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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
Co nta cto :Co nta cto : [email protected]
Tesis de Posgrado
Caracterización de la fosfodiesterasaCaracterización de la fosfodiesterasade AMP cíclico del hongo dimórficode AMP cíclico del hongo dimórfico
Mucor rouxii : Regulación de laMucor rouxii : Regulación de laactividad enzimática poractividad enzimática por
fosforilación-desfosforilaciónfosforilación-desfosforilación
Galvagno, Miguel Angel
1981
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasBiológicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.
Cita tipo APA:
Galvagno, Miguel Angel. (1981). Caracterización de la fosfodiesterasa de AMP cíclico del hongodimórfico Mucor rouxii : Regulación de la actividad enzimática por fosforilación-desfosforilación. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1676_Galvagno.pdfCita tipo Chicago:
Galvagno, Miguel Angel. "Caracterización de la fosfodiesterasa de AMP cíclico del hongodimórfico Mucor rouxii : Regulación de la actividad enzimática por fosforilación-desfosforilación". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad deBuenos Aires. 1981. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1676_Galvagno.pdf
(III“IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIÍIIIIIIIIIIIIIIIIIIlllIIIIII‘IIIIII
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
CARACTERIZACION DE LA FDSFÜDIESTERASA DE AMP CICLICÜ DEL HDNGÜ
DIMDRFICÜ MUCDR RÜUXII
REGULACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA PUR
FDSFDRILACIÜN-DESFÜSFÜRILACIDN
Autor: Lic. Miguel Angel Galvagno
Director: Prof. Dra. María Susana Di Bernardo de Passeron
Lugar de trabajo: Departamento de Química Biológica
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (U.B.A.)
Tesis presentada para optar por el título de:
DÜCTÜR EN CIENCIAS BIÜLÜGICAS
—19a1—
A mis padres
A m1 hermano
‘IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
AGRADECIMIENTOS
- A Susana Passeron quien me inició en el estudio de un nuevo
aspecto de la investigación en biologia y me enseñó, con su
ejemplo cotidiano, que el trabajo científico es importante en
la medida en que se encare con amor, seriedad y sin claudica
ciones.
Al Dr. Jorge Uright por ser mi maestro de micología, por haber
me alentado generosamente en todo momentodurante la realiza
ción de esta tesis y por haber depositado su confianza en mi.
A mis compañeros del laboratorio de Biología Molecular por he
ber compartido conmigo estos años de labor y aprendizaje y es
pecialmente a Silvia y a Maria Leonor quienes estuvieron siem
pre dispuestas a darme con cariño parte de su tiempo para esq!
char y solucionar mis incontables "dudas bioquímicas".
A María Esther Ranalli por haberme iniciado en la investiga
ción cientifica.
Al personal técnico del laboratorio que colaboró eficazmente
con mi tarea y en particular a la Sra. Alicia de Alcaraz por
su bondad y su responsabilidad en el trabajo.
Al Departamento de Quimica Biológica y al P.R.H.Ü.M. por las
posibilidades que mebrindaron para poder realizar este trabajo.
- A los miembros del Instituto Campomar,especialmente al Dr.
Carlos Cardini y al grupo del Dr. Torres por la colaboración
desinteresada prestada en todo momento.
Al Departamento de Biologia, a mis profesores, al personal tec
nico y de maestranza, al personal de Secretaria y a mis compa
ñeros por quienes guardo un profundo cariño y a los que conoci
y me conocieron a lo largo de tantos años de compartir todas
mis cosas, tanto las buenas comolas malas.
A mis alumnos de quienes aprendi mucho más de lo que ellos
aprendieron de mi.
A la Sra. Mary Ibáñez por la dedicación puesta en el mecanogra
fiado de esta tesis. A la Sra. Nora Telesca por la ayuda orian
da en todo momento.
Finalmente a la Facultad de Ciencias Exactas donde pasé casi la
mitad de mi vida.
-ABREVIATURAS UTILIZADAÉ EN EL TEXTO
ABF
5'AMP
AMPc
AMPcíclico
Ac-PDE
Ac-QP
ARN
ATP
BSA
BtZAMPc
CDA
cpm
CTP
DEAE
dibutiril AMPc
dimetil PDPDP
D.Ü.
DTT
EDTA
EGTA
GMPc
GMPcílico
azul de broma fenol
5'fdefatu de adenosina
AMPcíclico
3':5'-fdefato de adendsina
foefodiesterasa de AMPc
quinaaa de proteína dependiente de AMPc
ábido ribonucleico
5'-trifdsfato de adendsina
serdalbfimine bovina
dibutiril AMP:
coenzima A
cuentas por minuto
5'-trifosfato de citidinadietilaminoetil
3':5'-fdsfatd.N6 ,02' -dibutiriladenoeina
(1,h-bis [2(h-metil-5-fenil oxazolil] benceno)densidad ópticaditiotreítdlácido etilendiamindtetraecético
ácido etilenglicol-bis-(F -aminoetileter)N,N' tetraacético
GMPcíclico
3':5' - fosfato de guanosina
Gc-PDE
GTP
5" IMP
IMPC
IMPcíclico
ITP
H
mmol
2+
NAD
NDP
NMP
NMPc
NTP
PDE
PEA
Pipee
pmol
PPí
PPÜ
rpm
fnafodiesterasa de GMPc
5'-trifnsfato de guanosina
5‘-fosfato de inosina
IMPcíclico
3':5'-Foafato de inosina
5'-trifasfato de inoaina
kilodalton
constante de Michaelia de la enzima para el
sustrato
minuto
milimol
catión divalente
nicotinamida adenina dinucleótido
nucleóaido difoafato
nucleóaido munofuafato
nucleósidn monofosfato cíclico
nucleósido trifosfato
foefodiesterasa
alcohol fenetílico
P1perazina-N,N'-bis [2-ácido etanoaulfónico]picomol
pirofnsfato
(2,5-difeniloxazol)
revoluciones por minuto
Temed
Tris
TTP
UTP
N,N,N',N' tetrametiletileñdiamine
2-amino-2(hidraximetil)-l,3 propanodiol
5'-trifosfato de timidina
5'-trifosfato de uridina
velocidad máximade hidrólisis del sustrato
por la enzima
INTRODUCCION
I. DIMÜRFISMÜ EN HONGOS
II. DIMÜRFISMD EN MUCÜR
II.1.11.2.
II.3.II.h.II.5.11.6.
II.7.11.8.
11.9.
