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Carlos Eduardo Domingues Nazario
Desenvolvimento e caracterização de materiais baseados em sílica com aplicabilidade em
extração em fase sólida e cromatografia líquida de ultra alta eficiência
Tese apresentada ao Instituto de Química de São Carlos da
Universidade de São Paulo, como parte dos requisitos para a
obtenção do título de doutor em Química.
Área de concentração: Química Analítica e Inorgânica
Orientador: Prof. Dr. Fernando Mauro Lanças
São Carlos
2013
Dedicatória
A Deus por nunca deixar faltar
tranquilidade e confiança.
Dedico esta tese aos meus pais, Francisco e Cleide
Aparecida, e também à minha irmã, Luciana, pelo apoio
incondicional, incentivo, compreensão e ajuda durante
toda minha vida para que eu pudesse alcançar meus
objetivos. Além disso, dedico à minha namorada, Carla,
pelo companheirismo, amor e companhia em todos os
momentos. Dedico a vocês por compreender minha
ausência durante esse período para que eu pudesse
finalizar este trabalho.
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Fernando Mauro Lanças por ter me recebido no grupo de Cromatografia,
por confiar no meu potencial e também pela orientação, incentivo e apoio durante a realização
desta tese;
Ao Prof. Dr. Álvaro José dos Santos Neto pelas sugestões fornecidas no decorrer dos
trabalhos;
Aos amigos do CROMA que passaram pelo grupo entre o ano de 2008 até 2012,
Lincoln, Alessandra, Ariane, Christian, Paula, Wendell, Gabriela, Flávia, Tiago, Renato,
Juliana, Natália, Diana, Paulo, Danielle, Camila Centurion, Bruna, Robson, Rogério e Camila.
Gostaria de agradecer também aos amigos do atual grupo, Maraíssa, Meire, Maura, Scarlet,
Leidimara, Raquel, Andréia, Tanare, Felipe, Lucas, Rodrigo, Luis Felipe, Diego, Letícia,
Leonardo, Daiane, Elaine, Guilherme, Alcimar, Bruno, Patrícia e Odete. Agradeço a todos
pelos momentos de discussão de trabalhos científicos, aprendizados e descontração nos bares,
churrascos e até na cozinha do laboratório. Foi uma ótima oportunidade para crescimento
pessoal e profissional trabalhar e conviver no grupo de pesquisa;
Aos amigos do IIC, Protheus e NST, Elton, Adriana, Luciana, Gustavo, Priscila,
Karen, José, Tiago Guerreiro, Tiago Lanças, Maria Inês, e também ao Luis, Esmeraldo e
Maria Ângela que já passaram por lá;
Aos meus amigos da república Camilo, Isac e Tiago pelos assuntos extrovertidos,
alegres e companheirismo durante esse período;
A todos os meus amigos que conheci em Aparecida D’Oeste/SP, Campo Grande/MS e
São Carlos/SP durante a época do colégio, graduação e pós-graduação. Apesar da distância
geográfica com alguns, isto não impediu que deixassem de me apoiar e torcer pelo meu
sucesso;
Ao Alexandre Cruz da SINC do Brasil e Carlos Cavalheiro da Nova Analítica pela
amizade, conselhos e ensinamentos sobre a instrumentação em cromatografia;
Aos meus familiares pelo apoio e força. Agradeço também à família da Carla, seus
pais e seu irmão, pela ótima recepção proporcionada;
Aos docentes do IQSC, funcionários da pós-graduação, biblioteca, oficina mecânica,
vidraria e central de análises químicas (CAQI) pelo auxílio fornecido em todos os momentos;
Ao Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) pela oportunidade de aprendizado;
À Universidade de São Paulo (USP) e ao Instituto de Química de São Carlos (IQSC)
pela infraestrutura e auxílios fornecidos;
Ao professor Tiago Venâncio da UFSCar pelas análises de RMN;
Ao grupo da professora Elisabete Moreira Assaf do IQSC/USP pelas análises de BET;
À CAPES pela bolsa concedida e à FAPESP e ao CNPq pelo apoio financeiro em
projetos desenvolvidos no grupo;
A todos que de alguma forma contribuíram para que esta tese tenha sido concluída.
“Challenges are what make life interesting;
overcoming them is what makes life meaningful.”
-Joshua J. Marine
Resumo
Atualmente, a demanda e a necessidade de metodologias analíticas e bioanalíticas que
promovam análise rápida e seletiva tem impulsionado o constante desenvolvimento de
sorventes para preparo de amostra e fases estacionárias para cromatografia líquida de alta
eficiência (HPLC). Desta maneira, esta tese tem por objetivo desenvolver materiais utilizando
precursores de sílica com aplicação em preparo de amostra e suportes cromatográficos para
cromatografia líquida de ultra alta eficiência (UHPLC). Foram sintetizadas e caracterizadas
duas fases extratoras as quais tiveram sua aplicabilidade demonstrada na extração de fármacos
em fluidos biológicos empregando a técnica de extração em fase sólida (SPE). A primeira
metodologia desenvolvida foi a síntese de partículas de sílica empregando precursores de
baixo custo (silicato de sódio) pelo método sil-gel. Após a funcionalização com grupamento
C18, e caracterização da fase extratora, o material sintetizado foi aplicado em SPE off-line
para a determinação de fluoxetina e seu metabólito, norfluoxetina, em plasma humano por
HPLC-UV. O método desenvolvido foi validado e aplicado em amostra de plasma de
pacientes sob tratamento de fluoxetina. Além disso, o sorvente desenvolvido apresentou
resultados similares quando comparado com fases extratoras comerciais. O segundo método
desenvolvido utilizou a técnica de impressão molecular (MIP) a qual tem se tornado uma fase
extratora atrativa devido a sua maior seletividade em relação as fases típicas empregadas em
SPE. Ao mesmo tempo, o uso de SPE online com MIP (MISPE) é uma alternativa atraente no
preparo de amostra, pois é simples, diminui o tempo total da análise, necessita de pequena
quantidade de amostra, e pode ser automatizado. Assim, MIP amino-funcionalizado pelo
processo sol-gel utilizando ibuprofeno como template foi sintetizado. Para comparação, o
polímero não impresso (NIP) foi preparado nas mesmas condições, sem a presença do
template. As análises por cromatografia líquida foram realizadas utilizando uma coluna de
extração MIP e uma coluna analítica em fase reversa configuradas para operar no modo SPE
online por column switching. O método desenvolvido, MISPE-HPLC-UV, foi validado e
aplicado na extração seletiva de cinco anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs) em urina
humana com um tempo total de análise de 22 minutos. Além dos materiais voltados para
preparo de amostra, foi avaliado a síntese e caracterização de suporte cromatográfico baseado
em sílica com diâmetro de partícula abaixo de 2 µm com aplicabilidade em análises rápidas
em cromatografia (UHPLC). Nesta vertente, partículas de sílica esférica não porosa (0,9 µm)
foram sintetizadas pelo método sol-gel com DPR abaixo de 10 %. As partículas foram
funcionalizadas com o grupamento C18 (ODS) e submetidas posteriormente ao processo de
endcapping (TMS) para operar em modo reverso. Métodos físico-químicos de caracterização
foram utilizados para determinar a morfologia, área superficial e quantidade de carbono na
superfície do material. Adicionalmente, as técnicas de infravermelho e ressonância magnética
nuclear forneceram informações sobre a estrutura da sílica e das ligações após a
funcionalização. A fase estacionária foi empacotada em uma coluna (40 mm x 0,25 mm) e a
sua aplicabilidade foi avaliada em cromatografia líquida capilar (cLC). Apesar de não
alcançar a eficiência ótima da separação cromatográfica devido a limitação instrumental, a
fase estacionária sub 1 µm apresenta potencial para separações rápidas sem perda de
eficiência.
Abstract
Currently, the demand and need for bioanalytical and analytical methodologies that promotes
rapid and selective analysis has stimulated the development of sorbents for sample
preparation and stationary phases for high performance liquid chromatography (HPLC).
Therefore, this thesis aims to develop materials using silica precursors with application in
sample preparation and chromatographic supports for ultra high performance liquid
chromatography (UHPLC). Thus, in this study two sorbents were synthesized and
characterized and their applicability was demonstrated in the extraction of drugs in biological
fluids employing the solid phase extraction technique (SPE). The first method developed was
the synthesis of silica particles employing low cost precursors (sodium silicate) using the sil-
gel method. After functionalization with C18 group and characterization of the extraction
phase, the synthesized material was applied to SPE off-line for the determination of fluoxetine
and its metabolite, norfluoxetine, in human plasma by HPLC-UV. The method was validated
and applied to plasma samples from patients treated with fluoxetine. Furthermore, the
labmade sorbent presented similar results when compared with commercial ones. The second
method developed used the molecular imprinting technique (MIP) that has become an
attractive sorbent due to its greater selectivity over the typical phases employed in SPE. At the
same time, the use of online SPE with MIP (MISPE) is an attractive alternative in sample
preparation because it is simple, reduces the total time of analysis, needs little amount of
sample and can be automated. Thus, MIP amino-functionalized by the sol-gel method using
ibuprofen as template was synthesized. For comparison, the non-imprinted polymer (NIP)
was prepared under the same conditions without the presence of template. LC analysis was
performed using a MIP extraction column and a reverse phase analytical column in order to
perform column switching on-line sample separation. The developed method, MISPE-HPLC-
UV, was validated and applied to the selective extraction of five anti-inflammatory drugs
(NSAIDs) in human urine with a total analysis time of 22 minutes. Moreover it was evaluated
the synthesis and characterization of chromatographic support based on silica with particle
diameter under 2 µm with applicability in fast LC analysis (UHPLC). In this instance,
spherical particles of non-porous silica (0.9 µm) were synthesized by sol-gel method with
RSD below 10 %. The particles were functionalized with the C18 group and submitted to the
endcapping process with TMS to operate in reverse phase mode. Physico-chemical methods
were used to determine the morphology, surface area and amount of carbon in the silica
surface. Additionally, the infrared and nuclear magnetic resonance techniques provided
information about the structure of silica and bonds after the functionalization step. The
stationary phase was packed into a column (40 mm x 0.25 mm), and its applicability was
evaluated in capillary liquid chromatography (cLC). Although optimum chromatographic
efficiency was not achieved separation due to instrumental limitations, the sub 1 µm
stationary phase has potential for rapid separations without loss of efficiency.
Lista de Figuras
Figura 1.1 - Etapas envolvidas no desenvolvimento de metodologia analítica. ....................... 27
Figura 2.1 – Formatos tipicamente empregados em SPE. ........................................................ 35
Figura 2.2 – Modos de integração entre o preparo de amostra e o sistema de separação e
detecção. ................................................................................................................................... 36
Figura 2.3 - Etapas envolvidas no processo SPE off-line. (1) Condicionamento do cartucho de
extração, (2) Aplicação da amostra, (3) Remoção dos interferentes (clean up) e (4) eluição dos
analitos. ..................................................................................................................................... 37
Figura 2.4 – Representação esquemática da técnica bidimensional por column switching
aplicada em LC. Posição de carregamento da amostra (A) e posição de eluição da amostra (B)
.................................................................................................................................................. 38
Figura 2.5 – Estrutura de sorventes baseados em sílica. .......................................................... 39
Figura 2.6 – Fase extratora polimérica apolar PS-DVB. .......................................................... 40
Figura 2.7 – Esquema geral de modificação da fase polimérica PS-DVB. .............................. 41
Figura 2.8 – Estrutura polimérica da fase extratora Oasis HLB comercializada pela Waters. 42
Figura 2.9 – Estrutura de fases baseadas em carbono. (A) carbono poroso grafitado, (B)
nanotubos de carbono de parede simples (single-walled carbon nanotube – SWCNT) e (C)
nanotubos de carbono de paredes múltiplas (multi-walled carbon nanotube – MWCNT). ..... 42
Figura 2.10 – Representação da fase extratora RAM. .............................................................. 43
Figura 2.11 – Representação de fase extratora baseada em imunoafinidade. .......................... 44
Figura 2.12 - Ilustração esquemática de preparo do MIP. ........................................................ 44
Figura 2.13 – Esquema geral de um equipamento de HPLC. (A) bomba, (B) sistema de
introdução de amostra, (C) forno cromatográfico, (D) coluna, (E) sistema de detecção, (F)
descarte/coleta da amostra e (G) sistema de aquisição de dados. ............................................. 47
Figura 2.14 – Representação cromatográfica que ilustra a evolução da HPLC ao longo dos
anos. .......................................................................................................................................... 48
Figura 2.15 – Formato dos suportes cromatográficos. (A) partículas porosas e irregulares, (B)
partícula pelicular esférica, (C) partícula esférica porosa, (D) partícula esférica não porosa,
(E) partícula superficialmente porosa e (F) monolíto. .............................................................. 51
Figura 2.16 – Característica estrutural de uma coluna particulada (A) e monolítica (B). ........ 53
Figura 2.17 – Etapas do processo sil-gel: hidrólise e condensação. ......................................... 56
Figura 2.18 – Representação da formação da sílica gel. (A) formação das partículas primárias,
(B) aumento de tamanho das partículas primárias e (C) formação do hidrogel. ...................... 56
Figura 2.19 – Influência do pH no tempo de gelificação no processo sil-gel. ......................... 57
Figura 2.20 – Processo de maturação de Otswald. ................................................................... 58
Figura 2.21 – Etapa de hidrólise e condensação no processo sol-gel. ...................................... 59
Figura 2.22 – Representação da dispersão das partículas no experimento de aumento do
diâmetro. (A) crescimento monodisperso e (B) crescimento com formação de partículas
secundárias................................................................................................................................ 60
Figura 2.23 – Esquema da geração e consumo do intermediário sintético no processo de
crescimento de partícula. .......................................................................................................... 60
Figura 2.24 – Microscopia de partículas de sílica obtidas pelo método de microencapsulação.
.................................................................................................................................................. 62
Figura 2.25 – Método de secagem por nebulização. (A) representação esquemática do
equipamento de spray drying e (B) processo de nebulização e secagem da suspensão coloidal.
.................................................................................................................................................. 62
Figura 2.26 – Representação do preparo de sílica híbrida. (A) sílica híbrida com grupamento
hidreto na superfície, (B) sílica híbrida com ligações silício-metil, (C) sílica híbrida com
ligações de etano e (D) sílica híbrida com um organossilano na superfície. ............................ 64
Figura 2.27 – Grupos silanois presente na superfície da sílica. ................................................ 67
Figura 2.28 – Obtenção de fase estacionária quimicamente ligada. (A) reação de esterificação,
(B) reação com SOCl2, (C) reação de organossilanização com reagente monofuncional, (D)
reação de organossilanização com reagente difuncional e (E) reação do hidreto com grupo
alquílico. ................................................................................................................................... 68
Figura 2.29 – Representação de algumas fases estacionárias quimicamente ligadas no suporte
cromatográfica baseado em sílica. ............................................................................................ 69
Figura 2.30 - Representação de fases estacionárias utilizadas em HPLC ................................ 71
Figura 2.31 - Cromatograma ilustrativo de parâmetros cromatográficos de uma análise. ....... 71
Figura 2.32 - Gráfico representativo da curva de van Deemter. ............................................... 74
Figura 2.33 – Influência do fator de retenção, fator de separação e número de pratos sobre a
resolução cromatográfica. ......................................................................................................... 75
Figura 2.34 - Representação esquemática da determinação do fator de assimetria e
alargamento do pico cromatográfico. ....................................................................................... 76
Figura 2.35 – Relação sinal-ruído (S/R). .................................................................................. 77
Figura 3.1 - Estrutura química da fluoxetina (1), norfluoxetina (2) e clomipramina (3) - padrão
interno. ...................................................................................................................................... 86
Figura 3.2 – Esquema geral da síntese da sílica C18. ............................................................... 92
Figura 3.3 – MEV das partículas de sílica obtidas para SPE na faixa de 38 - 72 µm .............. 93
Figura 3.4 – MEV das partículas de sílica obtidas abaixo de 38 µm ....................................... 94
Figura 3.5 – MEV das partículas de sílica obtidas sem a remoção dos metais. ....................... 94
Figura 3.6 – EDS das partículas de sílica obtidas para SPE na faixa de 38 - 72 µm................ 95
Figura 3.7 - Espectro de infravermelho da sílica pura e sílica C18. Bandas: (1) O-H, (2) C-H,
(3) O-H, (4) Si-O-Si, (5) Si-OH, (6) Si-O e (7) Si-O. .............................................................. 96
Figura 3.8 – Nomenclatura das espécies de sílica. Silício ligado ao carbono (M); silanol
geminal (Q2); silanol isolado (Q
3) e siloxano (Q
4). .................................................................. 97
Figura 3.9 – Espectro de 29
Si RMN/CP/MAS da sílica sintetizada antes da funcionalização
(A) e após a funcionalização (B). ............................................................................................. 97
Figura 3.10 – Espectro de 13
C RMN/CP/MAS/TOSS da sílica C18 sintetizada. ..................... 98
Figura 3.11 – Estrutura química dos PAHs. (1) fenantreno, (2) antraceno e (3) criseno. ........ 99
Figura 3.12 – Perfil cromatográfico da separação dos PAHs em solvente (vermelho) e após a
extração em água (preto). Ordem de eluição: fenantreno (1), antraceno (2) e criseno (3). .... 100
Figura 3.13 – Cromatograma da separação cromatográfica da norfluoxetina (1), fluoxetina (2)
e clomipramina (3) na concentração de 1 µg mL-1
. ................................................................ 101
Figura 3.14 – Cromatograma da separação cromatográfica de amostras de plasma com 250 ng
mL-1
de norfluoxetina (1) e fluoxetina (2) utilizando a clomipramina (3) como padrão interno
(500 ng mL-1
). ......................................................................................................................... 102
Figura 3.15 – Cromatograma do branco do plasma extraído. ................................................ 103
Figura 3.16 - Curva analítica e gráfico de resíduos obtidos na análise de FLX em plasma. .. 104
Figura 3.17 - Curva analítica e gráfico de resíduos obtido na análise de NFLX em plasma. 105
Figura 3.18 - Cromatograma do plasma fortificado com 250 µg L-1
de FLX e NFLX e amostra
real com FLX (129,66 ng mL-1
) e NFLX (181,97 ng mL-1
) contendo 500 ng mL-1
de CLO. 109
Figura 3.19 – Comparação da extração de plasma fortificado com diferentes sorventes. ..... 110
Figura 4.1 - Número de publicações relacionadas com MIP a partir de 1980. ...................... 116
Figura 4.2 - Distribuição das publicações relacionadas com MIP. ........................................ 116
Figura 4.3 - Representação das estratégias de impressão covalente e não- covalente. .......... 117
Figura 4.4 – Representação de sítios seletivos de MIP baseado em ligação covalente
reversível com derivado do ácido borônico (A), aldeídos (B) e alcoóis (C). ......................... 117
Figura 4.5 – Reagentes tipicamente usados na síntese dos MIPs baseados por interações não-
covalente utilizando precursores orgânicos. ........................................................................... 119
Figura 4.6 – Representação esquemática da síntese do MIP pelo processo sol-gel. .............. 120
Figura 4.7 - Esquema da hidrólise e condensação no processo sol-gel. ................................. 121
Figura 4.8 - Precursores trialcoxissilanos frequentemente usados no processo sol-gel. ........ 121
Figura 4.9 - Monômeros orgânicos aplicados na formação de materiais híbridos sol-
gel/orgânico. ........................................................................................................................... 122
Figura 4.10 – Representação esquemática da síntese de MIP amino funcionalizado. ........... 122
Figura 4.11 – Representação esquemática da síntese de MIP híbrido (orgânico-inorgânico).
................................................................................................................................................ 123
Figura 4.12 - Estrutura química dos NSAIDs estudados. ....................................................... 125
Figura 4.13 - Fotografia do sistema online. A) Vista completa do arranjo online dentro do
forno cromatográfico e B) ampliação da válvula de seis vias e da coluna de extração. ......... 135
Figura 4.14 - Configuração do sistema online para eluição no modo foreflush. .................... 135
Figura 4.15 - Configuração do sistema online para eluição no modo backflush. ................... 136
Figura 4.16 - Esquema sugerido para a preparação do MIP. .................................................. 141
Figura 4.17 - Imagem de MEV da superfície da sílica ativada (A) e do MIP sintetizado (B).
................................................................................................................................................ 141
Figura 4.18 - Espectro de Infravermelho da sílica gel, MIP e NIP. Bandas: (1) O-H, (2) N-H,
(3) C-H, (4) O-H, (5) N-H, (6) Si-O-Si, (7) Si-OH, (8) Si-O e (9) Si-O. ............................... 143
Figura 4.19 - Cromatograma da separação dos fármacos utilizando acetonitrila e metanol
como fase móvel. Ordem de eluição: cetoprofeno (1), naproxeno (2), fenoprofeno (3),
flurbiprofeno (4) e ibuprofeno (5). ......................................................................................... 144
Figura 4.20 - Cromatograma da injeção direta da urina na coluna MIP no arranjo
unidimensional........................................................................................................................ 145
Figura 4.21 - Cromatograma da urina fortificada com os fármacos no modo de injeção
foreflush e backflush. Ordem de eluição: Cetoprofeno (1), Naproxeno (2), Fenoprofeno (3),
Flurbiprofeno (4) e Ibuprofeno (5). ........................................................................................ 146
Figura 4.22 - Cromatograma do branco da urina e da urina fortificada com os fármacos no
nível médio. Ordem de eluição: cetoprofeno (1), naproxeno (2), fenoprofeno (3),
flurbiprofeno (4) e ibuprofeno (5). ......................................................................................... 148
Figura 4.23 - Curva analítica e gráfico de resíduos obtidos para o cetoprofeno. ................... 149
Figura 4.24 - Curva analítica e gráfico de resíduos obtidos para o naproxeno. ..................... 150
Figura 4.25 - Curva analítica e gráfico de resíduos obtidos para o flurbiprofeno. ................. 151
Figura 4.26 - Curva analítica e gráfico de resíduos obtidos para o ibuprofeno. ..................... 152
Figura 4.27 - Efeito dos parâmetros avaliados na robustez na concentração dos fármacos. .. 159
Figura 4.28 - Efeito dos parâmetros avaliados na robustez na área absoluta dos fármacos. .. 160
Figura 4.29 - Cromatograma do branco da urina fortificada com os interferentes e
monitorados nos comprimentos de onda de 220 e 254 nm..................................................... 162
Figura 4.30 – Cromatograma do íon extratido no modo MS da extração online dos NSAIDs
(500 ng mL-1
) fortificados em água (sinal mais intenso) e urina humana diluída em água (sinal
menos intenso). ....................................................................................................................... 167
Figura 5.1 – Representação hipotética da curva de van Deemter com diferentes diâmetros de
partícula. ................................................................................................................................. 173
Figura 5.2 - Pressão requerida (eixo esquerdo) e tempo de análise (eixo direito) em função do
tamanho da partícula. .............................................................................................................. 174
Figura 5.3 – Separação de alquilbenzenos utilizando colunas com diferentes tamanho de
partículas sob condições isocráticas. ...................................................................................... 175
Figura 5.4 – Separação de compostos barbituricos em coluna capilar (150 mm x 50 µm x 1,0
µm, C18 não poroso) com temperatura de 80°C. ................................................................... 177
Figura 5.5 – Separação cromatográfica em diferentes pressões. Coluna (150 mm x 1,0 mm x
1,5 µm, C18). .......................................................................................................................... 177
Figura 5.6 - MEV das partículas de sílica obtidas após adaptações no procedimento
experimental. .......................................................................................................................... 183
Figura 5.7 – Microscopia das partículas de sílica obtidas pelo método de Stober com a razão
molar TEOS:NH4OH de (A) 1:0,5, (B) 1:1, (C) 1:1,5 e (D) 1:2. ........................................... 184
Figura 5.8 – Microscopia da partícula de sílica sintetizada com razão molar TEOS:NH4OH de
1:20. ........................................................................................................................................ 185
Figura 5.9 – Microscopia das partículas de sílica sintetizadas de acordo com as condições
especificadas na Tabela 5.3. ................................................................................................... 186
Figura 5.10 – MEV das partículas de sílica submetidas ao processo de crescimento da
partícula semente. ................................................................................................................... 188
Figura 5.11 – MEV e distribuição das partículas obtidas no processo de crescimento de
partícula semente. (A) partícula semente, (B) após 4 adições de 2,2 mmol de TEOS, (C) após
8 adições de 2,2 mmol de TEOS e (D) após 12 adições de 2,2 mmol de TEOS. ................... 190
Figura 5.12 – MEV das partículas sintetizadas com a alimentação realizada com bomba
peristáltica. (A) imersão direta na suspensão e (B) sistema de gotejamento na suspensão. ... 191
Figura 5.13 – (A) MEV das partículas de sílica sintetizadas, (B) Histograma da distribuição
das partículas e (C) Gráfico da percentagem acumulada das partículas. ................................ 192
Figura 5.14 - Espectro de Infravermelho da sílica pura e sílica C18. Bandas: (1) O-H, (2) C-H,
(3) O-H, (4) Si-O-Si, (5) Si-OH, (6) Si-O e (7) Si-O. ............................................................ 193
Figura 5.15 – Espectro da sílica C18 não porosa sintetizada. (A) 29
Si RMN/CP/MAS e (B) 13
C
RMN/CP/MAS/TOSS. ........................................................................................................... 195
Figura 5.16 – Esquema de um tubo preparado para a confecção de coluna capilar empacotada.
................................................................................................................................................ 196
Figura 5.17 – Imagem da coluna capilar desenvolvida (40 mm x 250 µm x 0,9 µm, C18). .. 196
Figura 5.18 – Cromatograma obtido na separação da solução teste utilizando a coluna capilar
com a fase estacionária C18 sub-1 µm. Ordem de eluição: uracila (1), fenol (2), difenilamina
(3), naftaleno (4) e acenaftileno (5). ....................................................................................... 197
Figura 5.19 – Cromatograma obtido na separação dos NSAIDs na concentração de 100 mg L-1
utilizando a coluna capilar com a fase estacionária C18 sub-1 µm. Ordem de eluição:
cetoprofeno (1), naproxeno (2), fenoprofeno (3), flurbiprofeno (4) e ibuprofeno (5). ........... 199
Lista de Tabelas
Tabela 2.1 - Classificação da cromatografia líquida de acordo com o diâmetro interno das
colunas e o intervalo de vazão da fase móvel. .......................................................................... 49
Tabela 2.2 –Diminuição do tamanho das partículas em LC. .................................................... 54
Tabela 2.3 – Efeitos e variações na robustez avaliada pelo método de Youden. ..................... 79
Tabela 2.4 - Matriz de Youden. ................................................................................................ 80
Tabela 2.5 - Parâmetros cromatográficos recomendados durante a validação. ........................ 81
Tabela 3.1 – Custo estimado dos precursores de sílica. ........................................................... 85
Tabela 3.2 – Análise elementar das partículas de SPE labmade. ............................................. 95
Tabela 3.3 - Dados da curva analítica..................................................................................... 103
Tabela 3.4 - Precisões obtidas para o método desenvolvido (n = 3). ..................................... 106
Tabela 3.5 - Exatidões obtidas para o método desenvolvido (n = 3)...................................... 106
Tabela 3.6 – Recuperação e efeito matriz para o método desenvolvido (n = 3). ................... 107
Tabela 3.7 - Resultados da avaliação da robustez (n = 3). ..................................................... 107
Tabela 3.8 – Concentração de fluoxetina e norfluoxetina em plasma de pacientes sobre
tratamento. .............................................................................................................................. 108
Tabela 3.9 – Característica dos sorventes avaliados............................................................... 109
Tabela 3.10 – Comparativo de recuperação utilizando a fase extratora desenvolvida no
trabalho e duas comerciais (n = 3). ......................................................................................... 110
Tabela 4.1 – Métodos de MISPE-LC online. ......................................................................... 126
Tabela 4.2 - Eventos realizados durante as etapas de preparo de amostra e separação
cromatográfica. ....................................................................................................................... 137
Tabela 4.3 - Fatores avaliados na robustez do método. .......................................................... 139
Tabela 4.4 - Matriz de Youden. .............................................................................................. 139
Tabela 4.5 - Parâmetros cromatográficos da separação. ........................................................ 146
Tabela 4.6 - Parâmetros da curva analítica para os anti-inflamatórios não esteroidais
(NSAIDs) - cetoprofeno (CET), ibuprofeno (IBU), fenoprofeno (FEN), flurbiprofeno (FLU) e
o naproxeno (NAP) (n = 30). .................................................................................................. 147
Tabela 4.7 - Precisão para o método de análise de NSAIDs em urina (n = 5). ...................... 153
Tabela 4.8 - Exatidão para o método de análise de NSAIDs em urina (n = 5). ..................... 154
Tabela 4.9 - Recuperações obtidas para os NSAIDs (n = 5). ................................................. 155
Tabela 4.10 - Avaliação do efeito matriz (n = 6).................................................................... 156
Tabela 4.11 - Resultados da reprodutibilidade intralaboratorial (n = 6). ............................... 157
Tabela 4.12 - Avaliação da injeção direta e diluição da urina (n = 5). ................................... 157
Tabela 4.13 - Resultados da avaliação da robustez (n = 3). ................................................... 158
Tabela 4.14 - Avaliação de interferentes na análise dos NSAIDs. ......................................... 161
Tabela 4.15 - Estabilidade de curta duração da amostra fortificada (n = 3). .......................... 162
Tabela 4.16 - Estabilidade pós-processamento da amostra fortificada (n = 3)....................... 163
Tabela 4.17 - Estabilidade da amostra após ciclos de congelamento/descongelamento (n = 3).
................................................................................................................................................ 163
Tabela 4.18 - Estabilidade de longa duração da amostra fortificada (n = 3). ......................... 164
Tabela 4.19 - Concentrações dos NSAIDs em urina após administração de comprimidos. .. 165
Tabela 4.20 - Amostras de controle de qualidade. ................................................................. 166
Tabela 5.1 – Correlação entre os parâmetros dependentes e independentes. ......................... 171
Tabela 5.2 – Proporções dos reagentes utilizados no processo sintético................................ 180
Tabela 5.3 – Diâmetro de partícula e desvio padrão relativo dos experimentos de acordo com
a condição experimental utilizada. ......................................................................................... 185
Tabela 5.4 - Avaliação da repetibilidade do preparo da partícula. ......................................... 187
Tabela 5.5 – Comparação da distribuição das partículas de sílica antes e depois da reação de
crescimento de partícula semente. .......................................................................................... 191
Tabela 5.6 – Parâmetros cromatográficos para a coluna sintetizada. ..................................... 198
Lista de abreviaturas, siglas e símbolos
4-VP – 4-vinilpiridina
ACN – acetonitrina
AIBN – 2,2’-azobisisobutironitrila
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
APTES – aminopropiltrietoxissilano
As – assimetria do pico
ASE – extração acelerada com solvente
BET – Brunauer-Emmett-Teller
CET – cetoprofeno
cLC – cromatografia líquida capilar
CLO – clomipramina
Cox – cicloxigenase
CP – polarização cruzada
CQ – amostra de controle de qualidade
CQA – amostra de controle de qualidade de alta concentração
CQB – amostra de controle de qualidade de baixa concentração
CQ-LIQ – amostra de controle de qualidade do limite inferior de quantificação
CQM – amostra de controle de qualidade de média concentração
Cs – concentração de saturação
Cs* – concentração limite de saturação
CTAC – cloreto de hexadeciltrimetilamônio
CyD - β-ciclodextrina
DAD – detector de arranjo de diodos
Dm – difusão do analito na fase móvel
DP – desvio padrão
dp – diâmetro da partícula
DPR – desvio padrão relativo
Ds – difusão do analito na fase estacionária
DVB – divinilbenzeno
ECD – detector eletroquímico
EDMA – etilenoglicol dimetacrilato
EDS/EDX – espectroscopia de energia dispersiva
EMEA – European Medicine Agency
ETEOS – etiltrietoxissilano
exp – experimento
Fc – vazão da fase móvel
FDA – Food and Drug Administration
FEN – fenoprofeno
FEQL –Fase estacionária quimicamente ligada
FLD – Detector de fluorescência
FLU – flurbiprofeno
FLX – Fluoxetina
FT-IR – espectrofotômetro infravermelho com transformada de Fourier
g – força gravitacional
GC – cromatografia gasosa
H – altura equivalente a um prato
h – altura reduzida do prato
HEMA – 2-hidroxietil metacrilato
HILIC – cromatografia de interação hidrofílica
HLB – hydrophilic-lipophilic balanced
HPLC – cromatografia líquida de alta eficiência
HRGC - cromatografia gasosa de alta resolução
IBU – ibuprofeno
IBU-d3 – ibuprofeno deuterado
INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia
k – fator de retenção
L – comprimento da coluna
LC – cromatografia líquida
LD – limite de detecção
LIQ – limite inferior de quantificação
LLE – extração líquido-líquido
LPME – microextração em fase líquida
LQ – limite de quantificação
LSQ – limite superior de quantificação
MAA – Ácido metacrílico
MAE – extração assistida por micro-ondas
MAS – rotação no ângulo mágico
MBAA – n,n-metileno-bis-acrilamida
MeOH – metanol
MEPS – microextração por sorbente empacotado
MEV – microscopia eletrônica de varredura
min – minuto
MIP – polímero molecularmente impresso
MISGMs - materiais sol-gel molecularmente impressos
MISPE – extração em fase sólida com polímero impresso
MS – espectrometria de massas
MSPD – dispersão da matriz em fase sólida
MWCNT – nanotubos de carbono de parede múltiplas
N – número de pratos
NAP – naproxeno
NCT – nanotubo de carbono
NFLX – norfluoxetina
NIP – polímero não impresso
NP – fase normal
NR – não reportado
NSAID – anti-inflamatório não esteroidal
ODS – clorodimetiloctadecilssilano
PAH/HPA – hidrocarboneto policíclico aromático
PG – prostaglandina
PGC – carbono grafitado poroso
PI – padrão interno
ppm – deslocamento químico
PS-DVB – poliestireno-divinilbenzeno
RAM – meio de acesso restrito
RMN – ressonância magnética nuclear
RP – fase reversa
Rs – resolução cromatográfica
SAX – trocador aniônico forte
SBSE – extração por sorção em barra de agitação
SCX – trocador catiônico forte
SFC – cromatografia com fluido supercrítico
SFE – extração com fluido supercrítico
SPE – extração em fase sólida
SPME – microextração em fase sólida
SWCNT – nanotubos de carbono de parede simples
SWE – extração com água sub-crítica
T – temperatura
TEA – trietilamina
TEOS – tetraetilortosilicato
TES – trietoxissilano
TF – fator de alargamento
TFMAA – ácido trifluorometacrilato
THF – tetrahidrofurano
tm – tempo morto
TMOS – tetrametilortosilicato
TMS – trimetilclorossilano
TOF – analisador tempo de voo
TOSS – supressão das bandas laterais
tR – tempo de retenção
TRIM – trimetilopropano trimetacrilato
u – velocidade linear
UHPLC – cromatografia líquida de ultra alta eficiência
UV – ultravioleta
ʋ – velocidade linear reduzida
– concentração média calculada
WAX – trocador aniônico fraco
wb – largura da base
WCX – trocador catiônico fraco
α – fator de separação
η – viscosidade da fase móvel
– constante relacionada ao empacotamento da coluna
– proporcional
Sumário
Capítulo 1 ................................................................................................................................. 25
Introdução ............................................................................................................................. 25
1.1 Introdução e justificativa................................................................................................. 27
1.2 Objetivo geral do projeto ................................................................................................ 28
1.2.1 Objetivos específicos ................................................................................................... 29
Capítulo 2 ................................................................................................................................. 31
Revisão bibliográfica ............................................................................................................ 31
2.1 Preparo de amostra .......................................................................................................... 33
2.1.1 Extração em fase sólida ............................................................................................... 33
2.1.1.1 Mecanismos de separação ......................................................................................... 34
2.1.1.2 Formato ..................................................................................................................... 34
2.1.1.3 Modo de integração da extração em fase sólida ....................................................... 36
2.1.1.4 Fases extratoras ......................................................................................................... 39
2.2 Técnicas de separação ..................................................................................................... 45
2.2.1 Desenvolvimento e evolução da cromatografia líquida ............................................... 45
2.2.2 Evolução dos suportes cromatográficos em LC........................................................... 51
2.2.3 Suporte cromatográfico em LC .................................................................................... 54
2.2.4 Fases estacionárias ....................................................................................................... 66
2.3 Parâmetros cromatográficos em HPLC .......................................................................... 70
2.4 Validação de metodologia............................................................................................... 76
Capítulo 3 ................................................................................................................................. 83
Determinação de fluoxetina e norfluoxetina em plasma humano por HPLC-UV utilizando a
técnica de SPE com sorvente C18 sintetizado com precursores de sílica de baixo custo .... 83
3.1 Introdução ....................................................................................................................... 85
3.2 Fármacos antidepressivos ............................................................................................... 85
3.3 Objetivos ......................................................................................................................... 87
3.4 Parte experimental .......................................................................................................... 87
3.4.1 Materiais e reagentes.................................................................................................... 87
3.4.2 Síntese e caracterização das partículas C18 ................................................................. 87
3.4.2.1 Preparação de partículas de sílica ............................................................................. 87
3.4.2.2 Funcionalização das partículas de sílica ................................................................... 88
3.4.2.3 Caracterização físico-química ................................................................................... 88
3.4.3 Aplicabilidade das partículas de sílica C18 labmade em extração em fase sólida ...... 89
3.4.3.1 Preparo das soluções ................................................................................................. 89
3.4.3.2 Tratamento das amostras de plasma ......................................................................... 89
3.4.3.3 Método cromatográfico ............................................................................................. 90
3.4.3.4 Validação do método ................................................................................................ 91
3.4.3.5 Determinação do fármaco em amostras de plasma humano ..................................... 92
3.5 Resultados e discussão .................................................................................................... 92
3.5.1 Síntese e caracterização da sílica C18 ......................................................................... 92
3.5.2 Avaliação da fase extratora .......................................................................................... 99
3.5.3 Aplicação das partículas labmade na análise de antidepressivo ................................ 100
3.5.3.1 Desenvolvimento do método de análise ................................................................. 100
3.5.3.2 Validação do método .............................................................................................. 103
3.5.3.3 Determinação do fármaco em amostras de plasma humano ................................... 108
3.5.3.3 Estudo comparativo com fases comerciais baseadas em sílica ............................... 108
3.6 Conclusão ...................................................................................................................... 111
Capítulo 4 ............................................................................................................................... 113
Emprego de MISPE-HPLC-UV na determinação online de anti-inflamatórios não
esteroidais em urina humana ............................................................................................... 113
4.1 Introdução ..................................................................................................................... 115
4.1.1 Polímero molecularmente impresso ........................................................................... 115
4.1.2 Aplicações dos polímeros molecularmente impressos em preparo de amostra ......... 124
4.1.3 Anti-inflamatórios não esteroidais ............................................................................. 125
4.2 Objetivos ....................................................................................................................... 132
4.3 Experimental ................................................................................................................. 132
4.3.1 Reagentes ................................................................................................................... 132
4.3.2 Síntese do MIP ........................................................................................................... 133
4.3.3 Caracterização do MIP ............................................................................................... 133
4.3.4 Preparo da coluna MIP............................................................................................... 134
4.3.5 Método cromatográfico .............................................................................................. 134
4.3.6 Preparo das soluções padrões para a validação.......................................................... 136
4.3.7 Validação do método ................................................................................................. 137
4.3.8 Determinação dos fármacos em amostras de urina .................................................... 140
4.4 Resultados e discussão .................................................................................................. 140
4.4.1 Preparo e caracterização do MIP ............................................................................... 140
4.4.2 Separação cromatográfica .......................................................................................... 142
4.4.3 Validação do método ................................................................................................. 147
4.4.4 Determinação dos fármacos em amostras de urina .................................................... 164
4.5 Aplicação do método MISPE-LC-MS/TOF ................................................................. 166
4.6 Conclusão ...................................................................................................................... 168
Capítulo 5 ............................................................................................................................... 169
Preparo e avaliação de partículas de sílica sub 1 µm com aplicabilidade em cromatografia
líquida de ultra alta eficiência ............................................................................................. 169
5.1 Introdução ..................................................................................................................... 171
5.2 Objetivos ....................................................................................................................... 179
5.3 Experimental ................................................................................................................. 179
5.3.1 Materiais e reagentes.................................................................................................. 179
5.3.2 Síntese da partícula de sílica ...................................................................................... 179
5.3.3 Funcionalização das partículas de sílica .................................................................... 181
5.3.4 Caracterização físico-química .................................................................................... 181
5.3.5 Método cromatográfico .............................................................................................. 182
5.4 Resultados e discussões ................................................................................................ 182
5.4.1 Síntese da partícula de sílica ...................................................................................... 182
5.4.2 Caracterização das partículas ..................................................................................... 193
5.4.3 Avaliação cromatográfica das partículas de sílica ..................................................... 195
5.5 Conclusão ...................................................................................................................... 199
Capítulo 6 ............................................................................................................................... 201
Conclusão geral e perspectivas futuras ............................................................................... 201
6.1 Conclusão geral ............................................................................................................. 203
6.2 Perspectivas futuras ...................................................................................................... 203
Referências .......................................................................................................................... 205
Capítulo 1
Introdução
Capítulo 1 27
1.1 Introdução e justificativa
Um método analítico utilizando técnicas cromatográficas pode ser subdivido em
etapas como apresentado na Figura 1.1. Assim, entre a informação inicial necessária para
realizar o trabalho (analito alvo, matriz, técnica de preparo de amostra e análise) e o resultado
encontram-se as etapas de amostragem, preparo de amostra, análise cromatográfica e
processamento dos dados.
