LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA ANALISIS

PEMISAHAN PARACETAMOL DENGAN COFFEIN SECARA HPLC

GOLONGAN : Q

KELOMPOK : D

ASISTEN : PAK HENRY K.S

NAMA KELOMPOK :

1. MICHELLE OLIVIA 2443013035

2. ANISAH 2443013147

3. IWANA PUTRI OKTAVIA 2443013280

4. LOVIENA VERONICA N. 2443013319

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS KATOLIK WIDYA MANDALA SURABAYA

2015

I. DASAR TEORI

HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Cromatography, yaitu

alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu sebuah

tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan memompa

cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. Sampel yang akan dianalisis

dijadikan dalam volume yang kecil dari fase bergerak dan diubah melalui reaksi kimia

oleh fase diam ketika sampel melalui sepanjang kolom. Tujuan penggunaan alat ini

adalah mengetahui kadar asam organik. (Synider L R dan J.J Kirkland 1979)

Alat ini digunakan untuk memisahkan komponen berdasarkan dua fase yaitu

fase gerak dan fase diam dengan metode kolom. Kromatografi cair ini menggunakan

kolom tabung gelas yang bermacam-macam diameternya. Pemisahan ini dapat digunakan

untuk proses secara kualitatif maupun kuntitatif. Pengukuran yang didasarkan secara

kualitatif yaitu dengan ditunjukkan oleh waktu retensi. Waktu retensi yaitu waktu yang

dibutuhkan komponen dari mulai diinjeksikan hingga sampel terbaca didetektor.

Sedangkan pengukuran yang didasarkan secara kuantitatif dapat dilat dengan

menggunakan luas area. Luas area yang dihasilkan berhubungan atau erat kaitannya

dengan konsentrasi komponen yang dianalisis. Semakin besar konsentrasi maka semakin

besar juga luas areanya. Atau dapat dikatakkan bahwa luas area sebanding dengan

konsentrasi. Luas puncak kromatografi yang dihasilkan pada kurva elusi menggunakan

HPLC, dapat dipengaruhi oleh tiga proses perpindahan massa, yaitu difussi eddy, difusi

longitudinal, dan transfer massa tidak seimbang. Sedangkan parameter-parameter yang

menentukan berlangsungnya proses-proses tersebut adalah laju aliran ukuran partikel,

dan laju difusi dari ketebalan stasioner. (Khopkar 2007).

Metoda HPLC (High PerformanceLiquid Chromatography) merupakan

metoda untuk menentukan konsentrasi dan pemisahan suatu senyawa dengan mudah,

cepat, dan teliti, dimana dalam sistem ini merupakan sistemkromatografi cair yang juga

merupakan gabungan sistem antara High Speed LiquidChromatography, High Eficiency

Liquid Cromatography, High Pressure Liquid Cromatography.HPLC yang merupakan

gabungan dari 3 sistem ini, memiliki beberapa keunggulan biladibandingkan dengan

kromatografi cair lainnya,diantaranya adalah kolom HPLC yang dapatdipakai berulang

tanpa perlu diregenerasi,pemisahan yang memuaskan dapat tercapai padakolom,

peralatan HPLC dapat dioperasikan secara otomatis dan kuantitatif, serta waktu

analisisyang relative singkat dan dapat dilakukan dalam skala besar (Skoog, 2004).

Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembap (inert). Wadah pelarut kosong ataupun

labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya

dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak atau eluen

biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan

berperan dalam daya elusi dan resolusi. Fase gerak yang paling sering digunakan

untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol

atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase

gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon

dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol.

Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.

2. Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat

sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak.

Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan

batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai

5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit.

Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak

dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran

fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara

tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam

HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak

yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih

umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

3. Tempat penyuntikan sampel

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang

mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat

dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel

(sample loop) internal atau eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik sampel.

4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.

Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya

proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama

dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

A. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding

dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak

lebih lambat (10 -100 μl/menit).

B. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal

jika digabung dengan spektrometer massa.

C. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis

kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

5. Detektor HPLC

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal

(yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat

selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan

detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif,

seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia. Idealnya, suatu

detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar

yang sangat kecil.

