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第七章转基因植物的检测与鉴定

主要内容

一、PCR检测

二、报告基因的表达检测

三、Southern杂交鉴定

四、Northern杂交鉴定

五、外源基因表达蛋白的检测

六、其它方法

根据国内外几十年的研究，目前认为转基因植物

的证据应有以下几点：

① 要有严格的对照（包括阳性及阴性对照）；

② 转化当代要提供外源基因整合和表达的分子生

物学证据（PCR检测、Southern杂交，Northern

杂交，Western杂交）与表型数据（酶活性分析

或其它）；

③ 提供外源基因控制的表型性状证据（如抗虫、

抗病等）；

④ 根据该植物的繁殖方式（有性繁殖还是无性繁

殖）提供遗传证据。有性繁殖作物需有目的基

因控制的表型性状传递给后代的证据，无性繁

殖作物有繁殖一代稳定遗传的证据。

一、PCR检测

1. 概述

2. 基本原理

3. 特点

4. 步骤

一、PCR检测1. 概述

PCR是聚合酶链式反应（polymerase chain

reaction）的简称。它模拟DNA聚合酶在生物体

内的催化作用，根据检测的目的片段及一定的原则设计引物，与模板DNA经过变性、退火、延伸三步骤的数个循环，对特异DNA序列进行扩增，可以在一只小小的离心管中几小时内使目的DNA

片段扩增数百万倍。

一、PCR检测

1. 概述

PCR检测所需的模板量仅为10ng以内，而且粗提的DNA就可以得到良好的扩增效果，因而这一

技术的出现为外源基因整合的检测提供了便利条件，尤其是在转化材料少又需及早检测的时候。但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩增，因此检测的只是初步结果。

穆利斯(Kary Mullis 1944～)

美国化学家

Nobel prizewinners in

chemistry 1994

一、PCR检测2. 基本原理

• DNA模板变性

双链DNA是通过94℃左右的高温使其发生变性，形成单链DNA。

• 模板与引物退火

将合成的两个寡核苷酸引物分别与待扩增DNA两端的序列互补。通过控制退火条件，引物就能准确地与扩增区域的两端配对。

一、PCR检测

2. 基本原理

• 引物延伸

在4种dNTP底物及Mg2+存在条件下，DNA聚合酶在最适作用温度可将单核苷酸从引物3′端掺入，沿模板延伸合成新股DNA，每一循环的产物可作为下一循环的模板。

PCR的基本原理

1 2 3 4 5

22

55

72

94

时间（min）

温度

（℃）适温延伸3高温变性

1低温退火

2重复1~3步

25~30轮

目的DNA片段

扩增100万倍以上

DNA双螺旋

DNA单链

与引物复性

DNA

变性

形成2

条单链

子链延伸

DNA加倍

PCR的基本原理• PCR反应条件• PCR过程• PCR的特点

1 2 3 4 5

22

55

7294

时间（min）

温度

（℃）

适温延伸3

高温变性1

低温退火2

重复1~3步

25~30轮

目的DNA片段

扩增100万倍以上

DNA双螺旋

DNA单链

与引物复性

子链延伸

DNA加倍

DNA

变性

形成2

条单链

模板DNA

95℃


95℃50℃

引物1

引物2

DNA引物


50℃

引物1

引物2

DNA引物

72℃Taq酶

Taq酶


72℃

第1轮结束

95℃

第2轮开始


95℃50℃

72℃

Taq

Taq

Taq

Taq


72℃

第2轮结束

• PCR反应条件• PCR过程• PCR的特点

重复30轮后

230=1,073,741,824

模板DNA第1轮扩增第2轮扩增

第3轮扩增

第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增

理想拷贝数=2n

n 循环次数

实际拷贝数=(1+x)n

X 平均效率,约为0.85

n 循环次数

一、PCR检测

3. 特点

3.1高度的敏感性

PCR产物的生成是以指数方式增加的，即使按75%的扩增效率计算，单拷贝基因经25次循环后，其基因拷贝数也在100万以上，即可将极微量(pg级)DNA扩增到紫外光下可见的水平(g级)。