Atualmente, mais de 80 % dos trabalhos publicados na literatura abordando o preparo
de amostras e análise cromatográfica estão voltadas para a aplicação da metodologia analítica
em análises ambiental, biológica, industrial, farmacêutica, entre outras.
Apesar de minoritários, estudos de desenvolvimento de equipamentos analíticos,
dispositivos e sorventes para preparo de amostra, suportes cromatográficos e fases
estacionárias para cromatografia líquida vêm sendo conduzidos por pesquisadores da área
acadêmica e industrial, sempre objetivando aprimorar o desempenho analítico.
Neste contexto, o grupo de cromatografia do Instituto de Química de São Carlos já
desenvolveu diversos trabalhos aplicando esse conceito de pesquisa, além de realizar estudos
comparativos e de aplicabilidade das técnicas comumente empregadas no preparo de amostra
e separações cromatográficas. (1-13) Assim, esta tese de doutorado possui o enfoque no
desenvolvimento de materiais objetivando o aprimoramento da etapa de preparo de amostra e
análise cromatográfica (especificamente, a HPLC), através da síntese de materiais à base de
sílica.
Para fins didáticos, esta tese foi dividida em capítulos para a melhor compreensão das
estratégias e metodologias utilizadas.
O Capítulo 1 aborda de forma geral, a contextualização desta tese e também a
justificativa e o objetivo geral do trabalho.
Figura 1.1 - Etapas envolvidas no desenvolvimento de metodologia analítica.
Capítulo 1 28
O Capítulo 2 apresenta uma revisão da literatura no qual compreende informações
sobre os temas abordados nesta tese. Assim, neste capítulo, são discutidas as técnicas de
preparo de amostra, princípios teóricos da cromatografia, desenvolvimento e evolução da
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), estratégias de integração entre o preparo de
amostra e a análise cromatográfica, e aspectos sobre validação de metodologias analíticas.
Adicionalmente, são discutidos métodos de síntese de materiais baseados em sílica e as
estratégias de funcionalização dos suportes cromatográficos na obtenção de fases
estacionárias.
O Capítulo 3 aborda a síntese e caracterização de sorvente baseado em sílica
empregando precursores de baixo custo (silicato de sódio) para uso como fase extratora em
SPE. A aplicabilidade do suporte cromatográfico após sua funcionalização operando em fase
reversa com o grupamento C18 foi demonstrada na extração do fármaco fluoxetina e seu
principal metabólito, norfluoxetina, em plasma humano.
O Capítulo 4 descreve a síntese e caracterização de fases extratoras baseadas na
tecnologia de impressão molecular utilizando a rota sintética sol-gel com enfoque no aumento
da seletividade na etapa de extração. Nesse capítulo, descreve-se um método de análise dos
fármacos anti-inflamatórios não esteroidais em urina humana usando sistema online por
column switching (MISPE-HPLC-UV). Além disso, também é avaliada a hifenação do
sistema automatizado com a espectrometria de massas em tandem (MISPE-HPLC-MS/TOF).
O Capítulo 5 relata as estratégias cromatográficas empregadas para a diminuição do
tempo de análise sem comprometimento da resolução cromatográfica. Nesse capítulo é
abordada a síntese e caracterização (físico-química e cromatográfica) de materiais baseados
em sílica com aplicação em cromatografia líquida de ultra alta eficiência (UHPLC).
O Capítulo 6 possui as conclusões gerais desta tese e as possibilidades de continuidade
do trabalho desenvolvido.
1.2 Objetivo geral do projeto
Esta tese tem por objetivo geral desenvolver materiais baseados em sílica com
aplicabilidade na etapa de preparo de amostra e também na análise cromatográfica (HPLC).
Capítulo 1 29
1.2.1 Objetivos específicos
Desenvolver e caracterizar (quimicamente e morfologicamente) suportes
cromatográficos baseados em sílica com aplicação em métodos de preparo de
amostra (SPE), utilizando precursores de baixo custo. Adicionalmente, sintetizar
materiais baseados em sílica com a tecnologia de impressão molecular (MIP)
buscando elevar a seletividade da extração;
Desenvolver e caracterizar partículas de sílica sub 2 µm com aplicabilidade em
cromatografia líquida de ultra alta eficiência (UHPLC) visando análises rápidas
sem perder eficiência de separação;
Utilizar os suportes cromatográficos desenvolvidos para preparar e caracterizar
fases estacionárias quimicamente ligadas;
Demonstrar a aplicabilidade dos materiais desenvolvidos.
Capítulo 2
Revisão bibliográfica
Capítulo 2 33
2.1 Preparo de amostra
Nos últimos anos, houve um grande desenvolvimento da cromatográfica com o
objetivo de melhorar a resolução cromatográfica e diminuir o tempo de análise. Um exemplo
disso são os equipamentos de cromatografia gasosa rápida (fast GC) e ultrarrápida (ultra fast
GC). (14, 15) Em cromatografia líquida temos as colunas monolíticas, colunas com
tecnologia core-shell e colunas com partículas sub-2 µm utilizadas em cromatografia líquida
de ultra alta eficiência (UHPLC). (16, 17)
Já a etapa do preparo de amostra, a qual antecede a análise cromatográfica, também
evoluiu ao longo dos anos; contudo, não no mesmo ritmo que a análise cromatográfica. (17)
Assim, o tempo gasto na etapa do preparo de amostra pode representar até 60 % do tempo
total de uma análise e é a principal fonte de erros devido a muitas etapas de manipulação da
amostra. (18)
Os métodos de preparo de amostra são etapas fundamentais no desenvolvimento dos
métodos analíticos e bioanalíticos, pois é através deles que os compostos de interesse são
separados dos interferentes provenientes da matriz.
Atualmente existem diversas técnicas que podem ser empregadas no preparo de
amostras. Podemos citar a extração líquido-líquido (LLE), extração por soxhlet, extração em
fase sólida (SPE), dispersão da matriz em fase sólida (MSDP) extração com fluido
supercrítico (SFE), extração acelerada com solvente (ASE), extração com água sub-crítica
(SWE) e extração assistida por microondas (MAE). Temos ainda as técnicas miniaturizadas
como, por exemplo, a microextração em fase sólida (SPME), extração por sorção em barra de
agitação (SBSE), microextração por sorbente empacotado (MEPS) e microextração em fase
líquida (LPME).
Nesse escopo de métodos de preparo de amostra, podemos destacar a SPE, a qual é
uma técnica versátil, bem estabelecida, e que tem sido muito utilizada em métodos analíticos
e bioanalíticos. (19)
2.1.1 Extração em fase sólida
No mercado atual, inúmeras empresas desenvolvem e comercializam produtos para
SPE. Entre as décadas de 1960 e 1980 houve intensas pesquisas na busca de novos materiais
sortivos. O uso desses materiais em procedimentos analíticos estimulou o desenvolvimento da
SPE que vem ocorrendo por mais de 30 anos. O início da SPE aconteceu no ano de 1977 no
Capítulo 2 34
qual a empresa Waters disponibilizou comercialmente cartuchos de SPE contendo sorventes
baseados em sílica. Dois anos mais tarde (1979) foi colocado no mercado o formato tipo
seringa e nos primeiros anos da década de 1980 foram realizadas as primeiras aplicações de
pré-colunas para a extração online integrada com a LC. O termo “e tração em fase sólida”
(solid phase extraction) foi criada em 1982 com os funcionários da empresa J.T. Baker. (20-
22)
Os benefícios e vantagens da SPE que alavancou sua utilização em procedimentos
analíticos, em substituição a LLE e a extração por soxhlet, foram o menor tempo de análise,
redução do custo e do consumo de solventes orgânicos, diminuição da exposição do analista a
solventes tóxicos e também o fato de não gerar emulsão e promover altos fatores de
concentração. Adicionalmente, diferente de microtécnicas modernas de preparo de amostra
(SPME e SBSE) no qual promovem a extração baseada por equilíbrio, a SPE promove a
extração exaustiva dos analitos na amostra. Dependendo das características da matriz e da
concentração dos analitos, a SPE pode ser utilizada para concentrar os compostos de interesse,
isolar os analitos (clean up), isolar a matriz ou ainda, ser utilizada com estocagem dos analitos
do campo de coleta até o laboratório de análise. (20)
2.1.1.1 Mecanismos de separação
Os mecanismos de separação utilizados em SPE são os mesmos utilizados na
cromatografia líquida clássica, sendo que a escolha da fase extratora vai depender da natureza
do analito de interesse e da matriz. Os mecanismos de separação mais empregados em SPE
são adsorção, partição, troca iônica e exclusão por tamanho. Neste contexto, as interações
entre os analitos e a fase extratora ocorrem por interações intermoleculares tais como as
interações tipo London, eletrostática, dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido, íon-dipolo, íon-
íon e ligação de hidrogênio. (22)
2.1.1.2 Formato
O formato mais popular e utilizado em SPE é a fase extratora empacotada em
cartuchos ou seringas (Figura 2.1). Nesses dispositivos, polipropileno e polietileno são os
materiais empregados como corpo e disco poroso (frit) dos cartuchos. Entretanto, o formato
disgni
Capítulo 2 35
Figura 2.1 – Formatos tipicamente empregados em SPE.
Fonte: Adaptado de (23).
(design) pode variar para promover a compatibilidade com sistemas automatizados. Além
disso, o formato desses cartuchos apresenta variações de acordo com o fabricante.
Tipicamente, o tamanho das partículas empregadas neste processo varia entre 40 – 60 µm e, a
quantidade de fase extratora depende da aplicabilidade do método. A limitação deste formato
esta relacionada com a vazão restrita e, consequentemente, a aplicação de grande volume de
amostra. Entretanto o uso de um dispositivo de múltipla extração possibilita preparar diversas
amostras simultaneamente. (20, 21)
O disco é o segundo formato mais empregado em SPE. Neste formato, o sorvente é
imobilizado numa rede de microfibras de membranas de vidro ou politetrafluoretileno (PTFE
ou teflon) no qual possuem aproximadamente 0,5 µm de espessura. Discos de fibra de vidro
são mais espessos e rígidos, proporcionando vazões mais elevadas durante a aplicação da
amostra quando comparadas com discos baseados em PTFE. As partículas imobilizadas nas
membranas são menores que as utilizadas em SPE com cartucho, variando entre 8 – 12 µm. O
tempo gasto na percolação de grande volume de amostra em discos é menor quando
comparada com cartuchos. Entretanto, o volume de breakthrough (volume de amostra que
atravessa o sorvente até o momento em que os compostos absorvidos são liberados na
extremidade oposta) é diminuído e os discos têm sido empregados em extrações no qual a
interação entre a sorvente e o analito seja suficiente para promover sua retenção no disco. (20,
21)
Outro formato empregado é a bandeja ou placa de 96 poços (96-well SPE plates). Este
formato permite o processamento de 96 amostras simultaneamente e, portanto, diminuindo o
tempo gasto no preparo de amostra. Cada um dos 96 poços possui um cartucho contendo a
Capítulo 2 36
fase extratora particulada (3 – 10 mg) ou discos. Além disso, outros formatos têm sido
empregados no processo de extração. Podemos destacar também a extração em ponteiras
(pipette tips), e miniaturização da SPE, no qual podemos citar a SPME, SBSE e, mais
recentemente, MEPS.
2.1.1.3 Modo de integração da extração em fase sólida
Em SPE, quatro diferentes modos de operação podem ser utilizados para integrar o
preparo de amostra com o método de separação e detecção (Figura 2.2). (24, 25)
O modo mais empregado é o off-line (fora da linha) na qual todas as etapas são
realizadas manualmente pelo analista. De maneira geral, a Figura 2.3 ilustra as etapas
envolvidas na SPE off-line. O cartucho/seringa de extração é condicionado para a ativação do
material extrator para que haja interação efetiva com os analitos de interesse através de
pressão positiva ou negativa. Depois ocorre a aplicação da amostra pelo cartucho de extração.
Nesta etapa é importante um controle da vazão para obter métodos reprodutíveis e também
promover interação suficiente entre fase extratora e os analitos. Posteriormente, é realizada a
etapa de remoção dos interferentes (clean up da amostra). Por fim, a eluição dos analitos do
cartucho utilizando o menor volume possível de solvente, seguida da secagem do eluato
empregando
Figura 2.2 – Modos de integração entre o preparo de amostra e o sistema de separação e
detecção.
Fonte: Adaptado de (25).
Capítulo 2 37
Figura 2.3 - Etapas envolvidas no processo SPE off-line. (1) Condicionamento do cartucho
de extração, (2) Aplicação da amostra, (3) Remoção dos interferentes (clean up) e (4) eluição
dos analitos.
empregando vazão de gás (nitrogênio, por exemplo) e a ressuspensão em solvente adequado
seguida da análise cromatográfica. (19, 20)
Outro modo de operação é o at-line (na linha) na qual todas as etapas de tratamento da
amostra do processo off-line são robotizadas e o extrato final dos analitos é injetado no LC.
(26). Algumas opções no mercado de equipamentos operando neste modo são o ASPEC
(Gilson), Microlab (Hamilton) e Rapid Trace (Zymark). (20)
O modo in-line (em linha diretamente) possui a coluna de extração em linha com a
coluna analítica sem a presença de válvulas ou dispositivos entre as colunas. (27) As
vantagens desse sistema é a automação do processo e a análise direta dos analitos sem gerar
extratos. Em contrapartida, a análise de amostras complexas é dificultada devido ao
entupimento da coluna ou adsorção de interferentes da matriz. Adicionalmente, devido a
injeção direta da amostra na coluna, a eficiência na separação cromatográfica está fortemente
relacionada com o volume da amostra e a natureza do solvente de eluição.
Já o modo online (em linha indiretamente) pode ser realizado de duas maneiras. A
primeira é através de equipamentos automatizados que são capazes de realizar todas as
operações do modo off-line, porém, diferentemente do modo at-line, não é gerado um extrato
contendo os analitos, pois todo eluato do cartucho é transferido em linha para o sistema
cromatográfico. Neste modo, assim como no off-line e at-line, costuma ser necessário um
cartucho de extração para cada amostra a ser extraída. Prospekt da SparkHolland, OSP-2 da
Capítulo 2 38
Merck e ASPEC XL da Gilson são exemplos de equipamentos que realizam a integração
online entre SPE-LC. Um aumento na produtividade é alcançado com esses equipamentos,
pois enquanto a próxima amostra é automaticamente preparada, os analitos da extração
anterior são analisados no sistema de separação/detecção. (20)
Outro modo de operação online utiliza o próprio cromatógrafo em um arranjo
bidimensional (column switching), no qual a pré-coluna de extração está interligada à coluna
analítica através de uma válvula de comutação. A vantagem do modo online de SPE por
column switching é a automação do processo de extração sem a necessidade de equipamentos
dedicados ao processo de extração. Nesse arranjo instrumental, a amostra é injetada
diretamente pelo amostrador automático do LC, os interferentes são removidos, os analitos
são eluídos após o giro da válvula de comutação, separados na coluna analítica, e
posteriormente, detectados (Figura 2.4). Outro fator positivo é o enriquecimento da amostra,
pois não há perda de analito durante a extração. Além disso, não há contaminação externa da
amostra, ocorre a redução do tempo de análise, os resultados são mais reprodutíveis e a
mesma coluna de extração pode ser utilizada diversas vezes. Como desvantagem, nesse
sistema não há como repetir a injeção do mesmo extrato e a seleção do solvente de clean up e
de eluição dos analitos se torna um pouco mais restrita. (28-30)
Figura 2.4 – Representação esquemática da técnica bidimensional por column switching
aplicada em LC. Posição de carregamento da amostra (A) e posição de eluição da amostra (B)
Fonte: Adaptado de (31).
Capítulo 2 39
2.1.1.4 Fases extratoras
A seleção da fase extratora em SPE é um dos parâmetros mais importantes quando se
trabalha com essa técnica, e a escolha deve ser feita com base na polaridade dos analitos e da
amostra. Atualmente diversas fases extratoras têm sido utilizadas em SPE. Entre os sorventes
clássicos, podemos destacar os materiais baseados em sílica (Figura 2.5). Sílica gel (SiO2)
pode ser utilizada como fase adsorvente sem modificação adicional. A superfície das
partículas de sílica possuem grupos silanois que interagem com os analitos no processo de
extração. Adicionalmente, alumina (Al2O3) e florisil (silicato de magnésio (Mg2SiO3))
também são fases extratoras muito empregadas na etapa de clean up no preparo de amostra
em algumas aplicações tais como ácidos graxos e pesticidas clorados. Para aumentar o escopo
de compostos a serem extraídos, foram desenvolvidas fases extratoras nas quais a superfície
da partículas.
Figura 2.5 – Estrutura de sorventes baseados em sílica.
NH2 CN OOH
OH
OH
SO3-
CO2-
NH+ NH2 N
+
Fase Reversa
Fase Normal
Troca Iônica
Catiônicos Aniônicos
C18 C8
C4 C2 Ciclohexil Fenil
Amino Ciano Diol Silica gel
Ácido carboxílico
(CO2H)
Ácido propil sulfônico
(SO3H)
Amina 1° e 2°
(NH/NH2)Amina quaternária
(N+)
Capítulo 2 40
da sílica é modificada quimicamente com uma grande variedade de grupamentos orgânicos. A
funcionalidade desses materiais pode ser classificada como sendo fase reversa, no qual se
utiliza grupamentos não polares (C18, C8, C4, C2, ciclohexil, fenil); fase normal, no qual
emprega grupamentos polares (amino, ciano, diol); troca iônica (SCX e SAX) e modo misto
(não polar e trocador iônico). (19, 32)
Dentre as fases citadas, as mais utilizadas no processo de extração contem o
grupamento C18 ou C8. Materiais baseados em sílica são estáveis em valores de pH entre 2 e
8. Abaixo do pH 2 ocorre a quebra da ligação com o grupo funcional e pH acima de 8
favorece a solubilização da sílica. Na tentativa de ampliar a faixa de pH no processo de
extração utilizando esses materiais, algumas estratégias tem sido desenvolvidas. Materiais que
passaram pelo processo de endcapping (segunda funcionalização com grupos menores que o
C18) ou o uso de fases trifuncionais em substituição aos grupamentos monofuncionais são
exemplos de fase extratora que possuem estabilidade com uma maior faixa de pH. Esse tipo
de material apresenta bons resultados na extração de compostos apolares e com polaridades
intermediárias, contudo, possuem baixa eficiência na extração de compostos com polaridade
elevada. Para minimizar essa problemática, fases extratoras contendo C18 monofuncional e
sem o processo de endcapping tem sido utilizadas para promover interações secundárias entre
o analito e o silanol residual na superfície da sílica, contudo, a faixa de pH aplicável é restrita.
(33)
A introdução de fases extratoras poliméricas possibilitou estender a faixa de pH (1 -
13) utilizada nos processos de extração. O polímero poliestireno-divinilbenzeno (PS-DVB) é
um exemplo de fase extratora polimérica (Figura 2.6). A extração de compostos polares foi
parcialmente solucionada com o uso de PS-DVB pois a superfície do polímero possui grupos
aromáticos que permite interações - com os analitos. (19)
Mais recentemente, foram desenvolvidas fases extratoras poliméricas funcionalizadas,
no qual diferentes grupos funcionais hidrofílicos (acetil, benzoil, o-carboxibenxoil,
hidroximeti
Figura 2.6 – Fase extratora polimérica apolar PS-DVB.
n
n
Capítulo 2 41
hidroximetil, sulfonato e trimetilamônio) foram inseridos na estrutura do polímero PS-DVB
(Figura 2.7). (34, 35)
Adicionalmente, a preparação de materiais extratores por polimerização do
divinilbenzeno (lipofílico) com n-vinilpirrolidona (hidrofílico) possibilitou o desenvolvimento
de sorventes que tivessem características hidrofílica e lipofílica (hydrophilic-lipophilic
balanced, HLB) em sua superfície (Figura 2.8). Esses materiais têm demonstrado bons
resultados na extração de compostos polares e apolares. (20, 21)
Figura 2.7 – Esquema geral de modificação da fase polimérica PS-DVB.
Fonte: Retirado de (35).
Capítulo 2 42
Figura 2.8 – Estrutura polimérica da fase extratora Oasis HLB comercializada pela Waters.
NO
Fases baseadas em carbono, tais como o carbono poroso grafitado (porous graphitized
carbon - PGC) e os nanotubos de carbono (carbon nanotube – CNTs) também vêm sendo
exploradas como fase extratora em SPE (Figura 2.9). (36, 37) PGC consiste em fitas
entrelaçadas de carbono, em que cada fita é constituída por cerca de 30 camadas de folhas. Já
fsdf
Figura 2.9 – Estrutura de fases baseadas em carbono. (A) carbono poroso grafitado, (B)
nanotubos de carbono de parede simples (single-walled carbon nanotube – SWCNT) e (C)
nanotubos de carbono de paredes múltiplas (multi-walled carbon nanotube – MWCNT).
Fonte: Adaptado de (38, 39).
Capítulo 2 43
os CNTs são estruturas finitas de carbono com morfologia tubular em dimensões
nanométricas e tem apresentado desempenho similar ou superior na extração de compostos
quando comparada com fases extratoras baseadas em sílica e poliméricas.
Sorventes seletivos também tem sido desenvolvido para aumentar a qualidade do
processo de extração dos analitos. Uma estratégia seletiva para promover a extração dos
analitos e a eliminação das macromoléculas é o uso de fases extratoras modificadas
superficialmente com meio de acesso restrito (RAM). Nesse modo de operação, os materiais
apresentam características mistas no qual ocorre a combinação da cromatografia por exclusão
e da cromatografia em fase reversa (Figural 2.10). (29, 40)
Em técnicas de imunoextração, a fase extratora possui anticorpos específicos para um
grupo de compostos ligados quimicamente na superfície do sorvente (Figura 2.11). Assim, em
uma única etapa, os analitos são seletivamente concentrados na coluna extratora. (41)
Outra abordagem de extração seletiva e baseada no reconhecimento molecular é o uso
de polímeros molecularmente impressos (MIP). Esses materiais tem se destacado pela
vantagem de serem mais seletivos para um composto ou uma classe de compostos em relação
às fases tradicionais de SPE. (42-44) A Figura 2.12 apresenta o esquema geral sintético do
preparo MIP. Na primeira etapa, há uma interação das moléculas precursoras do polímero
com a molécula alvo (template) formando um complexo monômero-template. Essa interação
leva a posições específicas das extremidades dos monômeros ao redor do template. A próxima
etapa
Figura 2.10 – Representação da fase extratora RAM.
Fonte: Adaptado de (22).
Capítulo 2 44
Figura 2.11 – Representação de fase extratora baseada em imunoafinidade.
Fonte: Adaptado de (22).
Figura 2.12 - Ilustração esquemática de preparo do MIP.
etapa é a reação de polimerização, na qual ocorre a formação do polímero ao redor do
template. Nesta etapa ocorre a fixação dos grupamentos dos monômeros no material
polimérico. Por fim, após a remoção do template, temos o MIP com cavidades e sítios
Capítulo 2 45
seletivos para a extração do template ou de estruturas análogas a ele. (45) Detalhes e maiores
informações sobre este material encontram-se no Capítulo 4 da tese.
2.2 Técnicas de separação
Atualmente diversas técnicas têm sido utilizadas nas determinações analíticas.
Podemos citar como exemplo as técnicas eletroanalíticas, a eletroforese capilar e a
cromatografia. (46) Entre essas técnicas, a cromatografia vem se destacando nas análises
qualitativa e quantitativa.
Cromatografia é o termo empregado para descrever a separação físico-química de
componentes de uma amostra através das diferentes interações entre duas fases imiscíveis: a
fase estacionária e a fase móvel. (47)
Existem diversas classificações da cromatografia, contudo, de maneira geral, pode ser
dividida, de acordo com a fase móvel utilizada, em cromatografia gasosa de alta resolução
(HRGC), cromatografia com fluido supercrítico (SFC) e cromatografia líquida de alta
eficiência (HPLC). (32)
A HRGC apresenta bons resultados de tempo de análise e eficiência cromatográfica
contudo, como inconveniente, as amostras precisam ser voláteis e estáveis termicamente nas
temperaturas de análise. Outro fator importante é a necessidade de derivatização dos fármacos
quando os compostos possuem grupos –OH, –NH2 ou –COOH em suas estruturas.
A SFC é uma técnica que apresenta características da cromatografia líquida e gasosa.
Apesar de ser uma técnica promissora, ela não foi muito empregada ao longo dos anos porém,
atualmente, tem recebido uma atenção especial.
Já em HPLC, a restrição da técnica está relacionada com solubilidade dos analitos na
fase móvel. Outra vantagem é a possibilidade de coleta da amostra após a análise quando não
se utilizam detectores destrutivos. Assim, a HPLC, principalmente operando em fase reversa,
é a técnica mais utilizada atualmente nas análises.
2.2.1 Desenvolvimento e evolução da cromatografia líquida
Carl Runge, um químico alemão nascido em 1856, relatou pela primeira vez a
separação de corantes empregando uma técnica similar a cromatografia em papel. Entretanto
o grupo de pesquisa não deu continuidade aos experimentos e as possíveis explicações dos
Capítulo 2 46
fenômenos envolvidos no processo. (33) No ano de 1897 David Talbot Day observou o
fracionamento e alterações na composição do petróleo após a passagem por terra Fuller.
Entretanto Day não conseguiu definir os processos envolvidos. (48) Em 1903, o botânico
polonês Mikhael Semenovich Tsweet apresentou trabalhos descrevendo a separação de
pigmentos de folhas de plantas através da adsorção dos analitos em colunas de vidro
preenchidas com diversos suportes sólidos e diferentes eluentes, sendo um dos seus
experimentos, o carbonato de cálcio empregado como fase estacionária e éter de petróleo
como a fase móvel. (49) Assim, historicamente, esse trabalho é relatado como sendo o marco
inicial do desenvolvimento da técnica cromatográfica. O nome cromatografia intitulada por
Tswett vem do grego no qual chroma e graphe significam cor e escrita, respectivamente.
A técnica cromatográfica foi pouco estudada até 1931 voltando a ganhar destaque
quando Edgar Lederer apresentou experimentos identificando várias xantofilas presentes na
gema do ovo. (50) Em 1941, Martin e Synge apresentaram um trabalho no qual descreveram o
uso de cromatografia líquida por partição na separação de aminoácidos. Os autores aplicaram
teorias cromatográficas e descreveram a possível aplicação de vapor como fase móvel,
podendo ser considerado o início da cromatografia gasosa (GC). Além disso, sugeriram que a
utilização de partículas menores operadas em altas pressões aumenta a eficiência de separação
(primeiras citações de HPLC). (51) Esse, e outros trabalhos levaram ao reconhecimento da
importante contribuição de ambos no desenvolvimento da cromatografia no qual em 1952
receberam o prêmio Nobel de Química.
A cromatografia gasosa desenvolveu-se mais rapidamente em relação a cromatografia
líquida (LC) pois a instrumentação era mais simples e as teorias existentes não explicavam
claramente o papel da fase móvel e estacionária em LC.(52) Isso conduziu ao grande avanço
na cromatografia gasosa, visto que, em 1957 já havia colunas capilares (desenvolvidas por
Golay) e equipamentos para GC, enquanto a cromatografia líquida ainda era conduzida quase
que exclusivamente de acordo com os experimentos de Tswett, ou seja, em colunas de vidro
(1 – 5 cm de diâmetro e 50 – 500 cm de comprimento) contendo fase estacionária (120 -200
µm) no qual a fase móvel era eluida apenas por gravidade ou com pequenas pressões de um
gás inerte sobre o solvente. Esse procedimento era demorado, podendo levar dias para
completar uma análise. No decorrer dos anos alguns trabalhos efetuando separações rápidas e
eficientes utilizando cromatografia líquida foram realizados empregando moderadas pressões.
(53)
Durante o aperfeiçoamento da cromatografia líquida percebeu-se que seria necessário
desenvolver uma sofisticada instrumentação para operar em pressões elevadas com o objetivo
Capítulo 2 47
de aumentar a eficiência da separação (utilização de partículas menores). Assim, no decorrer
da década de 1960 dois grupos de pesquisa (Csaba Horváth nos Estados Unidos e Josef Huber
na Europa) conduziram estudos voltados para o desenvolvimento do sistema HPLC. (33)
Juntamente com esse processo, ocorreu aprimoramento das técnicas de empacotamento de
partículas. Assim, tecnologias para o empacotamento de colunas reprodutíveis com partículas
abaixo de 30 µm foram desenvolvidas (fato que não havia sido obtido anteriormente). (54)
No final da década de 1960 as empresas Waters e DuPont colocaram no mercado os primeiros
equipamentos de HPLC. Alguns anos mais tarde, outras empresas entraram no ramo com
equipamentos similares e como consequência, houve um grande avanço em pesquisas
voltadas para HPLC. A Figura 2.13 ilustra o esquema geral de um equipamento de HPLC. As
bombas dos equipamentos operavam em pressões de 200 – 340 bar (3000 – 5000 psi). Os
sistemas de introdução de amostra eram por válvulas ou seringas e septos. A coluna era um
tubo com parede grossa de vidro ou metal com diâmetro interno de 2 a 5 mm e 0,1 a 2 m de
comprimento. Na saída da coluna cromatográfica, um detector capaz de gerar sinal analítico
era empregado para monitorar a concentração dos analitos ao saírem da coluna. (33, 48)
No início da década de 1970, o primeiro livro voltado para a temática HPLC foi
publicado pelos autores Snyder e Kirkland. Nesta publicação foi introduzido e discutido o
tema “cromatografia líquida moderna”. (32)
Nesta época, diversas discussões e publicações consolidaram as fundamentações da
LC e expandiram a aplicação em diferentes áreas. Nesse período, surgiram os nomes
comprimento.
Figura 2.13 – Esquema geral de um equipamento de HPLC. (A) bomba, (B) sistema de
introdução de amostra, (C) forno cromatográfico, (D) coluna, (E) sistema de detecção, (F)
descarte/coleta da amostra e (G) sistema de aquisição de dados.
Capítulo 2 48
“Cromatografia Líquida de Velocidade Rápida” (High Speed Liquid Chromatography, HSLC)
e também “Cromatografia Líquida de Alta Pressão” (High Pressure Liquid Chromatography,
HPLC), sendo este último o termo mais empregado. Contudo, posteriormente, a sigla
permaneceu a mesma e o nome foi alterado para a forma como conhecemos atualmente
“Cromatografia Líquida de Alta Eficiência” (High Performance Liquid Chromatography).
A alta resolução, eficiência, automação e menor tempo de análise, reprodutibilidade e
reutilização da coluna são algumas das vantagens da cromatografia líquida de alta eficiência
(HPLC) em relação a cromatografia líquida clássica. (48) Assim, de 1970 até os dias atuais, a
HPLC foi sendo desenvolvida sempre buscando melhoria na eficiência cromatográfica aliada
ao menor tempo de análise. A Figura 2.14 ilustra a evolução da análise por HPLC ao longo
dos anos.
Figura 2.14 – Representação cromatográfica que ilustra a evolução da HPLC ao longo dos
anos.
Fonte: Adaptado de (33).
Capítulo 2 49
dos anos. O bom desempenho da HPLC está relacionado principalmente com a evolução do
design dos sistemas cromatográficos aliado juntamente com o desenvolvimento de novas
tecnologias colunas no qual são preenchidas com partículas cada vez menores permitindo a
diminuição do comprimento da coluna. (55)
Os sistemas cromatográficos convencionais operam com pressões de até 400 bar.
Nesses sistemas, colunas preenchidas com partículas na faixa de 3 – 10 µm têm sido
utilizadas nas análises. A partir de 2004 foi introduzido no mercado equipamentos capazes de
operar em pressões de até 1000 bar. O desenvolvimento de cromatógrafos de alta pressão
possibilitou a utilização de colunas contendo partículas sub 2 µm. Assim, vazões mais
elevadas são utilizados sem perder a eficiência da separação. Para análises empregando essas
colunas, a denominação cromatografia líquida de ultra-alta eficiência (ultra high performance
liquid chromatography, UHPLC), tem sido utilizada. Entretanto, a única mudança no
equipamento não ficou restrita apenas a alta pressão suportada. Os equipamentos tiveram que
reduzir o volume do sistema. Neste sentido, coluna, tubulações, sistema de introdução de
amostra e de detecção tiveram que passar por adaptações. Assim, os sistemas de injeção tem
que possuir um ciclo rápido de injeção; os detectores uma alta taxa de aquisição de dados e o
gradiente da fase móvel deve ser efetivo para não prejudicar a separação cromatográfica. (56)
As colunas empregadas em HPLC possuem uma ampla faixa de diâmetro interno.
Assim, pode-se classificar as colunas cromatográficas de acordo com o diâmetro interno e a
vazão da fase móvel empregada (Tabela 2.1).
promissor,
Tabela 2.1 - Classificação da cromatografia líquida de acordo com o diâmetro interno das
colunas e o intervalo de vazão da fase móvel.
Denominação da coluna Diâmetro interno Vazão típica
Preparativas > 10 mm > 20 mL min-1
Semipreparativas 4,6 – 10 mm 5 – 20 mL min-1
Convencional/padrão 4,0 – 4,6 mm 1 – 5 mL min-1
Narrowbore 2,0 – 4,0 mm 0,2 – 2 mL min-1
Microbore 1,0 – 2,0 mm 50 – 1000 µL min-1
Capilar 100 µm – 1 mm 0,5 – 200 µL min-1
Nanobore 25 - 100 µm 25 – 4000 nL min-1
Tubulares abertas < 25 µm < 25 nL min-1
Fonte: Retirado de (32).
Capítulo 2 50
Pode-se observar que a diminuição do diâmetro interno da coluna cromatográfica
promove a redução da vazão da mesma. Esta redução de escala vem de acordo com o termo
“Química Verde” no qual foi introduzido por Anastas (57, 58), e, nesse âmbito,
posteriormente evoluiu a ideia da “Química Analítica Verde”. (59, 60)
A miniaturização da LC surgiu 10 anos após a introdução de colunas capilares para
GC, com os trabalhos pioneiros de Horvàth et al. Em 1967 (61, 62) Apesar do início
promissor, a miniaturização da LC foi lenta ao longo dos anos devido à restrição de
instrumentação adequada. Em LC capilar, as bombas devem produzir vazões baixas
(µL min-1
) com pulsação minimizada; as tubulações do sistema cromatográfico devem
contribuir pouco ao volume extra-coluna; e os sistemas de introdução de amostra e os
detectores devem apresentar volumes compatíveis com as colunas capilares para evitar a
dispersão da banda cromatográfica.
As principais vantagens do uso da cromatografia líquida miniaturizada estão
relacionadas com a redução no diâmetro interno da coluna e, consequentemente, a diminuição
do consumo de fase móvel e da quantidade de fase estacionária empregada. Essa situação é
ambientalmente amigável e possibilita o uso de aditivos ou de fase móvel ou estacionária
exótica possibilitando novas interações na busca de melhores resultados de seletividade.
Outras vantagens são o menor consumo de amostra, principalmente quando a quantidade
disponível é restrita; hifenação direta com diversos sistemas de detecção; e o aumento na
sensibilidade com detectores sensíveis à concentração, devido à diminuição da diluição
cromatográfica. (63, 64) Ainda pode-se destacar a melhor eficiência de ionização e a menor
contaminação de fontes de ionização baseadas em electrospray (eletrovaporização), no
acoplamento à espectrometria de massas, fato esse importante no caso de amostras complexas
e que tendem, inclusive, a um maior efeito de matriz.
Nos últimos anos, equipamentos comerciais vêm sendo colocado no mercado com
aplicabilidade em escala micro, capilar e nano com limites de pressões dos equipamentos
convencionais (400 bar) e pressões elevadas (1000 bar). Contudo, alguns equipamentos
utilizam a divisão de vazão para atingir as vazões exigidas na escala miniaturizada e,
consequentemente, não apresentam a vantagem da redução do consumo da fase móvel.
Capítulo 2 51
2.2.2 Evolução dos suportes cromatográficos em LC
Na década de 1950 as partículas para LC eram de materiais porosos e com formato irregular
com 100 - 200 µm de diâmetro (Figura 2.15A). Entretanto esses materiais ocasionavam
alargamento das bandas cromatográficas e, consequentemente, uma diminuição da eficiência
cromatográfica. Outro problema encontrado na época está relacionado com a dificuldade de
empacotar as colunas. Assim, problemas de reprodutibilidade de análise era um desafio a ser
superado. Esse problema foi solucionado na década de 1960 no qual Horváth desenvolveu
partículas de sílica peliculares (30 – 50 µm) (Figura 2.15B). Esse material apresentou bons
resultados utilizando o empacotamento a seco. O suporte cromatográfico era composto por
um núcleo sólido, rígido e não poroso (contas de vidro), revestido com uma película de
aproximadamente 1 µm de sílica porosa. A fina camada pelicular permitiu uma rápida
transferência do analito na camada porosa do suporte cromatográfico e, assim, promoveu um
melhoramento da eficiência cromatográfica comparada com as partículas porosas empregadas
na época. Em contrapartida, os suportes peliculares possuem baixa área superficial e,
consequentemente, uma diminuição na capacidade de amostra e também na retenção dos
analitos. (33, 65)
Figura 2.15 – Formato dos suportes cromatográficos. (A) partículas porosas e irregulares, (B)
partícula pelicular esférica, (C) partícula esférica porosa, (D) partícula esférica não porosa,
(E) partícula superficialmente porosa e (F) monolíto.
Fonte: Adaptado de (33)
Capítulo 2 52
A transição de partículas peliculares para partículas porosas menores iniciou na década
de 1970 com o desenvolvimento da técnica de empacotamento por suspensão (slurry packing
method) no qual permitiu obter colunas com micropartículas de sílica irregular e porosa com
diâmetro médio de 10 µm. Com o passar do tempo, e o melhor entendimento/aperfeiçoamento
dos métodos sintéticos, partículas esféricas porosas foram desenvolvidas (Figura 2.15C). A
uniformidade das partículas forneciam melhores empacotamentos da coluna cromatográfica e
consequentemente, colunas mais eficientes.
Na década de 1980 foram desenvolvidas partículas de 5 µm os quais apresentaram
melhor desempenho que as partículas anteriores. Em seguida, no início da década de 1990
partículas de 3,5 e 3 µm possibilitaram diminuir em entre 30 - 50 % o tempo de análise sem
perder a resolução na separação cromatográfica quando comparadas com partículas de 5 µm.
(33, 56)
Partículas não porosas foram introduzidas em 1996 com diâmetro de
aproximadamente 1,5 µm (Figura 2.15D). Esse suporte minimiza o efeito de difusão no poro
e, portanto, podem ser aplicadas vazões elevadas sem perder a eficiência cromatográfica.
Sílica não porosa também possui maior resistência mecânica e térmica. Entretanto, suporte
não poroso possui baixa área superficial, menor retenção dos analitos e menor capacidade de
amostra.
Em 2004, sílica porosa sub 2 µm foi disponibilizada comercialmente, apresentando
melhor eficiência quando comparada com colunas de 3 µm. A grande vantagem desses
materiais é utilizar vazão acima do valor considerado ótimo para a separação sem perder a
resolução na separação cromatográfica. Outra vantagem é a possibilidade de redução do
comprimento da coluna sem perder a eficiência da separação. Como resultado, colunas com
partículas sub 2 µm possibilitaram alcançar análises cromatográficas em menos de 1 minuto.
