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Charakterisierung der Interaktionen von SNARE-
Proteinen mit dem vakuolären HOPS Tethering-
Komplex bei der Fusion von Vakuolen
Dissertation zur Erlangung des Grades
Doktor der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
Vorgelegt dem Fachbereich Biologie/Chemie der
Universität Osnabrück
von
Dipl. Biotech. Lukas Krämer
aus Siegen
Osnabrück, Juni 2011
Hauptberichterstatter: Prof. Dr. Christian Ungermann
Berichterstatter: apl. Prof. Dr. Siegfried Engelbrecht-Vandré
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbstständig und ohne fremde Hilfe verfasst
und keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe. Außerdem
versichere ich, dass die Arbeit noch nicht veröffentlicht oder in einem anderen
Prüfungsverfahren als Prüfungsleistung vorgelegt worden ist.
Osnabrück, den _________________________________
Lukas Krämer
So eine Arbeit wird eigentlich nie fertig,
man muss sie für fertig erklären,
wenn man nach Zeit und Umständen
das mögliche getan hat.
(Johann Wolfgang von Goethe)
I
Inhaltsverzeichnis
Publikationen.......................................................................................................IV
Zusammenfassung ................................................................................................. V
Summary.............................................................................................................. VII
1 Einleitung........................................................................................................... 1
1.1 Organellen des Endomembransystems.......................................................................................1 1.1.1 Das endoplasmatische Retikulum (ER) ..................................................................................2 1.1.2 Der Golgi-Apparat (Golgi) ......................................................................................................2 1.1.3 Die endosomalen Kompartimente...........................................................................................3 1.1.4 Das vakuoläre Kompartiment..................................................................................................4
1.2 Transportwege zur Vakuole .........................................................................................................5 1.3 Transport und Fusion intrazellulärer Vesikel...........................................................................6
1.3.1 Das Abschnüren und der Transport von Vesikeln .................................................................6 1.3.2 Fusion mit der Akzeptormembran ..........................................................................................7
1.4 SNARE-Proteine ............................................................................................................................8 1.4.1 Struktur von SNARE-Proteinen ..............................................................................................9 1.4.2 Funktion von SNARE-Proteinen ......................................................................................... 12
1.5 Rab-GTPase ................................................................................................................................. 13 1.6 SM-Proteine und Tethering-Faktoren...................................................................................... 14
1.6.1 Sec1/Munc18 (SM)-Proteine................................................................................................ 14 1.6.2 Coiled-coil Tethers und Multisubunit Tethering-Komplexe .............................................. 16
1.7 Homotypische Vakuolenfusion in vitro .................................................................................... 19
2 Aufgabenstellung ............................................................................................. 20
3 Ergebnisse ........................................................................................................ 21
3.1 Assemblierung von SNARE-Proteinen .................................................................................... 21 3.2 Die Wechselwirkung von SNARE-Proteinen mit dem HOPS-Komplex ............................ 22
3.2.1 Der HOPS-Komplex bindet die PX-Domäne von Vam7 ................................................... 24 3.2.2 Der HOPS-Komplex bindet assemblierte Q-SNAREs ....................................................... 26 3.2.3 Wechselwirkung mit HOPS-Untereinheiten ....................................................................... 28
3.3 Funktionelle Analysen zur HOPS-SNARE Wechselwirkung .............................................. 30 3.3.1 Der Einfluss des N-Terminus von Vam3 und Vam7.......................................................... 30 3.3.2 Der HOPS-Komplex hemmt die Vam7SD-abhängige Fusion in vitro.............................. 34 3.3.3 Der minimale Q-SNARE-Komplex hemmt die Fusion in vitro......................................... 36
II
3.4 Funktionelle Analyse des Pal-Vam7 Vam3∆N-Stammes...................................................... 38 3.4.1 Untersuchung des Zytokinesedefektes ................................................................................ 38 3.4.2 Analyse der Vakuolendynamik in vivo ................................................................................ 39 3.4.3 Lokalisation von Markerproteinen....................................................................................... 41 3.4.4 Untersuchung der Fusionseigenschaften von Pal-Vam7 Vam3∆N-Vakuolen in vitro .... 43
4 Diskussion ........................................................................................................ 46
4.1 Die Wechselwirkung zwischen HOPS und SNAREs im aufgereinigten System............... 46 4.1.1 Assemblierung eines SNARE-Komplexes .......................................................................... 46 4.1.2 Der HOPS-Komplex interagiert mit assemblierten Q-SNAREs........................................ 48 4.1.3 Die Wechselwirkung zwischen HOPS-Untereinheiten und Q-SNAREs .......................... 51
4.2 Die funktionelle Bedeutung der HOPS-SNARE Wechselwirkungen ................................. 53 4.2.1 Der Einfluss der N-terminalen Domänen von Vam3 und Vam7 ....................................... 53 4.2.2 Der HOPS-Komplex hemmt die Vam7SD-abhängige Fusion in vitro.............................. 56 4.2.3 Der minimale Q-SNARE-Komplex hemmt die Vakuolenfusion in vitro ......................... 57
5 Ausblick............................................................................................................ 60
6 Material und Methoden................................................................................... 62
6.1 Medien........................................................................................................................................... 62 6.1.1 Vollmedien ............................................................................................................................ 62 6.1.2 Synthetische Medien............................................................................................................. 62 6.1.3 Antibiotika............................................................................................................................. 63
6.2 Stammhaltung und Anzucht von Mikroorganismen............................................................. 63 6.3 Verwendete Hefe- und Bakterienstämme ............................................................................... 63
6.3.1 Bakterienstämme................................................................................................................... 63 6.3.2 Hefestämme........................................................................................................................... 64
6.4 Molekularbiologische Arbeitsmethoden.................................................................................. 64 6.4.1 Präparation von Plasmid-DNA ............................................................................................ 64 6.4.2 Photometrische Quantifizierung von DNA ......................................................................... 64 6.4.3 Polymerasekettenreaktion (PCR)......................................................................................... 64 6.4.4 Agarose-Gelelektrophorese .................................................................................................. 68 6.4.5 Enzymatische Modifikation von DNA ................................................................................ 68 6.4.6 Transformation von Plasmid-DNA in E. coli...................................................................... 70 6.4.7 Transformation von Plasmid-DNA oder PCR-Fragmenten in Hefe.................................. 70 6.4.8 Verwendete Plasmide ........................................................................................................... 71
6.5 Biochemische Arbeitsmethoden................................................................................................ 71 6.5.1 Proteinbestimmung ............................................................................................................... 71 6.5.2 SDS-Gelelektrophorese ........................................................................................................ 71 6.5.3 Westernblot ........................................................................................................................... 72 6.5.4 Proteinextraktion aus Hefe (nach Rödel)/TCA-Präzipitation ............................................ 72
III
6.5.5 Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen aus E.coli.......................................................... 73 6.5.6 Aufreinigung von His-Fusionsproteinen aus E.coli............................................................ 74 6.5.7 Affinitätsaufreinigung von Proteinen aus S. cerevisiae...................................................... 74 6.5.8 SNARE-Assemblierung und HOPS Interaktion ................................................................. 75 6.5.9 Homotypische Vakuolenfusion in vitro............................................................................... 75
6.6 Mikroskopie ................................................................................................................................. 77 6.6.1 FM4-64-Färbung................................................................................................................... 77 6.6.2 Calcofluor-Färbung............................................................................................................... 78
7 Literaturverzeichnis ........................................................................................ 79
8 Anhang ............................................................................................................. 88
8.1 Verwendete Hefestämme und Plasmide .................................................................................. 88 8.2 Abkürzungsverzeichnis .............................................................................................................. 90 8.3 Abbildungsverzeichnis ............................................................................................................... 92 8.4 Tabellenverzeichnis..................................................................................................................... 93
IV
Publikationen
Krämer, L. and Ungermann, C. (2011). HOPS drives vacuole fusion by binding the
vacuolar SNARE complex and the Vam7 PX domain via two distinct sites. Mol. Biol.
Cell
Epp, N., Rethmeier, R., Krämer, L. and Ungermann, C. (2011). Membrane
dynamics and fusion at late endosomes and vacuoles – Rab regulation, multisubunit
tethering complexes and SNAREs. Eur. J. Cell Biol. [Review]
V
Zusammenfassung
Das Endomembransystem eukaryontischer Zellen besteht aus einem dynamischen
Netzwerk membranumschlossener Organellen. Der Austausch von Proteinen und
Lipiden zwischen diesen Organellen wird über einen gerichteten Transport von
Vesikeln gewährleistet. Für die spezifische Fusion der Transportvesikel mit der
Akzeptormembran sind Tethering-Faktoren, Rab-GTPasen und SNARE-Proteine
verantwortlich.
Die Zusammenlagerung der membranassoziierten SNAREs zu einem Bündel aus vier
α-Helices leitet die Verschmelzung der Membranen ein. Obwohl jedes
Kompartiment des Endomembransystems eine spezifische SNARE-Ausstattung
besitzt, benötigen SNAREs zusätzliche Faktoren, um selektiv zu assemblieren. Diese
Aufgabe wird von Tethering-Faktoren, SM-Proteinen und Rab-GTPasen
übernommen.
In Saccharomyces cerevisiae ist der hexamere HOPS als Tethering-Komplex zusammen
mit den SNAREs Vam3, Vam7, Vti1, Nyv1 und Ykt6 an der Fusion mit der Vakuole
beteiligt. Aus der nachgewiesenen Wechselwirkung des HOPS-Komplexes mit den
SNAREs Vam3 und Vam7 lässt sich ein genereller Einfluss des Komplexes auf
SNARE-Proteine ableiten.
Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Chakterisierung der Wechselwirkung zwischen
HOPS und SNAREs und der Analyse der Bedeutung dieser Bindungen für die Fusion
mit der Vakuole. In dieser Arbeit wird die spezifische Bindung des HOPS-
Komplexes an assemblierte Q-SNAREs gezeigt. Diese Bindung wird durch die
HOPS-Untereinheiten Vps16, Vps18 und Vps33 vermittelt. Die N-terminale PX-
Domäne von Vam7 bindet an die HOPS-Untereinheiten Vps16 und Vps18. Über in
vitro Fusionen von Vakuolen konnte gezeigt werden, dass die Wechselwirkung des
HOPS-Komplexes mit dem assemblierten Q-SNARE-Komplex für eine Stimulation
der Fusion ausreichend ist. Die Wechselwirkung des HOPS-Komplexes mit der N-
terminalen Domäne von Vam7 und Vam3 trugen zur Erhöhung der Fusionseffizienz
bei, waren aber nicht essentiell. In diesem Zusammenhang konnte beobachtet
werden, dass eine alternative Membranassoziation von Vam7 ohne PX bei einer
zusätzlichen N-terminalen Verkürzung von Vam3 zu einem Zytokinesedefekt führt.
VI
Weiterhin konnte ich zeigen, dass HOPS die Vakuolenfusion hemmt, wenn das N-
terminal verkürzte Vam7 an der Fusion beteiligt war. Diese Beobachtung läßt auf
eine proofreading Aktivität des HOPS-Komplexes schließen.
Die hier vorgelegten Daten erlauben die Erweiterung der bisherigen vakuolären
Fusionsmodelle um zusätzliche Aspekte und konkretisieren die Wechselwirkung von
HOPS und SNAREs.
VII
Summary
The endomembrane system of eukaryotic cells consists of a dynamic network of
membrane-enclosed organelles. The exchange of proteins and lipids between these
organelles is ensured by a directed transport of vesicles. Tethering factors, Rab-
GTPases and SNARE proteins are responsible for the specific fusion of transport
vesicles with the acceptor membrane. The assembly of membrane-associated
SNAREs into a bundle of four α-helices initiates the fusion of the membranes.
Although each compartment of the endomembrane system is equipped with a
specific set of SNAREs, additional factors are responsible for a selective assembly.
This task is performed by tethering factors, Rab-GTPases and SM proteins. In
Saccharomyces cerevisiae, the hexameric HOPS tethering complex and the SNAREs
Vam3, Vam7, Vti1, Nyv1 and Ykt6 are involved in vacuole fusion. The described
interaction of the HOPS complex with the SNAREs Vam3 and Vam7 suggest a
general influence of the complex on SNARE proteins.
This work was focused on the characterization of the interaction between HOPS and
SNAREs and the analysis of the importance of the observed interactions for fusion
with the vacuole. In this work, a specific binding of the HOPS complex with
assembled Q-SNAREs was observed. This interaction is mediated by the HOPS
subunits Vps16, Vps18 and Vps33. The N-terminal PX domain of Vam7 binds to the
HOPS subunits Vps16 and Vps18. It could be demonstrated that the interaction of
the HOPS complex with assembled Q-SNAREs is sufficient to stimulate fusion of
purified vacuoles in vitro. The interaction of the HOPS complex with the N-terminal
domain of Vam7 and Vam3 contributed to an increase in fusion efficiency but was
not essential. In this context, it was observed that an alternative membrane
association of Vam7 without the PX domain results in a cytokinesis defect if Vam3
was also truncated N-terminally. Furthermore, I was able to show that HOPS
inhibits vacuole fusion when the N-terminal domain of Vam7 was truncated. This
observation suggests a proofreading activity of the HOPS complex. The presented
data allow the extension of the current vacuolar fusion model by substantiating the
interaction between HOPS and SNAREs.
Einleitung
1
1 Einleitung
Das Endomembransystem ist ein typisches Merkmal eukaryontischer Zellen und
dient der Kompartimentierung in unterschiedliche Reaktionsräume. Zwischen den
einzelnen Kompartimenten wird der selektive Austausch von Proteinen und Lipiden
durch Transportvesikel gewährleistet. Das Abschnüren der Vesikel von der
Donormembran, der Transport und die Fusion mit der Akzeptormembran ist ein in
Eukaryonten stark konservierter Prozess, ohne den eine Kompartimentierung nicht
möglich wäre. Die folgende Arbeit widmet sich der Untersuchung von
Fusionsprozessen an der Vakuole im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae (S.
cerevisiae).
Nach der Einführung von S. cerevisiae als experimentellem Organismus durch H.
Roman und C. Lindegren in den 1940er Jahren erlangte die Bäckerhefe schnell
große Bedeutung als Modellorganismus zur Untersuchung zellbiologischer
Fragestellungen (Lindegren, 1945; Roman und Hawthorne, 1951). Durch
verschiedene Sequenzierungsprojekte steht seit 1996 die gesamte genetische
Information der 16 Chromosomen zur Verfügung, die die systematische Suche nach
funktionellen Proteinen und nach Homologien zu anderen Organismen erleichtert
(Williams, 1996). Die Bezeichnung von Proteinen und Genen in dieser Arbeit folgt
der allgemein üblichen Nomenklatur für S. cerevisiae.
1.1 Organellen des Endomembransyst e ms
Im Zytoplasma eukaryontischer Zellen findet man durch Membranen abgegrenzte
Räume, die Organellen. Eukaryonten enthalten einen Zellkern, das
endoplasmatische Retikulum (ER), den Golgiapparat (Golgi), Peroxisomen,
Mitochondrien, Endosomen und Lysosomen bzw. Vakuolen. Die Aufgaben der
einzelnen Organellen sind in eukaryontischen Zellen klar verteilt. Zwischen
verschiedenen Organismen können diese Organellen strukturelle Unterschiede
aufweisen. Der Golgi-Apparat ist beispielsweise in Säugerzellen über ein tubuläres
Netzwerk aus Membranstapeln organisiert, während S. cerevisiae etwa 30 Golgi-
Kompartimente pro Zelle aus vorwiegend ungestapelten Zisternen aufweist (Preuss
et al., 1992). Vakuolen sind in Hefezellen mit 30% bis 90% des Zellvolumens deutlich
ausgeprägter als Lysosomen, die nur etwa 1% bis 15% des gesamten
Einleitung
2
Säugerzellvolumens einnehmen (Alberts, 2002; Yoon et al., 2010). Über das
Abschnüren und die Fusion von kleinen Transportvesikeln steht das
Endomembransystem, bestehend aus Plasmamembran, Golgi, ER, Endosomen und
Vakuole, direkt oder indirekt miteinander in Kontakt. Die an dieser Kommunikation
beteiligten Organellen werden im Folgenden charakterisiert.
1.1.1 Das endoplasmatische Retikulum (ER)
Das endoplasmatische Retikulum (ER) ist ein weit verzweigtes röhrenförmiges
Netzwerk, das mit der äußeren Kernmembran in Verbindung steht. Man
unterscheidet zwischen dem rauen (granulären) und glatten (agranulären) ER.
Transmembranproteine werden durch Ribosomen am rauen ER synthetisiert. Sie
besitzen eine Signalsequenz, welche durch ein Signalerkennungspartikel (SRP)
erkannt wird. Dieses tritt in Wechselwirkung mit dem Ribosom und bewirkt die
Unterbrechung der Proteinsynthese und die Bindung des Ribosoms an einen
spezifischen Rezeptor des rauen ER. Die Polypeptidkette wird somit direkt durch die
Pore des Sec61-Komplexes vom Ribosom in das ER transloziert (Zimmermann et al.,
2010). Das raue ER ist damit vorwiegend für die Proteinsynthese und
Glykosylierung zuständig, während das glatte ER eine wichtige Rolle bei der
Lipidsynthese einnimmt. Proteine mit einem C-terminalen Membrananker werden
über den GET-Komplex in die Membran des ER integriert (Schuldiner et al., 2008).
Die mit einem Exit-Signal gekennzeichneten Proteine werden über die Abschnürung
von COPII-ummantelten Vesikeln zum Golgi-Apparat transportiert. Die
Wechselwirkung des komplementären Rezeptors zum Exit-Signal mit Komponenten
des COPII-Mantels sorgt für die Anreicherung des Transportguts im Vesikel. Für
den retrograden Transport vom Golgi-Apparat zurück zum ER sind COPI-Vesikel
verantwortlich, die sich wie die COPII-Vesikel entlang der Mikrotubuli bewegen
(Barlowe et al., 1994; Letourneur et al., 1994).
1.1.2 Der Golgi-Apparat (Golgi)
Der Golgi-Apparat besteht aus einem dynamischen Membransystem. Er spielt eine
Schlüsselrolle bei der posttranslationalen Glykosylierung von Proteinen und
Lipiden. Die charakteristischen Merkmale des Golgi-Apparates sind die
scheibenförmigen membranumhüllten Zisternen. Der Golgi weist eine polare
Einleitung
3
Anordnung auf, so dass der zum ER gerichtete Bereich (cis-) und der vom ER
abgewandte Bereich (trans-Golgi) unterschieden werden kann. Der cis-Golgi
empfängt die vom ER kommenden COPII-Vesikel, während die vom trans-Golgi-
Netzwerk (TGN) abgeschnürten Vesikel zur Plasmamembran, zum Endosom oder
direkt zur Vakuole sortiert werden. Man spricht beim Golgi von einem dynamischen
System, da sich das Modell der Zisternenreifung im Gegensatz zum Modell des
ausschließlich vesikulären Transports weitgehend durchgesetzt hat (Glick et al.,
1997). Es kommt dabei zu einer Fusion der vom ER kommenden COPII-Vesikel, die
eine cis-Zisterne bilden und dann über die zentral-Zisternen zu trans-Zisternen
heranreifen, wobei der Rücktransport von Enzymen und Membranproteien durch
COPI-Vesikel gewährleistet wird.
1.1.3 Die endosomalen Kompartimente
Das endosomale System besteht aus funktionell unterschiedlichen Kompartimenten
und dient vorwiegend der Regulation des Gleichgewichtes von Rezeptoren und
anderen Membranproteinen an der Plasmamembran (PM). Die Rezeptoren werden
durch Sortierung in abknospende Vesikel internalisiert und entweder über tubuläre
endosomale Strukturen an den trans-Golgi oder die PM recycelt oder sie gelangen
weiter zum Abbau in die Vakuole.
Als Internalisierungssignal dient monomeres Ubiquitin, das an ein Lysin der
Membranproteine transferiert wird. Die so markierten Proteine werden endozytiert
und gelangen während der Reifung der Vesikel durch Untereinheiten des ESCRT-
Komplexes ins Innere der Endosomen, den sogenannten intraluminalen Vesikeln
(ILV) (Katzmann et al., 2001). Die Anreicherung dieser ILVs im Lumen des späten
Endosoms führt zur Ausbildung des multivesicular bodys (MVB), der das letzte
endosomale Stadium vor der Fusion mit der Vakuole darstellt. Der MVB wird auch
als prävakuoläres Kompartiment bezeichnet, von dem außerdem retrograder
Transport zurück zum trans-Golgi-Netzwerk (TGN) erfolgt.
Die Endosomen durchlaufen bis zu ihrer Fusion mit der Vakuole einen
Reifungsprozess, dessen Übergänge schwierig zu unterscheiden sind. Man kann
anhand von Markerproteinen grundsätzlich zwischen frühen und späten
Endosomen unterscheiden, die jeweils einen spezifischen Besatz von SNAREs und
Rab-GTPasen aufweisen. In Hefe gilt z.B. das Rab-Protein Vps21 als Marker für
Einleitung
4
frühe Endosomen, während Ypt7 an der homotypischen Fusion von späten
Endosomen und von Endosomen mit der Vakuole beteiligt ist.
Eine Reihe von Arbeiten zeigen, dass Endosomen auch eine Rolle bei der
Weiterleitung von Signalen spielen, was auf eine starke Vernetzung des
Endozytosewegs mit der Signaltransduktion schließen lässt (Miaczynska et al., 2004;
Schiefermeier et al., 2011).
1.1.4 Das vakuoläre Kompartiment
Die Vakuole übernimmt in der Zelle eine wichtige Rolle beim Recycling von
Makromolekülen, der Speicherung von Nährstoffen und der Regulation der
Homöostase.
Die Endosomen geben bei der Fusion mit der Vakuole ihre ILVs in das Lumen der
Vakuole frei. Dort werden sie in ihre Makromoleküle zerlegt und recycelt. Der
niedrige pH-Wert im Lumen der Vakuole ist Voraussetzung für die Aktivität der
zahlreichen hydrolytischen Enzyme, die diesen Abbau gewährleisten. Für die
Ansäuerung intrazellulärer Kompartimente und die Aufrechterhaltung der pH-
Differenz zum Zytoplasma ist die V-ATPase (vacuolar ATPase) verantwortlich. Diese
besteht bei Hefen aus 14 Untereinheiten, die zusammen den peripheren V1 und den
in die Membran integrierten V0 Komplex ausbilden. Der aktive Transport von
Protonen entgegen dem Konzentrationsunterschied wird durch die Hydrolyse von
ATP energetisiert (Compton et al., 2006). Auch Kanäle für den Ionentransfer und
Aminosäuretransporter tragen zum Austausch zwischen der Vakuole und dem
Zytoplasma bei. Die Vakuole durchläuft Fusions- und Teilungsprozesse als Antwort
auf osmotischen Stress und verändert ihre Morphologie abhängig vom Zellzyklus.
In der frühen Telophase ändert sich die Vakuolenmorphologie in tubuläre
Strukturen, die in der Tochterzelle wieder zu einer Vakuole fusionieren. Diese
vorübergehende Reduktion des Vakuolenvolumens trägt vermutlich zur
Vergrößerung des Zytosols für die Ausbildung der Mikrotubuli bei (Seguí-Simarro
und Staehelin, 2006).
Einleitung
5
1.2 Transportw eg e zur Vakuole
Der Ursprung der unterschiedlichen Transportvesikel, die eine Fusion mit der
Vakuole eingehen, soll im folgenden Kapitel genauer beleuchtet werden, da er
wichtige Informationen zum Verständnis dieser Arbeit liefert. Der konkrete
Transport- und Fusionsmechanismus der Transportvesikel wird ausführlich in
Kapitel 1.3 behandelt.
Die Carboxpeptidase Y wird über den nach ihr benannten CPY-Weg zur Vakuole
transportiert. Diese vakuoläre Hydrolase gelangt durch Vesikel vom trans-Golgi über
ein endosomales Intermediat, dem prävakuolären Kompartiment, zur Vakuole. Die
in der Prä-Pro-Form synthetisierte Carboxypeptidase Y wird im ER prozessiert und
glykosyliert. Im Golgi folgt eine weitere Anlagerung von Zuckerseitenketten, bevor
CPY über den transmembranen Vps10-Rezeptor den Golgi-Apparat verlässt.
Ein alternativer Transportweg zur Vakuole ist der ALP-Weg, der nach der
alkalischen Phosphatase (ALP/Pho8) benannt ist. Dieser umgeht den Transport
über das endosomale Kompartiment und stellt somit eine direkte Verbindung
zwischen Golgi-Apparat und Vakuole dar. Aufgrund des Adaptorproteinkomplexes
AP-3, der an der Ausbildung der Vesikel am trans-Golgi beteiligt ist, wird dieser
Transportweg auch AP-3-Weg genannt. Typische vakuoläre Proteine, die diesen
Transportweg nutzen, sind die SNARE-Proteine Vam3 und Nyv1 sowie die vakuoläre
Kinase Yck3. Eine Wechselwirkung zwischen Vps41, einer Untereinheit eines
hexameren Tethering-Komplexes, und der AP-3 ∂ -Untereinheit Apl5 weist auf ein
Zusammenspiel dieser beiden Proteine beim Andocken der AP-3 Vesikel an die
Vakuole hin (Angers und Merz, 2009; Cabrera et al., 2010).
