chromatographie ii hplc - · chromatographie ii 2 hplc praktikum i.1i.1 einleitung einleitung...
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HPLCHPLCHPLCHPLCChromatographie IIChromatographie II
Chr
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S 20 HPLC HPLC SeminarSeminarHPLC HPLC SeminarSeminar
2Chromatographie II Chromatographie II HPLC PraktikumHPLC PraktikumI.1I.1 Einleitung Einleitung (siehe Skript Praktikum)(siehe Skript Praktikum)
HPLC PraktikumHPLC Praktikum
I 3I 3 Die stationäre PhaseDie stationäre PhaseI.2I.2 Ziele des PraktikumsZiele des PraktikumsI.3I.3 Die stationäre PhaseDie stationäre PhaseI.4I.4 Die mobile PhaseDie mobile PhaseI 5I 5 Di P ( )Di P ( )I.5I.5 Die Pumpe(n)Die Pumpe(n)I.6I.6 Die InjektionseinheitDie Injektionseinheit
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ld I.7I.7 Die DetektoreinheitDie DetektoreinheitI.8I.8 Die SoftwareDie Software
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R. I.8I.8 Die SoftwareDie SoftwareI.9I.9 Die Methode des ISTDDie Methode des ISTDI 10I 10 Aufgaben zum theoretischen TeilAufgaben zum theoretischen Teil
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S 20 I.10I.10 Aufgaben zum theoretischen Teil Aufgaben zum theoretischen Teil
3
I 2 Ziele des PraktikumsI 2 Ziele des PraktikumsChromatographie II Chromatographie II
Nach diesem Nach diesem PraktikumPraktikum soll man u.a.:soll man u.a.:
I.2 Ziele des PraktikumsI.2 Ziele des Praktikums
Über den Aufbau einer Über den Aufbau einer HPLCHPLC--AnlageAnlage, sowie , sowie überüber stationärestationäre undund mobilemobile PhasePhase BescheidBescheid
Ziel 1Ziel 1über über stationärestationäre und und mobilemobile PhasePhase Bescheid Bescheid wissen. wissen.
Ziel 2Ziel 2 Über dieÜber die EinzelbestandteileEinzelbestandteile (wie z B(wie z B PumpenPumpenZiel 2Ziel 2 Über die Über die EinzelbestandteileEinzelbestandteile (wie z.B. (wie z.B. PumpenPumpen, , InjektoreinheitInjektoreinheit und und DetektorenDetektoren) Bescheid) Bescheidwissen. wissen.
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ld Wichtige Wichtige chromatographische Kenngrößenchromatographische Kenngrößen(z.B. (z.B. ttmm, , ttRR(X)(X), , VVmm, , VVRR(X)(X), , uumm, , uu(X)(X),, k etc.)k etc.)
Ziel 3Ziel 3
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R. bestimmen können. bestimmen können.
Eine Eine quantitative Bestimmungquantitative Bestimmung mit der mit der Methode desMethode des Internen StandardsInternen Standards durchführendurchführen
Ziel 4Ziel 4
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S 20 Methode des Methode des Internen StandardsInternen Standards durchführen durchführen
können. können.
4
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Kapitel IKapitel I Theoretischer TeilTheoretischer TeilKapitel IKapitel I Theoretischer TeilTheoretischer Teil
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I 2 1I 2 1 KomponentenKomponenten derder HPLC AnlageHPLC AnlageI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.2.1 I.2.1 KomponentenKomponenten der der HPLC AnlageHPLC Anlage
11 33114444
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I 2 1I 2 1 KomponentenKomponenten derder HPLC AnlageHPLC AnlageI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.2.1 I.2.1 KomponentenKomponenten der der HPLC AnlageHPLC Anlage
331144
1144
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2 1 C2 1 C SS
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S 20 Abb. I.2.1: Komponenten eines HPLCAbb. I.2.1: Komponenten eines HPLC--Systems Systems
7
Chromatographiearten (Auswahl)Chromatographiearten (Auswahl)I Theoretischer TeilI Theoretischer TeilChromatographiearten (Auswahl)Chromatographiearten (Auswahl)
Trennung durch AdsorptionTrennung durch Adsorption Stationäre Stationäre
Adsorptions-Chromatographie
Trennung durch AdsorptionTrennung durch AdsorptionPhasePhase
Adsorptions-Chromatographieflüssig / fest
(NP/RP-HPLC) Mobile Mobile PhasePhasePhasePhase
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ld Trennung durch LöslichkeitTrennung durch Löslichkeit
StationäreStationäre
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Verteilungs-Chromatographieflüssig / flüssig
Stationäre Stationäre PhasePhase
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I 3 Die Stationäre PhaseI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.3 Die Stationäre Phase
Ad tiAd ti Ch t hiCh t hi t ilt i h f it ilt i h f i
NormalNormal PhasePhase Chomatographie:Chomatographie: NPNP
AdsorptionsAdsorptions--ChromatographieChromatographie teilt sich auf in:teilt sich auf in:
NormalNormal--PhasePhase--Chomatographie:Chomatographie: NPNP
St ti ä PhSt ti ä Ph M bil PhM bil PhStationäre Phase Stationäre Phase polarpolar
Mobile Phase Mobile Phase unpolarunpolar
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ReversedReversed--PhasePhase--Chomatographie:Chomatographie: RPRP
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Stationäre Phase Stationäre Phase unpolarunpolar