Dimorfismo a nivel celular
Dimorfismo y pared celular
Factores ambientales y metabolismocelular
Influencia de loa hidratos de carbono
Acción de inhibidores
Cambiosrespiratorios durante la diferenciaciónlevadura-micelio
Dimorfismoy sintesis de proteinas
Dimorfismo y poliaminas
Dimorfismo y AMPc
III. PAPEL BIDLÜGICO DEL AMPc EN DTRQSÍEUCARIONTES
INFERIÜRES
111.1.
111.2.
_III.3.III.u.111.5.
III.6.
Mucoralea
Blastocladiella emersonii
Neurosgora crasaa
Dictyoatelium discoideum
Ütros hongos
Algas, muagoa y protozoarioa
IU. AMPC EN EUCARIÜNTES SUPERIORES
V. MECANLSMD DE ACCIQN DEL AMPc EN EUCARIÜNTES
SUPERIORES
lÜ
ll.12
13
16
17
17
19
19
21
22
23
25
26
26
27
UI. FÜSFÜRILACIÜN-DESFÜSFDRILACIÜN DE PRÜTEINEÉ
V1.1.
V1.2.
V1.3.
UI.h.
V1.5.
V1.6.
V1.7.
V1.8.
V1.9.
Modificaciones covalentes de proteinas
Fosforilación y desfosforilación de enzimas
Quinasas de proteínas
Clasificación de las quinasas de proteínas
Quinasas de proteinas dependientes de AMPc
Quinasas de proteínas dependientes de AMPcen
eucariontes inferiores
Quinasa de proteína dependiente de AMPcen
Mucor rouxii
Fosfatasas de fosfoproteínas
Fosfatasas de fosfoproteïnas en Mucorrouxii
VII. METABOLISMO DEL AMPc
VIII. ADENILATÜCICLASA
VIII.1. Adenilato ciclasa en eucariontes inferiores
VIII.2. Adenilato ciclasa en Mucorrouxii
IX. FÜSFÜDIESTERASA
IX.1.
IX.2.
IX.3.
IX.h.
IX.5.
Formas múltiples
Activadores de la actividad de fosfodiesterasa
Efecto de hormonas
Inhibidores de la actividad de fosfodiesterasa
»Fosfodíesterasa en eucaríontes inferiores
X. OBJETIVOS
3D
3D
31
33
35
36
QÜ
#2
#2
uu
bh
#5
#6
kB
#9
'51
59
67
7D
76
BD
MATERIALES Y METQQQE
I. PREPARACION DEL MATERIAL BIDLÜGICO
1.1. Organismo
1.2. Obtención y cosecha de esporas
1.3. Medio de cultivo
I.b. Obtención de micelio
1.5. Obtención de las distintas formas celulares producidas
durante la morfogénesis aeróbica
II. MEDICION DEL CRECIMIENTO
III. DETERMINACIQflng LOS NIVELES INTRA Y EXTRACELULARES
DE AMPc
III.1. Procesamiento de las muestras oara el ensayo
de AMPc
III.2. Valoración del AMPcde las muestras
IV. PREPARACION DE L g EXTRACTOQÍENZIMATICQÉ
IV.1. Preparación de extractos de los distintos estadios
de la morfogénesis aeróbica
IU.2. Obtención de las fracciones aubcelulares de micelio
IV.3. Preparación de los extractos para la purificación,
caracterización y regulación de 1a fosfodiesterasa
de AMPc
U. DETERMINACION DE ACTIVIDADES ENZIMATICQQ
V.1. Ensayo de la actividad de la fosfodiesterasade AMPc
82
82
82
83
8h
8h
86
86
86
88
88
88
89
90
91
91
V.2. Ensayo de la actividad de la Fosfodiesterasa
de AMPoen geles de poliacrilamida
V.3. Ensayo de la actividad de la Fosfodíeaterasa
de GMPC
V.h. Ensayo de la activación de la fosfodiesterasa
de AMPo por ATP.Mg y AMPo.
V.h.1. Ensayo directo de la activación enzimática
V.h.2. Ensayo de la activación enzimática por
preincubación
V.5. Dtros ensayos enzimáticos
V.5.1. Quinasa de proteína dependiente de AMPc
V.5.2. Glucosa oxidasa
V.5.}. Peroxídasa
V.5.h. Fosfatasa alcalina
VI. TECNICAS CRDMATDGRAFICAQ
V1.1. Cromatografía en DEAE-celulosa
V1.2. Cromatografía en papel
V1.3. Cromatografía de afinidad
u1.u. Filtración en gel de Seohadex a-2oo
VII. GRADIENTES DE SACARDSA
VIII. CALCULO DE ALGUNOS PARAMEIBQÉÍHIDRDDINAMICQ__1
MDLECULARES DE LA FDSFDDIESTERAEB DE AMPc
VIII.1. Coeficiente de sedimentación y coeficiente
de difusión
95
95
95
'96
96
97
97
99
99
IÜÜ
lÜD
lÜÜ
101
lÜl
102
103
10h
10k
VIII.2. Radio de Stokes
VIII.3. Peso molecular
VIII.h. Coeficiente friccional
UIII.5. Parámetros hidrodinámicos y moleculares
de las proteínas marcadoras
IX. ELECTROFORESIS EN EEL DE POLIACRILAMIDA
X. OTRAS TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALITICOS
Identificación de los productos de la reacción
de la fosfodiesterasa de AMPc
Determinación de los volúmenes celulares
Valoración de otros marcadores de peso molecular
Valoracion de proteínas
Purificación del AMPc[3H
Síntesis de ATP[TC-32%Contaje de radíoactivídad
XI. REACTIVOS UTILIZADOS
RESULTADOS Y DISCUSION
I. VALIDEZ DEL ENSAYO DE FOSFODIESTERASA
DE LOS NIVELES DE AMPC DURANTE LA MORFOGENESIS AEROBICA
II. ACTIVIDAD DE FOSFODIESTERASA DE AMPc Y VARIACIONES
III. CONCENTRACION CELULAR DE AMPc
IV. DISTRIBUCION SUBCELULAR DE LA FOSFODIESTERASA DE AMPC
EN EXTRACTOS DE LA FORMA FILAMENTOSA
lOS
lOS
lOS
LOE
lO7
lO9
lO9
lO9
llO
llO
llllllll2113
116
118
125
127
V. ACTIVIDADES DEgEgngDIESTERAgA DE AMPc Y DE EyPc EN
EXTRACTOS SOLUBLES DE MICELIO
V.1. Perfil de elución de las actividades de fosfa
diesterasa de AMPCy de GMPCen columna de
DEAE-celuldsa
V.2. Efectd del BMPcsobre la actividad de fosfodies
terasa de AMPC
VI. PURIFICACION PARCIAL DE LA ACTIVIDAD DE FngODIES
TERASA DE AMPc SOLUBLE
VII. ELECTROFORESIS EHAQEL DE POLIACRILAMIDA DE LA
fgngDIESTERAgA DE AMPc
VIII. PARAMETROECINETICOQADE LA FOEFODIESTERAEA DE AMPc
IX. REQUERIMIENTO DE CATIONES DIVALENTES PARA LA ACTIVIDAD
DE FOSFODIESTERAEA DE AMPc
X. EFECTO DE ALGUNOS INHIBIDORES Y ACTIVADORES CLASICQQ
DE LA FngODIESTERAgAADE AMPc ¿CORE LA ACTIVIDAD DE
LA ENZIMA DE MUCOR ROUXII
XI. EFECTO DE CALMODULINA ÉQERE LA FOSFODIESTERAEAADE AMPc
DE MUCOR ROUXII
XII. ALGUNOS PARAMETRQÉAHIDRÜDINAMICÜS Y MOLECULARES DE LA
FOSFODIESTERASA DE AMPc
XII.1. Coeficiente de sedimentación y coeficiente de
difusión
XII.2. Radio de Stokes
130
132
13h
137
lh5
lhB
151
155
158
160
160
162
XII.3. Cálculo del peso molecular y del coeficiente
friccional
XIII. REGULACION DE LA ACTIVIDAD DE FDEfÜDIESTERASA DE
AMPc DE MUCÜR RDUXII PUR EQÉEDRILACIÜN-DESFÜSFÜ
RILACIÜN
XIII.1.