Das Abschnüren von Vesikeln von der Plasmamembran in die Zelle stellt den
Ursprung des endozytotischen Transportwegs dar. Er dient dem Recycling von
Membranrezeptoren über die tubulären Recycling-Endosomen oder dem Abbau
dieser durch den Transport in die Vakuole. Auf dem Weg zur Vakuole durchlaufen
Endosomen einen Reifungsprozess vom frühen zum späten Endosom. Nach der
Einleitung
6
Fusion mit Vesikeln des CPY-Transportwegs fusioniert das prä-vakuoläre
Kompartiment mit der Vakuole.
Der Cvt-Transportweg (cytosole to vacuole targeting) nutzt die Maschinerie der
Autophagozytose, stellt aber im Vergleich zu dieser einen konstitutiven
Transportweg vom Zytoplasma zur Vakuole dar. Die vakuolären Enzyme α-
Mannosidase (Ams1) und Aminopeptidase I (Ape1) nutzen diesen Transportweg, um
zur Vakuole zu gelangen (Suzuki et al., 2002). Das an zytoplasmatischen Ribosomen
als proApe1 synthetisierte Protein wird über die mit einer Doppelmembran
umhüllten Cvt-Vesikel in die Vakuole transportiert. Nachdem sie in die Vakuole
entlassen wurde, wird proApe1 über die Proteinase B (PrB) in der Vakuole zu Ape1
prozessiert (Kim et al., 1997).
1.3 Transport und Fusion intraz ellulärer Vesik el
Der vesikuläre Transport zwischen den Organellen des Endomembransystems ist
hoch spezifisch. Schon beim Abschnüren der Vesikel von der Donormembran steht
seine Zielmembran fest. Membranassoziierte Faktoren sind verantwortlich für die
Anheftung (Tethering) und die Fusion mit der Akzeptormembran und tragen zur
Spezifität des Transports bei. Dieser Prozess kann nach seiner Abfolge in vier Stufen
eingeteilt werden: das Abschnüren (budding) der Vesikel, der Transport, das
Tethering und die Fusion (Cai et al., 2007).
1.3.1 Das Abschnüren und der Transport von Vesikeln
Kleine Rab-GTPasen der Arf1/Sar1-Familie rekrutieren Hüllproteine (coat-Proteine)
aus dem Zytoplasma, die sich in einer Käfigstruktur zusammenlagern und durch
ihre Geometrie eine Auswölbung der flachen Donormembran begünstigen
(Gillingham und Munro, 2007). Spezifische Transmembranproteine und ihr
luminales Transportgut werden an der Protein-umhüllten Membran angereichert,
da sie über ihre Signalsequenz von Hüllproteinen oder Adaptorproteinen (AP)
erkannt werden (Bonifacino und Lippincott-Schwartz, 2003). Clathrin war das erste
Hüllprotein, das identifiziert wurde. Clathrin-umhüllte Vesikel findet man bei der
rezeptorvermittelten Endozytose an der Plasmamembran und bei der Ausbildung
sekretorischer Vesikel am trans-Golgi (Owen et al., 2004). COPI (coat protein
Einleitung
7
complex I) und COPII (coat protein complex II) sind weitere Hüllproteine, die am
Transport von Vesikeln beteiligt sind. Zwischen dem Golgi-Apparat und dem ER
sowie zwischen den Golgi-Zisternen findet COPI-vermittelter Transport statt,
während zwischen dem ER und dem Golgi COPII Vesikel transportiert werden (Cai
et al., 2007).
Nach dem Abschnüren der Vesikel folgt der Transport zur Akzeptormembran.
Dieser kann entweder über aktiven Transport entlang des Zytoskeletts oder passiv
über Diffusion stattfinden (Cai et al., 2007). Die reversible Bindung der Vesikel an die
Akzeptormembran wird über Tethering-Faktoren vermittelt. Diese Faktoren
initiieren den ersten Kontakt zwischen Akzeptor- und Donormembran. Die
Eigenschaften und Funktionsprinzipien werden in Kapitel 1.6 ausführlich behandelt.
1.3.2 Fusion mit der Akzeptormembran
Die Membranfusion ist ein weit verbreiteter Prozess und die Voraussetzung für die
Kompartimentierung der eukaryontischen Zelle.
In wässriger Umgebung fügen sich amphipatische Phospholipide spontan zu einer
Lipiddoppelschicht oder zu einer Mizelle zusammen. Bei der Fusion solcher
Membranen muss unter Aufwendung von Energie der elektrostatische Widerstand
der geladenen Membranoberfläche überwunden werden, bevor die Lipide
miteinander interagieren können. Die „stalk-Hypothese“ beschreibt drei
Übergangszustände der Membranfusion, die schließlich zur Fusion zweier
Doppellipidschichten führt (Abb. 1.1).
Abbildung 1.1: Stadien der Membranfusion A: Annäherung der flachen Membranen. B: Fusions-stalk. C: zirkuläres Hemifusions-Diaphragma. D: Fusionspore (Kozlovsky et al., 2002).
Durch die Annäherung der Membranen kommt es zu einer lokalen Vermischung der
proximalen Lipidschichten der jeweiligen Bilayer. Die distale Lipidschicht bleibt dabei
erhalten. Bei diesem Zwischenzustand, der auch als Hemifusion bezeichnet wird,
kommt es nicht zu einer Vermischung der wässrigen Phasen jenseits der
Membranen. Das durch die lokale Interaktion der proximalen Lipidschichten
Einleitung
8
herbeigeführte Intermediat wird als stalk bezeichnet und gibt dem Modell seinen
Namen (Abb. 1.1B). Eine radiale Expansion dieses stalk-Intermediats führt die
distalen Lipidschichten zu einer Lipiddoppelschicht zusammen, die als Hemifusions-
Diaphragma bezeichnet wird und die letzte Stufe vor der Bildung der Fusionspore
darstellt (Abb. 1.1C, D). Die starken Krümmungen der Intermediate dieses Modells
setzen allerdings eine unrealistisch hohe Aktivierungsenergie voraus (Siegel, 1993;
Kozlovsky et al., 2002; Jahn et al., 2003). Diese Energiebarriere muss demzufolge
durch krümmungsinduzierende Faktoren überwunden werden (Martens und
McMahon, 2008).
Die Geschwindigkeit der Membranfusion ist abhängig von der Kontaktfläche und
somit auch von der Größe der Vesikel. Daher bewegt sich die
Fusionsgeschwindigkeit von synaptischen Vesikeln (ca. 40 nm im Durchmesser) im
Bereich von Millisekunden, während die Fusion von Hefevakuolen (mehr als 500
nm im Durchmesser) Minuten benötigen kann (Jahn et al., 2003; Craige et al., 2004;
Cabrera und Ungermann, 2008). Um eine schnelle Fusion von Vesikeln mit der
Akzeptormembran zu gewährleisten, muss die benötigte Aktivierungsenergie in der
Zelle für die Fusion bereitgestellt werden. Diese Aufgabe wird von SNARE (soluble N-
ethylmaleimide-sensitive factor (NSF) attachment protein (SNAP) receptor)-Proteinen
übernommen (Hanson et al., 1997; Lin und Scheller, 1997). Diese wurden von
Söllner et al. 1993 erstmalig als membranassoziierte Proteine und essentieller
Bestandteil der Fusionsmaschinerie von Synapsen im Rinderhirn charakterisiert.
1.4 SNARE-Protein e
Die Aufreinigung von zwei löslichen Proteinen, die eine entscheidende Rolle bei
einem in vitro-Experiment zur Untersuchung des Proteintransports zwischen Golgi-
Kompartimenten spielten, dienten später der Affinitätsaufreinigung ihrer
membrangebundenen Rezeptoren, den SNARE-Proteinen (Balch et al., 1984; Söllner
et al., 1993). Bei diesen beiden Proteinen handelte es sich um NSF (N-
ethylmaleimide sensitive factor) und das Adaptorprotein α-SNAP (soluble-NSF
attachment protein). Deren Homologe in S. cerevisiae sind Sec18 und Sec17.
Untersuchungen des Transports von synaptischen Vesikeln zur präsynaptischen
Membran zeigten, dass bestimmte SNAREs entweder auf der Vesikel- oder auf der
Akzeptormembran zu finden sind. Dies war die Grundlage für die ursprüngliche
Einleitung
9
Typisierung der SNAREs in v- (vesicle) und t- (target membrane) SNAREs.
Problematisch gestaltet sich diese Nomenklatur bei der Beschreibung von
symmetrischen Fusionen, wie der homotypischen Vakuolenfusion, bei der sich
nicht eindeutig eine Akzeptormembran ausmachen lässt. Daher hat sich eine zweite
strukturbasierte Nomenklatur durchgesetzt. Diese unterscheidet zwischen R-
SNAREs und Q-SNAREs und basiert auf den stark konservierten Arginin- (R) und
Glutamin- (Q) Resten im SNARE-Motiv, die bei SNARE-Proteinen eine
Schlüsselrolle einnehmen (Abb. 1.2A) (Fasshauer et al., 1998; Ungar und Hughson,
2003).
1.4.1 Struktur von SNARE-Proteinen
SNARE-Proteine bilden eine Superfamilie aus kleinen, einfach konstruierten
Proteinen mit 25 Mitgliedern in S. cerevisiae (Abb. 1.2B). Sie sind mit einem
evolutionär konservierten SNARE-Motiv ausgestattet, das über einen kurzen Linker
mit der C-terminal endständigen Transmembrandomäne (TMD) verbunden ist,
wodurch sie dem TypII der Transmembranproteine zugeordnet werden. Sie besitzen
außerdem eine unabhängig faltende N-terminale Region, die eine Unterteilung in die
Untergruppen Qa, Qb und Qc zulässt (Abb. 1.2A).
Einleitung
10
A B
Abbildung 1.2: Struktur und Lokalisation von SNARE-Proteinen. A: Schematische Darstellung der unterschiedlichen Domänen von SNARE-Proteinen. Gestrichelt dargestellte Domänen weisen auf Variationsmöglichkeiten innerhalb der SNARE-Superfamilie hin. Das Qc-SNARE Vam7 besitzt beispielsweise keine C-terminale Transmembrandomäne sondern eine N-terminale PX-Domäne. Qa-SNAREs weisen N-terminal eine Struktur bestehend aus drei α-Helices auf (Habc-Domain). Der variable N-terminus der Qb, Qc und R-SNAREs ist mit einem Oval dargestellt. SNAP-25 ist ein Mitglied der kleinen Qbc-Superfamilie, die ein Qb und ein Qc Motiv besitzt. B: Übersicht der SNARE-Kompositionen in einer Hefezelle (Jahn und Scheller, 2006; Kienle et al., 2009).
In S. cerevisiae findet man vier SNAREs, die von diesem Prinzip abweichen und auf
eine andere Art und Weise mit der Membran assoziiert vorliegen. Die an der
Plasmamembran lokalisierten SNAREs Sec9 und Spo20 sind palmitoyliert, während
das an vielen unterschiedlichen Fusionsprozessen beteiligte Ykt6 an Stelle einer
TMD eine CAAX-box (Aminosäuresequenz: CCIIM) besitzt, die ein Substrat für die
Farnesyltransferase darstellt. Das Qc-SNARE Vam7 lokalisiert mittels einer N-
terminalen Phox-homologen (PX) Domäne an die Vakuole, die etwa 120
Aminosäurereste umfasst. Die PX-Domäne ist ein weit verbreiteter Membrananker,
der bevorzugt an Phosphatidylinositol-3-phosphat (PI3P) bindet, das hauptsächlich
an den Endosomen und der Vakuole angereichert vorliegt (Cheever et al., 2001;
Jahn und Scheller, 2006).
Die unstrukturierten monomeren SNARE-Motive der SNARE-Proteine können sich
durch ihre hydrophoben Aminosäureseitenketten nach dem Prinzip eines leucin
Einleitung
11
zippers zusammenlagern und unter Freisetzung von Energie ihre Konformation
ändern (Jahn und Scheller, 2006). Die SNARE-Motive assemblieren in einem Bündel
aus vier lang gestreckten parallelen α-Helices. Die erste Kristallstruktur eines
solchen Komplexes gelang 1998 mit den SNARE-Motiven der synaptischen SNAREs
Synaptobrevin (VAMP), Syntaxin-1 und SNAP-25 (zwei SNARE-Motive) (Abb. 1.3A)
(Sutton et al., 1998). Diese Struktur bestätigte die α-helikalen Strukturen, von denen
man schon vorher im assemblierten SNARE-Komplex ausgegangen war. Bei der
Bildung eines trans-SNARE-Komplexes zwischen zwei Membranen soll die parallele
Anordnung der SNARE-Motive für die Annäherung der Membranen verantwortlich
sein. Im Zentrum des Bündels findet man 16 layer mit interagierenden
Aminosäureresten. Bis auf die Arginin- (R) bzw. Glutamin- (Q) Reste im
konservierten „0“ layer, sind es hydrophobe Wechselwirkungen, die diesem Bündel
die Stabilität verleihen (Abb. 1.3B) (Antonin et al., 2002).
Abbildung 1.3: Kristallstruktur des neuronalen SNARE-Komplexes. A: Kristallstruktur des SNARE-Kernkomplexes bestehend aus Syntaxin-1 (Qa, rot), SNAP-25 (Qc und Qb, grün) und Synaptobrevin (R, blau). Die an die Membran gebundenen C-terminalen Bereiche sind nach rechts orientiert. B: Die 16 layer der interagierenden Seitenketten sind von -7 bis +8 nummeriert und graphisch in schwarz oder rot („0“ layer) dargestellt. Die weißen Strukturen zeigen den Verlauf der α-Helices. Wie in A sind die einzelnen SNAREs farbig dargestellt und zeigen hier den Achsenverlauf der Helices (Jahn und Scheller, 2006).
Einleitung
12
1.4.2 Funktion von SNARE-Proteinen
Die Voraussetzung für einen funktionellen und somit fusionsinduzierenden SNARE-
Komplex ist die Zusammenlagerung von drei Q-SNAREs und einem R-SNARE
(QabcR-Komplex) (Fasshauer et al., 1998). Die 16 hydrophoben layer des SNARE-
Kernkomplexes werden reißverschlussartig vom N-terminus ausgehend gebildet
(Abb. 1.4, unten). Da die SNARE-Proteine vorwiegend C-terminal in der Membran
verankert sind, führt die Assemblierung der SNAREs zu einer Annäherung der
beiden Membranen. Der so gebildete trans-SNARE-Komplex führt zur Fusion und
somit zu einem cis-SNARE-Komplex, bei dem alle beteiligten SNAREs assembliert auf
derselben Membran vorliegen (Abb. 1.4, rechts). Dieser Zustand muss wieder gelöst
werden, damit die SNAREs für eine weitere Fusion zur Verfügung stehen. Dieses
Recycling wird von der hexameren AAA (ATPase associated with diverse cellular
activities)-ATPase NSF (Sec18 in S. cerevisiae) und dessen Kofaktor α-SNAP (Sec17
in S. cerevisiae) unter ATP-Hydrolyse übernommen (Ungermann und Wickner,
1998) (Abb. 1.4, oben).
Abbildung 1.4: SNAREs-abhängiger Fusionszyklus. Als Ausgangszustand wird von einem R-SNARE auf der Vesikelmembran und drei Q-SNAREs auf der Akzeptormembran ausgegangen. Q-SNAREs assemblieren in Akzeptorkomplexe (links) für die vermutlich SM (Sec1/Muc18)-Proteine benötigt werden. Akzeptorkomplexe interagieren mit dem R-SNARE der Donormembran und bilden das α-helikale Bündel aus vier Helices. In Synapsen ist die Fusion von Vesikeln mit der Donormembran abhängig von dem SNARE-bindenden Complexin und dem durch Kalzium aktivierbaren Synaptotagmin. Der nach der Fusion vorliegende cis-SNARE-Komplex wird durch die ATPase NSF und dessen Kofaktor α-SNAP unter ATP-Hydrolyse disassembliert und somit in seinen Ausgangszustand überführt (Jahn und Scheller, 2006).
Einleitung
13
Die Rolle der C-terminalen Transmembrandomänen der SNARE-Proteine während
der Fusion ist bisher noch nicht eindeutig geklärt, sie sollen aber durch Ausübung
von Stress auf die Membran die Bildung der Fusionspore unterstützen (Langosch et
al., 2007; Poschner et al., 2009; Risselada et al., 2011).
Ursprünglich wurde den SNARE-Proteinen eine hohe Spezifität zugesprochen, die
hauptsächlich auf in vitro-Studien mit Liposomenfusionen basierte (Fukuda et al.,
2000; McNew et al., 2000; Paumet et al., 2004). Tatsächlich lokalisieren SNARE-
Proteine vorwiegend spezifisch. Jedem intrazellulären Kompartiment ist ein
bestimmtes Set von SNAREs zugeordnet, das an der Fusion beteiligt ist (Abb. 1.2B)
(Jahn und Scheller, 2006). In vivo-Experimente zeigen jedoch, dass die Spezifität der
Fusion nicht ausschließlich durch SNARE-Proteine vorgegeben wird (Brandhorst et
al., 2006). Das auf der Vakuole lokalisierte Syntaxin-Homolog Vam3 in S. cerevisiae
kann beispielsweise durch Überproduktion den Phänotyp einer Deletion des
endosomalen SNARE Pep12 retten (Götte und Gallwitz, 1997). Eine weitere Studie
zeigt, dass eine Deletion des R-SNARE Sec22, das an der Fusion von ER-Vesikeln mit
dem Golgi beteiligt ist, eine erhöhte Expression seines Homologs Ykt6 zur Folge hat
(Liu und Barlow 2002).
SNARE-Proteine können also nur bedingt die Spezifität der Fusionen von
Membranen in einer Zelle beeinflussen. Daher liegt es nahe, dass andere Faktoren
mit den SNAREs in Kontakt stehen und diese Aufgabe für sie übernehmen. Dabei
liegt der Fokus hauptsächlich auf drei Proteinfamilien: den SM-Proteinen, den
Tethering-Faktoren und den Rab-Proteinen.
Im folgenden Kapitel wird auf die grundlegenden Mechanismen der Rab-GTPasen
eingegangen, da sie eine wichtige Rolle bei der Regulation des Tethering spielen. Die
Eigenschaften der Tethering-Faktoren und der SM-Proteine, auf denen der Fokus
dieser Arbeit liegt, werden im Anschluss daran in Kapitel 1.6 ausführlich beleuchtet.
1.5 Rab-GTPase
Kleine Rab-GTPasen sind für die Regulation und Koordination des Vesikeltransports
verantwortlich. Diese GTPasen sind Proteine, die ihre Konformation abhängig vom
gebundenen Nukleotid ändern. Der Wechsel zwischen der GDP- und GTP-
gebundenen Form wird durch guanine nucleotide exchange factors (GEFs) und GTPase
activating proteins (GAPs) katalysiert, wodurch eine Regulation der zeitlichen und
Einleitung
14
räumlichen Aktivierung gewährleistet wird. Rab-GTPasen können abhängig von
ihrem Aktivierungszustand membrangebunden oder zytosolisch vorliegen. Der
hydrophobe Membrananker wird im Zytosol durch einen GDP-dissociation inhibitor
(GDI) von der polaren Umgebung abgeschirmt. Liegen sie membranassoziiert in
ihrer GTP-gebundenen, aktiven Form vor, rekrutieren sie spezifisch
Effektorproteine an die Membran. Beispielsweise ist die HOPS-Untereinheit Vps41
als Effektorprotein von der an der Vakuole lokalisierten Rab-GTPase Ypt7
beschrieben (Cabrera et al., 2009; Cabrera et al., 2010). Für den Austausch des
Nukleotids und die daraus folgende Aktivierung von Ypt7 wird das dimere GEF
Mon1-Ccz1 benötigt (Nordmann et al., 2010).
1.6 SM-Prot eine und Tethering-Fak tor en
Die Voraussetzung einer intrazellulären Vesikelfusion ist das spezifische Ankoppeln
der Vesikel an die Akzeptormembran, das durch Tethering-Faktoren initialisiert und
über Rab-Proteine reguliert wird. Eine Reihe von Studien geben Hinweise, dass die
fusionseinleitenden Tethering-Faktoren zusätzlich die Assemblierung des trans-
SNARE-Komplexes unterstützen (Shorter et al., 2002; Pérez-Victoria und
Bonifacino, 2009; Hickey und Wickner, 2010). Proteine der Sec1/Munc18-Familie
übernehmen nachweislich regulatorische Aufgaben bei der trans-SNARE-SNARE
Wechselwirkung. Ein Zusammenspiel zwischen Tethering-Faktoren und SM-
Proteinen konnte aber bisher nur vereinzelt nachgewiesen werden (Wiederkehr et
al., 2004; Laufman et al., 2009).
1.6.1 Sec1/Munc18 (SM)-Proteine
Die SM-Proteine können sich in ihrer Funktion stark unterscheiden und daher auch
in ihrer Art der Interaktion mit SNAREs der Syntaxin-Familie und assemblierten
SNAREs. In Eukaryonten spielen evolutionär konservierte SM-Poteine eine
essentielle Rolle in der Exozytose (Sec1/Munc18), Endozytose (Vps45),
Proteinbiosynthese (Sly1) und dem Abbau (Vps33) (Koumandou et al., 2007). Man
unterscheidet grundsätzlich zwischen drei unterschiedlichen SM–SNARE-
Bindemodi. Zwei der drei Bindemodi beruhen auf der direkten Interaktion von
Sec1/Munc18-Proteinen mit Qa-SNAREs (Rizo und Südhof, 2002).
Einleitung
15
Das neuronale Sec1 (Munc18) bindet an die geschlossene Konformation des
SNAREs Syntaxin-1. Dieses Qa-SNARE kann durch eine Interaktion der N-
terminalen Habc-Domäne mit dem SNARE-Motiv die Assemblierung mit anderen
SNAREs verhindern. Die Bindung des SM-Proteins erfolgt möglicherweise über die
Erkennung von insgesamt vier Helices, wobei drei Helices der N-terminalen Habc-
Domäne und zusätzlich das SNARE-Motiv des Syntaxins erkannt werden (Südhof
und Rothman, 2009). Das Sec1-Protein in Hefen unterscheidet sich trotz der
Homologie zum neuronalen Sec1 (Munc18) in der Bindung an das Syntaxin-1
Homolog Sso1. Es kommt im Gegensatz zum neuronalen Sec1 nur zu einer
Bindung, wenn Sso1 im assemblierten SNARE-Komplex vorliegt. Aber auch hier
übernimmt Sec1 eine stimulierende Funktion für die SNARE-abhängige
Membranfusion (Scott et al., 2004).
Der äußere N-terminale Bereich von Syntaxin-1 (N-Peptid) bietet eine zusätzliche
Bindedomäne für Munc18, die möglicherweise der Rekrutierung des Proteins zum
SNARE-Komplex dient, um dort regulatorische Aufgaben zu übernehmen (Rathore
et al., 2010).
Der dritte Bindemodus ist die Interaktion mit dem gesamten SNARE-Komplex. Das
SM-Protein agiert hier wahrscheinlich als Chaperon und unterstützt die SNARE-
Assemblierung (Südhof und Rothman, 2009).
Vps33 ist als einziges SM-Protein Bestandteil von zwei Tethering-Komplexen mit
jeweils sechs Untereinheiten, dem HOPS-Komplex und dem CORVET-Komplex. Die
Wechselwirkung von Vps33 mit dem an der Vakuole lokalisierten Syntaxin-
Homolog Vam3 ist bisher nur durch Experimente mit Zelllysaten gezeigt worden, so
dass eine indirekte Wechselwirkung über den HOPS-Komplex nicht ausgeschlossen
werden kann (Sato et al., 2000; Dulubova et al., 2001). Da Vps33 bisher nur als
Untereinheit der Komplexe nachgewiesen werden konnte, gestalten sich die
funktionellen Untersuchungen dieses Proteins besonders schwierig. Als
Untereinheit des HOPS-Komplexes wird aber Vps33 eine regulatorische Funktion
im Rahmen der Fusion mit der Vakuole zugesprochen (Pieren et al., 2010).
Einleitung
16
1.6.2 Coiled-coil Tethers und Multisubunit Tethering-Komplexe
Tethering-Faktoren sind strukturell sehr unterschiedlich, können aber in zwei
Klassen eingeteilt werden: lange coiled-coil–Proteine und Multisubunit-Komplexe, die
aus drei bis zehn Untereinheiten bestehen können.