Como desvantagem, as pressões geradas pelo tamanho das partículas impossibilitam seu uso
em equipamentos convencionais (400 bar). Assim, essas colunas necessitam de um
equipamento com arranjo dedicado para operar em altas pressões (UHPLC). (33, 66)
Para evitar as altas pressões geradas utilizando partículas porosas sub 2 µm, em 2007
foram introduzidas no mercado as colunas com partículas superficialmente porosas (core shell
particles) os quais podem ser utilizadas em sistemas convencionais e, adicionalmente,
fornecerem análises rápidas (Figura 2.15E). As partículas possuem um núcleo sólido e não
poroso, de aproximadamente 1,7 µm de diâmetro, e uma camada porosa revestida
externamente de 0,5 µm de espessura. Esse material possui uma faixa estreita de distribuição
Capítulo 2 53
de partícula, apresenta eficiência cromatográfica elevada e uma rápida cinética de
transferência de massa. (66)
Além dos materiais particulados, outra possibilidade de suportes cromatográficos
envolve o uso de materiais monolíticos (Figura 2.15F). (67) Um material monolítico possui
estrutura sólida e altamente porosa que fornece alta permeabilidade da fase móvel através dos
canais porosos. Esses podem ser classificados como microporos (não excedem 2 nm),
mesoporos (entre 2 e 50 nm) e macroporos (acima de 50 nm), dependendo do molde utilizado
na síntese do monolito.(68) A principal vantagem das colunas monolíticas em relação a
colunas com preenchimentos de materiais particulados é a redução do tempo de análise pois
vazão elevada pode ser empregado sem um grande aumento na pressão do sistema. As
primeiras colunas monolíticas disponíveis comercialmente (2000) não apresentavam alta
eficiência na separação quando comparadas com colunas particuladas. Entretanto,
recentemente (2012) foram desenvolvidas colunas monolíticas de segunda geração chamadas
de colunas monolíticas de alta resolução os quais possuem um maior número de pratos por
metro sem comprometer a vantagem da vazão elevada e pressões compatíveis com os
sistemas convencionais de LC. (66) A Figura 2.16 ilustra a comparação de coluna particulada
e monolítica.
De forma resumida, a Tabela 2.2 apresenta a evolução dos suportes cromatográficos, a
redução no tamanho das partículas e o aumento na eficiência das colunas.
Figura 2.16 – Característica estrutural de uma coluna particulada (A) e monolítica (B).
Fonte: Adaptado de (69).
Capítulo 2 54
Tabela 2.2 –Diminuição do tamanho das partículas em LC.
Ano Tamanho da
partícula Morfologia Pratos/15 cm
1950s 100 - 200 µm Irregular porosa 200
1967 50 µm Pelicular esférica 1000
1970s 10 µm Irregular porosa
Esférica porosa 6000
1985 5 µm Esférica porosa 12000
1992 3 µm e 3,5 µm Esférica porosa 22000
1996 1,5 µm Esférica não porosa 30000
2000 - Monolítica 15000
2000 2,5 µm Esférica porosa 25000
2004 1,7 µm Esférica porosa 35000
2007 1,6 e 2,6 µm Superficialmente porosa 30000
2012 - Monolítica 22500
Fonte: Adaptado de (56, 66).
2.2.3 Suporte cromatográfico em LC
Um bom suporte cromatográfico em cromatografia liquida de alta eficiência deve
possuir algumas características fundamentais: (70)
Ser mecanicamente estável, ou seja, suportar altas pressões exigidas na HPLC;
Possuir grande concentração de grupos ativos na superfície a fim de promover melhor
desempenho cromatográfico;
Ser inerte em relação aos compostos a serem analisados.
Em cromatografia líquida os suportes cromatográficos podem ser baseados em
polímeros inorgânicos ou orgânicos. (71) Entre os polímeros inorgânicos, podemos citar os
óxidos de silício (sílica) que são os mais utilizados nas separações cromatográficas atuais.
(72) A sílica apresenta-se em unidades tetraédricas (SiO4) aleatórias unidas por grupos
siloxanos e sua superfície apresenta grupos silanois. (65, 73)
As características do suporte cromatográfico baseado em sílica são extremamente
dependentes da estratégia utilizada para o seu preparo. Entre as metodologias de síntese de
sílica podemos destacar o método de gelificação das soluções de sal de silicato (sil-gel), o
Capítulo 2 55
método de hidrólise de organossilanos (sol-gel) e o método de agregação controlada de sílica
coloidal estável. O termo sol é utilizado para definir uma dispersão de partículas coloidais
(diâmetro entre 1 – 100 nm) enquanto o termo gel é caracterizado como um sistema formado
por estruturas rígidas das partículas coloidais ou de cadeias poliméricas que imobiliza a fase
líquida nos seus interstícios. (74)
Pela rota sílica gel (também chamada de sil-gel) utiliza-se o silicato de sódio como
material de partida. A descoberta da sílica gel foi realizada por Thomas Graham (1981) o qual
preparou a sílica a partir de uma mistura de uma solução aquosa de silicato de sódio com
ácido clorídrico. Já o preparo do silicato de sódio normalmente é realizado através do
aquecimento de areia e soda cáustica em temperatura elevada. (65)
Inicialmente a solução contendo o silicato de sódio sofre um processo de hidrólise
com a adição do acido clorídrico formando o ácido silícico. Posteriormente, ocorre a reação
de condensação do ácido silícico formando dímeros, trímeros e consequentemente uma rede
polimérica de ácido silícico (Figura 2.17).
A rede polimérica continua crescendo, e formando partículas esféricas primárias de
alguns Angstrons de diâmetro (Figura 2.18A). As partículas primarias continuam a aumentar
de tamanho (Figura 2.18B) e, posteriormente, sofrem condensação através dos grupos silanois
presentes em sua superfície. Como resultado, as partículas primárias ficam aderidas umas as
outras (aglomeração) e a solução começa o processo de gelificação para formar o hidrogel
(Figura 2.18C).
Após a formação do hidrogel, o material sintetizado é submetido a um período de
envelhecimento no qual as partículas primárias de sílica continuam o processo de
polimerização. Esta etapa é importante, pois confere resistência mecânica ao material final.
Em seguida o hidrogel passa pela etapa de desidratação (secagem) na qual é transformado em
xerogel. (65)
A característica final da sílica sintetizada é extremamente dependente das condições
reacionais (concentração dos reagentes, temperatura da reação, pH da solução, tempo e
condições de envelhecimento e processo de secagem) e muitas vezes difícil de controlar e
reproduzir. A influência do pH no tempo de gelificação está representada na Figura 2.19.
Pode-se observar que em baixos valores de pH, o tempo de gelificação aumenta rapidamente
com o aumento do pH (próximo a 2). Na faixa de pH entre 2 e 4, a solução é estável e muitas
horas são necessárias para promover a formação do hidrogel. Em contrapartida, se o pH da
solução é ajustado entre 4 e 8, a solução se torna instável e a formação do hidrogel ocorre em
Capítulo 2 56
Figura 2.17 – Etapas do processo sil-gel: hidrólise e condensação.
Na2SiO3 (aq) 2 HCl Si OH
OH
HO
OH
2 NaCl
Hidrólise
ácido silícico
Condensação
Si OH
OH
HO
OH
Si OH
OH
HO
OH
Si O
OH
HO
OH
Si OH
OH
OH
H2O
Si O
OH
HO
OH
Si OH
OH
OH
Si OH
O
HO
OH
Si O
OH
HO
OH
Si O
O
Si OH
OH
OH
Si OH
OH
HO
Figura 2.18 – Representação da formação da sílica gel. (A) formação das partículas
primárias, (B) aumento de tamanho das partículas primárias e (C) formação do hidrogel.
Fonte: Adaptado de (65).
Capítulo 2 57
Figura 2.19 – Influência do pH no tempo de gelificação no processo sil-gel.
Fonte: Adaptado de (65).
poucos minutos. Acima de pH 8 o tempo de gelificação começa a aumentar novamente e
ocorre a competição com a quebra da rede polimérica da sílica devido sua solubilização. (65)
Partículas de sílica formadas na faixa de pH entre 1 – 4 apresentam grande área
superficial (aproximadamente 800 m2 g
-1). Em contrapartida, a medida que o pH é aumentado
de 4 para 8 ocorre uma diminuição dos valores de área superficial (800 m2 g
-1 para 200 m
2 g
-
1). De forma geral, a área superficial das partículas de sílica é inversamente proporcional as
dimensões das partículas primárias provenientes da polimerização do ácido silícico. Como
resultado, as partículas primárias são relativamente menores quando preparadas em pH entre 1
– 4 quando comparadas com a faixa de 4 - 8.
Quando a solução de silicato de sódio com o pH ajustado é submetida a agitação
magnética ocorre o fenômeno chamado maturação de Otswald (também conhecido como
envelhecimento de Otswald). Esse processo consiste no aumento do diâmetro de partículas
primárias a custa de partículas primárias com diâmetro menor (Figura 2.20). Adicionalmente
o processo de maturação/envelhecimento do gel formado leva ao aumento do tamanho das
partículas primárias. Além disso, logo após a formação do gel, o mesmo não apresenta rigidez
e durante o processo de maturação por alguns dias, reações de condensação das partículas
primárias continuam ocorrendo e o hidrogel se torna firme e com resistência mecânica. (65)
O processo de lavagem do hidrogel após o envelhecimento também altera as
características finais da sílica. Estudos demonstram que a lavagem do hidrogel com solução
ácida (pH =3) promove uma diminuição da área superficial do polímero quando comparada
com
Capítulo 2 58
Figura 2.20 – Processo de maturação de Otswald.
com a lavagem com água em pH = 6,5. Além disso, a imersão do hidrogel em diferentes
solventes também promove alterações no material sintetizado. Após todas essas etapas, o
hidrogel é submetido ao aquecimento para se transformar em xerogel. Para serem utilizadas
como suporte cromatográfico em LC, as partículas do xerogel são trituradas e separadas em
faixas de diâmetros de partículas com aplicabilidade em LC. Ajustes nas condições sintéticas
devem ser realizadas de acordo com os parâmetros desejados para o polímero final.
Esse método permite obter-se partículas irregulares sendo classificadas como sílica gel
tipo A por utilizar precursor de baixa pureza e, portanto, apresentar maior quantidade de
metais. (75, 76)
O processo sol-gel é uma segunda abordagem empregada para preparar partículas de
sílica. Nesta rota sintética geralmente utiliza-se precursores alcoxissilano (tetrametoxisilano
(MTOS) ou tetraetoxissilano (TEOS)) dissolvidos em álcool. Posteriormente, com a adição de
água e catalisador (ácido ou básico) ocorre a reação de hidrólise e condensação. É importante
ressaltar que a hidrólise dos alcoxissilanos ocorre com maior eficiência e rapidez quando
catalisadores são utilizados no processo. Geralmente as reações de hidrólise e condensação
ocorrem simultaneamente, assim que os reagentes são misturados. A reação de hidrólise leva
a formação de grupos silanois e as reações de condensação levam a formação de ligações
siloxano. A Figura 2.21 ilustra as reações químicas que ocorrem durante a transformação sol-
gel. A reação de condensação possui um mecanismo complexo, pois se inicia antes do
término da reação de hidrólise.
No processo sol-gel a sílica obtida é classificada com sendo do tipo B por apresentar
maior pureza em relação à sílica tipo A. As características finais da sílica são dependentes das
condições experimentais de síntese (concentração dos precursores, a agitação, temperatura
reacional, natureza do catalisador). Um método amplamente conhecido para a obtenção de
partículas
Capítulo 2 59
Figura 2.21 – Etapa de hidrólise e condensação no processo sol-gel.
Fonte: Adaptado de (77).
partículas esféricas e monodispersas de sílica é o método de Stober no qual se baseia na
hidrólise e condensação de alcoxissilano em uma solução contendo água, álcool e amônia
formando partículas de hidrogel que posteriormente são calcinadas para aumentar a
estabilidade do material. (78) Normalmente as partículas obtidas neste processo são
consideradas não porosas e possuem diâmetros em escala nanométrica. O aumento no
diâmetro das partículas pode ser obtido através do método conhecido como crescimento de
partícula semente o qual consiste em adições do precursor da sílica na suspensão coloidal das
partículas.
Capítulo 2 60
Segundo Chang as partículas de sílica começam a aumentar de tamanho quando a
concentração de TEOS no sistema alcança o nível saturado (CS). Entretanto, se a concentração
de TEOS ultrapassar um valor limite de saturação (CS*) ocorrem novas nucleações
comprometendo a monodispersão das partículas (Figura 2.22). (79)
Já Chou avaliou o crescimento de partícula em relação a velocidade de geração de
novas partículas e a velocidade de consumo do TEOS no crescimento de partículas. Se a
velocidade de consumo do TEOS for maior que a de formação de novas partículas ocorrerá o
crescimento da partícula sem o surgimento de partículas secundárias. Contudo, se o inverso
ocorrer, aparecerão novas nucleações (Figura 2.23). (80)
Figura 2.22 – Representação da dispersão das partículas no experimento de aumento do
diâmetro. (A) crescimento monodisperso e (B) crescimento com formação de partículas
secundárias.
Fonte: Adaptado de (79).
Figura 2.23 – Esquema da geração e consumo do intermediário sintético no processo de
crescimento de partícula.
Fonte: Adaptado de (80).
Capítulo 2 61
Uma forma de obter partículas porosas através do método de Stober é incorporando no
processo sintético compostos formadores de poros. Nesse procedimento, moléculas
volumosas são utilizadas como template de poros e incorporadas na rede polimérica de sílica.
Assim, após sua remoção por calcinação, a partícula de sílica apresenta maior porosidade.
Unger et al realizou trabalhos empregando alquilaminas (dodecilamina e hexadecilamina)
para produzir poros nas partículas de sílica sintetizadas pelo método de Stober modificado.
(81) Similarmente, outros trabalhos têm demonstrado bons resultados ao utilizar cloreto de
hexadeciltrimetilamônio (CTAC) como surfactante porogênico. (82) Após a síntese do
material, o mesmo é submetido a calcinação (500 – 600°C) para remoção da cadeia orgânica e
geração dos poros na partícula de sílica. Com esse procedimento, materiais com mesoporos
são tipicamente sintetizados. Adicionalmente, trabalhos têm relatado que o tamanho dos poros
pode ser expandido para a faixa de meso e macroporos através do tratamento das partículas de
sílica com hidróxido de sódio, carbonato de sódio ou agentes complexantes orgânicos em
temperatura elevada. Pode-se considerar que este processo de adequação dos poros está
relacionada e fundamentada no processo de maturação de Ostwald. (83, 84)
Uma terceira abordagem para a preparação de partículas de sílica porosa para LC é o
método de agregação controlada. Nesta rota sintética, pode ser utilizada a agregação reativa
ou agregação de gotículas (gotas) dispersas. A primeira foi desenvolvida por Iler e
McQueston em 1977, os quais deram ao processo o nome de coacervação (coacervation).
Nesse procedimento, uma solução aquosa e estável de partículas de sílica coloidal (centenas
de Angstrons) é misturada com monômeros orgânicos miscíveis na solução. Após o processo
de polimerização dos monômeros, as partículas coloidais de sílica são microencapsuladas em
agregados esféricos na matriz polimérica orgânica. Por exemplo, ureia e formaldeído podem
ser adicionados a uma solução coloidal em que, após ajuste do pH em faixas ácidas, ocorre o
encapsulamento das partículas de sílica na escala nanométrica para a formação de partículas
na escala micrométrica com polímero orgânico. Posteriormente, o polímero formado é tratado
termicamente à temperatura de 500°C para remoção do polímero orgânico. Adicionalmente, a
temperatura é elevada até 1000°C para a sinterização das micropartículas e aumento da
resistência mecânica. (83) A Figura 2.24 ilustra partículas de sílica esféricas obtidas através
deste procedimento experimental.
O método de agregação de gotículas (gotas) dispersas inclui o método de secagem por
nebulização (spray drying) e o método de emulsão. O spray drying consiste na dispersão de
uma suspensão coloidal de sílica através de um bocal formando pequenas gotículas do líquido
líqudo
Capítulo 2 62
Figura 2.24 – Microscopia de partículas de sílica obtidas pelo método de microencapsulação.
Fonte: Adaptado de (85).
(Figura 2.25). A pulverização da suspensão ocorre dentro de um forno com temperatura em
torno de 400°C. Essa etapa resulta na evaporação da água das gotículas empregando um gás
de secagem
Figura 2.25 – Método de secagem por nebulização. (A) representação esquemática do
equipamento de spray drying e (B) processo de nebulização e secagem da suspensão coloidal.
Fonte: Adaptado de (86, 87).
Capítulo 2 63
de secagem quente e na policondensação simultânea dentro das gotículas. As partículas
obtidas após esse processo podem ser submetidas a um tratamento hidrotérmico para ajuste de
porosidade. Tipicamente, a maioria das partículas sintetizadas por este procedimento é
esférica, contudo há uma dependência da morfologia com as condições experimentais
ajustadas. O tamanho das partículas produzidas varia de acordo com a concentração dos
reagentes, temperatura do forno de secagem, abertura do bocal de pulverização, tamanho das
gotículas e outros parâmetros. Os materiais obtidos por essa metodologia geralmente
apresentam grande faixa de distribuição de partículas e necessitam de classificação para obter
faixas estreitas de diâmetro de partícula para uso em LC. (71, 83)
Partículas esféricas porosas também podem ser obtidas através do método de
emulsificação de uma suspensão coloidal, organossilano ou solução de silicato em solvente
apolar no qual gotículas são formadas e em seguida são solidificadas formando as partículas
esféricas que são separadas do meio reacional e submetidas a um tratamento térmico. É
importante ressaltar, no entanto, que a distribuição do tamanho de partícula pode ser bastante
ampla dependendo das condições de emulsificação utilizada para regular o tamanho das gotas.
(71, 83)
Os suportes baseados em sílica apresentam faixa de pH aplicável limitado (2 - 8) e
análise em temperatura superior a 60°C favorecem a solubilização da sílica. Assim, outros
materiais foram desenvolvidos com o objetivo de ampliar a faixa de pH e temperatura nas
aplicações. Desta forma, foi desenvolvido um suporte cromatográfico no qual a superfície da
sílica foi recoberta com uma camada de grupamentos hidreto (-Si-H). Esse grupos foram
formados pela reação dos silanois na superfície da sílica com o produto de hidrólise do
precursor trietoxissilano (TES). Assim, os grupos polares presentes na superfície da sílica
reagem formando uma superfície não polar, e, as interações indesejáveis dos analitos com os
silanois residuais são minimizadas. Esses novos materiais são chamados de sílica tipo C,
caracterizados por serem materiais híbridos e com alta pureza e com maior estabilidade
química (Figura 2.26A). Nesta mesma linha, outros materiais híbridos foram desenvolvidos
utilizando precursores que continham a ligação silício-carbono (Si-C). Assim, essa ligação faz
parte do suporte cromatográfico e melhora a estabilidade dos materiais em uma faixa mais
ampla de pH. A reação de TEOS com metiltrietoxissilano leva a incorporação do grupo metil
na rede polimérica da sílica (Figura 2.26B). Um segundo exemplo de materiais híbridos é a
reação de TEOS com bis(trietoxissiletano) formando suportes que contem ligações de etano
na estrutura do polímero (Figura 2.26C). Adicionalmente, outra metodologia utiliza a
modificação
Capítulo 2 64
Figura 2.26 – Representação do preparo de sílica híbrida. (A) sílica híbrida com grupamento
hidreto na superfície, (B) sílica híbrida com ligações silício-metil, (C) sílica híbrida com
ligações de etano e (D) sílica híbrida com um organossilano na superfície.
CH3O
SiO
SiO
SiO
SiO
Si
OO
CH3O
SiO
SiO
SiO
SiO
Si
CH3OHOHO
CH3 CH3
OH OH
CH3
OCH3
OCH3
CH3
O
O
CH3
CH3
OHOH
CH3
CH3O
SiO
SiO
SiO
SiO
Si
OO
CH3O
SiO
SiO
SiO
SiO
Si
CH2OHOHO
CH2 CH2OH OH
CH2
OCH3
OCH3
CH2
O
O
CH3
CH3
OHOH
CH2
Si OEt
OEt
OEt
EtO
Si OEt
OEt
OEt
EtO
+
+
Si OEt
CH3
OEt
EtO
SiOEt
EtO
OEtSiCH2
EtO
OEtEtO
CH2
Si OEt
R
OEt
EtO
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
O
O
O
O
O
HH
H
H
H
H
H
+ Si OEt
H
OEt
EtO
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
HH
H
H
H
H
H
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
O
H
H
H
H
H
H
H
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
O
O
O
O
O
HH
H
H
H
H
H
+
O
O
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
OH
R
R
R
OH
OH
R
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
HH
H
H
H
H
H
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
O
H
R
R
OH
OH
R
Si OEt
OEt
OEt
EtO
A
B
C
D
Capítulo 2 65
modificação da superfície da partícula de sílica com um organossilano para ampliar a faixa de
pH utilizado sem perder a estabilidade mecânica do material (Figura 2.26D). (33, 88, 89)
Além disso, a inserção de um grupo organossilano (aminopropiltrietoxissilano ou
viniltrimetoxissilano) é interessante ao considerar que a presença desses grupos funcionais
facilita a reação química com outros grupamentos orgânicos. Este fator torna possível o
desenvolvimento de novas fases estacionárias.
Em LC os suportes cromatográficos também podem ser obtidos a partir de óxidos
metálicos, destacados pela estabilidade química e térmica. Os materiais baseados em óxido de
alumínio (alumina - Al2O3) apresentam uma boa estabilidade em uma faixa mais ampla de pH
(1 – 13). Entretanto, esse suporte cromatográfico apresenta uma eficiência cromatográfica
inferior aos materiais baseados em sílica e, consequentemente, esse fator contribuiu para a
utilização moderada desse suporte. (90, 91) Suportes cromatográficos baseados em óxido de
zircônio (zircônia, ZrO2) (92) e óxido de titânio (titânia, TiO2) (93, 94) apresentam boa
estabilidade em pH entre 1 e 14, e em temperaturas de até 200°C. A superfície desses
materiais apresentam sítios ácidos de Lewis. Consequentemente, fases estacionárias baseadas
nesses óxidos tem demonstrado modo misto de retenção (fase reversa e troca iônica, por
exemplo). Além disso, analitos com características básicas podem interagir fortemente com
esses sítios ácidos provocando caudas cromatográficas. (83) Outros óxidos metálicos também
vêm sendo explorados como suportes cromatográficos. Podemos destacar os materiais
baseados em óxido de cério (céria, CeO2) (95) e óxido de tório (tória, ThO2). Apesar das
vantagens de estabilidade química e térmica, os suportes cromatográficos baseados em óxidos
metálicos apresentam como desvantagem a dificuldade de síntese e funcionalização de
partículas com propriedades adequadas para LC quando comparadas com materiais baseados
em sílica. (88, 96, 97) Assim, trabalhos foram conduzidos na preparação de óxidos mistos no
qual combinam as propriedades da sílica e dos óxidos metálicos. Neste conceito, os materiais
mistos apresentam área superficial e diâmetro de poros adequados, melhores desempenhos em
temperaturas elevadas e operação em uma faixa mais ampla de pH. (98)
Partículas esféricas porosas baseadas em polímeros orgânicos também são utilizadas
como suporte cromatográfico em LC. Podemos citar o uso de poliestireno-divinilbenzeno
(PS-DVB) em cromatografia líquida em fase reversa, troca iônica e exclusão por tamanho.
Outros polímeros como metacrilato substituídos, alcoóis polivinílicos e poliacrilamida
também tem sido usados. Apesar de possuírem uma ampla faixa de pH aplicável, esses
materiais possuem baixa eficiência cromatográfica. (99) Adicionalmente, a facilidade de
Capítulo 2 66
encolhimento e expansão do polímero diminuem sua resistência mecânica e, como
consequência, ocorre uma limitação na pressão máxima de análise. (32)
Suportes baseados em carbono grafitado poroso (PGC) consistem em partículas
esféricas de carbono totalmente poroso formadas a partir de folhas planas de átomos de
carbono dispostos em forma hexagonal. PGC são estáveis a um pH entre 1 – 14 e em
temperaturas de até 200°C. No entanto, as partículas desse material não possuem resistência
mecânica elevada e, consequentemente, apresentam uma limitação em termos de pressão
máxima. (33)
Como já citado anteriormente, colunas monolíticas são utilizadas como suporte
cromatográfico em LC. De acordo com a metodologia utilizada no preparo de colunas
monolíticas, pode-se classificá-las em colunas monolíticas baseadas em polímeros orgânicos
(100, 101) e colunas monolíticas baseada em sílica (obtida pelo processo sol-gel). (102, 103)
2.2.4 Fases estacionárias
A fase estacionária é que determina a retenção e a seletividade dos analitos na análise
cromatográfica. Os grupos silanois na superfície da sílica apresentam polaridade e suas
ligações de hidrogênio têm a capacidade de interagir com diversas moléculas, tornando
possível a separação de substâncias (Figura 2.27).
Devido as primeiras separações cromatográficas terem sido realizadas utilizando a
sílica (que possui superfície polar) como suporte cromatográfico, a cromatografia líquida em
fase normal (normal phase, NP) é caracterizada por apresentar fase estacionária mais polar
em relação à fase móvel; quando a fase estacionária for menos polar do que a fase móvel é
denominada de cromatografia líquida em fase reversa (reverse phase, RP).(47)
Em HPLC as fases estacionárias podem ser classificadas em sorvidas, imobilizadas ou
quimicamente ligadas. A primeira caracteriza-se por ser um líquido de baixa massa molar
apenas sorvido na superfície do suporte cromatográfico, porém, essas fases estacionárias são
difíceis de serem mantidas quando submetidas às pressões utilizadas na HPLC. Assim, é
necessário empregar fases móveis saturadas com a fase estacionária e fazer um controle de
temperatura e vazão para diminuir a remoção da fase estacionária e garantir um resultado
confiável nas análises. (104)
Capítulo 2 67
Figura 2.27 – Grupos silanois presente na superfície da sílica.
Fonte: Adaptado de (33).
Outra metodologia utilizada para modificar a superfície de um suporte cromatográfico
é o recobrimento com polímeros orgânicos. (105) Primeiramente o polímero é sorvido no
suporte cromatográfico e, posteriormente, é imobilizado por reações de entrecruzamento
catalisadas por agente químico (106) ou por processos físicos (radiação térmica, gama ou
micro-ondas). (107) Essa técnica tem a vantagem de preparar fases estacionárias estáveis,
além de isolar os sítios ativos residuais dos suportes cromatográficos. Entre os polímeros
utilizados como fases estacionárias destacam-se o polietileno, poliestireno e os polissiloxanos.
A maior dificuldade nessa técnica é a obtenção de um filme fino e homogêneo. (108)
A grande concentração de grupos silanois na superfície da sílica possibilita a
modificação química obtendo as chamadas fases estacionárias quimicamente ligadas (FEQL)
que possuem propriedades específicas relacionadas aos grupos ligados na superfície da sílica.
(Figura 2.28). A síntese dessas fases teve início na década de 1960 através da reação de
esterificação dos grupos silanois com um álcool alifático de cadeia longa (Figura 2.28A).
Contudo a ligação Si-O-C é relativamente fraca em soluções aquosas, sendo hidrolisada
rapidamente regenerando os grupos silanois na sílica. (54, 65, 109)
Capítulo 2 68
Figura 2.28 – Obtenção de fase estacionária quimicamente ligada. (A) reação de
esterificação, (B) reação com SOCl2, (C) reação de organossilanização com reagente
monofuncional, (D) reação de organossilanização com reagente difuncional e (E) reação do
hidreto com grupo alquílico.
Si OH Si ClSOCl2
R MgBrSi R
Si NH
NH2
NH2
NH2
ROH
Si ORSi OH
Si OH Si O Si R
R'
R'XSi(R')R
A
B
C
R = alquil de cadeia longa
R = alquil ou fenil
X = Cl, OMe, OEt
R' = alquil de cadeia curta
R = fase estacionária
X = Cl, OMe, OEt
R = fase estacionáriaD
X3SiRSi OH
Si OH Si O
Si O
Si(X) R
R = fase estacionáriaE
H2C=CH-R
Si CH2 CH2 RSi Hcatalisador
Na tentativa de obter FEQL estáveis foram preparados materiais a partir da reação da
sílica com cloreto de tionila (SOCl2) e posteriormente com reagente de Grignard gerando
ligações Si-C, ou com aminas gerando ligações Si-N (Figura 2.28B). Apesar de serem
ligações mais estáveis, comparando com a ligação Si-O-C, a ligação Si-N ainda apresenta
faixa de pH restrita (4 a 8) e as fases obtidas por Grignard apresentam interferentes
proveniente da rota sintética. A metodologia mais empregada atualmente no preparo de FEQL
é a reação de organossilanização que utiliza modificadores do tipo cloro (Cl) ou alcoxissilano
podendo ser mono, di ou trifuncional (Figura 2.28C e D). (65) Adicionalmente temos também
a sílica tipo C na qual um grupamento alquílico pode ser ligado quimicamente na superfície
do suporte cromatográfico através da reação dos grupamentos hidretos (Si-H) com
Capítulo 2 69
grupamentos alquílicos terminalmente insaturados, em presença de um catalisador (Figura
2.28E).
Quando um reagente funcionalizante silano monofuncional
(clorodimetiloctadecilssilano (ODS) por exemplo) reage com o grupo silanol na superfície da
sílica ocorre a formação da fase estacionária C18 monomérica (Figura 2.29). Fases obtidas
por este procedimento são reprodutíveis e apresentam boa eficiência cromatográfica devido a
rápida difusão do analito na camada da fase monomérica. Entretanto as fases monoméricas
apresentam grande quantidade de silanol residual após o processo de funcionalização. Esses
grupos silanois podem promover interações secundárias com os analitos e provocar
alargamento da banda cromatográfica. Além disso, o uso dessa fase em pH baixo leva a
hidrólise do grupo funcionalizador e consequentemente a perda de seletividade da coluna
cromatográfica. Uma maneira de minimizar esses efeitos é promover uma segunda etapa de
funcionalização com um reagente silano de volume menor (trimetilclorossilano (TMS)). Este
procedimento diminui 20 – 30 % dos silanois residuais nas partículas de sílica. Assim, é
importante ressaltar que a interação silanol-analito é minimizada e não completamente
eliminada. (33)
Figura 2.29 – Representação de algumas fases estacionárias quimicamente ligadas no suporte
cromatográfica baseado em sílica.
Fonte: Adaptado de (33).
Capítulo 2 70
Outra estratégia para bloquear os grupos silanois da sílica é utilizar reagentes
funcionalizantes com proteção estérica. Esses precursores são uma variação das fases
monoméricas pois os grupos metila ligados ao átomo de silício são substituídos por grupos
volumosos (i-propil ou i-butil). Esses grupamentos dificultam o processo de hidrólise da fase
estacionária e, portanto, são mais apropriados para análise em pH baixo. Entretanto, as fases
com proteção estérica possuem menor concentração dos ligantes na superfície do suporte
cromatográfico e consequentemente apresentam menor retenção quando comparadas com
fases estacionárias monoméricas contendo o grupamento dimetil. Fases estacionárias
bidentadas apresentam maior estabilidade em meio básico e, portanto são utilizadas para
aplicações no qual é necessário um pH acima de 8.
Se um reagente silano bi ou trifuncional é empregado, dependendo das condições
utilizadas, pode-se obter fases estacionárias com polimerização vertical ou horizontal. Essas
fases tendem a ser mais estáveis do que fases monoméricas em pH baixo e alto. Entretanto,
esses materiais possuem menor reprodutibilidade de retenção e seletividade devido a
dificuldade de controlar o processo de polimerização do organossilano. Adicionalmente, as
colunas contendo as fases poliméricas possuem uma menor eficiência na separação,
principalmente quando vazão elevada é empregada. (33)
Atualmente diversas colunas com diferentes fases estacionárias estão disponíveis para
HPLC (Figura 2.30) atuando no modo normal (diol, ciano, amino, SiO2), reverso (C30, C18,
C8, C4, C2, fenil, ciclohexil, fluoradas, grupos polares embutidos), iônico (SAX, SCX, WAX,
WCX) ou seletivo (quiral, bioafinidade) e HILIC (cromatografia de interação hidrofílica). (54,
110)
2.3 Parâmetros cromatográficos em HPLC
Os parâmetros cromatográficos são uma ferramenta importante para avaliar e
caracterizar cromatograficamente uma coluna de HPLC. Adicionalmente, antes de realizar a
validação da metodologia, é fundamental averiguar se as condições estabelecidas na análise
cromatográfica são capazes de gerar dados confiáveis. Assim, é importante verificar se os
parâmetros cromatográficos estão de acordo com os limites recomendados e aceitos.
Os parâmetros cromatográficos são obtidos através de dados do cromatograma
conforme apresentado na Figura 2.31. O tempo morto (tm) é o tempo gasto para o analito
percorrer toda a tubulação e chegar ao detector sem interagir com a coluna cromatográfica. Já
o
Capítulo 2 71
Figura 2.30 - Representação de fases estacionárias utilizadas em HPLC
Fonte: Adaptado de (33).
Figura 2.31 - Cromatograma ilustrativo de parâmetros cromatográficos de uma análise.
Fonte: Adaptado de (32).
Capítulo 2 72
o tempo de retenção (tR) é o tempo decorrido desde a injeção cromatográfica até o máximo de
altura do sinal. (32)
A velocidade linear da fase móvel (u) é comumente expressada em mm s-1
ou cm s-1
e
pode ser calculada a partir do quociente entre o comprimento da coluna com o tempo de
eluição de um composto não retido (tm) como representado na Equação 1.
mt
Lu (1)
O fator de retenção (k) estabelece a relação entre o tempo em que um composto passa
na fase estacionária e na fase móvel (Equação 2).
m
mR
t
ttk
Equação 2
O número de pratos (N) expressa a eficiência de uma coluna cromatográfica e é
calculado de acordo com a Equação 3.
2
16
b
R
w
tN Equação 3
Uma das formas de comparar a eficiência de colunas com diferentes comprimentos (L)
e diâmetros de partículas (dp) é através do cálculo da altura equivalente a um prato (H) e
altura reduzida do prato (h) (Equações 4 e 5).
N
LH Equação 4
dp
Hh Equação 5
A eficiência cromatográfica pode ser expressa numericamente através da determinação
do numero de pratos (N) ou da altura do prato (H). Sua relação com a velocidade linear média
(u) da fase móvel é dada através da equação de van Deemter (Equação 6).
Capítulo 2 73
Cuu
BAH
Equação 6
onde A é o termo para a difusão turbulenta (múltiplos caminhos), B é o termo para a difusão
molecular, C é o termo de transferência de massa e u é a velocidade linear média da fase
móvel.
A equação de van Deemter foi inicialmente desenvolvida para GC no qual a
transferência de massa em gases é relativamente rápida. Em LC, os termos que envolvem a
difusão na fase móvel e transferência de massa são mais pronunciados. Como consequência,
ajustes na equação de van Deemter são necessários. Vários estudos foram conduzidos e
publicados promovendo as modificações na equação de van Deemter, podem-se destacar as
equações de Giddings, Huber e Knox. (32, 54) Como resultado desses estudos, o termo C,
relacionado a transferência de massa, é melhor representado realizando a subdivisão em duas
contribuições como representado na Equação 7.
uCCu
BAH ms
dpA 2 mDB 2 Equação 7
s
fs
sD
dkfC
2
m
m
mD
dpkfC
2
O termo A é relacionado ao efeito dos múltiplos caminhos que o analito pode
percorrer através do leito cromatográfico. Conforme mostrado na Equação 7, este termo é
diretamente proporcional à qualidade do empacotamento () e ao tamanho das partículas (dp).
Este termo pode ser minimizado ao se preparar colunas com bom empacotamento e com
partículas uniformes. O termo B da equação está relacionado à difusão longitudinal do analito
na fase móvel. é uma constante relacionada ao empacotamento da coluna e Dm o coeficiente
de difusão do analito na fase móvel. Ao se utilizar vazões elevadas esse termo é minimizado.
Os termos Cs e Cm são relacionados a transferência de massa do analito na fase móvel e na
fase estacionária respectivamente sendo fs(k) e fm(k) funções complexas do fator de retenção k;
df a espessura da fase estacionária; dp o diâmetro da partícula; e Ds e Dm o coeficiente de
Capítulo 2 74
difusão do analito na fase estacionária e na fase móvel.
A Figura 2.32 ilustra o gráfico da variação de H em função da velocidade linear
média. Adicionalmente, estão representadas de forma genérica as contribuições de cada termo
no valor de H. De maneira geral, o vazão ótima para a coluna cromatográfica é obtida pela
curva deste gráfico no qual é gerado o menor H e, consequentemente, uma melhor eficiência
cromatográfica.
O fator de separação (α) expressa a separação entre dois analitos e é calculada pela
relação existente entre o fator de retenção de acordo com a Equação 8.
1
2
k
k Equação 8
A resolução (Rs) é a medida da separação entre dois compostos e é obtida através da
distancia entre os dois picos cromatográficos e suas respectivas larguras de base (Equação 9).
21
2,12
bb
R
ww
tRs
Equação 9
(N),
Figura 2.32 - Gráfico representativo da curva de van Deemter.
Capítulo 2 75
Outro modo de se avaliar a resolução é utilizando a equação mestra da resolução. Esta
equação leva em consideração diversos parâmetros tais como, o número de pratos, fator de
retenção e fator de separação, e é expressa pela Equação 10.
1
14
k
kNRs
Equação 10
A representação gráfica da contribuição de cada um desses parâmetros na resolução é
exemplificada na Figura 2.33. Pode-se observar que o fator de separação é o parâmetro que
possui maior influência na resolução cromatográfica.
Distorções frontais e caudas nos picos cromatográficos podem ser avaliados através do
fator de assimetria (As) calculado a 10% da altura do pico ou pelo fator de alargamento (TF)
geralmente calculado a 5% da altura do mesmo. As Equações 11 e 12 e a Figura 2.34
apresentam a forma esquemática do cálculo desses parâmetros.
A
BsA Equação 11
A
BA
2TF
Equação 12
Figura 2.33 – Influência do fator de retenção, fator de separação e número de pratos sobre a
resolução cromatográfica.
Fonte: Adaptado de (111).
Capítulo 2 76
Figura 2.34 - Representação esquemática da determinação do fator de assimetria e
alargamento do pico cromatográfico.
Fonte: Adaptado de (33).
2.4 Validação de metodologia
O processo de validação tem por objetivo garantir se os dados gerados no método
desenvolvido são confiáveis e se podem ser aplicados em análise de rotina. Vários artigos e
livros dedicados ao processo de validação têm sido publicados. (112-115) No Brasil a
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) através da RE n° 899 possui
recomendações para validação em métodos bioanalíticos. (116) Além disso, o Instituto
Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO) fornece guias de
validação analítico através do documento DOQ-CGCRE- 008. Essas recomendações também
podem ser encontradas em órgãos internacionais tais como a European Medicine Agency
(EMEA) e a Food and Drug Administration (FDA). (117, 118)
Os parâmetros analíticos normalmente utilizados para validação de métodos de
separação são a seletividade, linearidade, faixa de trabalho ou aplicação, precisão, exatidão,
limite de detecção, limite de quantificação, recuperação, efeito matriz, robustez e estabilidade.
A seguir, uma breve descrição dos principais parâmetros avaliados.
A linearidade é a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os
resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro
de um intervalo especificado. Os guias de validação recomendam utilizar de cinco a seis
concentrações diferentes para avaliar a linearidade do método. Após a construção da curva
analítica através do gráfico de resposta do equipamento (normalmente área) em função da
Capítulo 2 77
concentração do analito avalia-se matematicamente a correlação entre os dados obtidos
através do método de mínimos quadrados para obter uma função do primeiro grau:
Equação 13
onde y é a resposta analítica do equipamento, x é a concentração do analito, a é o coeficiente
angular e b é o coeficiente linear.
A curva analítica pode ser obtida através da padronização externa, padronização
interna ou padronização por adição de padrão.