3. Stabil dalam pengopersiannya.

4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.

5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran

yang luas (kisaran dinamis linier).

6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Berikut merupakan kelebihan dari alat HPLC antara lain:

Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya

memisah yang tinggi.

Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.

Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.

Kolom dapat digunakan kembali.

Waktu analisa cukup singkat.

HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang

tidak stabil.

Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.

Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

Kelemahan dari alat HPLC antara lain:

o Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.

o Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.

o Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3

mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus

seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.

PROSEDUR KERJA

Alat:

- Alat-alat gelas

- Timbangan analitis

- Ultrasonik

- Membran filter 0,45 um

- HPLC dengan kolom RP 18 dan detektor UV

- Spektrofotometer UV

Bahan:

- Paracetamol

- Coffein

- Metanol for HPLC

- Metanol pa

- Aqua pro injection

Prosedur:

1. Pembuatan fase gerak

Buat campuran metanol : air (45:55) saring dengan membran filter dan degassing

selama 15 menit

2. Pembuatan larutan uji

Buat larutan standart paracetamol dalam metanol dengan konsentrasi 30 ppm, saring

dengan membran filter dan degassing selama 5 menit.

Buat larutan standart coffein dalam metanol dengan konsentrasi 30 ppm, saring

dengan membran filter dan degassing selama 5 menit.

Buat larutan campuran paracetamol dan coffein dalam metanol dengan konsentrasi 30

ppm, saring dengan membran filter dan degassing selama 5 menit.

3. Penentuan panjang gelombang terpilih

Amati spectrum paracetamol tunggal dan coffein tunggal dengan spektrofotometer

UV, kemudian tentukan panjang gelombang terpilih yang akan digunakan untuk

pengamatan pada HPLC

4. Pemisahan paracetamol dengan coffein dengan HPLC

- Setting HPLC dengan panjang gelombang detektor UV sesuai yang sudah dipilih

sebelumnya, atur flow rate 1 ml/min

- Flushing kolom dengan metanol for HPLC yang sudah disaring dan di degass

sampai baseline

- Ganti metanol dengan fase gerak metanol air (55:45) dan tunggu kolom sampai

stabil dan siap untuk inject sampel

- Injectkan larutan standart paracetamol, coffein dan campuran paracetamol coffein

lalu amati kromatogram yang terjadi

- Ubah komposisi fase gerak untuk mendapatkan hasil pemisahan yang baik

DATA HASIL PRAKTIKUM

Gambar 1: Spektrum Parasetamol (fase gerak methanol:air 55:45)

Gambar 2: Spektrum Coffein (fase gerak methanol:air 55:45)

Gambar 3: Spektrum Parasetamol dan Coffein (fase gerak methanol:air 55:45)

Gambar 4: Spektrum Parasetamol dan Coffein (fase gerak methanol:air 45:55)

k’ fase gerak methanol: air 65:35

parasetamol k’ ¿tr− tmtm

=2.60−1.101.10

=1.36

Coffein k’¿3.66−1.53

1.53 ¿1.39

Parasetamol+Coffein k’¿2.60−1.20

1.20=1.16

k’¿3.63−1.20

1.20=2.025

k’ fase gerak methanol: air 55:45

paracetamol+Coffein k’¿2.49−1.36

1.36=0.83

k’¿3.32−1.36

1.36=1.44

Rs(Resolusi) Parasetamol dan Coffein

Rs¿2∆ tr

W 1+W 2

∆=tr2−tr1

Ket:

Tr = waktu retensi

W = lebar puncak

Rs fase gerak methanol: air 65:35 ¿2 (3.63−2.60 )

1.15+1.2=0.876

Rs fase gerak methanol: air 55:45 ¿2(3.32−2.49)

1.2+1.2=0.69

Index Kepolaran Fase Gerak(Methanol:Air)

Pmetanol = 5.1

Pair = 10.2

Pmetanol-air 55:45 = (0.55x5.1)+(0.45x10.2)

= 7.395

Pmetanol-air 45:55 = (0.45x5.1)+(0.55x10.2)

