chevaliez du 2009
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VIRUS DE L’HEPATITE CVIRUS DE L’HEPATITE C
& Marqueurs& Marqueurs
Stéphane ChevaliezStéphane Chevaliez
Centre National de RéférenceCentre National de Référence
Des Hépatites B, C et deltaDes Hépatites B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955Laboratoire de Virologie & INSERM U955
Hôpital Henri MondorHôpital Henri Mondor
Université Paris XIIUniversité Paris XII
CréteilCréteil
VIRUS DE L’HEPATITE CVIRUS DE L’HEPATITE C
& Marqueurs& Marqueurs
Stéphane ChevaliezStéphane Chevaliez
Centre National de RéférenceCentre National de Référence
Des Hépatites B, C et deltaDes Hépatites B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955Laboratoire de Virologie & INSERM U955
Hôpital Henri MondorHôpital Henri Mondor
Université Paris XIIUniversité Paris XII
CréteilCréteil
Virus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite CI. Aspects VirologiquesI. Aspects VirologiquesVirus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite C
I. Aspects VirologiquesI. Aspects Virologiques
Virus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite C
• Famille : Famille : FlaviviridaeFlaviviridae
• Genre : Genre : HepacivirusHepacivirus
Phylogénie de la région codant la protéine NS5B
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Adapted from Simmonds et al., 1999; 2001.
• Famille : Famille : FlaviviridaeFlaviviridae
• Genre : Genre : HepacivirusHepacivirus
• Hôte naturel : HommeHôte naturel : Homme
Virus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite C
Bartenschalger et al., 2004.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Organisation StructuraleOrganisation StructuraleOrganisation StructuraleOrganisation StructuraleVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Organisation StructuraleOrganisation StructuraleOrganisation StructuraleOrganisation StructuraleVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Organisation StructuraleOrganisation StructuraleOrganisation StructuraleOrganisation StructuraleVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Organisation GénomiqueOrganisation GénomiqueOrganisation GénomiqueOrganisation GénomiqueVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Protéines Structurales Protéines Non-Structurales
IRES
5’NTR 3’NTR
C E1 E2 NS2 NS3 NS5A NS5B
NS4A
NS4B
p 7
Adapted from Tail et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
Régions 5’ et 3’NCRégions 5’ et 3’NCRégions 5’ et 3’NCRégions 5’ et 3’NCVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Protéines Structurales Protéines Non-Structurales
IRES
5’NTR 3’NTR
C E1 E2 NS2 NS3 NS5A NS5B
NS4A
NS4B
p 7
Adapted from Tan et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
Site d’Entrée Interne du RibosomeSite d’Entrée Interne du RibosomeSite d’Entrée Interne du RibosomeSite d’Entrée Interne du RibosomeVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Tan et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
From Department of Structural Biology, Stanford University Medical School, USA
Site d’Entrée Interne du RibosomeSite d’Entrée Interne du RibosomeSite d’Entrée Interne du RibosomeSite d’Entrée Interne du RibosomeVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Organisation GénomiqueOrganisation GénomiqueOrganisation GénomiqueOrganisation GénomiqueVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Protéines Structurales Protéines Non-Structurales
IRES
5’NTR 3’NTR
C E1 E2 NS2 NS3 NS5A NS5B
NS4A
NS4B
p 7
Adapted from Tan et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
STÉATOSE
ROS
FIBROSEActivation des cellules étoilées
Insulino-Résistance
Cytokines (TNF, TGF, IL-8, FasL)Produits de la peroxydation lipidique
CytokinesNF-kB
TNF
NécroInflammation
Cytokines TGF
Cytokines Réponse
immunitaire
TGF
CapsideTNF
Génotype 3
CapsideNS5A
Adapted from Asselah et al., 2006
Protéine de Capside & PathogenèseProtéine de Capside & PathogenèseProtéine de Capside & PathogenèseProtéine de Capside & PathogenèseVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Piodi et al., Hepatology 2008, 48(1): 16-27.
VHC génotype 1b
xyz
xy
z
Piodi et al., Hepatology 2008, 48(1): 16-27.
Glycoprotéines E1-E2Glycoprotéines E1-E2Glycoprotéines E1-E2Glycoprotéines E1-E2Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Protéines Structurales Protéines Non-Structurales
IRES
5’NTR 3’NTR
C E1 E2 NS2 NS3 NS5A NS5B
NS4A
NS4B
p 7
Adapted from Tan et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
Glycoprotéines d’EnveloppeGlycoprotéines d’EnveloppeGlycoprotéines d’EnveloppeGlycoprotéines d’EnveloppeVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Heijne et al., Nature Reviews Molecular cell Biology, 2006; 7: 909-918
Région HVR1 (27 amino-acides) 80% de divergence nucléotidique entre génotypes Epitope majeur de neutralisation
Timm et al., World J Gastroenterol 2007; 13(36)4808-4817.
Région HVR1Région HVR1Région HVR1Région HVR1Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Protéine Non-structurale 3Protéine Non-structurale 3Protéine Non-structurale 3Protéine Non-structurale 3Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Protéines Structurales Protéines Non-Structurales
IRES
5’NTR 3’NTR
C E1 E2 NS2 NS3 NS5A NS5B
NS4A
NS4B
p 7
Adapted from Tan et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
1 631189
Sérine protéaseSérine protéaseSérine protéaseSérine protéase Hélicase/NTPaseHélicase/NTPaseHélicase/NTPaseHélicase/NTPase
Protéine NS3Protéine NS3Protéine NS3Protéine NS3Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Sérine protéaseSérine protéaseSérine protéaseSérine protéase
• Modulateur de la réponse interféron type I via les
Toll-Like receptor (TLR3)
Hélicase/NTPaseHélicase/NTPaseHélicase/NTPaseHélicase/NTPase
Protéine NS3Protéine NS3Protéine NS3Protéine NS3Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
1 631189
Bode et al., 2007; Archives of Biochemistry and Biophysics, 462: 6254-265
Production d’IFN-Production d’IFN- en Réponse à en Réponse à une Infection Viraleune Infection ViraleProduction d’IFN-Production d’IFN- en Réponse à en Réponse à une Infection Viraleune Infection Virale
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Bode et al., 2007; Archives of Biochemistry and Biophysics, 462: 6254-265
1.1. Clivage de TRIFClivage de TRIF 2.2. Clivage de CARDIFClivage de CARDIF
Inhibition de la Phosphorylation Inhibition de la Phosphorylation d’IRF3 par NS3d’IRF3 par NS3Inhibition de la Phosphorylation Inhibition de la Phosphorylation d’IRF3 par NS3d’IRF3 par NS3
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Sérine protéaseSérine protéaseSérine protéaseSérine protéase
• Modulateur de la réponse interféron type I via les
Toll-Like receptor (TLR3)
• Cible de molécules antivirales
VX-950 (Telaprevir®, Vertex)
SCH503034 (Boceprevir®, Schering-Plough)
ITMN 191 (Intermune)
Hélicase/NTPaseHélicase/NTPaseHélicase/NTPaseHélicase/NTPase
Protéine NS3Protéine NS3Protéine NS3Protéine NS3Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
1 631189
OPM Database, University of Michigan, College of Pharmacy.
Site actifSite actif((His57, Asp81, Ser139)
Telaprevir (VX-950)
Boceprevir (SCH 503034)
ITMN 191
Protéine NS4BProtéine NS4BProtéine NS4BProtéine NS4BVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Protéines Structurales Protéines Non-Structurales
IRES
5’NTR 3’NTR
C E1 E2 NS2 NS3 NS5A NS5B
NS4A
NS4B
p 7
Adapted from Tan et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
Complexe de RéplicationComplexe de RéplicationComplexe de RéplicationComplexe de RéplicationVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
ARN Polymérase ARN-dépendanteARN Polymérase ARN-dépendanteARN Polymérase ARN-dépendanteARN Polymérase ARN-dépendanteVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Protéines Structurales Protéines Non-Structurales
IRES
5’NTR 3’NTR
C E1 E2 NS2 NS3 NS5A NS5B
NS4A
NS4B
p 7
Adapted from Tan et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
Lesburg et al., Nat struct Biol 1999, 6: 937-943; Bressanelli et al., Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96: 13034-13039; Ago et al., Srructure Fold Des 1999, 7: 1417-1426.
Polymérase ViralePolymérase ViralePolymérase ViralePolymérase ViraleVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Réplication
– Modèle du poliovirus. Virus à ARN monocaténaire de polarité positive
De Clercq., Nature Review Drug Discovery, 2007; 6: 1001-18
Réplication ViraleRéplication ViraleRéplication ViraleRéplication ViraleVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Copyright © 2006 Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, New Jersey, USA
AA
NNI site A (Thumb/fingertips)Indoles
Benzimidazoles
NNI site B (Thumb)Phe derivatives
Thiophene-COOHDihydroxypirones
Pyranoindoles
BB
NNI site C (Palm)BenzothiadiazineAcyl-pyrrolidine
Proline sulfonamideAcrylic acid derivatives
Active SiteActive Site
Allosteric GTP
CC
2’-methyl nucleosides4’ azido-cytidine
NNI site D (R200 hinge)Benzofurans
AA
BBCC
DD
Cibles des Molécules AntiviralesCibles des Molécules AntiviralesCibles des Molécules AntiviralesCibles des Molécules AntiviralesVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Cycle ViralCycle ViralCycle ViralCycle Viral
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Cycle ViralCycle ViralCycle ViralCycle Viral
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Modèle d’Entrée ViraleModèle d’Entrée ViraleModèle d’Entrée ViraleModèle d’Entrée Virale
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Cycle ViralCycle ViralCycle ViralCycle Viral
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Maturation de la PolyprotéineMaturation de la PolyprotéineMaturation de la PolyprotéineMaturation de la Polyprotéine
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Structure des Protéines NSStructure des Protéines NSStructure des Protéines NSStructure des Protéines NS
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Cycle ViralCycle ViralCycle ViralCycle Viral
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Complexes de RéplicationComplexes de RéplicationComplexes de RéplicationComplexes de Réplication
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Cycle ViralCycle ViralCycle ViralCycle Viral
Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Virus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite CII. Modèles d’EtudeII. Modèles d’Etude
Virus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite CII. Modèles d’EtudeII. Modèles d’Etude
Souris transgéniquesSouris SCID/uPA
Modèles AnimauxModèles AnimauxModèles AnimauxModèles AnimauxVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Visualisation des cellules Huh7 infectées
3 - Vecteur de transfert de la GFP
2 - Expression des glycoprotéines E1E2 du VHC
1 - Expression de Gag-Pol de MLV
CMVCMV MLV MLV Gag-PolGag-Pol
CMVCMV VHC E1-E2VHC E1-E2
CMVCMV LTRLTR LTRLTRGFPGFP
Co-transfection des cellules 293 T
Production de ppVHC infectieuses
Infection in vitro des cellules Huh7
Pseudoparticules Rétrovirales (HCVpp)Pseudoparticules Rétrovirales (HCVpp)Pseudoparticules Rétrovirales (HCVpp)Pseudoparticules Rétrovirales (HCVpp)Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
AA
BB
Adapted from Nature Review Drug Discovery, 2002; 1:911-916
Réplicons SubgénomiquesRéplicons SubgénomiquesRéplicons SubgénomiquesRéplicons SubgénomiquesVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Adapted from www.molecular-virology.uni-hd.de
Système Productif (HCVcc)Système Productif (HCVcc)Système Productif (HCVcc)Système Productif (HCVcc)Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Virus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite CIII. Variabilité GénétiqueIII. Variabilité Génétique
Virus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite CIII. Variabilité GénétiqueIII. Variabilité Génétique
Virus de l’hépatite CProduction virale (/24 heures) 1012
T1/2 virus libre (heures) 2 - 3
T1/2 brin ARN (heures) ~10
Taux de mutation Très élevé
Mutants d’échappement au SI Fréquent
Cellules ciblesTaille du compartiment Probablement grande
Soriano et al., J Antimicro Chemother 2008, 62: 1-4
Dynamique ViraleDynamique ViraleDynamique ViraleDynamique ViraleVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Erreurs au cours de la réplication– Fréquentes
. 10-4-10-4 mutations par nucléotide copié au cours de la réplication du VHC
– Spontanées– Au hasard
• Absence d’activité exonucléasique 3’5’ ("proofreading")– Accumulation de mutations
• A l’origine de : – La diversification des types et des sous-types– La distribution en quasi-espèces
ARN Polymérase ARN-dépendanteARN Polymérase ARN-dépendanteARN Polymérase ARN-dépendanteARN Polymérase ARN-dépendanteVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Simmonds et al. Hepatology 2005.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Diversification des GénotypesDiversification des GénotypesDiversification des GénotypesDiversification des Génotypes
7
Central Africa
Murphy et al., AASLD, Hepatology, 2007.