3.2高度的特异性

PCR扩增的特异性在很大程度上依赖于引物与模板的互补程度，即引物与模板结合的正确性。

3.3 操作简便、快速

4.4 适用样品广泛

含微量(pg、ng)目的DNA或RNA的样品即可

用作反应的起始材料。

一、PCR检测

4. 步骤1）引物设计及合成

引物：PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互

补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA

序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，

利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

1）引物设计及合成

①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC

最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。


④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3 ’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。


⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

4. 步骤

2）模板DNA的制备

提取植物基因组DNA或总DNA；

制备方法可用小量提取法或大量提取法；

检测时要有阳性和阴性对照，阳性对照可用质

粒DNA，阴性对照可从未转基因的植株中提取。

4. 步骤3）反应体系设置

Parameter Concentration

Template

pH

dNTPs

Gelatin

Primers

Mg2+ oncentration

Enzyme

Total volume

10 attomoles(~1×106 molecules)

8.4（10mM Tris-Hcl）

200 μ M(each one)

100 g/ml (optional)

0.5 μ M(each one);(0.1—1.0μ M)

>0.5mM< 10mM1 unit

25—100μ l

4. 步骤

4）反应条件设置

变性 90-97℃ / 30-60s

退火 45-55℃/3 0-60s

延伸 72℃左右

循环次数 25-30 不超过35

940C,2’940C,1’420C,1’720C,2’720C,10’

|-------30 cycles-------|

DNA模板

DNA引物

dNTP

TaqDNA聚合酶

电泳槽

核酸或蛋白质的电泳定性分析时的凝胶支架

5）扩增产物的检测

电泳时提供电压和电流

凝胶成像系统

电泳结果的定性和

定量分析

bp

1200

900700500300100

.

M, 1200bp Marker; 1, 载体质粒；2，非转化烟草；3~14，转化烟草

1, Vector plasmid; 2, Non-transgenic tobacco; 3~14, Transgenic tobacco.