A faixa de trabalho compreende os limites de quantificação superior e inferior de um
método analítico. Normalmente é derivado do estudo de linearidade e é estabelecido pela
confirmação de que o método apresenta exatidão, precisão e linearidade adequados.
A seletividade do método é a capacidade que o método possui de medir exatamente
um composto em presença de outros componentes tais como impurezas, produtos de
degradação e componentes da matriz.
A sensibilidade do método avalia a capacidade de discriminar concentrações próximas
de um analito. Esse termo não deve ser confundido com detectabilidade no qual avalia os
limites de detecção e quantificação. O limite de detecção (LD) é a menor quantidade do
analito detectado na amostra que pode ser diferenciada do ruído da linha de base. O LD pode
ser estabelecido como sendo três vezes o valor do ruído da linha de base. O limite de
quantificação (LQ) é a menor quantidade que pode ser determinada na amostra com precisão
e exatidão adequada e pode ser estabelecido como sendo dez vezes o valor do ruído da linha
de base (Figura 2.35).
Figura 2.35 – Relação sinal-ruído (S/R).
Capítulo 2 78
A precisão (repetibilidade) é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em
uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. A precisão pode
ser expressa em desvio padrão relativo (DPR) a partir da Equação 14.
Precisão DPR DP
Equação 14
onde DP é o desvio padrão das concentrações e é a concentração média calculada.
A precisão intra-dia, também conhecida como precisão intra-corrida, analisa a
concordância entre os resultados dentro de um curto período de tempo com o mesmo analista,
amostra e instrumentação. Já a precisão inter-dia (inter-corrida) é a concordância entre os
resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes.
A exatidão do método analítico é a proximidade dos resultados obtidos
experimentalmente em relação ao valor verdadeiro e pode ser obtida pela Equação 15.
atidão concentração e perimental - concentração teórica
concentração teórica Equação 15
De forma análoga aos ensaios de precisão, também é avaliada a exatidão intra-dia e
inter-dia.
A reprodutibilidade avalia a concordância dos resultados utilizando o mesmo método,
mesma amostra com diferentes equipamentos, analistas e laboratórios. O desvio padrão dos
ensaios de reprodutibilidade é cerca de duas vezes maior que os ensaios de repetibilidade.
Quando não há possibilidade de realizar os ensaios em condições de reprodutibilidade
interlaboratorial pode-se avaliar a reprodutibilidade intralaboratorial no qual os experimentos
são conduzidos no mesmo laboratório, equipamento e amostra, e variando analista e
temperatura da sala por exemplo. Os resultados são expressos em termos de precisão e
exatidão.
A recuperação avalia a eficiência de extração do método analítico. O método mais
comum de avaliar a recuperação é através de recuperação absoluta que é expressa em
percentagem do analito extraído de um branco fortificado em relação a uma amostra solução
que não foi submetida ao processo de extração (Equação 16). Já a recuperação relativa é a
razão da quantidade do analito extraído na matriz com a quantidade do analito extraído em
uma solução que não contenha a matriz.
Capítulo 2 79
Recuperação concentração do analito e traído
concentração da solução padrão Equação 16
A avaliação do efeito matriz tem por objetivo verificar a influência das substâncias
presentes na matriz no sinal correspondente aos analitos de interesse. O efeito matriz pode
causar alterações nos resultados analíticos tais como aumento no sinal analítico do detector
levando a superestimação do resultado ou supressão do sinal analítico levando a subestimação
do resultado (Equação 17).
feito matri área do analito fortificado após e tração da matri
área do analito em solvente Equação 17
A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a
pequenas variações dos parâmetros analíticos (extração e análise) e indica sua confiança
durante o uso do método. Durante o desenvolvimento da metodologia, deve-se considerar a
avaliação da robustez. Constatando-se a susceptibilidade do método à variações nas condições
analíticas, estas deverão ser controladas e precauções devem ser incluídas no procedimento.
A robustez pode ser avaliada de forma univariada no qual a influência dos parâmetros
é avaliada separadamente. O teste de Youden é outra maneira de avaliar a robustez do
método. Esse teste possui um projeto fatorial fracionário no qual avalia a influência de sete
variáveis em dois níveis diferentes (Tabela 2.3). (119) As letras maiúsculas representam os
valores nominais ou padrão do método desenvolvido e as letras minúsculas as variações a
serem estudadas. Assim, neste teste são realizados oito experimentos de forma aleatória com a
combinação fatorial dos parâmetros avaliados e verifica-se qual o efeito ou combinações de
efeitos que influenciam no resultado final (Tabela 2.4). Para cada experimento realizado a
resposta
Tabela 2.3 – Efeitos e variações na robustez avaliada pelo método de Youden.
Efeito Condição Nominal Variação
A/a A a
B/b B b
C/c C c
D/d D d
E/e E e
F/f F f
G/g G g
Capítulo 2 80
Tabela 2.4 - Matriz de Youden.
Efeito Combinação dos parâmetros
Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 Exp. 5 Exp. 6 Exp. 7 Exp. 8
A/a A A A A a a a a
B/b B B b b B B b b
C/c C c C c C c C c
D/d D D d d d d D D
E/e E e E e e E e E
F/f F f f F F f f F
G/g G g g G g G G g
RESULTADO s t u v w x y z
resposta obtida é representada pelas letras de s a z. Para comparar a influência da variação de
cada parâmetro, deve-se calcular a diferença da média (Di) dos valores correspondentes às
letras maiúsculas com a média dos valores referente às letras minúsculas como representado
pela Equação 18.
44DA/a Efeito a
zyxwvuts
Equação 18
44DB/b Efeito b
zyvuxwts
Para avaliar se as modificações tem influência na robustez é necessário calcular o
desvio padrão das diferenças (SDi) através da Equação 19.
Equação 19
O estudo de estabilidade visa determinar se um analito mantém-se quimicamente
inalterado numa dada matriz sob condições específicas, em determinados intervalos de tempo.
Capítulo 2 81
Assim, é fundamental avaliar a estabilidade das soluções padrões, estabilidade da amostra
após ciclos de congelamento/descongelamento, em temperatura ambiente e também nas
condições de análise.
Antes de realizar experimentos de validação ou mesmo análises de amostras, deve-se
avaliar se o sistema utilizado para a análise é capaz de fornecer dados de qualidade aceitável.
Assim, algumas recomendações sobre os parâmetros avaliados estão representados na Tabela
2.5.
Tabela 2.5 - Parâmetros cromatográficos recomendados durante a validação.
Parâmetro Recomendação
Fator de retenção (k) k > 2, o sinal referente ao analito dever estar
separado do sinal referente ao tempo morto e
possíveis interferentes.
Número de pratos (N) Em HPLC recomenda-se um valor maior que
2000 pratos na coluna analítica.
Fator de separação (α) α > 1
Fator de alargamento (TF) TF < 2
Assimetria (As10 %) As10 % < 2
Resolução cromatográfica (Rs) Rs > 1,50 para picos com intensidade similar
e com assimetria próxima de 1,00.
Rs > 2,00 para os demais casos.
Capítulo 3
Determinação de fluoxetina e norfluoxetina em
plasma humano por HPLC-UV utilizando a técnica
de SPE com sorvente C18 sintetizado com
precursores de sílica de baixo custo
Capítulo 3 85
3.1 Introdução
Como já discutido no Capítulo 2, materiais baseados em sílica podem ser obtidos por
diferentes metodologias. Neste sentido, de acordo com o método utilizado a sílica pode ser
classificada com do tipo A, no qual possui uma baixa pureza em relação a presença de metais;
sílica tipo B que possui uma pureza elevada e usa principalmente precursores alcoxissilanos; e
sílica tipo C que possuem a alta pureza da sílica tipo B, porém são polímeros híbridos.
Atualmente, há uma crescente vertente na qual sílica de alta pureza (sílica tipo B) tem sido
empregada em métodos de preparo de amostra, principalmente em SPE. Entretanto o custo
dos reagentes alcoxissilanos comparados com os precursores da sílica tipo A (silicato de
sódio) são muito elevados. Assim, dependendo da aplicação, é economicamente vantajoso
empregar suportes baseados em sílica tipo A, mesmo que seja necessária uma purificação
prévia dos reagentes. A Tabela 3.1 apresenta a comparação de preços e pureza entre os
precursores de sílica obtidos através de catálogo online da empresa Sigma-Aldrich. (120)
3.2 Fármacos antidepressivos
Fluoxetina (FLX) é uma fenoxi-fenil-propalamina que pertence à classe dos inibidores
seletivos de recaptação da serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) e tem se destacado
mundialmente no tratamento de transtornos psiquiátricos (depressão) e também de outras
síndromes, tais como a bolimia nervosa, ansiedade, distúrbios alimentares, síndrome do
pânico e desordem obsessiva-compusiva. (121)
Tabela 3.1 – Custo estimado dos precursores de sílica.
Reagente Quantidade Preço estimado (R$)a
TEOS 99,999 % 1 L 7020,00
TEOS 99,0 % 1 L 410,00
TEOS 98,0 % 1 L 297,00
TMOS 98,0 % 1 L 1630,00
Silicato de sódio em solução - grau reagente 1 L 114,00
Silicato de sódio sólido - grau reagente 1 kg 106,00
a Valor obtido no dia 12/11/2012
Capítulo 3 86
A FLX é administrada pela via oral e, posteriormente, metabolizada no fígado
formando o metabólito ativo norfluoxetina (NFLX), também conhecido como
desmetilfluoxetina, a qual é a molécula da FLX que sofreu o processo de desmetilação
(desmetilfluoxetina).
A dose utilizada de FLX para o tratamento da depressão varia de 20 - 40 mg por dia e
seus níveis terapêuticos abrangem a faixa de 50 a 300 ng mL-1
. Esses fármacos apresentam
uma eliminação lenta no organismo, pois a meia-vida da FLX é de 1 a 3 dias quando utilizada
em administração aguda e de 4 a 6 dias em usos crônicos. Já a NFLX apresenta uma meia-
vida de 9 a 16 dias tanto no uso agudo quanto no crônico. Assim, o uso crônico da FLX leva a
significante acumulação de espécies ativas. Estudos tem revelado que a administração de 40
mg por dia de FLX num período de 30 dias fornece uma concentração plasmática de FLX e
NFLX na faixa de 91 – 302 ng mL-1
e 72 – 258 ng mL-1
respectivamente.
Como característica química, a FLX apresenta um log P de 4,05, pKa de 8,7. Já a
NFLX apresenta um pKa no valor de 9,37. A Figura 3.1 apresenta a estrutura química da FLX,
NFLX e CLO (padrão interno).
Diferentes métodos analíticos estão disponíveis na literatura para análise de fluoxetina
em plasma. A maioria dos métodos utiliza a técnica de HPLC empregando a detecção por
ultravioleta (UV), arranjo de diodos (DAD), fluorescência (FLD) ou espectrometria de massas
(MS). Entre as técnicas de preparo de amostra, os trabalhos tem relatado o uso de LLE, SPE,
SPME, SBSE, LPME, in-tube SPME em diferentes modos de operação (off-line e online por
exemplo). (5, 122-131)
Figura 3.1 - Estrutura química da fluoxetina (1), norfluoxetina (2) e clomipramina (3) -
padrão interno.
O NCH3
F3C
HO NH2
F3C
N
N
CH3
CH3
1 2 3
Capítulo 3 87
3.3 Objetivos
O objetivo desta parte da tese foi sintetizar um suporte cromatográfico baseado em
sílica pelo método sil-gel empregando precursores de sílica de baixo custo (silicato de sódio).
Posteriormente, após a funcionalização com grupamento C18 monofuncional e caracterização
química, a fase extratora foi utilizada no desenvolvimento do método de extração em fase
sólida (SPE) para a análise de fluoxetina e seu metabólito, norfluoxetina, em plasma humano
utilizando o sistema HPLC-UV. Finalmente, o método foi validado e aplicado em amostras
reais de plasma. Além disso, uma comparação do desempenho da extração da fase
desenvolvida foi realizada com fases disponíveis comercialmente.
3.4 Parte experimental
3.4.1 Materiais e reagentes
Silicato de sódio em solução (28 % SiO2) (Sigma-Aldrich, Alemanha) foi utilizado
com fonte de silica. Ácido clorídrico (Fluka, Suíça), ácido fórmico (Synth, Brasil), hidróxido
de amônio (Fluka, EUA) e etanol (Tedia, EUA), todos grau reagente foram utilizados sem
purificação adicional. Acetonitrila e metanol, ambos da Tedia (EUA) e grau HPLC foram
usados no trabalho. A água ultrapura foi fornecida pelo sistema Elga Purelab Ultra
(Inglaterra). Resina de troca catiônica Amberlite IR-120 na forma H+ foi adquirida da Synth
(Brasil). A separação granulométrica foi realizada com peneiras da marca Granutest (Brasil).
Para funcionalização das partículas de sílica foram usados tolueno (Mallinckrodt, Mexico),
imidazol (Mallinckrodt, EUA), piridina (Merck, Alemanha), dimetilamina (Merck,
Alemanha) e octadecildimetilclorosilano (ODS) (Aldrich, EUA).
Os padrões analíticos de fenantreno, antraceno e criseno foram adquiridos da Supelco
(Alemanha) e os padrões de fluoxetina (FLX), norfluoxetina (NFLX) e clomipramina (CLO)
foram adquiridos da Sigma (Alemanha).
3.4.2 Síntese e caracterização das partículas C18
3.4.2.1 Preparação de partículas de sílica
Capítulo 3 88
Em um béquer de 100 mL foi adicionado 40 mL de silicato de sódio em solução (SiO2
28 %) e completado com água ultrapura para volume final de 150 mL. Essa solução foi
percolada em uma coluna cromatográfica aberta (50 cm x 2 cm) preenchida com resina de
troca catiônica Amberlite IR-120 na forma H+ com o uso da gravidade. O eluato foi recolhido
e apresentou um pH igual a 2,6. Utilizando solução de NH4OH 1,0 M, o pH da solução foi
ajustado para 4,5. A solução foi transferida para uma vasilha de plástico com tampa na qual se
iniciou a formação do polímero. Após a gelificação, o hidrogel ficou 3 dias em repouso. Após
esse período, o hidrogel foi lavado com água ultrapura e posteriormente com EtOH. O
hidrogel foi inserido na estufa com temperatura de 40ºC por 24 horas. Em seguida, a
temperatura foi aumentada gradativamente num período de 24 h até atingir a temperatura de
100°C e permaneceu nesta temperatura durante 24 h.
Após esse processo as partículas de sílica sintetizadas foram classificadas de acordo
com seu diâmetro em peneiras com aberturas de malhas específicas. As partículas com
diâmetro entre 38 e 72 µm foram recolhidas e utilizadas nos experimentos seguintes.
3.4.2.2 Funcionalização das partículas de sílica
Em um balão de duas bocas acoplado ao condensador Friedrich sob atmosfera de
nitrogênio foi adicionado 10 g da sílica com tamanho de partículas entre 38 – 72 µm em 50
mL de tolueno. Em seguida foi adicionado 1,7 g de imidazol dissolvido em 3 mL de tolueno e
posteriormente 5,4 g de ODS em 10 mL de tolueno. O sistema ficou em refluxo por 5 horas
com aquecimento por banho de óleo. As partículas de sílica funcionalizadas foram filtradas e
lavadas com 20 mL de tolueno, metanol, metanol:água (1:1) e metanol. A sílica foi seca em
estufa a temperatura de 120ºC.
3.4.2.3 Caracterização físico-química
A morfologia das partículas foi analisada por microscopia eletrônica de varredura
(MEV) (Zeiss-Leica/440) operando a 20 kV e as amostras foram recobertas com uma fina
camada de ouro. A área superficial e o diâmetro do poro foram medidos pela isoterma de
adsorção/dessorção de nitrogênio a 77K (Quantachrome Instruments) pelo método Braunaer-
Emmett-Teller (BET). Análise elementar foi realizada em um analisador CHNS-O, modelo
EA 1110 da CE Intruments. Os espectros de infravermelho (FT-IR) foram obtidos de 4000 a
Capítulo 3 89
400 cm-1
no equipamento Bomem MB-102 empregando disco de KBr para preparar as
amostras.
Espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) no estado sólido foram obtidos em
espectrômetro Bruker, modelo Avance III (400 MHz) com rotores de óxido de zircônio de 4
mm, velocidade de rotação de 5 kHz e campo magnético de 9,4 T. Analise de 29
Si RMN
foram adquiridas a 79,46 MHz empregando a técnica de polarização cruzada e rotação no
ângulo mágico (CP/MAS) com largura de pulso (/2) de 5 µs, tempo de contato de 5 ms e
intervalo entre os pulsos de 5 s. A temperatura da análise foi de 20,76°C, o número de scans
foi de 3600 e ácido 4,4-dimetil-4-silapentano-1-sulfônico (= 0 ppm) foi utilizado como
padrão externo dos deslocamentos químicos. Os espectros de RMN 13
C foram adquidos a
100,56 MHz empregando a técnica de polarização cruzada, rotação no ângulo mágico e
supressão das bandas laterais (CP/MAS/TOSS) com largura de pulso (/2) de 5 µs, tempo de
contato de 2 ms e intervalo entre os pulsos de 5 s. A temperatura da análise foi de 21,80°C, o
número de scans foi de 2048 e o adamantano (= 38.48 ppm para o sinal mais intenso) foi
utilizado como padrão externo dos deslocamentos químicos.
3.4.3 Aplicabilidade das partículas de sílica C18 labmade em extração em fase
sólida
3.4.3.1 Preparo das soluções
Soluções estoque de FLX e CLO (padrão interno) foram preparadas em metanol na
concentração de 1000 µg mL-1
e NFLX na concentração de 2 μg mL-1
as quais foram
mantidas em freezer para conservação. Essas soluções foram diluídas para soluções
intermediárias de FLX, NFLX e CLO a , μg mL-1
.
Soluções trabalho de FLX e NFLX a 5,0, 1,0 e 0,3 µg mL-1
foram preparadas a partir
das soluções intermediárias. Essas soluções foram usadas para fortificar as amostras de
plasma usadas no processo de validação.
3.4.3.2 Tratamento das amostras de plasma
As amostras de plasma humano foram centrifugadas a 11178 g por 5 minutos e
filtradas através de membrana hidrofílica de policarbonato ( ,2 μm 13 mm). Para atingir as
Capítulo 3 90
concentrações desejadas dos fármacos, alíquotas da solução trabalho de FLX, NFLX e CLO
foram transferidas para frascos do tipo eppendorf, secas sob fluxo de nitrogênio e
ressuspensas em 500 µL de plasma isento dos analitos estudados. As amostras foram
homogenizadas no ultrassom por 5 minutos e diluídas com água ultrapura para volume final
de 1 mL.
A extração da FLX, NFLX e CLO foi realizada utilizando seringas plásticas de SPE
com capacidade de 1 mL contendo 100 mg da sílica C18 sintetizada (labmade) entre os frits
de polipropileno com 20 µm de abertura da malha . Os cartuchos preparados no laboratório
foram condicionados com 3 mL de metanol e 3 mL de água ultrapura. Após esta etapa, 1 mL
da amostra diluída foi percolada pelo cartucho de extração. O clean up foi realizado com 3
mL de água e 3 mL de uma mistura H2O:ACN (80:20). Posteriormente os cartuchos foram
secos sob pressão reduzida por 3 minutos. Os analitos foram eluídos utilizando 3 mL de uma
solução de metanol contendo 0,2 % de ácido fórmico. O eluato foi evaporado a secura com
fluxo de nitrogênio e temperatura do banho à 40°C. Por fim, os analitos foram reconstituídos
em 500 µL da fase móvel, as amostras foram homogenizadas em vórtex por 20 s, transferidas
para vials e colocadas no amostrador automático do HPLC no qual 10 µL da amostra foram
injetadas no equipamento.
3.4.3.3 Método cromatográfico
O sistema de cromatografia líquida consistiu de um HPLC série Prominence 20A da
Shimadzu (Kyoto, Japão). O sistema consistiu de duas bombas LC-20AD, um amostrador
automático SIL-20A, um forno cromatográfico CTO-20A, um detector UV SPD-20A e uma
controladora CBM-20A. O software LC-Solution (Shimadzu) controlou os módulos do
sistema cromatográfico.
Os fármacos foram separados em uma coluna analítica NST C18 (2,1 mm x 150 mm x
5 µm) com vazão de 0,2 mL min-1
em modo isocrático. A fase móvel de separação foi
composta de uma mistura 50:50, v/v de ACN:H2O. A fase aquosa era composta por acetato de
amônio (10 mM) e TEA (3,6 mM) tamponados em pH 5,40 com ácido acético. A temperatura
da coluna foi mantida a 35°C e o detector foi ajustado a 226 nm.
Capítulo 3 91
3.4.3.4 Validação do método
O método para análise de FLX e NFLX em plasma humano através de SPE off-line e
HPLC-UV foi validado segundo critérios aceitos pela comunidade científica. Os parâmetros
de validação selecionados foram: especificidade, linearidade, limite de detecção e
quantificação, precisão e exatidão intra e inter-dias, recuperação absoluta, efeito matriz e
robustez do método.
A seletividade do método foi avaliada através da análise de amostra de plasma livre
dos fármacos estudados (branco) em três réplicas e observando a presença ou não de
interferentes no tempo de retenção dos fármacos.
A linearidade foi avaliada através das curvas analíticas construídas por calibração
externa e padronização interna, realizando a fortificação do plasma e submetendo as amostras
ao processo de extração e análise cromatográfica. Cinco níveis de concentração (15, 50, 100,
250 e 500 ng mL-1
) em quintuplicatas foram utilizados na construção da curva analítica
totalizando um n = 25 para cada fármaco analisado. Em todos os ensaios utilizou-se CLO na
concentração de 500 ng mL-1
como padrão interno. O coeficiente de determinação (r2) e a
equação linear de regressão (y = ax + b) foram calculados pelo método dos mínimos
quadrados. O limite de detecção (LD) foi estabelecido como sendo três vezes a amplitude do
ruído da linha de base e o limite de quantificação (LQ) como sendo no mínimo dez vezes a
amplitude do ruído da linha de base.
A precisão intra-dia foi avaliada em triplicata em três níveis diferentes 15 ng mL-1
(baixo), 100 ng mL-1
(médio) e 500 ng mL-1
(alto) em dois dias diferentes, e a precisão inter-
dia foi avaliada com os resultados dos dois dias de coleta dos dados. Os resultados destes
ensaios foram expressos em desvio padrão relativo (DPR). Analogamente ao ensaio de
precisão, foi calculada a exatidão intra e inter-dia, nos mesmos níveis e os resultados foram
apresentados em percentagem de desvio.
A recuperação foi determinada por meio de análises de amostras de plasma fortificado
com FLX e NFLX (baixo, médio e alto) em triplicata. Os valores obtidos foram expressos
como percentagem da quantidade extraída.
O efeito matriz do método foi avaliado realizando a comparação das áreas relativas
dos fármacos no extrato obtido da matriz e em solvente.
A robustez do método foi avaliada no modo univariado no qual quatro parâmetros
(vazão da fase móvel, temperatura do forno, percentagem de solvente orgânico na fase móvel
e comprimento de onda) foram verificados em dois níveis de variação.
Capítulo 3 92
3.4.3.5 Determinação do fármaco em amostras de plasma humano
A aplicabilidade do método foi demonstrada na determinação de FLX e NFLX em
amostras de plasma de pacientes sob tratamento de FLX. As amostras doadas foram mantidas
congeladas antes de sua análise.
3.5 Resultados e discussão
3.5.1 Síntese e caracterização da sílica C18
A Figura 3.2 exemplifica o esquema geral utilizado na síntese da fase extratora sílica
C18 empregando precursor de baixo custo. O silicato de sódio em solução apresenta um
grande número de átomos de sódio e também de outros metais devido sua baixa pureza. A
utilização de resina hidrogeniônica para eliminação de metais do silicato de sódio é necessária
para promover uma maior homogeneidade na superfície da sílica, além de evitar o aumento da
acidez dos silanois devido a presença de metais incorporados na rede polimérica da sílica.
Assim, foi realizada a remoção dos metais percolando a solução de silicato de sódio em uma
coluna aberta contendo resina hidrogênionica. Um ponto importante nesta etapa da síntese é o
controle do pH no experimento. A solução de silicato de sódio apresenta pH próximo de 12 e,
a medida que ocorre a troca dos átomos metálicos desta solução com o hidrogênio da resina
catiônica, há uma diminuição do pH. O processo de polimerização do ácido silícico para a
formação do hidrogel ocorre rapidamente com pH entre 5 e 7. Se durante a remoção de metais
mportante
Figura 3.2 – Esquema geral da síntese da sílica C18.
Capítulo 3 93
da solução o pH atingir essa faixa crítica, ocorre a polimerização do ácido silícico dentro da
coluna e, portanto, seu entupimento. Assim, é importante manter o pH do eluente próximo a 2
no qual a solução aquosa de ácido silícico apresenta uma maior estabilidade e, portanto,
demanda de um maior tempo para polimerização.
O eluente da coluna cromatográfica contendo o ácido silícico (Si(OH)4) apresentou pH
2,6 e esta solução foi ajustada ao pH 4,5 para promover a formação da rede polimérica da
sílica. Após a formação do hidrogel, o mesmo ficou em repouso por três dias para reforçar a
ligação dos siloxanos (SiO2) e, também, a resistência mecânica do material.
Após a secagem do material as partículas de sílica apresentaram distribuição
granulométrica na faixa de 0,5 – 110 µm. Assim, para a utilização dessas partículas com fase
extratora, foi necessário separar as partículas por faixas de diâmetro empregando peneiras
com abertura de malhas específicas. Partindo de 120 mL de silicato de sódio foi possível
sintetizar aproximadamente 25 g de sílica na faixa de 38 - 72 µm para serem utilizadas como
fase extratora em SPE (Figura 3.3). Aproximadamente 10 g da sílica passaram pela peneira
com a malha de 38 µm (Figura 3.4), entretanto não foi utilizada esta fração de material para os
demais experimentos.
Para fins comparativos, foi sintetizado partículas de sílica sem a remoção dos metais.
Assim, a solução silicato de sódio teve seu pH ajustado para 2 utilizando HCl para a formação
do ácido silícico. Posteriormente, o pH foi elevado para 4,5 com hidróxido de amônio e,
consequentemente, o hidrogel foi formado e todas as etapas seguintes foram realizadas
conforme citado anteriormente.
Figura 3.3 – MEV das partículas de sílica obtidas para SPE na faixa de 38 - 72 µm
Capítulo 3 94
Figura 3.4 – MEV das partículas de sílica obtidas abaixo de 38 µm
conforme citado anteriormente. Como resultado, as partículas obtidas não apresentaram a
mesma homogeneidade que as partículas sintetizadas através da remoção dos metais (Figura
3.5).
Pela análise de EDS da partícula de sílica podemos observar a presença de átomos de
silício e oxigênio no material (Figura 3.6). A ausência do sinal de sódio vem em concordância
com o processo de troca catiônica realizado com o precursor silicato de sódio em solução. O
preparo do suporte foi realizado 4 vezes e o material final apresentou características similares.
Assim, o método de preparo possui repetibilidade.
Após o preparo do suporte cromatográfico, as partículas foram submetidas a
funcionalização com o grupamento C18 monofuncional. Antes da reação, as partículas foram
ativadas em estufa a 120°C por 24 h para remoção de moléculas de água da superfície da
sílica para aumentar a eficiência da etapa de funcionalização.
Figura 3.5 – MEV das partículas de sílica obtidas sem a remoção dos metais.
Capítulo 3 95
Figura 3.6 – EDS das partículas de sílica obtidas para SPE na faixa de 38 - 72 µm.
Foi avaliada a funcionalização empregando três aminas diferentes (imidazol, piridina e
dietilamina) como catalisadores da reação. A quantidade de carbono adicionada quimicamente
a superfície das partículas de sílica foi mensurada através de análise elementar e os resultados
encontram-se na Tabela 3.2. Podemos observar que as partículas de sílica sem a
funcionalização apresentam quantidades de carbono em sua estrutura praticamente nula e após
a funcionalização as quantidades inseridas variaram de 19 a 24 % de carbono confirmando a
eficiência no processo de funcionalização.
Para a funcionalização de uma maior quantidade de sílica, foi utilizado como
catalisador o imidazol. Como resultado, o material obtido apresentou 22,3 % de carbono em
sua estrutura.
A fase extratora foi caracterizada por espectroscopia de infravermelho (Figura 3.7). A
banda larga e intensa na região de 1300 a 1000 cm-1
é atribuída ao estiramento assimétrico Si-
O-Si, o pico na região de 950 cm-1
ao estiramento assimétrico Si-OH e aquele em 790 cm-1
dsafds
Tabela 3.2 – Análise elementar das partículas de SPE labmade.
SPE labmade - 38-72 µm
Linha
%C %H %N
1 Sem funcionalização 0,06 2,46 -
2 C18 - imidazol 23,92 5,15 -
3 C18 - piridina 20,18 4,65 -
4 C18 - dietilamina 19,38 4,36 -
0 2 4 6 8 1 0E n e r g y ( k e V )
0
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
4 0 0 0
C o u n t s
O
S i
Capítulo 3 96
Figura 3.7 - Espectro de infravermelho da sílica pura e sílica C18. Bandas: (1) O-H, (2) C-H,
(3) O-H, (4) Si-O-Si, (5) Si-OH, (6) Si-O e (7) Si-O.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 50040
50
60
70
80
90
7
% T
ran
smit
ân
cia
Número de onda (cm-1)
Silica C18
Silica
1
23
4
5 6
e 470 cm-1
ao estiramento simétrico Si-O. A banda larga na região 3500 cm-1
, é atribuída aos
estiramentos do grupo silanol. Observa-se também em torno de 1644 cm-1
a deformação O-H.
Após a reação de funcionalização com ODS, podemos observar o aparecimento de banda na
região de 2940 cm-1
referente aos estiramentos de carbono alifático (C-H). Adicionalmente, a
formação da ligação química entre os grupos silanol e ODS promoveu uma redução da banda
atribuída ao estiramento O-H.
A espectroscopia de RMN assim como o FT-IR é uma ferramenta utilizada para
verificar a estrutura da sílica e os grupos presentes na fase estacionária. A investigação por
esta técnica auxilia na caracterização das espécies presentes na sílica, visto que, por
infravermelho essa diferenciação é dificultosa. A sílica pura apresenta-se em unidades
tetraédricas unidas por grupos siloxano (Q4) e sua superfície pode apresenta silanois geminais
(Q2), que são dois grupos OH ligados em um átomo de silício, e também silanois isolados e
vicinais (Q3) que são um grupo OH ligado em um átomo de silício (Figura 3.8).
No espectro de RMN/CP/MAS 29
Si da sílica antes do processo de funcionalização
(Figura 3.9A) podemos observar que o sinal em -111,99 ppm é atribuído a espécie Q4,
característica para todo material baseado em sílica. O sinal em -103,09 ppm e 93,59 são
referentes a espécie Q3 e Q
2, respectivamente. A Figura 3.9B representa o espectro de
29Si
após a funcionalização da sílica com ODS. Podemos observar a presença das espécies Q2, Q
3
ddsf
Capítulo 3 97
Figura 3.8 – Nomenclatura das espécies de sílica. Silício ligado ao carbono (M); silanol
geminal (Q2); silanol isolado (Q
3) e siloxano (Q
4).
Si
Si
OH
OH
O Si
CH3
CH3
CH2 RSi
OH
OHSiO
O
O
O
M Q2 Q4Q3
Figura 3.9 – Espectro de 29
Si RMN/CP/MAS da sílica sintetizada antes da funcionalização
(A) e após a funcionalização (B).
SPE 1.esp
40 20 0 -20 -40 -60 -80 -100 -120 -140 -160
Chemical Shift (ppm)
-11
1.9
9
-10
3.0
9
-93
.59
SPE 2.esp
40 20 0 -20 -40 -60 -80 -100 -120 -140 -160
Chemical Shift (ppm)
-11
2.1
9
-10
3.0
9
-93
.39
12
.13
M
Q2
Q4
Q3
Q2Q4
Deslocamento químico (ppm)
Deslocamento químico (ppm)
A)
B)
Q3
Capítulo 3 98
e Q4 e também o surgimento de um sinal em 12,13 ppm, atribuído ao átomo de silício ligado
ao grupamento C18 monofuncional (M).
O espectro de 13
C RMN/CP/MAS/TOSS foi utilizado para confirmar a estrutura
química da sílica C18 monofuncional (Figural 3.10). O carbono C ’ apresenta deslocamento
químico no campo alto do espectro (0,00 ppm) devido a blindagem contra o campo
magnético. Os sinais em 18,50 e 23,99 ppm são atribuídos aos carbonos C1 e C2/C17
respectivamente. O carbonos C3 e C16 aparecem em campo mais baixo do espectro, com sinais
em 34,68 ppm e 32,95 ppm. O sinal mais intenso em 30,92 ppm é referente aos carbonos
centrais (C4-15) ao longo da cadeia octadecil. Esse deslocamento químico dos carbonos
centrais indica que a cadeia carbônica encontra-se na posição desordenada, na qual ocorre
uma rápida troca desses carbonos entre as conformações trans e gauche. (132) Quando a
cadeia carbônica possui a conformação trans predominante, um deslocamento químico em
torno de 33 ppm é esperado para os carbonos centrais. Contudo, quando os carbonos estão em
conformação desordenada ocorre uma mudança na blindagem eletrônica dos átomos de
químico
Figura 3.10 – Espectro de 13
C RMN/CP/MAS/TOSS da sílica C18 sintetizada.
SPE 3.esp
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 -5 -10 -15 -20
Chemical Shift (ppm)
0.0
0
18
.50
23
.99
30
.92
32
.95
34
.68
SiO
CH3
CH3
CH2 CH2 CH2 (CH2)12 CH2 CH2 CH3
C3
C16
C2 C17
C1C1'
C1' C2C1 C3
C4-15 C16C17
C4-15
C18
Deslocamento químico (ppm)
Capítulo 3 99
carbono e um deslocamento químico de 2 – 3 ppm é esperado para a região de campo alto do
espectro (aproximadamente 30,5 ppm).
3.5.2 Avaliação da fase extratora
A avaliação da extração da fase C18 sintetizada foi realizada com hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos (HPAs ou PAHs, sigla em inglês (polycyclic aromatic hydrocarbon))
para avaliar a capacidade de extração de compostos não polares. Os PAHs são compostos
orgânicos semivoláteis formados em processos de combustão a alta temperatura. (133) O
processo de queima incompleta de materiais orgânicos, que contém cadeias carbônicas em sua
estrutura, é a principal fonte de emissão de PAHs. As principais fontes são a queima de
combustível fóssil em processos industriais, motores de automóveis, sistemas de aquecimento
domésticos (com carvão mineral ou gás butano), incineração de resíduos domésticos e
industriais, fumaça de cigarros e refinarias de petróleo. Ainda várias fontes naturais, incluindo
a queima de biomassa em florestas e erupções vulcânicas são consideradas emissoras de
PAHs.
Os PAHs constituem uma família de compostos caracterizada por possuírem dois ou
mais anéis aromáticos condensados, e tem recebido muita atenção nos últimos anos devido ao
fato de que muitos compostos desse grupo são potentes carcinógenos. A Figural 3.11
apresenta a estrutura dos três PAHs empregados no processo de extração.
Para o processo de extração, 100 mg da fase extratora foi inserida no cartucho de
extração. Posteriormente, a fase foi condicionada com metanol (3 mL) e água ultrapura (3
mL). Em seguida, 10 mL de água ultrapura fortificada com PAHs (50 ng mL-1
) foram
percoladas pelo cartucho e, posteriormente, os analitos foram eluidos com 2 mL da
acetonitrila. Após a evaporação com fluxo de nitrogênio em banho de gelo para minimizar a
analitos
Figura 3.11 – Estrutura química dos PAHs. (1) fenantreno, (2) antraceno e (3) criseno.
1 2 3
Capítulo 3 100
perda dos PAHs, os analitos foram reconstituídos em 1 mL da fase móvel (ACN:H2O, 65:35,
v/v) e um volume de 10 µL foi injetado no HPLC 20A da Shimadzu. Assim, o processo de
extração forneceu um fator de concentração de 10 vezes para os analitos. A coluna
cromatográfica utilizada foi a uma NST C18 (150 mm x 2,1 mm, 5 µm) com vazão de 0,2 mL
min-1
com eluição isocrática. O forno cromatográfico operou a 30°C e o comprimento de onda
monitorado foi o 254 nm.
Para efeito comparativo, os padrões de PAHs na concentração de 500 ng mL-1
foram
analisados no sistema cromatográfico. A Figura 3.12 apresenta os cromatogramas da injeção
do padrão dos PAHs com a amostra de água fortificada. O experimento foi realizado em
triplicata e a comparação entre as áreas dos dois cromatogramas mostra que a recuperação dos
PAHs variou entre 71 e 85 %.
3.5.3 Aplicação das partículas labmade na análise de antidepressivo
3.5.3.1 Desenvolvimento do método de análise
Fase extratora baseada em sílica C18 é interessante para a extração de compostos
secundárias
Figura 3.12 – Perfil cromatográfico da separação dos PAHs em solvente (vermelho) e após a
extração em água (preto). Ordem de eluição: fenantreno (1), antraceno (2) e criseno (3).
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
0
2
4
6
8
10
Ab
sorb
ân
cia
(m
V)
Tempo (min)
Água fortificada
Padrão
1
2
3
Capítulo 3 101
apolares em matriz polar, tais como o plasma. Adicionalmente, além da interação hidrofóbica
com o C18, a presença de silanois residuais na superfície da sílica favorece interações
secundárias de característica iônica. Assim, compostos contendo grupamento amino podem
interagir com os silanois através de ligações de hidrogênio. Desta forma, os analitos podem
ter sua retenção no cartucho de extração aumentada e, consequentemente, melhores resultados
de recuperação.
Inicialmente, a etapa de extração foi avaliada utilizando água fortificada com FLX,
NFLX e CLO na concentração de 1,0 mg L-1
. Após o condicionamento do cartucho de
extração contendo 100 mg da fase extratora labmade, 1 mL da solução fortificada foi aplicada
e, em seguida os analitos foram eluídos com 3 mL de metanol puro ou metanol contendo 0,2
% de ácido fórmico. O eluato foi evaporado com fluxo de nitrogênio a temperatura de 40°C e
redissolvido em 1 mL da fase móvel (mistura 50:50 de ACN:acetato de amônio (10 mM) +
TEA (3,6 mM) tamponados em pH 5,4 com ácido acético). Uma alíquota de 10 µL foi
injetada no sistema cromatográfico contendo coluna em fase reversa e monitoramento do
comprimento de onda de 226 nm. A Figura 3.13 apresenta o cromatograma da separação dos
fármacos e pode-se perceber que os picos estão bem resolvidos e simétricos. O fator de
retenção dos fármacos obtidos foi adequado (entre 2,8 e 7,5). Assim, o primeiro composto
(NFLX) não eluiu próximo ao tempo morto e o último composto não ficou muito retido na
coluna provocando longo tempo de análise.
Figura 3.13 – Cromatograma da separação cromatográfica da norfluoxetina (1), fluoxetina (2)
e clomipramina (3) na concentração de 1 µg mL-1
.
0 3 6 9 12 15-5
0
5
10
15
Ab
sorb
ân
cia
(m
V)
Tempo (min)
1
2 3
Capítulo 3 102
A recuperação dos fármacos foi abaixo de 50 % quando se utilizou metanol puro na
etapa de eluição do cartucho de extração. Desta forma, metanol acidificado com ácido
fórmico (0,2 %) foi necessário para promover a diminuição das interações iônicas
secundárias, pois sob condições ácidas, os silanois não se apresentam ionizados facilitando a
remoção dos analitos da fase extratora.
Após a otimização do método de separação, o método de extração foi avaliado
utilizando a matriz plasma fortificada com os fármacos. A influência dos interferentes,
principalmente as proteínas, foi minimizada por meio da diluição da amostra de plasma em
água (50 %). Adicionalmente, a etapa da diluição favoreceu a interação dos fármacos de
interesse (FLX, NFLX e CLO) com a fase extratora C18. Além disso, houve uma redução da
viscosidade da matriz, facilitando a percolação da amostra através do cartucho de extração.