Diversification des GénotypesDiversification des GénotypesDiversification des GénotypesDiversification des GénotypesVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Facteur prédictif de la réponse au traitement
• Conditionne – La dose de ribavirine (800 - 1400 mg)– La durée de traitement (16 - 72 semaines)
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
GénotypesGénotypesGénotypesGénotypes
Weiner et al., Virology 1991; 180:842-848; Martell et al., J Virol 1992;66:3225-36.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Distribution en Quasi-espèceDistribution en Quasi-espèceDistribution en Quasi-espèceDistribution en Quasi-espèce
• Dérive génétique– Accumulation de mutations ponctuelles
• Glissement génétique– Suite à la modification brutale de l’environnement
réplicatif
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Mécanismes d’Evolution de la Mécanismes d’Evolution de la Quasi-espèceQuasi-espèceMécanismes d’Evolution de la Mécanismes d’Evolution de la Quasi-espèceQuasi-espèce
• Joue un rôle dans le maintien de l’infection chronique
• Joue un rôle dans l’échec des traitements antiviraux
• Joue un rôle dans la sévérité de la maladie
Farci P, 2000; Science, 288: 339-344; Lavillette D, 2005; Journal of Virology, 79(10): 6023-6034; Farci P, 2002; PNAS, 99: 3081-3086; Chambers TJ et al., 2005; 79: 3071-3083; Sullivan et al., JID 2007, 196: 239-248.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Distribution en Quasi-espèceDistribution en Quasi-espèceDistribution en Quasi-espèceDistribution en Quasi-espèce
Virus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite CIV. Exemples d’Application IV. Exemples d’Application de la Variabilité Génétiquede la Variabilité Génétique
Virus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite CIV. Exemples d’Application IV. Exemples d’Application de la Variabilité Génétiquede la Variabilité Génétique
• Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique Impacts de la Variabilité Génétique du VHCdu VHCImpacts de la Variabilité Génétique Impacts de la Variabilité Génétique du VHCdu VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique Impacts de la Variabilité Génétique du VHCdu VHCImpacts de la Variabilité Génétique Impacts de la Variabilité Génétique du VHCdu VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
7
Central Africa
Murphy et al., AASLD, Hepatology, 2007.
Diversification des GénotypesDiversification des GénotypesDiversification des GénotypesDiversification des GénotypesVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Génotype & Mode de TransmissionGénotype & Mode de TransmissionGénotype & Mode de TransmissionGénotype & Mode de Transmission
52% 54%
63%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
UDVI Transfusion Autres
31b1aAutres
Pawlotsky et al., J Infect Dis, 1995; 171(6): 1607-10.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
27%
39%
36%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
UDVI Transfusion Autres
4321b1a1nt
Payan et al., J Viral Hepat 2005;12: 405-13.
Génotype & Mode de TransmissionGénotype & Mode de TransmissionGénotype & Mode de TransmissionGénotype & Mode de TransmissionVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Génotype 3a Génotype 3a Chez les UDVIChez les UDVI
0.1 substitution per site
JK049TrKj
NE125NE048
HCV-3a
HCV-3fHCV-3c
HCV-3bHCV-3k
Australie
USA, Côte Ouest
Argentine
Brézil
France
USA, Côte Est
75
72
83
79
100
92
60
62
81
63
98
98
99
62
52
7195
56
Morice et al., J Med Virol 2006;78:1296-1303.
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique Impacts de la Variabilité Génétique du VHCdu VHCImpacts de la Variabilité Génétique Impacts de la Variabilité Génétique du VHCdu VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Mise en évidence d’une séroconversion VHC lors du dépistage et du suivi des patients hémodialysés en juillet 2005, à l’hôpital Henri Mondor
• L’ensemble des patients hémodialysés ont été testés (anticorps anti-VHC et ARN viral)– Mise en évidence d’un 2nd cas au cours de la même période
• Analyses génétique et phylogénique
• Recherche du VHC dans l’environnement– Supports et surfaces inertes
Transmission Nosocomiale Transmission Nosocomiale "Mondorienne""Mondorienne"Transmission Nosocomiale Transmission Nosocomiale "Mondorienne""Mondorienne"
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Identification de deux cas de séroconversion en 2004 au sein de l’unité d’hémodialyse de l’hôpital Henri Mondor :
– Patient "1" infecté par un génotype 3a
– Patient "2" infecté par un génotype 1
Transmission Nosocomiale Transmission Nosocomiale "Mondorienne""Mondorienne"Transmission Nosocomiale Transmission Nosocomiale "Mondorienne""Mondorienne"
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
1h_FrSSD98
1h_98CM15211h_98CM1357
1f_FR21i_FR16
1i_QC771iQC181
1m_GUI171m_GUI11
1m_GUI241d_HC1N161d_BA107
1d_FR17Patient 81b_HCJ4
Patient 7Patient 6
Patient 5Patient 4
1b_HCP011b_HCVBK
1c_HCG91c_SR0311c_Khaja1
1l_M5186N1l_98CM14271l_98CM1457
1e_M4541N1e_CAM1078
1e_QC1721g_1382
1g_21521g_EG024
1a_HCV11a_HCVH
1a_HCJ11j_QC2
1j_QC891k_QC68
1k_QC82Patient 3Patient 2*Patient 2**
2a_HCJ65a_SA13
6a_EUHK2Patient 1
3a_NLZ14a_ED43
0.05
Genotype 4
Genotype 3
Genotype 6Genotype 5
Genotype 2
Genotype 1
100
100
100
Patients VHC chroniqueSéroconversion VHC
Girou et al., Clin Infect Disease 2008, 47(5): 627-633.
G1
Analyse Analyse PhylogéniquePhylogéniqueAnalyse Analyse PhylogéniquePhylogénique
Région NS5B (329 nt)CLUSTALXDNADist (PHYLIP 3.5)Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)Neighbor-JoiningBootstraping : 1000 replicatesNJPlot
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
6a_332b_JFH1Patient 1 (7/04)
5a_SA131b_HVR3812
S5 (7/05)Patient 3 (7/05)Patient 3 (9/05)Patient 2 (7/04)Patient 2 (9/04)Patient 3 (7/04)S4 (6/05)S3 (6/05)S2 (6/05)Patient 3 (01/05)S1 (6/05)
1a_HCT27X52a_Q2B
3a_CB1a_HCT18X5
Patient 61b_AWV2C33
Patient 8Patient 4
Patient 74a_ED43
0.2
100
Girou et al., Clin Infect Disease 2008, 47(5): 627-633.
Patients VHC chroniqueSéroconversion VHC
Analyse PhylogéniqueAnalyse PhylogéniqueAnalyse PhylogéniqueAnalyse Phylogénique
Région HVR1 (81 nt)CLUSTALXDNADist (PHYLIP 3.5)Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)Neighbor-JoiningBootstraping : 1000 replicatesNJPlot
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
6a_332b_JFH1Patient 1 (7/04)
5a_SA131b_HVR3812
S5 (7/05)Patient 3 (7/05)Patient 3 (9/05)Patient 2 (7/04)Patient 2 (9/04)Patient 3 (7/04)S4 (6/05)S3 (6/05)S2 (6/05)Patient 3 (01/05)S1 (6/05)
1a_HCT27X52a_Q2B
3a_CB1a_HCT18X5
Patient 61b_AWV2C33
Patient 8Patient 4
Patient 74a_ED43
0.2
100
Surfaces inertes
Girou et al., Clin Infect Disease 2008, 47(5): 627-633.
Patients VHC chroniqueSéroconversion VHC
Région HVR1 (81 nt)CLUSTALXDNADist (PHYLIP 3.5)Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)Neighbor-JoiningBootstraping : 1000 replicatesNJPlot
Analyse PhylogéniqueAnalyse PhylogéniqueAnalyse PhylogéniqueAnalyse Phylogénique
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Screening de 64 patients hémodialysés à l’hôpital Hubert Kutuku Maga, Cotonou, Bénin (Afrique)– Détection anticorps anti-VHC– Détection ARN VHC (limite détection <50UI/mL)
• Etude génétique et phylogénique de deux régions distinctes du génome viral– NS5B– Core-E1
Transmission Nosocomiale au Transmission Nosocomiale au BéninBéninTransmission Nosocomiale au Transmission Nosocomiale au BéninBénin
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Analyse PhylogéniqueAnalyse PhylogéniqueAnalyse PhylogéniqueAnalyse Phylogénique
5aSA132aHCJ6
Patient 496aEUHK2 3aNLZ1
Patient 624aED431hFrSSD98
1h98CM13571h98CM1521
1cHCG91cSR0311cKhaja11aHCV1
1aHCVH1aHCJ1
1jQC21jQC891kQC68
1kQC821eM4541N
1eCAM10781eQC172
1g13821g2152
1gEG0241lM5186N1l98CM14271l98CM1457
1fFR2Patient 59Patient 46Patient 54Patient 2
Patient 28Patient 64Patient 16Patient 36
Patient 18Patient 17Patient 8
Patient 71bHCJ41bHCVBK
1bHCP01Patient 401iFR16
1iQC771iQC181Patient 48Patient 60Patient 52
Patient 261dFR17
1dHC1N161dBA1071mGUI171mGUI111mGUI24
0.05
5999
96
34100
72
100
98
43
Région NS5B (286 nt)CLUSTALXDNADist (PHYLIP 3.5)Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)Neighbor-JoiningBootstraping : 1000 replicatesNJPlot
Génotype 2
Génotype 4
Génotype 3
Génotype 1
Génotype 6
Génotype 2Génotype 5
Génotype 1, sous-type b
Génotype 3, sous-type a
Génotype 1, sous-type i
Génotype 1, sous-type ?