6. RT-PCR（反转录PCR）Reverse Transcribed PCR

• RT-PCR方法可检测外源DNA在植物体内的转录表达。

• 原理是以植物总RNA或mRNA为模板进行反转录，然后再经PCR扩增。如果从细胞总RNA提取物中得到特异的cDNA扩增条带，则表明外源基因实现了转录。

• 此法简单、快速，但对外源基因转录的最后决定，还需与Northern杂交的实验结果结合分析。

0.8-1.0%琼脂糖凝胶电泳


1. 概述

报告基因（reporter gene）是指其编码产物

能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已

经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其

表达活性的一类特殊用途的基因。


1. 概述

报告基因必须具有两大特点：

① 报告基因的表达产物及产物的类似功能在未

转化的植物细胞内并不存在；

②便于检测。

2. 报告基因的应用

① 启动子的检测

② 反式作用因子的检测

③ 相关蛋白质的分离

④ 基因工程细胞系的建立

3. 常用的报告基因

3.1 β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUS）基因

编码基因：gusA（uidA）

检测方法：

1）组织化学法

﹡ 底物：X-Gluc（5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸）

﹡ 在酶活性部位呈现蓝色，即可观察定位。

﹡ GUS染色液：X-Gluc 5 mg

氯霉素 1 mg

0.1 M NaH2PO4 5 ml

Triton X-100 0.1 ml

甲醇 2 ml

H2O 补至 50 ml

﹡ 步骤：

把准备好的试材浸泡在染

色液中，于37℃保温育1

小时至过夜，叶片等绿色

材料转入70％乙醇中脱色

2-3次，至阴性材料呈白色，

肉眼或显微镜下观察，白

色背景上的蓝色小点即为

GUS表达位点。

转基因烟草中gus基因的表达

上：转基因烟草根中gus基因的表达；左下：转基因烟草植株中gus基因的表达；右下：对照

转基因水稻根、茎和叶的GUS组织化学分析

A B C

a

b

c

a

b

c

a

b

c

A, 根系； B, 茎杆；C, 叶片。a, Gus 基因由35S启动子驱动； b,

Gus 基因由蔗糖合酶基因RSuS1的启动子序列驱动； c, 未转基因水稻植株。

2）荧光法

﹡ 底物：4-甲基伞形酮酰- β-D-葡萄糖醛酸苷

（4-methylumbelliferyl- β-D-glucuronide, 4-MUG）

﹡ GUS催化其水解为4-甲基伞形酮（4-

methylumbelliferone，4-MU）和β-D-葡萄糖醛酸。

4-MU分子中的羟基解离后被365 nm的光激发，产

生455 nm的荧光，可用荧光分光光度计定量。

﹡ 单位：mg(μ g)(ng)/(min·mg蛋白）

3）分光光度法﹡ 底物：对硝基苯基- β-D-葡萄糖醛酸苷

（p-nitrophenyl-β-D-glucuronide, PNPG)

﹡ GUS将其水解生成对硝基苯酚（p-nitrophenol），在

pH7.15时离子化的发色团吸收400-420 nm的光，溶液呈

黄色。

﹡ 分别在反应开始后不同时间取样，终止反应后于415 nm

测定吸收值。

3.2 绿色荧光蛋白基因Green fluorescent protein, GFP

﹡ 绿色荧光蛋白是一些腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白，能在激发光作用下发射出荧光。