= 5.61

PEMBAHASAN

Pada praktikum ini, dilakukan pemisahan parasetamol dengan coffein menggunakan

metode kromatografi cair tingkat tinggi (KCKT/HPLC) jenis reverse phase. Fase diam yang

digunakan adalah C-18 yang bersifat nonpolar, dengan menggunakan 2 fase gerak yang sama

namun perbandingannya berbeda untuk mengetahui mana pemisahan yang paling baik. Fase

gerak pertama digunakan metanol : air dengan perbandingan 55 : 45 dan kedua dengan

perbandingan 45 : 55. Paracetamol merupakan senyawa nonpolar namun bersifat lebih polar

dari coffein.

Pada proses pengerjaan, dibutuhkan ketelitian tinggi untuk mengurangi kesalahan

yang dapat terjadi. Sampel yang diuji sebelumnya telah disaring dengan membran filter

sehingga tidak ada partikel yang mengganggu yang dapat menyumbat kolom. Pada proses

injeksi diharuskan bebas dari gas atau gelembung, sebab jika ada gas, gas tersebut dapat

menyumbat kolom dan menaikkan tekanan pada HPLC.

Setelah penginjectkan, komponen – komponen yang ada dalam sampel akan terpisah

pada kolom. Pemisahan ini berdasarkan perbedaan kekuatan interaksi solute terhadap fase

diamnya. Solute yang berinteraksi kurang kuat (bersifat lebih polar) dengan fase diam akan

keluar lebih dulu sedangkan yang berinteraksi kuat (lebih nonpolar) dengan fase diam akan

keluar lebih akhir. Pada pemisahan ini, paracetamol bersifat lebih polar jika dibandingkan

dengan coffein sehingga paracetamol akan keluar terlebih dahulu setelah itu baru coffein.

Dari hasil yang didapatkan pada kromatogram menunjukkan hubungan antara

komponen yang dibawa oleh fase gerak terhadap waktu retensi. Waktu retensi tersebut

merupakan jangka waktu yang terukur saat sampel melewati kolom HPLC. Banyaknya

puncak menunjukkan jumlah komponen sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi. Dan

dari hasil tersebut didapat Harga Rs yang didapat dalam pemisahan dengan fase gerak

metanol : air (55 : 45) adalah 0,876 dan dengan fase gerak metanol : air (45 : 55) adalah 0,69.

Dari data yang dihasilkan tersebut dapat dilihat bahwa harga Rs yang lebih besar adalah

harga Rs dengan fase gerak metanol : air (55:45) sehingga yang lebih baik keterpisahannya

adalah dengan fase gerak metanol : air (55:45). Dari data kromtogram sampel didapatkan dua

puncak yaitu puncak untuk paracetamol dan coffein. Puncak dari coffein lebih kecil daripada

puncak paracetamol, karena kadar dari coffein dalam sampel lebih sedikit. Kurva yang bagus

adalah kurva yang lancip (lebarnya kecil) dengan kaki yang simetris.

KESIMPULAN

Dari praktikum ini dapat disimpulkan bahwa pemisahan paracetamol dan

coffein yang baik adalah dengan fase gerak metanol : air (55 : 45) karena memiliki harga Rs

yang lebih besar dibandingkan dengan fase gerak perbandingan 45 : 55. Paracetamol bersifat

lebih polar dari coffein sehingga peak paracetamol keluar terlebih dahulu dan diikuti dengan

peak coffein. Karena coffein bersifat lebih nonpolar maka akan terikat lebih kuat pada fase

diam sehingga coffein keluar lebih akhir.

DAFTAR PUSTAKA

Khopkar SM.2007. Konsep Dasar Kimia Analitik. Saptorahardjo.penerjemah. Jakarta: Ui

            Press. Terjemahan dari Basic Concepts of Analytical Chemistry.

Synider L R dan J.J Kirkland.1979. Introduction to Modern Liquid Chromatography.

            New York : John Wiley & Sons, INC.

Skoog, D.C., D.M. West, F.J. Holler, & S.R. Crouch. 2004. Fundamentals of Analytical   Chemistry 8th ed . Thomson Learning, Inc