PLAN

Applications de la Chromatographie d xclusion E Strique la caractrisation de systmes macromolculaires au sein de l unit mixte CNRS-bioMrieux CNRSCatherine Ladavire, Ladavire Bertrand de Lambert, Carole Chaix, Marie-Thrse Charreyre, Thierry Delair, Christian PichotSystme macromolculaire et Immuno-virologie Humaine UMR 2142 Ecole Normale Suprieure de Lyon 46, alle d'Italie 69364 Lyonhttp://www.ens-lyon.fr/CNRS-bioMerieux

A propos de Polymres

Chromatographie d Exclusion Strique (CES)

Applications de la CES

Les PolymresDfinition : substances gnralement organiques ou semi-organiques, On distingue :caractrises par la rptition d'un ou plusieurs types de motifs monomres. les homopolymres (linaires, ramifis) = polymres constitus par l'association d'un seul motif monomreA A A A A A A A C A A A A A A

Les PolymresLes proprits des polymres dpendent : du type d'assemblage de ces monomres du degr de polymrisation ou longueur des chanes (A)n

:

de la distribution des longueurs de chanes : Polymrisation radicalaire :AmorageAkd

2Rka

R + M

R Mkp

les copolymres, la polymrisation s'effectue avec deux ou plusieurs monomres diffrentsB A B B A A

Propagation

R M + M n

R M

n+1R M M R 1 2

distribution des longueurs de chanes Caractre alatoire

les polymres rticuls (gels), les macromolcules s'enchanent dans les trois directions de l'espaceB B A A A B A A B A B B

Terminaison R

M

1

+ R M

2

kt

R M H + R M 2 1

Transfert

R M

1

+ X

Y

ktr

R M X + Y 1

Les PolymresComment caractriser la largeur de cette distribution ? ? A l aide de diffrentes moyennes ? en nombre : Mn = ? niMi/ ? ni ? Trs sensible la prsence de petite quantits de macromolcules de

Principales mthodes de dtermination des masses molaires, de IpMthodes Analyse des extrmits de chanes (RMN) Osmomtrie Diffusion de la lumire Spectromtrie de masse MALDI-TOF CES 103 - 106 102 - 105 Mw Mn, Mw, Ip Domaines de masses molaires (g/mol) < 104 Mn Mn Valeurs moyennes

faible masse

? en masse : Mw = ? niMi2/ ? niMi ? Les macromolcules de forte masse ont une influence prpondrante ? Indice de polymolcularit (ou distribution) : Mn Ip = 1, chantillon isomolculaire Ip connatre : masses molaires moyennes, indice de Paramtres ?, htrognit en masse molaire ? polymolcularit Ip = Mw /

104 - 105

102 - 106

Mn, Mw, Ip

1

Chromatographie d Exclusion Strique - Intrts Chromatographie d Exclusion Strique (CES) ou Chromatographie par Permation de Gel (CPG)

Chromatographie d Exclusion Strique - Principe ?Gel rticul ou phase stationnaire gonfl par la phase mobile Elution

?

?

Mesure des masses molaires moyennes, de Ip Fractionnement possible des chantillons de polymre Rcupration totale de l chantillon Simplicit, Rapidit

Gel = bille sphrique poreuse ColonneElution par ordre dcroissant de taille Ve

Essor considrable depuis les 1ers appareils commerciaux (1964 en France)

Fractionnement ou sparation selon le volume hydrodynamique des chanes en solution

=

Chromatographie d Exclusion Strique - Principe Volume total d une colonne chromatographique (VT)

Chromatographie d Exclusion Strique - Principe Exclusion strique d une macromolcule Vlution = Vo + Vaccessible = Vo + KVpK=0 0 seule

Rizzardo et col. (Macromolecules, 33, 243-245, (2000) ; 32, 6977-6980, (1999) ; 32, 5457-5459, (1999) ; 32, 2071-2074, (1999) ; 31, 5559-5562, (1998)) Macromolecular Symp., 143, 291-307, (1999))

? CES + Rfractomtre diffrentiel - Suivi de polymrisation Colonne : Styragel HR 4E (Waters), 35C Eluant : THF Calibration : Poly(N-acryloylmorpholine) Dbit : 1 ml/min Rfractomtre diffrentiel (2410 Waters)Mn (g/mol)

? CES + Rfractomtre diffrentiel - Suivi de polymrisation -

50000

?

Mpic (g/mol)

Poly(N-acryloylmorpholine) ou P(NAM)30000

40000 30000 20000 10000Calibration P(NAM) Calibration P(St) Diffusion de la lumire

? ?30 40 50 60N O

?n

MM? ???10.00 Signal (mV) 5.00

20000

O

?

10000 70 80

0 10 30 50 70 90

Conversion (%)

Conversion (%)0.00 6.00 6.20 6.40 6.60 6.80 7.00 7.20 7.40 7.60 Minutes 7.80 8.00 8.20 8.40 8.60 8.80 9.00

? ? ? ?

Mn = 15 600 g/mol, Mn = 25 950 g/mol, Mn = 30 700 g/mol, Mn = 31 200 g/mol,

Ip = 1,15 Ip = 1,20 Ip = 1,25 M Ip = 1,30 n tho. ?