XIII.2.
XIII.3.
XIII.A.
XIII.5.
XIII.6.
XIII.7.
XIII.B.
Activación por ATP de la Ac-PDEde una Fracción
enzimática poco purificada
Conservación de la activación por ATP
Dependencia con el tiempo de la activación
de la Ac-PDE por ATP.Mg y AMPc
Efecto de la concentración de ATPsobre la
activación de la Ac-PDE
Requerimientos para la activación de la Ac-PDE
Dependencia de la activación de la Ac-PDEcon
la quinasa de proteína dependiente de AMPc
Parámetros cinéticos de la Ac-PDEactivada
Reversibilidad dei proceso de activación de
la Ac-PDE
XIV. ACTIVACIÜN DE LA FÜSFDDIESTERASA DE AMPc PUR
ENZI
XIV.1.
XIU.2.
MAS PRÜTEÜLITICAS
Relación entre la activación de la fosfodieste
rasa de AMPcpor fosforilación y por proteóliois
Perfil de sedimentación en gradiente de sacarosa
de la fosfodiesterasa de AMPcactivada por fosfigrilación o por tripsinizaciún
16h
167
167
167
17D
172
175
177
179
181
18h
186
XU. ACTIVACIÜN DE LA FÜSFÜDIESTERAEB DE AMPC LUEGO DE
CRÜMATÜGRAFIA EN COLUMNA DE AFINIDAD
CONCLUSIONES
NÜMENCLATURA DE LAS ENZIMEÉ
BIBLIOGRAFIA
191
199
ZÜÜ
INTRODUCCION
I. DIMÜRFISMÜ EN HÜNGÜS
Existe un cierto número de hongos que presentan una dualidad
fenotipica en la forma de sus células. Dependiendo de las condi
ciones ambientales, pueden crecer bajo la forma de un micelio
compuesto de filamentos largos y ramificados, septados o asepta
dos, o bajo la forma de células levaduriformes, ovoides o esféri
cas que se reproducen por gemación. El término dimorfismo ha si
do Frecuentemente utilizado para referirse a un grupo de hongos
que causan infecciones sistémicas en el hombre y animales, y ha
sido definido por Ainsuorth (1) como "la condición en la cual
se produce una fase parásita levaduriforme y una fase miceliana
saprofitica". Actualmenteel término se utiliza en un sentido
más amplio y comprende a hongos patógenos y no patógenos sin
hacer distinción particular entre las formas de vida saprobias
o parásitas. El dimorfismo, en su sentido más amplio, se define
entonces comouna interconversión reversible de formas levadura
formes y micelianas controladas por el medio ambiente y puede
simplificarse por la notación:
L = forma levaduriforme
M= forma miceliana
Diferentes factores ambientales controlan el dimorfismoen
estos hongos. Asi en el caso de Blastomyces dermatitidis y
V'A- .rx-«ov-io 7-.»-\_.—s x t- _ _\i\- — - -_ .. , te,» A.- .. .. .i.. ¿vr-c .5.1.3..D: jvc- —I--'_-\ x>\\€S'*..‘ ‘mk +‘:&A\-—Ï«fix. '=&\i “ELX”.
tutti trim-ae, X'a temer ¡Puna es 2X (Anita f actor oetemwimxe Ue.Xa
‘ÑEÏVÉARÉÉSA\SA\ÉÜGSA\:L:Ï\\‘&Si\ük‘\RRRSÁ\GAYSÑGSÏÉS\ïSÑSEÏGSi‘®&É_
isa.minima:/É
“\‘ 9amokxainam\aexïsxc.uniquso‘üe‘xsngfiiïnÏüïstxfih.
incubación a 37DE no es condicion suficiente para mani
forma levaduriforme o producirla a partir de la filame
en el caso de Sporotricnum_gcnenkii e Histoplasma farc
._ es necesario, además, que el organismo crezca en atmós;
l 002 (5 y 10-20%respecti ¡xa/vente)(4,5). Mientras que en
ea de Histapiasma capsulatum 1a incubación a temperatura:
vadas (370 C) debe estar acompañada por la presencia de am
ácidos con grupos sulfhidrilo (v.g.cisteina) y agentes que]
tEB en El medio de cultivo (V.g. citrato); además el inúcul
empleado debe ser superior a 5.105 células/m1 (6-9).
En el caso de Candida albícans el dimorfismo depende a
mente de las condiciones nutricionales (10).
¡IIIIIIlllllIIIIII...¡¡l...II, ülflüfiflsfla [IVflaca/7
(clase:Desde hace más de un siglo este género de hongos'ón de los
Zygomycetes, orden: Mucorales) ha atraído la atenc1
III'"'"'¡III
Paracoccidioides brasiliensís, cuyas formas patógenas son leva
duriformes, la temperatura es el único Factor determinante de la
morfología in vitro (2,3), por lo tanto la notación anterior pugde escribirse:
25°C.—————‘T'—_‘37°C
Por otra parte existe un grupo de hongos en los cuales la
incubación a 37DC no es condición suficiente para mantener la
Formalevaduriforme o producirla a partir de la filamentosa. Asi
en el caso de Sporotrichum schenkii e Histoplggmgrfarciminoggm
es necesario, además, que el organismo crezca en atmósfera de
802 (5 y 10-20%respectivamente) (h,5). Mientras que en el ca
so de Histoplasma capsulatum la incubación a temperaturas ele
vadas (370 C) debe estar acompañada por la presencia de amino
ácidos con grupos sulfhidrilo (V.g.cisteina) y agentes quelan
tes en el medio de cultivo (v.g. citrato); ademásel inoculo
empleado debe ser superior a 5.1[15 células/ml (6-9).