﹡ GFP荧光具有以下优点：

1）适用于各种生物的基因转化；

2）检测方法简便。无需底物、酶、辅因子等物质，只有有紫外光或蓝光照射，其表达产物即可发出绿色荧光；

3.2 绿色荧光蛋白基因Green fluorescent protein, GFP

3）便于活体检测，十分有利于活体内基因表达调控的研究；

4）检测时可获得直观信息，有利于转基因植物安全性问题的研究及防范。

转GFP 小鼠

Expression pattern population

水稻矮缩缩病毒S9编码蛋白Pns9可能定位于内质网

水稻矮缩病毒S6基因可以补偿马铃薯X病毒细胞间运动突变

体在选择性寄主-普通烟草（N. tabacum）中的细胞间运动

B

G HF

20 m

E

DC

50 m

A

水稻矮缩病毒细胞间运动蛋白和绿色荧光蛋白的融合蛋白在烟草表皮细胞中的表达

a b

洋葱表皮细胞中的GFP基因在MS培养基上的表达

左.pBI35S#GFP 右.pBI29A#GFP

3.3 氯霉素乙酰转移酶基因Chloramphenicol acetyltransferase, CAT

1) 原理

此酶催化酰基由乙酰CoA转向氯霉素，乙酰化

了的氯霉素失去了干扰蛋白质生物合成的作用。真

核细胞不含氯霉素乙酰转移酶基因，因而cat基因可

作为真核细胞转化的标记及报告基因， cat基因转化

的植物细胞能够产生对氯霉素的抗性，并可通过对

转化细胞中CAT活性的检测来了解外源基因的表达。

3.3 氯霉素乙酰转移酶基因Chloramphenicol acetyltransferase, CAT

2）CAT的活性可通过反应底物乙酰CoA的减少或反应产

物乙酰化氯霉素及还原型CoASH的生成来测定。目

前常用的方法有：薄层层析法和DTNB法。

3.4 冠瘿碱合成酶基因的检测

1）冠瘿碱合成酶基因存在于农杆菌Ti或Ri质粒上，该基

因的启动子是真核性的，在农杆菌中，该基因并不表达，整合到植物染色体上后进行表达，编码与冠瘿碱合成有关的酶，催化冠瘿碱合成。

2）冠瘿碱的几种形式：胭脂碱、章鱼碱、农杆碱、琥珀碱、甘露碱等。

3.4 冠瘿碱合成酶基因的检测

3）目前已发现的催化冠瘿碱合成的酶主要有两种：

a）胭脂碱合成酶（nopaline synthase），又叫胭脂碱脱氢酶（nopaline dehydrogenase），简称NpDH，催化的反应为：

精氨酸+α-酮戊二酸+NADH 胭脂碱+NAD+NpDH

b）章鱼碱合成酶（octopine synthase），又叫

Lysopion脱氢酶（D-（+）-lysopion

dehydrogenase），简称LpDH。催化的反应为：

精氨酸+丙酮酸+NADH 章鱼碱+NAD+

4）冠瘿碱的检测方法：用纸电泳分离被检组织抽

提物，然后用菲醌染色。菲醌是胍基类化合物的

特异染色剂，与精氨酸、胭脂碱、章鱼碱作用后

在紫外光下显示黄色荧光，放置两天后变为蓝色。

NpDH

3.5 新霉素磷酸转移酶II基因Neomycin phosphotransferase II，nptII 1）该基因来源于细菌转座子Tn5上的ahpA2，该酶能

使氨基糖苷类抗生素（卡那霉素、新霉素、庆大霉素、巴龙霉素等）磷酸化而失活。

2）检测原理：使用放射性标记的 [γ 32p] ATP，通过

γ -磷酸基团的转移，生成带放射性的磷酸卡那霉素。

3）检测方法：

点渍法层析法凝胶原位杂交法

3.6 荧光素酶基因

1）用作报告基因的的荧光素酶基因主要来自萤火虫

或细菌。

2）荧光素酶在催化的化学反应中将化学能转变为光

能。

3）可在活体或离体条件下进行检测。

转萤火虫荧光素酶基因烟草

3.7 其它基因

a) pat基因：编码PPT乙酰转移酶（PAT）

b) 二氢叶酸还原酶基因

三、Southern杂交鉴定

1. 概述

核酸分子杂交技术，是于1968年由华盛顿卡

内基学院（Cavnegie Institute of Washington）的

Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是，

带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，

当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退

火形成双链的结构。

根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分

离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后

通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检

测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做

DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于

1975年首先设计出来的，故又叫Southern DNA 印

迹转移技术。

2. Southern杂交的实验流程

同探针同源杂交的基因DNA片段

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

基因组DNA

DNA限制片段

硝酸纤维素滤膜

X光底片

（1）植物基因组DNA的提取

1）CTAB法：

cetyltriethylammonium bromide，十六烷三甲基溴化铵，

一种阳离子去污剂，使细胞膜破裂，同时将核酸与植物多糖

等杂质分开。

2）SDS法：

sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠，一种去污剂，

高浓度的SDS可裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释

放出核酸。

DNA电泳图

3）样品的浓度及纯度

紫外吸收法测定核酸含量(DNA/RNA)

• 纯度：DNA和RNA的纯品的OD260/OD280值分别为1.8和

2.0。当核酸样品中污染有蛋白质或酚，其OD260/OD280

值将明显偏低。

• 浓度：OD值为1相当于大约50μg/ml 双链DNA，40μg/ml

单链DNA或RNA及大约20μg/ml的单链寡核苷酸。

DNA浓度(μg/ml)=(A260nm×稀释倍数)/(0.020×L)