Eluant pour diff. de la lumire : Tpn acide borique / NaOH 0,05M pH 10

35 000g/mol

Calibration P(NAM) ? Diffusion de la la lumire (MM absolue) Calibration P(NAM) ? Calibration P(St) (VH ? )

5

CES + Rfractomtre diffrentiel + Diffusion de la lumire - Dispositif CES + Rfractomtre diffrentiel + Diffusion de la lumire - Conjugus Polymre/ODNC, dn/dc, n Rservoir d luant Pomp e DgazeurAUX, 90 Detector0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02

Injecteu r Colonnes0,14

Exclusion de UH 2000 : 7 000 000g/molconjugus agrgats UV 260nm ODN libre

Rfractomtre Diffrentiel Poubell e Informatiqu e

Diffusion de la lumire

Dtecte ur UV

Dtecteur 90 RI

Mn, Mw, Ip, Rg

Colonnes : UH 500 + UH 2000 (Waters) Eluant : Tampon acide borique / NaOH 0,05M pH 10 (n = 1,338) Diffusion : 45, 90, 135 (miniDawn, Wyatt) Dbit : 0,5 ml/min Rfractomtre diffrentiel (410 Waters) Spectromtre UV (484 Waters) Filtration 0,45m (Millipore)

0 5 7 9 11 13 15 17

Volume d'lution (ml)

Rponses diffrentes des dtecteurs Trs mauvaise sparation entre les trois espces, pas de mesure possible de masses molaires

CES + Rfractomtre diffrentiel + Diffusion de la lumire - Agrgation de polymreCES + Rfractomtre diffrentiel + Diffusion de la lumire - Dgradation de polymre

Masse molaire du polymre observe trs leve par rapport celle attendue ? Variation de la rponse du dtecteur de diffusion de la lumire enf(Tre)Agrgat s

? Variation de la rponse du rfractomtre diffrentiel en fonction dutemps, 130C0,8 0,7

MM ?10h 5h

1j

1,2

MM ?37C

5

h

0,6

Dtecteur 45

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 7 9 11 13 15

Rponse RI

P(AMVE)

0,5 0,4 0,3 0,2

100C 130C17 19 21 23 25

1h

Tpn acide borique / NaOH 0,05M pH 10

0,1 0 10 12 14 16 18 20 22 24

Volume d'lution (ml)

Volume d'lution (ml)

Tpn acide borique / NaOH 0,05M pH 10

La temprature abaisse la quantit d'agrgats mais...

il y a galement une dgradation du polymre

? CES + RD + Diffusion de la lumire + Viscosimtre - Suivi de l volution d une conformation macromolculaire Colonnes : UH 500 + UH 2000 (Waters) Eluant : Tampon acide borique / NaOH 0,05M pH 10 (n = 1,338) Diffusion : 90 (Dawn, Wyatt) Rfractomtre diffrentiel (modle 410 Waters) Dtecteur de viscosit diffrentielle (H 502B Viscotek) Dbit : 0,5 ml/min Filtration 0,45m (Millipore)

? CES + RD + Diffusion de la lumire + Viscosimtre - Suivi de l volution d une conformation macromolculaire Mark-Houwink-Sakurada : [? ] = K.Maa = facteur de forme reflte la conformation des macromolcules en solution : - 0,3 ? a ? 0,8 : les chanes sont replies sur elles-mmes, en pelote - 0,8 ? a ? 1 : les chanes sont plus rigides et moins aptes se mettre en pelote - 1 ? a ? 1,8 : les chanes sont sous forme de btonnets rigides

Exemple de chromatogramme? P ? 8 . l4 .Q.? ? r

?? ? ?

? ? P / ? P ? 1? 0 ? ?? ? ? ? ? ? C ? ?C ?

? ? / ? 0 ? 1? ? ? ? ? C ? ?C ?

?

?

?

?

0

Rfractomtre Viscosimtr Diffusion de e la lumire 90C.Ladavire, T.Delair, A.Domard, C.Pichot, B.Mandrand, Polymer Degradation and Stability, 65, 231-241, 1999.

a

compacte expanse

0

Paramtre x

6

ConclusionCES = Technique rapide et simple qui permet d analyser : ? le greffage de molcules biologiques sur polymre, les conjugus obtenus, des stabilits ? la modification chimique de molcule biologique ? le suivi cintique d une polymrisation radicalaire contrle ? la dsagrgation ou la dgradation d polymre un ? les changements de conformation macromolculaire

Bibliographie

? Initiation la Chimie et la physico-Chimie Macromolculaires, volume 1, Physico-Chimie des polymres , Groupe Franais d Etudes et d applications des Polymres.

? Techniques de l Ingnieur, Trait Analyse et Caractrisation, Chromatographie d exclusion strique , par James Lesec.

? Chomatography of polymers , characterisation by SEC and FFF, Theodore Provder, ACS Symposium Series 521, New York, 1991.

? HPLC of polymers , H.Pasch, B.Trathnigg, Springer, Berlin, 1999.

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