Mobile Phase Mobile Phase polarpolar
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S 20 unpolarunpolar polarpolar
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I 3 DieI 3 Die Stationäre PhaseStationäre PhaseI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.3 Die I.3 Die Stationäre PhaseStationäre Phaseph
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Abb I 3 1 K t i HPLCAbb I 3 1 K t i HPLC S t (Sä l )S t (Sä l )
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S 20 Abb. I.3.1: Komponenten eines HPLCAbb. I.3.1: Komponenten eines HPLC--Systems (Säule)Systems (Säule)
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I 3 DieI 3 Die Stationäre PhaseStationäre PhaseI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.3 Die I.3 Die Stationäre PhaseStationäre Phase
Stationäre Phase
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End-Kartusche
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Abb I 3 2 D t ll i HPLC Sä l
End Kartusche
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S 20 Abb. I.3.2: Darstellung einer HPLC-Säule
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I 3 Die Stationäre PhaseI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.3 Die Stationäre Phase
Partikel (z.B.sphärisch)
3µm 10µm
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ld 3µm -10µm
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Abb I 3 3 D t ll d Ei l tik l
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S 20 Abb. I.3.3: Darstellung der Einzelpartikel
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I 3 1 Beispiele stationärer PhasenI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.3.1 Beispiele stationärer Phasen
sesePh
asPh
asm
alm
al--
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Nor
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S 20 Abb. I.3.1.a: Material mit polaren Silanol- (SiOH)- Endguppen
13I Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI 3 1 Beispiele stationärer PhasenI.3.1 Beispiele stationärer Phasen
eeha
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PR
P--PhPh
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Abb I 3 1 b M t i l it l CH E d
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S 20 Abb. I.3.1.b: Material mit unpolaren CH3-Endgruppen
14I Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI 3 1 Beispiele stationärer PhasenI.3.1 Beispiele stationärer Phasen
eeha
seha
seR
PR
P--PhPh
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Abb I 3 1 M t i l it l C4 E d
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S 20 Abb. I.3.1c: Material mit unpolaren C4-Endgruppen
15I Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI 3 1 Beispiele stationärer PhasenI.3.1 Beispiele stationärer Phasen
eeha
seha
seR
PR
P--PhPh
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ld RR
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Abb I 3 1 d M t i l it l C8 E d
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S 20 Abb. I.3.1.d: Material mit unpolaren C8-Endgruppen
16I Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI 3 1 Beispiele stationärer PhasenI.3.1 Beispiele stationärer Phasen
eeha
seha
seR
PR
P--PhPh
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S 20 Abb. I.3.1e: Material mit C18-Endgruppen
17I Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI 3 1 Beispiele stationärer PhasenI.3.1 Beispiele stationärer Phasen
Im Praktikumsversuch wird folgende Säule Im Praktikumsversuch wird folgende Säule i t ti t teingesetzt:eingesetzt:
Hersteller:Hersteller: Fa. PhenomenexFa. Phenomenex
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ld Dimensionen:Dimensionen: 150 mm x 4.6 mm (ID)150 mm x 4.6 mm (ID)Material:Material: 3 µm3 µm
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R. stationäre Phase: stationäre Phase: C18C18
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I 4 Die mobile PhaseI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.4 Die mobile Phase
Ad tiAd ti Ch t hiCh t hi t ilt i h f it ilt i h f i
NormalNormal PhasePhase Chomatographie:Chomatographie: NPNP
AdsorptionsAdsorptions--ChromatographieChromatographie teilt sich auf in:teilt sich auf in:
NormalNormal--PhasePhase--Chomatographie:Chomatographie: NPNP
St ti ä PhSt ti ä Ph M bil PhM bil PhStationäre Phase Stationäre Phase polarpolar
Mobile Phase Mobile Phase unpolarunpolar
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ReversedReversed--PhasePhase--Chomatographie:Chomatographie: RPRP
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Stationäre Phase Stationäre Phase unpolarunpolar
Mobile Phase Mobile Phase polarpolar
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S 20 unpolarunpolar polarpolar
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I 4 Die mobile PhaseI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.4 Die mobile Phaseph
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4 1 C4 1 C S ( )S ( )