O cromatograma da extração da amostra de plasma apresentou um grande número de
interferentes e, portanto, o desenvolvimento da etapa de clean up se fez necessário. Foram
avaliados metanol:água e acetonitrila:água nas proporções de 10:90, 20:80 e 30:70, v/v como
solventes de lavagem do cartucho. A melhor condição encontrada para conciliar a remoção
dos interferentes sem comprometer a eficiência da extração foi empregando metanol:água na
proporção 20:80, v/v. A Figura 3.14 apresenta o cromatograma referente a extração do branco
de plasma fortificado com os fármacos de interesse. Durante os experimento foi verificado
que a seringa de extração poderia ser utilizada no máximo duas vezes sem comprometer o
processo de extração.
Figura 3.14 – Cromatograma da separação cromatográfica de amostras de plasma com 250
ng mL-1
de norfluoxetina (1) e fluoxetina (2) utilizando a clomipramina (3) como padrão
interno (500 ng mL-1
).
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Ab
sorb
ânci
a (m
V)
Tempo (min)
1
2
3
Capítulo 3 103
3.5.3.2 Validação do método
Após o desenvolvimento da extração por SPE off-line seguida de análise por HPLC-
UV, o método foi validado. A seletividade do método foi avaliada através da análise de
amostras de plasma humano isento dos fármacos estudados. Foi avaliada a presença de
interferentes eluindo no mesmo tempo de retenção da FLX, NFLX ou CLO. A Figura 3.15
apresenta a extração do branco do plasma. Pode-se observar a ausência de interferentes no
tempo de retenção da CLO, contudo, no tempo de retenção da FLX e NFLX houve um
pequeno sinal analítico da matriz. Entretanto, os valores em área desses interferentes são
inferiores a 10 % da área dos fármacos no nível baixo (LQ) e não apresentaram variação entre
diferentes extrações. Assim, a presença desses compostos não influenciou no processo de
validação do método desenvolvido. A linearidade e a faixa de trabalho na análise da FLX e
ldkfjlds
Figura 3.15 – Cromatograma do branco do plasma extraído.
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0
1
2
3
4
Ab
sorb
ân
cia
(m
V)
Tempo (min)
Tabela 3.3 - Dados da curva analítica.
Fármaco
Faixa
linear
(ng mL-1
)
Dados da
equação (a, b)
Coeficiente de
determinação
(r2)
LD
(ng mL-1
)
LQ
(ng mL-1
)
FLX 15 - 500 1,01 x 10
-3
8,79 x 10-3
0,98937 4,3 15
NFLX 15 - 500 1,63 x 10
-3
0,0222 0,98861 4,2 15
Capítulo 3 104
NFLX foi avaliada de 15 a 500 ng mL-1
(Tabela 3.3). Os coeficientes de determinação (r2)
foram maiores que 0,98 para FLX e NFLX, demonstrando haver uma correlação entre
concentração e resposta obtida (Figuras 3.16 e 3.17). Adicionalmente, a linearidade foi
avaliada pela análise do gráfico de resíduos no qual podemos observar que o modelo segue
uma distribuição normal. O LQ foi estabelecido como sendo 15 ng mL-1
com DPR abaixo de
20,0%. O LD para a FLX e NFLX foram estabelecidos como a concentração de 4,3 ng mL-1
e
4,2 ng mL-1
, respectivamente.
Figura 3.16 - Curva analítica e gráfico de resíduos obtidos na análise de FLX em plasma.
0 100 200 300 400 5000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Áre
a r
ela
tiv
a
Concentração (ng mL-1)
0 100 200 300 400 500-0.04
-0.02
0.00
0.02
0.04
0.06
Resí
du
os
Concetração (ng mL-1)
Capítulo 3 105
Figura 3.17 - Curva analítica e gráfico de resíduos obtido na análise de NFLX em plasma.
Os estudos de precisão e exatidão intra e inter-dia foram realizados nos níveis baixo,
médio e alto da curva analítica. Os resultados destes ensaios estão representados na Tabela 3.4
e 3.5. Foi considerado como limite máximo o valor de 15 % para os experimentos de precisão
e exatidão, exceto para o limite inferior de quantificação (15 ng mL-1
), o qual se admitiu um
valor de até 20%. Analisando esses resultados podemos concluir que o método desenvolvido
apresentou precisão e exatidão adequada.
0 100 200 300 400 5000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Áre
a r
ela
tiv
a
Concentração (ng mL-1)
0 100 200 300 400 500
-0.06
-0.03
0.00
0.03
0.06
0.09
0.12
Resí
du
os
Concentração (ng L-1)
Capítulo 3 106
Tabela 3.4 - Precisões obtidas para o método desenvolvido (n = 3).
Fármacos Níveis
Precisão
intra-dia 1
(DPR %)
Precisão
intra-dia 2
(DPR %)
Precisão
inter-dia
(DPR %)
FLX
Baixo
Médio
Alto
7,85
7,12
8,73
15,05
10,81
7,60
10,75
9,84
10,53
NFLX
Baixo
Médio
Alto
5,12
10,52
11,57
10,47
12,11
10,24
7,60
13,38
10,57
Baixo = 15 ng mL-1
, Médio = 100 ng mL-1
, Alto = 500 ng mL-1
Tabela 3.5 - Exatidões obtidas para o método desenvolvido (n = 3).
Fármacos Níveis
Exatidão
intra-dia 1
(%)
Exatidão
intra-dia 2
(%)
Exatidão
inter-dia
(%)
FLX
Baixo
Médio
Alto
16,83
13,15
13,21
12,99
8,50
1,61
14,91
10,82
7,43
NFLX
Baixo
Médio
Alto
10,45
5,49
4,26
15,06
12,63
3,47
12,75
9,07
3,86
Baixo = 15 ng mL-1
, Médio = 100 ng mL-1
, Alto = 500 ng mL-1
A recuperação do método foi calculada por meio da razão das áreas relativas dos
fármacos que foram fortificados antes do processo de extração e dos padrões fortificados após
a extração de amostras branco. Os resultados deste experimento encontram-se na Tabela 3.6;
os valores de recuperação ficaram entre 86,78 e 105,82 %, sendo considerado um nível
aceitável entre 70 e 120 %.
O efeito matriz se mostra mais evidente quando se utiliza espectrômetros de massas
para a detecção dos analitos de interesse. Entretanto, é importante avaliar este parâmetro
quando se utiliza outros sistemas de detecção como, por exemplo, o UV-vis. Assim, o efeito
matriz foi avaliado realizando a comparação da área relativa dos analitos na presença e na
Capítulo 3 107
ausência da matriz (Tabela 3.6). Os valores obtidos ficaram próximos de 100 % e, portanto, o
método não apresentou efeito matriz significativo. Desta forma, a curva analítica para este
método poderia ser construída em água.
A robustez do método foi avaliada de forma univariada, ou seja, um parâmetro de cada
vez foi avaliado. A Tabela 3.7 apresenta o resultado da variação de cinco parâmetros (vazão
da fase móvel, temperatura do forno, percentagem de solvente orgânico na fase móvel e
comprimento de onda do detector UV). Os experimentos foram conduzidos no nível médio de
fortificação (100 ng mL-1
),
Tabela 3.6 – Recuperação e efeito matriz para o método desenvolvido (n = 3).
Fármacos Níveis Recuperação
(%)
Efeito matriz
(%)
FLX
Baixo
Médio
Alto
92,84
105,82
101,55
3,98
4,47
1,67
NFLX
Baixo
Médio
Alto
86,78
90,91
92,69
5,19
7,83
4,33
CLO (PI) - 94,53 1,69
Baixo = 15 ng mL-1
, Médio = 100 ng mL-1
, Alto = 500 ng mL-1
Tabela 3.7 - Resultados da avaliação da robustez (n = 3).
Parâmetro avaliado Nível da
variação Variação
Exatidão (%)
FLX NFLX
Vazão da fase móvel
-
0
+
0,18 mL min-1
0,20 mL min-1
0,22 mL min-1
3,15
1,79
1,45
6,84
2,30
4,78
Temperatura do forno
-
0 +
33°C
35°C 37°C
3,56
1,79 2,58
4,82
2,30 3,38
Proporção fase móvel
(ACN:H2O tamponada)
-
0
+
47:53
50:50
53:47
3,51
1,79
12,75
2,98
2,30
7,32
Comprimento de onda
-
0
+
224 nm
226 nm
228 nm
12,54
1,79
9,65
10,78
2,30
11,48
Capítulo 3 108
fortificação (100 ng mL-1
),sendo a variação de cada parâmetro realizada em um nível abaixo e
um acima do estabelecido no método desenvolvido. Os resultados foram expressos em
percentagem de desvio do valor real (exatidão) e podemos observar que a variação nos
parâmetros avaliados não alteraram os valores de concentração da FLX e NFLX de forma
significativa.
3.5.3.3 Determinação do fármaco em amostras de plasma humano
Após a validação do método, sua aplicabilidade foi demonstrada pelo monitoramento
em nível plasmático de FLX e seu metabólito, NFLX, de pacientes sob tratamento com este
medicamento (20 mg/dia). A Tabela 3.8 apresenta os resultados da análise de seis amostras de
plasma. A Figura 3.18 mostra a comparação dos cromatogramas da amostra número 6 com o
plasma fortificado (250 µg L-1
de FLX e NFLX). As concentrações de FLX e NFLX
encontradas neste trabalho estão em concordância com outros trabalhos relatados na literatura
científica. (5, 131, 134, 135)
3.5.3.3 Estudo comparativo com fases comerciais baseadas em sílica
O desempenho do processo de extração empregando as partículas de sílica C18
labmade foi comparado com duas fases extratoras comerciais baseadas em sílica C18. A
primeira é um sorvente da empresa Alltech o qual possui endcapping e 6 % de carbono na sua
estrutura. O segundo sorvente avaliado foi o Strata C18 da Phenomenex que possui 18 % de
Tabela 3.8 – Concentração de fluoxetina e norfluoxetina em plasma de pacientes sobre
tratamento.
Amostra FLX (ng mL-1
) NFLX (ng mL-1
)
1 48,18 69,47
2 109,36 81,56
3 46,81 48,01
4 61,31 64,15
5 215,51 167,94
6 129,66 181,97
Capítulo 3 109
Figura 3.18 - Cromatograma do plasma fortificado com 250 µg L-1
de FLX e NFLX e
amostra real com FLX (129,66 ng mL-1
) e NFLX (181,97 ng mL-1
) contendo 500 ng mL-1
de
CLO.
4 6 8 10 12 14 16
0
1
2
3
4
5A
bso
rbân
cia
(mV
)
Tempo (min)
Amostra real
Plasma fortificado
1
2
3
carbono na sua estrutura. As características dos três sorventes avaliados encontram-se na
Tabela 3.9.
As extrações utilizadas para comparação foram feitas em plasma fortificado. A mesma
quantidade de sorvente (100 mg) foi empacotada em tubos de polipropileno e a extração e
análise cromatográfica dos fármacos ocorreu conforme procedimento desenvolvido e
validado. A Tabela 3.10 apresenta os valores de recuperações obtidas com as três fases
extratoras em triplicata. Podemos observar que a fase extratora labmade apresentou valores de
recuperação entre 86,78 e 105,86 %. O intervalo das recuperações obtidas com a fase da
Alltech, quando comparados com a fase labmade, foi maior uma vez que os valores variaram
dfds.
Tabela 3.9 – Característica dos sorventes avaliados.
Sorvente Suporte Carbono
(%) Endcapping
Tamanho
da partícula
(µm)
Área
superficial
(m2 g
-1)
Diâmetro
do poro
(nm)
Labmade C18 Sílica 22 Não 38 - 72 607 4,6
Alltech C18 Sílica 6 Sim 50*
518 6
Strata C18 Sílica 18 Não 55*
500 7
* tamanho médio das partículas.
Capítulo 3 110
Tabela 3.10 – Comparativo de recuperação utilizando a fase extratora desenvolvida no
trabalho e duas comerciais (n = 3).
Fármacos Níveis Recuperação
labmade C18 (%)
Recuperação
Alltech C18 (%)
Recuperação
Strata C18 (%)
FLX
Baixo
Médio
Alto
92,84
105,82
101,55
125,26
85,65
119,06
83,60
89,91
86,28
NFLX
Baixo
Médio
Alto
86,78
90,91
92,69
116,30
75,02
110,98
89,67
76,99
79,28
CLO (PI) - 94,53 96,47 87,12
Baixo = 15 ng mL-1
, Médio = 100 ng mL-1
, Alto = 500 ng mL-1
entre 75,02 e 125,26 %. Já a fase Strata C18, a qual possui percentual de carbono próxima ao
do sorvente desenvolvido, apresentou um percentual de recuperação inferior (76,99 – 89,91
%).
A Figura 3.19 ilustra a comparação das extrações com as três fases extratoras. Os
picos cromatográficos 1, 2 e 3 representam FLX, NFLX e CLO respectivamente. Podemos
observar.
Figura 3.19 – Comparação da extração de plasma fortificado com diferentes sorventes.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
0
1
2
3
4
5
Ab
sorb
ân
cia
(m
V)
Tempo (min)
Labmade C18
Strata C18
Alltech C18
1
2
3
Capítulo 3 111
observar que nas mesmas condições de extração, o cromatograma referente ao processo de
extração com a fase desenvolvida no laboratório apresentou menos interferentes.
3.6 Conclusão
Suporte cromatográfico baseado em sílica foi obtido utilizando precursores de baixo
custo em conjunto com a reação sil-gel. A purificação com resina catiônica promoveu a
redução de possíveis contaminantes metálicos presentes no precursor silicato de sódio.
Após a funcionalização com grupamento C18, e caracterização físico-química, o
sorvente apresentou bons resultados na extração dos fármacos fluoxetina e norfluoxetina.
A comparação do sorvente desenvolvido com sorventes disponíveis comercialmente
demonstrou resultados similares em termo de recuperação. Entretanto, a extração realizada
com a fase desenvolvida apresentou menor intensidade de picos atribuídos a interferentes.
O método desenvolvido para análise dos fármacos em plasma utilizando preparo de
amostra por SPE off-line com o sorvente sintetizado seguida da análise cromatográfica por
HPLC-UV apresentou resultados adequados para os parâmetros validados.
O método analítico foi aplicado com sucesso em amostras de plasma de pacientes sob
tratamento com fluoxetina.
Capítulo 4
Emprego de MISPE-HPLC-UV na determinação
online de anti-inflamatórios não esteroidais em urina
humana
Capítulo 4 115
4.1 Introdução
4.1.1 Polímero molecularmente impresso
A alta seletividade do reconhecimento biomolecular das interações antígeno-anticorpo,
fármaco-receptor e enzima-substrato, levaram os pesquisadores a desenvolverem linhas de
pesquisa voltadas para o preparo de materiais que atuam como receptores sintéticos com
seletividade para o composto de interesse. Linus Pauling foi um dos grandes pesquisadores a
contribuir com estudos nesta área. (136, 137)
O primeiro trabalho relacionado com a síntese do MIP foi publicado por Polyakov em
1931 relacionando uma mudança na porosidade da sílica gel com a presença de benzeno,
tolueno e xileno como aditivos sintéticos. (138) Já em 1949 Dickey publicou a extração
seletiva do alaranjado de metila, etila, propila e butila usando matriz polimérica de sílica.
(139) De 1930 até 1972 cerca de 40 publicações foram realizadas abordando a impressão
molecular. (140) Entretanto, foi em 1972 com as pesquisas realizadas por Sarhan e Wulff e
também por Takagishi e Klotz que a técnica ganhou destaque. (141, 142) Diferentemente dos
trabalhos anteriores, nos quais a impressão ocorria com precursores inorgânicos, os polímeros
sintetizados nestes dois grupos usaram precursores orgânicos. Contudo, a técnica ganhou
visibilidade e popularidade como material para uso em preparo de amostra após os trabalhos
publicados por Vlatakis e Morbach (143) em 1993 e Sellergren (144) em 1994. O primeiro
demonstrou a aplicabilidade na extração da teofilina e diazepam em soro fortificado, com
resultados comparáveis a técnica de imunoensaio. Já o segundo reportou o uso de
pentamidina-MIP como fase extratora em SPE para a extração e pré-concentração dos analitos
em amostras de urina seguida da dessorção online para o detector de UV. A partir destas
pesquisas, o número de publicações relacionadas com a impressão molecular vem crescendo
ao longo dos anos (Figura 4.1), e a técnica tem se tornando atrativa devido a geração de sítios
de reconhecimento seletivo nos quais uma molécula alvo pode ser facilmente moldada na rede
polimérica durante a síntese.
Podemos também analisar a distribuição das publicações relacionadas com MIP entre
os países onde o pesquisador possui vínculo (Figura 4.2). Em primeiro lugar temos a China
que representa 27 % das publicações nesta área, seguida pelos EUA (15 %) e Japão (10 %) O
Brasil ocupa a 20ª posição com 52 publicações que representa apenas 1 % do total das
publicações nesta área.
Capítulo 4 116
Figura 4.1 - Número de publicações relacionadas com MIP a partir de 1980.
Fonte: Web of Science. Dia da pesquisa: 19/10/2012 às 11 h. Busca por tópicos utilizando
molecular*, imprint* e polymer* como palavras-chave.
Figura 4.2 - Distribuição das publicações relacionadas com MIP.
Fonte: Web of Science. Dia da pesquisa: 19/10/2012 às 11 h. Busca por tópicos utilizando
molecular*, imprint* e polymer* como palavras-chave.
China
27%
EUA
15%
Japão
10% Suécia
6%
Alemanha
6%
Inglaterra
6%
Espanha
6%
França
3%
Itália
3%
Índia
2%
Brasil
1%
Outros países
15%
Capítulo 4 117
Na preparação dos MIPs duas estratégias de síntese podem ser empregadas para gerar
interação dos grupos funcionais com as moléculas do template. A primeira envolve a
formação de ligações covalentes reversíveis entre os monômeros do polímero e o template
(Figura 4.3). Essa abordagem tem uma maior seletividade, pois diminui o número de sítios
não seletivos nos materiais poliméricos. Contudo, para a remoção do template do MIP é
necessário uma clivagem das ligações covalentes. Neste tipo de material, a aplicação se torna
restrita, já que não há muitos monômeros funcionais que podem ser utilizados nas sínteses.
(145) Neste método, o template pode ser impresso através de ligações covalentes reversíveis
com derivados de ácido borônico formando ésteres de ácido borônico (Figura 4.4A), ligações
com aldeídos formando bases de Schiff (Figura 4.4B), ou ligações de álcool com
cetonas/aldeídos formando cetais/acetais (Figura 4.4C). (141, 146-148)
Figura 4.3 - Representação das estratégias de impressão covalente e não- covalente.
Fonte: Adaptado de (149).
Figura 4.4 – Representação de sítios seletivos de MIP baseado em ligação covalente
reversível com derivado do ácido borônico (A), aldeídos (B) e alcoóis (C).
B
OH
OH
OH
O
OH
OH
A B C
Fonte: Adaptado de (141, 147, 148).
Capítulo 4 118
A segunda estratégia de preparo envolve as interações não-covalentes entre os
monômeros e o template. Essas interações podem ser do tipo iônica, hidrofóbica ou ligações
de hidrogênio. Este método de preparo do MIP tem sido o mais utilizado devido a
incorporação e a remoção do template do polímero não envolver a formação e quebra de
ligação química, além de haver uma grande variedade de monômeros funcionais que podem
ser utilizados como sítios seletivos na interação com as moléculas de interesse. Entretanto,
esse método possui menor seletividade, pois ocorre um equilíbrio durante a interação do
monômero com o template no processo de síntese. Assim, é necessário utilizar um excesso de
monômero para garantir a formação do complexo e este fator leva a formação de sítios não
seletivos no MIP causado pela presença de monômeros funcionais livres. (145)
No método de impressão com interações não-covalentes, as matrizes poliméricas
podem ser classificadas em orgânicas, inorgânicas ou híbridas. Grande parte dos trabalhos
relacionados com MIP utilizam matrizes orgânicas. Nesta rota sintética, normalmente são
utilizados monômeros ácidos (ácido acrílico, ácido metacrílico e ácido p-vinilbenzóico) ou
monômeros básicos (vinilpiridina, vinilmidazol e acrilamida) para interagir com a molécula
do template, monômeros de agentes de ligação cruzada (etilenoglicol dimetacrilato, p-
divinilbenzeno, n,n-metileno bisacrilamida) para dar rigidez a estrutura do polímero, um
solvente (ACN, THF, tolueno, clorofórmio) para dissolver o template e os precursores do
polímero, e também um iniciador radicalar de polimeri ação (2,2’-azobisisobutironitrila
(AIBN)) que é ativado por radiação UV ou aquecimento (Figura 4.5). (45, 145)
A propriedade de reconhecimento molecular do MIP é diretamente influenciada pelo
solvente utilizado no processo sintético. Assim, para o bom desempenho do MIP, é necessário
utilizar solventes similares ao empregado na síntese. Portanto, MIPs preparados em meio não
aquoso podem possuir reconhecimento molecular fraco quando aplicado em matrizes aquosas
como, por exemplo, amostras ambientais ou fluídos biológicos. (150)
Uma alternativa para esta problemática é a utilização da tecnologia sol-gel na
preparação do MIP. (151, 152) Neste processo, os materiais sol-gel molecularmente
impressos (molecular imprinted sol-gel materials, MISGMs) incorporam a molécula do
template na estrutura rígida inorgânica ou híbrida (inorgânica-orgânica) do polímero. Os
materiais inorgânicos normalmente são baseados em sílica, zircônia, titânia ou alumina. (153)
Os precursores mais utilizados nesse processo sol-gel são baseados em sílica, utilizando como
material de partida alcóxidos de silício como, por exemplo, o tetrametilortosilicato (TMOS)
ou tetraetilortosilicato (TEOS). No preparo do MIP, a primeira etapa é a hidrólise do
precursor
Capítulo 4 119
Figura 4.5 – Reagentes tipicamente usados na síntese dos MIPs baseados por interações não-
covalente utilizando precursores orgânicos.
O
OH
O
OH
Ácido acrílico Ácido metacrílico
Monômero funcional
O
O
Ácido p-vinilbenzóico
N
N
4-vinilpiridina 2-vinilpiridina
NNH
4-vinilimidazol
O
NH2
Acrilamida
Agente de ligação cruzada
OO
O
O
NH NH
O O
Etilenoglicol dimetacrilato p-divinilbenzeno n,n- metileno bisacrilamida
Iniciador radicalar
N N
N
N
O
OO
O
2,2'-azobisisobutironitrila Peróxido de benzoíla
N N
N
N
Azobisdimetilvaleronitrila
precursor levando a formação de moléculas com grupos silanois. Em seguida, inicia a reação
de condensação dos grupos silanois e a formação da rede polimérica de sílica. A reação de
hidrólise é catalisada por ácido ou base, e a reação de condensação ocorre simultaneamente
com a hidrólise (Figura 4.6). (154)
Nos polímeros híbridos, o material é formado por uma estrutura orgânica-inorgânica.
as propriedades estruturais dos polímeros podem ser usadas para distinguir e classificar os
mate
Capítulo 4 120
Figura 4.6 – Representação esquemática da síntese do MIP pelo processo sol-gel.
Fonte: Adaptado de (155).
materiais híbridos. Quando a estrutura final da rede inorgânica é modificada com um grupo
orgânico sem fornecer grupos funcionais capazes de sofrer reações químicas adicionais, o
precursor é classificado como modificador de rede polimérica (Figura 4.7A). Entretanto, se
um grupo funcional reativo é incorporado na rede polimérica, o precursor se torna
funcionalizador de rede (Figura 4.7C). A situação é diferente quando grupos orgânicos são
ancorados na rede polimérica (precursor construtor de rede). Neste caso, a parte orgânica
integra e se torna parte da rede híbrida do material (Figura 4.7B). (77)
No preparo de materiais híbridos pode ser utilizada a rota sol-gel no qual precursor
trialcoxissilano contendo o grupamento orgânico é incorporado na rede polimérica. Os
principais precursores neste processo estão representados na Figura 4.8. Outra estratégia
também utilizada no preparo de materiais híbridos é a combinação de monômeros orgânicos
com os precursores do processo sol-gel (Figura 4.9). (77, 154)
Capítulo 4 121
Figura 4.7 - Esquema da hidrólise e condensação no processo sol-gel.
Fonte: Adaptado de (77).
Figura 4.8 - Precursores trialcoxissilanos frequentemente usados no processo sol-gel.
Si(OR)3
CH3 Si(OR)3
NH2 Si(OR) 3H Si(OR) 3
CH2
Si(OR)3
N Si(OR) 3CO
O Si(OR) 3CH3
CH2
O
Si(OR) 3O
O
Si(OR) 3(RO)3Si
Capítulo 4 122
Figura 4.9 - Monômeros orgânicos aplicados na formação de materiais híbridos sol-
gel/orgânico.
O Si(OR) 3CH3
CH2
O
Si(OR)3O
O
OOH
CH3
O
CH2
N
CH2 CH2
NH2CH2 O
As Figuras 4.10 e 4.11 ilustram o esquema geral de síntese de MIP híbrido baseado em
precursor trialcoxisilano (aminofuncionalizado) e a combinação do processo sol-gel com
monômeros orgânicos.
Figura 4.10 – Representação esquemática da síntese de MIP amino funcionalizado.
Fonte: Adaptado de (156).
Capítulo 4 123
Figura 4.11 – Representação esquemática da síntese de MIP híbrido (orgânico-inorgânico).
Fonte: Adaptado de (157).
Os materiais híbridos tem a vantagem de acumular características tanto dos polímeros
orgânicos como dos polímeros inorgânicos, além de possuir maior compatibilidade com uma
ampla faixa de solventes. (77)
Apesar dos MIPs serem fáceis de preparar, uma das desvantagens desse material está
relacionada com a remoção do template da matriz polimérica após a síntese. Na literatura,
diversas metodologias de extração do template têm sido empregadas; contudo, em alguns
casos, não se consegue a total remoção desses compostos do polímero. Assim, para superar
este problema, muitos trabalhos utilizam estruturas análogas às moléculas de interesse para
ser utilizada como template no preparo do MIP. (158)
Capítulo 4 124
MIP pode ser sintetizado por diversas metodologias. Os principais métodos sintéticos
são a polimerização em massa (bulk polimerization), polimerização por suspensão
(suspension polimerization), polimerização por enxerto (seed polimerization) e polimerização
por precipitação (precipitation polimerization). (45, 158) Partículas esféricas ou irregulares
são obtidas de acordo com o método escolhido no preparo do MIP. Pelos métodos tradicionais
de preparação dos MIPs (polimerização em massa), os materiais possuem alta seletividade e
afinidade com o template, entretanto possuem baixa acessibilidade das cavidades contendo os
sítios seletivos. Assim, a cinética do processo de adsorção/dessorção é desfavorecida e a
transferência de massa torna-se lenta. Uma solução promissora é a utilização da impressão
molecular na superfície de um suporte. Desta maneira, o MIP com sítios seletivos na
superfície do material melhora a cinética do processo de adsorção/dessorção e a transferência
de massas sem perder a seletividade do processo de extração. (156, 159-161)
4.1.2 Aplicações dos polímeros molecularmente impressos em preparo de amostra
Os MIPs vêm sendo utilizados como fase extratora seletiva de diversas técnicas de
preparo de amostra (SPE, SPME, SBSE, MEPS) em diferentes campos de aplicação
(ambiental, biológica, alimentos, farmacêutica e herbal). (42, 158, 162, 163)
Entre os métodos de preparo de amostra, a aplicação de MIP em SPE, denominada
extração em fase sólida com polímero impresso (molecularly imprinted solid phase extraction
- MISPE), tem sido amplamente utilizada como meio de separação, clean up e pré-
concentração seletiva de analitos em diferentes amostras. MISPE tem demonstrado extrações
mais seletivas quando comparada com fases extratoras convencionais (baseadas em sílica e
poliméricas). (164, 165) Além disso, a facilidade de preparo, baixo custo, robustez química e
física, resistência a alta pressão e temperatura são algumas vantagens que tornam o MIP um
sorvente mais atrativo que os sorventes baseados em imunoafinidade - no qual é difícil a
obtenção de anticorpos, demanda de longo tempo de preparo, é um processo caro e ainda
possui problemas de estabilidade.
MISPE no modo off-line é o método mais comum e empregado para a extração
seletiva dos analitos. Entretanto, como já discutido no capítulo 1, o protocolo online promove
a automação do processo de extração, separação e detecção apenas conectando a coluna de
extração e separação com válvulas de comutação (sistema bidimensional). Aplicações de
MISPE-LC online têm sido demonstradas em matrizes ambientais (água de rio, lago,
subterrânea, residuária e solo) (43, 165-170), biológicas (urina, plasma, e cultura de células)
Capítulo 4 125
(171-175) e alimentícia (frutas, bebidas e carnes) (176-182). A Tabela 4.1 relata os trabalhos
publicados abordando o acoplamento online entre o MISPE e a LC. O primeiro trabalho
empregando esta característica foi publicado em 1999 (164) e até agosto de 2012,
aproximadamente 54 artigos foram publicados.
4.1.3 Anti-inflamatórios não esteroidais
Os anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs) são um grupo de compostos muito
usados para o tratamento da dor, inflamação, febre e doenças reumáticas. (183) Além disso,
estudos recentes vêm sendo conduzidos com esses compostos na quimioprevenção do câncer.
(184)
Os NSAIDs estudados neste trabalho foram o cetoprofeno (CET), ibuprofeno (IBU),
fenoprofeno (FEN), flurbiprofeno (FLU) e o naproxeno (NAP) que são fármacos derivados do
ácido arilpropiônico (Figura 4.12).
A ação desses fármacos ocorre através do bloqueio da enzima cicloxigenase (Cox-1 e
Cox-2) que são responsáveis pela produção das prostaglandinas (PGs). (185) As PGs possuem
diversas funções no organismo e uma delas está relacionada com a sensibilidade das vias de
transmissão de dor. Entretanto, as PGs também são responsáveis no processo de proteção do
estômago e coagulação do sangue. Assim, o uso dos NSAIDs pode provocar úlceras no
estômago, e até promover sangramento prolongado após ferimento ou cirurgia devido a
demora na coagulação sanguínea. Além disso, em alguns casos eles estão associados com
insufi
Figura 4.12 - Estrutura química dos NSAIDs estudados.
OH
O
CH3 O
OH
O
CH3
OH
OO
H3C
CH3
F
OH
O
CH3
OH
O
CH3
O
ibuprofeno cetoprofeno
naproxeno flurbiprofeno fenoprofeno (PI)
Capítulo 4 126
Tabela 4.1 – Métodos de MISPE-LC online.
Template Extração Matriz Online MISPE Método de
separação Detecção Observações Ano Ref
Análise Ambiental
Simazina Triazinas Água com
ácido húmico
55 mm x 2,0 mm
C18
150 mm 4,6 mm
MIP
250 mm x 4,6 mm
5 µm C18 LC-UV MAA/EDMA 1999 (164)
4-nitrofenol 4-nitrofenol Água de rio 10 mm x 3,0 mm 250 mm 4,0 mm
5 µm C18 LC-UV 4-PV/EDMA 2000 (186)
Terbutilazina Triazinas Água de rio
25 mm x 4,0 mm
RAM
25 mm x 4,6 mm
MIP
5,0 mm x 250 mm
5µm C18 LC-MS
MAA/EDMA
LD = 20 – 50 ngL-1 2001 (187)
4-nitrofenol 4-nitrofenol Água de rio 10 mm x 3,0 mm 250 mm x 4,0 mm
5 µm C18 LC-UV 4-PV/EDMA 2002 (188)
4-clorofenol 4-clorofenóis,
4-nitrofenol Água de rio 10 mm x 3,0 mm
250 mm x 4,0 mm
5µm C18 LC-UV
4-PV/EDMA
MAA/EDMA 2003 (189)
p-t-butilfenol
ou
bisfenol A
Bisfenol A Água de rio 10 mm x 4,0 mm 150 mm x 4,6 mm
C18 LC-FLD
4-PV/EDMA
LD = 25 ng L-1
2003 (190)
p-t-butilfenol Bisfenol A Água de lago 30 mm x 4,0 mm 150 mm x 4,6 mm
C18 LC-ECD
4-PV/EDMA
LD = 0,36 ng L-1
2004 (191)
p-t-butilfenol Bisfenol A Água de rio 50 mm x 4,0 mm 4,6mm x 150mm
C18
LC-ECD
LC-UV
4-PV/EDMA
LD = 0,36 ng L-1
2004 (192)
4,4’-
metilenobisfenol Bisfenol A Água de rio NR
150 mm x 4,6 mm
C18 LC-UV
4-PV/EDMA
RAM-MIP 2004 (193)
Pentaclorofenol Pentaclorofenol Esgoto, água
de rio e lago 15 mm x 4,0 mm
250 mm x 4,6 mm
5µm C18 LC-UV
APTES/TEOS
LD = 6 ng L-1
2005 (159)
Capítulo 4 127
Template Extração Matriz Online MISPE Método de
separação Detecção Observações Ano Ref.
4,4’-
metilenobisfenol Bisfenol A Água de rio 30 mm x 4,6 mm
150 mm x 2,1 mm
C18
LC-MS
LC-DAD
4-PV/EDMA
RAM-MIP
LD = 0,45 ng L-1
2005 (194)
4,4’-
metilenobisfenol e
p-t-butilfenol
Bisfenol A Água de rio 30 mm x 4,6 mm 150 mm x 4,6 mm
C18
LC-ECD
LC-UV
4-PV/EDMA
RAM-MIP
LD = 0,36 ng L-1
2005 (195)
4,4’-
metilenobisfenol Bisfenol A Água de rio 30 mm x 4,6 mm
150 mm x 4,6 mm
C18 LC-UV
4-PV/EDMA
RAM-MIP 2005 (196)
Bisfenol A Compostos
fenólicos Água de rio 50 mm x 4,0 mm
200 mm x 4,6 mm
5µm C18
50 mm x 4,6 mm
C18 monolítica
LC-UV
4-PV/EDMA
MIP monolítico
LD = 60 ng L-1
2006 (197)
6-Cetoecradiol 7β-estradiol Água de rio 30 mm x 4,6 mm 150 mm x 2,1 mm
C18 LC-MS
4-PV/EDMA
RAM-MIP
LD = 1,8 ng L-1
2006 (44)
Irgarol Metiltiotriazina Água de rio 10 mm x 4,0 mm 150 mm x 4,0 mm
C18 LC-MS
TFMAA/EDMA
RAM-MIP
LD = 25 ng L-1
2007 (198)
Tiabendazol Benzimidazóis Água de rio e
torneira 50 mm x 4,0 mm
250 mm x 4,6 mm
5 µm C18 LC-UV
MAA/EDMA
MAA/DVB
LD = 30 – 90 ng L-1
2009 (166)
Ciclobarbital Antiepileticos Água de rio 10 mm x 4,0 mm 150 mm x 2,0 mm
C18 LC-MS
4-PV/EDMA
RAM-MIP
LD = 0,5 – 5 ng L-1
2009 (167)
Estrona Estrona Água de lago 15 mm x 4,0 mm 250 mm x 4,6 mm
C18 LC-UV
APTES/TEOS
LD = 5,7 ng L-1
2009 (43)
Tiabendazol Benzimidazóis Água de rio e
torneira 50 mm x 4,6 mm C18 LC-UV
MAA/DVB
LD = 2,3 – 5,7 ng L-1
2009 (199)
Metribuzina Metribuzina
Solo de
plantação de
milho
15 mm x 4,6 mm 250 mm x 4,6 mm
C18 LC-UV
MAA/EDMA
MIP monolítico
LD = 0,83 µg kg-1
2009 (168)
Capítulo 4 128
Template Extração Matriz Online MISPE Método de
separação Detecção Observações Ano Ref
MIP comercial Triazinas Solo e água de
torneira
Sorvente
polimérico + MIP
150 mm x 4,6 mm
3,5 µm C18 LC-UV micro-SPE multimodal 2010 (165)
Sudan I Sudan I - IV Água de rio NR 250 mm x 4,6 mm
C18 LC-UV
2-VP/EDMA
LD = 10 – 50 ng L-1
2010 (176)
Clorsulfuron Clorsulfuron Água de
superfície 15 mm x 4,0 mm
250 mm x 4,6 mm
C18 LC-UV
Liquido iônico
vinilimidazol/EDMA
LD = 1 ng L-1
2011 (169)
Bisfenol A Bisfenol A Água de rio 30 mm x 4,6 mm 150 mm x 4,6 mm
C18 LC-FLD
EDMA
RAM-MIP
LD = 90 µg L-1
2011 (170)
Análise de fluidos biológicos
Simazina Triazinas Urina
55 mm x 2,0 mm
C18
150 mm 4,6 mm
MIP
250 mm x 4,6 mm
5 µm C18 LC-UV MAA/EDMA 1999 (164)
Naproxeno Ibuprofeno Plasma de rato 10 mm x 4,0 mm 150 mm x 4,6 mm
C18 LC-UV
4-VP/EDMA
RAM-MIP
LD = 50 µg L-1
2000 (200)
Tramadol Tramadol Plasma
humano
25 mm x 4,0 mm
RAM
25 mm x 4,6 mm
MIP
125 mm x 4,0 mm
5 µm CN LC-FLD MAA/EDMA 2001 (201)
Propranolol β-bloqueadores Plasma de rato 10 mm x 4,0 mm 150 mm x 6,0 mm
5 µm ES-PhCD LC-FLD
MAA/EDMA
RAM-MIP
LD = 12,5 µg L-1
2003 (202)
Verapamil Verapamil e
metabólitos
Cultura de
células, urina e
plasma
25 mm x 4,0 mm
RAM
40 mm x 4,0 mm
MIP
125 mm 4,0 mm
5 µm C18 LC-MS
MAA/EDMA
LD = 5 µg mL-1
2004 (171)
Capítulo 4 129
Template Extração Matriz Online MISPE Método de
separação Detecção Observações Ano Ref
Cafeína Cafeína Urina Cartucho de
polipropileno 250 mm x 4,6 mm LC-UV MAA/EDMA 2004 (177)
Carbaril Carbaril e
1-naftol Plasma de rato 50 mm x 4,6 mm
50 mm x 4,6 mm
5µm C18 LC-UV
MAA/EDMA
LD = 1 µg L-1
2006 (203)
Bupivacaína Ropivacaína,
bupivacaína
Plasma
humano 20 mm x 2,0 mm
50 mm x 4,6 mm
5 µm C18 LC-UV
MAA/EDMA/HEMA
LD = 2,5 – 5 µmol L-1
2007 (204)
Alfuzosina Alfuzosina Plasma 20 mm x 2,0 mm 150 mm x 4,6 mm
5µm C18 LC-UV
MAA/EDMA
LQ = 15 µg L-1
2008 (205)
Norfloxacina Enrofloxacina,
ciprofloxacina Urina 15 mm x 3,2 mm
4,6mm x 250mm
5µm C18 LC-UV
HEMA/EDMA
MIP monolítico
LD = 10 – 12 µg L-1
2009 (173)
Dextrometorfano Dextrometorfa
no
Plasma
humano
Cartucho
polipropileno
250 mm x 4,6 mm
5 µm C18 LC-DAD
MAA/EDMA
LD = 0,12 µg L-1
2011 (174)
MIP comercial NNAL Urina 19 mm x 0,5 mm 100 mm x 2 mm
5 µm C18 LC-MS LQ = 20 ng L
-1 2011 (175)
Análise de alimentos
Simazina Triazinas Maça
55 mm x 2,0 mm
C18
150 mm 4,6 mm
MIP
250 mm x 4,6 mm
5 µm C18 LC-UV MAA/EDMA 1999 (164)
Cafeína Cafeína Café e bebidas Cartucho
polipropileno 250 mm x 4,6 mm LC-UV MAA/EDMA 2004 (177)
Carbaril Carbaril e
1-naftol Maça 50 mm x 4,6 mm
50 mm x 4,6 mm
5µm C18 LC-UV
MAA/EDMA
LD = 1 µg L-1
2006 (206)
Capítulo 4 130
Template Extração Matriz Online MISPE Método de
separação Detecção Observações Ano Ref
Ocratoxina A Ocratoxin A Vinho tinto
Frit 0,5 µm
, 94” i..d.
,25 ” o.d.