Coiled-coil–Proteine findet man hauptsächlich als Tethering-Faktoren am Endosom
und dem Golgi-Apparat. Durch ihre Größe von etwa 3000 Aminosäureresten
können sie Distanzen bis zu 200 nm zwischen Membranen überbrücken
(Gillingham und Munro, 2003). Die zweite Klasse wird aus großen hetero-
oliogomeren Proteinkomplexen gebildet. Man kann zwischen Multisubunit
Tethering-Komplexen, die an der Fusion mit Organellen des sekretorischen
Transportweges (Dsl1, COG, GARP und Exocyst) beteiligt sind, und denen des
endosomalen Transportwegs (CORVET und HOPS) unterscheiden (Abb. 1.5)
(Bröcker et al., 2010).
Abbildung 1.5: Lokalisierung der Multisubunit Tethering-Komplexe und ihrer Rab-GTPasen in S. cerevisiae Die Rho- bzw. Rab-GTPasen sind im membrangebundenen Zustand dargestellt. Die TRAPP-Komplexe sind als Multisubunit GEFs dargestellt. Weitere GEFs sind in der schematischen Darstellung aus Gründen der Vereinfachung nicht erwähnt. Mit einem schwarz umrandeten Oval sind die Multisubunit Tethering-Komplexe dargestellt (Bröcker et al., 2010).
Einleitung
17
Der TRAPP-Komplex agiert nicht wie ein Multisubunit Tethering-Komplexes als Rab-
Effektor, sondern fungiert als GEF. Er wird daher als Multisubunit GEF bezeichnet
(Bröcker et al., 2010) (Abb. 1.5).
Klasse C-Komplexe (HOPS-/CORVET-Komplex)
Der 680 kDa große HOPS (homotypic vacuole fusion and vacuole protein sorting)-
Komplex hat mit dem CORVET (class C core vacuole-endosome transport)-Komplex vier
gemeinsame Untereinheiten (Vps11, Vps16, Vps18 und Vps33), die als Klasse C-
Proteine bezeichnet werden und bei einer Deletion den gleichnamigen Phänotyp mit
fragmentierten Vakuolen hervorrufen (Robinson et al., 1988; Bowers und Stevens,
2005). Die Strukturvorhersagen der Proteine dieser beiden Komplexe sind bis auf
das SM-Protein Vps33 sehr ähnlich. Sie enthalten einen N-terminalen β-Propeller
und eine C-terminale α-Solenoid Domäne. Der CORVET-Komplex enthält außerdem
die Untereinheiten Vps8 und Vps3, der HOPS-Komplex stattdessen Vps41 und
Vps39 (Rieder und Emr, 1997; Peplowska et al., 2007; Bröcker et al., 2010) (Abb.
1.6A). Nach bisherigen Untersuchungen ist der CORVET-Komplex an der Fusion
mit Endosomen beteiligt während der HOPS-Komplex eine wichtige Funktion bei
der Fusion mit Vakuolen übernimmt (Rieder und Emr, 1997; Markgraf et al., 2009).
Einleitung
18
A B
Abbildung 1.6: Die Rolle des HOPS-Komplexes bei der Membranfusion. A: Schematische Darstellung des HOPS-Komplexes mit den Untereinheiten Vps41, Vps39 den Klasse C Untereinheiten Vps11, Vps18, Vps16 (class C-core) und dem SM-Homolog Vps33, das auch zum Klasse C Kern gehört. B: HOPS vermittelte Fusion ist abhängig von der Bindung an Ypt7, Lipide und SNAREs. Der HOPS-Komplex kann die Fehlassemblierung von SNAREs erkennen (proofreading) und die Fusion der Membranen verhindern (Bröcker et al., 2010).
Neben der Fusion mit Autophagosomen, späten Endosomen (MVBs) und AP-3-
Vesikeln wird der HOPS-Komplex auch bei der homotypischen Vakuolenfusion
benötigt. Die Untereinheiten Vps41 und Vps39 interagieren mit der Rab-GTPase
Ypt7. Durch die Bindung an Ypt7-GTP gilt Vps41 als dessen Effektorprotein,
während Vps39 nukleotidunabhängig an Ypt7 bindet (Wurmser et al., 2000; Cabrera
et al., 2009; Ostrowicz et al., 2010). Die Affinität von Vps39 zu Ypt7 ist nur
außerhalb des Komplexes nachweisbar (Ostrowicz et al., 2010). Die Bindung an Ypt7
stellt eine für die Fusion essentielle Rekrutierung des HOPS-Komplexes an die
Membran dar (Hickey et al., 2009).
Die funktionelle Bedeutung der Interaktion des HOPS-Komplexes mit der N-
terminalen PX-Domäne des Qc-SNAREs Vam7 ist bisher nicht untersucht worden.
Der HOPS-Komplex kann Fehlpaarungen von SNARE-Proteinen erkennen und
diese an der Fusion hindern. Diese Eigenschaft wird als proofreading beschrieben
(Abb. 1.6B) (Starai et al., 2008). Weiterhin verhindert der HOPS-Komplex eine
Einleitung
19
vorzeitige Disassemblierung der trans-SNAREs durch Sec18/Sec17 und erlaubt somit
eine Fusion in der Anwesenheit dieser Recyclingfaktoren (Xu et al., 2010). Es gibt
Hinweise auf eine direkte Membranassoziation des HOPS. Neben der
krümmungsabhängigen Membranbindung des ALPS-Motivs von Vps41, welches
eine amphipatische Helix bildet, gibt es auch eine lipidabhängige Wechselwirkung
mit Membranen (Stroupe et al., 2006; Cabrera et al., 2010).
1.7 Homotypische Va kuolenfusion in vitro
Eine Methode zur quantitativen Untersuchung der homotypischen Vakuolenfusion
in vitro wurde 1995 von Albert Haas eingeführt. Dabei können unter bestimmten
Bedingungen aufgereinigte Vakuolen aus S. cerevisiae miteinander fusionieren.
Vorraussetzung ist die Verwendung von aufgereinigten Vakuolen aus zwei Stämmen
mit unterschiedlichem Deletionshintergrund. Dabei handelt es sich zum einen um
einen Stamm, der nicht die membranassoziierte alkalische Phosphatase Pho8
synthetisieren kann, die im Lumen der Vakuole Phosphoester-Bindungen spaltet.
Dem zweiten Stamm fehlt die vakuoläre Protease Pep4, die für die Aktivierung von
pro-Pho8 benötigt wird. Kommt es zu einer Fusion der Vakuolen dieser beiden
Stämme, werden die Inhalte der Vakuolen gemischt und pro-Pho8 wird von Pep4
prozessiert und damit aktiviert. Die Fusionsrate wird nach Lyse der Vakuolen durch
den Umsatz von p-Nitrophenolphosphat in p-Nitrophenol durch Pho8
photometrisch bei 400 nm quantifiziert (Haas, 1995; Ostrowicz et al., 2008).
Abbildung 1.7: Schematische Darstellung der homotypischen Vakuolenfusion in vitro Durch die Fusion von pep4∆ und pho8∆ Vakuolen kommt es zur Prozessierung und Aktivierung von Pho8. Durch die Lyse der Vakuolen und die Zugabe von Substrat kann das Produkt bei 400 nm photometrisch bestimmt werden (Haas, 1995).
Aufgabenstellung
20
2 Aufgabenstellung
Der hexamere HOPS-Komplex übernimmt als Tethering-Faktor eine wichtige Rolle
bei der Fusion von Transportvesikeln mit der Vakuole. Das Zusammenspiel
zwischen der Rab-GTPase Ypt7, den fünf SNARE-Proteinen (Vam3, Vam7, Vti1,
Nyv1 und Ykt6) und HOPS stellt die Basis einer funktionellen Fusionsmaschinerie
an der Vakuole dar, deren konkrete Mechanismen weitgehend unbekannt sind.
In dieser Arbeit soll die Wechselwirkung zwischen HOPS und den vakuolären
SNARE-Proteinen analysiert werden. Die Interaktionsstudien sollen in einem
System aus aufgereinigten Komponenten durchgeführt werden. Auch Hinweise auf
eine veränderte Affinität des HOPS-Komplexes zu assemblierten SNAREs gegenüber
Einzelproteinen soll überprüft werden und zum Verständnis des Zusammenspiels
zwischen HOPS und SNAREs beitragen.
Desweiteren soll mit der Methode der in vitro-Vakuolenfusion die Bedeutung der
Wechselwirkungen zwischen SNARE-Proteinen und dem HOPS-Komplex
untersucht werden.
Zusätzliche mikroskopische Analysen sollen die in vitro erlangten Daten
unterstützen und deren Relevanz in vivo verdeutlichen.
Ergebnisse
21
3 Ergebn isse
3.1 Assemblierung von SNARE-Proteinen
Um Wechselwirkungen der vakuolären SNAREs Vam3, Vam7, Vti1, und Ykt6 bzw.
Nyv1 mit dem HOPS-Komplex in vitro untersuchen zu können, musste
sichergestellt werden, dass die rekombinant aufgereinigten SNAREs funktionell
sind. Voraussetzung dafür ist die Assemblierung von drei Q-SNAREs und einem R-
SNARE (3Q1R-Komposition) zu einem Komplex, der dem trans-SNARE-Komplex in
vivo entspricht (Fasshauer et al., 1998). Dass prinzipiell eine in vitro-Assemblierung
der vakuolären SNAREs möglich ist, wurde bereits gezeigt (Fukuda et al., 2000).
Unter modifizierten Bedingungen sollen die vakuolären SNAREs auf ihre in vitro
Assemblierung getestet werden.
An der Vakuole existieren zwei unterschiedliche SNARE-Komplexe, die sich nur in
ihrem R-SNARE unterscheiden: Nyv1 ist an der homotypischen Vakuolenfusion
beteiligt, während Ykt6 als R-SNARE an anderen Fusionsprozessen an der Vakuole
involviert ist (Dilcher, 2001). Zur in vitro-Assemblierung dieser beiden vakuolären
SNARE-Komplexe wurde das Syntaxin-Homolog Vam3 als GST-Fusionsprotein
aufgereinigt, während alle übrigen SNAREs mit einem His6-tag versehen waren. Um
hydrophobe Wechselwirkungen während der Assemblierung und
Löslichkeitsprobleme bei der Aufreinigung der Einzelproteine zu vermeiden, wurden
von Vam3, Vti1 und Nyv1 verkürzte Versionen ohne Transmembrandomäne (TMD)
hergestellt (Abb. 3.1A). Nach Inkubation der aufgereinigten Proteine konnte über
eine GST Affinitätsmatrix der assemblierte SNARE-Komplex isoliert und auf einem
12% SDS-Polyacrylamidgel analysiert werden. Ein zusätzlicher Ansatz bei dem nur
GST anstelle von GST-Vam3 verwendet wurde, diente als Negativkontrolle, um
unspezifische Bindungen an die Matrix auszuschließen (Abb. 3.1B).
Ergebnisse
22
A B
Abbildung 3.1: Assemblierung von SNARE-Proteinen A: Schematische Darstellung der aufgereinigten SNARE-Proteine. Die Scherensymbole weisen auf den Ort der Verkürzungen hin. Die Zahlen geben die Aminosäurereste an. B: 10 µg von GST-Vam3 wurden mit jeweils 12 µg der His6-Fusionsproteine bei 4°C inkubiert. Der Komplex wurde anschließend über das GST-Vam3-Fusionsprotein an Glutathion Sepharose gebunden. Nach vier Waschschritten wurde der Komplex durch Aufkochen in zweifachem Laemmlipuffer eluiert. Die Analyse der assemblierten SNAREs erfolgte mittels eines Coomassie-gefärbten 12% Polyacrylamidgels. Der Thioredoxin-tag von Nyv1 vergrößert das Protein um ca. 10 kDa.
Die aufgereinigten SNARE-Proteine assemblieren stöchiometrisch zu einem stabilen
Komplex mit einer 3Q1R Komposition (Abb. 3.1B). Es kann daher von einem
aktiven SNARE-Komplex mit funktionellen Einzelproteinen ausgegangen werden.
Dies schafft die Voraussetzung für weitere Analysen, an denen der assemblierte
Komplex und die einzelnen SNARE-Proteine beteiligt sind.
3.2 Die Wechselwirkung von SNARE-Proteinen mit dem
HOPS-Komplex
Der hexamere HOPS-Komplex agiert als Tethering-Komplex an der Vakuole.
Interaktionen mit SNARE-Proteinen und die Affinität zum vakuolären
membranassoziierten trans-SNARE-Komplex weisen auf ein Zusammenspiel mit
SNARE-Proteinen hin (Dulubova et al., 2001; Stroupe et al., 2006; Collins und
Wickner, 2007). Die beobachtete Wechselwirkung zwischen HOPS und SNAREs
trägt möglicherweise zur selektiven Assemblierung der vakuolären SNAREs bei. Eine
direkte Wechselwirkung des HOPS-Komplexes mit dem vakuolären SNARE-
Komplex wäre ein Hinweis auf eine HOPS-vermittelte SNARE-Spezifität an der
Vakuole, da sie auf eine Erkennung des vakuolären SNARE-Komplexes schließen
ließe.
Ergebnisse
23
Ein Hefestamm, der alle sechs Untereinheiten des HOPS-Komplexes
überproduziert, wurde zur Aufreinigung des Komplexes verwendet. Die HOPS-
Untereinheit Vps41 wurde dazu mit einem TAP-tag versehen. Über immobilisierte
IgG konnte dann Vps41 mit seinen Interaktionspartnern affinitätsaufgereinigt
werden. Die Aktivität des HOPS-Komplexes ist die Voraussetzung für
Interaktionsstudien mit SNARE-Proteinen. Die Methode der in vitro Vakuolenfusion
wurde zur Überprüfung der Aktivität herangezogen. Dazu wurden aufgereinigte
Wildtyp-Vakuolen in Anwesenheit unterschiedlicher HOPS-Konzentrationen
fusioniert. Die konzentrationsabhängige Fusionsstimulation der Vakuolen durch den
HOPS-Komplex bestätigt die Funktionalität des aufgereinigten Komplexes (Abb.
3.2).
Abbildung 3.2: Überprüfung der Aktivität des aufgereinigten HOPS-Komplexes Wildtyp-Vakuolen wurden für 90 min bei 26°C in Anwesenheit von unterschiedlichen HOPS-Konzentrationen fusioniert und anschließend entwickelt. Die Quantifizierung der Fusion erfolgte photometrisch bei 400 nm.
Um die Wechselwirkung zwischen dem HOPS-Komplex und dem vakuolären
SNARE-Komplex näher zu untersuchen, wurde der präassemblierte SNARE-
Komplex wie zuvor über ein GST-Vam3-Fusionsprotein an eine Matrix gebunden
und mit dem aufgereinigten HOPS-Komplex inkubiert. Nach der Elution von der
Matrix wurden die Proteine über eine SDS-PAGE aufgetrennt (Abb. 3.3A).
Ergebnisse
24
A B
Abbildung 3.3: Wechselwirkung zwischen dem HOPS und dem SNARE-Komplex A: Assemblierte SNAREs mit HOPS (1), ohne HOPS (2) und GST als Kontrolle (3). B: Assemblierte SNAREs (1, 2), GST-Vam3 (3) und GST (4) wurden mit Zelllysat, das aus 500 OD600 Einheiten Zellen gewonnen wurde, inkubiert. Unten: Kontrastierter Ausschnitt des gebundenen HOPS-Komplexes. Die SNARE-Assemblierung erfolgte wie in Abb. 2.1 beschrieben. Die Inkubation mit aufgereinigtem HOPS bzw. Hefelysaten betrug 2h bei 4°C. Die Analyse erfolgte über eine SDS-PAGE mit einem 12% SDS-Polyacrylamidgel, das anschließend mit Coomassie gefärbt wurde.
Der HOPS-Komplex konnte neben den SNARE-Proteinen in dem SDS-
Polyacrylamidgel nachgewiesen werden, was auf eine Interaktion zwischen dem
assemblierten SNARE-Komplex und dem aufgereinigten HOPS-Komplex schließen
ließ (Abb. 3.3A).
Um die Spezifität dieser Wechselwirkung zu verifizieren, wurden die assemblierten
SNAREs mit dem Lysat eines HOPS überproduzierenden Stammes, der auch für die
Aufreinigung des HOPS-Komplexes diente, inkubiert. Die weitere Vorgehensweise
glich dem Versuch mit aufgereinigten Komponenten. Die Affinität des Tethering-
Komplexes zu dem SNARE-Komplex ist sehr stark und kann nach zwei Stunden
Inkubationszeit sogar mit der relativ unempfindlichen Coomassiefärbung
nachgewiesen werden (Abb. 3.3B).
3.2.1 Der HOPS-Komplex bindet die PX-Domäne von Vam7
Von Stroupe et al. 2006 wurde bereits eine Bindung des HOPS-Komplexes an die PX-
Domäne von Vam7 beschrieben. Um Aussagen über die Wechselwirkung des HOPS-
Ergebnisse
25
Komplexes mit dem assemblierten SNARE-Komplex treffen zu können, musste
daher untersucht werden, ob es sich um eine spezifische Bindung des HOPS-
Komplexes an assemblierte SNAREs oder um eine Bindung an Einzelproteine
handelt. Dazu wurden alle SNAREs als GST-Fusionsproteine aufgereinigt und einzeln
mit dem HOPS-Komplex inkubiert, bevor sie über eine GST Affinitätsmatrix isoliert
wurden.
Das Qc-SNARE Vam7 weist eine Interaktion mit dem HOPS-Komplex auf, wie sie
unter modifizierten Bedingungen schon von Stroupe et al. gezeigt wurde (Stroupe et
al., 2006). Die SNAREs Vti1, Vam3 und Ykt6 zeigen als Einzelproteine keine Affinität
zum HOPS (Abb. 3.4).
Abbildung 3.4: Wechselwirkung zwischen HOPS und einzelnen SNARE-Proteinen GST-SNAREs und GST wurden mit (+) und ohne (-) HOPS bei 4°C inkubiert und an Glutathion Sepharose gebunden. Die Elution erfolgte durch Zugabe von Laemmli-Puffer und anschließendem Aufkochen bei 95°C. Die Auftrennung des Eluats erfolgte mit einem 12% SDS-Polyacrylamidgel, die Färbung des Polyacrylamidgels mit Hilfe von Coomassie.
Somit kann die bereits beschriebene Wechselwirkung des HOPS-Komplexes aus
Zelllysaten und lysierten Vakuolen mit Vam3 unter den hier verwendeten
Bedingungen nicht bestätigt werden (Abb. 3.4) (Sato et al., 2000; Dulubova et al.,
2001).
Um als nächstes die Bindedomäne von Vam7 einzugrenzen, wurden verkürzte
Versionen von Vam7 rekombinant aufgereinigt und auf ihre Interaktion mit dem
HOPS-Komplex getestet.
Der HOPS-Komplex bindet an die etwa 190 Aminosäurenreste große PX-Domäne
von Vam7. Mit dieser Beobachtung wurden unter modifizierten Bedingungen die
Ergebnisse vorheriger Studien bestätigt (Abb. 3.5) (Stroupe et al., 2006).
Ergebnisse
26
Abbildung 3.5: Identifizierung der HOPS-Bindedomänen von Vam7 Aufgereinigtes GST-Vam7, GST-Vam7SD (SNARE-Domäne), GST-Vam7PX (PX-Domäne) und GST wurden mit HOPS inkubiert. Weitere Vorgehensweise siehe Abb. 2.3. Auf ein 12% Polyacrylamidgel wurden jeweils 50% und 25% des Eluats aufgetragen. Die Färbung erfolgte mit Coomassie.
Die SNARE-Assemblierungen in den folgenden Interaktionsstudien wurden mit der
Vam7-SNARE-Domäne (Vam7SD) anstatt des Volllängen-Vam7 durchgeführt, da
diese Domäne nachweislich keine Interaktion mit dem HOPS-Komplex eingeht
(Abb. 3.5) (Stroupe et al., 2006).
3.2.2 Der HOPS-Komplex bindet assemblierte Q-SNAREs
Trotz der fehlenden PX-Domäne von Vam7, die eine HOPS-Bindedomäne darstellt,
weist der assemblierte SNARE-Komplex eine Affinität zum HOPS-Komplex auf (Abb.
3.6) (Stroupe et al., 2006). Eine weitere Reduktion des assemblierten SNARE-
Komplexes auf einen minimalen SNARE-Komplex soll die Bindedomäne des HOPS-
Komplexes eingrenzen.
Wurde der 3Q1R SNARE-Komplex auf einen Komplex mit ausschließlich Q-SNAREs
reduziert, blieb die Affinität zum HOPS-Komplex erhalten. Demzufolge ist das R-
SNARE weder als Einzelprotein noch im assemblierten SNARE-Komplex an der
Bindung des HOPS-Komplexes beteiligt (Abb. 3.6, 3.4).
Ergebnisse
27
Abbildung 3.6: Wechselwirkung zwischen HOPS und assemblierten SNARE-Proteinen 3Q1R-SNARE (2) und 3Q-SNAREs (3) wurden mit HOPS inkubiert. Vam7 wurde ohne PX-Domäne (Vam7SD) als GST-fusioniertes Protein eingesetzt. Als Kontrolle wurde GST alleine anstelle von GST-Vam7SD mit HOPS inkubiert. Die Proteine wurden auf einem SDS-Polyacrylamidgel analysiert. Die Färbung erfolgte mit Coomassie.
Um die Bindedomäne des HOPS-Komplexes zum assemblierten SNARE-Komplex
weiter einzugrenzen, wurde das Syntaxin-Homolog Vam3 N-terminal verkürzt. Da
die Bindung des HOPS-Komplexes an den N-terminalen Bereich von Vam3 in einem
System mit aufgereinigten Komponenten bisher nicht gezeigt werden konnte, ist
unklar, welchen Bedingungen und zusätzlichen Faktoren diese Wechselwirkung
unterliegt. Um einen Einfluss der N-terminalen Domäne von Vam3 auf die HOPS-
Interaktion ausschließen zu können, wurde ein minimaler Q-SNARE-Komplex aus
Vti1, Vam7SD und N-terminal verkürztem Vam3 gebildet (Abb. 3.7A, B). Dieser
wurde anschließend auf die Interaktion mit HOPS getestet.
Ergebnisse
28
A B
Abbildung 3.7: Wechselwirkung des HOPS mit dem minimalen Q-SNARE-Komplex A: Schematische Darstellung der SNARE-Proteine Vam7 und Vam3 und deren N-terminalen Verkürzungen Vam7SD und Vam3∆N. B: Der minimale Q-SNARE-Komplex wurde mit dem HOPS-Komplex inkubiert. Es wurden zwei Ansätze mit einfacher und zehnfacher Vam3∆N Konzentration verwendet. Als Negativkontrolle dient GST anstelle von GST-Vam7SD. Die Auftrennung der Proteine erfolgte über eine SDS-PAGE. Die Färbung des Polyacrylamidgels erfolgte mit Coomassie.
Der HOPS-Komplex wies weiterhin eine Interaktion mit diesem minimalen Q-
SNARE-Komplex auf (Abb. 3.7B). Die Bindedomäne reduziert sich demzufolge auf
den assemblierten Bereich der SNARE-Motive, den sogenannten SNARE-
Kernkomplex. Daher sollte eine Korrelation zwischen der Menge an assembliertem
Q-SNARE-Komplex und der Interaktion mit dem HOPS-Komplex zu beobachten
sein. Eine Titration mit zwei unterschiedlichen Konzentrationen (1x; 10x) von
Vam3 ohne N-Terminus (V3∆N) zu einer konstanten Vti1- und GST-Vam7SD-
Konzentration zeigte einen unterschiedlichen Assemblierungsstatus, da das
verkürzte Vam3 den limitierenden Faktor bei der Assemblierung darstellte (Abb.
3.7B). Werden beide Ansätze mit der gleichen Menge HOPS inkubiert, zeigen die
Komplexe eine assemblierungsabhängige Affinität zum HOPS-Komplex. Der
assemblierte minimale Q-SNARE-Komplex bietet dem HOPS-Komplex eine
Bindedomäne, die möglicherweise der Komplexerkennung dient.
3.2.3 Wechselwirkung mit HOPS-Untereinheiten
In der folgenden Studie wurde untersucht, welche HOPS-Untereinheiten
Interaktionen mit SNARE-Proteinen oder SNARE-Komplexen eingehen können.
Um die Rolle der HOPS-Untereinheiten bei der Interaktion mit SNARE-Komplexen
zu analysieren, wurden die einzelnen HOPS-Untereinheiten als TAP-
Fusionsproteine in Hefezellen überproduziert und über immobilisierte IgG
Ergebnisse
29
aufgereinigt (siehe Methoden). Die Interaktionsanalysen wurden wie zuvor über
immobilisierte GST-Fusionsproteine durchgeführt. Erste Untersuchungen zeigten
eine Bindung von Vps16, Vps18 und Vps33 an assemblierte Q-SNAREs, während
dies für Vps41, Vps39 und Vps11 nicht der Fall war (Abb. 3.8A, B). Die
interagierenden Untereinheiten wurden anschließend zur Affinitätsanalyse mit
einzelnen SNARE-Proteinen herangezogen.