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S 20 Abb. I.4.1: Komponenten eines HPLCAbb. I.4.1: Komponenten eines HPLC--Systems (Eluenten)Systems (Eluenten)
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I 4 1 Die Eluotrope ReiheI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.4.1 Die Eluotrope Reihe
== AnordnungAnordnung der Laufmittel nach der Laufmittel nach steigender Elutionskraft Esteigender Elutionskraft E00
(( P l ität)P l ität) b fb f NPNP Ph ( i i h b ti t)Ph ( i i h b ti t)(( Polarität) Polarität) bezogen aufbezogen auf NPNP--Phase (empirisch bestimmt)Phase (empirisch bestimmt)
UVUV--Grenze Grenze [nm][nm]
PolaritätPolarität[E[E0 0 (Al(Al22OO33)])]
EluentEluent
2452450 400 40ChloroformChloroform
2852850,290,29ToluolToluol
1901900,000,00nn--HexanHexan
togr
aphi
eto
grap
hie
[ ][ ][[ (( 22 33)])]
2602600 580 58EssigsäureethylesterEssigsäureethylester
3303300,560,56AcetonAceton
2302300,420,42DichlormethanDichlormethan
2452450,400,40ChloroformChloroformN
PN
P--C
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chlic
he
chlic
he
ndun
gnd
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nn
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1901900 650 65AcetonitrilAcetonitril
2752750,630,63DiethylaminDiethylamin
2702700,620,62DimethylsulfoxidDimethylsulfoxid
togr
aphi
eto
grap
hie
2602600,580,58EssigsäureethylesterEssigsäureethylester
haup
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<190<190>1 11>1 11WasserWasser
2052050,950,95MethanolMethanol
2102100,820,8222--PropanolPropanol
1901900,650,65AcetonitrilAcetonitril
RP
RP--
Chr
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<190<190>1,11>1,11WasserWasserRR
Abb. I.4.1.a:Abb. I.4.1.a: Die Eluotrope Reihe (Auszug)Die Eluotrope Reihe (Auszug)
21
I 4 1 Die Eluotrope ReiheI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.4.1 Die Eluotrope Reihe
nn--HexanHexan CHClCHCl33 CHCH22ClCl22 22--PropanolPropanolnn HexanHexan CHClCHCl33 CHCH22ClCl22 pp
EE0 0 == 0,000,00 EE00 = 0, 40= 0, 40 EE00 = 0,42= 0,42 EE00 =0,82=0,82
Für die Für die NormalphasenNormalphasen--(NP)(NP)--Chomatographie gilt:Chomatographie gilt:
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Elutionskraft = Fähigkeit desElutionskraft = Fähigkeit des
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Elutionskraft Fähigkeit des Elutionskraft Fähigkeit des Fließmittels Substanzen inFließmittels Substanzen inder Säule weiter zu befördernder Säule weiter zu befördern
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I 4 1 Die Eluotrope ReiheI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.4.1 Die Eluotrope Reihe
Beispiel für die Beispiel für die NormalphasenNormalphasen--(NP):(NP):
50% Hexan + 50% 250% Hexan + 50% 2--PrPrEE0 0 == 0,000,00 EE0 0 == 0,820,82
kt
Rete
60% Hexan + 40% 260% Hexan + 40% 2--PrPr
raft
sink
entionsz
70% Hexan + 30% 270% Hexan + 30% 2--PrPr
lutio
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80% Hexan + 20% 280% Hexan + 20% 2--PrPr
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90% Hexan + 10% 290% Hexan + 10% 2--PrPr
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Abb. I.4.1.b:Abb. I.4.1.b: Entwicklung einer NPEntwicklung einer NP--Trennung (isokratisch) Trennung (isokratisch)
23I Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI 4 1 Die Eluotrope ReiheI.4.1 Die Eluotrope Reihe
THFTHF CHCH33CNCN MethanolMethanol HH22OOTHFTHF 33 MethanolMethanol HH22OO
EE0 0 == 0,450,45 EE00 = 0, 65= 0, 65 EE00 = 0,95= 0,95 EE00 > 1 > 1
Für die Für die ReversedReversed--PhasePhase--(RP)(RP)--ChomatographieChomatographie gilt:gilt:
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Elutionskraft = Fähigkeit desElutionskraft = Fähigkeit des
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Elutionskraft Fähigkeit des Elutionskraft Fähigkeit des Fließmittels Substanzen inFließmittels Substanzen inder Säule weiter zu befördernder Säule weiter zu befördern
24
I 4 1 Die Eluotrope ReiheI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.4.1 Die Eluotrope ReiheBeispiel für die Beispiel für die ReversedReversed--PhasePhase--(RP)(RP)--ChomatographieChomatographie::
70% CH70% CH33CN + 30% HCN + 30% H22OO
NebenproduktNebenprodukt
EE00 = 0,65= 0,65 EE00 > 1> 1kt
Rete
60% CH60% CH33CN + 40% HCN + 40% H22OO
pp
raft
sink
entionsz
33 22
lutio
nskr
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sold 50% CH50% CH33CN + 50% HCN + 50% H22OOE
l teigen m
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40% CH40% CH33CN + 60% HCN + 60% H22OO
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Abb. I.4.1.c:Abb. I.4.1.c: Entwicklung einer RPEntwicklung einer RP--Trennung (isokratisch) Trennung (isokratisch)
25
I 4 2 Die isokratische-ElutionI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.4.2 Die isokratische-Elution
Die Die ZusammensetzungZusammensetzung der der mobilen Phasemobilen Phase ändert sichändert sichggwährend der während der chromatographischenchromatographischen Trennung Trennung nichtnicht::