100
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Transmissions NosocomialesTransmissions NosocomialesTransmissions NosocomialesTransmissions Nosocomiales
Région HVR1 (81 nt)CLUSTALXDNADist (PHYLIP 3.5)Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)Neighbor-JoiningNJPlot
2aQ2B
3aCB2bJFH1
1aHCT18X56a33
4aED431aHCT27X5
Patient 7Patient 8Patient 16Patient 18
Patient 17Patient 2
Patient 28Patient 64
Patient 54Patient 46
5aSA13Patient 59
Patient 52Patient 48
Patient 601bAWV2C33
1bHVR3812
0.2
Patient 26Patient 40
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
MAXIMUM DE VRAISEMBLANCEMAXIMUM DE VRAISEMBLANCE
Assignation Provisoire d’un Nouveau Assignation Provisoire d’un Nouveau Sous-type : Sous-type : Etude de la région NS5BEtude de la région NS5B
Patient 16Patient 18Patient 17Patient 8Patient 7
Patient 64Patient 46
1f_L38350
1e_AY894555
1g_AF271822
1g_AF271820
1d_L39302
1d_L39299
1b_M58335
1b_D90208
1i_AY434119
1h_AY434131
1j_AY434158
1j_AY434128
1k_AY434122
1k_AY434112
1a_M67463
1a_M62321
1c_D14853
1c_AY051292
0.05
PARCIMONIEPARCIMONIE
Patient 16Patient 18Patient 17Patient 7Patient 8Patient 64Patient 461f_L38350
1h_AY434131
1i_AY434119
1d_L39302
1d_L39299
1b_M58335
1b_D90208
1e_AY894555
1g_AF271822
1g_AF271820
1j_AY434158
1j_AY434128
1k_AY434122
1k_AY434112
1a_M67463
1a_M62321
1c_D14853
1c_AY051292
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
MAXIMUM DE VRAISEMBLANCEMAXIMUM DE VRAISEMBLANCE
Assignation Provisoire d’un Nouveau Assignation Provisoire d’un Nouveau Sous-type : Sous-type : Etude de la région Core-E1Etude de la région Core-E1
PARCIMONIEPARCIMONIE
Patient 7Patient 64
Patient 46Patient 18Patient 16
Patient 17Patient 8
1h_AY4341321h_AY257087
1d_L383771i_AY434120
1i_L484951b_M583351b_L38372
1b_D902081f_L38371
1l_AY2570911l_AY257083
1c_AY0512921c_D14853
1g_AF2717971g_AF2717981e_AY894553
1e_L383611k_AY434123
1k_AY4341131j_AY434129
1j_AY4341061a_M67463
1a_M62321
0.02 Patient 64Patient 46Patient 18Patient 16Patient 17Patient 7Patient 81d_L383771i_AY4341201i_L484951b_D902081b_L383721b_M583351l_AY2570911l_AY2570831c_AY0512921c_D148531g_AF2717971g_AF2717981e_AY8945531e_L383611k_AY4341231k_AY4341131j_AY4341291j_AY4341061a_M674631a_M623211f_L383711h_AY4341321h_AY257087
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Epidémie à VHC au sein d’une unité d’hémodialyse en Grèce ("Papageorgiou General HospitalPapageorgiou General Hospital", Thessaloniki), Thessaloniki)
• 17 patients hémodialysés contaminés en quelques mois
• Analyses génétique et phylogénique
• Etude de la réponse neutralisante– Système HCVpp
Lavillette et al., J Virol 2005;79:6023-34
Transmission Nosocomiale en GrèceTransmission Nosocomiale en GrèceTransmission Nosocomiale en GrèceTransmission Nosocomiale en GrèceVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
0,1 substitution per site
HCV-1HCV-H
SR052HC-G9
SR037HC-J4
HCV-BKBE90
Pt-11Pt-10Pt-9Pt-5Pt-12Pt-13Pt-15
Pt-16Pt-2Pt-4
Pt-3Pt-1Pt-17Pt-7Pt-6Pt-8
1b
HCV-1
1a
1c
Souche B
Souche A
Analyse PhylogéniqueAnalyse PhylogéniqueAnalyse PhylogéniqueAnalyse Phylogénique
Lavillette et al., J Virol 2005;79:6023-34
Région HVR1 (81 nt)CLUSTALXDNADist (PHYLIP 3.5)Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)Neighbor-JoiningNJPlot
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Incubation HCVpp avec des dilutions de sérum
Détermination de l’infectivité (bruit de fond)
Détermination de l’activité neutralisante du sérum
Infection de cellules Huh7
Pseudoparticules Rétrovirales (HCVpp)Pseudoparticules Rétrovirales (HCVpp)Pseudoparticules Rétrovirales (HCVpp)Pseudoparticules Rétrovirales (HCVpp)
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Patient-10 (souche B)
ARN VHC(UI/mL)
Semaines
% neutralisationinfection
Huh7
ARN VHC
Réponse Neutralisante
ALAT
Contrôle Neutralisation1,E+01
1,E+02
1,E+03
1,E+04
1,E+05
1,E+06
1,E+07
1,E+08
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
1,E+01
1,E+02
1,E+03
1,E+04
1,E+05
1,E+06
1,E+07
1,E+08
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
• Absence de réponse neutralisante et absence de contrôle de l’infection
Lavillette et al., J Virol 2005;79:6023-34
Réponse Neutralisante - Groupe 1Réponse Neutralisante - Groupe 1Réponse Neutralisante - Groupe 1Réponse Neutralisante - Groupe 1Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Réponse neutralisante forte et spécifique• Réponse neutralisante inversement proportionnelle
à la cinétique de la charge virale
Patient-1 (souche A)
1,E+01
1,E+02
1,E+03
1,E+04
1,E+05
1,E+06
1,E+07
1,E+08
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
1,E+01
1,E+02
1,E+03
1,E+04
1,E+05
1,E+06
1,E+07
1,E+08
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% neutralisationinfection
Huh7
Réponse Neutralisante - Groupe 2Réponse Neutralisante - Groupe 2Réponse Neutralisante - Groupe 2Réponse Neutralisante - Groupe 2
ARN VHC(UI/mL)
Semaines
ARN VHC
Réponse Neutralisante
ALAT
Contrôle Neutralisation
Lavillette et al., J Virol 2005;79:6023-34
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique Impacts de la Variabilité Génétique du VHCdu VHCImpacts de la Variabilité Génétique Impacts de la Variabilité Génétique du VHCdu VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Histoire NaturelleHistoire NaturelleHistoire NaturelleHistoire Naturelle
Hépatite Aiguë
Hépatite Chronique50 - 85%
Cirrhose 20 - 30%
Décompensation6 - 10%
HCC4 - 5% par an
Mortalité
10 -
30
ans
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Histoire NaturelleHistoire NaturelleHistoire NaturelleHistoire Naturelle
Hépatite Aiguë
Hépatite Chronique50 - 85%
Cirrhose 20 - 30%
Décompensation6 - 10%
HCC4 - 5% par an
Mortalité
10 -
30
ans
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Persistance ViralePersistance Virale
• Persistance virale– Echec de la réponse immune, pourtant
présente et adaptée, à éliminer le virus ou les cellules qui l’abritent
• Interface complexe
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Processus Multi-étapeProcessus Multi-étape
Hépatite Aiguë
Infection Chronique
Hépatite Chronique50 - 85%
1. Mise en place de l’infection aiguë
2. Etablissement de la persistance virale
3. Maintient de l’infection au cours du temps
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Hépatite Aiguë
Infection Chronique
Hépatite Chronique50 - 85%
1. Mise en place de l’infection aiguë
2. Etablissement de la persistance virale ?
3. Maintient de l’infection au cours du temps
Processus Multi-étapeProcessus Multi-étapeVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
Adapted from Ferrari C, Gasroenterology 2007; 132(2): 801-805
Persistance du VHCPersistance du VHCVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique Impacts de la Variabilité Génétique du VHCdu VHCImpacts de la Variabilité Génétique Impacts de la Variabilité Génétique du VHCdu VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
Roque-Afonso et al., J Virol 2005;79:6349-57)
Région 5’NCRégion 5’NC Région E1-E2Région E1-E2
Compartimentation Plasma-PBMCCompartimentation Plasma-PBMCCompartimentation Plasma-PBMCCompartimentation Plasma-PBMCVirus de l’Hépatite C et Marqueurs
• Diversification et diffusion du VHC
• Transmission du VHC
• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC
• Compartimentation tissulaire du VHC
• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance
Impacts de la Variabilité Génétique Impacts de la Variabilité Génétique du VHCdu VHCImpacts de la Variabilité Génétique Impacts de la Variabilité Génétique du VHCdu VHC
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs
HEPATITE C : Stratégie HEPATITE C : Stratégie
Diagnostique & Suivi Diagnostique & Suivi
VirologiqueVirologique
HEPATITE C : Stratégie HEPATITE C : Stratégie
Diagnostique & Suivi Diagnostique & Suivi
VirologiqueVirologique
Virus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite CI. Cinétique des Marqueurs I. Cinétique des Marqueurs
VirologiquesVirologiques
Virus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite CI. Cinétique des Marqueurs I. Cinétique des Marqueurs
VirologiquesVirologiques
Marqueurs VirologiquesMarqueurs VirologiquesMarqueurs VirologiquesMarqueurs VirologiquesStratégie diagnostique & suivi virologique
Marqueurs indirects
Anticorps anti-VHC totaux
Marqueurs directs
ARN VHC
Génotype VHC
Cinétique des MarqueursCinétique des MarqueursCinétique des MarqueursCinétique des Marqueurs
ARN VHC
Symptômes +/-
Temps après contage (mois)
Tit
re
Anti-VHC
ALAT
Normal
0 1 2 3 4 5 6 12 24 36 48
Infection Aiguë
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Cinétique des MarqueursCinétique des MarqueursCinétique des MarqueursCinétique des Marqueurs
ARN VHC
Symptômes +/-
Temps après contage (mois)
Tit
re
Anti-VHC
ALAT
0 1 2 3 4 5 6 12 24 36 48
Infection Chronique
Normal
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Virus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite CII. Tests VirologiquesII. Tests VirologiquesVirus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite CII. Tests VirologiquesII. Tests Virologiques
Tests Virologiques MoléculairesTests Virologiques MoléculairesTests Virologiques MoléculairesTests Virologiques Moléculaires
Tests quantitatifsSeuil de détection ≥ qualitatifs
Quelle quantité est présente ?
Tests qualitatifsTrès sensibles( 50 IU/mL)
Est-ce que le VHC est présent ?