A B
Abbildung 3.8: Wechselwirkung zwischen HOPS-Untereinheiten und SNAREs A: Interaktion von Vps41, Vps39, Vps11 mit dem minimalen Q-SNARE-Komplex (Q-SNAREs truncated) mit zwei unterschiedlichen Vam3∆N Konzentrationen (2, 3). Als Positivkontrolle diente der aufgereinigte HOPS-Komplex. Die Inkubation mit den HOPS-Untereinheiten erfolgte für 2 h, die Inkubation mit den GSH-beads für 30 min. Nach dem Waschen und der Elution durch Kochen bei 95°C in einfachem Ladepuffer erfolgte die Analyse über ein 15% SDS-PAGE Gel und anschließendem Westernblot. Der Nachweis erfolgt über einen Antikörper gegen das Calmodulin Peptid, das nach der TEV-Elution an den HOPS-Untereinheiten verbleibt. B: Interaktion von Vps16, Vps18 und Vps33 mit einzelnen SNARE-Proteinen (2-7), dem assemblierten SNARE-Komplex (complete), Q-SNAREs und dem minimalen Q-SNARE-Komplex (Q-SNAREs truncated) mit zwei unterschiedlichen Vam3∆N Konzentrationen. Vorgehensweise wie in a beschrieben. Ein beispielhaftes Coomassie-gefärbtes Gel dient der Ladekontrolle der SNAREs (unten). Für Western-Blots wurde 20% und für Coomassie gefärbte Gele 80% einer Standard SNARE-Assemblierung (siehe Methoden) aufgetragen.
Das SM-Protein Vps33 zeigte im Vergleich zu den HOPS-Untereinheiten Vps16 und
Vps18 keine Interaktion mit Vam7, allerdings eine Affinität zum assemblierten
SNARE-Komplex. Diese komplexspezifische Bindung konnte auch für Vps16 und
Vps18 beobachtet werden (Abb. 3.8B). Die Interaktion von Vps16, Vps18 und Vps33
mit dem minimalen Q-SNARE-Komplex (Q-SNAREs truncated) zeigt, dass nicht nur
Ergebnisse
30
die PX-Domäne von Vam7 eine Bindestelle für den HOPS-Komplex bereitstellt,
sondern auch eine zweite Bindedomäne über die Assemblierung der Q-SNAREs
entsteht.
3.3 Funktionelle Analysen zur HO PS-SNARE Wechs el-
wirkung
Die Wechselwirkung des HOPS-Komplexes mit der PX-Domäne von Vam7 und dem
assemblierten Q-SNARE-Komplex deutet auf mindestens zwei unterschiedliche
Bindestellen im HOPS-Komplex für den funktionellen SNARE-Komplex hin. Im
Folgenden soll die funktionelle Bedeutung der SNARE-HOPS-Wechselwirkung mit
der Methode der in vitro-Vakuolenfusion untersucht werden.
3.3.1 Der Einfluss des N-Terminus von Vam3 und Vam7
Um die Bedeutung der Wechselwirkungen zwischen den SNARE-Proteinen und dem
HOPS-Komplex analysieren zu können, müssen sie getrennt von einander
betrachtet werden. Es muss daher zuerst die funktionelle Bedeutung der Interaktion
des HOPS-Komplexes mit dem N-Terminus von Vam3 und Vam7 auf die
Vakuolenfusion analysiert werden, bevor die Relevanz der Wechselwirkung von
HOPS mit assemblierten Q-SNAREs verifizieren werden kann.
Die Interaktion von Vam3 mit dem HOPS-Komplex konnte in dem hier
verwendeten System mit aufgereinigten Komponenten nicht gezeigt werden,
dennoch beschreiben andere Studien mit Zelllysaten, dass der N-terminale Bereich
mit dem HOPS-Komplex interagiert und regulatorische Aufgaben während der
Fusion mit der Vakuole übernimmt (Dulubova et al., 2001; Laage und Ungermann,
2001; Pieren et al., 2010).
Die Wechselwirkung des HOPS-Komplexes mit der N-terminalen PX-Domäne von
Vam7 konnte zuvor von Stroupe et al. mit aufgereinigten Proteinen belegt und in
der vorliegenden Arbeit bestätigt werden (Stroupe et al., 2006).
Ergebnisse
31
Vam7SD ist ausreichend für eine Fusionsstimulation in vitro
Der Einfluss der N-terminalen Domänen von Vam3 und Vam7 auf die in vitro
Vakuolenfusion soll Hinweise auf die funktionelle Bedeutung der HOPS-SNARE
Wechselwirkungen geben. Dazu wurden Vakuolen aus Hefestämmen isoliert, die ein
N-terminal verkürztes Vam3 (Vam3∆N) anstelle eines Volllängenproteins
exprimieren. Da es auf Grund der fragmentierten Vakuolen nicht möglich ist, diese
aus Stämmen mit Vam7 ohne PX-Domäne aufzureinigen, wurde rekombinant
aufgereinigtes Vam7SD zu der Fusion von Vam3∆N und Wildtyp-Vakuolen titriert,
um das endogene Vam7 aus den SNARE-Komplexen zu verdrängen und somit
Vam7∆PX Vakuolen zu simulieren. Wird rekombinant aufgereinigtes Vam7 bzw.
Vam7SD der Fusion zugesetzt, folgt eine ATP-unabhängige Stimulation der Fusion
(Abb. 3.9) (Thorngren et al., 2004; Fratti und Wickner, 2007). Die Wildtyp- und die
Vam3∆N-Vakuolen zeigen bei der Titration von Vam7 und Vam7SD eine Fusion, die
anfangs konzentrationsabhängig ansteigt. Ab etwa 0,7 µM Vam7 erreicht die
Fusionsrate die Sättigung, während die Vam7SD-abhängigen Fusionen einen
annähernd linearen Anstieg zeigen.
Abbildung 3.9: Analyse der Fusion von Wildtyp- und Vam3∆N-Vakuolen Aufgereinigte Vakuolen aus BJ- bzw. DKY-Wildtyp (wt) und Vam3∆N-Stämmen wurden unter der Zugabe von Vam7 bzw. Vam7SD für 90 min bei 26°C fusioniert und anschließend entwickelt.
Der Verläufe der gemessenen Fusionsraten der Vam3∆N- und der Wildtyp-Vakuolen
sind sehr ähnlich. Sie unterscheiden sich nur in ihrer maximalen Fusionsrate. Die
Vam3∆N-Vakuolen zeigen unter gleichen Bedingungen nur die Hälfte der
Fusionsaktivität der Wildtyp-Vakuolen (Abb. 3.9).
Die PX-Domäne von Vam7 und der N-Terminus von Vam3 steigern unter den
gewählten Bedingungen die Fusionseffizienz aufgereinigter Vakuolen. Sie sind aber
Ergebnisse
32
für die Fusion nicht zwingend notwendig, da die Vam7SD-abhängige Fusion von
Vam3∆N-Vakuolen zu einer Stimulation der Fusion führt, ohne dass die
N-terminalen Domänen von Vam7 und Vam3 an der Fusion beteiligt sind.
Die PX-Domäne von Vam7 kann durch einen Palmitoylanker ersetzt werden
Die PX-Domäne von Vam7 ist nicht nur eine Bindedomäne für den HOPS-Komplex,
sondern vorwiegend ein Membrananker und Sensor für Phosphoinositol-3-
Phosphat (PI3P). Daher kann der Einfluss von Vam7SD auf die Vakuolenfusion zwei
Ursachen haben. Eine Ursache für die niedrige Fusionsrate kann die fehlende
Membranassoziation sein. Eine weitere ist die fehlende HOPS-Interaktion die
möglicherweise zur Stimulation der Fusion beiträgt. Um zwischen diesen beiden
Einflüssen unterscheiden zu können, wurde Vam7 nicht über die PX-Domäne an die
Vakuolenmembran gebunden, sondern über einen Palmitoylanker. Dazu wurde die
PX-Domäne von Vam7 durch die ersten 18 Aminosäurereste von Vac8 ersetzt (Pal-
Vam7∆PX), was zu einer N-terminalen Membranbindung von Vam7 ohne
zusätzliche Bindedomäne für den HOPS-Komplex führt.
Die Zellen mit palmitoyliertem Vam7 (Pal-Vam7∆PX) zeigen in vivo vorwiegend
runde Vakuolen, was auf eine funktionelle vakuoläre Fusionsmaschinerie schließen
lässt und die Voraussetzung für in vitro-Vakuolenfusionen darstellt. Die Interaktion
des HOPS-Komplexes mit Vam7 ist nach diesen Ergebnissen nicht für die Fusion
mit der Vakuole essentiell (Abb. 3.10).
Ergebnisse
33
Abbildung 3.10: Vakuolenmorphologie der Zellen ohne Vam7 PX-Domäne Wildtyp (wt) oder vam7∆ Zellen mit Vam7, palmitoyliertem Vam7 (Pal-Vam7∆PX) und palmitoyliertem Vam7 mit zusätzlich N-terminal verkürztem Vam3 (Pal-Vam7∆PX Vam3∆N) wurden in YPD kultiviert und mit FM4-64 gefärbt. Die Analyse der Vakuolenmorphologie erfolgte über Fluoreszenzmikroskopie. Der weiße Balken repräsentiert 10 µm.
Auch eine zusätzliche Deletion der ersten 145 Aminosäurereste von Vam3 zeigt
keinen Einfluß auf die Vakuolenmorphologie (Abb. 3.10). Es ist allerdings bei etwa
20% der Zellen ein Zytokinesedefekt zu erkennen (Abb. 3.14B). Die Funktionalität
des Pal-Vam7∆PX Vam3∆N wird ausführlich in Kapitel 3.4 untersucht.
Der Vergleich der Fusionsaktivität der Pal-Vam7∆PX- und der Pal-Vam7∆PX
Vam3∆N-Vakuolen mit denen des Wildtyps soll Hinweise auf die Rolle der N-
terminalen Domänen auf die Vakuolenfusion geben.
Eine ausschließlich ATP-abhängige Fusion ist mit Pal-Vam7-Stämmen nicht
möglich. Eine zusätzliche Vam7-Titration zeigt allerdings eine Stimulation (Abb.
3.11A). Erst eine Optimierung der Fusionsbedingungen unter Zugabe einer
optimalen Vam7- und HOPS-Konzentration ließ eine statistische Auswertung der
Fusionsaktivität zu (Abb. 3.11B).
Ergebnisse
34
A B
Abbildung 3.11: Fusion von Vakuolen mit verkürzten SNAREs A: Wildtyp-Vakuolen und Vakuolen mit verkürztem Vam3 (Vam3∆N) und Vam7 (Pal-Vam7∆PX) wurden für 90 min bei 26°C mit unterschiedlichen Vam7-Konzentrationen inkubiert. Einmal mit (+) und einmal ohne (-) ATP. B: Statistische Auswertung der maximalen Fusionsraten in % auf den Wildtyp bezogen. Zur Optimierung der Fusion wurden 0,7 µM Vam7 und 35 nM HOPS zu den Ansätzen gegeben. Verglichen wurden die Fusionen von Wildtyp (wt), Vam3∆N (V3∆N), Pal-Vam7∆PX (Pal-V7) und Pal-Vam7 Vam3∆N (V3∆N Pal-V7) Vakuolen.
Ein Vergleich der maximalen Fusionsraten unter optimalen Bedingungen zeigt, dass
die substituierte PX-Domäne der limitierende Faktor bei den Fusionen ist, was auf
eine eingeschränkte Mobilität von Vam7 zurückzuführen sein könnte
(Boeddinghaus et al., 2002). Die N-terminale Verkürzung von Vam3 resultiert in
einer verminderten Fusionsrate von etwa 40% bezüglich des Wildtyps. Die Pal-Vam7
Stämme erreichen maximal 20% der Wildtypfusion (Abb. 3.11B). Aufgrund der
geringen Fusionsraten sind die Pal-Vam7-Stämme für weitere Fusionsstudien nicht
geeignet. Für die folgenden Untersuchungen der HOPS-SNARE Wechselwirkungen
werden deshalb die Fusionen mit Wildtyp-Vakuolen durchgeführt.
Da eine verringerte Pho8 Konzentration auf der Vakuole eine weitere Ursache für
die geringe Fusionsaktivität des Pal-Vam7∆PX Vam3∆N Stammes sein könnte, wird
deren Lokalisation und Aktivität in Kapitel 3.4 analysiert.
3.3.2 Der HOPS-Komplex hemmt die Vam7SD-abhängige Fusion in vitro
Die Zugabe von Vam7SD oder Vam7 stimuliert die Vakuolenfusion in vitro (Abb. 3.9).
In dem folgenden Versuch wird der Einfluss des HOPS-Komplexes auf die Vam7SD-
und Vam7-abhängige Fusion untersucht, um mögliche Unterschiede in der
Stimulation der Fusion beobachten zu können. Wie in Abbildung 3.5 gezeigt,
Ergebnisse
35
interagiert die PX-Domäne von Vam7 mit dem HOPS-Komplex. Wird der HOPS-
Komplex zu einer Vam7SD-abhängigen Fusion mit konstanter Vam7SD
Konzentration titriert, dann kommt es zu einer anfänglichen Stimulation der
Fusion, die ihr Maximum bei etwa 40 nM HOPS hat. Höhere HOPS-
Konzentrationen haben eine Hemmung der Fusion bis unter den Ausgangswert zur
Folge (Abb. 3.12).
Abbildung 3.12: Kooperation von SNAREs und HOPS während der Fusion Die Fusion von Wildtyp-Vakuolen wurde durch drei unterschiedliche Vam7SD Konzentrationen (0,175; 0,35 und 0,7 µM) und als Kontrolle von zwei Vam7 Konzentrationen (0,175 und 0,7 µM) stimuliert. Zu den ATP-unabhängigen Fusionsansätzen wurde HOPS in drei unterschiedlichen Konzentrationen (35, 70 und 150 nM) oder das gleiche Volumen an Puffer zugesetzt.
Die Vam7-abhängige Fusion zeigt bei der Zugabe von HOPS eine Stimulation, die
mit steigender Konzentration in eine Sättigung übergeht. Eine
HOPS-konzentrationsabhängige Inhibition der Fusion kann bei diesen Ansätzen
nicht beobachtet werden. Ab einer bestimmten Konzentration gibt es also
Unterschiede bei der HOPS-Stimulation von Vam7SD- und Vam7-abhängiger
Vakuolenfusion. Dieses Ergebnis zeigt eine funktionelle Bedeutung der
Wechselwirkung zwischen dem HOPS-Komplex und der PX-Domäne, die schon
zuvor zwischen den aufgereinigten Proteinen gezeigt werden konnte. Das Fehlen
der PX-Domäne führt in Abhängigkeit von der HOPS Konzentration zum Auslösen
einer proofreading Aktivität des HOPS-Komplexes.
Die durchgeführten Experimente zeigen, dass die N-terminalen Domänen von Vam3
und Vam7 nicht essentiell für die Vakuolenfusion sind. Der stimulierende Effekt der
N-terminalen Domänen auf die Fusion deutet jedoch auf eine regulatorische
Ergebnisse
36
Funktion hin. Die Hemmung der Vam7SD-abhängigen Fusion durch den HOPS-
Komplex bestätigt den regulatorischen Effekt der PX-Domäne und zeigt, dass diese
nicht nur eine Funktion als Membrananker besitzt. Der Zytokinesedefekt, der durch
die Substitution der PX-Domäne von Vam7 und die N-terminale Verkürzung von
Vam3 zu beobachten war, wird in Kapitel 3.4 untersucht.
3.3.3 Der minimale Q-SNARE-Komplex hemmt die Fusion in vitro
Nach der Untersuchung des Einflusses der N-terminalen Domänen von Vam7 und
Vam3 sollen sich die folgenden Untersuchungen auf die Bedeutung der
Wechselwirkung zwischen dem HOPS-Komplex und assemblierten Q-SNAREs bei
der Fusion von Vakuolen fokussieren. Dazu wurde zu einer Vam7- und Vam7SD-
abhängigen Vakuolenfusion mit Wildtyp-Vakuolen der minimale Q-SNARE-Komplex
gegeben (Abb. 3.7B). Die Assemblierung des minimalen Q-SNARE-Komplexes
erfolgte wie bei einer Standard-SNARE-Assemblierung (siehe Methoden) mit GST-
Vam7SD. Zusätzlich wurde der assemblierte Komplex vor der Titration mit HOPS
vorinkubiert oder der HOPS-Komplex alleine zu der Reaktion gegeben (Abb. 3.13B).
Wie zu erwarten war, zeigt die Zugabe von HOPS zu einer Vam7-abhängigen Fusion
eine Stimulation, die in eine Sättigung übergeht. Die Zugabe der Q-SNAREs ohne
HOPS zeigte eine deutliche Hemmung der Fusion. Wurde HOPS mit Q-SNAREs
vorinkubiert und anschließend zu der Fusion titriert, war bis auf die anfängliche
Stimulation, die schon in Abbildung 3.12 zu beobachten war, kein Effekt zu
erkennen (Abb. 3.13A).
Ergebnisse
37
A B
C
Abbildung 3.13: Kompetition von Q-SNAREs mit HOPS A-C: Der minimale Q-SNARE-Komplex wurde an GSH-Sepharose assembliert und mit 15 mM reduziertem Glutathion eluiert. Über eine SpinTrap G-25 Säule wurde das Glutathion entfernet und der Komplex für 2 h mit HOPS oder Puffer inkubiert (B). HOPS, Q-SNAREs oder HOPS und Q-SNAREs wurden zu den Wildtyp-Vakuolen titriert und die Fusion durch Vam7 (0,7 µM) (A) oder durch Vam7SD (C) stimuliert. Alle Reaktionen wurden für 90 min bei 26°C inkubiert und anschließend entwickelt.
Es wurde für dieses Experiment eine Vam7- bzw. Vam7SD-abhängige Fusion
gewählt, da die Zugabe von ATP zur Disassemblierung des Q-SNARE-Komplexes
führen kann. Die Vam7SD-abhängige Fusion zeigt die gleichen Tendenzen wie die
Vam7-abhängige Fusion, allerdings weist sie eine deutlich geringere Fusionsrate auf
(Abb. 3.13C).
Die Vorinkubation des HOPS-Komplexes mit assemblierten Q-SNAREs verhindert
den stimulierenden Effekt des HOPS-Komplexes, was auf eine Blockade einer
essentiellen Bindedomäne des HOPS-Komplexes durch den assemblierten SNARE-
Komplex hinweist.
Ergebnisse
38
3.4 Funktionelle Analyse des Pal-Vam7 Vam3∆N -Stammes
Die Substitution der PX-Domäne von Vam7 durch einen Palmitoylanker und die
zusätzliche N-terminale Verkürzung von Vam3 hat einen Zytokinesedefekt zur
Folge. Die Vakuolen dieses Stammes sind vorwiegend rund und zeigen nur selten
Fragmentierungen. Das Wachstum ist gegenüber dem Wildtyp deutlich verzögert.
Eine Temperaturempfindlichkeit war nicht feststellbar (nicht gezeigte Daten). Im
Folgenden soll der Zusammenhang zwischen dem Zytokinesedefekt und den
verkürzten SNARE-Proteinen untersucht werden. Weiterhin sollen die deutlich
reduzierte Fusionsaktivität der Vakuolen in vitro und die Vakuolendynamik in vivo
analysiert werden.
3.4.1 Untersuchung des Zytokinesedefektes
Der Zytokinesedefekt betrifft etwa 20% der Zellen und macht sich durch
ungewöhnliche Zellformen mit zwei oder mehrere Vakuolen bemerkbar (3.14A, B).
A B
Abbildung 3.14: Quantifizierung des Zytokinesedefekts A: Zellen mit N-terminal verkürztem Vam3 und einer substituierten PX-Domäne von Vam7 zeigen einen Zytokinesedefekt. Zellen wurden bei 30°C in YPD kultiviert und mikroskopisch mit einer DIC-Optik analysiert. Zellen mit einem Zytokinesedefekt sind mit Pfeilen gekennzeichnet. B: Statistische Auswertung des Zytokinesedefekts (n>200).
Ergebnisse
39
Calcofluor white ist ein Fluoreszenzfarbstoff der Chitin anfärbt. Durch Calcofluor
kann der bei der Abschnürung der Tochterzelle zurückbleibende Chitinring, der
auch als Sprossungsnarbe bezeichnet wird, angefärbt werden. Diese mit Chitin
angereicherten Bereiche der Zellwand sind in haploiden Hefezellen axial angeordnet.
Ein Einfluss auf die Lokalisation der Sprossungsnarben kann Auskunft über das
Zusammenspiel der beiden verkürzten SNAREs mit Faktoren geben, die die
Sprossungsseite bestimmen und als bud-site-selection-factors bezeichnet werden
(Roemer et al., 1996).
Abbildung 3.15: Calcofluor-Färbung Für die Analyse der Lokalisation der Sprossungsnarben wurden Wildtyp und Pal-Vam7∆PX Vam3∆N Zellen mit Calcofluor white gefärbt und fluoreszenzmikroskopisch untersucht.
Die Zellen mit der substituierten PX-Domäne von Vam7 und dem verkürzten Vam3
zeigen eine normale Lokalisation der Sprossungsnarben. Sowohl der haploide
Wildtypstamm als auch die haploide Doppelmutante zeigt ein monopolares
Wachstum (Abb. 3.15). Der Zytokinesedefekt ist daher nicht auf einen Defekt in der
räumlichen Organisation der Knospenbildung zurückzuführen.
3.4.2 Analyse der Vakuolendynamik in vivo
Die Substitution der PX-Domäne von Vam7 führt zu einer dramatischen Inhibition
der Vakuolenfusion in vitro. Die Zellen zeigen vorwiegend runde Vakuolen, was aber
auf eine funktionelle Fusionsmaschinerie der Vakuolen in vivo hinweist. Um die
homotypische Vakuolenfusion in vivo zu beurteilen, wurde die Fähigkeit der Vakuolen
untersucht, nach Salzstress-bedingter Fragmentierung wieder zu fusionieren. Dazu
wurden die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase für 10 min in YPD mit
0,4 M NaCl inkubiert und die Vakuolen analysiert. Nach einer Kultivierung von 1 h
Ergebnisse
40
in YPD wurde anschließend die Wiederherstellung (recovery) der ursprünglichen
Vakuolenmorphologie mikroskopisch beurteilt.
A B
Abbildung 3.16: Untersuchung der homotypischen Vakuolenfusion in vivo A: Wildtypzellen und Pal-Vam7∆PX Vam3∆N-Zellen wurden in der logarithmischen Wachstumsphase mit FM4-64 gefärbt (Kontrolle) und anschließend für 10 min in YPD mit 0,4 M NaCl inkubiert (0,4 M NaCl). Nach 1 h Kultivierung in YPD bei 30°C wurde die Vakuolenmorphologie nochmals analysiert (recovery). B: Statistische Auswertung der Wiederherstellung der Vakuolenmorphologie von Wildtyp (wt) und Pal-Vam7∆PX Vam3∆N (Pal-V7 V3∆N) nach 1 h.
Da bei beiden Stämmen eine Wiederherstellung der ursprünglichen
Vakuolenmorphologie beobachtet werden konnte, kann von einer funktionellen
homotypischen Vakuolenfusion in vivo ausgegangen werden. Der Stamm mit den
verkürzten SNARE-Proteinen zeigte schon vor dem Experiment vereinzelt Zellen
mit leicht fragmentierten Vakuolen (Abb. 3.16A). Es war daher keine
hundertprozentige Wiederherstellung zu erwarten. Dieser Aspekt wurde bei der
statistischen Auswertung berücksichtigt (Abb. 3.16B).
Vam3 und Vam7 sind an vielen Fusionsprozessen mit der Vakuole beteiligt. Daher
können sie möglicherweise auch eine Funktion bei der Vererbung von Vakuolen
haben. Ein Defekt in der Vakuolenvererbung könnte sogar den Ablauf des
Zellzyklusses und somit die Zytokinese beeinflussen. Um die Vererbung der
Vakuolen an die Tochterzelle zu untersuchen, wurden diese mit dem lipophilen
Farbstoff FM4-64 angefärbt. Anschließend wurden die Zellen 3 h bei 30°C in YPD
Ergebnisse
41
kultiviert und bezüglich ihres Fluoreszenzsignals in der Tochterzelle quantifiziert
(3.17A, B).
A B
Abbildung 3.17: Untersuchung der Vakuolenvererbung Zellen wurden in der logarithmischen Phase mit FM4-64 gefärbt und 3 h bei 30°C in YPD kultiviert. Anschließend wurden die Zellen bezüglich ihres Fluoreszenzsignals in der Tochterzelle mikroskopisch quantifiziert. A: Beispiel einer Zelle mit Fluoreszenzsignal in der Tochterzelle. B: Statistische Auswertung (n>200). Prozentualer Vergleich zwischen Wildtyp (wt) und Pal-Vam7∆PX Vam3∆N (Pal-V7 V3∆N) Zellen.