En el caso de Candida albicans el dimorfismo depende sola
mente de las condiciones nutricionales (lÜ).
II. DIMÜRFISMÜ EN MUCÜR
Desde hace más de un siglo este género de hongos (clase:
Zygomycetes, orden: Mucorales) ha atraído la atención de los
investigadores debido a su habilidad de crecer bajo dos formas
según el medio en que se hallen. En presencia de aire, y en me
dio sólido o liquido, desarrollan un micelio cenocitico típico.
El micelio produce frecuentemente estructuras de reproducción
vegetativa llamadas clamidosporas. En el extremo de las hifas
aéreas, y en ciertas condiciones, se producen esporangios que
llevan numerosas esporas asexuales o esporangiosporas. En el gg
nero yugo; existen especies homotálicas y heterotálicas, siendo
estas últimas mayoría, las que se reproducen sexualmente por cg
pulacifin gametangial produciendo una cigospora tipica. El ci
clo de Vida aeróbico del hongo se esquematiza en la Figura l.
En 1857 el botánico alemán Bail (12) observó que en las pag
tes más profundas de cultivos liquidos aeróbicos de M. racemosus,
hongo típicamente Filamentoso, aparecían células esféricas o ni
fas cortas muyengrosadas que se reproducian por gemación.
Posteriormente, Pasteur (13) demostró que las células leva
duriformes se producían simplemente comouna respuesta adaptati
va de Mucor a una atmósfera pobre en oxigeno y observó que la
fase levaduriforme desaparecía con aereación suficiente.
Desde estos primeros trabajos, la adaptación morfogenética
de ciertas especies de Mucora una atmósfera aeróbica o anaerg
bíca ha sido objeto de innumerables estudios que continúan has
ta el presente.
Esporongio roosexuo/»©Esporongio
usexuul
Clamidosporu
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Esporangio Progametcngiossexual
/ A/Aéé/Gomeïongios
Meiosis?\ /'Cigoïo
Figura l: Ciclo de Vida de Mucor sE. Tomadode Burnett (ll).
Mucorresultó ser asi un sistema excelente para el estudio
de las bases bioquímicas de la diferenciación morfológica. Diver
sos Factores estén involucrados en el proceso de diferenciación.
II. 1.Dimorfismo a nivel celular
El ciclo de vida asexual de las especies dimórficas de Mucor,
puede dividirse en tres estadios (1h): a) germinación de la espg
rangiospora, b) crecimiento vegetativo y c) esporogénesis. Es en
los estadios a y b, donde se observan las transiciones dimórficae.
a) Germinaciónggg la esporangiospora. Las esporangiosporas de
flgggg spp.son de forma elipsoidal y su dimensión aproximada es
de 6 x 5 pm. Hay discrepancias en cuanto al número de núcleos por
espora, según Robinom (15) el número de núcleos seria superior a
uno, en cambio Storck y Morrill (16) observaron en la mayoria de
las especies estudiadas un núcleo por espora. La germinación de
las esporangiosporas da origen a células vegetativas levadurifor
mes o a células hifales, dependiendo de las condiciones ambienta
les durante la germinación.
Independientemente de la morfología final, la germinación de
las esporangiosporas puede dividirse en dos Fases (17): crecimiegto de la espora en una gran célula esférica de aproximadamente
10-18 pm de diámetro y emergencia del tubo germinativo, en el og
so de desarrollo hifal; o producción de una yemaesférica, en el
caso de desarrollo levaduriforme. La formación de la célula es
férica es una Fase de crecimiento verdadero, ya que hay un incre
mento importante de peso seco y de la cantidad de proteina (17).
Durante esta fase se sintetiza gg_ggvguna pared celular, fisica
y químicamente diferente de la de la espora.
Los eventos posteriores difieren según la morfología Final
de la célula. En el caso del desarrollo filamentoso se produce
un aumentoen la polarización de la sintesis de la pared celular
que resulta de la ruptura de la pared de la célula esférica y en
la emisión de un tubo germinativo (17). Si la célula esférica va
a dar origen a una célula levaduriforme, la sintesis de la pared
celular no es polarizada y la ruptura de la pared de la célula
esférica está seguida por la emergencia de una yemaesférica.
b) Crecimiento vegetativo. En aerobiosis, con una variedad
de fuentes carbonadas y en medio sólido o liquido, el crecimien
to vegetativo de tggggr spp. al igual que el de todos los hongos
Filamentosos, está caracterizado por un crecimiento apical de
la pared celular (18). La longitud, ancho y grado de ramifica
ción de las hifas de este hongo, varia con las condiciones de
cultivo.
En anaerobiosís y en presencia de concentraciones altas de
azúcares Fermentables, el crecimiento vegetativo de Mucor spp,
es del tipo levaduriforme y está caracterizado por la presencia
de células esféricas con gemaciónmultipolar y con la síntesis de
la pared celular uniformementedistribuida sobre 1a superficie
celular (18).
Comoel dímorfismo en este hongo es reversible, pueden lo
grarse cambios morfológicos en ambas direcciones. Cuando se in
duce a las células levaduriformes a formar híFas, las yemas se
transforman para Formar uno o más tubos germinativos por polar;
zación de la síntesis de la pared celular. Cuandolas hifas son
estimuladas para Formar células levaduriformes se originan ye
mas esféricas de los extremos hifales. En esta última transfor
mación quedan algunos elementos hifales en el cultivo, aún lue
go de períodos largos.
c) Esporogénesis. En ciertas condiciones el micelio produ
ce esporangiúforos cuyo extremo se dilata y comienza a Former
se el esporangio hacia el cual fluye una gran cantidad de citg
plasma que lleva numerosos núcleos y que se concentra en la
periferia de éste, dejando una parte central estéril (columela).
El protoplasma de la zona periférica se divide en una gran can
tidad de porciones uni o multinucleadas que luego se redondean,
se rodean de pared y maduran para dar las esporangiosporas. Las
esporas se liberan por ruptura de la pared esporangial.
II. 2.Dimorfismo y pared celular
La morfología de los hongos depende de manera fundamental de
la Formade la pared celular, estructura rígida que está determi
nada por la disposición espacial y la estructura molecular de_
sus diversos componentes. Por lo tanto, la dilucidación del meca
nísmo de sintesis de la pared celular es de importancia fundamql
tal en cualquier estudio del dimorfismo en hongos.