式中：A260nm为260nm波长处光吸收读数；L为比色

皿的厚度，一般为1或0.5cm；0.020为每ml溶液中含1μg

DNA钠盐时的光吸收。

（2）探针的制备

• 探针是指经特殊化合物标记的特定的核苷酸序列。用于核酸分子杂交的探针有基因组DNA探针、cDNA探针和RNA探针。

• 根据标记物是否有放射性探针可分为放射性探针和非放射性探针。放射性探针灵敏度高，重复性好，但对人体有害；非放射性探针灵敏度较差，但无毒害性。

• 放射性同位素（32P）标记探针的方法：

随机引物合成法

PCR法

切口平移法

末端标记法

• 非放射性探针：

生物素

地高辛

碱性磷酸酶

辣根过氧化物酶

荧光素

…

（3）植物DNA的限制性酶切

• 限制性酶的选择：可选用价格便宜、识别6碱基序列的限

制性酶，要求限制性酶在目的基因内部不应有酶切位点，从而保证杂交带中能分析出外源基因的拷贝数，可进行单酶切或双酶切。

• 酶切反应体系：

10×buffer 10% V

DNA溶液 <80% V

限制性酶 <10% V

H2O 补至 100% V

• 酶切效果检测

将酶切样品用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳分离，

酶切效果好的样品应呈现一条连续的条带。

涂抹片状，smear

（4）酶切DNA的电泳分离

• 凝胶一般为浓度0.8%的琼脂糖。

• 样品及样品量：

分子量标准、阳性对照、阴性对照、转基因植物的DNA要点在同一块胶上。

分子量标准一般上样0.5，阳性对照质粒DNA上样0.5-1μg，阴性对照和转基因植物的DNA上样15-30 μg。

• 电泳条件：低电压、长时间，一般1 V/cm电泳16 h。

• DNA变性：碱变性 0.5 mol/L NaOH +1.5 mol/L NaCl

酶切电泳检测结果

（5）印迹（转膜）

• 固相膜的种类：

硝酸纤维素膜

尼龙膜

• 印迹方法：

毛细管转移法

电转移法

真空转移法

（6）杂交

• 探针浓度：0.5 ng/ml

• 杂交反应温度：杂交液为5×SSC-6×SSC，不含甲酰胺时采用68℃；有变性剂甲酰胺时采用42℃。

• 杂交时间：根据探针的长度和浓度而定，一般为12-16 h。

• 步骤：

预杂交

杂交

洗膜

（7）杂交信号的检出

• 放射性标记的探针通过放射自显影检

测。

• 非放射性标记的探针可通过酶反应的

方法进行检测。

Southern blot

3. PCR-Southern杂交• PCR-Southern杂交是将PCR技术与Southern杂交结合

起来的一种检测外源基因整合的方法。

• 用外源基因特异引物对被检材料进行PCR扩增，然

后再用目的基因的同源探针与PCR扩增产物进行

Southern杂交，以检出外源基因。

• 使用的样品量少，对样品DNA纯度的要求不太高，

操作简便。

4. Southern斑点杂交

• 斑点杂交（dot blot）

可以较快地大略检测

植物基因组内是否含

有外源基因。

• 缺点：假阳性率较高。

四、Northern杂交鉴定1. 概述

Northern杂交是指将细胞组织中的总RNA

或mRNA样品，经变性电泳分离后，将其转移

到固相支持物（如尼龙膜）上，然后与特异探

针（DNA或RNA探针）杂交，从而鉴定特定

mRNA分子存在与否或量的多少。

2. Northern杂交的程序

（1）植物RNA的提取

1）RNA操作概述：

• 创造一个无RNase的环境，用DEPC（焦碳酸二乙酯）处理器皿与试剂。

• DEPC的分子式为C2H5-O-CO-O-CO-O-C2H5，为粘性液体，是很强的RNase抑制剂，作用机制是通过与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。