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Abb. I.4.2.: Abb. I.4.2.: EluentenverlaufEluentenverlauf bei bei isokratischerisokratischer ElutionElution
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I 4 3 Die Gradienten-ElutionI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.4.3 Die Gradienten-Elution
Die Die ZusammensetzungZusammensetzung der der mobilen Phasemobilen Phase ändertändert sichsichggwährend der chromatographischen Trennung:während der chromatographischen Trennung:
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Abb. I.4.3: Abb. I.4.3: EluentenverlaufEluentenverlauf bei Gradienten bei Gradienten ElutionElution
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I 5 Die Pumpe / Injektor / DetektorI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.5 Die Pumpe / Injektor / Detektorph
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S 20 Abb. I.5.a: Komponenten eines HPLCAbb. I.5.a: Komponenten eines HPLC--Systems (Pumpe,Systems (Pumpe,
Detektor, Injektionseinheit)Detektor, Injektionseinheit)
28
I 5 Die PumpeI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.5 Die Pumpe
Auslaßventil
K lbKolben
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Einlaßventil
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Abb. I.5.b:Abb. I.5.b: KolbenpumpeKolbenpumpe
29
I 5 DieI 5 Die PumpePumpeI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.5 Die I.5 Die PumpePumpe
Auslaßventil
phie
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ld Kolben
EinlaßventilKolbenantrieb
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Abb I 5 Ei k lbAbb I 5 Ei k lb PP
Einlaßventil
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S 20 Abb. I.5.c: EinkolbenAbb. I.5.c: Einkolben--PumpePumpe
30
I 5 DieI 5 Die PumpePumpeI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.5 Die I.5 Die PumpePumpe
KolbenMembran
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Hydraulik-Flüssigkeit
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Abb I 5 Di hAbb I 5 Di h PP
Chr
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S 20 Abb. I.5.e: DiaphragmaAbb. I.5.e: Diaphragma--PumpePumpe
31
I 6 DieI 6 Die InjektionseinheitInjektionseinheitI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.6 Die I.6 Die InjektionseinheitInjektionseinheit
Injektionsnadel
Ventil
phie
II
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ld
Probengläschen
Proben-Schleife
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R. g
Abb. I.6.a:Abb. I.6.a:
Chr
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S 20 Funktionsweise AutosamplerFunktionsweise Autosampler
Pumpe Säule
32
I 7 DieI 7 Die DetektoreinheitDetektoreinheitI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.7 Die I.7 Die DetektoreinheitDetektoreinheitI.7.1 Der I.7.1 Der UV/VISUV/VIS--DetektorDetektor
GitterSpalt
Gitter
Flußzelle
phie
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ld DeuteriumlampeFlußzelle
Photozelle
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1/12
R.
Abb. I.7:Abb. I.7: UV/VIS UV/VIS -- Detektor (VWD oder MWD) Detektor (VWD oder MWD) jeweils nur eine Wellenlänge einstellbarjeweils nur eine Wellenlänge einstellbar
Chr
omC
hrom
WS
20W
S 20
33I Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI 7 DieI 7 Die DetektoreinheitDetektoreinheitI.7.2 Der I.7.2 Der DiodenarrayDiodenarray--Detektor (UV/VIS)Detektor (UV/VIS)I.7 Die I.7 Die DetektoreinheitDetektoreinheit
Gitter
Spalt PhotodiodenSpalt otod ode
Flußzelle
Deuteriumlampe
Flußzelle
phie
II
phie
II
. . Vas
old
Vaso
ldm
atog
rap
mat
ogra
p01
1/12
R.
011/
12 R
.C
hrom
Chr
omW
S 20
WS
20
Abb. I.7.2: Der Photodiodenarray-Detektor
34
I 7 2 1 DerI 7 2 1 Der ISOISO--Plot (DADPlot (DAD--Detektor)Detektor)I Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.7.2.1 Der I.7.2.1 Der ISOISO--Plot (DADPlot (DAD--Detektor)Detektor)
AbsorptionAbsorption0 mAU0 mAU 100 mAU100 mAUe
[nm
]e
[nm
]en
läng
een
läng
eW
ell
Wel
l
phie
II
phie
II
. . Vas
old
Vaso
ldm
atog
rap
mat
ogra
p01
1/12
R.
011/
12 R
.C
hrom
Chr
omW
S 20
WS
20
Abb. I.7.2.1: Isoplot einer chromatographischen TrennungAbb. I.7.2.1: Isoplot einer chromatographischen TrennungZeit [min]Zeit [min]
35I Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI 7 2 2 DerI 7 2 2 Der 3D3D--Plot (DAD Detektor)Plot (DAD Detektor)I.7.2.2 Der I.7.2.2 Der 3D3D--Plot (DAD Detektor)Plot (DAD Detektor)
]]on
[mA
U]
on [m
AU
]
phie
II
phie
II
. . Vas
old
Vaso
ld
bsor
ptio
bsor
ptio
mat
ogra
pm
atog
rap
011/
12 R
.01
1/12
R.
Ab
Ab
Chr
omC
hrom
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S 20
Abb. I.7.2.2: 3-D-Plot einer chromatographischen Trennung
36
I 7 3 DerI 7 3 Der MSMS DetektorDetektorI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.7.3 Der I.7.3 Der MSMS--DetektorDetektor
Quadrupol IonenfalleIonenquelle
HPLC
phie
II
phie
II
. . Vas
old
Vaso
ldm
atog
rap
mat
ogra
p01
1/12
R.