Die Zellen des Pal-Vam7∆PX Vam3∆N Stammes zeigen keinen Defekt in der
Weitergabe von Vakuolen an die Tochterzellen. Gegenüber dem Wildtyp kann zwar
ein Unterschied von etwa 25% festgestellt werden, dieser kann allerdings auch auf
die generell etwas kleineren Vakuolen zurückgeführt werden, die in den
Tochterzellen nur zu sehr schwachen Signalen führten (Abb. 3.17).
3.4.3 Lokalisation von Markerproteinen
Zur Charakterisierung des Stammes mit den verkürzten SNARE-Proteinen wurden
deren aufgereinigte Vakuolen lysiert, die Proteine auf einem SDS-Polyacrylamidgel
aufgetrennt und anschließend auf eine Nitrozellulosemembran transferiert.
Antikörper dienten zur Visualisierung ausgewählter Markerproteine. Dabei wurde
der Fokus auf die vakuolären SNAREs Vam3, Vti1, Vam7, Nyv1 gelegt. Vps41 steht
repräsentativ für den HOPS-Komplex und das vakuoläre Membranprotein Vac8
diente als Ladekontrolle (Abb. 3.17). Die korrekte Lokalisation der vakuolären
Ergebnisse
42
alkalischen Phosphatase Pho8 ist die Voraussetzung für den Nachweis der
homotypischen Vakuolenfusion in vitro.
Abbildung 3.18: Lokalisation von Markerproteinen auf der Vakuole 20 µg aufgereinigte BJ Wildtyp (wt), BJ Pal-Vam7 (Pal-V7) und BJ Pal-Vam7∆PX Vam3∆N (Pal-V7 V3∆N) Vakuolen wurden mit 0,5% TritonX-100 lysiert und mit TCA gefällt. Die Analyse erfolgte auf einem 12% SDS-Polyacrylamidgel mit anschließendem Westernblotting. Der Nachweis erfolgte über entsprechende primäre Antikörper und einen Fluoreszenz-konjugierten sekundären Antikörper.
Die Pal-Vam7∆PX Vakuolen weisen im Vergleich zum Wildtyp eine deutlich
geringere Vam3-Konzentration auf, während die SNAREs Vti1 und Nyv1 in gleicher
Menge vorliegen. Auch der Gehalt von Vps41 ist auf allen Vakuolen sehr ähnlich.
Wildtyp-Vakuolen zeigen eine deutlich höhere Pho8-Konzentration im Vergleich zu
Pal-Vam7∆PX-Stämmen (Abb. 3.18).
Die Analyse der Lokalisation der vakuolären Kinase Yck3 soll Aufschluss über die
Funktionalität des AP-3-Transportweges geben, da neben der alkalischen
Phosphatase Pho8, Nyv1 und Vam3 auch Yck3 diesen Transportweg zur Vakuole
nutzt. Weiterhin soll die Lokalisation des HOPS-Komplexes untersucht werden, um
eine Fehllokalisation des Komplexes in der Doppelmutante als Ursache für die
Defizite in der Fusionsaktivität ausschließen zu können. Für diese Untersuchungen
wurden die Markerproteine Vps39, Vps41 und Yck3 im Wildtyp- und im Pal-
Vam7∆PX Vam3∆N-Stamm N-terminal mit einem GFP-Protein fusioniert. Die
Ergebnisse
43
fluoreszenzmikroskopische Auswertung belegte in beiden Stämmen eine normale
Lokalisation von Vps39 und Yck3. Während Vps39 partiell angereichert an der
Vakuole lokalisiert, zeigt das GFP fusionierte Yck3 ein homogenes Signal an der
vakuolären Membran (Abb. 3.19).
Abbildung 3.19: Lokalisation von GFP-fusionierten Markerproteinen Die Markerproteine Vps39, Vps41 und Yck3 wurden in Wildtypzellen und Pal-Vam7∆PX Vam3∆N Zellen N-terminal mit GFP fusioniert. In der logarithmischen Wachstumsphase wurden die Zellen geerntet und mit PBS gewaschen bevor sie fluoreszenzmikroskopisch analysiert wurden.
Die Lokalisation von Vps41 in der Doppelmutante mit verkürztem Vam3 und Vam7
unterscheidet sich etwas vom Wildtyp. In den Zellen der Doppelmutante ist das
Signal für GFP-Vps41 nicht bevorzugt an der Vakuole zu erkennen, wie es für den
Wildtyp der Fall ist, sondern im gleichen Maße im Zytosol (Abb. 3.19).
3.4.4 Untersuchung der Fusionseigenschaften von Pal-Vam7 Vam3∆N-
Vakuolen in vitro
Der Hefestamm mit der substituierten PX-Domäne von Vam7 und dem N-terminal
verkürzten Vam3 wurde zur Untersuchung der HOPS-SNARE Wechselwirkung
konstruiert. Die in vitro Fusion der aufgereinigten Vakuolen war nur durch die
Zugabe von rekombinanten Vam7 möglich. Trotz dieser zusätzlichen Stimulation
konnte nur etwa 50% der maximalen Fusion vom Wildtyp erreicht werden. Zu
untersuchen ist daher die Präsenz und die Prozessierbarkeit der alkalischen
Phosphatase Pho8 in diesem Stamm, da diese eine Schlüsselrolle bei der Methode
der Valuolenfusion in vitro spielt. Dazu wurden BJ-Vakuolen des Wildtyps, der Pal-
Vam7 und Pal-Vam7 Vam3∆N Mutanten aufgereinigt, lysiert und mit Proteinase K
Ergebnisse
44
versetzt. Die Prozessierung von Pho8 erfolgte bei 26°C für 20 min. Die Entwicklung
der Proben und die photometrische Quantifizierung erfolgte wie bei der in vitro
Vakuolenfusion. Berechnet wurde die Pho8-Aktivität in Prozent zum Wildtyp.
Abbildung 3.20: Pho8-Aktivität im Vergleich zum Wildtyp 15 µg Vakuolen wurden mit TritonX-100 lysiert und mit Fusionspuffer versetzt. Nach der Zugabe von 5 µg Proteinase K wurden die Ansätze (jeweils ein Ansatz ohne und zwei Ansätze mit Proteinase K) für 20 min bei 26°C inkubiert und anschließend für 10 min bei 30°C entwickelt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 1 M Glycin pH 11,5 gestoppt und das umgesetzte Substrat bei 400 nm photometrisch quantifiziert. Die Proben ohne Proteinase K dienten als Referenz bei der photometrischen Messung.
Die Pal-Vam7-Mutanten zeigen eine verringerte Pho8-Aktivität von ca. 60% der
Aktivität des Wildtyps (Abb. 3.20).
Nicht nur die Funktionalität der Fusionsmethode kann ein Grund für die geringe
Fusionsaktivität der Pal-Vam7-Vakuolen sein. Möglicherweise hat der
Palmitoylanker von Vam7 einen direkten Einfluß auf die homotypische
Vakuolenfusion in vitro. Um dies zu testen, wurde ein Hefestamm konstruiert, in
dem zusätzlich zum endogenen Vam7 mit der PX-Domäne auch Pal-Vam7
exprimiert wird. Sowohl das endogene als auch das Vam7 mit dem Palmitoylanker
sind auf der Vakuole vertreten, wenn sie in der Zelle koexprimiert werden (Abb.
3.21A).
Ergebnisse
45
A B
Abbildung 3.21: Untersuchung der Fusionsinhibition durch palmitoyliertes Vam7 A: 15 µg lysierte Vakuolen wurden TCA gefällt und in Laemmlipuffer resuspendiert. Die präzipitierten Proteine wurden mit einem 12% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und geblottet. Der Nachweis von Vam7 und Pal-Vam7 auf Wildtyp-Vakuolen mit und ohne Koexpression von Pal-Vam7 erfolgte über Vam7 Antikörper und einen fluoreszierenden sekundären Antikörper. B: Vergleich der Fusionsaktivität des Wildtyps ohne Pal-Vam7 (wt) und zusätzlicher Expression von Pal-Vam7 (Pal-V7 V7).
Der Vergleich mit dem Wildtyp zeigt, dass die zusätzliche Expression von Pal-Vam7
keinen signifikanten Einfluss auf die in vitro-Vakuolenfusion besitzt (Abb. 3.21B).
Das palmitoylierte Vam7 zeigt eine Doppelbande, die möglicherweise durch
palmitoyliertes und nicht palmitoyliertes Vam7 bedingt ist (Abb. 3.21A).
Diskussion
46
4 Diskussion
Die zu diskutierenden Ergebnisse wurden bereits in Kapitel 3 ausführlich
beschrieben. Es konnte eine Wechselwirkung zwischen dem assemblierten
vakuolären Q-SNARE-Komplex und dem HOPS-Komplex beobachtet werden, die auf
die Untereinheiten Vps16, Vps18 und Vps33 zurückzuführen ist. Eine weitere
Wechselwirkung des HOPS-Komplexes mit der N-terminalen PX-Domäne von
Vam7 wird über die Untereinheiten Vps16 und Vps18 vermittelt.
Mit in vitro-Vakuolenfusionen konnte außerdem gezeigt werden, dass die
Wechselwirkung zwischen dem HOPS-Komplex und Vam7 für eine funktionelle
Fusionsmaschinerie nicht notwendig ist. Dies trifft auch auf die Wechselwirkung
zwischen der N-terminalen Domäne von Vam3 und dem HOPS-Komplex zu, die
bereits in vorherigen Studien beschrieben wurde, jedoch unter den verwendeten
Bedingungen nicht bestätigt werden konnte. In diesem Zusammenhang ließ sich bei
einer alternativen vakuolären Membranassoziation von N-terminal verkürztem
Vam7 ohne PX-Domäne und einer zusätzlichen Verkürzung von Vam3 ein
Zytokinesedefekt beobachten.
Weitere Experimente zeigten, dass die Wechselwirkung zwischen dem HOPS-
Komplex und assemblierten Q-SNAREs für die Stimulation der Fusion ausreichend
ist.
In dem Fall, dass bei der Fusion aufgereinigter Vakuolen nur der C-terminale Bereich
von Vam7 anstelle des Volllängen-Proteins an der Fusion beteiligt war, konnte eine
Hemmung der Fusion durch den HOPS-Komplex beobachtet werden.
In den folgenden Kapiteln werden die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit diskutiert
und mit denen vorheriger Studien in Zusammenhang gebracht.
4.1 Die W echs elwirkung zwischen HOPS und SNAREs im
aufger einigt en Syst em
4.1.1 Assemblierung eines SNARE-Komplexes
In der Zelle vermitteln SNARE-Proteine durch die Zusammenlagerung ihrer
SNARE-Motive die Fusion von Vesikeln mit der Donormembran. Die Assemblierung
Diskussion
47
erfolgt in einer 3Q1R Stöchiometrie. Es entsteht ein Bündel aus vier Helices
(Fasshauer et al., 1998). Kristallstrukturen eines minimalen neuronalen SNARE-
Komplexes aus rekombinant aufgereinigten Komponenten zeigten, dass eine in vitro
Assemblierung zur Ausbildung eines α-helikalen coiled-coil Komplexes, dem sog.
SNARE-Komplex führt (Fasshauer et al., 1998; Sutton et al., 1998). Daraus wurde
geschlossen, dass keine weiteren Faktoren zur Bildung eines SNARE-Komplexes
benötigt werden und der in vitro assemblierte Komplex funktionell ist. Die
Funktionalität rekombinant aufgereinigter SNARE-Proteine wurde bereits durch in
vitro Fusionen von rekonstituierten Liposomen belegt (Weber et al., 1998; Mima et
al., 2008). Die Assemblierung einzelner, rekombinant aufgereinigter SNARE-
Proteine zu einem funktionellen SNARE-Komplex bildet die Grundlage dieser Arbeit.
Sie befasst sich mit der vakuolären Fusionsmaschinerie und fokussiert sich somit
auf die dort agierenden SNARE-Proteine Vti1, Vam3, Vam7, Nyv1 und Ykt6. Um
hydrophobe Wechselwirkungen der Transmembrandomänen in vitro zu vermeiden,
wurde für die Assemblierung der SNARE-Proteine nur die zytoplasmatischen
Domänen verwendet. Wie bereits in Kapitel 1.4.2 erwähnt, übernehmen die
Transmembrandomänen der SNARE-Proteine auch eine wichtige Rolle bei der
Fusion. Da sie aber in die Membran integrieren und daher nicht für lösliche
Proteine in der Zelle zugänglich sind, wird der Einfluss der TMDs bei den
durchgeführten Interaktionsstudien nicht betrachtet. Die Q-SNAREs Vti1, Vam3
und Vam7 assemblieren sowohl mit dem R-SNARE Nyv1 als auch mit Ykt6 zu einem
Komplex. Das R-SNARE Nyv1 ist für die homotypische Vakuolenfusion
verantwortlich, während Ykt6 als R-SNARE vorwiegend an anderen Fusionen mit
der Vakuole beteiligt ist (Dilcher, 2001). Die Assemblierung dieser beiden SNARE-
Komplexe ist kinetisch sehr effizient, da eine Inkubationszeit der Einzelproteine von
10 min ausreichend ist, um den Komplex zu bilden (Abb. 3.1B). Sie weisen im
assemblierten Zustand eine relativ hohe Salz- und Detergenz-Resistenz auf (Daten
nicht gezeigt).
Die Rolle der SNARE-Proteine bei Vermittlung der Fusionsspezifität wurde
ursprünglich kontrovers diskutiert (Söllner, 1995; Chen und Scheller, 2001;
Pelham, 2001). Die anfänglich formulierte SNARE-Hypothese spricht SNARE-
Proteinen eine spezifische Assemblierung zu, die die Erkennung der Zielmembran
erlaubt (Söllner et al., 1993; Rothman und Warren, 1994). Durch in vivo Studien,
Diskussion
48
aber auch in vitro-Fusionen von Liposomen wurde diese Hypothese widerlegt (Götte
und Gallwitz, 1997; McNew et al., 2000; Brandhorst et al., 2006). SNARE-Proteine
können entgegen der SNARE-Hypothese auch in unterschiedlichen nicht
physiologischen Kombinationen stabile Komplexe ausbilden (Yang et al., 1999).
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Spezifität der Membranfusion nicht über die
Interaktion zwischen SNARE-Proteinen kodiert wird, sondern zusätzliche Faktoren
diese Aufgabe übernehmen.
4.1.2 Der HOPS-Komplex interagiert mit assemblierten Q-SNAREs
An der Vermittlung der Fusionsspezifität von Membranen in der Zelle sind
Tethering-Faktoren, SM (Sec1/Munc18)-Proteine und Rab-GTPasen beteiligt (Südhof
und Rothman, 2009; Bröcker et al., 2010). Neben den Wechselwirkungen zwischen
SM- und Syntaxin-homologen Proteinen konnten auch Bindungen zwischen
Tethering-Komplexen und SNARE-Proteinen nachgewiesen werden, die
möglicherweise der spezifischen Assemblierung von SNARE-Komplexen dienen
(Sweet und Pelham, 1993; Sivaram et al., 2005). Der HOPS-Komplex ist ein
Tethering-Komplex, der an Fusionen mit der Vakuole beteiligt ist und über die Rab-
GTPase Ypt7 reguliert wird. Studien haben Interaktionen mit den vakuolären
SNAREs Vam7 und Vam3 gezeigt (Dulubova et al., 2001; Stroupe et al., 2006). N-
terminal besitzt das Qc-SNARE Vam7 eine Phox-homologe PX-Domäne, die als
Membrananker dient. Diese Domäne interagiert ebenfalls mit dem HOPS-Komplex
(Abb. 3.5) (Stroupe et al., 2006). Diese Wechselwirkung dient möglicherweise der
Rekrutierung von Vam7 an die vakuoläre Membran, da sich nach der
Disassemblierung des vakuolären cis-SNARE-Komplexes durch Sec17 und Sec18
Vam7 von der Vakuole löst, und für weitere Fusionen wieder an die Vakuole
rekrutiert werden muss (Boeddinghaus et al., 2002). Ob sich die Affinität der PX-
Domäne von Vam7 zum HOPS-Komplex bei der Bindung an die vakuoläre Membran
verändert, konnte bisher nicht geklärt werden, was die zeitliche Einordnung dieser
Interaktion in den Fusionsprozess erschwert.
Da die Interaktion zwischen dem HOPS-Komplex und dem Syntaxin-Homolog
Vam3 bisher nicht in Systemen mit aufgereinigten Komponenten gezeigt wurde,
könnte ein bisher unbekannter Faktor eine vermittelnde Funktion bei dieser
Bindung einnehmen oder zur Stabilisierung beitragen (Abb. 3.4). Die
Diskussion
49
Wahrscheinlichkeit einer Interaktion zwischen Vam3 und Vps33 ist allerdings sehr
hoch, da Vam3 zu den Syntaxinen gehört und die HOPS-Untereinheit Vps33
homologe Bereiche zu dem neuronalen Sec1-Protein Munc18 aufweist (Abb. 4.1).
Denkbar wäre die Umfaltung der N-terminalen Domäne von Vam3 durch ein
unbekanntes Chaperon in eine Formation, die der geschlossenen Konformation von
Syntaxinen ähnelt und die Voraussetzung für die Bindung von Vps33 darstellt.
Abbildung 4.1: Vergleich der Aminosäuresequenz von Vps33 aus Hefe mit neuronalem Sec1/Munc18 Vergleich der Aminosäuresequenz von Vps33 aus Hefe und dem neuronalen Sec1/Munc18 der Ratte (nSec1) und dem Homolog des Tintenfischs (sSec1). Die dargestellte Sekundärstruktur basiert auf einer Röntgenstrukturanalyse des neuronalen Sec1 der Ratte (Misura et al., 2000). Unterlegte Spalten weisen auf Sequenzübereinstimmungen, fettgedruckte Buchstaben auf Ähnlichkeiten in der Sequenz hin (Pieren et al., 2010).
SM-Proteine sind bekannt für ihre Bindung an die geschlossene Konformation von
Syntaxinen, um regulatorische Aufgaben für die SNARE-Assemblierung zu
übernehmen (Dietrich et al., 2003). Die Ausbildung einer geschlossenen
Konformation, wie es für Syntaxine üblich ist, konnte für Vam3 allerdings nicht
gezeigt werden (Dulubova et al., 2001). Die Bindedomäne von Vam3 an Vps33
scheint sich daher auf die N-terminale Region (Habc-Domäne) zu beschränken,
obwohl frühere Studien eine Affinität zur SNARE-Domäne zeigten (Dulubova et al.,
2001; Pieren et al., 2010). Vps33 ist bisher nicht als Einzelprotein außerhalb eines
Komplexes nachgewiesen worden. Deshalb gestaltete sich die funktionelle
Diskussion
50
Untersuchung problematisch, da sekundäre Einflüsse durch den Komplex schwer zu
kontrollieren sind.
Verschiedene Untersuchungsansätze haben gezeigt, dass der HOPS-Komplex nicht
nur einzelne SNARE-Proteine bindet, sondern auch mit dem trans-SNARE-Komplex
interagiert und so die Disassemblierung der SNAREs durch Sec18 und Sec17
verhindert (Xu et al., 2010). Diese Beobachtung wurde ausschließlich für trans-
SNARE-Komplexe gemacht und lässt auf eine zusätzliche Membranassoziation des
HOPS-Komplexes schließen, die für diese Interaktion notwendig ist (Collins et al.,
2005; Hickey und Wickner, 2010; Xu et al., 2010).
Die Daten über die Wechselwirkung zwischen dem HOPS und SNAREs stützen die
Hypothese, dass der HOPS-Komplex den vakuolären SNAREs ihre Spezifität
verleiht. Da der HOPS-Komplex die Disassemblierung des trans-SNARE-Komplexes
durch Sec18 und Sec17 verhindern kann, wird angenommen, dass er eine
Interaktion mit dem assemblierten SNARE-Komplex eingeht. Um diese Annahme zu
belegen, wurden die vakuolären SNARE-Proteine Vam3, Vam7, Vti1 und Ykt6
rekombinant aufgereinigt und an GSH-Sepharose assembliert. Sowohl die
Inkubation mit aufgereinigtem HOPS als auch mit Hefelysat zeigen, dass der
assemblierte SNARE-Komplex eine hohe Affinität zum HOPS aufweist (Abb. 3.3A,
B). Obwohl die PX-Domäne von Vam7 nachweislich an den HOPS bindet, wird sie
nicht für die Interaktion mit dem HOPS-Komplex benötigt (Abb. 3.6). Auch ohne
das R-SNARE Ykt6 bleibt die Affinität zum HOPS-Komplex bestehen. Demzufolge ist
der assemblierte Q-SNARE-Komplex für die HOPS-Interaktion ausreichend (Abb.
3.6). Unter den in dieser Arbeit verwendeten Bedingungen hat der N-terminale
Bereich von Vam3 keinen Einfluss auf die HOPS-Interaktion, da ein minimaler Q-
SNARE-Komplex, bestehend aus Vti1 und N-terminal verkürztem Vam3 und Vam7,
für die Interaktion mit dem HOPS-Komplex ausreichend war (Abb. 3.7B). Es kann
daher von einer Bindung des HOPS-Komplexes an den assemblierten SNARE-
Kernkomplex ausgegangen werden, der trotz dem fehlenden R-SNARE die typische
helikale Struktur aufweist (Brunger et al., 2009). Diese spezifische Interaktion
schützt möglicherweise die assemblierten SNARE-Proteine vor der
Disassemblierung durch Sec18 und Sec17. Wenn das der Fall wäre, würde der
HOPS-Komplex den SNARE-Proteinen ihre Assemblierungsspezifität dadurch
verleihen, dass er selektiv den vakuolären SNARE-Komplex bindet, fehlassemblierte
Diskussion
51
SNARE-Proteine jedoch nicht vor der Disassemblierung schützt (Starai et al., 2008).
Demzufolge kann an der Vakuole nur eine Fusion stattfinden, wenn es zu einer
korrekten Assemblierung zwischen den vakuolären SNARE-Proteinen kommt. Diese
Annahme wird durch die proofreading Hypothese unterstützt (Starai et al., 2008).
Diese beruht allerdings nicht auf Interaktionsstudien, sondern auf der in vitro Fusion
von Liposomen. Die proofreading Hypothese wurde formuliert, da gezeigt werden
konnte, dass der HOPS-Komplex eine fehlerhafte Assemblierung im „0“ layer des
SNARE-Komplexes erkennt und die Fusion dadurch verhindert.
Die Untersuchung der HOPS-SNARE Wechselwirkungen zeigte, dass unter den
gewählten Versuchsbedingungen keine 1:1 Stöchiometrie zwischen dem HOPS-
Komplex und dem assemblierten SNARE-Komplex erreicht werden konnte (Abb.
3.3A, 3.7B). Eine Erklärung für diese Beobachtung ist der nicht hinreichend
kontrollierbare Assemblierungsstatus der SNARE-Komplexe. Neben den korrekt
assemblierten SNARE-Komplexen können auch weniger stabile fehlassemblierte
Komplexe vorliegen, die nicht mit dem HOPS-Komplex interagieren (Weninger et
al., 2003). Eine weitere Erklärung für die ungleiche Stöchiometrie der beiden
Komplexe wäre die Bindung mehrerer SNARE-Komplexe durch HOPS. Dies wirft
die Frage nach der Anzahl der am Fusionsprozess beteiligten SNARE-Komplexe auf.
Hier gehen die Meinungen auseinander. Einige Modelle zeigen vorwiegend zwei
SNARE-Komplexe pro Fusion (Jahn et al., 2003; Bonifacino und Glick, 2004),
energetisch scheint aber bereits ein einzelner SNARE-Komplex für die Fusion
ausreichend zu sein (Bogaart et al., 2010; Risselada et al., 2011). Ein weiteres Modell
beschreibt die Ausbildung einer Fusionspore, an der mehr als zwei SNARE-
Komplexe beteiligt sein sollen (Jackson, 2010). Demzufolge ist je nach Modell eine
Interaktion eines HOPS-Komplexes mit mehreren SNARE-Komplexen möglich und
könnte in vivo zu einer Anreicherung von SNARE-Komplexen und damit zur
Fusionsstimulation beitragen.
4.1.3 Die Wechselwirkung zwischen HOPS-Untereinheiten und Q-SNAREs
Bei der Untersuchung der HOPS-SNARE Interaktion stellt sich die Frage, ob der
HOPS-Komplex als Einheit für die Wechselwirkung mit dem Q-SNARE-Komplex
verantwortlich ist oder ob einzelne HOPS-Untereinheiten die Bindung vermitteln.
