberculosis non è l’unica specie AFB.

Inoltre, alcuni pazienti possono avere uno striscio AFB- ma essere positiviall’indagine colturale. Una osservazione microscopica negativa per AFB non esclude, pertanto, la malattia TB.

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TubercolosiOsservazione microscopica per AFB

Nei campioni AFB+ si procede alla conta cellulare (ottenuta ad un determinato ingrandimento) refertando il risultato in maniera semi-quantitativa mediante l’adozione di uno score: 4+, 3+, 2+, or 1+. Lo score è direttamente proporzionale alla presenza di AFB e, conseguentemente, allacontagiosità del paziente.

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TubercolosiRicerca diretta mediante amplificazione degli acidi nucleici

Questa metodica si basa sulla amplificazione di specifiche sequenze contenute nel DNA/RNA di M. tuberculosis (NAA, Nucleic Acid Amplification).

Molto più rapida rispetto all’esame colturale (ore vs settimane).

Possibili vantaggi associate all’utilizzo della NAA:

– precoce conferma di malattia TB;

– rapido avvio della terapia antibiotica;

– migliore outcome del paziente;

– interruzione della trasmissione (per precoce diagnosi, messa in isolamento respiratorioed avvio di una terapia appropriate);

– precoce e più efficiente utilizzo dell’isolamento respiratorio;

– precoce inizio della individuazione dei “contatti”;

– maggiore efficacia degli interventi di salute pubblica.

CDC raccomanda l’utilizzo di questi tests nei pazienti:

– sintomatici con sospetta TB polmonare

– in cui il risultato potrebbe influire significativamente sul management del caso o sulleattività di controllo (es. ricerca dei “contatti”).

Un test negativo non può escludere la malattia, soprattutto in presenza di un fondato sospettoclinico. Tuttavia, se considerato unitamente ad altre evidenze può essere utile per velocizzarel’iter diagnostico, o per evitare l’adozione di una terapia non necessaria.

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TubercolosiIsolamento ed identificazione

L’indagine colturale rimane il “gold standard” per la conferma della malattia, oltre che necessariaper valutare il genotipo dell’isolato, nonchè la sua sensibilità agli antibiotici.

L’esame va effettuato su tutti i campioni diagnostici, indipendentemente dall’esito per AFB o NAA.

Un risultato positivo per M. tuberculosis conferma la diagnosi di malattia.

Nel caso di negatività, la diagnosi può essere posta soltanto su base clinica. Bacilli vitali potrebberoessere infatti presenti in altri campioni/siti.

I sistemi automatizzati attualmente in commercio (BACTEC, MGIT, VersaTREK, MBBACT) sono in grado di evidenziare la crescita in terreno liquid della maggior parte dei micobatteri in 4 - 14 giorni, mentre 3 - 6 settimane sono necessarie per la crescita su agar.

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L’indagine colturale è importante nel monitoraggio della efficaciadella terapia e, conseguentemente, della contagiosità del paziente.

– i campioni vengono prelevati ad intervalli mensili fino a chenon si ottengano 2 campioni consecutivi NEGATIVI. La “conversione” del colturale rappresenta la prova dell’efficaciaterapeutica.

– negativizzazione di tutti i campioni: avvenuta eradicazione.