011/
12 R
.
Abb. I.7.3: Vereinfachte Darstellung eines HPLC-MS-Detektors
Chr
omC
hrom
WS
20W
S 20
37
I 7 4 weitereI 7 4 weitere HPLCHPLC--DetektorenDetektorenI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.7.4 weitere I.7.4 weitere HPLCHPLC--DetektorenDetektoren
HPLC-Detektoren Anwendung Nachweisgrenze Linearität
UV-VIS(VWD. MWD)
selektivnur für einzelne UV-aktive
Komponenten
ca. 0,3 ng/ml 104
DAD(Diodenarray-Detektor)
190-950 nm
selektivfür fast alle UV-aktiven
Komponenten
0,3 ng/ml 104
RI universell ca. 0,7 g/ml 3 x 103
(Brechungsindex-Detektor)
(stark temperaturabhängig, keine Gradientenelution möglich, relativ
unempfindlich)
FLD selektiv 0,8 pg/ml 103 - 104
phie
II
phie
II
. . Vas
old
Vaso
ld (Fluoreszenz-Detektor) nur für fluoreszierende Komponenten
ECD(Elektrochemischer
D t kt )
selektiv,nur für oxidierbare oder d i b K t
ca. 1,0 pg/ml --
mat
ogra
pm
atog
rap
011/
12 R
.01
1/12
R. Detektor) reduzierbare Komponenten
CDLeitfähigkeitsdetektor
ionenselektiv bis zu ca 0,2% untersch.
Leitfähigkeit
ca. 105
Chr
omC
hrom
WS
20W
S 20 Abb. I.7.4: weitere häufig eingesetzte HPLC-Detektoren
38
I 8 SoftwareI 8 SoftwareI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.8. SoftwareI.8. Softwareph
ie II
ph
ie II
. . V
asol
dVa
sold
mat
ogra
pm
atog
rap
011/
12 R
.01
1/12
R.
Chr
omC
hrom
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20W
S 20
Abb. I.8: Software ChemStation B.03.02
39
KenngrößenKenngrößen des Chromatogrammsdes ChromatogrammsI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilKenngrößenKenngrößen des Chromatogrammsdes Chromatogramms
tt tt ttRR (X)(X) SS(X)(X)
ttRR(X(X11))
ttRR(X(X22))tt tt ttRR (X)(X) SS(X)(X) mm
ttRR(X(X11))
ttmm
phie
II
phie
II
. . Vas
old
Vaso
ldm
atog
rap
mat
ogra
p01
1/12
R.
011/
12 R
.
Zeit [s]Zeit [s]ttSS(X(X11))ttSS(X(X22))
Chr
omC
hrom
WS
20W
S 20 Kenngrößen eines ChromatogrammsKenngrößen eines Chromatogramms
40
I 9 Die Methode desI 9 Die Methode des Internen StandardsInternen StandardsI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.9 Die Methode des I.9 Die Methode des Internen StandardsInternen Standards
Ch t hi h Lä f i d iCh t hi h Lä f i d iChromatographische Läufe sind nieChromatographische Läufe sind nie100%100% identisch denn:identisch denn:
Es kann zu „ganz normalen“ Es kann zu „ganz normalen“ SchwankungenSchwankungenzwischen den Läufen kommen, wie: zwischen den Läufen kommen, wie:
Geringe Unterschiede im Geringe Unterschiede im InjektionsvolumenInjektionsvolumen(Luftblasen, manuelle Injektion). (Luftblasen, manuelle Injektion).
phie
II
phie
II
. . Vas
old
Vaso
ld
( , j )( , j )
Veränderungen des Veränderungen des SäulenmaterialsSäulenmaterials im im Laufe des MeßbetriebesLaufe des Meßbetriebes
mat
ogra
pm
atog
rap
011/
12 R
.01
1/12
R. Laufe des Meßbetriebes.Laufe des Meßbetriebes.
Veränderungen der Veränderungen der UmgebungstemperaturUmgebungstemperaturtt
Chr
omC
hrom
WS
20W
S 20 etc. etc.
41I Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI 9 Die Methode desI 9 Die Methode des Internen StandardsInternen Standards
tt tt ttRR (X)(X) SS(X)(X)
I.9 Die Methode des I.9 Die Methode des Internen StandardsInternen Standards
ttRR(X(X11))
ttRR(X(X22))tt tt ttRR (X)(X) SS(X)(X) mm
Interner StandardInterner StandardttRR(X(X11))
ttmm
phie
II
phie
II
. . Vas
old
Vaso
ldm
atog
rap
mat
ogra
p01
1/12
R.
011/
12 R
.