, 62”
comprimento
250 mm x 4,6 mm
5 µm C18 LC-FLD
Pirrol/nanotubos de
carbono
LD = 12 ng L-1
2006 (178)
Sudan I Sudan I Pimenta 15 mm x 4,0 mm 150 mm x 4,6 mm
C18 LC-UV
APTES/TEOS
LD = 1,2 ng L-1
2007 (207)
Sulfametazina Sulfonamidas Músculo de
porco e frango 15 mm x 4,0 mm
250 mm x 4,6 mm
5 µm C18 LC-UV
APTES/TEOS
LD = 4,6 - 7,3 ng L-1
2008 (208)
Ractopamina Ractopamina Carne de
porco 15 mm x 4,0 mm
250 mm x 4,6 mm
C18 LC-FLD
APTES/TEOS
LD = 4,5 ng L-1
2009 (209)
Enrofloxacina Enrofloxacina Carne de peixe
e frango 15 mm x 4,0 mm
250 mm 4,6 mm
C18 LC-FLD
APTES/TEOS
LD = 8 ng L-1
2009 (179)
Tetraciclina Tetraciclinas Leite e mel 100 mm x 4,6 mm 150 mm x 4,6 mm
5 µm C18 LC-UV
MAA/EDMA
MIP monolítico
LD = 10,2 – 18,8 µg L-
1
2009 (210)
Oxitetraciclina e
clortetraciclina Tetraciclinas
Lagosta, leite e
mel 10 mm x 4,6 mm
150 mm x 2,1 mm
5 µm C18 LC-UV MAA/TRIM 2010 (181)
Sulfametazina Sulfonamidas Leite bovino 40 mm x 4,6 mm 250 mm x 4,6 mm
5µm C18 LC-UV
MAA/EDMA
RAM-MIP
LD = 0,2 – 0,8 µg L-1
2010 (211)
Para-red Para-red Molho de
tomate 15 mm x 4,0 mm
250 mm x 4,6 mm
C18 LC-UV
APTES/TEOS
LD = 6,6 ng L-1
2010 (212)
Sudan I Sudan I - IV
Tomate,
molho de
tomate e
salsicha
NR 250 mm x 4,6 mm
C18 LC-UV
2-VP/EDMA
LD = 10 – 50 ng L-1
2010 (176)
Capítulo 4 131
Template Extração Matriz Online MISPE Método de
separação Detecção Observações Ano Ref
Sudan IV Sudan IV Pimenta 15 mm x 4,0 mm 150 mm x 4,6 mm
C18 LC-UV
APTES/TEOS
LD = 2,3 ng L-1
2010 (213)
Ácido 3-metil-
quinoxalina-2-
carboxílico
1,4-dioxido-
quinoxalina-
Músculo de
porco 15 mm x 4,0 mm
250mm x 4,6 mm
C18 LC-UV
APTES/TEOS
LD = 20 – 40 ng kg-1
2011 (214)
Oxitetraciclina e
clortetraciclina Tetraciclinas Ovo 10 mm x 4,6 mm
150 mm x 2,1 mm
5 µm C18 LC-DAD
MAA/TRIM
LD = 0,8 – 1,3 µg kg-1
2011 (180)
2,4-diamino-6-
undecil-
1,3,5-triazina
Ciromazina e
melamina Leite 50 mm x 4,6 mm
150 mm x 4,6 mm
5µm C18 LC-UV
MAA/EDMA
MIP monolítico
LD = 50 – 120 µg L-1
2011 (215)
β-naftol Estrogênios Leite NR 250 mm x 4,6 mm
C18 LC-UV
CyD/MBAA
LD = 1 – 8 µg kg-1
2012 (182)
Análise farmacêutica e herbal
Atropina Atropina e
escopolamina
Medicamento
gastrointestina
l
10 mm x 4,0 mm 150 mm x 4,6 mm
SCX LC-UV
TFMAA/EDMA
LD = 1 – 8 µg L-1
2005 (172)
l-tetraidropalmatina dl-tetraidropal
matina
Raiz da
Corydalis
yanhusuo
50 mm x 4 mm 200 mm x 4,6 mm
5 µm C18 LC-UV
MAA/EDMA
MIP monolítico 2006 (216)
trans-resveratrol
trans-
resveratrol e
emodina
Raiz da
Polygonum
cuspidatum
150 mm x 4,6 mm 150 mm x 4,6 mm
5 µm C18 LC-UV
4-VP/EDMA
LD = 10 µg L-1
2008 (217)
Propil galato Ácido
protocatecuico
Extrato da
Radix Salviae
Miltiorrhizae
50 mm x 4,6 mm 250 mm x 4,6 mm
5 µm C18 LC-MS 4-VP/EDMA 2012 (218)
Capítulo 4 132
insuficiência renal, sonolência, tontura, náusea, diarreia e falta de apetite. Esses compostos
também diminuem a ação de compostos diuréticos e atuam na inibição de fármacos utilizados
no tratamento da hipertensão. (219, 220) Assim, é importante o desenvolvimento de métodos
de monitoramento desses compostos em fluidos biológicos.
A determinação desses compostos em fluidos biológicos pode ser realizada pela coleta
de sangue ou de urina. A escolha pela via urinária para a determinação desses fármacos na
rotina laboratorial é vantajosa, visto que é um método de coleta não invasivo quando
comparada com a via sanguínea. Na urina, os NSAIDs são excretados na forma inalterada,
metabolizada (oxidada) e conjugada com o ácido glucorônico. Na literatura, existem diversos
métodos propostos para a determinação dos NSAIDs em matriz biológica com fases
extratoras tradicionais. (219, 221-223) Alguns trabalhos também foram publicados utilizando
a tecnologia de impressão molecular nessas determinações; entretanto, grande parte dos
artigos realiza a determinação de apenas um composto de interesse. (200, 224-228) Além
disso, a maioria dos métodos bioanalíticos desenvolvidos utilizam muitas etapas de extração,
e isto torna o método muito trabalhoso, com diversas fontes de erro e contaminação, além de
prolongar o tempo total de análise. Assim, os métodos online são uma opção vantajosa por
minimizar essas desvantagens. Uma busca na literatura revelou que apenas um trabalho foi
publicado utilizando MISPE-LC online na determinação de NSAIDs. Adicionalmente, o
trabalho relata a síntese do MIP empregando monômeros orgânicos e utilizando o naproxeno
como template para a análise de ibuprofeno em plasma de rato. (200)
4.2 Objetivos
Primeiramente o objetivo deste trabalho foi sintetizar um polímero amino-
funcionalizado seletivo para a extração de cinco NSAIDs. Em seguida o objetivo foi
desenvolver um método de análise automatizado, simples e rápido através do sistema online
utilizando column switching para analisar amostras de urina com o mínimo de preparo de
amostra. Por fim, o método foi validado e aplicado em amostras reais de urina.
4.3 Experimental
4.3.1 Reagentes
Capítulo 4 133
Silica gel 60 (Merck, Darmstadt, Alemanha) com 63-200 µm foi utilizada como
suporte de polimerização do MIP. Para a síntese do polímero foram utilizados trietoxissilano
(TEOS), aminopropiltrietoxissilano (APTES) da Aldrich (Steinheim, Alemanha) e
etiltrietoxissilano (ETEOS) da Gelest (Morrisville, EUA). Ácido acético glacial
(Mallinckrodt, Xalostoc, México), acetonitrila e metanol, ambos da Tedia (Fairfield, EUA)
foram usados no trabalho. A água ultrapura foi fornecida pelo sistema Milli-Q da Millipore
(Bedford, EUA).
Os padrões analíticos de ibuprofeno (IBU), fenoprofeno (FEN), naproxeno (NAP),
cetoprofeno (CET), flurbiprofeno (FLU), fluoxetina e norfluoxetina foram adquiridos da
Sigma (Steinheim, Alemanha). A cafeína proveniente da Alfa Aesar (Heysham, Reino Unido)
e o ácido acetilsalicílico da Synth (Diadema, Brasil).
4.3.2 Síntese do MIP
Primeiramente, 5 g de sílica gel foram ativadas por refluxo com 60 mL de HCl 5 mol
L-1
por 12 h; posteriormente, a sílica ativada foi filtrada, lavada com água ultrapura e secada
em estufa a 120°C por 24 h.
Para preparar o MIP de ibuprofeno, 300 mg de ibuprofeno foram dissolvidos em 5 mL
de metanol, sendo adicionados 2 mL de APTES e 30 µL de ETEOS a mistura. A solução foi
agitada magneticamente e refluxada por 20 minutos. Depois, 4 mL de TEOS foram
adicionados, permanecendo a agitação por 10 minutos. Por fim, 1 g de sílica ativada e 1 mL
de ácido acético 1 mol L-1
foram adicionados a mistura. A reação permaneceu a temperatura
ambiente por 24 h.
O produto foi lavado com metanol para remover resíduos dos reagentes e secado em
estufa a 100°C por 12 h. O MIP foi triturado e o template removido por refluxo em soxhlet
utilizando metanol contendo 5 % de ácido acético por aproximadamente 200 ciclos de
extração. O polímero controle (NIP) foi sintetizado conforme procedimento anterior, porém
sem a adição do ibuprofeno.
4.3.3 Caracterização do MIP
A morfologia das partículas do MIP foi analisada por microscopia eletrônica de
varredura (MEV) (Zeiss-Leica/440) operando a 20 kV e as amostras foram recobertas com
Capítulo 4 134
uma fina camada de ouro. A área superficial e o diâmetro do poro foram medidos pela
isoterma de adsorção/dessorção de nitrogênio a 77K (Quantachrome Instruments) pelo
método Braunaer-Emmett-Teller (BET). Os espectros de infravermelho (FT-IR) foram
obtidos de 4000 a 400 cm-1
no equipamento Bomem MB-102 empregando disco de KBr para
preparar as amostras.
4.3.4 Preparo da coluna MIP
As partículas do MIP foram empacotadas em tudo de aço inoxidável com 4,6 mm de
diâmetro interno e 20 mm de comprimento utilizando frit de 2 µm. O empacotamento foi
realizado empregando uma bomba LC-20AD e metanol como solvente propulsor.
4.3.5 Método cromatográfico
O sistema de cromatografia líquida online com column switching consistiu de um
HPLC série Prominence 20A da Shimadzu (Kyoto, Japão). O sistema consistiu de três
bombas LC-20AD, um amostrador automático SIL-20A, um forno cromatográfico CTO-20A,
um detector UV SPD-20A e uma controladora CBM-20A. As bombas, o amostrador e o
detector foram acoplados a uma válvula seletora de seis vias e duas posições. O software LC-
Solution (Shimadzu) controlou os módulos do sistema cromatográfico e também a válvula
seletora.
Neste trabalho foi empregada uma coluna MIP para extração (4,6 mm x 20 mm) e uma
coluna analítica NST C18 (2,1 mm x 150 mm x 5 µm) para realizar a análise online dos
analitos. A Figura 4.13 detalha as colunas cromatográficas conectadas a válvula seletora
dentro do forno cromatográfico. A extração online foi avaliada no modo de injeção foreflush e
backflush. No modo foreflush a eluição dos analitos acontece no mesmo sentido da vazão de
extração (Figura 4.14). Já no modo blackflush a eluição acontece em sentido contrário à vazão
de extração (Figura 4.15). A bomba A operou como bomba analítica com vazão de 0,2 mL
min-1
utilizando MeOH: H2O (70:30) 0,2 % de ácido acético como fase móvel em modo
isocrático. A temperatura do forno foi mantida a 35°C e o comprimento de onda monitorado
durante os experimentos pelo detector de UV foi de 220 nm. Já as bombas B e C operaram
como bombas do processo de extração. A bomba B possuía H2O 0,05 % de ácido acético e a
bomba
Capítulo 4 135
Figura 4.13 - Fotografia do sistema online. A) Vista completa do arranjo online dentro do
forno cromatográfico e B) ampliação da válvula de seis vias e da coluna de extração.
A B
Figura 4.14 - Configuração do sistema online para eluição no modo foreflush.
Coluna
analítica (C18)
((C18)
Coluna de
extração (MIP)
Capítulo 4 136
Figura 4.15 - Configuração do sistema online para eluição no modo backflush.
bomba C, MeOH 0,5 % de ácido acético. O volume injetado pelo amostrador automático foi
de 5 µL. A Tabela 4.2 apresenta a sequencia de eventos otimizados na análise online.
4.3.6 Preparo das soluções padrões para a validação
Soluções estoque de CET, NAP, FLU, IBU e FEN (PI) foram preparadas em MeOH
na concentração de 1000 µg mL-1
. Soluções de trabalho de CET, NAP, FLU e IBU a 250 e 25
µg mL-1
, e FEN a 400 µg mL-1
foram preparadas a partir das soluções estoque. Essas soluções
foram usadas para fortificar as amostras de urina usadas no processo de validação. As
soluções estoque foram mantidas em freezer, e as soluções de trabalho sob refrigeração a 4°C.
Para atingir as concentrações desejadas, alíquotas da solução trabalho foram
transferidas para frascos do tipo eppendorf, secas sob fluxo de nitrogênio e ressuspensas em 1
mL de urina branco. As amostras foram homogenizadas no ultrassom por 5 minutos, diluídas
com água ultrapura em igual volume (50:50, v/v), centrifugadas a 10955 g por 5 minutos e
transferidas para frascos (vials) apropriados que foram levados ao amostrador automático do
HPLC.
Capítulo 4 137
Tabela 4.2 - Eventos realizados durante as etapas de preparo de amostra e separação
cromatográfica.
Tempo (min) Evento
0,00 Válvula seletora na posição 1
0,00 Amostrador faz a injeção da amostra
0,00 – 23,00 Vazão Bomba A em 0,2 mL min-1
0,00 – 7,00 Vazão total das bombas B/C em 0,2 mL min
-1
Solvente da bomba B = 100 %
5,00 Válvula seletora na posição 2
7,00 Válvula seletora na posição 1
8,00 – 17,00 Vazão total das bombas B/C em 1 mL min-1
9,00 – 12,00 Solvente da bomba C = 100 %
14,00 – 22,00 Solvente da bomba B = 100 %
18,00 Vazão total das bombas B/C em 0,2 mL min-1
22,00 Sistema finaliza a corrida cromatográfica
4.3.7 Validação do método
Os seguintes parâmetros foram avaliados na validação do método: seletividade,
sensibilidade, linearidade, precisão e exatidão intra e inter-dias, recuperação, limite de
detecção e quantificação, reprodutibilidade intralaboratorial, efeito matriz, interferentes, efeito
da diluição da amostra e robustez. Na validação foram seguidas as recomendações da RE n°
899 da ANVISA. (116) Entretanto, alguns parâmetros não abordados mais profundamente
nesta resolução, foram avaliados seguindo recomendações de outras agências. (117, 119)
Amostra de branco de urina foram coletadas de 7 indivíduos sadios, sendo então
preparado um pool de urina o qual foi utilizado na validação da metodologia. A seletividade
do método foi avaliada realizando a injeção em quintuplicada da urina sem adição do
fármaco.
A linearidade foi avaliada através das curvas analíticas construídas em quintuplicatas
em seis níveis de concentração (0,5, 3, 6, 9, 12 e 15 µg mL-1
) totalizando um n = 30 para cada
Capítulo 4 138
fármaco analisado. O limite de detecção (LD) foi estabelecido como sendo três vezes a
amplitude do ruído da linha de base e o limite de quantificação (LQ) como sendo no mínimo
dez vezes a amplitude do ruído da linha de base.
A precisão intra-dia foi avaliada em quintuplicata em três níveis diferentes (baixo (0,5
µg mL-1
), médio (9 µg mL-1
) e alto (15 µg mL-1
)) em dois dias consecutivos, e a precisão
inter-dia foi avaliada com os resultados dos dois dias de coleta dos dados. Os resultados
destes ensaios foram expressos em desvio padrão relativo (DPR).
Similarmente ao ensaio de precisão, foi calculada a exatidão intra e inter-dia, nos
mesmos níveis e os resultados foram apresentados em percentagem de desvio.
A reprodutibilidade intralaboratorial foi realizada em três níveis diferentes (baixo,
médio e alto), sendo realizadas seis injeções para cada nível. O primeiro conjunto de amostras
fortificadas foi realizado nas condições padrões do método. O segundo conjunto foi realizado
por outro analista, e o terceiro conjunto alterando a temperatura da sala do equipamento. A
seguir foram calculados os valores de precisão e exatidão do ensaio.
A eficiência da extração foi avaliada através da recuperação absoluta (níveis médio e
alto) e da recuperação relativa (níveis baixo, médio e alto).
O efeito matriz do método foi avaliado realizando a injeção de seis amostras branca de
urina fortificada no nível baixo e alto da curva analítica em sextuplicata de doadores
individuais. Nesta etapa não se utilizou o pool de amostra branco de urina. Os resultados
foram expressos em DPR e percentagem de desvio do valor real.
O efeito de memória (carry over) foi avaliado realizando a injeção do nível mais alto
da curva cromatográfica (15 µg mL-1
), e em seguida, a injeção do branco da urina.
A robustez foi avaliada pelo teste de Youden usando um planejamento fatorial
fracionário no qual é avaliada a influência de sete variáveis em dois níveis diferentes (Tabela
4.3). As letras maiúsculas representam os valores nominais ou padrão do método
desenvolvido, e as letras minúsculas as variações a serem estudadas. Assim, neste teste são
realizados oito experimentos de forma aleatória com a combinação fatorial dos parâmetros
avaliados e verifica-se qual o efeito ou combinações de efeitos que influenciam no resultado
final (Tabela 4.4).
Assim, foi avaliada a influência dos sete parâmetros em relação à concentração dos
analitos, tempo de retenção, fator de retenção e fator de retenção relativo.
O ensaio para avaliar a influência de interferentes na análise foi realizado fortificando
urina com cafeína (30 µg mL-1
), nicotina (15 µg mL-1
), ácido acetilsalicílico (15 µg mL-1
),
fluoxetina (1 µg mL-1
) e norfluoxetina (1 µg mL-1
).
Capítulo 4 139
Tabela 4.3 - Fatores avaliados na robustez do método.
Efeito Condição Nominal Variação
Temperatura do forno (°C) 35 A 37 a
Vazão da bomba analítica (mL min-1
) 0,20 B 0,18 b
Proporção de MeOH na fase móvel (%) 70 C 67 c
Ácido acético na fase móvel (%) 0,20 D 0,25 d
Vazão da bomba de extração (mL min-1
) 0,20 E 0,15 e
Comprimento de onda do detector (nm) 220 F 222 f
Ácido acético na água de carregamento (%) 0,05 G 0,10 g
Tabela 4.4 - Matriz de Youden.
Efeito Combinação dos parâmetros
Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 Exp. 5 Exp. 6 Exp. 7 Exp. 8
A/a 35 35 35 35 37 37 37 37
B/b 0,20 0,20 0,18 0,18 0,20 0,20 0,18 0,18
C/c 70 67 70 67 70 67 70 67
D/d 0,20 0,20 0,25 0,25 0,25 0,25 0,20 0,20
E/e 0,20 0,15 0,20 0,15 0,15 0,20 0,15 0,20
F/f 220 222 222 220 220 222 222 220
G/g 0,05 0,10 0,10 0,05 0,10 0,05 0,05 0,10
RESULTADO s t u v w x y z
O estudo da estabilidade dos fármacos reproduziu as condições reais de manuseio e
análise das amostras. Foi avaliada a estabilidade dos analitos nas soluções estoque e
intermediária, após ciclos de congelamento e descongelamento, em armazenagem de curta
duração (temperatura ambiente) e longa duração (congelamento), e também no pós-
processamento das amostras. As determinações foram realizadas fortificando a urina isenta
dos analitos nos níveis baixo e alto da curva analítica. Foram utilizadas três amostras para
cada nível e as análises foram feitas em duplicatas.
Capítulo 4 140
4.3.8 Determinação dos fármacos em amostras de urina
Após o método ter sido validado, foi aplicado em amostras de urina de voluntários
saudáveis que administraram uma única dose oral de comprimidos contendo cetoprofeno 100
mg, naproxeno 250 mg e ibuprofeno 200 mg. As amostras de urina dos voluntários foram
coletadas em três períodos de tempo (2-4 h, 6-8h e 10-12h) e, posteriormente, armazenadas
em geladeira a 4°C. Para a quantificação dos fármacos na forma livre em urina, foi realizada a
adição do padrão interno seguida da análise pelo método desenvolvido e validado.
A determinação dos NSAIDs na forma desconjugada (acil-glucoronídeo) foi realizada
pela adição 100 µL de NaOH 1,0 M em 500 µL de urina contendo o padrão interno em tubo
de 1,5 mL. A solução ficou em temperatura ambiente por 1,5 h para a hidrólise dos fármacos.
Posteriormente, a urina hidrolisada foi neutralizada com 100 µL de HCl 1,0 M e o volume foi
completado para 1 mL seguida da análise pelo método desenvolvido e validado.
Amostras de controle de qualidade (CQ) foram preparadas para avaliar o desempenho
do método e a validade dos resultados das amostras desconhecidas analisadas. Foram
preparadas quatro amostras de CQ: CQ do limite inferior (CQ-LIQ (0,5 µg mL-1
)), CQ de
baixa concentração (CQB (1,5 µg mL-1
)), CQ de média concentração (CQM (6 µg mL-1
)) e
CQ de alta concentração (CQA (12 µg mL-1
)). Os CQs foram intercalados com a análise de
amostras.
4.4 Resultados e discussão
4.4.1 Preparo e caracterização do MIP
A Figura 4.16 representa o esquema reacional sugerido para o preparo do MIP. Após a
mistura dos precursores poliméricos com o template (ibuprofeno) ocorre a formação de um
complexo polímero-template. Após a reação de hidrólise e condensação catalisada por ácido
há a formação da rede polimérica de sílica amino-funcionalizada na superfície das partículas
de sílica gel. Os grupamentos amino e silanol estão fixados na estrutura do polímero e
interagem com o template. Após a remoção do template por soxhlet, há a formação de uma
cavidade que possui sítios seletivos para o ibuprofeno e estruturas análogas a ele.
Na Figura 4.17 temos imagens da MEV das partículas de sílica gel e do MIP
sintetizado. Podemos observar que antes do preparo do MIP as partículas de sílica apresentam
Capítulo 4 141
superfície lisa e, após o recobrimento destas partículas com o MIP, elas se apresentaram
rugosas. Pelo método BET, as partículas do MIP apresentaram área superficial de 64 m2 g
-1 e
um diâmetro médio dos poros de 2,6 nm, enquanto o material usado como suporte
cromatográfico apresentou área superficial de 550 m2 g
-1 e diâmetro médio dos poros de 6 nm
de acordo com especificações do fabricante.
Figura 4.16 - Esquema sugerido para a preparação do MIP.
CH3
CH3
CH3
O
OH
Si
O
O
O
Et
Et
Et
N H
H
Si
CH3
O
O
O
Et
Et
Et
+
MeOH,
CH3
CH3
CH3
O
OH
Si
O
O
O
Et
Et
Et
N
H
H
Si
O
O
O
Et
Et
Et
N
H
H
Si
CH3
O
O
O
Et
Et
Et
TEOS,
HAc,
silica
CH3
CH3
CH3
O
OH
CH3
CH3
CH3
O
OH
Si
O
O
ON
H
H
Si
O
O
O
Si
N
H
HOSi
O
Si
OSi
O Si
CH3
SiH3
CH3
CH3
OSi
O
OSi
CH3
CH3CH3
Si
CH3
CH3
CH3
O
O
O
Si
CH3
CH3 Si
CH3
CH3CH3
CH3
CH3
Si
CH3
O
O
O
Si
Si
Si
OSi
O
O
Si
H H
H
H
Si
O
O
Si
H
CH3 CH3
CH3
O
O
Si
CH3 CH3
O
SiO
O
O
SiCH3
O
Si
CH3CH3
OCH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3Si
O
O
ON
H
H
Si
O
O
O
Si
N
H
HOSi
O
Si
OSi
O Si
CH3
SiH3
CH3
CH3
OSi
O
OSi
CH3
CH3CH3
Si
CH3
CH3
CH3
O
O
O
Si
CH3
CH3 Si
CH3
CH3CH3
CH3
CH3
Si
CH3
O
O
O
Si
Si
Si
OSi
O
O
Si
H H
H
H
Si
O
O
Si
H
CH3 CH3
CH3
O
O
Si
CH3 CH3
O
SiO
O
O
SiCH3
O
Si
CH3CH3
OCH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
ETEOS APTES
Figura 4.17 - Imagem de MEV da superfície da sílica ativada (A) e do MIP sintetizado (B).
Capítulo 4 142
Os polímeros sintetizados também foram caracterizados por análise na região do
infravermelho. Para confirmar a presença dos modificadores na superfície da sílica, os
espectros da sílica ativada, MIP e NIP estão na Figura 4.18. Podemos observar que as bandas
em 1103 cm-1
e 935 cm-1
são atribuídas às vibrações Si-O-Si e Si-O-H, respectivamente. Já as
bandas presentes em 796 cm-1
e 470 cm-1
são referentes às vibrações Si-O. As vibrações das
hidroxilas presentes na estrutura da sílica (O-H) apresentam bandas na região de 3433 cm-1
e
1627 cm-1
. Todas essas bandas apresentadas são características da estrutura polimérica da
sílica e estão presentes na sílica gel, MIP e NIP.
A confirmação da polimerização do APTES e ETEOS na superfície da sílica gel é a
presença de bandas atribuídas às vibrações da ligação N-H em 3357 cm-1
e 1598 cm-1
e
também a presença de ligações C-H com bandas em 2933 cm-1
nos sorbentes MIP e NIP. As
bandas dessas vibrações nos dois materiais apresentaram localização e intensidades similares.
Assim, estes resultados sugerem que os grupos modificadores da sílica foram
polimerizados e ancorados na superfície da sílica ativada após a síntese do MIP do
ibuprofeno.
4.4.2 Separação cromatográfica
Primeiramente foi realizada a otimização da separação cromatográfica dos cinco
NSAIDs. Nesta etapa utilizou-se LC-UV no modo unidimensional, com a coluna em fase
reversa C18, sendo a temperatura do forno mantida a 35°C, o volume injetado do padrão (1,0
µg mL-1
) foi de 10 µL, a vazão da fase móvel foi de 0,2 mL min-1
e o comprimento de onda
monitorado foi de 220 nm. Nestas condições foi avaliado qual o solvente orgânico a ser
utilizado na fase móvel. Na Figura 4.19 temos os cromatogramas da separação dos compostos
utilizando ACN e MeOH na fase móvel. Ao utilizar ACN, observamos que o cetoprofeno e o
naproxeno coeluem, ou seja, nesta condição de análise não há seletividade entre esses dois
compostos e o fator de separação (α) é igual a , . Provavelmente o uso de uma percentagem
baixa de ACN na fase móvel na condição inicial e, posteriormente, um gradiente de solvente,
promoveria uma melhor resolução entre esses dois compostos. Entretanto, isso aumentaria o
custo de uma bomba adicional no sistema online. Além disso, a fase móvel inicial seria o
solvente de eluição dos analitos da coluna de extração (MIP) e uma baixa percentagem do
solvente orgânico poderia não eluir completamente os compostos, prejudicando o método.
Capítulo 4 143
Figura 4.18 - Espectro de Infravermelho da sílica gel, MIP e NIP. Bandas: (1) O-H, (2) N-H,
(3) C-H, (4) O-H, (5) N-H, (6) Si-O-Si, (7) Si-OH, (8) Si-O e (9) Si-O.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
10
20
30
40
50
60
70
80
90
9
6
% T
ran
smit
ân
cia
Número de onda (cm-1)
Silica gel
1
4
7
8
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 50010
15
20
25
30
35
40
45
9
% T
ran
smit
ân
cia
Número de onda (cm-1)
MIP
2
3
1
4 5
6
7
8
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 50010
15
20
25
30
35
40
45
50
95
% T
ran
smit
ân
cia
Número de onda (cm-1)
NIP
2 3
1
4
6
7
8
Capítulo 4 144
Figura 4.19 - Cromatograma da separação dos fármacos utilizando acetonitrila e metanol
como fase móvel. Ordem de eluição: cetoprofeno (1), naproxeno (2), fenoprofeno (3),
flurbiprofeno (4) e ibuprofeno (5).
0 2 4 6 8 10 12
0
10
20
30
ACN:H2O (60:40) 0,2 % ácido acético
Ab
sorb
ân
cia
(m
V)
Tempo (min)
1+2
34 5
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0
10
20
30
MeOH:H2O (70:30) 0,2 % ácido acético
Ab
sorb
ân
cia
(m
V)
Tempo (min)
1
2
34 5
Assim, uma das maneiras de alterar o fator de separação para o cetoprofeno e o
naproxeno foi trocando a ACN por MeOH na fase móvel. Utilizando MeOH:H2O (70:30 v/v)
com 0,2 % de ácido acético com fase móvel no modo isocrático, realizou-se a separação
cromatográfica dos cinco compostos de interesse, podendo assim, realizar a quantificação de
todos os analitos utilizando o detector UV.
Capítulo 4 145
Após a otimização da fase móvel, ainda no arranjo unidimensional, foi avaliado o
tempo na qual a válvula seletora ficaria na posição de carregamento para que os interferentes
presentes na urina fossem eliminados. A Figura 4.20 apresenta o cromatograma da injeção de
5 µL de urina na coluna MIP. Podemos observar que o tempo de cinco minutos foi suficiente
para garantir a extração dos analitos e promover um clean up da amostra.
Após essa etapa, o HPLC foi rearranjado para o modo online por column switching e
as condições de análise foram otimizadas conforme apresentado na Tabela 4.2. Como
solvente de extração e clean up foi utilizado água ultrapura com 0,05 % de ácido acético, e
para evitar efeito de memória, após a eluição dos analitos para a coluna analítica, foi realizada
uma limpeza da coluna MIP com metanol 0,5 % de ácido acético.
Neste trabalho foi avaliada a possibilidade de realizar o modo foreflush e backflush de
eluição. A Figura 4.21 mostra a comparação dos cromatogramas nos dois modos de eluição.
Os dois modos apresentaram separação cromatográfica adequada para análise. No modo
foreflush, os picos cromatográficos foram ligeiramente mais estreitos em relação ao modo
backflush, contudo, o sinal cromatográfico foi maior no modo backflush.
Na continuidade do trabalho, o modo backflush foi escolhido para realizar as análises;
a Tabela 4.5 apresenta os parâmetros cromatográficos para os NSAIDs nas condições
otimizada de análise.
Figura 4.20 - Cromatograma da injeção direta da urina na coluna MIP no arranjo
unidimensional.
0 1 2 3 4 5 6
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
1 2 3 4 5 6
0
10
20
30
40
50
Ab
sorb
ân
cia
(m
V)
Tempo (min)
Capítulo 4 146
Figura 4.21 - Cromatograma da urina fortificada com os fármacos no modo de injeção
foreflush e backflush. Ordem de eluição: Cetoprofeno (1), Naproxeno (2), Fenoprofeno (3),
Flurbiprofeno (4) e Ibuprofeno (5).
0 5 10 15 20
0
25
50
75
Ab
sorb
ân
cia
(m
V)
Tempo (min)
Backflush
Foreflush
1
2
3 45
Tabela 4.5 - Parâmetros cromatográficos da separação.
Fármaco tR
(min.) k
k
relativo*
Rs α TF N/m H
(µm) h
CET 10,81 2,63 0,54 - - 1,54 44880 22,28 4,46
NAP 11,61 3,13 0,64 2,51 1,19 1,64 46320 21,59 4,32
FEN 14,41 4,88 1,00 6,99 1,55 1,42 54000 18,52 3,70
FLU 15,76 5,72 1,17 2,78 1,17 1,30 56613 17,66 3,53
IBU 19,87 8,29 1,70 6,89 1,44 1,23 59967 16,68 3,34
Tempo morto (tm) = 1,6 minutos; * krelativo = kfármaco/kpadrão interno; k = fator de retenção; Rs = resolução; α = fator de
separação; TF = fator de alargamento; N/m = número de pratos por metro; H = altura equivalente ao prato; h
=altura reduzida do prato.
Em geral recomenda-se que em um método cromatográfico otimizado o fator de
retenção (k) dos compostos esteja na faixa de 2 – 10. Valores de k < 2 prejudicam a pureza do
sinal cromatográfico devido os possíveis interferentes da matriz, já valores de k > 10 promove
tempo de análise longo, maior largura da base e picos menos intensos. Podemos observar que
os valores de k para os cinco fármacos analisados ficaram dentro dos valores recomendados.
Todos os fármacos apresentaram fator de separação (α) maior que 1,00 e número de
pratos (N) suficientes para promover a separação cromatográfica. Outro parâmetro a ser
analisado é a simetria da banda cromatográfica. Este parâmetro pode ser avaliado pelo fator
Capítulo 4 147
de alargamento (TF). Para fins de quantificação, recomenda-se que TF < 2,00, pois valores
superiores a esse prejudicam a separação cromatográfica e a integração dos sinais devido a
presença de cauda nos picos. Para picos com mesma intensidade e com valores de simetria
próximos de 1,00 recomenda-se uma resolução (Rs) mínima de 1,50. Contudo neste trabalho,
para fins de margem de segurança, a resolução para os pares críticos CET/NAP e FEN/FLU a
resolução foi superior a 2,50.
4.4.3 Validação do método
Na validação, e também na aplicação do método, nenhuma etapa adicional a
centrifugação e diluição da amostra foi realizada na urina antes da análise, exceto na
determinação da forma hidrolisada. A seletividade do método foi avaliada com a injeção de
seis amostras de urina sem a presença dos fármacos (branco) e nenhum interferente eluiu no
tempo de retenção dos analitos de interesse (Figura 4.22).A linearidade foi avaliada através da
curva analítica construída em amostras de urina fortificada em seis níveis diferentes. A Tabela
4.6 apresenta os valores da faixa de quantificação analítica, as equações da regressão linear e
os coeficientes
Tabela 4.6 - Parâmetros da curva analítica para os anti-inflamatórios não esteroidais
(NSAIDs) - cetoprofeno (CET), ibuprofeno (IBU), fenoprofeno (FEN), flurbiprofeno (FLU) e
o naproxeno (NAP) (n = 30).
Fármaco
Faixa
linear
(µg mL-1
)
Dados da
equação
(a, b)
Coeficiente
correlação
(r2)
LD
(µg mL-1
)
LQ
(µg mL-1
)
CET 0,5 – 15 0,07704
-0,1123 0,9992 0,025 0,080
NAP 0,5 – 15 0,41763
0,06537 0,9996 0,010 0,025
FLU 0,5 – 15 0,6139
-0,01005 0,9974 0,070 0,200
IBU 0,5 – 15 0,06877
-0,01374 0,9994 0,50 0,150
a – coeficiente angular; b = coeficiente linear; LD = limite de detecção; LQ = limite de quantificação.
Capítulo 4 148
Figura 4.22 - Cromatograma do branco da urina e da urina fortificada com os fármacos no
nível médio. Ordem de eluição: cetoprofeno (1), naproxeno (2), fenoprofeno (3),
flurbiprofeno (4) e ibuprofeno (5).
0 5 10 15 20-25
0
25
50
75
100 Branco
Ab
sorb
ân
cia
(m
V)
Tempo de retenção (min)
0 5 10 15 20-25
0
25
50
75
100 Urina fortificada
Ab
sorb
ânci
a (m
V)
Tempo de retenção (min)
1
2
34 5
os coeficientes de correlação (r2) para cada fármaco. Para métodos bionalíticos recomenda-se
um r2 superior a 0,98 e os quatro fármacos analisados atenderam esse critério. Além dos
coeficientes de correlação, uma ferramenta complementar de avaliar a linearidade da curva
analítica é a construção do gráfico de resíduos. As Figuras 4.23 – 4.26 apresentam as curvas
analíticas e os gráficos de resíduos para os fármacos avaliados. Podemos observar que não
houve falta de ajuste para o modelo proposto.
Capítulo 4 149
Figura 4.23 - Curva analítica e gráfico de resíduos obtidos para o cetoprofeno.
curva analítica
intervalo de confiança a 95%
intervalo de previsão a 95%
0 3 6 9 12 150.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Áre
a r
ela
tiv
a
Concentração (g mL-1)
0 3 6 9 12 15
-0.02
-0.01
0.00
0.01
0.02
Resí
du
os
Concentração (g mL-1)
Capítulo 4 150
Figura 4.24 - Curva analítica e gráfico de resíduos obtidos para o naproxeno.
curva analítica
intervalo de confiança a 95%
intervalo de previsão a 95%
0 3 6 9 12 150
1
2
3
4
5
6Á
rea r
ela
tiv
a
Concentração (g mL-1)
0 3 6 9 12 15
-0.12
-0.08
-0.04
0.00
0.04
0.08
Resí
du
os
Concentração (g mL-1)
Capítulo 4 151
Figura 4.25 - Curva analítica e gráfico de resíduos obtidos para o flurbiprofeno.
curva analítica
intervalo de confiança a 95%
intervalo de previsão a 95%
0 3 6 9 12 150.00
0.25
0.50
0.75
1.00Á
rea r
ela
tiv
a
Concentração (g mL-1)
0 3 6 9 12 15
-0.030
-0.015
0.000
0.015
0.030
Resí
du
os
Concentração (g mL-1)
Capítulo 4 152
Figura 4.26 - Curva analítica e gráfico de resíduos obtidos para o ibuprofeno.
A sensibilidade do método é o aumento da resposta gerada pelo detector em função do
aumento da concentração do analito. Ela pode ser expressa pela inclinação da curva analítica
na qual quanto maior o valor da inclinação maior será a sensibilidade do método. Podemos
curva analítica
intervalo de confiança a 95%
intervalo de previsão a 95%
0 3 6 9 12 150.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Áre
a r
ela
tiv
a
Concentração (g mL-1)
0 3 6 9 12 15-0.02
-0.01
0.00
0.01
0.02
Resí
du
os
Concentração (g mL-1)
Capítulo 4 153
observar que o flurbiprofeno foi o que apresentou maior sensibilidade enquanto que o
naproxeno foi o que atingiu os menores níveis de detectabilidade com um limite de detecção
(LD) de 10 ng mL-1
e um limite de quantificação de 25 ng mL-1
. Em todas as curvas
analíticas, o limite inferior de quantificação (LIQ) foi estabelecido em 0,50 µg mL-1
e o limite
superior de quantificação (LSQ) em 15,0 µg mL-1
.
Os estudos de precisão intra-dia e inter-dia foram expressas em desvio padrão relativo
(DPR, %), onde os valores aceitáveis são abaixo de 20 % para o nível baixo (LIQ) e 15 %
para os demais níveis (Tabela 4.7).
Os estudos de exatidão intra-dia e inter-dia foram expressos em percentagem de desvio
na qual os valores aceitáveis também são abaixo de 20 % para o nível baixo (LIQ) e 15 %
para os demais níveis (Tabela 4.8).
No ensaio da recuperação absoluta, o qual possui uma abordagem de recuperação real
do processo, amostras de urina foram extraídas no modo online, contudo durante a etapa de
eluição dos analitos da coluna MIP, a tubulação foi desconectada da coluna analítica e os
analitos
Tabela 4.7 - Precisão para o método de análise de NSAIDs em urina (n = 5).
Fármacos Níveis
Precisão
intra-dia 1
(DPR %)
Precisão
intra-dia 2
(DPR %)
Precisão
inter-dia
(DPR %)
CET
Baixo
Médio
Alto
1,50
0,64
1,69
2,82
0,91
1,08
7,06
1,79
2,21
NAP
Baixo
Médio
Alto
1,92
0,13
0,80
1,39
0,76
0,83
1,60
2,37
1,09
FLU
Baixo
Médio
Alto
1,35
0,46
1,79
1,11
1,16
2,78
3,54
4,21
2,82
IBU
Baixo
Médio
Alto
5,16
0,78
0,33
6,28
1,11
2,28
5,45
0,92
1,61
Baixo = 0,5 µg mL-1
, Médio = 9,0 µg mL-1
, Alto = 15,0 µg mL-1
Capítulo 4 154
Tabela 4.8 - Exatidão para o método de análise de NSAIDs em urina (n = 5).
Fármacos Níveis
Exatidão
intra-dia 1
(%)
Exatidão
intra-dia 2
(%)
Exatidão
inter-dias
(%)
CET
Baixo
Médio
Alto
13,24
1,99
1,16
0,39
1,08
4,60
6,42
0,45
2,88
NAP
Baixo
Médio
Alto
8,64
0,18
0,69
9,19
4,13
2,13
8,92
1,88
1,41
FLU
Baixo
Médio
Alto
8,60
3,66
1,59
15,72
4,18
5,00
12,16
0,26
3,30
IBU
Baixo
Médio
Alto
3,59
1,32
0,60
4,67
1,68
1,54
4,13
1,50
1,08
Baixo = 0,5 µg mL-1
, Médio = 9,0 µg mL-1
, Alto = 15,0 µg mL-1
analitos recolhidos em um tubo do tipo eppendorf. O equipamento foi configurado no modo
unidimensional, e as alíquotas foram analisadas. Esses resultados foram comparados com
injeções de padrões nos mesmos níveis de fortificação (Tabela 4.9). Esta não é a forma mais
adequada para realizar a recuperação do método, pois as etapas de coleta do eluente
promovem uma grande diluição da amostra e manuseio do analista. Assim, esses fatores
podem levar a erros aleatórios no experimento. Devido às diluições da amostra, apenas os
níveis médio e alto puderam ser avaliados pela recuperação absoluta, e os resultados ficaram
dentro dos padrões aceitáveis (70 a 120 %).