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détermination du Génotype
Quel type de VHC est présent ?
Tests Virologiques MoléculairesTests Virologiques MoléculairesTests Virologiques MoléculairesTests Virologiques MoléculairesStratégie diagnostique & suivi virologique
Est-ce que le VHC est présent et en quelle quantité ?
Détermination du Génotype
Quel type de VHC est présent ?
Tests Quanti-Qualitatifs
Détection-Quantification de l’ARN VHC
Intérêts de la Détection - Intérêts de la Détection - Quantification de l’ARN VHCQuantification de l’ARN VHCIntérêts de la Détection - Intérêts de la Détection - Quantification de l’ARN VHCQuantification de l’ARN VHC
• Evaluation de la réplication virale chez des patients anticorps anti-VHC positifs
• Evaluation de la réponse virologique au cours du traitement pegIFN - RBV
– Réponse virologique rapide (semaine 4)– Réponse virologique précoce (semaine 12)– Réponse fin de traitement (EOT)– Réponse virologique soutenue (semaine 24 post-Rx)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Techniques DisponiblesTechniques DisponiblesTechniques DisponiblesTechniques Disponibles
b-DNA PCR
Branched DNA Polymerase chain reaction
Amplification du signal Amplification de la cible
Quantitative Quantitative
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Principe des TechniquesPrincipe des TechniquesPrincipe des TechniquesPrincipe des Techniques
b-DNA PCR
Branched DNA Polymerase chain reaction
Amplification du signal Amplification de la cible
Quantitative Quantitative
Stratégie diagnostique & suivi virologique
bDNA : PrincipebDNA : PrincipebDNA : PrincipebDNA : Principe
ARN VHC
Capture ProbeCapture Extender
Label extender
Preamplifier
Amplifier with hybridizedlabel probe
Adapted from Siemens
Stratégie diagnostique & suivi virologique
bDNA : Forces & FaiblessesbDNA : Forces & FaiblessesbDNA : Forces & FaiblessesbDNA : Forces & Faiblesses
• Forces– Quantification indépendante du génotype– Tolérance de polymorphismes nucléotidiques– Faible volume de prise d’essai– Large intervalle de quantification linéaire
. ≥ 6.90 Log10 UI/mL
• Faiblesses– Faible sensibilité
. LLOD: 2.80 Log10 UI/mL
– Faux positifs dans les faibles valeurs – Méthode semi-automatisée (Siemens system 340 analyzer)– 12 contrôles par run
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Principe des TechniquesPrincipe des TechniquesPrincipe des TechniquesPrincipe des Techniques
b-DNA PCR
Branched DNA Polymerase chain reaction
Amplification du signal Amplification de la cible
Quantitative Quantitative
Stratégie diagnostique & suivi virologique
PCR : PrincipePCR : PrincipePCR : PrincipePCR : Principe
VHC ARN ADNc Amplicons(ADNdb)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Avantages Techniques de la PCR Avantages Techniques de la PCR en temps réelen temps réel
• Diminution du risque de contamination
• Amélioration de la sensibilité
• Augmentation de l’intervalle de quantification linéaire
• Amélioration précision et reproductibilité
• Augmentation de débit à travers l’automatisation
• Diminution des coûts
Stratégie diagnostique & suivi virologique
10 102 103 104 105 106 107 108
Cobas AmplicorHCV Monitor v2.0
SuperQuant
LCx HCV RNAAssay
Versant HCV RNA3.0 (bDNA)
Intervalle de QuantificationIntervalle de QuantificationStratégie diagnostique & suivi virologique
10 102 103 104 105 106 107 108
Cobas AmplicorHCV Monitor v2.0
SuperQuant
LCx HCV RNAAssay
Versant HCV RNA3.0 (bDNA)
TaqMan 48 HCVTaqMan 48 HCV(Roche)(Roche)
HCV Quant ASRHCV Quant ASR(Abbott)(Abbott)
Versant HCV RNAVersant HCV RNA1.0 (kPCR, Siemens)*1.0 (kPCR, Siemens)**en développement
Intervalle de QuantificationIntervalle de QuantificationStratégie diagnostique & suivi virologique
• Diminution du risque de contamination
• Amélioration de la sensibilité
• Augmentation de l’intervalle de quantification linéaire
• Amélioration précision et reproductibilité
• Augmentation de débit à travers l’automatisation
• Diminution des coûts
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Avantages Techniques de la PCR Avantages Techniques de la PCR en temps réelen temps réel
Plates-formesPlates-formesPlates-formesPlates-formesCAP-CTM96 (ROCHE)
kPCR (SIEMENS)
m2000SP-m2000RT (ABBOTT)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
• Remplace les techniques qualitatives de détection de l’ARN VHC
• Quantifie l’ensemble des charges virales observées en pratique clinique– Faibles charges virales au cours du traitement
• Surveille efficacement les cinétiques virales (évaluation précoce des réponses virologiques au traitement)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Avantages Cliniques de la PCR Avantages Cliniques de la PCR en temps réelen temps réel
Quantification de l’ARN du VHCQuantification de l’ARN du VHCQuantification de l’ARN du VHCQuantification de l’ARN du VHCCAP-CTM48 (Roche) versus bDNA 3.0 (Siemens)
Dif
fere
nce
bet
wee
n H
BV
DN
A l
eve
ls m
eas
ure
d i
n
CA
P/C
TM
an
d i
n b
DN
A (
in L
og
10 I
U/m
L)
3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0-1.5
1.0
-1.0
1.5
0.0
0.5
-0.5
Mean of HCV RNA levels measured in CAP/CTM and bDNA (in Log10 UI/mL)
Genotype 1 (n=29)
Genotype 2 (n=27)
Genotype 3 (n=29)
Genotype 4 (n=30)
Genotype 5 (n=9)
Genotype 6 (n=2)
Chevaliez et al., 2007; Hepatology, 46(1): 22-31.
Meandifference
+ 1.96 meandifference
- 1.96 meandifference
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Différences de QuantificationDifférences de QuantificationDifférences de QuantificationDifférences de Quantification
Chevaliez et al., 2007; Hepatology, 46(1): 22-31.
Genotype 1 (n=29)
Genotype 2 (n=27)
Genotype 3 (n=29)
Genotype 4 (n=30)
Genotype 5 (n=9)
Genotype 6 (n=2)
-1.5
1.0
-1.0
1.5
0.0
0.5
-0.5
15%15%30%30%
Dif
fere
nce
bet
wee
n H
CV
RN
A l
eve
ls m
eas
ure
d i
n
CA
P/C
TM
an
d i
n b
DN
A (
in L
og
10 U
I/m
L)
CAP-CTM48 (Roche) versus bDNA 3.0 (Siemens)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Chevaliez et al., manuscript in preparation.
m2000SP-m2000RT (Abbott) versus bDNA 3.0 (Siemens)
Mean of HCV RNA levels measured in m2000SP/m2000RT and bDNA (in Log10IU/mL)
3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0-1.5
1.0
-1.0
1.5
0.0
0.5
-0.5
Dif
fere
nce
bet
wee
n H
CV
RN
A l
eve
ls m
eas
ure
d i
n
m20
00 S
P/m
200
0 RT a
nd
in
bD
NA
(in
Lo
g1
0 I
UI/
mL
)
Meandifference
+ 1.96 meandifference
- 1.96 meandifference
Genotype 1 (n=55)
Genotype 2 (n=21)
Genotype 3 (n=29)
Genotype 4 (n=24)
Genotype 5 (n=9)
Genotype 6 (n=3)
Quantification de l’ARN du VHCQuantification de l’ARN du VHCQuantification de l’ARN du VHCQuantification de l’ARN du VHCStratégie diagnostique & suivi virologique
David Sherman., Molecular Symposium, September 2007 (source: Siemens Medical Solutions Diagnostics).
kPCR HCV 1.0 (Siemens) versus bDNA 3.0 (Siemens)
132 clinical samples
Quantification de l’ARN du VHCQuantification de l’ARN du VHCQuantification de l’ARN du VHCQuantification de l’ARN du VHCStratégie diagnostique & suivi virologique
Détermination du Génotype
Génotypes du VHCGénotypes du VHCGénotypes du VHCGénotypes du VHC
Simmonds et al. Hepatology 2005; Murphy et al., AASLD, Hepatology, 2007.