Zeit [s]ttSS(X(X11))ttSS(X(X22))
Chr
omC
hrom
WS
20W
S 20 Abb. I.9:Abb. I.9: Zugabe eines internen Standards (Tracer)Zugabe eines internen Standards (Tracer)
42
I 9 Die Methode desI 9 Die Methode des Internen StandardsInternen StandardsI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.9 Die Methode des I.9 Die Methode des Internen StandardsInternen Standards
DieDie FlächeFläche eineseines PeaksPeaks ist mit derist mit derDie Die FlächeFläche eines eines PeaksPeaks ist mit der ist mit der eingespritzten Stoffmengeeingespritzten Stoffmenge bzw. der bzw. der Masse Masse mmii desdes StoffesStoffes proportional:proportional:
ff
ii
iimmff iiiiaa = = •• (1)(1)
phie
II
phie
II
. . Vas
old
Vaso
ld
FlächeFläche derder
mat
ogra
pm
atog
rap
011/
12 R
.01
1/12
R.
MasseMasseder Komponente ider Komponente iResponsefaktorResponsefaktor
Komponente iKomponente i
Chr
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S 20
ppResponsefaktorResponsefaktorder Komponente ider Komponente i
43
I 9 Die Methode des Internen StandardsI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.9 Die Methode des Internen Standards
BeliebigeBeliebige SubstanzSubstanz Tracer Tracer SubstanzSubstanz
ffii == iiaa(2)(2) ffTT == TrTraa
(3)(3)ffii = = iimm (2)(2) ffTrTr = =
TrTrmmTT = Tracer= Tracer
(3)(3)
TrTr = Tracer= Tracer
phie
II
phie
II
. . Vas
old
Vaso
ld
KKKK
KKKK
iiKFKF = = TrTrff== TrTrii aamm
(4)(4)
mat
ogra
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011/
12 R
.01
1/12
R. KKKKii
iiff iiTrTr aamm
Chr
omC
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S 20
KK = Kalibrierlösung= KalibrierlösungKalibrierfaktorKalibrierfaktor der Komponente ider Komponente i
44
I 9 Die Methode des Internen StandardsI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.9 Die Methode des Internen Standards
TrTr
ffff
== xxxx
xxTrTr
xxii aamm
(5)(5)
x = Probenlösung
iiff xxii
xxTrTr aamm
( )( )
Auflösen nach Auflösen nach Masse Masse der Komponente der Komponente ii
g
phie
II
phie
II
. . Vas
old
Vaso
ld
xx TrTrff iiaa xx
mat
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011/
12 R
.01
1/12
R. mmxx
ii = = mmTrTr (6)(6)ii
TrTr
ffff ii
xxTrTraa
aaKFKFii
Chr
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S 20
45
I.10 Fragen zumI.10 Fragen zum Theoretischen TeilTheoretischen TeilI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.10 Fragen zum I.10 Fragen zum Theoretischen TeilTheoretischen Teil1.) In welche zwei grundlegenden Typen von Phasensystemen kann die
Adsorptionschromatographie unterschieden werden?2 ) E klä i d B iff d i “2.) Erklären sie den Begriff „endcapping“.3.) Welche Effekte hinsichtlich der Peakform können auftreten, wenn z.B. basische
Substanzen (Amine, Phenole) auf schlecht endgecappten RP-Phasen chromatographiert werden (2 Beispiele)?
4 ) N Si i d t d i V t il di RP Ph i V l i h NP Ph4.) Nennen Sie mindestens drei Vorteile, die RP-Phasen im Vergleich zu NP-Phasen aufweisen.
5.) Was versteht man unter der Eluotropen Reihe, wie wurde sie bestimmt, und welchem Ordnungsprinzip folgt sie?
6 ) W l h Z h b t ht i h E (Al O ) d E (SiO ) ?6.) Welcher Zusammenhang besteht zwischen Eo (Al2O3) und Eo (SiO2) ?7.) Zwischen welchen beiden grundlegenden Arbeitsweisen wird beim Einsatz der
mobilen Phase während einer chromatographischen Trennung unterschieden und wie nennt man diese Formen der Elution?
8 ) E lä t i i di Z h di B iff bi ä “ t ä “ d
phie
II
phie
II
. . Vas
old
Vaso
ld 8.) Erläutern sie in diesem Zusammenhang die Begriffe „binärer“, „ternärer“ und „quaternärer“ Gradient.
9.) Nennen sie zwei Gründe, warum Eluenten entgast werden sollten.10.) Nennen sie vier mögliche Verfahren der Eluentenentgasung11 ) Wi i t d K lib i f kt KFi i K t i d fi i t ?
mat
ogra
pm
atog
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011/
12 R
.01
1/12
R. 11.) Wie ist der Kalibrierfaktor KFi einer Komponente i definiert ?
12.) Nennen sie mindestens vier Eigenschaften, die ein geeigneter Tracer aufweisen muß.
13.) Nennen sie einen wesentlichen Unterschied zwischen dem Bauprinzip eines VWD D t kt d i DAD D t kt
Chr
omC
hrom
WS
20W
S 20 VWD-Detektors und eines DAD-Detektors.
14.) Erläutern sie in diesem Zusammenhang der Ausdruck: „Inverse Optik“.Nennen sie neben UV/VIS vier weitere Arten von HPLC-Detektoren.
46
phie
II
phie
II
. . Vas
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Vaso
ldm
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p01
1/12
R.
011/
12 R
.