Dies ist nicht nur interessant bezüglich der Wechselwirkung, sondern auch
Diskussion
52
bezüglich der Funktionalität des HOPS-Komplexes. Nur die HOPS-Untereinheit
Vps41 scheint als Ypt7 Effektorprotein nachweislich im Komplex und als
Einzelprotein ihre Funktion auszuüben (Brett et al., 2008; Ostrowicz et al., 2010;
Plemel et al., 2011). Daneben gibt es weder zuverlässige Aussagen über die Rolle der
Untereinheiten im Komplex noch gibt es Hinweise auf deren Funktionalität
außerhalb des Komplexes. Die aufgereinigten HOPS-Untereinheiten Vps16, Vps18
und Vps33 binden als einzige Untereinheiten isoliert an den minimalen Q-SNARE-
Komplex, bestehend aus Vti1 und N-terminal verkürztem Vam3 und Vam7.
Möglicherweise vermitteln sie die Interaktion mit dem SNARE-Kernkomplex, der in
Kapitel 3.2.2 für den HOPS-Komplex als Einheit beschrieben wurde. Für die
Bindung an die PX-Domäne von Vam7 sind ausschließlich Vps16 und Vps18
verantwortlich (Abb. 3.8B).
Im Kontext mit vorherigen Erkenntnissen über den HOPS-Komplex, ergeben sich
Hinweise darauf, dass die Untereinheiten Vps41 und Vps39 durch ihre Interaktionen
mit der vakuolären Rab-GTPase Ypt7 regulatorische Aufgaben innerhalb des
Komplexes übernehmen, während Vps16, Vps18 und Vps33 SNARE-spezifische
Interaktionen eingehen (Abb. 3.8A, B). Da Vps33 die einzige der drei Untereinheit
ist, die ausschließlich an assemblierte SNAREs bindet, lässt dies auf eine SM-Protein
typische Chaperonfunktion schließen, die die SNARE-Assemblierung unterstützt
(Südhof und Rothman, 2009). Der HOPS-Untereinheit Vps11 konnte bisher keine
spezifische Funktion zugeordnet werden. Möglicherweise trägt sie indirekt zur
Funktionalität und Stabilität des Komplexes bei, indem sie ein Bindeglied zwischen
den SNARE-bindenden und regulatorischen Bereichen darstellt (Stroupe et al.,
2006). Die hantelförmige Struktur des HOPS-Komplexes (C. Bröcker, Dissertation
2011) unterstützt die Theorie, dass er zwei miteinander verbundene Domänen
besitzt, die unterschiedliche Aufgaben beim tethering übernehmen. Die
regulatorische Domäne des HOPS-Komplexes würde dabei über Vps41 an das
membranassoziierte Ypt7-GTP binden, während die SNARE-bindende Domäne mit
Vps33, Vps16 und Vps18 an assemblierte Q-SNAREs der gegenüberliegenden
Membran binden könnte, um das tethering zu gewährleisten.
Neben dem HOPS gibt es einen homologen hexameren Komplex, dessen Funktion
allerdings noch relativ unbekannt ist. Dieser wird als CORVET-Komplex bezeichnet.
Er lokalisiert an Endosomen und hat die Untereinheiten Vps11, Vps16, Vps18 und
Diskussion
53
Vps33 mit dem HOPS-Komplex gemein. Diese Gemeinsamkeit wirft Fragen im
Hinblick auf die SNARE-Spezifität des HOPS-Komplexes auf, da an Endosomen und
an der Vakuole unterschiedliche SNAREs für die Fusion genutzt werden, die SNARE-
bindenden Untereinheiten in CORVET und HOPS jedoch identisch sind. Es ist
daher unwahrscheinlich, dass ein Subkomplex aus vier Proteinen selektiv
endosomale und vakuoläre SNARE-Komplexe unterscheiden kann.
Möglich ist, dass die spezifischen Untereinheiten der Komplexe die Lokalisation
durch die Bindung an Vps21 bzw. Ypt7 festlegen und somit für den Aktionsradius
der Komplexe verantwortlich sind (Peplowska et al., 2007; Markgraf et al., 2009;
Ostrowicz et al., 2010). Dadurch könnten Vps16, Vps18 und Vps33 eine Domäne
innerhalb des SNARE-Komplexes erkennen, die sowohl bei assemblierten
vakuolären SNAREs als auch im Komplex endosomaler SNAREs existiert. Hierbei
könnte es sich sogar um einen allgemeingültigen Mechanismus zur Erkennung von
assemblierten SNAREs handeln (Antonin et al., 2002). Bisher gibt es allerdings keine
Erkenntnisse über SNARE-CORVET Wechselwirkungen, die diese Hypothese
widerlegen oder unterstützen würden.
4.2 Die funktionelle Bedeutung der HOPS-SNARE Wechsel-
wirkungen
4.2.1 Der Einfluss der N-terminalen Domänen von Vam3 und Vam7
Eine Deletion der PX-Domäne von Vam7 hat eine Fragmentierung der Vakuolen zur
Folge, da Vam7 ohne PX-Domäne nicht an Membranen binden kann. Für die
eigentliche Fusion mit der Vakuole scheint die PX-Domäne nicht unbedingt
notwendig zu sein, da die Überexpression von Vam7 ohne PX-Domäne zu einer
wildtypähnlichen Vakuolenmorphologie führt (Cheever et al., 2001). Folglich findet
durch den fehlenden Membrananker von Vam7 nur eine zufällige Assemblierung
der Q-SNAREs statt, die durch Überexpression kompensiert werden kann. Ein
ähnlicher Rekrutierungsmechanismus, wie er für den HOPS-Komplex und Vam7
vermutet wird, ist auch beim Exozyst zu beobachten. Dieser an der Exozytose
beteiligte Tethering-Komplex rekrutiert das lösliche SNARE Sec9 aus dem Zytosol an
die Plasmamembran, um eine effiziente SNARE-Assemblierung zu gewährleisten (Yu
und Hughson, 2010).
Diskussion
54
Der N-terminale Bereich von Vam3 hat keinen direkten Einfluss auf die
Vakuolenmorphologie und kann ohne eine Veränderung der Vakuolenmorphologie
deletiert werden (Laage und Ungermann, 2001).
Eine in vitro-Vakuolenfusion, mit Vakuolen aus einem Stamm mit N-terminal
verkürztem Vam3 (Vam3∆N), konnte nicht nur durch Vam7, sondern auch durch
Vam7 ohne PX-Domäne (Vam7SD) stimuliert werden. Diese Beobachtung zeigt, dass
die N-terminalen Domänen von Vam7 und Vam3 zwar nicht essentiell für die Fusion
sind, die Effizienz aber erhöhen (Abb. 3.9).
Auch der Austausch der PX-Domäne gegen den Palmitoylanker von Vac8 hat keinen
bedeutenden Einfluss auf die Vakuolenmorphologie (Abb. 3.10). Dies bestätigt die
Hypothese, dass die PX-Domäne ausschließlich für die Rekrutierung und die
Bindung an die vakuoläre Membran verantwortlich ist, nicht aber direkt zur Fusion
beiträgt. Die Lokalisierung durch den Palmitoylanker an die vakuoläre Membran ist
scheinbar für die Fusion ausreichend und eine Rekrutierung von Vam7 an die
Vakuole durch HOPS ist nicht unbedingt notwendig. Ein Grund dafür kann sein,
dass durch den Palmitoylanker die Mobilität von Vam7 eingeschränkt wird und
dadurch nicht mehr aus dem Zytosol an die Vakuolenmembran rekrutiert werden
muss (Boeddinghaus et al., 2002). Problematisch gestaltet sich allerdings die in vitro-
Fusion der Vakuolen dieses Stammes (Pal-Vam7∆PX). Sie zeigen nur etwa 20% der
Wildtypfusion (Abb. 3.11B). Diese 20% können nur durch Zugabe von
rekombinantem Vam7 erreicht werden, während die Zugabe von ATP keine weitere
stimulatorische Wirkung hat (Abb. 3.11A). Eine mögliche Erklärung für die geringe
Fusionsaktivität könnte die fehlende Mobilität von Vam7 durch die Substitution des
Membranankers sein. Außerdem könnte durch den Palmitoylanker die SNARE-
Domäne zu dicht an die Membran lokalisieren und dadurch sterische Probleme bei
der SNARE-Assemblierung oder bei der Fusion hervorrufen. Die PX-Domäne ist
etwa 190 Aminosäurereste lang, wobei die ersten 130 davon direkt an der Bindung
von PI3P beteiligt sind, während das Substrat für die Palmitoyltransferase nur 18
Aminosäurereste beträgt (Kutateladze, 2007). Allerdings sprechen die runden,
wildtypähnlichen Vakuolen dieses Stammes gegen eine eingeschränkte
Fusionsaktivität (Abb. 3.10). Es lässt sich jedoch eine verringerte Vam3-
Konzentration auf der vakuolären Membran feststellen, die möglicherweise die
Fusionsaktivität in vitro beeinflusst, sich aber nicht auf die Vakuolenmorphologie
Diskussion
55
auswirkt (Abb.3.18). Aufgereinigte Vakuolen des Pal-Vam7∆PX-Stammes zeigen eine
geringere Konzentration an Pho8 und somit auch nur 60% der Pho8-Aktivität im
Vergleich zum Wildtyp (Abb. 3.18, 3.20). Ein funktioneller Transport der aktiven
alkalischen Phosphatase Pho8 ist bei der in vitro-Fusion von Vakuolen ein sehr
wichtiger Parameter, da ihr umgesetztes Substrat der photometrischen
Quantifizierung dient (Abb. 1.7). Eine mögliche Erklärung für die unterschiedlichen
vakuolären Pho8-Konzentrationen könnte ein leichter Defekt im AP-3-
Transportweg sein, über den Pho8 zur Vakuole transportiert. Die vakuoläre Kinase
Yck3, die über denselben Weg zur Vakuole transportiert wird, lokalisiert allerdings
in Pal-Vam7∆PX-Zellen wie auch in Wildtypzellen auf der vakuolären Membran.
Daraus kann geschlossen werden, dass die an der Vakuole ankommenden AP-3-
Vesikel auch mit der Vakuole fusionieren. Die Ursache der geringen Fusionsrate liegt
vermutlich in methodischen Problemen bei der homotypischen Vakuolenfusion in
vitro, da gleiche Pho8-Konzentrationen in der Vakuole die Voraussetzung für den
Vergleich von Fusionsaktivitäten sind.
Das palmitoylierte Vam7 hat keine hemmende Wirkung auf die Fusion, da eine
zusätzliche Expression von Pal-Vam7 zum endogenen Vam7 die Fusionsaktivität
nicht beeinträchtigt hat (Abb. 3.21B). Demzufolge wird entweder das endogene
Vam7 im Vergleich zum palmitoylierten und verkürzten Vam7 bevorzugt in den
SNARE-Komplex eingebaut oder die zusätzliche Expression hat nicht die verringerte
Pho8-Konzentration auf der Vakuole zur Folge, wie sie im Pal-Vam7∆PX Vam3∆N-
Stamm zu beobachten war.
Die zusätzliche Deletion der N-terminalen Domäne von Vam3 in dem Pal-Vam7∆PX-
Stamm (Pal-Vam7∆PX Vam3∆N) hat keinen Einfluss auf die Vakuolenmorphologie
(Abb. 3.10). Da allerdings das palmitoylierte Vam7 den limitierenden Faktor bei der
in vitro-Fusion darstellt, kann keine Aussage über den Einfluss der zusätzlichen
Deletion gemacht werden. Etwa 20% der Pal-Vam7∆PX Vam3∆N-Zellen zeigen einen
Zytokinesedefekt, der sich durch unnormale Zellformen mit mehreren Vakuolen
auszeichnet (Abb. 3.14). Auch die leicht runden Zellen und das verlangsamte
Wachstum sind Charakteristiken dieses Stammes. Die Vakuolenvererbung und die
homotypische Vakuolenfusion in vivo zeigen jedoch in diesen Zellen keine
Auffälligkeiten gegenüber dem Wildtyp (Abb. 3.16B, 3.17B). Die Ausknospung an der
Mutterzelle zeigt ebenfalls keine Anomalien in Bezug auf die Ausbildung der Polarität
Diskussion
56
(Abb. 3.15). Genetische Interaktionen von Vam7 und Vam3 mit Komponenten des
Septinrings, der zur Zelltrennung erforderlich ist, weisen allerdings auf einen
Defekt im Zusammenhang mit dem Zellzyklus hin, der den Zytokinesedefekt
erklären könnte (Costanzo et al., 2010). Auch die Beteiligung von Vam7 an der
Sporulation von Hefezellen und der Einfluss des Vam7-Homologs moVam7 in
Magnaporthe oryzae auf die Zytokinese geben Hinweise auf einen direkten oder
indirekten Einfluss von Vam7 auf die Zellarchitektur (Heider und Barnekow, 2008;
Dou et al., 2011).
4.2.2 Der HOPS-Komplex hemmt die Vam7SD-abhängige Fusion in vitro
Die homotypische Vakuolenfusion in vitro ist ein ATP-abhängiger Prozess, da die
assemblierten SNARE-Proteine durch die hexamere ATPase Sec18 und dessen
Kofaktor Sec17 aktiv disassembliert werden müssen, um für Fusionsprozesse zur
Verfügung zu stehen (Ungermann et al., 1998). Alternativ kann anstelle von ATP
auch Vam7 und sogar die Vam7-SNARE-Domäne (Vam7SD) zur Fusionsstimulation
eingesetzt werden (Thorngren et al., 2004; Starai et al., 2008). Vermutlich liegt Vam7
aufgrund seiner Mobilität und der guten Löslichkeit gegenüber den anderen
vakuolären SNARE-Proteinen unterrepräsentiert auf der Vakuole vor (Boeddinghaus
et al., 2002). Daher kann durch die Zugabe von Vam7 zur Fusionsreaktion dieses
Defizit ausgeglichen und die Fusion stimuliert werden. Allerdings kann der
assemblierte SNARE-Komplex nach der Fusion nicht recycelt werden, da kein ATP
zur Verfügung steht. Es stehen also bei der Vam7-abhängigen Fusion einmalig mehr
SNARE-Komplexe für die Fusion zur Verfügung als bei der ATP-abhängigen Fusion,
da Vam7 im Überschuss vorliegt und somit bei der Assemblierung von SNARE-
Komplexen keinen limitierenden Faktor darstellt. Bei der ATP-abhängigen Fusion
können dafür mehrere Fusionsrunden pro SNARE-Komplex stattfinden, da Energie
für das Recycling bereitgestellt wird.
Wird zu einer Vam7SD-abhängigen Fusion von Wildtyp-Vakuolen der HOPS-
Komplex in unterschiedlichen Konzentrationen hinzugegeben, kann eine
anfängliche Stimulation beobachtet werden, die bei 40 nM ihr Maximum findet.
Höhere HOPS-Konzentrationen führen zu einer Inhibition der Fusion (Abb. 3.12).
Eine sehr ähnliche Beobachtung wurde auch von Starai et al. 2008 gemacht, die
dieses Phänomen als eine proofreading Aktivität des HOPS beschrieben, da der
Diskussion
57
HOPS-Komplex zwischen verkürztem und Volllängen-Vam7 unterscheiden kann
und entsprechend die Fusion stimuliert oder hemmt. Durch die bis zu diesem
Zeitpunkt erlangten Ergebnisse bezüglich der proofreading Aktivität war
anzunehmen, dass durch Veränderungen des Verhältnisses von Vam7SD zu HOPS
das Stimulationsmaximum verschoben werden kann, da der HOPS-Komplex die
Fusion mit der Beteiligung von Vam7SD verhindert. Dies kann jedoch nicht
beobachtet werden. Das Fusionsmaximum bleibt unabhängig von der Vam7SD-
Konzentration bei einer HOPS-Konzentration von etwa 40 nM erhalten (Abb. 3.12).
Die SNARE-Proteine weisen ähnliche Konzentrationen auf der Vakuole auf (Merz
und Wickner, 2004). Folglich müsste ein HOPS pro SNARE-Komplex für die
maximale Fusionsstimulation benötigt werden. Die proofreading Aktivität des HOPS-
Komplexes setzt erst bei höheren Konzentrationen ein. Dies lässt auf eine Inhibition
schließen, an der mehr als ein HOPS-Komplex pro SNARE-Komplex beteiligt ist. Ob
die fehlende Interaktion zwischen HOPS und PX-Domäne von Vam7 die
proofreading Aktivität des HOPS-Komplexes auslöst oder durch einen indirekten
Effekt durch die fehlende Membranassoziation von Vam7 zur Inhibition durch den
HOPS-Komplex führt, konnte unter den verwendeten Versuchsbedingungen nicht
geklärt werden.
4.2.3 Der minimale Q-SNARE-Komplex hemmt die Vakuolenfusion in vitro
Um die funktionelle Bedeutung der Wechselwirkung zwischen dem HOPS-Komplex
und dem minimalen Q-SNARE-Komplex aus Vti1 und N-terminal verkürztem Vam3
und Vam7 zu untersuchen, wurde der vorassemblierte SNARE-Komplex mit HOPS
inkubiert und zu Wildtyp-Vakuolen titriert. Der Versuch zeigte eine deutlich
verringerte Stimulation der HOPS-vermittelten Fusion, wenn dieser mit dem
minimalen Q-SNARE-Komplex vorinkubiert wurde im Vergleich zur Stimulation des
HOPS-Komplexes ohne Q-SNARE Vorinkubation. Die Bindestelle des HOPS-
Komplexes, die durch die Vorinkubation mit den Q-SNAREs blockiert wurde, trägt
demzufolge zur Stimulation der Fusion bei. Ein Modell zur Erklärung dieser
Inhibition könnte wie folgt aussehen: HOPS führt die Donor- und
Akzeptormembran durch die Interaktion mit den assemblierten SNAREs auf der
einen und der Affinität zu Ypt7-GTP auf der gegenüberliegenden Membran
zusammen. Ist die Bindestelle zu den assemblierten SNAREs blockiert, können die
Diskussion
58
Membranen nicht zueinander finden und der stimulierende Effekt des HOPS-
Komplexes wird unterbunden.
Mit den in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnissen über die HOPS-SNARE
Wechselwirkungen können die bisher postulierten Modelle des Fusionszyklusses an
der Vakuole um einige Aspekte erweitert bzw. konkretisiert werden (Abb. 4.2)
(Wurmser et al., 2000; Xu et al., 2010).
Obwohl die an der Fusion mit der Vakuole beteiligten SNAREs und somit die
möglichen SNARE-Komplexe bekannt sind, gestaltet sich die Darstellung von
vakuolären Fusionsmodellen diesbezüglich problematisch. Dabei liegt die
Problematik in der unbekannten Verteilung der SNARE-Proteine auf der Donor-
und Akzeptormembran. Das folgende Fusionsmodell gibt daher nur eine der
möglichen SNARE-Verteilungen wieder. Es beschreibt ein Fusionsereignis bei dem
das R-SNARE Nyv1 auf der einen und die Q-SNAREs Vam3, Vam7 und Vti1 auf der
gegenüberliegenden Membran lokalisieren.
Zu Beginn kommt es durch die Disassemblierung des cis-SNARE-Komplexes durch
Sec18 und Sec17 zu einer Freisetzung von Vam7 ins Zytoplasma (Abb. 4.2 (1)). Da
Vam7 für weitere Fusionen wieder zur Verfügung stehen muss, wird es über die
Wechselwirkung mit dem HOPS-Komplex erneut an die vakuoläre Membran
rekrutiert. Dort kommt es zur Bildung des Q-SNARE-Komplexes mit den SNAREs
Vam3 und Vti1. Der HOPS-Komplex stimuliert hierbei die Assemblierung des cis-
SNARE-Komplexes und schützt den assemblierten Komplex vor der
Disassemblierung durch Sec18 und Sec17 (Abb. 4.2 (2)). Das Tethering erfolgt durch
die Wechselwirkung von HOPS mit Ypt7-GTP auf der Donor- und den
assemblierten Q-SNAREs auf der Akzeptormembran (Abb. 4.2 (3)). Nach der
Ausbildung des trans-SNARE-Komplexes mit dem R-SNARE kommt es zur Fusion
der beiden Membranen und der anschließenden Freisetzung des HOPS-Komplexes
(Abb. 4.2 (4, 5)). Da Experimente in vitro zeigen konnten, dass Sec17 den HOPS-
Komplex vom assemblierten SNARE-Komplex verdrängen konnte, weist dies auf
eine regulatorische Rolle von Sec17 bei der Freisetzung des HOPS nach der Fusion
hin (Collins et al., 2005). Die SNAREs liegen anschließend wieder assembliert als cis-
Komplex vor und müssen für einen erneuten Fusionszyklus disassembliert werden
(Abb. 4.2 (5)).
Diskussion
59
Abbildung 4.2: Modell für das Zusammenspiel von HOPS und SNAREs im Fusionszyklus Zur Vereinfachung ist der Fusionszyklus in fünf Schritte unterteilt: (1) ATP-abhängige Disassemblierung des cis-SNARE-Komplexes durch Sec18 und Sec17. (2) HOPS rekrutiert Vam7 aus dem Zytosol an die Membran und stimuliert die SNARE-Assemblierung. HOPS schützt die assemblierten SNAREs vor der Disassemblierung durch Sec18 und Sec17 (3) Tethering durch die Bindung des HOPS-Komplexes an Ypt7-GTP und die assemblierten SNAREs. (4) Ausbildung des trans-SNARE-Komplexes und Fusion des Vesikels mit der Akzeptormembran. (5) Die SNAREs liegen nach der Fusion im assemblierten cis-SNARE-Komplex vor. Durch die Freisetzung des HOPS-Komplexes liegt der SNARE-Komplex ungeschützt vor und kann durch Sec18 und Sec17 disassembliert werden (Krämer und Ungermann, 2011).
Ausblick
60
5 Ausblick
Interaktionsstudien dieser Arbeit konnten die Bindedomäne von HOPS an SNARE-
Proteine auf einzelne Untereinheiten des Komplexes eingrenzen. Die funktionelle
Relevanz dieser Wechselwirkung wurde durch in vitro-Fusionen isolierter Vakuolen
belegt.
Die Ergebnisse tragen zur Vervollständigung und Konkretisierung der bisher
vorgestellten Modelle zur Fusion mit der Vakuole bei.
Die Wechselwirkungen des HOPS-Komplexes mit SNARE-Proteinen ließ sich auf die
HOPS-Untereinheiten Vps33, Vps16 und Vps18 zurückführen. Eine weitere
Eingrenzung der Bindedomänen könnte zusätzliche Informationen über die Art der
Interaktion und die räumliche Struktur des Komplexes liefern.
Insbesondere die Bindung von HOPS an die N-terminale Domäne von Vam3 und
Vam7 lässt einige Fragen offen.
Die mit Zelllysaten gezeigte Wechselwirkung des HOPS-Komplexes mit dem N-
terminalen Bereich von Vam3 konnte unter den in dieser Arbeit verwendeten
Bedingungen nicht bestätigt werden. Da das verwendete Vam3-Konstrukt
nachweislich an Vps33 aus Zelllysaten bindet, ist von einem zusätzlichen Faktor
auszugehen, der diese Interaktion entweder vermittelt oder verstärkt. Eine
Inkubation von GST-Vam3 mit Hefelysat und eine massenspektrometrische Analyse
der Interaktionspartner könnten zu diesem Faktor führen.
Um die Interaktion zwischen HOPS und der PX-Domäne von Vam7 genauer in die
zeitliche Abfolge des Fusionsprozesses einordnen zu können, wäre zunächst zu
klären, ob die Affinität zum HOPS erhalten bleibt, wenn die PX-Domäne gebunden
an die Membran vorliegt.
Da die drei SNARE-bindenden Untereinheiten des HOPS-Komplexes Vps33, Vps16
und Vps18 auch Teil des CORVET-Komplexes sind, stellt sich die Frage, ob diese
Interaktion spezifisch ist, oder ob der CORVET-Komplex auch die assemblierten
vakuolären SNAREs binden kann. Die Interaktionsstudie zur Klärung dieser Frage
Ausblick
61
sollte mit der Untersuchung der Affinität des HOPS-Komplexes zu assemblierten
endosomalen SNAREs vervollständigt werden.
Mit einem in vitro Fusionssystem aus Liposomen könnte im Vergleich zur
Vakuolenfusion unter kontrollierteren Bedingungen der Einfluss einzelner
Komponenten auf die Fusion getestet werden. Ein solches synthetisches System
könnte beispielsweise zum Verständnis der proofreading Aktivität des HOPS-
Komplexes beitragen, da definierte Konzentrationen der einzelnen Komponenten
zur Fusion hinzugefügt werden können. Die Rekonstitution der Liposomen mit
endosomalen SNARE-Proteinen und die Zugabe von aufgereinigtem HOPS könnte
eine Antwort auf die Frage nach der SNARE-Spezifität dieses Tethering-Komplexes
geben.
Material und Methoden
62
6 Material und Methoden
6.1 Medien
Folgende Medien wurden zur Kultivierung von Hefestämmen oder Escherichia coli
Kulturen verwendet.