7
Central Africa
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intérêts de la Détermination du Intérêts de la Détermination du GénotypeGénotypeIntérêts de la Détermination du Intérêts de la Détermination du GénotypeGénotype
• Détermination systématique du
génotype
– Facteur prédictif de la réponse au
traitement
– Conditionne
• La dose de ribavirine
• La durée du traitement (24 vs 48 semaines)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détermination du GénotypeDétermination du GénotypeDétermination du GénotypeDétermination du Génotype
• Détermination moléculaire du génotype VHC (génotypage)
• Détermination sérologique du génotype VHC (“sérotypage”)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détermination du GénotypeDétermination du GénotypeDétermination du GénotypeDétermination du Génotype
• Détermination moléculaire du génotype VHC (génotypage)
• Détermination sérologique du génotype VHC (“sérotypage”)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Cibles pour le GénotypageCibles pour le GénotypageCibles pour le GénotypageCibles pour le Génotypage
Protéines Structurales Protéines Non-Structurales
IRES
5’NTR 3’NTR
C E1 E2 NS2 NS3 NS5A NS5B
NS4A
NS4B
p 7
Adapted from Tail et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Cibles pour le GénotypageCibles pour le GénotypageCibles pour le GénotypageCibles pour le Génotypage
Protéines Structurales Protéines Non-Structurales
IRES
5’NTR 3’NTR
C E1 E2 NS2 NS3 NS5A NS5B
NS4A
NS4B
p 7
Adapted from Tail et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2002; 1(6): 867-881
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Méthodes de GénotypageMéthodes de GénotypageMéthodes de GénotypageMéthodes de Génotypage
• Séquençage direct des produits d’amplification1
• Restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP)2
• Hybridation inverse des produits d’amplification sur support solide : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV, Innogenetics)3
• Autres méthodes :– Single-strand conformation polymorphism analysis (SSCP)4
– Spectrométrie de masse MALDI-TOF après miniséquençage5
1Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29.; 2Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; 4Lareu et al., 1997; 3Le Pogam et al., 1998; J Clin Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Méthodes de GénotypageMéthodes de GénotypageMéthodes de GénotypageMéthodes de Génotypage
• Séquençage direct des produits d’amplification1
• Restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP)2
• Hybridation inverse des produits d’amplification sur support solide : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV, Innogenetics)3
• Autres méthodes :– Single-strand conformation polymorphism analysis (SSCP)4
– Spectrométrie de masse MALDI-TOF après miniséquençage5
1Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29.; 2Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; 4Lareu et al., 1997; 3Le Pogam et al., 1998; J Clin Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15
Stratégie diagnostique & suivi virologique
VersantVersant®® HCV Genotype 2.0 HCV Genotype 2.0 AssayAssayVersantVersant®® HCV Genotype 2.0 HCV Genotype 2.0 AssayAssay
3
17
15
20
21
23. AC
Marker
CC
AC
4
5
10
12
24. 6 c-l
16
2b 3a 4b 6a1b 6c-l1a
6
7
8
9
11
13
14
18
19
25. 1a
25. 1b
5’UTRSame bands
as the 1.0 version
Core region
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Importance de la Région Virale pour la Importance de la Région Virale pour la Détermination du Sous-typeDétermination du Sous-typeImportance de la Région Virale pour la Importance de la Région Virale pour la Détermination du Sous-typeDétermination du Sous-type
Analyse phylogénique de la région
5’NC
1ère génération
de Line probe assay
(LiPA1.0)
2ème génération
de Line probe assay
(LiPA2.0)PCR en
temps réel
1a (n=233) 80,3%
(n=187)
73,0% (n=170)
98,3% (n=229)
94,4% (n=220)
1b (n=253) 94,1%
(n=238)
91,7% (n=232)
98,0% (n=248)
93,3% (n=236)
Chevaliez et al., EASL 2009.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Virus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite CIII. Diagnostic VirologiqueIII. Diagnostic Virologique
Virus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite CIII. Diagnostic VirologiqueIII. Diagnostic Virologique
Diagnostic de l’Infection AiguëDiagnostic de l’Infection AiguëDiagnostic de l’Infection AiguëDiagnostic de l’Infection Aiguë
Ac anti-HCV
-
-
+
+
ARN VHC*
-
+
-
+
* Technique sensible seuil de détection ≤ 50 IU/ml
Diagnostic
Absence d’infection aiguë
Infection aiguë C
Probablement pas d’infection aiguë
Difficile de conclure
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Diagnostic de l’Infection ChroniqueDiagnostic de l’Infection ChroniqueDiagnostic de l’Infection ChroniqueDiagnostic de l’Infection Chronique
• Détection des anticorps anti-VHC totaux par ELISA
• Recherche d’ARN du VHC par un test sensible*
• Détection d’ARN du VHC* si le test ELISA (-) chez des patients hémodialysés ou immunodéprimés
* Technique sensible seuil de détection ≤ 50 IU/ml
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Virus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite CIII. Prise en Charge III. Prise en Charge
ThérapeutiqueThérapeutique
Virus de l’Hépatite CVirus de l’Hépatite CIII. Prise en Charge III. Prise en Charge
ThérapeutiqueThérapeutique
Intérêts des Tests Virologiques Intérêts des Tests Virologiques en Thérapeutiqueen ThérapeutiqueIntérêts des Tests Virologiques Intérêts des Tests Virologiques en Thérapeutiqueen Thérapeutique
Consensus conference: treatment of hepatitis C; 2002, Gastroenterol Clin Biol, 26(2): B303-20
• Décision de traiter
• Optimisation du schéma thérapeutique
• Etude de la réponse virologique au traitement
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Classification des PatientsClassification des PatientsClassification des PatientsClassification des Patients
Type1
Types2, 3
Types4, 5, 6
Génotypes VHC
Consensus conference: treatment of hepatitis C; 2002, Gastroenterol Clin Biol, 26(2): B303-20
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Indications Actuelles du TraitementIndications Actuelles du TraitementIndications Actuelles du TraitementIndications Actuelles du Traitement
• Patients infectés par un VHC de génotype 1– Interferon pégylé plus ribavirine (1000 - 1400 mg/j)– Durée : 48 semaines
• Patients infectés par un VHC de génotype 2/3– Interferon pégylé plus ribavirine (800 mg/j)– Durée : 24 semaines
• Patients infectés par une VHC de génotype 4, 5 et 6– Interferon pégylé plus ribavirine (1000 - 1400 mg/j)– Durée : 48 semaines
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Génotype VHC
VHC-1 (4,5,6)Quantification ARN
VHC-2,3
Bithérapie24 semaines
Ribavirine 800 mg
Bithérapie48 semaines
Ribavirine 1000-1400 mg
Quantification ARN à S12
Diminution < 2 Log Diminution 2 Log ARN VHC +
Arrêt traitementpoursuite avec
IFN pégylé pour ralentir la
progression de la maladie
hépatique
Poursuite jusqu’à S24
Si ARN VHC -Poursuite jusqu’à
S48
diminution 2 Log ARN VHC -
Poursuite jusqu’à S48
Optimisation du Traitement en Optimisation du Traitement en Fonction de la Réponse VirologiqueFonction de la Réponse VirologiqueOptimisation du Traitement en Optimisation du Traitement en Fonction de la Réponse VirologiqueFonction de la Réponse Virologique
• Outils virologiques sensibles– Sensibilité : 10-15 UI/mL– Evaluation de la réponse au traitement
• Répondeurs virologiques rapides– Raccourcissement de la durée de traitement
• Répondeurs virologiques précoces partiels– Allongement de la durée de traitement
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Raccourcissement de la Durée de Traitement
RVR facteur prédictif de la RVSRVR facteur prédictif de la RVSRVR facteur prédictif de la RVSRVR facteur prédictif de la RVS
0
20
40
60
80
100
RVR
RVPc
RVPp
Génot
ype
1
Génot
ype
2
Génot
ype
3
Génot
ype
4
Fried et al., EASL 2008, Journal of Hepatology, 48(Suppl.2): S5
N= 1383 (Analyse rétrospective)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Importance de la RVRImportance de la RVRImportance de la RVRImportance de la RVR
• Analyse rétrospective de patients infectés par un VHC de génotype 1 traités pendant 48 semaines par pegIFN alfa-2a + RBV (N = 453)
ARN VHC PositifÀ S24
4 12 24
Semaine ARN négatif
91
66
45
2
Ferenci P, et al. J Hepatol. 2005;43:425-433.
20
40
60
80
100
RV
S (
%)
0
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Traitement Court : Génotype 1Traitement Court : Génotype 1Traitement Court : Génotype 1Traitement Court : Génotype 1
• Patients par un VHC de génotype 1
– ARN VHC < 600,000 IU/ml
– PegIFN-2b + ribavirine
– 24 semaines de traitement
– Comparaison des données obtenus avec les résultats de l’étude pivot (Mann et al., Lancet 2001)
Zeuzem et al., J Hepatol 2006;44:97-103.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Traitement Court : Génotype 1Traitement Court : Génotype 1Traitement Court : Génotype 1Traitement Court : Génotype 1
Zeuzem et al., J Hepatol 2006;44:97-103.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Week 4 Week 12 Week 24
24 weeks24 weeks
48 weeks48 weeks(Mann et al., (Mann et al., 2001)2001)
Time to first negative HCV RNA (< 50 IU/ml)Time to first negative HCV RNA (< 50 IU/ml)
% S
VR
% S
VR
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Jensen et al., Hepatology 2006;43:954-960
Traitement court : Génotype 1Traitement court : Génotype 1Traitement court : Génotype 1Traitement court : Génotype 1
0
20
40
60
80
100
% d
e R
VS
% d
e R
VS
Peg-IFN alpha 2a 180 µg/semaine + RBV 800 ou 1000-1200 mg/jPeg-IFN alpha 2a 180 µg/semaine + RBV 800 ou 1000-1200 mg/j
ARN VHC > 50 UI/mL à S4
24-DF24-DF
24-DS24-DS
48-DF48-DF
48-DS48-DS
73%
89% 88% 91%
ARN VHC < 50 UI/mL à S4
44%
23%35%
16%
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Shiffman et al., EASL 2006.
Etude ACCELERATE : Génotypes 2/3Etude ACCELERATE : Génotypes 2/3Etude ACCELERATE : Génotypes 2/3Etude ACCELERATE : Génotypes 2/3Stratégie diagnostique & suivi virologique
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Génotype 2 Génotype 3
16 semaines
24 semaines% R
VS
% R
VS
p=<0.0001p=<0.0001 p=0.1565p=0.1565
65%
82%
65%71%
Rapid virological responseRapid virological responseHCV RNA < 50 IU/ml at week 4HCV RNA < 50 IU/ml at week 4
No rapid virological responseNo rapid virological responseHCV RNA ≥ 50 IU/ml at week 4HCV RNA ≥ 50 IU/ml at week 4
Etude ACCELERATE : Génotypes 2/3Etude ACCELERATE : Génotypes 2/3Etude ACCELERATE : Génotypes 2/3Etude ACCELERATE : Génotypes 2/3Stratégie diagnostique & suivi virologique
Shiffman et al., EASL 2006.
0102030405060708090
100
16 semaines
24 semaines
0102030405060708090
100
82%90%
27%
49%
SVR rate SVR rate
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
14 weeks14 weeks
24 weeks24 weeks
% S
usta
ined
vir
olo
gic
al re
sp
on
se
% S
usta
ined
vir
olo
gic
al re
sp
on
se
Dalgard et al., Hepatology 2008;47:35-42
RVR (HCV RNA < 50 IU/ml at week 4)
93%84%
Genotype 2 Genotype 3
92%97%
Traitement court : Génotypes 2/3Traitement court : Génotypes 2/3Traitement court : Génotypes 2/3Traitement court : Génotypes 2/3
Stratégie diagnostique & suivi virologique
PegIFN-2b
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
12 weeks12 weeks
24 weeks24 weeks
% S
usta
ined
vir
olo
gic
al re
sp
on
se
% S
usta
ined
vir
olo
gic
al re
sp
on
se
(Lagging et al., Hepatology 2008;47:1837-45)
71%71%
91%91%
RVR
62%62%
41%41%
n = 120n = 120n = 111n = 111 n = 68n = 68n = 71n = 71
No RVR
PegIFN-2a
Traitement court : Génotypes 2/3Traitement court : Génotypes 2/3Traitement court : Génotypes 2/3Traitement court : Génotypes 2/3
Stratégie diagnostique & suivi virologique
• Durée de traitement de 6 mois chez tous les patients avec une RVR indépendamment du génotype
• Raccourcissement de la durée de traitement à 12 ou 16 semaines chez les patients infectés par une génotype 2/3 avec un ARN indétectable à S1 ou S2 (?)