Kapitel II Experimenteller TeilKapitel II Experimenteller TeilKapitel II Experimenteller TeilKapitel II Experimenteller Teil
Chr
omC
hrom
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S 20
47
Kapitel II: Experimenteller Teil
II.1II.1 Einleitung Einleitung (siehe Skript Praktikum)(siehe Skript Praktikum)gg
II 2 1II 2 1 Vorbereitung der LösungenVorbereitung der Lösungen ( i h Sk i t)( i h Sk i t)
II.2II.2 VersuchsdurchführungVersuchsdurchführungII.2.1II.2.1 Vorbereitung der Lösungen Vorbereitung der Lösungen (siehe Skript) (siehe Skript)
II.2.1.1 Vorbereitung der Stammlösungen(siehe Skript Praktik m)(siehe Skript Praktikum)
II.2.1.2 Vorbereitung der Eich-(Kalibrierlösung)(siehe Skript Praktikum)
phie
II
phie
II
. . Vas
old
Vaso
ld
(siehe Skript Praktikum)
II.2.1.3 Vorbereitung der Probenlösungen(siehe Skript Praktikum)
mat
ogra
pm
atog
rap
011/
12 R
.01
1/12
R. ( p )
II.2.2II.2.2 Durchführung der HPLCDurchführung der HPLC--AnalysenAnalysenII 3II 3 Aufgaben zum experimentellen TeilAufgaben zum experimentellen Teil
Chr
omC
hrom
WS
20W
S 20 II.3II.3 Aufgaben zum experimentellen TeilAufgaben zum experimentellen Teil
48II Experimenteller TeilII Experimenteller Teil
O CH3
phie
II
phie
II
. . Vas
old
Vaso
ld
N
NNCH3
mat
ogra
pm
atog
rap
011/
12 R
.01
1/12
R.
Coffein
NNO
CH3
Chr
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S 20 Coffein
49
II 2 2 Durchführung derII 2 2 Durchführung der HPLCHPLC--AnalysenAnalysenII Experimenteller TeilII Experimenteller TeilII.2.2 Durchführung der II.2.2 Durchführung der HPLCHPLC--AnalysenAnalysenph
ie II
ph
ie II
. . V
asol
dVa
sold
mat
ogra
pm
atog
rap
011/
12 R
.01
1/12
R.
Abb II 2 2 1 Di P P i
Chr
omC
hrom
WS
20W
S 20 Abb. II.2.2.1: Die Pumpen-Programmierung
50
II 2 2 Durchführung derII 2 2 Durchführung der HPLCHPLC--AnalysenAnalysenII Experimenteller TeilII Experimenteller TeilII.2.2 Durchführung der II.2.2 Durchführung der HPLCHPLC--AnalysenAnalysenph
ie II
ph
ie II
. . V
asol
dVa
sold
mat
ogra
pm
atog
rap
011/
12 R
.01
1/12
R.
Abb. II.2.2.2: Die Programmierung des Injektionsvolumens
Chr
omC
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WS
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S 20
51
II.2.2 Durchführung derII.2.2 Durchführung der HPLCHPLC--AnalysenAnalysenII Experimenteller TeilII Experimenteller TeilII.2.2 Durchführung der II.2.2 Durchführung der HPLCHPLC AnalysenAnalysenph
ie II
ph
ie II
. . V
asol
dVa
sold
mat
ogra
pm
atog
rap
011/
12 R
.01
1/12
R.
Chr
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S 20 Abb. II.2.2.3: Die Detektorprogrammierung (DAD)
52
II.2.2 Durchführung derII.2.2 Durchführung der HPLCHPLC--AnalysenAnalysenII Experimenteller TeilII Experimenteller TeilII.2.2 Durchführung der II.2.2 Durchführung der HPLCHPLC AnalysenAnalysenph
ie II
ph
ie II
. . V
asol
dVa
sold
mat
ogra
pm
atog
rap
011/
12 R
.01
1/12
R.
Abb II 2 2 4 Di P i d Sä l th t t
Chr
omC
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WS
20W
S 20 Abb. II.2.2.4: Die Programmierung des Säulenthermostaten
53
II.2.2 Durchführung derII.2.2 Durchführung der HPLCHPLC--AnalysenAnalysenII Experimenteller TeilII Experimenteller TeilII.2.2 Durchführung der II.2.2 Durchführung der HPLCHPLC AnalysenAnalysenph
ie II
ph
ie II
. . V
asol
dVa
sold
mat
ogra
pm
atog
rap
011/
12 R
.01
1/12
R.
Abb II 2 2 5 Di Ei t ll d I t ti t
Chr
omC
hrom
WS
20W
S 20 Abb. II.2.2.5: Die Einstellung der Integrationsparameter
54
I.2.2 Durchführung derI.2.2 Durchführung der HPLCHPLC--AnalysenAnalysenII Experimenteller TeilII Experimenteller TeilI.2.2 Durchführung der I.2.2 Durchführung der HPLCHPLC AnalysenAnalysenph
ie II
ph
ie II
. . V
asol
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sold
mat
ogra
pm
atog
rap
011/
12 R
.01
1/12
R.