• DEPC也能与RNA或单链DNA反应，破坏单链核酸中大部

分腺嘌呤环。但它破坏单链核酸的浓度要比使蛋白质变性大100-1000倍。

• DEPC不能用聚苯乙烯器皿存放，保存在4℃或液氮中，

可防止DEPC降解。

• DEPC是一种致癌剂，DEPC靠结合到RNA酶上而使之失

活。高温高压处理后它分解成CO2和乙醇。

• DEPC处理好的器皿及溶液经高温高压灭菌处理20 min，

以除去残余的DEPC，不能高压灭菌的试剂用DEPC处理

的灭菌蒸馏水配制。

• 实验全过程中必须谨防RNase污染，操作人员要使用一

次性手套进行操作。

2）RNA的提取方法

异硫氰酸胍法

苯酚法

氯化锂沉淀法

3）RNA样品质量检测

• 用于Northern杂交的RNA样品应是纯净的，无明显的

DNA、蛋白质污染，无严重降解。

• RNA样品质量检测方法：

A）紫外吸收法：

RNA纯度：测量260 nm 和280 nm 的吸光度，纯RNA的

260 nm/280 nm比应在2左右。

RNA浓度：在分光光度计上读取260 nm吸光度值，1吸光

度=40 g/ml。

B）琼脂糖凝胶电泳法：

• 用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳后应呈现3条明

显的条带，即28 S rRNA，18 S rRNA，5 S rRNA。

• 28 S rRNA条带的亮度应为18 S rRNA的两倍，如果28 S

rRNA的亮度不如18 S rRNA条带，表明样品中RNA有降

解。

• 如果在点样孔或其附近有荧光区代，则表明RNA样品

中有蛋白质或DNA污染。

RNA电泳图

28S rRNA18S rRNA

5S rRNA

（2）探针制备

• 可制备成目的基因或报告基因的DNA探针或

RNA探针。

• 探针制备方法与Southern杂交基本相同。

（3）RNA电泳

为防止单链RNA形成高级结构，RNA电泳要采

取变性凝胶电泳。

甲醛变性凝胶电泳

乙二醛变性凝胶电泳

常用甲醛变性凝胶电泳。

甲醛变性凝胶电泳1）制胶

制备1%甲醛-MOPS琼脂糖凝胶（100 ml）

MOPS 5× 20ml

电泳级琼脂糖 1g

H2O 70ml (65ml+5ml)