RésuméRésuméRésuméRésuméStratégie diagnostique & suivi virologique
Allongement de la Durée de Traitement
Traitement Long : Génotypes 2/3Traitement Long : Génotypes 2/3Traitement Long : Génotypes 2/3Traitement Long : Génotypes 2/3
• Older age
• Male gender
• High BMI
• Fibrosis ≥ F3
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Génotype 1 : Traitement LongGénotype 1 : Traitement LongGénotype 1 : Traitement LongGénotype 1 : Traitement Long
010
20
30
40
50
60
70
80
90
100
48 weeks(n=230)
72 weeks(n=225)
53% 54%% S
VR
Berg et al., Gastroenterology 2006;130:1086-97
Stratégie diagnostique & suivi virologique
0
20
40
60
80
100
% d
e R
VP
NSNS NSNS
NSNS
p=0.04p=0.04
S 4 S 12 S 4 S 12
ARN VHC < 50 UI/mlARN VHC < 50 UI/ml ARN VHC ≥ 50 UI/mlARN VHC ≥ 50 UI/ml
Berg et al., Gastroenterology 2006;130:1086-97
48 semaines
72 semaines
Génotype 1 : Traitement LongGénotype 1 : Traitement LongGénotype 1 : Traitement LongGénotype 1 : Traitement LongStratégie diagnostique & suivi virologique
RésuméRésuméRésuméRésuméStratégie diagnostique & suivi virologique
• Allongement de la durée de traitement à 72 semaines améliore la RVS :
– Chez les patients avec une RVP partielle
– Chez les non-répondeurs à un premier traitement par une bi-thétrapie standard qui sont retraités
HEPATITE C : Résistance HEPATITE C : Résistance
aux Traitementsaux TraitementsHEPATITE C : Résistance HEPATITE C : Résistance
aux Traitementsaux Traitements
• Définition– Propriétés intrinsèques des souches
virales qui s’opposent à l’action antivirale des effecteurs ou à des médicaments antiviraux
Résistance aux traitements
Résistance ViraleRésistance ViraleRésistance ViraleRésistance Virale
• Résistance du VHC à la thérapie par l’interféron
• Résistance du VHC à la ribavirine
• Résistance du VHC aux inhibiteurs spécifiques
Résistance aux traitements
Résistance du VHCRésistance du VHCRésistance du VHCRésistance du VHC
• Résistance du VHC à la thérapie par l’interféron
• Résistance du VHC à la ribavirine
• Résistance du VHC aux inhibiteurs spécifiques
Résistance aux traitements
Résistance du VHCRésistance du VHCRésistance du VHCRésistance du VHC
PEG-IFN- 2a + ribavirine (Fried et al., 2002)
PEG-IFN- 2b + ribavirine(Manns et al., 2001)
Manns et al., Lancet 2001;358:958-65 ; Fried et al., N Engl J Med 2002;347:975-82; Hadziyannis et al., Ann Intern Med 2004;140:346-55.
PEG-IFN- 2a + ribavirine (Hadziyannis et al., 2004)
Génotype 1 Génotypes 2, 3
54%54%
24%24%
58%58%
48%48%
18%18%16%16%
Résistance aux traitements
Taux d’EchecsTaux d’EchecsTaux d’EchecsTaux d’Echecs
FacteursFacteursVirauxViraux
CaractéristiquesCaractéristiquesde la maladiede la maladie
FacteursFacteursd’Hôted’HôteTraitementTraitement
ECHECS DU TRAITEMENTECHECS DU TRAITEMENT
Cinétique Virale sous TraitementCinétique Virale sous TraitementCinétique Virale sous TraitementCinétique Virale sous Traitement
2nde phase
7 14 T(n)
Cutoff
1ère phase
1
0 1 2 3
2
3
4
5
6
7
Jours
Neumann et al., Science 1998;282:103-7.
Résistance aux traitements
0
1
2
3
4
5
6
7
0 4 7 8 15 22 291-7-28
Cut-off tests qualitatifs
Cut-off tests quantitatifs
Génotype 4
Génotype 1
Génotype 3
AR
N d
u V
HC
(L
og
10 U
I/mL
)
Jours
7
Résistance IntrinsèqueRésistance IntrinsèqueRésistance IntrinsèqueRésistance IntrinsèqueRésistance aux traitements
Pawlotsky et al., manuscript en preparation.
0
1
2
3
4
5
6
7
0 4 7 8 15 22 291-7-28
Cut-off tests qualitatifs
Cut-off tests quantitatifs
Génotype 4
Génotype 1
Génotype 3
AR
N d
u V
HC
(L
og
10 U
I/mL
)
Jours
7
Résistance IntrinsèqueRésistance IntrinsèqueRésistance IntrinsèqueRésistance IntrinsèqueRésistance aux traitements
Pawlotsky et al., manuscript en preparation.
0
1
2
3
4
5
6
7
0 4 7 8 15 22 291-7-28
Cut-off tests qualitatifs
Cut-off tests quantitatifs
Génotype 4
Génotype 1
Génotype 3
AR
N d
u V
HC
(L
og
10 U
I/mL
)
Jours
7
Résistance IntrinsèqueRésistance IntrinsèqueRésistance IntrinsèqueRésistance IntrinsèqueRésistance aux traitements
Pawlotsky et al., manuscript en preparation.
Viral FactorsViral Factors
Antiviral Antiviral resistanceresistance
DelayedDelayedclearanceclearance
LongerLongerhalf-life ofhalf-life of
infected cellsinfected cells
– Motif nucléotidique responsable de cette différence de sensibilité ?
– Pas de sélection de mutations de résistance, même si modification de la composition de la quasi-espèce virale
RésuméRésuméRésuméRésuméRésistance aux traitements
• Résistance du VHC à la thérapie par l’interféron
• Résistance du VHC à la ribavirine
• Résistance du VHC aux inhibiteurs spécifiques
Résistance aux traitements
Résistance du VHCRésistance du VHCRésistance du VHCRésistance du VHC
Mécanismes d’Action Mécanismes d’Action Hypothétiques de la RBVHypothétiques de la RBVMécanismes d’Action Mécanismes d’Action Hypothétiques de la RBVHypothétiques de la RBV
Adapted from Lau et al., Hepatology 2002; 35: 1002-9.
RibavirineRibavirine
RibavirineRibavirine
Transporteur
RMP RDP RTP
GMP
GTP
IMPDHIMP
RdRp
Réplication
HCV RNA
Hépatocyte
(2) Inhibition de la RdRp VHC(1) Inhibition de l’IMPDH
HCV RNA "Catastrophe
(3) Effet mutagène
erreur”
CTLTh1 IFN-, TNF-
(4) Effets immunomodulateurs
Résistance aux traitements
Pawlotsky et al., Gastroenterology 2004;126:703-14
-1.0-1.0
-0.5-0.5
0.00.0
0.50.5
00 22 44 66 88 1010 1212 1414 1616 1818 2020 2222 2424 2626 2828
Mean HCV RNA decrease (log IU/ml)Mean HCV RNA decrease (log IU/ml)
Time (days)Time (days)
ControlsControls
RibavirinRibavirinmonotherapymonotherapy
Résistance aux traitements
Effet Antiviral de la RBVEffet Antiviral de la RBVEffet Antiviral de la RBVEffet Antiviral de la RBV
00
1100
2200
3300
4400
5500
SemainesSemaines
**
**
**
**
**
* p<0.05* p<0.05
2424 72726060525248483030 3636
RBV jusqu’à S52RBV jusqu’à S52
Arrêt RBV à S24Arrêt RBV à S24
Bronowicki et al., Gastroenterology 2006
Po
urc
enta
ge
de
Rec
hu
tes
(HC
V R
NA
+)
Po
urc
enta
ge
de
Rec
hu
tes
(HC
V R
NA
+)
Suivi post-thérapeutiqueSuivi post-thérapeutique
Prévention de la RechutePrévention de la RechutePrévention de la RechutePrévention de la RechuteRésistance aux traitements
Prévention de la Rechute Prévention de la Rechute (PROVE-2)(PROVE-2)Prévention de la Rechute Prévention de la Rechute (PROVE-2)(PROVE-2)
Résistance aux traitements
Hézode et al., en révision favorable.
T12/PR12
n/N=
T12/P12(Sans RBV)
48
22/460
10
20
40
50
Ta
ux
de
re
ch
ute
s (
%)
30
T12/PR24
14
8/57 19/63
30
PR48(Contrôle)
22
10/45
• Ribavirin mechanisms of action in chronic hepatitis C remain unknown
• Ribavirin direct antiviral effect is modest and transient
• Long-term ribavirin administration does not select for specific resistance substitutions
RésuméRésuméRésuméRésuméRésistance aux traitements
• Résistance du VHC à la thérapie par l’interféron
• Résistance du VHC à la ribavirine
• Résistance du VHC aux inhibiteurs spécifiques
Résistance aux traitements
Résistance du VHCRésistance du VHCRésistance du VHCRésistance du VHC
Cibles Cibles Potentielles des Potentielles des Inhibiteurs Inhibiteurs SpécifiquesSpécifiques
Cibles Cibles Potentielles des Potentielles des Inhibiteurs Inhibiteurs SpécifiquesSpécifiques
De Clercq., Nature Review Drug Discovery, 2007; 6: 1001-18
1. Attachement viral, fusion, décapsidation
2. Traduction de l’ARN viral
3. Maturation de la polyprotéine
4. Réplication du génome viral
5. Maturation de la particule virale
Résistance aux traitements
Viral entry inhibitorsViral entry inhibitorsHepatitis C immunoglobulin HCIg)Hepatitis C immunoglobulin HCIg)HCV-Ab 68 and Ab 65 (monoclonal Ab)HCV-Ab 68 and Ab 65 (monoclonal Ab)
HCV RNA translation inhibitorsHCV RNA translation inhibitors ISIS 14803 (antisense) ISIS 14803 (antisense) AVI – 4065 (antisense) AVI – 4065 (antisense) Heptazyme (ribozyme)Heptazyme (ribozyme)VGX-410C (small molecule IRES inhibitor)VGX-410C (small molecule IRES inhibitor)TT 033 (siRNA) TT 033 (siRNA)
Posttranslational processing inhibitorsPosttranslational processing inhibitors NS3-4A serine proteinase inhibitorsNS3-4A serine proteinase inhibitors
BILN 2061BILN 2061ITMN 191ITMN 191VX-950 VX-950 SCH 503034SCH 503034ACH-806/GS-9132ACH-806/GS-9132
HCV replication inhibitorsHCV replication inhibitors NS5B polymerase inhibitorsNS5B polymerase inhibitors
MK-0608MK-0608HCV-796HCV-796R1626R1626JTK-003JTK-003NM-283NM-283XTL 2125XTL 2125
Cyclophilin B inhibitorsCyclophilin B inhibitorsDEBIO-025DEBIO-025NIM 811NIM 811
NS5A inhibitorsNS5A inhibitorsA-831, A-689A-831, A-689
Helicase inhibitorsHelicase inhibitors QU663 QU663 Recombinant Ab fragmentsRecombinant Ab fragments
Virus assembly and release inhibitorsVirus assembly and release inhibitorsUT-231B (iminosugar-glucosidase inhibitor)UT-231B (iminosugar-glucosidase inhibitor)Celgosivir (glucosidase inhibitor) Celgosivir (glucosidase inhibitor)
Phase of DevelopmentPhase of Development
**
**
**
**
PreclinicalPreclinical II IIII IIIIII IVIV
**
**
**
Pawlotsky JM, Chevaliez S, McHutchison JG, Gastroenterology 2007;132:1979-98.