Outra forma de avaliar a recuperação em sistemas online é através da recuperação
relativa na qual se compara amostras fortificadas da urina com amostras fortificadas de
padrões preparados em água na mesma concentração que a urina e submetidos ao processo de
extração online. Por esse método, a recuperação relativa apresentou os valores de em torno de
100 % para todos os fármacos analisados. A comparação da extração realizada com a coluna
MIP com o NIP foi avaliada, podendo-se observar que o polímero impresso sintetizado possui
uma maior capacidade adsortiva para os NSAIDs em relação ao polímero controle.
Capítulo 4 155
Tabela 4.9 - Recuperações obtidas para os NSAIDs (n = 5).
Baixo = 0,5 µg mL-1
, Médio = 9,0 µg mL-1
, Alto = 15,0 µg mL-1
Em extrações off-line, normalmente o efeito matriz é calculado da mesma forma que
apresentado como recuperação relativa, ou seja, comparando a área dos analitos na presença
da matriz com a área na ausência da matriz. Nos sistemas online, uma maneira de avaliar o
efeito matriz é realizar a injeção de seis lotes diferentes de urina de doadores individuais
fortificadas nos níveis baixo e alto. Esta é uma recomendação da EMEA e após a análise em
sextuplicata em cada nível, o DPR dos seis lotes não deve ser superior a 15 %. (117) Na
Tabela 4.10 temos os dados de precisão e exatidão do ensaio de efeito matriz, e todos os
valores obtidos estão de acordo com os níveis aceitáveis.
O efeito de memória é o resultado da presença dos analitos no sistema cromatográfico
após o término da corrida cromatográfica. Normalmente é apresentado como pequenos picos
cromatográficos no branco da matriz após a injeção dos analitos. Durante a validação foi feita
a injeção do nível alto da curva analítica (15 µg mL-1
) e, posteriormente, o branco da urina.
No
Fármacos Níveis
Recuperação
absoluta (%)
Recuperação
relativa (%)
Recuperação
(%)
MIP MIP NIP
CET
Baixo
Médio
Alto
-
98.81
107,27
99,32
107,14
101,32
57,82
45,63
38,18
NAP
Baixo
Médio
Alto
-
97,62
87,49
96,68
102,03
99,63
63,17
41,79
47,08
FLU
Baixo
Médio
Alto
-
106,37
103,76
102,23
107,14
101,32
64,65
56,50
51,18
IBU
Baixo
Médio
Alto
-
108,64
94,07
96,68
102,03
99,63
58,15
49,98
55,76
FEN (PI) - 90,91 103,94 49,36
Capítulo 4 156
Tabela 4.10 - Avaliação do efeito matriz (n = 6).
Fármacos Nível
Precisão (DPR %) Exatidão (%)
CET Baixo
Alto
8,47
2,88
1,54
1,50
NAP Baixo
Alto
4,38
2,25
6,55
1,92
FLU Baixo
Alto
5,44
3,13
10,86
2,35
IBU Baixo
Alto
4,30
6,73
5,70
4,15
Baixo = 0,5 µg mL-1
, Alto = 15,0 µg mL-1
No cromatograma do branco analisado não houve sinal cromatográfico no tempo de retenção
dos NSAIDs e, portanto o método de limpeza da coluna de extração foi efetivo para a
eliminação do efeito de memória.
A reprodutibilidade intralaboratorial foi avaliada em três níveis de fortificação (baixo,
médio e alto) em sextuplicata de acordo com a decisão da comunidade europeia 2002/657/EC.
(119) O primeiro conjunto de experimentos foi realizado em condições padrões de análise; o
segundo conjunto foi feito com variação da temperatura da sala do equipamento de 22°C para
25°C e no terceiro conjunto as amostras foram preparadas por outro analista. Os valores de
precisão e exatidão deste experimento estão apresentados na Tabela 4.11, ficando abaixo de
20 % para o nível baixo e 15 % para os demais níveis.
Esses NSAIDs possuem uma ampla faixa de dosagem que varia de 150 a 3200 mg por
dia. A faixa de trabalho da curva analítica foi de 0,5 a 15 µg mL-1
que, aplicando o fator de
diluição de 50 %, corresponde à quantificação dos fármacos na urina entre 1,0 a 30 µg mL-1
.
Neste trabalho não foi aplicada uma maior faixa de trabalho devido a coluna analítica possuir
2,1 mm de diâmetro interno e, altas concentrações dos fármacos levariam ao alargamento de
bandas cromatográficas, o que prejudicaria na quantificação dos analitos. Assim, foi
necessário avaliar a influência da injeção direta e da diluição das amostras de urina (Tabela
4.12). Foi realizada a variação em um nível abaixo (sem diluição) e um acima (diluição
urina:água (25:75, v/v)) em relação ao valor utilizado na validação (diluição urina:água
(50:50, v/v)). As análises foram realizadas com a urina fortificada com 10 µg mL-1
em
quintuplicatas,
Capítulo 4 157
Tabela 4.11 - Resultados da reprodutibilidade intralaboratorial (n = 6).
Fármacos Nível
Concentração média
(µg mL-1
)
Precisão
(DPR %)
Exatidão
(%)
CET
Baixo
Médio
Alto
0,60
8,55
13,75
17,94
10,24
12,97
19,14
5,64
8,31
NAP
Baixo
Médio
Alto
0,54
8,61
14,26
5,64
5,12
7,03
7,05
4,33
4,95
FLU
Baixo
Médio
Alto
0,57
10,21
16,34
4,42
7,58
5,26
15,17
13,47
8,97
IBU
Baixo
Médio
Alto
0,54
7,90
13,46
5,93
2,54
1,54
7,82
12,22
10,26
Baixo = 0,5 µg mL-1
, Médio = 9,0 µg mL-1
, Alto = 15,0 µg mL-1
Tabela 4.12 - Avaliação da injeção direta e diluição da urina (n = 5).
*Diluição (urina:água, v/v).
Fármacos Nível Diluição
amostra*
Concentração média
(µg mL-1
)
Precisão
(DPR %)
Exatidão
(%)
CET
–
0
+
-
50:50
25:75
8,53
9,33
10,75
0,15
0,68
0,09
14,70
6,66
7,45
NAP
–
0
+
-
50:50
25:75
9,09
9,27
10,21
0,36
2,15
3,40
9,11
7,32
2,11
FLU
–
0
+
-
50:50
25:75
8,65
8,62
8,96
0,37
0,99
0,08
13,54
13,84
10,45
IBU
–
0
+
-
50:50
25:75
8,52
8,76
10,06
0,17
0,74
2,08
14,82
12,38
0,60
Capítulo 4 158
quintuplicatas, e os valores de precisão e exatidão ficaram abaixo de 15 %. Entre os níveis
avaliados, a injeção direta da urina apresentou a maior variação nos resultados. Assim, para
realizar a quantificação de amostras de urina com concentrações inferiores a 1,0 µg mL-1
poderia realizar a injeção direta da amostra de urina no HPLC. Similarmente, para amostras
nas quais a dosagem do fármaco fosse elevada, seria necessário um maior fator de diluição na
urina para que as concentrações se enquadrassem dentro da faixa analítica.
Os ensaios de robustez foram realizados no nível médio de fortificação (9,0 µg mL-1
) e
a influência dos sete parâmetros analíticos foram calculados em função da concentração dos
fármacos, tempo de retenção, fator de retenção e fator de retenção relativo. A comparação e a
avaliação dos resultados da robustez estão apresentadas na Tabela 4.13.
Tabela 4.13 - Resultados da avaliação da robustez (n = 3).
Parâmetro avaliado Fármacos
Desvio padrão (DP)
Robustez Reprodutibilidade
intralaboratorial
Concentração
(µg mL-1
)
CET
NAP
FLU
IBU
0,35
1,38
0,85
0,06
0,77
0,34
0,81
0,20
Tempo de retenção
(min)
CET
NAP
FEN
FLU
IBU
0,744
0,925
1,823
2,283
3,544
0,040
0,040
0,038
0,037
0,038
Fator de retenção (k)
CET
NAP
FEN
FLU
IBU
0,390
0,492
1,013
1,279
2,001
0,025
0,025
0,024
0,023
0,024
Fator de retenção
relativo
CET
NAP
FLU
IBU
0,0246
0,0244
0,0141
0,0435
0,0026
0,0022
0,0011
0,0033
Capítulo 4 159
Segundo a abordagem do teste de Youden, sempre que o desvio padrão do ensaio da
robustez for significativamente maior que o desvio padrão, no mesmo nível, nas condições de
reprodutibilidade intralaboratorial pode-se deduzir que o conjunto de fatores escolhidos tem
influência no resultado, mesmo que isoladamente cada fator não influencie
significativamente. (119)
De acordo com os resultados apresentados na Tabela 4.13, observa-se que para o
cetoprofeno e ibuprofeno os mesmos se mostraram robustos frente à concentração dos
fármacos. Já o desvio padrão das diferenças para o naproxeno e flurbiprofeno foram
superiores ao da reprodutibilidade intralaboratorial e, portanto, não são robustos. A Figura
4.27 apresenta graficamente quais são os fatores que possuem maior influência na
concentração dos fármacos. Podemos observar que o comprimento de onda (efeito F/f)
apresenta maior influência, principalmente para o naproxeno e o flurbiprofeno. Assim,
resolvemos investigar a origem desse grande efeito nos resultados desses dois fármacos.
A Figura 4.28 apresenta os gráficos das diferenças em relação a áreas absolutas
coletadas na integração dos cromatogramas. Podemos observar que o efeito do comprimento
de
Figura 4.27 - Efeito dos parâmetros avaliados na robustez na concentração dos fármacos.
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
A/a B/b C/c D/d E/e F/f G/g
Cetoprofeno
-3
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
A/a B/b C/c D/d E/e F/f G/g
Naproxeno
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
A/a B/b C/c D/d E/e F/f G/g
Flurbiprofeno
-0,02
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
A/a B/b C/c D/d E/e F/f G/g
Ibuprofeno
Capítulo 4 160
Figura 4.28 - Efeito dos parâmetros avaliados na robustez na área absoluta dos fármacos.
de onda para o cetoprofeno, ibuprofeno, e o fenoprofeno (PI) apresentam valores positivos, e
que para o naproxeno e o flurbiprofeno apresentam efeito com valores negativos. Assim,
podemos concluir que ao realizar o quociente da área do fármaco com a área do padrão
interno para a obtenção da área relativa, haverá uma correção do efeito para os fármacos que
tiverem valores de diferença no mesmo sentido que o PI, e o efeito aumentará para os
compostos que vão em direção contraria ao PI.
-20000
-10000
0
10000
20000
30000
40000
A/a B/b C/c D/d E/e F/f G/g
Dif
eren
ça
Cetoprofeno
-150000
-100000
-50000
0
50000
A/a B/b C/c D/d E/e F/f G/g
Naproxeno
-10000
-8000
-6000
-4000
-2000
0
2000
4000
A/a B/b C/c D/d E/e F/f G/g
Flurbiprofeno
-20000
-10000
0
10000
20000
30000
A/a B/b C/c D/d E/e F/f G/g
Ibuprofeno
-30000
-20000
-10000
0
10000
20000
30000
40000
A/a B/b C/c D/d E/e F/f G/g
Fenoprofeno
Capítulo 4 161
Outro ponto interessante observado na Figura 4.28 é que a vazão da coluna de
extração (Efeito E/e) também apresenta influência nos resultados, porém nos gráficos
referentes aos efeitos na concentração (Figura 4.27) esse efeito é corrigido e minimizado.
Concluindo, podemos dizer que na determinação dos NSAIDs deve-se realizar um
controle rígido dos parâmetros avaliados na robustez, principalmente em relação ao
comprimento de onda, pois foi o parâmetro que mais apresentou influência na variação da
concentração dos analitos.
No ensaio da robustez em relação ao tempo de retenção dos fármacos, o efeito da
variação da proporção de metanol na fase móvel (efeito C/c) e da diminuição da vazão da
bomba analítica (efeito B/b) foram os fatores que mais influenciaram. Já em relação ao fator
de retenção, houve uma correção do efeito da vazão da bomba analítica; contudo o efeito C/c
ainda influenciava nos deslocamentos dos picos cromatográficos. Podemos observar que
quanto maior o tempo de retenção do fármaco na coluna analítica, maior é o desvio padrão
das diferenças. Calculando o fator de retenção relativo, no qual se faz a correção do tempo de
retenção em relação ao PI, podemos observar que o efeito crescente no desvio padrão das
diferenças deixou de ser pronunciado, porém tanto no tempo de retenção, fator de retenção e
fator de retenção relativo, os desvios padrões na robustez foram maiores que os do ensaio de
reprodutibilidade intralaboratorial.
A Tabela 4.14 apresenta os tempos de retenção dos compostos avaliados como
possíveis interferentes na determinação dos NSAIDs no arranjo online. Esses valores são uma
estimativa através da comparação dos tempos de retenção dos interferentes no arranjo
unidimensional, pois no sistema online não foi observado sinal cromatográfico referente aos
interferentes fazendo o monitoramento dos comprimentos de onda de 220 e 254 nm (Figura
4.29). Assim, podemos concluir que a coluna MIP foi seletiva na retenção dos NSAIDs e na
eliminação dos possíveis interferentes da análise.
Tabela 4.14 - Avaliação de interferentes na análise dos NSAIDs.
Composto tR (min)
Cafeína 8,12
Ácido acetilsalicílico 8,27
Norfluoxetina 8,96
Nicotina 11,37
Fluoxetina 26,15
Capítulo 4 162
Figura 4.29 - Cromatograma do branco da urina fortificada com os interferentes e
monitorados nos comprimentos de onda de 220 e 254 nm.
0 5 10 15 20 25 30
0
2
4
6
8
10
Ab
sorb
ânci
a (m
V)
Tempo de retenção (min)
220 nm
254 nm
A estabilidade dos fármacos foi avaliada durante todo o processo de validação
analítica. Para cada ensaio foram preparadas três amostras de urina em dois níveis de
fortificação (baixo e alto) com injeção em duplicata. A Tabela 4.15 mostra o estudo de
estabilidade de curta duração na qual compara a percentagem de desvio de uma amostra de
urina recém-fortificada e analisada com uma amostra fortificada e deixada em temperatura
ambiente da sala de preparo de amostra durante 6 h e posteriormente analisada.
Tabela 4.15 - Estabilidade de curta duração da amostra fortificada (n = 3).
Fármacos Nível
Desvio (%)
CET Baixo
Alto
12,27
8,54
NAP Baixo
Alto
9,65
5,09
FLU Baixo
Alto
13,75
4,98
IBU Baixo
Alto
7,13
6,46
Baixo = 0,5 µg mL-1
, Alto = 15,0 µg mL-1
Capítulo 4 163
A Tabela 4.16 mostra a estabilidade pós-processamento das amostras de urina. A
Análise 1 refere-se a urina fortificada e diluída deixada a temperatura do laboratório de
preparo de amostras por 6 h. Na Análise 2, as amostras ficaram por 24 h no amostrador
automático do HPLC à temperatura de 15°C antes de serem analisadas.
A estabilidade dos fármacos após ciclos de congelamento e descongelamento da
amostra também foram avaliados. Primeiramente a amostra recém-preparada foi analisada,
depois a urina foi congelada por 24 h, descongelada a temperatura ambiente e analisada
novamente. Este ciclo se repetiu mais duas vezes e está presente na Tabela 4.17.
Tabela 4.16 - Estabilidade pós-processamento da amostra fortificada (n = 3).
Fármacos Nível
Desvio (%)
Análise 1
Desvio (%)
Análise 2
CET Baixo
Alto
8,11
4,46
13,44
7,54
NAP Baixo
Alto
1,08
5,25
6,59
7,33
FLU Baixo
Alto
11,92
3,06
14,01
8,97
IBU Baixo
Alto
9,26
0,92
17,06
4,00
Baixo = 0,5 µg mL-1
, Alto = 15,0 µg mL-1
. Analise 1: amostra a temperatura ambiente por 6
h. Análise 2: amostra no amostrador automático a 15°C por 20 h.
Tabela 4.17 - Estabilidade da amostra após ciclos de congelamento/descongelamento (n = 3).
Fármacos Nível
Desvio (%)
Ciclo 1
Desvio (%)
Ciclo 2
Desvio (%)
Ciclo 3
CET Baixo
Alto
6,30
8,90
4,15
4,46
14,01
4,71
NAP Baixo
Alto
11,02
12,16
3,90
1,08
6,00
2,41
FLU Baixo
Alto
12,77
10,82
10,66
3,06
10,52
0,75
IBU Baixo
Alto
5,39
3,57
8,92
0,94
5,60
0,81
Baixo = 0,5 µg mL-1
, Alto = 15,0 µg mL-1
Capítulo 4 164
A estabilidade de longa duração visa assegurar que as amostras permaneçam estáveis
durante o inicio da validação até a última amostra ser analisada durante o processo. Assim, foi
calculada a percentagem de desvio após a amostra de urina fortificada permanecer congelada
por 60 dias (Tabela 4.18).
As soluções padrões intermediárias dos fármacos e do padrão interno armazenadas na
geladeira apresentaram estabilidade com desvio abaixo de 14,56 % por um período de 20 dias
e as soluções estoque armazenadas em congelador apresentaram estabilidade abaixo de 12,87
% no período de 60 dias.
Em todos os experimentos de estabilidade os DPR de cada ensaio ficaram abaixo de
16,13 %.
4.4.4 Determinação dos fármacos em amostras de urina
Os resultados das amostras de urina coletadas de seis voluntários que administraram
uma dose de cetoprofeno, naproxeno ou ibuprofeno estão apresentados na Tabela 4.19. Foram
analisadas amostras na forma livre e também na forma desconjugada após procedimento com
hidrólise básica para promover a quebra de ligação dos fármacos com o ácido glucorônico.
Podemos observar que após o processo de hidrólise, uma maior quantidade de fármaco é
quantificada. Além disso, um decaimento da concentração dos fármacos ao longo do tempo
também foi observado. Os resultados obtidos com as amostras reais estão em concordância
com outros trabalhos relatados na literatura. (219, 221, 223)
Tabela 4.18 - Estabilidade de longa duração da amostra fortificada (n = 3).
Fármacos Nível
Desvio (%)
CET Baixo
Alto
9,01
4,77
NAP Baixo
Alto
6,81
3,34
FLU Baixo
Alto
6,07
4,12
IBU Baixo
Alto
2,84
0,64
Baixo = 0,5 µg mL-1
, Alto = 15,0 µg mL-1
Capítulo 4 165
Tabela 4.19 - Concentrações dos NSAIDs em urina após administração de comprimidos.
Voluntário Coleta da
amostra (h)
Concentração na urina (µg mL-1
)
Forma livre Forma desconjugada
Cetoprofeno 100 mg
C1
2 – 4
6 – 8
10 – 12
20,75
8,25
1,13
61,87
35,52
5,43
C2
2 – 4
6 – 8
10 – 12
28,61
10,32
4,14
85,73
27,31
17,09
Naproxeno 250 mg
N1
2 – 4
6 – 8
10 – 12
8,66
4,05
2,15
85,35
64,79
22,62
N2
2 – 4
6 – 8
10 – 12
10,43
6,22
3,41
93,98
47,52
16,23
Ibuprofeno 200 mg
I1
2 – 4
6 – 8
10 – 12
7,36
3,87
1,70
50,40
28,26
10,06
I2
2 – 4
6 – 8
10 – 12
12,17
5,85
1,12
54,36
37,18
24,27
A integridade e a validade dos resultados da aplicação foram avaliadas pelo
monitoramento de amostras de controle de qualidade. A Tabela 4.20 mostra a variação das
amostras preparadas em quatro níveis diferentes. Segundo a RE 899, 67 % das amostras de
CQ devem estar com valores de desvio abaixo de 15 %. Podemos observar que apenas o nível
CQLIQ para o naproxeno apresentou valor acima do permitido, mas mesmo assim, o conjunto
de amostras deste fármaco ficou com 75 % dos valores dentro do permitido.
Capítulo 4 166
Tabela 4.20 - Amostras de controle de qualidade.
Fármacos CQ
Concentração
nominal
(µg mL-1
)
Concentração
média
(µg mL-1
)
Variação
(%)
CET
CQLIQ
CQB
CQM
CQA
0,50
1,50
6,00
12,00
0,56
1,53
6,26
11,73
2,73
1,68
4,32
2,25
NAP
CQLIQ
CQB
CQM
CQA
0,50
1,50
6,00
12,00
0,58
1,51
6,26
11,93
15,35
0,99
4,36
0,62
FLU
CQLIQ
CQB
CQM
CQA
0,50
1,50
6,00
12,00
0,55
1,52
6,30
12,11
9,56
1,41
4,92
0,95
IBU
CQLIQ
CQB
CQM
CQA
0,50
1,50
6,00
12,00
0,56
1,41
5,80
11,69
11,90
6,24
3,37
2,57
4.5 Aplicação do método MISPE-LC-MS/TOF
Nos dias atuais, a hifenação entre a HPLC e a espectrometria de massas (MS) é uma
poderosa ferramenta analítica empregada em diversos métodos de análise, pois concilia as
vantagens da cromatografia líquida (seletividade e eficiência de separação) e espectrometria
de massas (seletividade e detectabilidade). Neste sentido, resolvemos avaliar a potencialidade
da utilização do sistema bidimensional para extração e separação com monitoramento por
espectrometria de massas. O sistema online MISPE-LC-MS/TOF consistiu de um HPLC série
Prominence 20A da Shimadzu (Kyoto, Japão). O sistema possui três bombas LC-20AD, um
amostrador automático SIL-20A, um forno cromatográfico CTO-20A, um detector UV SPD-
20A e uma controladora CBM-20A. As bombas, o amostrador e o detector foram acoplados a
uma válvula seletora de seis vias e duas posições. O software LC-Solution (Shimadzu)
controlou os módulos do sistema cromatográfico e também a válvula seletora.
Capítulo 4 167
A análise no MS foi realizada utilizando o analisador de massa quadrupolo/tempo de
voo (QqTOF) da Bruker Daltonics operando no modo MS, e equipado com uma interface de
electrospray (ESI) no modo de íon negativo. Os parâmetros otimizados no MS foram 4 kV de
tensão capilar, 8 L h-1
de gás dessolvatação, temperatura de solvatação de 200°C e 4 bar de
pressão de nebulização. O MS foi operado no intervalo de 50 a 1550 m/z e o tempo de
transferência de íons a partir de quadrupolo para TOF foi de 50 µs. Neste trabalho foi
empregada a coluna MISPE (20 mm x 4,6 mm) seletiva para a extração dos profenos e a
coluna analítica NST C 8 ( 5 mm 2, mm 5 μm). As condições de vazão das bombas,
programação das válvulas foram as mesmas desenvolvidas e otimizadas para o sistema
MISPE-LC-UV. A proporção da fase móvel empregada foi de MeOH:H2O (65:35, v/v)
contendo 0,1 % de ácido acético.
A Figura 4.30 ilustra o cromatograma do íon extraído da extração dos NSAIDs em
água.(
Figura 4.30 – Cromatograma do íon extratido no modo MS da extração online dos NSAIDs
(500 ng mL-1
) fortificados em água (sinal mais intenso) e urina humana diluída em água (sinal
menos intenso).
Capítulo 4 168
água e em urina humana diluída 50 % em água conforme o método desenvolvido e validado.
Pode-se observar que houve um grande efeito matriz no experimento, no qual uma supressão
de até 70 % do sinal analítico foi observada. Assim, estudos mais aprofundados necessitam
ser realizados nesta nova configuração do equipamento para avaliar métodos de minimizar o
efeito matriz e também se o mesmo apresenta grande variação em lotes diferentes de amostra.
4.6 Conclusão
O MIP amino-funcionalizado foi sintetizado através da impressão do ibuprofeno
utilizando o método sol-gel. O método de remoção do template das cavidades seletivas foi
efetivo e o polímero sintetizado pode ser aplicado na extração seletiva do ibuprofeno e de
mais quatro fármacos análogos pertencente a classe dos NSAIDs (cetoprofeno, naproxeno,
fenoprofeno e flurbiprofeno).
O material sintetizado apresentou bons resultados de seletividade quando comparado
com o NIP, e também na retenção dos fármacos de interesse com eliminação dos interferentes
presentes na urina quando aplicados como fase extratora em SPE.
O método desenvolvido (MISPE-LC-UV) segue a tendência de análises simples,
rápidas, reprodutíveis e seletivas. Neste trabalho a quantidade de amostra de urina utilizada
foi pequena comparada com outros métodos de extração. Para cada amostra foram recolhidas
alíquotas de 500 µL de urina e apenas 5 µL da amostra diluída foram injetadas no sistema de
column switching. Além disso, a automação do sistema online minimizou o número de etapas
comumente realizadas nos procedimentos da SPE fornecendo um tempo total de análise
(extração e separação) de apenas 22 minutos.
O método desenvolvido apresentou resultados adequados para os parâmetros
validados. Durante as análises, deve-se garantir que os parâmetros do método (principalmente
o comprimento de onda monitorado) estejam em conformidade com os valores pré-
determinados para não prejudicar a quantificação dos fármacos.
A aplicabilidade do método foi demonstrada através da análise de amostras reais de
urina, coletadas de voluntários que fizeram a ingestão oral dos fármacos e analisadas na forma
livre e conjugada.
Também foi realizada a demonstração da potencialidade de aplicar o método de
extração e separação juntamente com as vantagens da espectrometria de massas (MISPE-LC-
MS/TOF).
Capítulo 5
Preparo e avaliação de partículas de sílica sub 1 µm
com aplicabilidade em cromatografia líquida de
ultra alta eficiência
Capítulo 5 171
5.1 Introdução
Atualmente, independente do campo de atuação, o número de amostras que necessitam
ser processadas e analisadas vem crescendo, continuamente. Adicionalmente, as cobranças
por redução no tempo das análises também vem sendo discutidas com o intuito de
desenvolver procedimentos rápidos e eficazes para análise qualitativa e quantitativa. Nesse
contexto, a HPLC tem se destacado por ser uma técnica de análise na qual se conseguem
determinar compostos polares e apolares, de baixa e alta massa molecular, devido as diversas
combinações possíveis entre fase móvel e estacionária. No entanto, o tempo da corrida
cromatográfica em análises convencionais geralmente é acima de 10 minutos e pode chegar
próximo de 40 – 50 minutos dependendo da complexidade da separação. Assim, é importante
desenvolver métodos rápidos ou ultra rápidos que forneçam tempo de análise inferior a 5
minutos, por exemplo. (56)
As abordagens e estratégias para diminuir o tempo de análise em HPLC incluem
aumento da vazão da fase móvel, colunas analíticas mais curtas, partículas com diâmetro
reduzido e elevação da temperatura de análise. Cada um destes parâmetros independentes está
inter-relacionado com os parâmetros dependentes (tempo de análise, pressão no sistema e
eficiência da coluna). (229) A Tabela 5.1 apresenta as relações entre os seis parâmetros, o
qual é seguida por uma breve descrição de cada um dos parâmetros e o seu papel em análise
rápida em HPLC.
Talvez a maneira mais óbvia de alcançar análises rápidas em HPLC é aumentar a
vazão da fase móvel. Pela Tabela 5.1, a vazão é inversamente proporcional ao tempo de
análise; assim, dobrar a vazão na coluna resultará em reduzir para a metade o tempo de
análise. Infelizmente, a vazão também é proporcional à queda de pressão através da coluna e,
como
Tabela 5.1 – Correlação entre os parâmetros dependentes e independentes.
Comprimento
da coluna (L) Vazão (Fc)
Tamanho da
partícula (dp)
Temperatura
da coluna (T)
Tempo de
análise L 1/ Fc Não relatado 1/T
x
Pressão L Fc 1/(dp)2
1/T
Eficiência (N) L Curva de
van Deemter 1/dp T
Fonte: Adaptado de (33, 229).
Capítulo 5 172
como resultado, a pressão no sistema aumenta. Muitos métodos de HPLC operam acima da
vazão ótima para conseguir análises rápidas; entretanto, deve-se tomar cuidado para que esse
aumento não prejudique a resolução cromatográfica e, também, esteja dentro dos parâmetros
permitidos da coluna e do sistema.
O aumento da temperatura de análise da coluna cromatográfica promove a redução da
viscosidade da fase móvel e, consequentemente, uma diminuição na pressão do sistema.
Assim, vazões mais elevadas podem ser empregadas dentro das condições permitidas pelo
sistema. Outro fator importante é o melhoramento da transferência de massa do analito (termo
C da equação de van Deemter). Como resultado, há um aumento na eficiência da coluna
permitindo utilizar vazões mais altas. Adicionalmente, o aumento da temperatura promove
uma menor retenção dos analitos e, consequentemente, análises mais rápidas. O uso da
temperatura em LC possui a limitação da estabilidade das fases estacionárias. Fases baseadas
em sílica apresentam problemas de dissolução em temperaturas acima de 60 – 70°C. Além
disso, a maioria dos sistemas cromatográficos possui a temperatura máxima de uso entre 80 –
85°C. Como já discutido anteriormente, outros suporte cromatográficos tem sido
desenvolvidos para utilizar altas temperaturas em sistemas de cromatografia líquida de alta
temperatura (high temperature liquid chromatography, HTLC). (230, 231)
O tempo de retenção dos analitos e a eficiência cromatográfica são diretamente
relacionados com o comprimento da coluna. A diminuição do tamanho da coluna para
conseguir análises rápidas é aceitável desde que haja eficiência suficiente para promover a
separação cromatográfica numa dada aplicação. Além disso, a diminuição no comprimento da
coluna fornece menor pressão no sistema.
O termo C da curva de van Deemter referente à transferência de massa é o efeito
dominante na eficiência da coluna quando se utiliza vazões elevadas. A diminuição do
diâmetro da partícula fornece uma melhoria na transferência de massa. Como resultado, o
termo C é minimizado levando a um aumento na eficiência da coluna (maior N) e,
consequentemente, um menor valor de H conforme apresentado na Equação 20 e Figura 5.1.
dp
L
H
LN
h (20)
Capítulo 5 173
Figura 5.1 – Representação hipotética da curva de van Deemter com diferentes diâmetros de
partícula.
Fonte: Adaptado de (232).
De acordo com a Equação 21, o diâmetro da partícula é inversamente proporcional a
velocidade linear ótima (uótima) na separação cromatográfica. Assim, partículas pequenas
fornecem uma uótima maior e, como resultado, vazões elevadas podem ser empregados sem
perder eficiência.
dp
mDu
(21)
onde ʋ é a velocidade reduzida da fase móvel e Dm é o coeficiente de difusão do soluto na fase
móvel.
O tempo de análise pode ser definido como o tempo de retenção do analito mais retido
na coluna. Assim, o tempo de análise sob condição isocrática pode ser representado pela
Equação 22:
dpD
Lkt
mR
)1( (22)
onde k é o fator de retenção do analito e L é o comprimento da coluna.
Capítulo 5 174
Observa-se a relação direta entre o tempo de análise e o tamanho da partícula. Uma
diminuição no tamanho da partícula conduz a uma redução do tempo de análise nas condições
ótimas.
A desvantagem de usar partículas pequenas é a pressão requerida para atingir a vazão
ótima de separação. A queda de pressão através de uma coluna, P, necessário para se obter
uma velocidade linear de fase móvel ótima, uótima, é dada pela Equação 23:
dpdp
)dp(
dpP
22ótimaótimam
ótima
DNhu
L (23)
onde η é a viscosidade da fase móvel e é a resistência a vazão.
Observa-se que a queda de pressão na coluna é inversamente proporcional ao
quadrado do diâmetro da partícula. Assim, uma pequena diminuição no tamanho do suporte
cromatográfico gera um grande aumento na pressão do sistema.
Anspach utilizou as Equações 22 e 23 para estimar a influência da diminuição no
tamanho da partícula na pressão requerida e no tempo de análise. (233) O gráfico apresentado
na Figura 5.2 mostra o resultado da pressão e tempo de análise em função do diâmetro da
partícula assumindo L = 15 cm, = 1000, η = 1 cP, Dm = 6,6 10-6
cm2 s
-1, ʋ = 2,5, h = 2,3 e
balbla
Figura 5.2 - Pressão requerida (eixo esquerdo) e tempo de análise (eixo direito) em função do
tamanho da partícula.
Fonte: Adaptado de (233).
Capítulo 5 175
k = 10 ou 20. Pelo gráfico nota-se que quando o tamanho da partícula é reduzido abaixo de
1 µm, a pressão na coluna aumenta rapidamente enquanto que a redução no tempo de análise
é pequena.
Devido a maior eficiência com o uso de partículas com diâmetro menor, pode-se
diminuir o comprimento da coluna (diminuindo a pressão no sistema) sem comprometer a
separação cromatográfica. A Figura 5.3 ilustra a separação de cinco alquilbenzenos com
colunas de diferente tamanho de partículas e diâmetro interno de 2,1 mm. Observa-se que a
resolução média não apresentou grande variação entre as três colunas; entretanto, o tempo de
colunas.
Figura 5.3 – Separação de alquilbenzenos utilizando colunas com diferentes tamanho de
partículas sob condições isocráticas.
Fonte: Adaptado de (234).
Capítulo 5 176
análise foi reduzido de 15 minutos (partícula de 5 µm) para abaixo de 2 minutos (partícula de
1,7 µm).
Outro exemplo da vantagem de colunas curtas com partículas pequenas é ao comparar
a redução de coluna contendo partículas de 5 µm e 1 µm. Assumindo o fato que uma coluna
de 250 mm contendo partículas de 5 µm gera 20000 pratos sob condições de vazão ótima, ao
reduzir o tamanho da partícula para 1 µm e sob condições ótimas, a coluna necessitaria de 50
mm de comprimento para gerar os mesmos 20000 pratos. Como resultado, o tempo de análise
cromatográfica utilizando coluna de 1 µm seria cerca de 25 vezes menor que a coluna
contendo partículas de 5 µm. Entretanto, um aumento na pressão em torno de 25 vezes
também é esperado. (234) Atualmente, os métodos de análise rápida em LC utilizam a
estratégia de colunas curtas (L = 20 – 50 mm) contendo partículas pequenas (sub 2 µm)
empregando vazões elevadas sem perder a eficiência e resolução cromatográfica.
Por outro lado, se o objetivo da análise é aumentar a eficiência e resolução de um
método, colunas com tamanho tradicional (L = 150 – 300 mm) com as partículas pequenas
tem demonstrado ser um a boa opção, apesar da limitação instrumental devido a pressão.
Genômica, proteômica e metabolômica são algumas áreas de aplicação nos quais é importante
utilizar método com grande capacidade de pico. (56)
O primeiro trabalho reportando o uso de partículas sub 2 µm foi conduzida por
Bidlingmeyer em 1967. (235, 236) Entretanto, resultados irreprodutíveis foram obtidos
devido a carência de desenvolvimento de métodos efetivos de empacotamento de colunas com
partícula pequena. A primeira separação bem sucedida empregando ultra alta eficiência foi
realizada pelo grupo de Jorgenson em 1997, o qual empregou uma coluna capilar ( 520 mm x
30 µm i.d.) contendo partículas de sílica não porosa de 1,5 µm. (237) A coluna gerou pratos
na faixa de 140000 – 190000 na separação de moléculas pequenas com tempo de análise
abaixo de 10 minutos e pressão no sistema de 4100 bar (60000 psi) com a vazão próxima do
valor ótimo. Alguns anos mais tarde (2003), a pressão máxima do sistema foi aumentada
permitindo realizar a separação com uma pressão de 7000 bar (103000 psi) e tempo de análise
inferior a 4 minutos com um N de aproximadamente 300000 empregando uma coluna 430
mm x 30 µm x 1,0 µm, C18 não poroso. (232, 238)
O grupo de pesquisa de Milton Lee realizou diversos trabalhos empregando colunas de
alta eficiência. Em seus trabalhos normalmente colunas com partículas não porosas e com
comprimento inferiores a 150 mm eram empregadas para fornecer análises rápidas (menor
que 1 minuto). (239, 240) Adicionalmente, o grupo também avaliou o uso de temperaturas
Capítulo 5 177
superiores a 60°C nas separações cromatográficas com alta eficiência. A Figura 5.4
exemplifica uma aplicação de uma coluna capilar com partículas C18 não porosa (150 mm x
50 µm x 1,0 µm) realizada na temperatura de 80°C e pressão de 2413 bar com tempo de
análise de 36 segundos. (241)
Anspach avaliou a separação cromatográfica de uma mistura teste em diferentes
pressões empregando uma coluna (150 mm x 1 mm i.d.) contendo partículas de sílica porosa
de 1,5 µm de diâmetro (Figura 5.5). (233) A separação cromatográfica realizada a 345 bar
(5000 psi), limite máximo dos sistemas cromatográficos convencionais, forneceu a separação
cromatográfica em 10 minutos gerando uma eficiência de aproximadamente 25000
bafdfdsflbal.
Figura 5.4 – Separação de compostos barbituricos em coluna capilar (150 mm x 50 µm x 1,0
µm, C18 não poroso) com temperatura de 80°C.
Fonte: Adaptado de (241).
Figura 5.5 – Separação cromatográfica em diferentes pressões. Coluna (150 mm x 1,0 mm x
1,5 µm, C18).
Fonte: Adaptado de (233).
Capítulo 5 178
pratos/coluna com uma velocidade linear de 1,2 mm s-1
. Ao elevar a velocidade linear para
2,0 mm s-1
a pressão foi aumentada para 621 bar (9000 psi) gerando uma eficiência de 30000
pratos/coluna. A velocidade linear ótima para a coluna foi atingida com 2,7 mm s-1
, com N =
37000, pressão de 966 bar (14000 psi) e tempo de análise inferior a 4 minutos. Ao empregar
velocidade linear de 4 mm s-1
, acima do valor ótimo, o tempo de análise foi reduzido para 3
minutos e não foi observado perda da eficiência cromatográfica. Em contrapartida, a pressão
do sistema foi elevada para 1380 bar (20000 psi).
Wu comparou a eficiência de colunas contendo partículas de sílica C18 porosa e não
porosa com diâmetros de 3,0 e 1,5 µm. (242) Como resultado, foi observado que as partículas
não porosas; apresentam melhor desempenho em vazões elevadas em relação as partículas
porosas, no entanto, essa diferença é diminuída quando o tamanho de partícula é de 1,5 µm.
Como já discutido, essa melhor eficiência é alcançada devido a rápida transferência de massa
nas colunas contendo partículas não porosas. Em contrapartida, a capacidade de amostra
injetada na coluna é cerca de 15 vezes maior quando utilizadas partículas porosas.
Adicionalmente, os analitos apresentam maior retenção em partículas porosas do que em
partículas não porosas. Assim, colunas com partículas de sílica não porosa necessitam de
maior percentagem de fase aquosa para promover uma melhor retenção dos analitos. Além
disso, partículas não porosas geram uma maior pressão quando comparadas com as partículas
de sílica porosa. (234)
Mellors realizou a comparação de colunas contendo partículas de sílica não porosa de
1 µm com partículas de sílica híbrida porosa de 1,5 µm. Foi observado que ambas as colunas
apresentaram resultados similares para altura reduzida do prato e resistência mecânica em
pressão de 4500 bar. (243)
Shen utilizou uma coluna (100 mm x 50 µm x 0,8 µm) de sílica C18 porosa na área de
proteômica. Uma grande capacidade de pico foi observada nesta aplicação. (244) Cintron
realizou a síntese de partículas não porosas de sílica com diâmetro médio de 0,67 µm; após a
funcionalização com C18, preparou uma coluna 90 mm x 50 µm contendo as partículas sub 1
µm. Empregando um sistema de UHPLC capaz de chegar em 3500 bar (50000 psi) foi
possível promover a separação cromatográfica em 3,2 minutos com uma eficiência de 500000
pratos por metro. Apesar da alta pressão utilizada, a velocidade linear empregada na análise
(1,3 mm s-1
) foi inferior a velocidade linear ótima para a coluna (3,0 mm s-1
). (245)
Atualmente, os sistemas comercialmente disponíveis para utilizar colunas de ultra alta
eficiência possuem a pressão máxima de 1000 a 1350 bar. Nesse contexto apresentado, a
Capítulo 5 179
UHPLC, juntamente com as pesquisas em novos materiais, fornece grandes possibilidades de
evolução nas diversas áreas de aplicação (ambiental, biológica, farmacêutica, proteômica,
metabolômica, genômica).