Bartnicki-García (19) estudió la composición química de la
pared celular de Mucorrouxii en dos estadios vegetativos, célu
las levaduriformes y micelío. Übservó que la composición cuantí
y cualitativa de la pared celular de las células levaduriformes
y de micelio es semejante, siendo los polisacáridos dominantes
quitina, quitosano y ácidos poliurdnicos; en cambioexisten di
ferencias cuantitativas en el contenido de manosay proteína.
Nose conoce bien el significado de estas diferencias en rela
ción al dimorfísmo, aunque se han encontrado diferencias en la‘
actividad de manosil transferasa en las formas levaduriformes y
filamentosa de esta especie (20).
La quitina forma un esqueleto microfiorilar en la pared ce
lular (21). Bartnicki-Garcia y colaboradores estudiaron los ca
minos metabólicos, localización y posible regulación de la sín
tesis de quitina en M. rouxii; encontraron que la actividad de
quitina sintetasa está localiZada principalmente en la fracción
correspondiente a la pared celular y propusieron un mecanismo
de regulación para la enzima que involucra activación e inacti
vación proteolitica (22). Según dicho mecanismouna proteasa
activaria a la enzima presente comozimógenoen la fracción mi
crosomal, esta activación puede ser bloqueada por un inhibidor,
termoestable y dializable, presente en la Fracción soluble. El
inhibidor mantendría a la enzima comozimógeno. La cantidad re
lativa de la proteasa activadora y del inhibidor difieren en
las células hifales y levaduriformes. En las hiFas los niveles
de proteasa son altos y los del inhibidor bajos, presentándose
la situación inversa en las células levaduriformes. El resulta
do neto seria la producción de una enzima de vida media relati
vamentecorta en las hifas y larga en las células levadurífor
mes (22). Este hecho tendria implicancia morfogenética ya que
en células levaduriformes la inactivacífin de la enzima seria
más lenta, lo que daria cuenta del mayor grosor de la pared ce
lular en estas células (23).
Existen diferencias sustanciales en la cantidad de quitina
por unidad de peso seco entre las células levaduriformes y mi
celianas. Es posible que las enzimas de vida medía corta y lag
ga puedan ser el reflejo de controles impuestos por el tiempo
de generación largo de las células levaduriformes creciendo anae
lÜ
robicamente comparado con el tiempo de generación más corto de
las hifas en aerobíosis (1h).
II. 3.Factores ambientales y metabolismo celular
Tal como se señaló, la morfología levaduriforme de algunas
especies de Mucor aparecía cuando la atmósfera del cultivo se
hacía anaeróbica.
Bartníckí-García y Nickerson (2h) estudiaron el papel que
podían tener los distintos factores ambientales asociados al
crecimiento anaeróbico comoeventuales agentes morfogenéticos en
M. rouxií. Demostraron que la presencia de anhídrido carbóníco
era necesaria para el desarrollo de la fase levaduriforme. A
bajas presiones del gas o en su ausencia (atmósfera de nitró
geno puro) obtenían crecimiento totalmente filamentoso. De es
tos estudios concluyeron que el anhídrido carbóníco participa
directamente en el mantenimiento de la fase levaduriforme.
Haidle y Storck (25) trabajando con la misma especie de
Mucor, obtuvieron crecimiento levaduriforme en atmósfera de
nitrógeno puro a condición de que este gas estuviera libre de
trazas de oxígeno y concluyeron que otros factores distintos
del anhídrido carbónico estaban involucrados en el control del
dimorfismo en esta especie.
ll
Sin embargo, recientemente, Mooneyy Sypherd (26) demostra
ron que en M. racemosus es posible obtener crecimiento levadu
riforme o filamentoso en atmósfera de nitrógeno puro o cualquier
otro gas inerte, dependiendo la morfología del cultivo de la ve
locidad de flujo del gas. Asi, a flujo alto de nitrógeno obtu
vieron crecimiento levaduriforme, mientras que a bajo flujo del
gas el crecimiento era puramente filamentoso. Para explicar es
tos resultados los autores postularon la existencia de una sus
tancia volátil: "Factor Fílamentoso", afin no identificada, la
cual seria la desencadenante del crecimiento apical. Con un al
to flujo de gas, dicha sustancia hipotética seria removida de
los cultivos permitiendo entonces el crecimiento levaduriforme.
En atmósfera de anhídrido carbónico, a alto o bajo Flujo de
gas, el crecimiento era siempre del tipo levaduriforme. Surge
inmediatamente de estos resultados que la acción morfogenética
de la sustancia volátil seria anulada por el anhídrido carbó
nico.
II. h-Influencia de los hidratos de carbono
Bartnicki-Garcia (27) y Passeron y colaboradores (28) es
tudiaron la influencia de la concentración de hexosas sobre la
morfología de Mucor rouxii en condiciones anaeróbicas. Demos
traron que se requiere una concentración minima de glucosa para
12
obtener una población netamente levaduriforme; a medida que la
concentración de glucosa disminuye los cultivos tienden a hace;
se más filamentosos. Este efecto de la concentración de glucosa
no puede ser atribuido al incremento de la producción de anhidri
do carbónico, ya que la máximaliberación de este gas se logra
con solo 0,1% de glucosa (27). Bartnicki-Garcia interpreta la
acción de la glucosa comoel resultado de la represión catabó
lica ejercida por metabolitos de este azúcar sobre los procesos
de morfogénesis de la hifa.
II. 5.Accíón de inhibidores
Algunas sustancias químicas alteran los cambios morfogené
ticos normales, y del estudio de su modo de acción han surgido
nuevas hipótesis sobre las causas del dimorfismo. Terenzi y
Storck (29) encontraron que el alcohol fenetílico, inhibidor
del crecimiento celular en bacterias, hongos y animales, indu
ce la formación de células levaduriFormes en cultivos aeróbicos
de Mucor rouxii, siempre y cuando la fuente carbonada sea un
azúcar fermentable en concentración superior a 2%. El alcohol
Fenetilico estimula la producción de anhídrido carbónico y eta
nol e inhibe la fosforilación oxidatíva. Posteriormente, Passeron
y colaboradores (28) encontraron que el cianuro de potasio, inhi
bidor clásico de la respiración, agregado a cultivos aeróbicos
13
produce efectos similares al alcohol fenetílico, o sea, induce
el crecimiento levaduriforme. En presencia de diferentes conceg
traciones de cianuro de potasio, es posible observar la transi
ción entre la morfología filamentosa y levaduriforme pasando
por formas intermedias, es decir que a concentraciones interme
dias del inhibidor se pueden encontrar hifes cortas y engrosadas.