Abb. II.2.2.6: Die Programmierung des Autosamplers
Chr
omC
hrom
WS
20W
S 20
55
II.2.2 Durchführung derII.2.2 Durchführung der HPLCHPLC--AnalysenAnalysenII Experimenteller TeilII Experimenteller TeilII.2.2 Durchführung der II.2.2 Durchführung der HPLCHPLC AnalysenAnalysenph
ie II
ph
ie II
. . V
asol
dVa
sold
mat
ogra
pm
atog
rap
011/
12 R
.01
1/12
R.
Abb II 2 2 7 D St t d P b
Chr
omC
hrom
WS
20W
S 20 Abb. II.2.2.7: Das Starten der Probensequence
56
II.2.2 Durchführung derII.2.2 Durchführung der HPLCHPLC--AnalysenAnalysenII Experimenteller TeilII Experimenteller TeilII.2.2 Durchführung der II.2.2 Durchführung der HPLCHPLC AnalysenAnalysenph
ie II
ph
ie II
. . V
asol
dVa
sold
mat
ogra
pm
atog
rap
011/
12 R
.01
1/12
R.
Abb II 2 2 8 D M ü kt D t A l i
Chr
omC
hrom
WS
20W
S 20 Abb. II.2.2.8: Der Menüpunkt: Data-Analysis
57
II.2.2 Durchführung derII.2.2 Durchführung der HPLCHPLC--AnalysenAnalysenII Experimenteller TeilII Experimenteller TeilII.2.2 Durchführung der II.2.2 Durchführung der HPLCHPLC AnalysenAnalysenph
ie II
ph
ie II
. . V
asol
dVa
sold
mat
ogra
pm
atog
rap
011/
12 R
.01
1/12
R.
Abb. II.2.2.9: Das Erstellen der Kalibriertabelle
Chr
omC
hrom
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S 20
58
II.3.1 Durchführung derII.3.1 Durchführung der HPLCHPLC--AnalysenAnalysenII Experimenteller TeilII Experimenteller TeilII.3.1 Durchführung der II.3.1 Durchführung der HPLCHPLC AnalysenAnalysenph
ie II
ph
ie II
. . V
asol
dVa
sold
mat
ogra
pm
atog
rap
011/
12 R
.01
1/12
R.
Chr
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S 20
Abb. II.2.2.10: Das Erstellen des Quantitativen Reports
59
II.3.1 Durchführung derII.3.1 Durchführung der HPLCHPLC--AnalyseAnalyseII Experimenteller TeilII Experimenteller TeilII.3.1 Durchführung der II.3.1 Durchführung der HPLCHPLC AnalyseAnalyse
1.) Was versteht man unter der chromatographische Durchbruchszeit tm.2.) Welche apparativen Einflüsse können zu einer deutlichen Beeinflussung der ) pp g
Durchbruchszeit führen (nennen sie 2 Beispiele)?3.) Ermitteln sie aus dem Tracer-Chromatogramm die Retentionszeit tR(X)
von Benzophenon, sowie die Durchbruchszeit tm des chromatographi-schen Systems.y
4.) Berechnen sie daraus die Wanderungsgeschwindigkeit der mobilen Phase um in [cm/min] (Länge der Säule = 150 mm).
5.) Berechnen sie das Durchbruchsvolumen Vm der mobilen Phase sowie das Retentionsvolumen VR von Benzophenon.R p
6.) Berechnen sie den Kapazitätsfaktor k für Benzophenon.7.) Berechnen sie ausgehend von den erhaltenen chromatographischen
Ergebnissen der Kalibriermessung den KF-Wert für Coffein.8.) Berechnen sie mit Hilfe des ermittelten KF-Wertes die Konzentration an
phie
II
phie
II
. . Vas
old
Vaso
ld
)Coffein [mg/ml] in den jeweils untersuchten Originallösungen (Caffee-Lösung / Red Bull / Coca-Cola).
9.) Der „Energy-Drink“ Red-Bull enthält neben Coffein auch die Substanz Taurin. Chemisch gesehen handelt es sich hierbei um 2-Amino-ethan-
mat
ogra
pm
atog
rap
011/
12 R
.01
1/12
R. g
sulfonsäure. Zeichnen sie die Strukturformel von Taurin.10.) In welchem Teil des Chromatogramms würden sie Taurin relativ zum
Coffeinpeak tendentiell erwarten (niedrigere oder höhere Retentionszeit). Begründen sie ihre Aussage.
Chr
omC
hrom
WS
20W
S 20
g g11.) Wie würden sie die Detektionsfähigkeit von Taurin im UV-Detektor einschätzen
(Begründung)? Nennen sie eine alternative Detektionsmethode für Taurin.12.) Welche Auftragung stellt ein Isoplot dar?
60
phie
II
phie
II
. . Vas
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Vaso
ldm
atog
rap
mat
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p01
1/12
R.
011/
12 R
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61
phie
II
phie
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. . Vas
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ldm
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rap
mat
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p01
1/12
R.
011/
12 R
.C
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S 20
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62
phie
II
phie
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. . Vas
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Vaso
ldm
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mat
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p01
1/12
R.
011/
12 R
.C
hrom
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S 20
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