5.2 Objetivos
Nesta parte do trabalho o objetivo foi desenvolver materiais baseados em sílica (sub 2
µm) pelo método sol-gel para atuar como suporte cromatográfico em cromatografia líquida de
alta eficiência visando obter colunas com alta eficiência e tempo de análise rápido.
Adicionalmente, a caracterização físico-química e cromatográfica da coluna funcionalizada
em fase reversa foi avaliada.
5.3 Experimental
5.3.1 Materiais e reagentes
Tetraetilortosilicato 95 % (TEOS) (Aldrich, Alemanha), hidróxido de amônio 28%
(Fluka, EUA), etanol (Tedia, EUA), todos grau reagente foram utilizados sem purificação
adicional. Na reação de funcionalização foram usados tolueno (Mallinckrodt, Mexico),
imidazol (Mallinckrodt, Mexico), clorodimetiloctadecilsilano (ODS) e clorotrimetilsilano
(TMS), ambos da Aldrich (EUA). Acetonitrila e metanol, ambos da Tedia (EUA) e grau
HPLC foram usados no trabalho. A água ultrapura foi fornecida pelo sistema Elga Purelab
Ultra (Inglaterra). Capilares de sílica fundida com diâmetro interno de 50 e 250 µm foram
adquiridos da Polymicro Technologies Inc. (EUA). Padrões analíticos de uracila, fenol,
difenilamina, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, cetoprofeno e naproxeno forma
adquiridos pela Sigma-Aldrich (Alemanha) e os padrões de naftaleno e acenaftileno da
Supelco (EUA).
5.3.2 Síntese da partícula de sílica
Para a síntese das partículas de sílica, foram avaliadas diferentes proporções de H2O,
EtOH e NH4OH em relação ao TEOS conforme a Tabela 5.2.
Capítulo 5 180
Em um balão de fundo redondo foram adicionados H2O, EtOH e NH4OH. A solução
foi homogeneizada por 10 minutos com agitação magnética a temperatura de 30°C com banho
de óleo. Posteriormente, TEOS foi adicionado na solução e permaneceu sob agitação por 4 h.
As partículas de sílica foram separadas da solução por centrifugação (1509 g) e lavadas com
água ultrapura até atingir pH próximo de 7. Por fim, as partículas de sílica foram secadas em
estufa à 60°C por 12 h e a 100°C por 24 h.
Nos experimentos de crescimento de partícula, foram adicionadas partículas de sílica
sintetizadas no experimento anterior a uma solução contendo H2O (4,5 mol L-1
) e NH4OH (60
mol L-1
) em EtOH em um balão de fundo redondo. Esta mistura foi levada ao ultrassom por 5
minutos para evitar a aglomeração das partículas. Posteriormente, sob temperatura de 30°C
controlada por banho de óleo e agitação magnética (700 rpm), foram adicionados na
suspensão 2,2 mmol de TEOS, gota a gota, para promover o crescimento da partícula. Essas
adições de TEOS ocorreram a cada 4 horas e variaram de 4 a 12 adições de TEOS. Para
encerrar a reação, as partículas de sílica foram centrifugadas, lavadas com água e metanol e,
posteriormente, secadas em estufa a 70°C por 12 h e 160°C por 24 h. As partículas foram
calcinadas a 400°C por 5 h e 850°C por 5 h, rehidroxiladas com HCl 5 mol L-1
sob refluxo por
10 h, lavadas com água e metanol para remoção do ácido e secada por 48 h a 100°C em estufa
a pressão reduzida.
Tabela 5.2 – Proporções dos reagentes utilizados no processo sintético.
Linha Razão molar
TEOS:EtOH:H2O:NH4OH
1 1:30:100:40
2 1:30:60:20
3 1:60:100:40
4 1:60:200:80
5 1:30:85:40
6 1:30:80:40
7 1:30:40:20
8 1:15:20:10
9 1:30:8:4
Capítulo 5 181
5.3.3 Funcionalização das partículas de sílica
Em um balão de duas bocas acoplado ao condensador Friedrich sob atmosfera de
nitrogênio foram adicionadas 2 g da sílica em 10 mL de tolueno. Em seguida foram
adicionadas 25 mg de imidazol dissolvido em 1 mL de tolueno e, posteriormente, 120 mg de
ODS em 3 mL de tolueno. . O sistema ficou em refluxo por 5 horas com aquecimento por
banho de óleo e as partículas de sílica funcionalizadas foram filtradas e lavadas com tolueno,
metanol, metanol:água (1:1) e metanol. A sílica foi seca em estufa a pressão reduzida na
temperatura de 70ºC por 24 h. Finalmente a sílica funcionalizada foi submetida ao processo
de endcapping empregando 45 µL of TMS nas mesmas condições descritas acima.
5.3.4 Caracterização físico-química
A morfologia das partículas do MIP foi analisada por microscopia eletrônica de
varredura (MEV) (Zeiss-Leica/440) operando a 20 kV e as amostras foram recobertas com
uma fina camada de ouro. A área superficial e o diâmetro do poro foram medidos pela
isoterma de adsorção/dessorção de nitrogênio a 77K (Quantachrome Instruments) pelo
método Braunaer-Emmett-Teller (BET). Analise elementar foi realizado no CHNS-O, modelo
EA 1110 da CE Intruments. Os espectros de infravermelho (FT-IR) foram obtidos de 4000 a
400 cm-1
no equipamento Bomem MB-102 empregando disco de KBr para preparar as
amostras.
Espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) no estado sólido foram obtidos no
espectrômetro Bruker, modelo Avance III (400 MHz) com rotores de óxido de zircônio de 4
mm, velocidade de rotação de 5 kHz e campo magnético de 9,4 T. Analise de 29
Si RMN
foram adquiridas a 79,46 MHz empregando a técnica de polarização cruzada e rotação no
ângulo mágico (CP/MAS) com largura de pulso (/2) de 5 µs, tempo de contato de 5 ms e
intervalo entre os pulsos de 5 s. A temperatura da análise foi de 20,76°C, o número de scans
foi de 3600 e ácido 4,4-dimetil-4-silapentano-1-sulfônico (= 0 ppm) foi utilizado como
padrão externo dos deslocamentos químicos. Os espectros de RMN 13
C foram adquidos a
100,56 MHz empregando a técnica de polarização cruzada, rotação no ângulo mágico e
supressão das bandas laterais (CP/MAS/TOSS) com largura de pulso (/2) de 5 µs, tempo de
contato de 2 ms e intervalo entre os pulsos de 5 s. A temperatura da análise foi de 21,80°C, o
Capítulo 5 182
número de scans foi de 2048 e o adamantano (= 38.48 ppm para o sinal mais intenso) foi
utilizado como padrão externo dos deslocamentos químicos.
5.3.5 Método cromatográfico
Para avaliação da fase estacionária sintetizada, uma coluna capilar (40 mm x 250 μm)
foi preparada no laboratório empregando a técnica de empacotamento por suspensão (slurry
packing technique). (246) Aproximadamente 6 mg da fase estacionária foram sonicadas com
1 mL de THF:isopropanol (90:10) por 5 minutos. Posteriormente, a suspensão foi transferida
para um reservatório e empacotada utilizando uma bomba Haskel com pressão inicial e 200
bar e pressão final de 500 bar, empregando metanol como solvente.
O sistema cromatográfico foi composto por uma bomba LC-20AD, um detector SPD-
M10AVP DAD, uma controladora CBM-20AD, e software LC solution, todos da Shimadzu.
Uma válvula modelo EPCI4W.06 da Valco (EUA) com alça de amostragem (loop) interno de
60 nL conectada a um atuador elétrico foi utilizado como sistema de introdução de amostra.
Uma cela de detecção labmade no formato em “U” com 7,92 mm de caminho ótico e volume
de 35 nL foi utilizada no experimento. (247)
5.4 Resultados e discussões
5.4.1 Síntese da partícula de sílica
Inicialmente foi utilizada uma adaptação da metodologia desenvolvida por Tani no
preparo das partículas de sílica (3 – 4 µm) pelo método sol-gel. (248) Assim, foi preparada
uma solução (solução A) contendo 11 mL de H2O, 0,1 mL de hidróxido de amônio e 7 mL de
etanol. Na síntese das partículas, 4 mL da solução A foi transferida para um balão reacional e
2 mL de TEOS foi adicionado na solução. O sistema ficou mantido a 60°C sob agitação
magnética em sistema fechado. Após 24 h de reação verificou-se a formação de um gel no
balão reacional. O gel foi lavado com etanol e, posteriormente, secado em estufa com
temperatura inicial de 40ºC por 5 h e depois a 100°C por 24 h. A Figura 5.6A ilustra as
partículas obtidas por esse processo sintético. Pode-se observar que as partículas apresentaram
formato totalmente irregular. Uma tentativa de aprimorar a metodologia na obtenção de
presentaram
Capítulo 5 183
Figura 5.6 - MEV das partículas de sílica obtidas após adaptações no procedimento
experimental.
partículas esféricas foi promover a diluição do TEOS. Assim, foi repetida o processo de
síntese empregando 8 mL da solução A e 500 µL de TEOS. As partículas desse experimento
apresentaram formato esférico (Figura 5.6B). Entretanto, observa-se que o material encontra-
se aglomerado e com grande distribuição de tamanho das partículas.
Outras variações no procedimento experimental foram aplicadas na tentativa de
conseguir sintetizar partículas esféricas, não aglomeradas e monodispersas. Contudo, sem
sucesso.
Assim, resolvemos avaliar o procedimento experimental desenvolvido por Stober para
a síntese das partículas. (78) Em um balão foram adicionados TEOS, H2O, EtOH na seguinte
razão molar 1:4:10. O sistema ficou sob agitação magnética durante 5 minutos para
homogeneização da solução. Posteriormente, foi adicionado NH4OH que permaneceu em
reação por 4 horas. Após esse período, a solução apresentou aparência leitosa. As partículas
foram removidas por centrifugação, lavadas com água e etanol e, posteriormente, secadas a
temperatura de 40ºC por 12 h e a 100ºC durante 1 hora. Para avaliar a influência da
quantidade de NH4OH na reação, foram realizados quatro experimentos com a razão molar
TEOS:NH4OH de 1:0,5, 1:1, 1:1,5 e 1:2. A Figura 5.7 ilustra a morfologia das partículas
obtidas nesses experimentos. Observa-se que a medida que a quantidade de NH4OH é
aumentada ocorre uma melhor formação de partículas esféricas. Entretanto, em todos os
experimentos realizados houve a aglomeração entre as partículas esféricas de sílica.
Capítulo 5 184
Figura 5.7 – Microscopia das partículas de sílica obtidas pelo método de Stober com a razão
molar TEOS:NH4OH de (A) 1:0,5, (B) 1:1, (C) 1:1,5 e (D) 1:2.
Jia promoveu uma modificação no procedimento experimental de Stober no qual
empregou maiores quantidade de hidróxido de amônio para o preparo das partículas de sílica.
(249) No procedimento de preparo das partículas foram adicionados no balão reacional 2 mL
de água ultrapura, 8 mL de etanol e 10 mL de hidróxido de amônio. A solução foi
homogeneizada por 5 minutos utilizando agitação magnética. Em seguida, foi adicionado à
solução 1 mL de TEOS, em uma única etapa. Após alguns minutos a solução ficou
esbranquiçada e permaneceu sob agitação por 4 h. As partículas formadas foram separadas
através de centrifugação, lavadas com água e etanol e, posteriormente, secadas em estufa a
40°C e posteriormente a 120°C. A Figura 5.8 ilustra as partículas de sílica obtidas nesse
procedimento experimental. Pode-se observar que as partículas encontram-se esféricas (com
diâmetro médio em torno de 400 nm), monodispersas e não estão aglomeradas.
Experimentos adicionais foram realizados fazendo variações nas razões molares entre
os reagentes na tentativa de obter partículas de sílica com diâmetro maior. A Tabela 5.3
contem o diâmetro médio das partículas e o desvio padrão relativo (DPR %) para os nove
experimentos realizados com diferentes proporções dos reagentes.
Capítulo 5 185
Figura 5.8 – Microscopia da partícula de sílica sintetizada com razão molar TEOS:NH4OH
de 1:20.
Tabela 5.3 – Diâmetro de partícula e desvio padrão relativo dos experimentos de acordo com
a condição experimental utilizada.
Linha Razão molar
TEOS:EtOH:H2O:NH4OH
Diâmetro médio da
partícula (nm) DPR (%)
1 1:30:100:40 407,80 2,8
2 1:30:60:20 457,77 3,8
3 1:60:100:40 436,32 4,3
4 1:60:200:80 354,93 5,3
5 1:30:85:40 525,90 5,6
6 1:20:80:40 501,85 4,4
7 1:30:40:20 697,82 4,8
8 1:15:20:10 - -
9 1:30:08:04 253,40 26,5
O diâmetro médio das partículas foi obtido através da contagem de uma população de
100 partículas nas imagens de microscopia. Adicionalmente, a morfologia das partículas
sintetizadas está ilustrada na Figura 5.9. As partículas dos experimentos das linhas 1 - 5
apresentaram morfologia esférica e, devido ao baixo DPR, podem ser consideradas
monodispersas. Entretanto no experimento da linha 6 surgiram algumas partículas com a
morfologia em dubletos (duas partículas de sílica) juntamente com outras partículas esféricas.
Capítulo 5 186
Figura 5.9 – Microscopia das partículas de sílica sintetizadas de acordo com as condições
especificadas na Tabela 5.3.
Já no experimento da linha 7, estes dubletos aparecem em maior proporção e surgem
os tripletos e quadrupletos. O aparecimento destas partículas deformadas indica que o sistema
reacional não está diluído o suficiente e ocorre o choque entre as partículas primárias durante
o processo sintético levando a formação de dubletos. O experimento da linha 8 foi a condição
reacional que apresentou maior concentração de TEOS e, como resultado, houve grande
aglomeração das partículas que apresentou formato irregular. A quantidade de amônia no
meio reacional é importante para que as partículas tenham morfologia esférica e
monodispersa. No experimento da linha 9 podemos observar que a quantidade de hidróxido
de amônio utilizado foi inferior aos outros experimentos e como resultado as partículas
apresentaram tamanhos variados e portanto não eram monodispersas (DPR = 26,5 %).
Para a continuidade dos experimentos, a condição da linha 2 da Tabela 5.3 foi
escolhida. Foram realizados três experimentos em dias diferentes, na mesma condição
reacional, para avaliar a repetitividade da síntese (Tabela 5.4).
Capítulo 5 187
Como resultado, as partículas nos três experimentos apresentaram diâmetro na faixa de
380 – 530 nm. O diâmetro médio e o DPR para o ensaio inter-dia foram de 448 nm e 5,4 %,
respectivamente. O baixo valor de DPR obtido indica que o processo possui repetititvidade e
que as partículas de sílica possuem uma estreita faixa de distribuição.
Bogush desenvolveu em 1988 uma equação para estimar o diâmetro da partícula em
função da concentração de TEOS, água e amônia no meio reacional com erro de predição de
até 28 %. (250) Em 2007, Razink realizou pequenas correções na equação de Bogush no qual
diminuiu o erro de predição para 20 % (Equação 24). (251)
2/12
22 ]OH[exp]OH[dp BA , (24)
onde,
33
233
2/1 ]NH[366]NH[1200]NH[15182]TEOS[ A
233 ]NH[128,0]NH[523,005,1 B
A Equação 24 foi aplicada nas concentrações experimentais da Tabela 5.4 e o valor de
diâmetro médio calculado para partículas (dpcalc) foi de 435 nm. Como resultado, os valores
obtidos experimentalmente (dpexp) foram próximos aos valores. A aplicação desse material
como suporte cromatográfico em HPLC é dificultoso, pois o diâmetro reduzido das partículas
(abaixo de 0,5 µm) promoveria um grande aumento na pressão do sistema cromatográfico.
Assim, estudos foram conduzidos na tentativa de aumentar o tamanho médio das partículas de
sílica.
Para aumentar o tamanho das partículas de 400 nm foi avaliado o método denominado
crescimento de partícula, o qual consiste em adições de TEOS no meio reacional contendo
uma suspensão das partículas sintetizadas anteriormente em água, etanol e amônia. O TEOS
adicionado
Tabela 5.4 - Avaliação da repetibilidade do preparo da partícula.
Experimento Razão molar
TEOS:EtOH:H2O:NH4OH
dpexp
(nm)a
DPR
(%)
dpcalc
(nm)
dpexp/dpcalc
(%)
1
424 3,6
435
97,5
2 1:30:60:20 457 3,8 105,2
3
462 3,2 106,3 a diâmetro médio das partículas de sílica; dpexp = diâmetro médio experimental; dpcalc =
diâmetro médio calculado.
Capítulo 5 188
adicionado na suspensão sofrerá o processo de hidrólise e, posteriormente, o processo de
condensação na superfície da partícula em suspensão e, por fim, o aumento no diâmetro da
partícula.
A primeira condição experimental avaliada foi baseada no trabalho publicado por
Chou (80), no qual 500 mg das partículas de sílica preparadas pelo método de Stober foram
suspensas em 25 mL solução etanólica contendo hidróxido de amônio (0,4 mol L-1
) e água (10
mol L-1
) em ultrassom por 5 minutos. Posteriormente, sob agitação magnética, foram
adicionados, em única etapa, TEOS no balão reacional para que a concentração na suspensão
fosse de 0,09 mol L-1
. A suspensão ficou em agitação magnética em balão fechado por 3 h e
posteriormente as partículas foram separadas por centrifugação, lavadas com água e secadas
em estufa. A Figura 5.10 ilustra a microscopia das partículas obtidas neste experimento.
Podemos observar que ao invés de promover o crescimento das partículas, o TEOS
adicionado promoveu a aglomeração das partículas existentes na suspensão.
Na tentativa de promover o aumento do tamanho da partícula sem promover a
aglomeração, foram conduzidos experimentos baseados no estudo realizado por Chang (79)
com uma maior dispersão das partículas para evitar colisões na suspensão. Adicionalmente, a
quantidade de TEOS adicionada na solução foi feita lentamente (e diluída em 50 % em etanol
para minimizar a formação de partículas secundárias). Assim, em um balão de fundo redondo,
100 mg da partícula semente foram suspensas em 70 mL de uma solução etanólica contendo
amônia (4,5 mol L-1
) e água (60 mol L-1
). A suspensão ficou sob agitação magnética a 600
rpm e temperatura de 30°C controlada por banho de óleo. Posteriormente, foram feitas
adições de TEOS (0,5 mL, 2,2 mmol) diluído em etanol (50:50, v/v).
Figura 5.10 – MEV das partículas de sílica submetidas ao processo de crescimento da
partícula semente.
Capítulo 5 189
Diferentemente do experimento anterior, a velocidade de adição da solução de TEOS
no sistema reacional foi de 1 gota a cada 10 segundos e sua concentração na suspensão não
ultrapassou o valor de 0,03 mol L-1
. O balão reacional foi fechado e o sistema permaneceu sob
agitação por 2 h. Posteriormente, outra alíquota de 2,2 mmol de TEOS diluído foi adicionado
lentamente no sistema reacional. No total foram realizadas 12 adições de TEOS a cada 2 h. A
Figura 5.11 ilustra a comparação das imagens de MEV e distribuição das partículas nesse
experimento através da contagem de uma população de 100 partículas obtidas pelas imagens
de microscopia.
A Figura 5.11A representa a partícula semente empregada como base no experimento.
Após quatro adições de TEOS no sistema reacional percebe-se que o tamanho médio das
partículas foi aumentado (Figura 5.11B) de 400 nm para a faixa de 700 – 900 nm sem a
formação de aglomerados. Entretanto foi observado o surgimento de novas nucleações
(partículas secundárias), pois algumas partículas na faixa de 200 – 400 nm foram encontradas.
Após 8 adições de TEOS (Figural 5.11C), houve o aumento de tamanho das partículas de 700
-900 nm para a faixa de 1100 – 1300 nm. Contudo, houve um aumento de novas nucleações
(mais de 40 % da partículas estavam na faixa de 400 -500 nm) que começaram a competir
com as partículas maiores no processo de crescimento. Assim, também foram encontradas
partículas com 600 - 800 nm. A Figura 5.11D ilustra as partículas obtidas após 12 adições de
TEOS no sistema reacional. Pode-se observar que as partículas encontram-se em uma ampla
faixa de distribuição (300 – 1800 nm) no qual cerca de 60 % são resultado de novas
nucleações (400 – 500 nm).
Na tentativa de promover um processo de alimentação continuo de TEOS no sistema
reacional, foram conduzidos testes empregando uma bomba peristáltica. Assim, em um balão
de fundo redondo, 100 mg da partícula semente foram suspensas em 70 mL de uma solução
etanólica contendo amônia (4,5 mol L-1
) e água (60 mol L-1
) conforme condições do
experimento anterior. Entretanto, 4 mL de TEOS foi diluído para volume final de 10 mL com
etanol e esta solução foi adicionada ao sistema reacional através da bomba peristáltica com
vazão de aproximadamente 30 µL min-1
num tempo aproximado de 5,5 h. A Figura 5.12A
representa as partículas obtidas neste processo, no qual o tubo de alimentação estava imerso
na solução. A Figura 5.12B representa uma modificação no sistema no qual o tubo de
alimentação estava suspenso dentro do balão reacional e a solução de TEOS foi adicionada
por gotejamento. Pode-se observar que ambos os processos não foram satisfatórios no preparo
de partículas monodispersas próximas de 1000 nm, pois houve o processo de aglomeração das
partículas sementes ou o surgimento de novas nucleações.
Capítulo 5 190
Figura 5.11 – MEV e distribuição das partículas obtidas no processo de crescimento de
partícula semente. (A) partícula semente, (B) após 4 adições de 2,2 mmol de TEOS, (C) após
8 adições de 2,2 mmol de TEOS e (D) após 12 adições de 2,2 mmol de TEOS.
Capítulo 5 191
Figura 5.12 – MEV das partículas sintetizadas com a alimentação realizada com bomba
peristáltica. (A) imersão direta na suspensão e (B) sistema de gotejamento na suspensão.
Para a continuidade do trabalho, optou-se por utilizar o procedimento no qual
fornecesse partículas de sílica próximas de 1000 nm para caracterização e avaliação de seu
desempenho como fase estacionária em HPLC. A imagem do MEV na Figura 5.13A ilustra as
partículas de sílica obtidas através do crescimento da partícula utilizando apenas 4 adições de
TEOS no sistema reacional. Pela imagem do MEV e do histograma (Figura 5.13B) observa-se
que houve a formação de algumas partículas secundárias. Entretanto, podemos observar pelo
gráfico de percentagem acumulada das partículas (Figura 5.13C) que uma quantidade inferior
a 5 % das partículas são resultados de novas nucleações e estão na faixa de 450-550 nm. Já o
restante das partículas, 95 %, estendem na faixa de 850 - 1000 nm. A Tabela 5.5 apresenta os
valores obtidos de diâmetro médio das partículas e DPR para as partículas antes e após o
processo
Tabela 5.5 – Comparação da distribuição das partículas de sílica antes e depois da reação de
crescimento de partícula semente.
Parâmetro Partícula base Partícula após reação de
crescimento
dp médio (nm) 424 895
DPR (%) 3,6 9,2
d10 (nm) 398 839
d50 (nm) 419 892
d90 (nm) 440 930
d90/d10 1,105 1,108
Capítulo 5 192
Figura 5.13 – (A) MEV das partículas de sílica sintetizadas, (B) Histograma da distribuição
das partículas e (C) Gráfico da percentagem acumulada das partículas.
processo de aumento de tamanho e informações sobre d10, d50, d90 e d90/d10. Pode-se observar
que os valores próximos de 1,0 para d90/d10 indica que as partículas sintetizadas possuem
uniformidade.
As partículas de sílica foram submetidas ao tratamento térmico para elevar sua
resistência mecânica e destruir matéria orgânica residual do processo de síntese. Durante o
tratamento térmico há uma diminuição do numero de silanois na superfície da sílica. Assim,
Capítulo 5 193
foi necessário realizar uma rehidroxilação da sílica com ácido antes da reação de
funcionalização com o grupamento monofuncional C18 e endcapping com TMS.
5.4.2 Caracterização das partículas
A análise de BET das partículas de sílica sem a funcionalização forneceu um área
superficial de 54 m2 g
-1 e um diâmetro médio dos poros de 0,95 nm. Os baixos valores para a
área superficial e diâmetro do poro caracterizam o material como não poroso. Os valores de
microporos (abaixo de 2 nm) dificulta a penetração de moléculas maiores que a da água.
Assim, os grupos silanois presentes nos microporos não são classificados como silanois na
superfície das partículas de sílica. Análise elementar do material após a reação de
funcionalização e endcapping indica a presença de 8,7 % de carbono ligado em sua estrutura.
O material sintetizado também foi caracterizado por infravermelho. O espectro de
infravermelho da sílica antes da funcionalização possui bandas características de polímeros
baseados em sílica (bandas 4-7 na Figura 5.14). (252) Em 3480 cm-1
, a banda larga é referente
referente
Figura 5.14 - Espectro de Infravermelho da sílica pura e sílica C18. Bandas: (1) O-H, (2) C-
H, (3) O-H, (4) Si-O-Si, (5) Si-OH, (6) Si-O e (7) Si-O.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
50
60
70
80
90
% T
ran
smit
ân
cia
Número de ondas (cm-1)
Sílica C18
Sílica pura
1
23
4
56
7
Capítulo 5 194
ao estiramento da ligação O-H atribuída aos grupos silanois na partícula de sílica. A ausência
de bandas na região de 3000-2800 cm-1
confirma que não há resíduo de TEOS no esqueleto
polimérico da sílica preparada. (253, 254) Após a reação de funcionalização e endcapping,
podemos observar o aparecimento de banda na região em 2950-2800 cm-1
atribuídas aos
estiramentos de carbono alifático (C-H). Adicionalmente, o processo de funcionalização e
endcapping promoveu uma redução da banda atribuída ao estiramento O-H. O sinal
remanescente relacionado aos grupos OH é atribuído aos silanois localizados no interior da
partícula (microporos) no qual não estão disponíveis para reação de funcionalização.
No espectro de RMN/CP/MAS 29
Si da sílica após, a funcionalização e endcapping,
podemos observar o sinal em -111 ppm atribuído a espécie Q4 (ligação siloxano) que está
presente em todo material baseado em sílica (Figura 5.15A). O sinal em -102 ppm é referente
a espécie Q3 (silanol isolado) e, assim como no FT-IR, indica que há grupos silanois no
material sintetizado. A ausência do sinal em -92 ppm confirma que nesta estrutura do material
não há a presença das espécies Q2 (silanol geminal). O sinal em 12 ppm no espectro de 29
Si
aparece somente após a reação de modificação da superfície da sílica e é atribuído a
sobreposição dos núcleos do átomo de silício tanto do grupamento C18 monofuncional quanto
do átomo de silício do TMS (M). (255)
A morfologia da cadeia carbônica do grupamento C18 foi avaliada por 13
C
RMN/CP/MAS/TOSS (Figura 5.15B). Trabalhos na literatura relatam que partículas de sílica
funcionalizadas com grupos C18 monofuncionais apresentam sinais mais intensos no espectro
de carbono em relação aos grupos C18 di e trifuncionais, pois a cadeia carbônica tem maior
mobilidade. (256) O sinal em 0,45 ppm é atribuído carbono C ’ do grupo C18 e aos carbonos
do grupamento TMS. Devido as densidades eletrônicas relativamente altas em torno desses
núcleos de carbono, forma-se uma blindagem contra o campo magnético provocando o
aparecimento dos sinais em campo alto do espectro. (257) Os sinais em 12,30 ppm e 18,08
ppm são atribuídos as carbonos C18 e C1, respectivamente. Já os sinais em 22,41 e 23,57 são
referentes aos metilenos C17 e C2. O carbonos C3 e C16 aparecem em campo mais baixo no
espectro, com sinais em 33,98 ppm e 31,95 ppm. O sinal mais intenso no espectro (30,51
ppm) é referente aos carbonos centrais (C4-15) ao longo da cadeia octadecil. A presença desses
carbonos centrais nesta região do espectro indica que a cadeia C18 encontra-se na
conformação desordenada, ou seja, seus carbonos apresentam grande mobilidade e há uma
rápida troca entre as conformações gauche e trans. (132) Adicionalmente, Jinno observou que
fases
Capítulo 5 195
Figura 5.15 – Espectro da sílica C18 não porosa sintetizada. (A) 29
Si RMN/CP/MAS e (B) 13
C RMN/CP/MAS/TOSS.
Carlos_silicaC18_P10_Si29.001.esp
100 50 0 -50 -100 -150
Chemical Shift (ppm)
C3
C16
C4-15
C2 C
17 C1
C1'
SiO
CH3
CH3
CH2 CH2 CH2 (CH2)12 CH2 CH2 CH3
C1' C
2C
1 C3
C4-15 C
16C
17
C18
C18
Si
Si
O H
O H SiO
O
O
O
M
Q3
Q4
(a)
(b)
SiCH2
CH3
CH3
OR
R = (CH2)16CH3, H
Carlos_silicaC18_P10.001.esp
56 48 40 32 24 16 8 0 -8
Chemical Shift (ppm)
Deslocamento químico (ppm)
Deslocamento químico (ppm)
fases estacionárias que passaram pela etapa de endcapping possuem uma maior mobilidade no
final da cadeia carbônica, provocando um aumento na intensidade dos sinais referente ao
carbono C16 e C18. (256)
5.4.3 Avaliação cromatográfica das partículas de sílica
Após o preparo, funcionalização e caracterização das partículas de sílica, foi realizado
o processo de empacotamento das partículas de sílica (conforme procedimento descrito na
Capítulo 5 196
etapa 5.3.5) para sua avaliação na separação cromatográfica. A Figura 5.16 ilustra o esquema
utilizado no preparo do corpo da coluna capilar de sílica fundida. Adicionalmente, a Figura
5.17 apresenta a imagem da coluna capilar com as partículas de sílica não porosa
desenvolvida. Após o processo de preparo da coluna cromatográfica, o seu desempenho foi
avaliado com uma solução teste contendo diferentes compostos: uracila (25 mg L-1
), fenol
(200 mg L-1
), difenilamina (300 mg L-1
), naftaleno (30 mg L-1
) e acenaftileno (200 mg L-1
).
Figura 5.16 – Esquema de um tubo preparado para a confecção de coluna capilar
empacotada.
Fonte: Retirado de (247).
Figura 5.17 – Imagem da coluna capilar desenvolvida (40 mm x 250 µm x 0,9 µm, C18).
Capítulo 5 197
A Figura 5.18 apresenta o cromatograma obtido na separação dessa solução teste
utilizando MeOH:H2O (30:70, v/v) como fase móvel no modo isocrático. A temperatura de
análise foi mantida a 22°C e o comprimento de onda do DAD fixado em 220 nm. O volume
de injeção foi de 60 nL. A vazão empregada na análise foi de 1,5 µL min-1
, no qual não é o
valor ótimo para trabalhar com essas partículas. Entretanto, devido a alta pressão gerada pela
partícula desenvolvida, não foi possível elevar a vazão da fase móvel. A partir do
cromatograma gerado foram calculados os valores de fator de retenção (k), número de pratos
por metro (N/m), assimetria medida em 10 % da altura do sinal do pico (As10), altura
equivalente ao prato (H), altura reduzida do prato (h), resolução (Rs) e fator de separação (α).
Os parâmetros avaliados estão resumidos na Tabela 5.6.
A uracila foi utilizada como marcador do tempo morto. A ordem de eluição seguiu a
hidrofobicidade dos analitos, ou seja, o menos hidrofóbico eluiu primeiro (fenol) e o mais
hidrofóbico eluiu por ultimo (acenaftileno). O par de compostos neutros (naftaleno e
acenaftileno) foi utilizado para avaliar a hidrofobicidade da fase estacionária. Podemos
observar que a resolução (Rs4,5) e a seletividade (α4,5) entre esse par de compostos foi de 3,2 e
1,31 respectivamente.
Figura 5.18 – Cromatograma obtido na separação da solução teste utilizando a coluna capilar
com a fase estacionária C18 sub-1 µm. Ordem de eluição: uracila (1), fenol (2), difenilamina
(3), naftaleno (4) e acenaftileno (5).
0 2 4 6 8 10
0
10
20
30
Ab
sorb
ân
cia
(m
V)
Tempo de retenção (min)
1
2
3 45
Capítulo 5 198
Tabela 5.6 – Parâmetros cromatográficos para a coluna sintetizada.
Composto k N/m H (µm) h As10 α Rs
Uracila 0,00 - 48,61 54,01 1,21 - -
Fenol 0,24 26951 37,10 41,23 1,60 - -
Difenilamina 2,48 91306 10,95 12,17 1,40 - -
Naftaleno 3,34 102506 9,75 10,84 1,25 1,31 3,20
Acenaftileno 4,52 108982 9,17 10,20 1,27
Os picos cromatográficos apresentaram formato simétrico e o acenaftileno gerou uma
eficiência de 108982 pratos/metros e, consequentemente, um H no valor de 9,17. Os valores
obtidos para H e h não são satisfatórios, entretanto, esse valor pode estar relacionado com
uma somatória de fatores que tornam o sistema (HPLC e coluna) inadequado. Um primeiro
ponto a ser discutido está relacionado com a presença dos microporos na sílica sintetizada.
Moléculas pequenas podem ficar aprisionadas nos microporos e sua lenta difusão no interior
da partícula causa um aumento perceptível na banda cromatográfica e consequentemente
diminui a eficiência da separação. Assim, esse tipo de material com microporos abaixo de 2
nm apresenta melhor desempenho em separações de macromoléculas.
Outro ponto que pode estar relacionado com a diminuição da eficiência da coluna
cromatográfica é a restrição ao aumento da vazão da fase móvel devido à pressão gerada pelas
partículas sub-1 µm. A velocidade linear média empregada na análise foi de 0,43 mm s-1
no
qual é um valor abaixo da velocidade linear adequada para esse tipo de partícula. Assim, a
separação cromatográfica foi realizada na região da curva de Van Deemter no qual o termo B
(difusão longitudinal) apresenta grande contribuição para o valor elevado de H. Além disso,
na Tabela 5.6 observa-se que ocorre um aumento no número de pratos com o aumento do
fator de retenção dos compostos analisados. Esta situação é um indicativo de que há uma
dispersão extra coluna no sistema cromatográfico.
Para demonstrar o potencial de aplicabilidade das partículas sub-1 µm, a coluna
preparada foi utilizada para a separação de anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs)
conforme discutido no Capítulo 4. A Figura 5.19 ilustra o cromatograma da separação de 5
NSAIDs empregando a coluna C18 sub 1 µm desenvolvida. O método cromatográfico
consistiu na separação isocrática empregando MeOH:H2O (35:65, v/v) contendo 0,1 % de
resolução
Capítulo 5 199
Figura 5.19 – Cromatograma obtido na separação dos NSAIDs na concentração de 100 mg L-
1 utilizando a coluna capilar com a fase estacionária C18 sub-1 µm. Ordem de eluição:
cetoprofeno (1), naproxeno (2), fenoprofeno (3), flurbiprofeno (4) e ibuprofeno (5).
0 2 4 6 8 10
0
50
100
150
200A
bso
rbân
cia
(m
V)
Tempo de retenção (min)
1
2
3
45
ácido acético. A vazão foi de 1,5 µL min-1
, a temperatura foi de 22°C e o comprimento de
onda foi fixado em 220 nm. Os picos cromatográficos demonstraram boa simetria e os pares
cetoprofeno/naproxeno e fenoprofeno/flurbiprofeno apresentaram resolução de 1,82 e 1,84
respectivamente com um tempo total de análise foi de apenas 9 minutos.
5.5 Conclusão
O método sol-gel empregando precursores alcoxissilanos forneceu partículas esféricas
com um DPR abaixo de 4 %. Após os experimentos de aumento do tamanho de partícula, o
DPR ficou abaixo de 10 % devido novas nucleações aparecerem nestes ensaios. A
caracterização físico-química revelou que o suporte cromatográfico é considerado não poroso
pois apresentam microporos em sua estrutura.
Devido a limitação instrumental (pressão máxima do sistema) durante a avaliação
cromatográfica do trabalho, a velocidade linear utilizada estava cerca de seis vezes abaixo do
valor mínimo considerado ótimo para partículas com este diâmetro. Desta forma, a eficiência
e o tempo de análise foram prejudicados.
Capítulo 6
Conclusão geral e perspectivas futuras
Capítulo 6 203
6.1 Conclusão geral
O desenvolvimento de fase extratora utilizando silicato de sódio como precursor de
baixo custo no processo sintético apresentou resultados adequados quando aplicada no
método desenvolvido para análise de antidepressivos e quando comparada com fases
extratoras comerciais conforme discutido nesta tese. Adicionalmente, a síntese do MIP para a
extração seletiva dos fármacos mostrou-se efetiva. Além disso, a migração da SPE no modo
off-line para o online forneceu um método simples e seletivo para a análise direta de NSAIDs
em urina humana com o mínimo de pré-tratamento da amostra.
O desenvolvimento das colunas curtas empacotadas com partículas abaixo de 1 µm
com sílica não porosa facilita a transferência de massa e aprimora a eficiência cromatográfica.
Em outras palavras, a vazão da fase móvel pode ser aumentado sem comprometimento da
separação dos analitos. Entretanto, materiais com essa característica necessitam de
equipamentos capazes de operar em pressões elevadas no qual dependendo das dimensões da
coluna é necessário trabalhar com pressões acima de 1000 bar para atingir a velocidade linear
ótima para a coluna analítica.
6.2 Perspectivas futuras
O desenvolvimento desse trabalho fornece condições e possibilidade de desenvolver
fases extratoras (preparo de amostra) e fases estacionárias (HPLC) com grupamentos
diferentes dos encontrados atualmente no mercado. Nesta estratégia, seletividade diferenciada
pode ser obtida e assim, extrações mais seletivas gerando extratos mais limpos ou
aprimoramento de separações cromatográficas podem ser alcançadas.
Desta forma, no âmbito do preparo de amostra há a possibilidade de modificar o
suporte cromatográfico com modificadores diferenciados. As fases desenvolvidas podem ser
aplicadas em extrações de diferentes matrizes empregando SPE off-line ou online conforme
descrito nesta tese. Além disso, há a possibilidade de aplicar em sistemas de extração
miniaturizados, tais como o MEPS. Adicionalmente, as fases extratoras podem ser
modificadas superficialmente com meio de acesso restrito (RAM) no qual os materiais
apresentam características mistas no qual ocorre a combinação da cromatografia por exclusão
e da cromatografia em fase reversa. (29, 40) Além disso, o método MISPE-HPLC-UV pode
ser utilizado para extração seletiva dos NSAIDs em outras matrizes, tais como a ambiental.
Capítulo 6 204
A avaliação da coluna com partículas sub 1 µm em equipamentos de UHPLC (1000
bar) forneceria a possibilidade de trabalhar em vazões mais elevadas e melhorar a eficiência e
tempo de análise.
Em relação às fases estacionárias para colunas cromatográficas, pode-se destacar a
possibilidade de sintetizar fases suportadas na superfície da sílica com seletividade
diferenciada. Como exemplo prático, pode-se citar o preparo de fases estacionárias contendo
líquidos iônicos (ILs). Uma das principais vantagens da superfície imobilizada com fases
estacionárias contendo IL é a possibilidade de alterar os cátions, ânions e a cadeia alquílica do
líquido iônico. Esta vantagem fornece a capacidade de manipular a estrutura de IL na sílica e,
consequentemente, as propriedades da fase estacionária. (258) Outro exemplo é a síntese de
fases zwitêrionicas no qual possui grupos com carga positiva e negativa que permite mudar a
seletividade da separação cromatográfica. Além disso, fases quirais podem ser desenvolvidas
com aplicabilidade na separação enantiomérica.
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