En base a estos resultados se concluyó que el metabolismo
oxidativo seria un determinante.importante en el desarrollo fila
mentoso de Mucor.
II. 6.Eambíosrespiratorios durante la difergpciacifin levaduramicelio
Pese a las conclusiones enunciadas en el párrafo anterior,
trabajos posteriores de Rogers, Clark-Walker y Stewart (30) y de
Paznokas y Sypherd (31) demostraron que el metabolismo respiratg
rio de Mucor no estaba correlacionado con la morfología.
Rogers y colaboradores cultivaron M. genevensis en condicio
nes de exceso de glucosa o con glucosa limitante a distintas
concentraciones de oxígeno disuelto. Encontraron que el desarrollo
filamentoso y el metabolismo oxidativo son inhibidos por exceso de
glucosa, sin mayores efectos sobre el desarrollo mitocondrial. Por
el contrario, la adición de cloranfenicol a cultivos filamentosos
1h
aeróbicos, en condiciones de glucosa limitante, inhibe el de
sarrollo mitocondrial sin inducir la transformación a células
levaduriformes. Los autores concluyen que el metabolismo oxi
dativo no es esencial para el desarrollo filamentoso.
Paznokas y Sypherd estudiaron algunos aspectos del metabg
lismo respiratorio de M.racemosus. Lograron obtener cultivos
filamentosos en condiciones estrictamente anaeróbicas, en at
mósfera_de nitrógeno o argón y a bajo Flujo de gas. Por otra
parte, obtuvieron cultivos levaduriformes en condiciones aeró
bicas por el agregado de Et AMPcal medio de cultivo. Midie2
ron el metabolismo respiratorio de estas células y lo compara
ron con el de cultivos levaduriformes y filamentosos obtenidos
en las condiciones habituales. Hallaron que el micelio obteni
do en atmósfera de nitrógeno posee un metabolismo netamente fer
mentativo, análogo al de las células levaduriformes obtenidas
en atmósfera de anhídrido carbónico. Este micelio carece de mí
tocondrias y el sistema de citocromos no se ha desarrollado.
Por el contrario las células levaduriformes obtenidas en atmfig
fera de oxigeno con Bt2 AMPc,poseen un metabolismo oxidativo
enteramente similar al del micelio que se obtiene normalmente.
Por los resultados reseñados anteriormente parece evidente
que la capacidad oxidativa y el desarrollo mitocondrial no son
factores importantes en el proceso de morfogénesis. Noobstante
15
Inderlied y Sypherd (32) encontraron una correlación positiva
entre el desarrollo levaduriforme y una alta capacidad fermentg
tiva. Übservaronque la transferencia de células levaduriformes
de flgggr de una atmósfera de anhídrido carbónico a aire, con
concentraciones progresivamente más altas de glucosa en el me
dio de cultivo retardan la aparición de los tubos germinativos.
Ademáscuando el organismo se desarrolla aeróbicamente, conceg
traciones creciEntes de glucosa en el medio de cultivo provocan
la acumulación de etanol en el medio y se induce un aumento de
las concentraciones intracelulares de intermediarios glucolíti
cos comola fructosa 1-6 difosfato. Se concluyó que el estudio
de las enzimas claves del camino glucolitico seria de gran uti
lidad para dilucidar las bases bioquímicas del dimorfísmo en
este hongo (1h).
Passeron y colaboradores (33-35) y Paznokas y Sypherd (36)
estudiaron una de las enzimas claves de la glucólisis, la pirg
vato quinasa en M. rouxii y M. racemosus respectivamente. Demos
traron la existencia de isoenzimas y estudiaron su regulación
por intermediarios de la glucólisis. No se halló una correla
ción entre la morFogénesis y el tipo de piruvato quinasa pre
sente (36), aparentemente esta enzima, no estaria involucrada
en el proceso morfogenético.
16
II. 7-Dimorfismoy sintesis gg proteinas
Ürlouski y Sypherd, (37) estudiaron en M. racemosus la velo
cidad de sintesis proteica durante la germinación aeróbica de
las esporas y en el proceso de transformación de células levadu
riformes a micelio. Encontraron un aumento en la velocidad de
sintesis de proteinas durante el periodo de emergencia de los tu
bos germinativos, tanto de las células levaduriformes comode
las esporas (37,38). Este aumentoen la velocidad de sintesis de
proteínas está acompañadopor un aumento en el porcentaje de ri
bosomas activos y en la sintesis de ARNtotal (ARNribosomal y
ARNmensajero), la capacidad sintética disminuye a medida que
los tubos germinativos se alargan (39,AÜ).
A pesar del incremento de la velocidad de sintesis de ARN
mensajero durante la transición de la Forma levaduriforme a la
micelíana (AD), no se pudieron encontrar cambios importantes en
la sintesis de nuevas especies de ARNmensajero y por consiguien
te en la calidad de las proteinas sintetizadas durante la trans;
ción morfogenética. El cambio más importante observado durante
la emergencia de los tubos germinativos, a partir de esporas o
de células levaduriformes, fue la fosforilación de la proteina
S 6 de la subunidad ribosomal hÜ S; coincidiendo el grado má
ximo de Fosforilación de esta proteína cdn el máximode incremeg
to de la sintesis proteica (bl). Aunqueel significado de esta
17
fosforilación en el proceso de morfogénesia no está aclarado,
demostraria que durante este proceso se producen cambios por lo
menos de un componente del sistema de traducción.
II. 8.Dimorfismo y poliamínas
Sypherd y colaboradores (1h, #2) estudiaron la variación en
los niveles de poliamínas durante la transición morfogenética
que se produce al aerear células levaduriformes de M. racemosus.
Encontraron que se produce un aumento transiente en los niveles
de cadaverina durante los primeros momentosde la aereacíón, pa
ra luego decaer a los niveles encontrados en las células levaduri
formes; con posterioridad a la disminución en los niveles de esta
poliamína, se produce un gran aumento en los niveles de putresci
na y espermidina, muy por encima de los valores encontrados en
las células levaduriformes. Aunqueestos resultados solamente re
Flejan una correlación entre la transición dimórfica y la apari
ción de tres poliamínas, los autores sugieren que estos compues
tos podrian tener una función regulatorio en los procesos metaoá
licos que conducen a los cambios morfogenéticos.
II. 9.Dimorfismo y AMPc
Tal vez el avance más importante en cuanto al esclarecimien
to de las bases bioquímicas del dimorfismo en Mucor se deba a
18
los experimentos de Larsen y Sypherd (#3) sobre la acción del
AMPcen Muoor racemosus. Estos autores encontraron que la adición
de Bt AMPCa cultivos aeróbicos del hongo, produce la represión2
del crecimiento apical y promueveel crecimiento levaduriforme.