Résistance aux traitements
Molécules en DéveloppementMolécules en DéveloppementMolécules en DéveloppementMolécules en Développement
sensible
résistant
sensible
résistant
Inhibiteur
résistant
sensible
Résistance aux traitements
Mécanismes de la RésistanceMécanismes de la RésistanceMécanismes de la RésistanceMécanismes de la Résistance
Arrêt inhibiteur
sensible
résistant
Inhibiteur
résistant
sensible
Résistance aux traitements
Mécanismes de la RésistanceMécanismes de la RésistanceMécanismes de la RésistanceMécanismes de la Résistance
sensiblesensible
résistant + fitrésistant + fit
Arrêt inhibiteur
sensible
résistant
Inhibiteur
résistant
sensible
Résistance aux traitements
Mécanismes de la RésistanceMécanismes de la RésistanceMécanismes de la RésistanceMécanismes de la Résistance
résistant trés fitrésistant trés fit
sensiblesensible
Arrêt inhibiteur
De Clercq., Nature Review Drug Discovery, 2007; 6: 1001-18
Inhibiteurs en Inhibiteurs en DéveloppementDéveloppementInhibiteurs en Inhibiteurs en DéveloppementDéveloppement
Résistance aux traitements
• Inhibiteurs de la maturation de la polyprotéine– Anti-protéase NS3
• Telaprevir (VX-950)• Boceprevir (SCH503039)• ITMN-191
• Inhibiteurs de la réplication Virale– Analogues nucléosidiques : R1626, R7128– Analogues non nucléosidiques : GS9190
Résistance aux traitements
Inhibiteurs en DéveloppementInhibiteurs en DéveloppementInhibiteurs en DéveloppementInhibiteurs en Développement
• Inhibiteurs de la maturation de la polyprotéine– Anti-protéase NS3
• Telaprevir (VX-950)• Boceprevir (SCH503039)• ITMN-191
• Inhibiteurs de la réplication Virale– Analogues nucléosidiques : R1626, R7128– Analogues non nucléosidiques : GS9190
Résistance aux traitements
Inhibiteurs en DéveloppementInhibiteurs en DéveloppementInhibiteurs en DéveloppementInhibiteurs en Développement
Telaprevir (VX-950)
Boceprevir (SCH 503034)
ITMN 191
Protéines Structurales Protéines Non-Structurales
IRES
5’NTR 3’NTR
C E1 E2 NS2 NS3 NS5A NS5B
NS4B
p 7
NS4A
Résistance aux traitements
Inhibiteurs de la Maturation Inhibiteurs de la Maturation de la Polyprotéinede la PolyprotéineInhibiteurs de la Maturation Inhibiteurs de la Maturation de la Polyprotéinede la Polyprotéine
Résistance aux traitements
Mutations de Résistance aux Mutations de Résistance aux Inhibiteurs de NS3/4AInhibiteurs de NS3/4AMutations de Résistance aux Mutations de Résistance aux Inhibiteurs de NS3/4AInhibiteurs de NS3/4A
Compounds
Ciluprevir (BILN 2061)
Telaprevir (VX-950)
Boceprevir (SCH 503034)
ITMN-191
TMC435350
In vitro
A156V/T, D168V/A/Y, R155Q
A156V/T
A156S/T, V170A, T54A
A156V/T, D168V/A, R155K/Q
?
In vivo
No data
A156S/V/T, R155K/T, T54A, V36A/M
T54A
No data
No data
Résistance aux traitements
Mutations de Résistance aux Mutations de Résistance aux Inhibiteurs de NS3/4AInhibiteurs de NS3/4AMutations de Résistance aux Mutations de Résistance aux Inhibiteurs de NS3/4AInhibiteurs de NS3/4A
Compounds
Ciluprevir (BILN 2061)
Telaprevir (VX-950)
Boceprevir (SCH 503034)
ITMN-191
TMC435350
In vitro
A156V/T, D168V/A/Y, R155Q
A156V/T
A156S/T, V170A, T54A
A156V/T, D168V/A, R155K/Q
?
In vivo
No data
A156S/V/T, R155K/T, T54A, V36A/M
T54A
No data
No data
Résistance aux traitements
Mutations de Résistance aux Mutations de Résistance aux Inhibiteurs de NS3/4AInhibiteurs de NS3/4AMutations de Résistance aux Mutations de Résistance aux Inhibiteurs de NS3/4AInhibiteurs de NS3/4A
Compounds
Ciluprevir (BILN 2061)
Telaprevir (VX-950)
Boceprevir (SCH 503034)
ITMN-191
TMC435350
In vitro
A156V/T, D168V/A/Y, R155Q
A156V/T
A156S/T, V170A, T54A
A156V/T, D168V/A, R155K/Q
?
In vivo
No data
A156S/V/T, R155K/T, T54A, V36A/M
T54A
No data
No data
Résistance aux traitements
Mutations de Résistance aux Mutations de Résistance aux Inhibiteurs de NS3/4AInhibiteurs de NS3/4AMutations de Résistance aux Mutations de Résistance aux Inhibiteurs de NS3/4AInhibiteurs de NS3/4A
Compounds
Ciluprevir (BILN 2061)
Telaprevir (VX-950)
Boceprevir (SCH 503034)
ITMN-191
TMC435350
In vitro
A156V/T, D168V/A/Y, R155Q
A156V/T
A156S/T, V170A, T54A
A156V/T, D168V/A, R155K/Q
?
In vivo
No data
A156S/V/T, R155K/T, T54A, V36A/M
T54A
No data
No data
• A highly selective, reversible peptidomimetic inhibitor of the HCV NS3-4A serine protease
• IC50 of the order of 0.5 µM in vitro
• HCV RNA level reduction of 3-4 Log10 in vivo
Lin et al., AAC 2006, 50(5): 1813-1822; Zhou et al., Antimicrob Agents and Chemother 2008, 52(1): 110-120.
Résistance aux traitements
Telaprevir (VX-950)Telaprevir (VX-950)Telaprevir (VX-950)Telaprevir (VX-950)
Welsch et al., Genome Biology 2008, 9(1): R16.1-R16.18.
Telaprevir
Reesink et al., Gastroenterology 2006, 131: 997-1002.
HC
V R
NA
ch
ang
e fr
om
b
asel
ine
(Lo
g10
IU/m
L)
Days
-5-5
-4-4
-3-3
-2-2
-1-1
00
11
00 11 22 33 44 55 66 77 88 99 1010 1111 1212 1313 1414
Baseline Baseline
Placebo (n=6)Placebo (n=6)
VX-950 750mg q8h VX-950 750mg q8h (n=8)(n=8)
-4.41-4.41
-0.21-0.21
Résistance aux traitements
Antiviral Effect of TVR Monotherapy Antiviral Effect of TVR Monotherapy (Phase Ib)(Phase Ib)Antiviral Effect of TVR Monotherapy Antiviral Effect of TVR Monotherapy (Phase Ib)(Phase Ib)
Reesink et al., Gastroenterology 2006, 131: 997-1002.
-5-5
-4-4
-3-3
-2-2
-1-1
00
11
00 11 22 33 44 55 66 77 88 99 1010 1111 1212 1313 1414
Baseline Baseline
Placebo (n=6)Placebo (n=6)
VX-950 450mg q8h VX-950 450mg q8h (n=10)(n=10)
VX-950 1250mg q12h VX-950 1250mg q12h (n=10)(n=10)
VX-950 750mg q8h VX-950 750mg q8h (n=8)(n=8)
-4.41-4.41
-0.21-0.21
-2.21-2.21
-2.37-2.37
HC
V R
NA
ch
ang
e fr
om
b
asel
ine
(Lo
g10
IU/m
L)
Days
Résistance aux traitements
Antiviral Effect of TVR Monotherapy Antiviral Effect of TVR Monotherapy (Phase Ib)(Phase Ib)Antiviral Effect of TVR Monotherapy Antiviral Effect of TVR Monotherapy (Phase Ib)(Phase Ib)
T54
R155
A156 V36
Amino Acid Substitutions Associated Amino Acid Substitutions Associated with Telaprevir Resistancewith Telaprevir ResistanceAmino Acid Substitutions Associated Amino Acid Substitutions Associated with Telaprevir Resistancewith Telaprevir Resistance
Sarrazin et al., Gastroenterlogy 2007, 132: 1767-1777.
466 7811 3.5 9 12 71
36/156A156V/T36/155T54AR155K/TV36M/AWT
Résistance aux traitements
PROVE-2 TrialPROVE-2 TrialPROVE-2 TrialPROVE-2 Trial
Weeks
480 2412
Placebo + Peg-IFNPlacebo + Peg-IFN2a + Ribavirin (RBV)2a + Ribavirin (RBV)
VX-950 750 mg q8h + Peg-IFN2a
+ RBV
VX-950 750 mg q8h + Peg-IFN2a
VX-950 750 mg q8h + Peg-IFN2a
+ RBV
Peg-IFNPeg-IFN2a + RBV2a + RBV Follow-upFollow-up
Follow-upFollow-up
Follow-upFollow-up
PR48
T12/PR24
T12/PR12
T12/P12
Follow-upFollow-up
72
Zeuzem et al., AASLD 2008, Abstract 243.
Résistance aux traitements
Zeuzem et al., AASLD 2008, Abstract 243.
80
T12/PR12
69
T12/PR24
Wk4
T12/P12 (No RBV)
13
PR48(Control)
50
0
20
40
60
80
100
Pa
tie
nts
Wit
h U
nd
ete
cta
ble
H
CV
RN
A (
%)
Wk4 Wk4 Wk4Wk12
43
62
Wk12
80
Wk12
73
Wk12
46
SVR
36
SVR
60
SVR
69
SVR
11/82 39/7835/82 38/82 66/8248/78 28/78 66/82 49/82 56/81 59/81 56/81
PROVE-2: RVR, EVR, SVRPROVE-2: RVR, EVR, SVRPROVE-2: RVR, EVR, SVRPROVE-2: RVR, EVR, SVR
Résistance aux traitements
Relapse RateRelapse RateRelapse RateRelapse Rate
Zeuzem et al., AASLD 2008, Abstract 243.
T12/PR12 and T12/PR24 Combined
3
0
10
20
30
5/163
Pat
ien
ts W
ith
Vir
olo
gic
B
reak
thro
ug
h b
y W
eek
12 (
%)
0
10
20
30
19/78
T12/P12(No RBV)
24
19/78P
atie
nts
Wit
h V
iro
log
ic
Bre
akth
rou
gh
by
Wee
k 12
(%
)
Résistance aux traitements
Patients Receiving Telaprevir Patients Receiving Telaprevir and Peg-IFN2a without RBVand Peg-IFN2a without RBVPatients Receiving Telaprevir Patients Receiving Telaprevir and Peg-IFN2a without RBVand Peg-IFN2a without RBV
• Among the 6 patients who received the combination of telaprevir and Peg-IFN2a without RBV
– 3 subtype 1a patients remained HCV RNA positive on treatment
– 3 patients became HCV RNA undetectable upon therapy and relapsed after treatment
• 2 infected with subtype 1b• 1 infected with subtype 1a
Résistance aux traitements
Chevaliez et al., IASL 2008.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Patient 1: subtype 1aPatient 1: subtype 1a
HC
V R
NA
(L
og
10 I
U/m
L)
0
1
2
3
4
5
6
7
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
Patient 2: subtype 1aPatient 2: subtype 1a
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72
Patient 3: subtype 1aPatient 3: subtype 1a
HC
V R
NA
(L
og
10 I
U/m
L)
Patient 4: subtype 1bPatient 4: subtype 1b Patient 5: subtype 1aPatient 5: subtype 1a Patient 6: subtype 1bPatient 6: subtype 1b
NON-RESPONDERSNON-RESPONDERS
RELAPSERSRELAPSERS
Weeks
WeeksTVR + Peg-IFN2a for 12 weeks
SOC
SOC
0
1
2
3
4
5
6
7
0 9 18 27 36 45 54 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Viral KineticsViral KineticsViral KineticsViral KineticsRésistance aux traitements
0
1
2
3
4
5
6
7
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
HC
V R
NA
(L
og
1 0 IU
/mL
)
Weeks
WT
AB C D
E F
R155K/NV36L/MWT
A40TV36L/M + A40TR155K/N + A40TV36L/M + R155K/NV36L/M + R155K/N + A40T
Patient 2
TVR-Peg-IFN
Quasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisQuasispecies Analysis
Chevaliez et al., IASL 2008.