6.1.1 Vollmedien
Die Anzucht von Hefe erfolgt in YP-Medium (yeast extract peptone), das sich aus 10 g
Hefeextrakt, 20 g Pepton und je nach gewünschter Kohlenstoffquelle aus 20 g D-
Glukose (YPD) oder 20 g Galaktose (YPG) zusammensetzt. Nachdem die Bestandteile
in 1 L H2O gelöst wurden, wird der pH-Wert mit 1 M HCl auf 5,5 eingestellt. Zur
Herstellung des Spheroplastenpuffers für die Vakuolenfusion wird YPD mit 2 g
Glukose pro Liter verwendet (0,2 x YPD).
Zur Anzucht von Escherichia coli Kulturen wurde LB-Medium (lysogeny broth; Bertani
1951) verwendet. Dieses setzt sich aus 5 g Hefeextrakt, 10 g Trypton und 10 g NaCl
zusammen. Nach dem Lösen der Substanzen in 1 L H2O wird der pH-Wert mit 1 M
NaOH auf 7,5 eingestellt. Zur Selektion wurde dem Medium das benötigte
Antibiotikum zugegeben. Die Endkonzentrationen der verwendeten Antibiotika sind
in Tabelle 6.1 dargestellt.
6.1.2 Synthetische Medien
Um Hefen nach ihren auxotrophen Markern zu selektieren, wird synthetisches
Medium verwendet. Das synthetische Medium setzt sich für 1 L aus 6,75 Difco Yeast
Nitrogen base without aminoacids (BD-Diagnostic Systems; Heidelberg), 20 g D-
Glukose und 0,75 g CSM-X (definierte Aminosäurezusammensetzung; MP-
Biomedicals; Eschwege) zusammen. Der pH-Wert wird auf 5,5 eingestellt.
Alle Medien werden für 20 min bei 121°C autokolaviert. Zur Herstellung von
Festmedien werden vor dem autoklavieren 20 g/L Agar dem entsprechenden
Medium hinzugefügt.
Material und Methoden
63
6.1.3 Antibiotika
In der folgenden Tabelle sind die verwendeten Antibiotika mit ihren
Endkonzentrationen zur Selektion von Hefe und E. coli Stämmen dargestellt.
Tabelle 6.1: Verwendete Antibiotika
Antibiotikum Konzentration
Ampicillin 100 µg/mL
Chloramphenicol 30 µg/mL
Geneticin (G418) 200 µg/mL
Hygromycin 300 µg/mL
Kanamycin 35 µg/mL
Nourseothricin (ClonNat) 100 µg/mL
6.2 Stammhaltung und Anzucht von Mikroorganismen
Hefe-Flüssigkulturen wurden bei 30°C und Bakterienkulturen bei 37°C in sterilen
Erlenmeyerkolben bei 170 Upm auf einem „Innova“-Schüttler (New Brunswick
Scientific, Edison, U.S.A) bewegt. Kleine Volumina wurden in 15 mL Röhrchen
(Sarstedt, Nümbrecht) kultiviert.
Relevante Stämme werden in Glycerinkulturen (15% v/v) bei -80°C gelagert
nachdem sie in flüssigem Stickstoff eingefroren wurden.
6.3 Verwendet e Hefe- und Bakt eriens t ämme
6.3.1 Bakterienstämme
E. coli DH5α
Der E. coli-Stamm DH5α wurde für alle Klonierungsarbeiten und zur Stammhaltung
verwendet. Dieser Stamm wurde von der Firma Invitrogen GmbH bezogen und von
Kathrin Auffarth oder Angela Perz (Universität Osnabrück, Abteilung Biochemie)
kompetent gemacht.
Genotyp: F- Φ80lacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF)U169 deoR recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk+)
phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 λ-
Material und Methoden
64
E. coli BL21 (DE3) Rosetta
Der E. coli Stamm BL21 (DE3) Rosetta wurde für die Expression von rekombinanten
Proteinen verwendet. Er besitzt ein Plasmid, das t-RNAs kodiert, die nur selten in
Prokaryonten vorkommen. Durch dieses Plasmid wird die Expression
rekombinanter Proteine unterstützt. Das Plasmid ist auch für die
Chloramphenicolresistenz dieses Stammes verantwortlich.
Genotyp: F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3) pRARE (CamR)
6.3.2 Hefestämme
Die in dieser Arbeit verwendeten Hefestämme sind in Tabelle 8.1 im Anhang
aufgelistet.
6.4 Molekularbiologische Arbeitsmeth oden
Alle verwendeten Enzyme, die zur Amplifikation oder zur Veränderung von DNA
dienen, wurden von der Firma Fermentas (St. Leon-Roth) oder NEB (New England
BioLabs) bezogen.
6.4.1 Präparation von Plasmid-DNA
Zur Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli DH5α wurde das „GeneJET Miniprep
Kit“ von Fermentas (St. Leon-Roth) nach Anleitung des Herstellers verwendet. Für
die Isolierung wurden 5 mL einer Übernachtkultur verwendet.
6.4.2 Photometrische Quantifizierung von DNA
Zur Quantifizierung der isolierten Plasmid-DNA wurde 1 µL der DNA-Lösung mit
dem „NanoDrop-ND1000”-Spektrophotometer (Peqlab, Erlangen) gemessen. Das
Photometer zeigt ein Spektrum zwischen 200 nm und 400 nm und ermittelt über
das Absorptionsmaximum bei 260 nm die DNA-Konzentration in ng/µL.
6.4.3 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die PCR dient der Amplifikation von DNA. Durch synthetische Oligonukleotide
(Primer) kann der zu amplifizierende Bereich festgelegt werden. Die Voraussetzung
für den in drei Temperaturstufen ablaufenden Prozess ist eine Polymerase mit
hoher Temperturtoleranz.
Material und Methoden
65
Pfu-PCR
Die PCR mit der Pfu-DNA-Polymerase von Fermentas dient der Amplifikation von
Teilen genomischer DNA oder Plasmid-DNA um diese anschließend in Vektoren zu
klonieren. Die verwendeten Primer besitzen endständig bestimmte
Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme, die es erlauben das amplifizierte
Fragment (Insert) in einen Vektor mit den gleichen Schnittstellen zu klonieren. Dazu
müssen Vektor und Insert mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnitten
werden. Tabelle 6.2 zeigt einen Standard PCR-Zyklus für eine Pfu-PCR. In Tabelle
6.3 ist das Pipettierschema für eine 50 µL PCR-Reaktion dargestellt.
Tabelle 6.2: PCR-Zyklus für die Pfu-DNA-Polymerase
Phasen Temperatur Dauer Wiederholungen
Primärer Denaturierung 95°C 2 min 1 x
Hybridisierung
Elongation
Denaturierung
48°C
70°C
95°C
30 s
1 min/0,5kb
20 s
35 x
Terminale Elongation 72°C 10 min 1 x
Material und Methoden
66
Tabelle 6.3: Pipettierschema für Pfu-PCR
Komponente Volumen
Template-DNA 1 µL
Puffer (10x) 5 µL
Primer 3’ (10 µM) 1,25 µL
Primer 5’ (10 µM) 1,25 µL
dNTP-Mix (10 mM) 1 µL
MgSO4 7 µL
Pfu-DNA-Polymerase (2,5 U/µL) 0,8 µL
H2O 32,7 µL
Knop-PCR
Die Knop-PCR dient der Amplifikation von Promotoren und Fusionsproteinen aus
einer Plasmidbibliothek mit speziellen Primern, die Bereiche für die homologe
Rekombination des PCR-Produkts in das Zielgen enthalten (Janke et al., 2004). Der
PCR-Zyklus und das Pipettierschema für die Knop-PCR sind in Tabellen 6.4 und 6.5
dargestellt.
Tabelle 6.4: PCR-Zyklus für Knop-PCR
Phasen Temperatur Dauer Wiederholungen
Primäre Denaturierung 95°C 4 min 1 x
Denaturierung
Hybridisierung
Elongation
95°C
54°C
68°C
30 s
30 s
2 min 30 s
10 x
Denaturierung
Hybridisierung
Elongation
95°C
54°C
68°C
30 s
30 s
2 min 40 s+20 s/Wdh
20 x
Material und Methoden
67
Tabelle 6.5: Pipettierschema für Knop-PCR
Komponente Volumen
Template-DNA 1 µL
Knop-Puffer (10x) 5 µL
Primer 3’ (10 µM) 3,2 µL
Primer 5’ (10 µM) 3,2 µL
dNTP-Mix (10 mM) 1,75 µL
Taq-DNA-Polymerase (5 U/µL) 0,4 µL
Vent-DNA-Polymerase (2,5 U/µL) 0,2 µL
H2O 35,2 µL
Kolonie-PCR
Die Kolonie-PCR dient der Amplifikation von DNA-Fragmenten zur Kontrolle von
Genotypen in Hefen. Dazu werden Primer gewählt, die das entsprechende Fragment
amplifizieren oder bei Deletionen zu keiner Amplifikation führen. Die Parameter des
PCR-Zyklusses für die Kolonie-PCR und das Pipettierschema für einen 20 µL
Reaktionsansatz sind Tabelle 6.6 und Tabelle 6.7 zu entnehmen.
Tabelle 6.6: PCR-Zyklus für Kolonie-PCR
Phasen Temperatur Dauer Wiederholungen
Primäre Denaturierung 95°C 10 min 1 x
Denaturierung
Hybridisierung
Elongation
95°C
48°C
72°C
50 s
50 s
1 kb/min
35x
Terminale Elongation 72°C 10 min 1x
Material und Methoden
68
Tabelle 6.7: Pipettierschema für Kolonie-PCR
Komponente Volumen
Template-DNA 1 Kolonie
DreamTaq Puffer (10x) 2 µL
Primer 3’ (10 µM) 1 µL
Primer 5’ (10 µM) 1 µL
dNTP-Mix (10 mM) 0,4 µL
BSA (20 mg/mL) 0,1 µL
DreamTaq-DNA-Polymerase (5 U/µL) 0,2 µL
H2O 15,3 µL
6.4.4 Agarose-Gelelektrophorese
Die Agarose-Gelelektrophorese stellt eine Methode zur Auftrennung von DNA-
Fragmenten in einem elektrischen Feld dar. Dabei passiert die DNA eine poröse
Matrix und trennt sich nach ihrer Größe auf. Üblicherweise werden 1% (w/v)
Agarosegele verwendet. Dazu wird 0,5 g Agarose (Fermentas) in 50 mL 1x TAE-
Puffer (40 mM Tris, pH8,3; 20 mM Essigsäure, 2 mM EDTA) unter mehrmaligem
Aufkochen gelöst und anschließend mit 4 µL Ethidiumbromid (1% (w/v)) Lösung
(AppliChem, Darmstadt) versetzt. Nach der Polymerisation der Agarose wird das
Gel in einer Hoefer HE 33 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden)-Laufkammer
mit TAE-Puffer überschichtet und beladen. Die angelegte Spannung beträgt 120 V.
Die Detektion der DNA erfolgt über UV-Licht.
6.4.5 Enzymatische Modifikation von DNA
Analytischer Restriktionsverdau
Zur Analyse von Plasmid-DNA aus E. coli wird diese isoliert und über ausgewählte
Restriktionsenzyme in Fragmente geschnitten, um anschließend das Schnittmuster
über die Agarose-Gelelektrophorese zu kontrollieren. Das Pipettierschema eines
analytischen Restriktionsverdaus kann der Tabelle 6.8 entnommen werden.
Material und Methoden
69
Tabelle 6.8: Pipettierschema für analytischen Restriktionsverdau
Komponente Volumen
DNA 2 µL
Puffer (10x) 1 µL
Restriktionsenzym (10 U/µL) 1 µL
H2O 6 µL
Der Ansatz wird nach einer Inkubationszeit von 1 h bei 37°C mit 2 µL Ladepuffer
versetzt und mit einem Agarosegel bei 120 V aufgetrennt.
Präparativer Restriktionsverdau
Zu Klonierungszwecken wurden 1,5 µg Plasmid-DNA oder 30 µL PCR-Produkt in
einem Gesamtansatz von 50 µL mit Restriktionsenzymen geschnitten. Die
Zusammensetzung eines präparativen Restriktionsverdaus ist in Tabelle 6.9
dargestellt.
Tabelle 6.9: Pipettierschema für präparativen Restriktionsverdau
Komponente Volumen
DNA oder PCR-Produkt 1,5 µg
30 µL
Plasmid oder
PCR-Produkt
FastDigest®(FD) Puffer (10x) 5 µL
FastDigest®-Restriktionsenzym (10 U/µL) 1 µL
H2O 50 µL Gesamtvolumen
Nach einer Inkubation von 1 h bei 37°C wird 10 µL Ladepuffer hinzugegeben und
auf ein Agarosegel aufgetragen. Nach der Auftrennung bei 120 V werden die
Fragmente zur weiteren Verwendung auf einem UV-Tisch ausgeschnitten und im
Bindepuffer vom „Nucleospin Extract II“ Aufreinigungs-Kit von Macherey Nagel
(Düren) bei 50°C unter Schütteln gelöst, bevor mit dem Protokoll des Herstellers
fortgefahren wird.
Material und Methoden
70
Ligation von DNA-Fragmenten
Zur Ligation wird für ein 20 µL Ansatz 100 ng des Vektors und die 5-fache
Molmenge des Inserts eingesetzt. Als Kontrolle wird ein zusätzlicher Ansatz mit
H2O anstelle des Inserts dem Ligationsprozess unterzogen, um die Religation des
Plasmids abschätzen zu können. Die Ligation erfolgt für 2 h bei Raumtemperatur
(RT).
6.4.6 Transformation von Plasmid-DNA in E. coli
Für die Transformation wird 1 µL Plasmidlösung oder 10 µL Ligationsansatz zu
50 µL kompetenten Zellen gegeben und 20 min auf Eis inkubiert. Es folgt ein
Hitzeschock von 30 Sekunden für BL21 (DE3) Rosetta und 45 Sekunden für DH5α
bei 42°C. Anschließend werden zu den Zellen 850 µL LB-Medium gegeben und 1 h
bei 37°C inkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt von 5 min bei 5000 Upm
(centrifuge 5424, Eppendorf) werden 850 µL Überstand verworfen. Mit dem Rest
wird das Bakterienpellet resuspendiert. Diese etwa 50 µL werden auf vorgewärmte
antibiotikahaltige LB-Agarplatten ausplattiert und bei 37°C inkubiert.
6.4.7 Transformation von Plasmid-DNA oder PCR-Fragmenten in Hefe
Eine Übernachtkultur des Hefestammes wird am nächsten Morgen mit YPD-
Medium verdünnt, so dass eine 20 mL Kultur mit einer OD600 von 0,2 vorliegt.
Diese wird bei 30°C und 170 Upm für 3-5 h kultiviert und anschließend bei 4000
Upm 5 min zentrifugiert (centrifuge 5702, Eppendorf). Das Pellet wird mit 1 mL
0,1 M Lithiumacetat (LiAc) resuspendiert und für ein paar Sekunden bei 1400 Upm
zentrifugiert (centrifuge 5424, Eppendorf). Anschließend wird der Überstand
verworfen, das Pellet in 350 µL 0,1 M LiAc aufgenommen und in 50 µL Aliquots
aufgeteilt. Für eine Transformation wird ein 50 µL Aliquot verwendet. Dazu wird
jeder Ansatz mit 240 µL 50% PEG4000, 36 µL 1 M LiAc und 50 µL aufgekochter
carrier-DNA versetzt. Dann folgt die Zugabe der zu transformierenden DNA.
Integrative Plasmide müssen entsprechend der vorgesehenen Lokalisation im Gen
mit einem Restriktionsenzym linearisiert werden. Das verwendete
Restriktionsenzym muss deaktiviert (10 min bei 80°C) vorliegen, bevor 1,5 µg für
die Transformation eingesetzt werden können. Bei DNA aus der Knop-PCR werden
für die Transformation 25 µL verwendet. Nachdem die Bestandteile der Ansätze
Material und Methoden
71
durchmischt wurden, folgt eine Inkubation für 30 min bei 30°C. Nach der Zugabe
von 36 µL DMSO folgt eine Inkubation von 10 min bei 42°C. Es schließt sich ein
Zentrifugationsschritt bei 4000 Upm für 5 min an. Der Überstand wird verworfen
und das Pellet mit 80 µL H2O resuspendiert. Die Zellsuspension wird nun auf YPD
oder Agarplatten aus Minimalmedium ausplattiert. Werden Antibiotika als
Selektionsmarker verwendet, werden die auf YPD gewachsenen Kolonien nach drei
Tagen Inkubationszeit bei 30°C auf antibiotikahaltige YPD-Platten überstempelt. Für
den gesamten Transformationsvorgang sind ausschließlich sterile Lösungen und
Gefäße verwendet worden.
6.4.8 Verwendete Plasmide
Die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide sind in Tabelle 8.2 aufgelistet.
6.5 Biochemisch e Arbeitsmethoden
6.5.1 Proteinbestimmung
Die Konzentrationsbestimmung von Proteinen erfolgt über die Bradford-Methode
(1971). Dazu wird 1 mL 1:5 verdünntes Rothi-Qant-Reagenz (Cal-Roth, Karlsruhe)
mit einem bekannten Volumen der Probe versetzt und nach 10 min bei RT bei
595 nm photometrisch die Absorption bestimmt. Als Leerwert dient das
Nachweisreagenz ohne Protein. Die Konzentration wird anschließend über eine mit
BSA erstellte Regressionsgerade ermittelt.
6.5.2 SDS-Gelelektrophorese
Die SDS-Gelelektrophorese, die auch SDS-PAGE (Sodium-Dodecyl-Sulfat-
Polyacrylamid-Gelelektrophorese) genannt wird, dient der Auftrennung von
Proteinen nach ihrem Molekulargewicht unter denaturierenden Bedingungen. Dazu
wandern die Proteine unterschiedlich schnell im elektrischen Feld durch eine
Gelmatrix. Das SDS verleiht dem Protein eine negative Ladung (Laemmli 1970). In
dieser Arbeit wurden 12% und 15% SDS-Trenngele verwendet. Der SDS-Laufpuffer
setzt sich aus 192 mM Glycin, 25 mM Tris, 0,1% (w/v) SDS zusammen. Der
Ladepuffer nach Laemmli setzt sich zusammen aus 2% (w/v) SDS, 62,5 mM Tris, pH
8,0, 10% (v/v) Glycerol, 0,005% (w/v) Bromphenolblau und 2,5% ß-
Material und Methoden
72
Mercaptoethanol. Der jeweils verwendete Ladepuffer wurde immer kurz vor der
Verwendung angesetzt.
Es wurde das Gelsystem von BioRad (München) mit einer Geldicke von 1 mm
verwendet und für 50-60 min eine Spannung von 200 V angelegt. Gefärbt wurden
die Gele mit Roti-Blue (Carl-Roth; Karlsruhe) und entfärbt mit 25% Methanol.
6.5.3 Westernblot
Bei der Westernblot-Methode handelt es sich um einen Transfer von geladenen
Proteinen aus einer Matrix (hier Polyacrylamidgele) auf einer Nitrocellulose-
Membran über ein elektrisches Feld. Die transferierten Proteine können
anschließend auf der Membran immunologisch durch spezifische Antikörper
nachgewiesen werden. Die Blotkammer wurde mit Western-Transfer-Puffer
(192 mM Glycin, 25 mM Tris, 0,025% (w/v) SDS, 20% (v/v) Methanol) gefüllt. Der
Blot erfolgte bei 20 V und 400 mA für 1,45 h.
Nach dem Transfer wurde die Membran mit 5% (w/v) Milchpulver in PBS-Puffer
(137 mM NaCl, 2,7 mM KCl und 12 mM, 4,3 mM Na2HPO4, 1,4 KH2PO4, pH7,4) für
30 min inkubiert, um sie abzusättigen. Es folgen zwei 5 min Waschschritte mit TBS-
Tween (10 mM Tris pH7,4, 155 mM NaCl, 0,5% (v/v) Tween20) und anschließend
die Inkubation mit dem entsprechenden primären Antikörper für etwa 1 h. Es folgt
ein erneuter doppelter TBS-Tween Waschschritt. Als sekundärer Antikörper dient
der 1:10000 verdünnte Anti-Kanninchen-IgG Dylight™800 von Pierce, an den ein
Fluoreszenzfarbstoff konjugiert ist. Nach 1 h Inkubationszeit wird nochmals mit
TBS-Tween gewaschen, bevor der Puffer in PBS gewechselt wird. Alle Inkubationen
wurden in abgedunkelten Boxen unter Schütteln durchgeführt.
Die Detektion des Fluoreszenzsignals erfolgt durch den Odyssey-Scanner (LI-COR
Biosciences, Bad Homburg).
6.5.4 Proteinextraktion aus Hefe (nach Rödel)/TCA-Präzipitation
Die alkalische Lyse nach Rödel wird für die Extraktion des Gesamtproteins aus
Hefezellen verwendet. Sie dient der Analyse von Expressionsleveln von Proteinen
auf Westernblot-Ebene.
Für die Extraktion werden 0,5 OD600 Einheiten einer frischen Hefekultur verwendet.
Das Volumen wird mit H2O auf 500 µL aufgefüllt und mit 75 µL Rödel-Mix (1,85 N
Material und Methoden
73
NaOH, 1 M β-Mercaptoethanol und 1 mM PMSF) versetzt. Nach einer
Inkubationszeit von 10 min auf Eis werden die Proteine mit Trichloressigsäure
(TCA) ausgefällt.
Diese Methode der Proteinfällung wurde nicht nur im Zusammenhang mit der
alkalischen Lyse nach Rödel angewandt, sondern auch bei der Analyse der
Proteinzusammensetzung von Vakuolen.
Zur Fällung mit TCA wird die Probe mit 13% (w/v) TCA aus einer 100% (w/v) TCA-
Stammlösung versetzt und durchmischt bevor sie 10 min auf Eis inkubiert wird. Es
folgt eine Zentrifugation bei 4°C mit 20000 g für 10 min. Das Pellet wird mit 1 mL
Aceton versetzt und durch Schütteln gelöst. Es folgt eine erneute Zentrifugation.
Nach dem Absaugen des Acetons wird das Pellet bei 55°C getrocknet bevor es in
Laemmli-Ladepuffer aufgenommen wird.
6.5.5 Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen aus E.coli
Es werden 2 L LB-Medium mit BL21 (DE3) Rosetta Zellen, die das entsprechende
Überexpressionsplasmid tragen, angeimpft und bis zu einer OD600 von 0,8 bis 1,0
bei 37°C und 170 Upm inkubiert. Es folgt eine Induktion mit 0,75 mM IPTG über
Nacht bei 16°C. Am nächsten Morgen werden die Zellen bei 5000 Upm 10 min in
der Avanti-J-26 XP mit dem Rotor JLA 8.1000 abzentrifugiert (Beckman-Coulter,
Krefeld) und anschließend mit insgesamt 15 mL Lysepuffer (150 mM NaCl, 50 mM
HEPES pH7,4) mit zusätzlich 1 mM PMSF und 0,05 x PIC resuspendiert. Der
Aufschluss erfolgt mit einem Microfluidizer® M-110L (Microfluidics, Newton, U.S.A)
in drei Durchgängen. Es folgt ein Zentrifugationsschritt bei 15000 Upm in der
Avanti J-26 XP mit dem Rotor JA 25.50 für 20 min zur Abtrennung unlöslicher
Bestandteile. Der Überstand wird mit 750 µL Glutathion Sepharose 4B beads (GE-
Helthcare), die dreimal mit 10 mL Lysepuffer gewaschen wurden, für 1-2 h bei 4°C
inkubiert. Die beads werden mit Hilfe einer 10 mL Säule mit Filter (QIAGEN) vom
Lysat abgetrennt und mit 25 mL Lysepuffer gewaschen. Die Elution erfolgt in
500 µL Fraktionen mit Lysepuffer mit zusätzlich 15 mM reduziertem Glutathion. Die
Proteinkonzentration wird mit Roti-Quant (Cal-Roth, Karlsruhe) nach Angaben des
Herstellers bestimmt und die Fraktionen mit den höchsten Konzentrationen vereint
und über eine PD-10 Säule (GE-Helthcare, Freiburg) in Lysepuffer mit 10% Glycerol
Material und Methoden
74
umgepuffert. Nach dem Einfrieren in Stickstoff wurden die Proteine bei -80°C
gelagert.
6.5.6 Aufreinigung von His-Fusionsproteinen aus E.coli
Der Ablauf ist mit der Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen identisch. Es wird
anstelle von Glutathion Sepharose Ni-NTA Agarose (QIAGEN) als Affinitätsmatrix
verwendet. Außerdem werden vor der Elution mit 0,3 M Imidazol die beads mit dem
gebundenen Protein mit 15 mL 15 mM Imidazol haltigem Lysepuffer gewaschen.