Para que estos cambios ocurran es necesaria la presencia en el
medio de cultivo de un azúcar Fermentable; en su ausencia, o si
la Fuente carbonada es glicerol, succinato o maltosa el cambio
no ae produce. También pudieron establecer que existe una buena
correlación entre los niveles intracelulares de AMPcy la morfig
logia. Las células levaduriformes contienen mayores niveles del
nucleótido cíclico que el micelio. Los mismosautores demostra
ron que la aereación de un cultivo de células levaduriformes es
tá acompañadapor una disminución en los niveles intracelulares
del nucleótido cíclico, disminución que precede a la aparición
de los tubos germinativoa.
Posteriormente Passeron y colaboradores (bb), encontraron
resultados similares en M. rouxii.
Asi, aunque el AMPces capaz de inducir la morfología leva
duriforme en aerobiosis y se lo encuentra en concentraciones al
tas en este tipo de células, el nucleótido cíclico 25323 no se
ria determinante de la morfología, ya que su acción está condi
cionada a la presencia de un azócar fermentable a concentracio
nes adeouadas en el medio de cultivo.
19
De acuerdo a lo expuesto en las secciones precedentes, surge
que la regulación del dimorfismo en Mucor es el resultado de
una interacción
tricionales, en
importante. Por
debe tenerse en
morfismo que se
compleja de numerosos factores ambientales y nu
donde el AMPc, sin duda, desempeña un papel muy
consiguiente,el estudio de su mecanismode acción
cuenta en cualquier modelo de regulación del di
proponga para el género Mucor.
En la Figura 2 se resume el efecto de los principales facto
res ambientales y nutricionales que participan en las transicignes dimórficas en Mucor rouxii.
III. PAPEL BIDLquBD DEL AMPc EN ÜTRQE EUCARIÜNTES INFERIÜRES
III. 1 Mucorales
Jones y Bu'lock (#5) demostraron que la adición de AMPcal
medio de cultivo influencia la morfología de Mucorhiemalis y
M.mucedo, dos especies de Mucor no dímórficas, produciendo la
perdida de la dominancia apical y un aumento de la septación
de las células del micelio que recuerda a la morfología levadg
riforme de las Mucorales dimórficas. En estas especies y en
Blakeslea trispora (#5, #6) se encontró que el AMPcpuede mimi
car los cambios morfológicos que se producen normalmente duran
te la reproducción sexual, formación de gametangíos y suspensg
G Espora
(Independiente decondiciones ambientales)
O Célula esférica
CONDICIONES C02+hexosqs .
02*hexosos + PEA o 2AMBIENTALES
OUE FAVORECEN u u +CNK
LA FORMA n u +812 AMPcLEVADURIFORME
Célula Qlevaduriforme Micelio
0.2
C02+hexosas
Figura 2: Ciclo de vida asexual, aeróbico y aneeróbico, de
Mucorrouxíi. Condiciones ambientales y nutricig
nales que influyen sobre el dimorfismo.
21
res (ver Fig. l) y aumento en la producción de carotenoides, que
estarian normalmenteinducidos por el ácido trispórico. Los auna
res (#6) postulan que el AMPcJunto con el ácido trispórico se
rian los responsables de la formación de cigóforos en B. trispora.
En Phycomvcesblakesleeanus, se encontraron resultados similares
a los hallados para las especies de M2523mencionadas arriba (A7).
Tambiénse encontró en esta especie que son necesarios niveles ha
jos de AMPcpara el desarrollo y la respuesta fototrópica del es
porangióforo (ha).
III. 2.81astocladiella emersonii
En el hongoacuático Blastocladiella emersonii, se han rela
cionado los_cambios en las concentraciones intracelulares de nu
cleótidos cíclicos con la citodiferenoiación. Se observó que los
niveles de AMPcy GMPccambian marcadamente durante el ciclo de
vida (h9- 51). Los niveles de AMPoaumentan en Forma transiente
durante la germinación de las zoosporas y alcanzan su máximova
lor en el estadío de zoospora hinchada (51); los niveles altos
de AMPcluego declinan y son minimos cuando las células emiten
los tubos germinativos. El tratamiento de las zoosporas con
cicloheximida mantiene el AMPcen sus niveles más altos y a la
población celular comocélulas hinchadas (#9, 51, 52). Esto in
dicaria que los primeros estadios de la germinación, son inde
pendientes de sintesis protéica contrariamente a lo que ocurre
22
en M3223. Recientemente Maia y col. (53) V Silverman (5h) encontra
ron que la germinación de las zoosporas de esta especie puede
ser inducida rapidamente por AMPcy postularon que el nucleóti
do cíclico actuaria comouna señal para la iniciación de los
procesos que conducen a la germinación de las zoosporas. Los prime
ros autores señalan que, dado que este proceso está acompañado
por un eflujo de calcio celular, la germinación dependerïa de
la correlación entre la movilización intracelular de calcio y
los niveles de AMPc ya que un ionóforo de calcio (A23187) Egg gg
no induce la germinación, pero el proceso puede desencadenarse
cuando se añade a las zoosporas el ionóforo y concentraciones
subóptimas de AMPc.
III. 3.Neurospora crassa
Los trabajos más importantes en cuanto a la participación
del AMPcen la morfogénesis de Neurospora crassa corresponden a
los grupos de Scott (55, 56) y de Torres (57, 58). El primer grg
po de trabajo,utilizando la mutante colonial (fr) de N. crassa,
que tiene disminuidos los niveles intracelulares de AMPc,logró
restaurar la morfología salvaje bajo condiciones de cultivo que
hacian aumentar los niveles intracelulares de AMPc(56). Estos
mismosautores (55), utilizando la cepa salvaje fueron capaces
de producir fenocopias de mutantes morfológicas coloniales adi
23
cionando al medio de cultivo sustancias que hacían disminuir la
concentración intracelular del nucleótido cíclico.
Para dilucidar el papel desempeñado por el AMPcen la morfg
génesis de N. crassa Torres y colaboradores, también trabajaron
con cepas mutantes del hongo. La mutante crisp (cr-l) tiene un
fenotipo colonial ya que no produce hifas aéreas y presenta abug
dante producción de conidios. Estos autores demostraron que los
niveles de AMPcen esta mutante son 10-20 veces menores que los
de la cepa salvaje (57), y encontraron que la adición de AMPco
de su Bt2 derivado al medio de cultivo de la mutante cr-l re
vierte la morfología produciendo una fenocopia de la cepa salva
je (58). De estos resultados surge la importancia del AMPc como
determinante de la morfología de Neurospora, aunque afin no se cg
noce el modo preciso de acción por el cual el AMPcejerce su
acción morfogenética.