Résistance aux traitements
0
1
2
3
4
5
6
7
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
HC
V R
NA
(L
og
1 0 IU
/mL
)
Weeks
WT
AB C D
E F
AA
R155K/NV36L/MWT
A40TV36L/M + A40TR155K/N + A40TV36L/M + R155K/NV36L/M + R155K/N + A40T
Patient 2
TVR-Peg-IFN
Quasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisRésistance aux traitements
0
1
2
3
4
5
6
7
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
HC
V R
NA
(L
og
1 0 IU
/mL
)
Weeks
WT
AB C D
E F
AA BB
R155K/NV36L/MWT
A40TV36L/M + A40TR155K/N + A40TV36L/M + R155K/NV36L/M + R155K/N + A40T
Patient 2
TVR-Peg-IFN
Quasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisRésistance aux traitements
0
1
2
3
4
5
6
7
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
HC
V R
NA
(L
og
1 0 IU
/mL
)
Weeks
WT
AB C D
E F
AA BB CC
DD EER155K/NV36L/MWT
A40TV36L/M + A40TR155K/N + A40TV36L/M + R155K/NV36L/M + R155K/N + A40T
Patient 2
TVR-Peg-IFN
Quasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisRésistance aux traitements
HC
V R
NA
(L
og
1 0 IU
/mL
)
Weeks
WT
AB
C
D
E
R155K/E + T42SWT
0
1
2
3
4
5
6
7
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72
A BWT
C E
Patient 3
TVR-Peg-IFN
SOC
Quasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisRésistance aux traitements
HC
V R
NA
(L
og
1 0 IU
/mL
)
Weeks
WT
AB
C
D
E
R155K/E + T42SWT
0
1
2
3
4
5
6
7
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72
A BWT
C E
Patient 3
TVR-Peg-IFN
SOC
Quasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisRésistance aux traitements
HC
V R
NA
(L
og
1 0 IU
/mL
)
Weeks
WT
AB
C
D
E
R155K/E + T42SWT
0
1
2
3
4
5
6
7
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72
A BWT
C D E
Patient 3
TVR-Peg-IFN
SOC
Quasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisRésistance aux traitements
Pt 1Pt 1 Pt 2Pt 2 Pt 3Pt 3 Pt 4Pt 4 Pt 5Pt 5 Pt 6Pt 6
R26KR26K
V36L/MV36L/M V36AV36A
T42ST42S
A40TA40T A40TA40T
T54ST54S T54ST54S T54AT54A
Y56FY56F
T91AT91A
R155KR155K R155KR155K R155K/ER155K/E R155T/AR155T/A
G174SG174S
Observed Amino Acid ChangesObserved Amino Acid ChangesObserved Amino Acid ChangesObserved Amino Acid ChangesRésistance aux traitements
Location of the Amino Acid ChangesLocation of the Amino Acid ChangesLocation of the Amino Acid ChangesLocation of the Amino Acid ChangesRésistance aux traitements
Location of the Amino Acid ChangesLocation of the Amino Acid ChangesLocation of the Amino Acid ChangesLocation of the Amino Acid ChangesRésistance aux traitements
• Among the 9 patients who received the triple combination of telaprevir, Peg-IFN2a and RBV
– 7 patients achieved an SVR
– 1 patient relapsed
– 1 subtype 1b patient stopped antiviral treatment at 6 weeks when HCV RNA was undetectable and relapsed thereafter
Patients Receiving the Triple Patients Receiving the Triple CombinationCombinationPatients Receiving the Triple Patients Receiving the Triple CombinationCombination
Résistance aux traitements
0
1
2
3
4
5
6
7
0 9 18 27 36 45 54 63 72 81
HC
V R
NA
(L
og
1 0 IU
/mL
)
Weeks
Patient 8
WT
L14FWT
L14F + V36C
AB C
AA BB
CCV36C
*
*TVR + Peg-IFN + RBV for 6 weeks
Quasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisQuasispecies AnalysisRésistance aux traitements
Cys36
D81
S139
H57
F43 C36
Val36D81
S139
H57
F43 V36
3D Structure of the V36 Mutations3D Structure of the V36 Mutations3D Structure of the V36 Mutations3D Structure of the V36 MutationsRésistance aux traitements
V36 Variants
N (%)Fold-
change in IC50
Relative replication capacity in Huh7.5 cells (%)
WT 1.0 100
V36M 24 (10%) 7.7 77 ± 12
V36A 10 (4.1%) 8.2 104 ± 26
V36L 3 (1.2%) 2.5 ND
V36G 1 (0.4%) 12.3 59 ± 8
V36C 1 (0.4%) 8.6 98 ± 9
V36 Variant ResistanceV36 Variant ResistanceRésistance aux traitements
V36 Variants
N (%)Fold-
change in IC50
Relative replication capacity in Huh7.5 cells (%)
WT 1.0 100
V36M 24 (10%) 7.7 77 ± 12
V36A 10 (4.1%) 8.2 104 ± 26
V36L 3 (1.2%) 2.5 ND
V36G 1 (0.4%) 12.3 59 ± 8
V36C 1 (0.4%) 8.6 98 ± 9
V36 Variant ResistanceV36 Variant ResistanceRésistance aux traitements
V36 Variants
N (%)Fold-
change in IC50
Relative replication capacity in Huh7.5 cells (%)
WT 1.0 100
V36M 24 (10%) 7.7 77 ± 12
V36A 10 (4.1%) 8.2 104 ± 26
V36L 3 (1.2%) 2.5 ND
V36G 1 (0.4%) 12.3 59 ± 8
V36C 1 (0.4%) 8.6 98 ± 9
V36 Variant ResistanceV36 Variant ResistanceRésistance aux traitements
Per
cen
tag
e o
f P
rote
oly
tic
Act
ivit
y
1005 10
50
100 FRET Technology
Telaprevir (µM)
WT
V36CV36M
V36L V36
Variants
IC50 VX-950 (S.E.)
(µM) Fold-change
WT 0.6 (0,2) 1
V36L 1.3 (0.1) 2
V36C 2.4 (1.3) 4
V36M 3.05 (3.85) 5
V36 Variant ResistanceV36 Variant ResistanceRésistance aux traitements
• Inhibiteurs de la maturation de la polyprotéine– Anti-protéase NS3
• Telaprevir (VX-950)• Boceprevir (SCH503039)• ITMN-191
• Inhibiteurs de la réplication Virale– Analogues nucléosidiques : R1626, R7128– Analogues non nucléosidiques : GS9190
Résistance aux traitements
Inhibiteurs en DéveloppementInhibiteurs en DéveloppementInhibiteurs en DéveloppementInhibiteurs en Développement
Copyright © 2006 Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, New Jersey, USA
AA
NNI site A (Thumb/fingertips)Indoles
Benzimidazoles
NNI site B (Thumb)Phe derivatives
Thiophene-COOHDihydroxypirones
Pyranoindoles (HCV371)
BB
NNI site C (Palm)Benzothiadiazine (A-848837)
Acyl-pyrrolidineProline sulfonamide
Acrylic acid derivatives
Active SiteActive Site
Allosteric GTP
CC
2’-methyl nucleosides (NM283, MK608)4’ azido-cytidine (R1626)
NNI site D (R200 hinge)Benzofurans (HCV086, HCV796)
AA
BBCC
DD
Copyright © 2006 Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, New Jersey, USA
AA
NNI site A (Thumb/fingertips)Indoles
BenzimidazolesPro 495, Pro 496, Val 499Pro 495, Pro 496, Val 499
NNI site A (Thumb/fingertips)Indoles
BenzimidazolesPro 495, Pro 496, Val 499Pro 495, Pro 496, Val 499
NNI site B (Thumb)Phe derivatives
Thiophene-COOHDihydroxypirones
Pyranoindoles (HCV371)Met 423Met 423
BB
NNI site C (Palm)Benzothiadiazine (A-848837)
Acyl-pyrrolidineProline sulfonamide
Acrylic acid derivativesAsn 411, Met 414, Tyr 448Asn 411, Met 414, Tyr 448
Active SiteActive Site
Allosteric GTP
CC
2’-methyl nucleosides (NM283, MK608)4’ azido-cytidine (R1626)
NNI site D (R200 hinge)Benzofurans (HCV086, HCV796)
Cys 316, Val 201Cys 316, Val 201
AA
BBCC
DD
Placebo
500 mg bid
1500 mg bid
3000 mg bid
4500 mg bid
Traitement Suivi
Jours
0 5 10 15 20 25 30
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
-2.6 log10
-3.7 log10
-1.2 log10
Réd
uct
ion
de
l’AR
N d
u V
HC
(Lo
g U
I/mL
)R1626 : Phase IbR1626 : Phase IbR1626 : Phase IbR1626 : Phase IbRésistance aux traitements
R7128 : Phase IIR7128 : Phase IIR7128 : Phase IIR7128 : Phase II
Jours
0 5 10 15 20 25 30--6
-5
-4
-3
-2
-1
0 PegIFN + RBV + placeboPegIFN + RBV + R7128 500 mg bidPegIFN + RBV + R7128 1500 mg bid
Réd
uct
ion
AR
N V
HC
(L
og
10)
Lalezari et al., EASL 2008.
Résistance aux traitements
MK 7009monotherapy
0
1
2
3
4
5
6
0 50 90 130 170 210 250
Day
log
IU/m
L
LOQLOQ
MK 7009+ MK-608 Chimp AChimp A
Chimp BChimp B
Chimp CChimp C
SVR
Olsen et al., APASL 2008
Combinaison de MK-7009 et Combinaison de MK-7009 et MK-608MK-608Combinaison de MK-7009 et Combinaison de MK-7009 et MK-608MK-608
Résistance aux traitements
Prévention de la RésistancePrévention de la Résistance
• Réduire au maximum la réplication virale
• Augmenter la barrière pharmacologique
• Utiliser des molécules avec une barrière
génétique élevée
• Compliance
Résistance aux traitements