6.5.7 Affinitätsaufreinigung von Proteinen aus S. cerevisiae
Es wurden aus S. cerevisiae ausschließlich Proteine mit einem TAP (Tandem-
Affinity-Purification)-Fusionsprotein aufgereinigt. Das Standardprotokoll beschreibt
die Aufreinigung aus 12000 ODs Hefezellen. Die Ernte der Zellen erfolgt bei 5000
Upm für 10 min in der Avanti J-26 XP (Beckman-Coulter, Krefeld) mit dem Rotor
JLA 8.1000. Das Zellpellet wird mit TAP-Puffer (50 mM HEPES pH 7,5, 300 mM
NaCl, 20 mM MgCl2) mit 0,5 mM PMSF und 1xFY Protease Inhibitor Mix (Serva,
Heidelberg) gewaschen. Je nach Verwendung der aufgereinigten Proteine wird dem
TAP-Puffer 0,15% IGEPAL C-630 zugefügt, um die Ausbeute zu steigern. An dieser
Stelle wird das gewaschene Pellet entweder bei -80°C gelagert oder es wird mit dem
Protokoll fortgefahren.
Das Pellet wird mit TAP-Puffer (mit zusätzlich 1 mM DTT, 1mM PMSF und 1xFY)
auf 25 mL aufgefüllt und resuspendiert. Der Zellaufschluss erfolgt in einer
Pulverisette-Planetenmühle (Fritsch, Idar-Oberstein) bei 500 Upm für 4 min und
zwei Wiederholungen mit einer Pause von 2 min bei 4°C. Dazu wird die
Zellsuspension im gleichen Volumen vorher mit Glaskügelchen (Durchmesser 0,4-
0,8 mm) vermischt. Die Glaskügelchen werden mit einer 50 mL Spritze (B.Braun,
Melsung) vom Lysat getrennt und dieses bei 4000 Upm für 10 min bei 4°C
zentrifugiert (centrifuge 5810R, Eppendorf). Der Überstand wird anschließend bei
100000 g für 1 h bei 4°C zentrifugiert. Die obere Lipidphase wird abgesaugt bevor
der Überstand zu 0,8 mL IgG-Sepharose (GE-Healthcare, Freiburg) gegeben wird, die
vorher mit 3x 15 mL TAP-Puffer gewaschen wurde. Die Inkubation mit dem Lysat
erfolgt unter Bewegung für 1-2 h bei 4°C. Anschließend werden die beads durch
einen Zentrifugationsschritt bei 1800 Upm für 2 min sedimentiert und in eine
Material und Methoden
75
MoBiCol-Säule (MoBiTec-Göttingen) überführt. Die beads mit den gebundenen
Proteinen werden mit 15 mL TAP-Puffer mit 0,5 mM DTT gewaschen.
Die Elution erfolgt in einem Volumen von 150 µL. Dazu wird zu den beads 150 µL
TAP-Puffer und 4 µL TEV-Protease (1 mg/ml) gegeben und bei 16°C für 1 h auf
einem Drehrad inkubiert. Durch Zentrifugation mit 5000 Upm bei 4°C werden die
beads von dem Eluat getrennt. Anschließend wird die Proteinlösung mit 10%
Glycerol versetzt und in Stickstoff eingefroren. Die Lagerung erfolgt bei -80°C.
6.5.8 SNARE-Assemblierung und HOPS Interaktion
Für die Assemblierung von SNARE-Proteinen wurden 10 µg eines GST-fusionierten
SNARE-Proteins und 12 µg der His6-fusionierten Interaktionspartner verwendet.
Die Ansätze werden mit TAP-Puffer mit 150 mM NaCl und 1 mM DTT auf 100 µL
Gesamtvolumen aufgefüllt und für 2 h bei 4°C unter Bewegung inkubiert. Zur
Untersuchung von Interaktionen mit SNARE-Proteinen werden zu den
Einzelproteinen die zu testenden Komponenten hinzugegeben. Das Waschen der
Glutathion Sepharose (GE-Healthcare, Freiburg) erfolgt in fünf Schritten. Zuerst
werden die beads mit dem zuvor verwendeten TAP-Puffer mit 3,5% BSA gewaschen
bevor vier weitere Waschschritte mit TAP-Puffer ohne BSA folgen. Zu den
Assemblierungsansätzen werden 15 µL der gewaschenen Sepharose hinzugegeben
und das Gesamtvolumen mit TAP-Puffer auf 200 µL erhöht. Es folgt eine weitere
Inkubation für 30 min bei 4°C. Nach dem Verwerfen des Überstandes werden die
beads viermal mit 0,5 mL TAP-Puffer gewaschen und anschließend in 2xLaemmli
Ladepuffer aufgenommen. Die Elution erfolgt durch Aufkochen bei 95°C für 5 min.
6.5.9 Homotypische Vakuolenfusion in vitro
Die Methode zur Aufreinigung und Fusion von Vakuolen wird durch Haas 1995
beschrieben.
Aufreinigung von Vakuolen
Hefekulturen mit einer OD600 von 0,8 bis 1 werden über Zentrifugation mit der
Avanti J-26 XP und dem Rotor JLA 8.1000 (Beckman-Coulter, Krefeld) bei 5000
Upm für 3 min geerntet. Das Zellpellet wird in 0,1 M Tris-Puffer pH 9,4 mit 1 mM
DTT resuspendiert und bei 30°C für 10 min inkubiert. Es wird der vorherige
Zentrifugationsschritt wiederholt und das Pellet in 10 mL Spheroplastenpuffer
Material und Methoden
76
aufgenommen, bei dem sich 100 mL aus 80 mL 0,2 x YPD, 15 mL 4 M Sorbitol und
5 mL 1 M KPi pH 7,5 zusammensetzt. Die resuspendierten Zellen werden zu 5 mL
Spheroplastenpuffer mit Lyticase hinzugegeben und bei 30°C für 20 min inkubiert.
Nach einem Zentrifugationsschritt bei 3500 Upm für 3 min bei 4°C mit dem Rotor
JA25.50 in der oben genannten Avanti Zentrifuge wird das Pellet mit 2,5 mL 15%
Ficoll (15% w/v Ficoll, 0,2 M Sorbitol, 10 mM PIPES/KOH pH6,8) und 200 µL DEAE
Dextran (0,4 mg/mL) versetzt und resupendiert. Es folgt eine Inkubation von 3 min
auf Eis mit einem anschließenden Hitzeschock bei 30°C für 1,5 min. Danach wird
die Zellsuspension in Ultrazentrifugenröhrchen für den SW40 Rotor von Beckman
pipettiert und mit jeweils 3 mL 8% Ficoll, 4% Ficoll und 0% Ficoll vorsichtig
überschichtet. Nach der Zentrifugation bei 30000 Upm für 1,5 h bei 4°C in der
Ultrazentrifuge Optima L-90K (Beckman-Coulter, Krefeld) mit dem Rotor SW40
werden die Vakuolen aus der Interphase zwischen 0% und 4% Ficoll geerntet und
über eine Proteinbestimmung mit Roti-Quant (Carl-Roth, Karlsruhe) quantifiziert.
Vakuolenfusion
Die Fusion erfolgt in 30 µL Ansätzen mit jeweils 3 µg BJ3505 und 3 µg DKY6281
Vakuolen. Dazu werden die geernteten Vakuolen zuerst mit 0% Ficoll auf eine
Proteinkonzentration von 0,3 mg/mL verdünnt. Es wird für jede Messreihe ein
Mastermix angesetzt um gleiche Ausgangsbedingungen zu schaffen. Dieser enthält
pro Ansatz 3 µL 10 x Fusionspuffer (1,25 M KCl, 50 mM MgCl2, 0,2 M Sorbitol und
10 mM PIPES/KOH, pH6,8), 10 µL BJ3505-Vakuolen (0,3 mg/mL), 10 µL DKY6281-
Vakuolen (0,3 mg/mL), 0,12 µL Koenzym A (2,5 mM) und bei einer ATP-abhängigen
Fusion 3 µL 10 x ATP regenerierendes System (5 mM ATP, 1 mg/ml Creatin Kinase,
400 mM Creatin Phosphat, 10 mM PIPES/KOH pH6,8 und 0,2 M Sorbitol). Bei
einer ATP-abhängigen Fusion wird zusätzlich 1 µL Sec18 (10 µg/mL) zugegeben,
bevor der Ansatz mit 0% Ficoll auf ein Gesamtvolumen von 30 µL aufgefüllt wird.
Die Fusion erfolgt bei 26°C für 90 min.
Nach der Zugabe von 470 µL Entwicklerlösung (10 mM MgCl2, 0,25 M Tris pH8,5,
0,4% (v/v) Triton X-100, 1,5 mM p-Nitrophenol-Phosphat) werden die Proben für
10 min bei 30°C inkubiert. Mit 500 µL Glycin, pH 11,5 wird die Reaktion gestoppt.
Die Quantifizierung erfolgt photometrisch bei 400 nm.
Material und Methoden
77
6.6 Mikroskopie
Für mikroskopische Untersuchungen wird eine Übernachtkultur auf eine OD600 von
0,3 mit YPD-Medium verdünnt und 3-5 h bei 30°C unter Schütteln kultiviert.
Anschließend werden die Zellen über einen Zentrifugationsschritt bei 3000 Upm für
3 min pelletiert und mit 1 mL PBS-Puffer gewaschen. Anschließend werden sie in
20 µL PBS-Puffer aufgenommen und mikroskopiert.
Es wird zur Mikroskopie ein Epifluoreszenz-Mikroskop (DM5500B; Leica),
ausgestattet mit Differenzialinterferenzkontrast-Optik, einem HCX PL APO 100x
1,46 oder 1,4-0,7 Öl-Objektiv, einer Kamera (DFC 350 FX; Leica) und Filter für GFP
(Anregung D480/30, Emmsion D535/40) und FM4-64 (Anregung D535/50x,
Emission E590LPv2; Chroma Technology Corp.) verwendet. Die Bilder werden in
Helligkeit und Kontrast mit Adobe Photophop CS3 optimiert.
6.6.1 FM4-64-Färbung
Der fluoreszierende lipophile FM4-64 Farbstoff wird von der Zelle über Endozytose
aufgenommen und an die Vakuole transportiert. Die Vakuolenmorphologie kann
dann mit einem Fluoreszenzmikroskop analysiert werden.
Die abzentrifugierten Zellen (siehe oben) werden mit 50 µL YPD-Medium
resuspendiert und mit 3 µL 0,3 mM FM4-64 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-
(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide; Invitrogen, Karlsruhe)
versetzt. Nach einer Inkubationszeit von 30 min bei 30°C (im Dunkeln), werden die
Zellen mit 500 µL YPD-Medium gewaschen und anschließend in 500 µL YPD-
Medium resuspendiert. Nach einer weiteren Inkubation bei 30°C für 1 h werden die
Zellen mit 500 µL PBS-Puffer gewaschen und in 20 µL PBS aufgenommen bevor sie
fluoreszenzmikroskopisch analysiert werden.
Material und Methoden
78
6.6.2 Calcofluor-Färbung
Calcofluor dient der Färbung von Chitin, das sich vor allem beim Ausbilden von
Knospen bei Hefezellen in einer ringartigen Struktur anreichert, die auch als Narbe
bezeichnet wird.
Für die Färbung wird 0,1% (w/v) Fluorescent Brightener 28 (Sigma-Aldrich,
Taufkirchen) in PBS-Puffer gelöst. Etwa 0,5 OD600 Einheiten einer Vorkultur
werden in 90 µL YPD-Medium resuspendiert und mit 10 µL der Färbelösung
versetzt. Nach 5 min werden die Zellen dreimal mit 1 mL PBS-Puffer gewaschen
und anschließend fluorszenzmikroskopisch analysiert.
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Anhang
88
8 An hang
8.1 Verwendete Hefestämme und Plasmide
Tabelle 8.1: In dieser Arbeit verwendete Hefestämme Stamm Genotyp Referenz BJ3505 MATa pep4∆::HIS3 prb1-∆1.6R lys2-208 trp1∆101 ura3-52 gal2 Haas, 1995
DKY6281 MATalpha leu2-3 leu2-112 ura3-52 his3-∆200 trp1-∆101 lys2-801 suc2-∆9
PHO8::TRP1
Haas, 1995
BY4732 MATa his3∆200 leu2∆0 met15∆0 trp1∆63 ura3∆0 Brachmann et al., 1998
BY4727 MATalpha his3∆200 leu2∆0 lys2∆0 met15∆0 trp1∆63 ura3∆0 Brachmann et al., 1998
BY 4720 MATalpha lys2∆0 trp1∆63 ura3∆0 Brachmann et al., 1998
CUY270 BJ3505 vam7∆::TRP1 Diese Arbeit
CUY291 BJ3505 VAM3::VAM3∆N Laage et al., 2001
CUY292 DKY6281 VAM3::VAM3∆N Laage et al., 2001
CUY2152 BY 4732 VPS41pr::TRP1-GAL1pr VPS41::TAP-URA3 Ostrowicz et al., 2010
CUY2675
BY4732xBY4727 VAM41::TRP1-GAL1pr VAM41::TAP-URA3 VAM39::KanMX-
GAL1pr VPS33::HIS3-GAL1pr VPS11::HIS3-GAL1Pr VPS16::natNT2-GAL1Pr
VPS18::kanMX-GAL1Pr-3HA
VPS33::HIS3-GAL1pr
VPS11::HIS3-GAL1Pr VPS16::natNT2-GAL1Pr VPS18::kanMX-GAL1Pr-3HA
VPS33::HIS3-GAL1pr
VPS11::HIS3-GAL1Pr VPS16::natNT2-GAL1Pr VPS18::kanMX-GAL1Pr-3HA
VPS33::HIS3-GAL1pr
VPS11::HIS3-GAL1Pr VPS16::natNT2-GAL1Pr VPS18::kanMX-GAL1Pr-3HA
VPS33::HIS3-GAL1pr
VPS11::HIS3-GAL1Pr VPS16::natNT2-GAL1P
Ostrowicz et al., 2010
CUY2839 BY4732 VPS33pr::TRP1-GAL1pr VPS33::TAPUra3 Ostrowicz et al., 2010
CUY2858 BY4732 VPS16::KanMX-Gal1Pr VPS16::TAP-Ura3 Diese Arbeit
CUY3210 BY 4732 VPS18pr::KanMX-GAL1Pr VPS18::TAP-URA3 Ostrowicz et al., 2010
CUY3588 BY4732xBY4720 VAM39::KanMX- Gal1Pr VAM39::URA3-TAP Diese Arbeit
CUY4291 BY4727 VPS11pr::HIS3-GAL1pr VPS11::TAP-URA3 Ostrowicz et al., 2010
CUY5506 BJ3505 vam7∆::TRP1 URA::pRS406-VAM3pr-Pal-VAM7∆PX Diese Arbeit
CUY5531 BJ3505 vam7∆::TRP1 VAM3::NOP1pr-VAM3∆N-kanMX Diese Arbeit
CUY5579 BJ3505 vam7::TRP1 VAM3::NOP1pr-VAM3∆N-kanMX URA::pRS406-VAM3pr-Pal-
VAM7∆PX
Diese Arbeit
CUY5642 BJ3503 VPS39::natNT2-ADHpr-GFP Diese Arbeit
CUY5643 BJ3503 VPS41::natNT2-ADHpr-GFP Diese Arbeit
CUY5644 BJ3503 YCK3::natNT2-ADHpr-GFP Diese Arbeit
CUY5645 BJ3503 vam7∆::TRP1 VAM3::NOP1pr-VAM3∆N-kanMX URA::pRS406-VAM3pr-
Pal-VAM7∆PX VPS39::natNT2-ADHpr-GFP
Diese Arbeit
CUY5646 BJ3503 vam7∆::TRP1 VAM3::NOP1pr-VAM3∆N-kanMX URA::pRS406-VAM3pr-
Pal-VAM7 VPS41::natNT2-ADHpr-GFP
Diese Arbeit
CUY5647 BJ3503 vam7∆::TRP1 VAM3::NOP1pr-VAM3∆N-kanMX URA::pRS406-VAM3pr-
Pal-VAM7 YCK3::natNT2-ADHpr-GFP
Diese Arbeit
CUY5674 DKY6281 vam7∆::natNT2 ura3::pRS406-Pal-Vam7∆PX Diese Arbeit
Anhang
89
CUY5693 DKY6281 vam7∆::hphNT1 VAM3::NOP1pr-VAM3∆N-kanMX URA::pRS406-
VAM3pr-Pal-VAM7 YCK3::natNT2-ADHpr-GFP
Diese Arbeit
CUY6385 BJ3503 URA::pRS406- VAM3pr-Pal-Vam7∆PX Diese Arbeit
CUY6386 DKY6281 URA::pRS406- VAM3pr-Pal-Vam7∆PX Diese Arbeit
Tabelle 8.2: In dieser Arbeit verwendete Plasmide
Name ProteinAS-Reste Vektor Schnittstelle Referenz pET28a-VAM7 Vam71-31 6 pET28a BamHI and EcoRI Von D. Langosch
(TU München) zur Verfügung gestellt
pET28a-VAM3∆TMD Vam31-26 4 pET28a BamHI and HindIII Diese Arbeit
pET28a-
VAM3∆N∆TMD
Vam3145- 26 4 pET28a BamHI and XhoI Diese Arbeit
pET28a-VTI1∆TMD Vti1aa1-18 9 pET28a BamHI and XhoI Diese Arbeit
pETHIS-YKT6 Ykt61-2 00 pET-HIS BamHI and HindIII Meiringer et al., 2008
pGEX-KT-VAM7 Vam71-31 6 pGEX-KT BamHI and EcoRI Merz und Wickner, 2004
EX-KT-VAM7∆PX m7126-31 6 EX-KT mHI and EcoRI Diese Arbeit
pGEX-2tk-VAM7SD Vam7190- 31 6 pGEX-2tk BamHI and EcoRI Diese Arbeit pGEX-KT-VAM7PX Vam71-12 9 pGEX-KT BamHI and EcoRI
VPS33::HIS3-GAL1pr
VPS11::HIS3-GAL1Pr
VPS16::natNT2-
GAL1P
Merz und Wickner, 2004
pGEX-KT-VAM3∆TMD Vam31-26 0 pGEX-2tk BamHI and EcoRI Dulubova et al., 2001
pGEX-2tk-NYV1∆TMD Nyv11-260 pGEX-2tk BamHI and XhoI Diese Arbeit
Anhang
90
8.2 Abkürzungsverz eichnis
(v/v) Volumenanteil (w/v) Gewichtsanteil ALP Alkalische Phosphatase (Pho8) Amp Ampicillin APS Ammoniumpersulfat AS Aminosäure Bp Basenpaare BSA Rinder Serum Albumin (Bovine serum albumine COP coat protein CORVET Class C core vacuole-endosome transport CPY Carboxypeptidase Y Cvt Cytosole to vacuole targeting DNA Desoxyribonukleinsäure DMSO Dimethylsulfoxid dNTP Desoxynukleotid DTT Dithiothreitol E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamin-tetraessigsäure g Erdbeschleunigung (9,81 m/s2) GAP GTPase activating proteins GDI GDP-dissociation inhibitor GDP Guanosindiphosphat GEF Guanine nucleotide exchange factor GST Glutathion-S-Transferase GTP Guanosintriphosphat His Histidin HOPS Homotypic vacuole fusion and vacuole protein sorting ILV Intraluminale Vesikel kDa Kilodalton M Molarität (mol/L) MVB Multivesicular body MW Molekulargewicht (molecular weight) NSF N-ethylmaleimide-sensitive factor ODxxx Optische Dichte bei einer Wellenlänge X PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction) PM Plasmamembran
Anhang
91
Q Glutamin (Gln) R Arginin (Arg) RT Raumtemperatur SD SNARE-Domäne SDS Natriumlaurylsulfat ( sodium dedecyl sulfate) SM Sec1/Munc18 SNARE soluble NSF attachment protein receptor TMD Transmembrandomäne Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan U Einheit enzymatischer Aktivität Upm Umdrehungen pro Minute VPS Vacuolar protein sorting Wdh Wiederholungen Ypt Yeast protein targeting
Anhang
92
8.3 Abbildungsverz eichnis
ABBILDUNG 1.1: STADIEN DER MEMBRANFUSION 7 ABBILDUNG 1.2: STRUKTUR UND LOKALISATION VON SNARE-PROTEINEN. 10 ABBILDUNG 1.3: KRISTALLSTRUKTUR DES NEURONALEN SNARE-KOMPLEXES. 11 ABBILDUNG 1.4: SNARES-ABHÄNGIGER FUSIONSZYKLUS. 12 ABBILDUNG 1.5: LOKALISIERUNG DER MULTISUBUNIT TETHERING-KOMPLEXE UND IHRER RAB-GTPASEN IN S.
CEREVISIAE 16 ABBILDUNG 1.6: DIE ROLLE DES HOPS-KOMPLEXES BEI DER MEMBRANFUSION. 18 ABBILDUNG 1.7: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DER HOMOTYPISCHEN VAKUOLENFUSION IN VITRO 19 ABBILDUNG 3.1: ASSEMBLIERUNG VON SNARE-PROTEINEN 22 ABBILDUNG 3.2: ÜBERPRÜFUNG DER AKTIVITÄT DES AUFGEREINIGTEN HOPS-KOMPLEXES 23 ABBILDUNG 3.3: WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN DEM HOPS UND DEM SNARE-KOMPLEX 24 ABBILDUNG 3.4: WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN HOPS UND EINZELNEN SNARE-PROTEINEN 25 ABBILDUNG 3.5: IDENTIFIZIERUNG DER HOPS-BINDEDOMÄNEN VON VAM7 26 ABBILDUNG 3.6: WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN HOPS UND ASSEMBLIERTEN SNARE-PROTEINEN 27 ABBILDUNG 3.7: WECHSELWIRKUNG DES HOPS MIT DEM MINIMALEN Q-SNARE-KOMPLEX 28 ABBILDUNG 3.8: WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN HOPS-UNTEREINHEITEN UND SNARES 29 ABBILDUNG 3.9: ANALYSE DER FUSION VON WILDTYP- UND VAM3∆N-VAKUOLEN 31 ABBILDUNG 3.10: VAKUOLENMORPHOLOGIE DER ZELLEN OHNE VAM7 PX-DOMÄNE 33 ABBILDUNG 3.11: FUSION VON VAKUOLEN MIT VERKÜRZTEN SNARES 34 ABBILDUNG 3.12: KOOPERATION VON SNARES UND HOPS WÄHREND DER FUSION 35 ABBILDUNG 3.13: KOMPETITION VON Q-SNARES MIT HOPS 37 ABBILDUNG 3.14: QUANTIFIZIERUNG DES ZYTOKINESEDEFEKTS 38 ABBILDUNG 3.15: CALCOFLUOR-FÄRBUNG 39 ABBILDUNG 3.16: UNTERSUCHUNG DER HOMOTYPISCHEN VAKUOLENFUSION IN VIVO 40 ABBILDUNG 3.17: UNTERSUCHUNG DER VAKUOLENVERERBUNG 41 ABBILDUNG 3.18: LOKALISATION VON MARKERPROTEINEN AUF DER VAKUOLE 42 ABBILDUNG 3.19: LOKALISATION VON GFP-FUSIONIERTEN MARKERPROTEINEN 43 ABBILDUNG 3.20: PHO8-AKTIVITÄT IM VERGLEICH ZUM WILDTYP 44 ABBILDUNG 3.21: UNTERSUCHUNG DER FUSIONSINHIBITION DURCH PALMITOYLIERTES VAM7 45 ABBILDUNG 4.1: VERGLEICH DER AMINOSÄURESEQUENZ VON VPS33 AUS HEFE MIT NEURONALEM
SEC1/MUNC18 49 ABBILDUNG 4.2: MODELL FÜR DAS ZUSAMMENSPIEL VON HOPS UND SNARES IM FUSIONSZYKLUS 59
Anhang
93
8.4 Tabellenverz eichnis
TABELLE 6.1: VERWENDETE ANTIBIOTIKA 63 TABELLE 6.2: PCR-ZYKLUS FÜR DIE PFU-DNA-POLYMERASE 65 TABELLE 6.3: PIPETTIERSCHEMA FÜR PFU-PCR 66 TABELLE 6.4: PCR-ZYKLUS FÜR KNOP-PCR 66 TABELLE 6.5: PIPETTIERSCHEMA FÜR KNOP-PCR 67 TABELLE 6.6: PCR-ZYKLUS FÜR KOLONIE-PCR 67 TABELLE 6.7: PIPETTIERSCHEMA FÜR KOLONIE-PCR 68 TABELLE 6.8: PIPETTIERSCHEMA FÜR ANALYTISCHEN RESTRIKTIONSVERDAU 69 TABELLE 6.9: PIPETTIERSCHEMA FÜR PRÄPARATIVEN RESTRIKTIONSVERDAU 69 TABELLE 8.1: IN DIESER ARBEIT VERWENDETE HEFESTÄMME 88 TABELLE 8.2: IN DIESER ARBEIT VERWENDETE PLASMIDE 89