DEPC处理，高温高压灭菌。

由于制胶过程要经历高温高压灭菌级微波炉融化，有大量水分丧失，因此事先多加入5ml水。待冷却至55℃~60℃

（或先凝固，到正式制胶时再用微波炉小火融化，等冷却至55℃~60℃）加入 37%甲醛溶液17.14ml，混匀，倒胶。

2）样品制备

按12混合RNA样品溶液和RNA样品缓冲液（总体积不超过

30l）；

65℃烘箱放置5min；

冷却至室温，各滴加2l上样缓冲液（RNA用），混匀。

3）电泳

将胶浸入MOPS 1×电泳缓冲液中，80V预电泳10min；

点样；

80～100V（约4.5V/cm）电泳，直至溴酚蓝条带跑完3/4胶。

（4）转膜、杂交和检测

1）凝胶处理

将甲醛-MOPS琼脂糖凝胶置于DEPC处理过的20×SSC

中，以达到去处甲醛和平衡的目的。

2）转膜

毛细管法转膜（具体操作略）。

3）杂交

4）检测

mRNA

rRNA

Northern杂交

Northern杂交

五、外源基因表达蛋白的检测

外源基因表达蛋白的检测方法主要有两种：

① 酶联免疫吸附法（enzyme-linked immuno

sorbent assay，ELISA）

② Western杂交

1. 酶联免疫吸附法（enzyme-linked immuno

sorbent assay，ELISA）

• ELISA是一种利用免疫学原理检测抗原、抗体的技术。

ELISA与经典的同位素标记为基础的液－液抗原－抗体反

应体系不同之处在于建立了固－液抗原抗体反应体系，

并采用酶标记，抗体与抗原的结合通过酶反应来检测。

• 由于酶的放大作用，使测定的灵敏度极高，可检测出1pg

的目的物，同时酶反应还具有很强的特异性。

• 缺点是易出现本底过高问题，重复性较差。

ELISA检测程序

（1）抗体的制备

抗体是机体应抗原刺激产生的一组特殊的球蛋白，以Ig表示。

ELISA检测中涉及到的抗体有：

一抗：针对特异抗原的酶标一抗

二抗：针对一抗的酶标二抗

未标记的抗体

酶标记的抗体

1）通过免疫反应制备抗体

• 抗原制剂的制备

常使用免疫佐剂，如福氏佐剂

完全福氏佐剂：1份羊毛脂+5份石蜡油混合后加入

3-4 mg/ml卡介苗

不完全福氏佐剂： 1份羊毛脂+5份石蜡油

• 免疫动物

最常用的动物是家兔，此外还有鼠、山羊、鸡、马等。

• 抗血清制备

抗血清是指含有某种特异抗体的动物血清。

• 抗体的纯化

2）抗体的酶标记

• 酶标记是指使抗体与酶交联。

• ELISA使用的酶应具有特异性强、纯度及比活高、室温下

稳定、来源方便、价格便宜等优点。

• 目前主要使用辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶

（AKP）。

• 目前酶标抗体已有试剂出售，便于各种ELISA测定。

（2）包被

• 包被是指将抗原或抗体固定在固相载体表面，又叫包

埋。

• 包埋可采用物理吸附或共价交联的方法。

• ELISA中最常用的固相载体是多孔的聚苯乙烯微量反应

板，其对蛋白质有较强的物理吸附作用，与蛋白类抗

原（体）结合。

（3）免疫反应

• 抗原与抗体结合。

• ELISA检测可溶性抗原主要有两种方法：

夹心法

间接法

（4）检出

• ELISA最后是通过酶反应检出

• 目前最常用的酶-底物系统见下表酶底物产物颜色测定波长

（nm）

辣根过氧化物酶（HRP） 3，3‘-二氨基联苯胺深褐色沉淀

5-氨基水杨酸棕色 449

邻苯二氨橘红色 492，460

邻联甲苯胺蓝色 425

碱性磷酸酶（AKP） 4-硝基酚磷酸黄色 400

苯酚-As-Mx磷酸盐-+重氮盐红色 500

2. Western杂交

Western杂交是将聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分

离抗原（Antigen）固定在固体支持物上（如硝酸纤维素膜，

NC膜）。不同分子量大小的蛋白质在凝胶中迁移率不同，据

此可确定特定的抗原存在与否以及相对丰度，或者蛋白质是

否遭到降解等。蛋白质电泳后转到NC膜，放在蛋白质（如牛

血清蛋白BSA）或奶粉溶液中，温育，以封闭非特异性位点，

然后用含有放射性标记或酶标记的特定抗体杂交，抗原-抗

体结合，再通过放射性自显影或显色观察。

（1）植物蛋白质的提取

• 植物细胞的功能蛋白绝大多数都能溶于水、稀盐、稀酸和

稀碱溶液中，提取时以水浴为主，其中稀盐溶液和缓冲液

对蛋白质的稳定性好、溶解度大，是提取时最常用的溶剂。

• 在提取过程中要防止变性和被降解，一般用等渗缓冲提取

液（pH3-6）、在低温（4℃）下进行操作。

（2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（SDS-PAGE）

• PAGE浓度为8-20%。

• 步骤：

点样

电泳

染色与脱色

（3）蛋白质印迹

• 蛋白质印迹是将SDS-PAGE电泳分离的蛋白质区带，利用某

种动力（毛细作用、扩散作用或电动力）由凝胶转移到固相膜上，然后与探针，即特异性抗体反应。

• 一般针对目的抗原的第一抗体不标记，第二抗体要标记，二抗能与一抗及抗原形成的复合物特异结合，从而检测出特异的蛋白质（抗原）区带。

• 印迹使用的固相膜有硝酸纤维素膜（NC膜）和重氮化纤维素膜等。

• 印迹的方法主要有电印迹法和被动扩散法。

（4）探针（抗体）制备

• 探针是针对目的蛋白的抗体，又称一抗，按抗体制备

方法制备。

• 一抗可使用由目的蛋白制成的抗血清或单克隆抗体。

• 标记物有放射性和非放射性两种。放射性标记主要使

用32P、125I等，非放射性标记主要是酶（过氧化物酶和

碱性磷酸酶）。

• 一般情况下，根据使用的第一抗体来选择第二抗体，如第一抗体为兔抗体，则可以使用碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体。

• 目前酶标抗体、酶标二抗均有成套试剂出售。

（5）杂交与检出

包括以下步骤

• 封闭

• 第一抗体反应

• 第二抗体反应

• 显色

Western blot

3. 表达蛋白的含量测定

测定指标：

• 细胞可溶性蛋白总量

• 目的蛋白在总蛋白中所占的比例

几种常用的测定方法：

• Bradford法紫外吸收法双缩脲法 Folin试剂法

• Lowry法

六、其它方法

• RFLP

• RAPD

本章结束

第七章转基因植物的检测与鉴定 - gsau...三、southern杂交鉴定...

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