III. b.Dictyostelium díscoideum
Dictyostelíum díscoideum posee un ciclo de vida con una fase
vegetativa unicelular ameboidey un cuerpo fructífero multicelu
lar. Cuandose agotan los nutrientes del medio, las amebas for
man agregados que luego se diferencian en una masa de esporas ag
bre un pié celulfisico (sorocarpo) (59). La agregación se produce
por quimiotsxis y la señal quimiotáctica natural es el AMPc
2h
(acrasina) (60). En las primeras horas de ayuno, en medio sóli
do o liquido, una secuencia de eventos característicos conduce
a la agregación de las amebas; primero desarrollan la habilidad
de responder a pulsos de señales de AMPcy luego son capaces de
emitir la señal por sintesis y liberación oscilatoria de AMPc
(61). Por medio de una serie compleja de movimientos morfogené
ticos el agregado celular forma un seudoplasmodio, conocido
comoestadio "babosa",que puede desplazarse por el medio y que
luego desarrolla el sorocarpo culminante. En este último esta
dio las futuras células del pié son apicales y las futuras es
poras, basales. Las células del pié migran hacia abajo a través
de las esporas dejando a estas en posición apical en el sorocar
po maduro. En las etapas de formación del cuerpo fructífero tam
bién interviene el AMPc.Asi cuando las amebas se incuban en al
tas concentraciones de AMPcforman células del/tipo de las del
pié (62). Tambiénlas porciones anteriores de un seudoplasmodio
en movimiento, que darán origen al pié, completan su desarrollo
en presencia de altas concentraciones de AMPcextracelular, mieg
tras que las que darán origen a las esporas, degeneran (63).
Además se vió que una fuente de AMPcimplantada en el seudoplag
modio induce en su adyacencia grupos de "células pié" (6h). Es
tos hallazgos dan cuenta de la importancia del AMPcen la dife
renciación celular de Dictyostelium.
25
III. 5¡Ütros hongos
Se ha estudiado el efecto del AMPcen el proceso de diferen
ciacifin en otros hongos. En Basidiomycetes comoCoprinus
macrorhizus el AMPcinduCe la formación de basidiocarpos (65).
En Schizophvllum commune se encontró que el AMPcadicionado al
medio de cultivo de la cepa salvaje produce una Fenocopia del
fenotipo mutante "bse" (bug's ear) que carece de laminillas (66).
Se observó, además, que esta cepa mutante poseía altos niveles
endógenos de AMPcdurante todo el ciclo de vida, mientras que
en la cepa salvaje solo se producen durante la formación de los
cuerpos fructíferos (67). Aparentementede estos resultados po
dria concluirse que en Basidiomycetes los niveles de AMPCson
determinantes en la Formación del basidiocarpo.
En el hongo imperfecto Aspergillus niger el’AMPcestimule
la velocidad de crecimiento cuando se agrege el nucleótido c1
clico a un cultivo del hongo creciendo en bajas concentraciones
de cinc y en los primeros estadios del proceso de Fermentación
más tarde en el ciclo celular la respuesta del micelio al AMPc
cambia y el nucleótído inhibe el crecimiento (respuesta bipolar),
por lo tanto el AMPcestimula la talogénesis en la fase de cre
cimiento (donde no se observa producción de citrato) y la acidg
génesis en la fase estacionaria (68).
26
III. 6.Algas¡musgosy protozoarios
Se ha Visto que el AMPcafecta la morfogénesis en algas; asi
en Acetabularia mediterranea se observó que el AMPcendógeno es
alto en los talos quueños y decrece durante el crecimiento de los
mismos,permaneciendoa bajos niveles hasta la diferenciación del
sombrero y aumentando durante la diferenciación de éste (69). En
Chlamydomonasreínhardtíi el AMPcestaria involucrado en el fun
cionamiento y regeneración de los Flagelos (7D).
En el musgoFunaria hygrometrica el AMPcacelera el desarrollo
del cloronema pero no del caulonema (71). En el protozoario
Trypanosomaleuisi, parásito de la sangre de ratas, la ablastina,
que es un anticuerpo producido pÜI' á.hospedante, produce el pa
saje de la forma reproductiva del parásito a la forma no reprodug
tiva; se ha observado que la ablastína produce un aumento en los
niveles intracelulares del AMPcen las células del parásito (72).
IU. AMPc EN EUCARIÜNTESÁEQEERIDRES
En 1957, Rall, Berthet y Sutherland (73) descubrieron que la
acción activadora de la epínefrina y del glucagón sobre la fosfig
rilasa de higado, una de la enzimas responsables de la degrada
ción del glucógeno, podia ser mimicada por un compuesto termoes
table que resultó ser el AMPc.
27
La estructura de este compuesto fue determinada por el grupo de
Markham(7h). A partir de entonces se han ido describiendo nume
rosos efectos de este nucleótido cíclico sobre todos los niveles
de organización celular, desde un órgano aislado hasta una enzi
mapurificada.
El grupo de Sutherland (75) le asignó al AMPcel papel de
segundo mensajero. El primer mensajero serían las diferentes hor
monas encargadas de llevar la información desde el tejido donde
se producen hasta la célula receptora y el segundo mensajero trans
feriría esa información a la maquinaria celular. La mayoría de las
hormonaspeptídicas, las catecolaminas y las prostaglandinas pro
ducen una modificacion de los niveles intracelulares de AMPcen
las células receptoras. El primer paso en este proceso es la unión
de la hormonaa un receptor específico en la superficie externa de
la membranaplasmática; como consecuencia de esta unión, se prodg
ce la activación de la enzima adenilato ciclasa que cataliza la
síntesis de AMPca partir de ATP y por consiguiente un aumento
en los niveles intracelulares de AMPcen respuesta a la hormona
específica.
U. MECANISMO DE ACCION DEL AMPC EN EUCARIÜNTES SUPERIORES
¿Cuál es el mecanismo por el cual el AMPcproduce efectos tan
diversos en los diferentes tejidos en respuesta a los estímuloshormonales?.
28
En 1968 y 1969 se describió (76-80) un grupo de enzimas lla
madasquinasas de proteínas, que catalizan la fosforilación de
diversos sustratos protEicos tales comoprotamina, caseína, his
tona, etc. y cuya actividad es dependiente de la presencia de
AMPc.Pronto se vió que estas enzimas estaban ampliamente distri
buidas en los organismos eucariontes.
Precisamente la universalidad de su distribución llevó a Huo
y Greengard en 1969 (81) a proponer que ellas serian las media
doras de las diversas acciones del AMPcen los distintos tejidos.
Esta hipótesis lleva implícita la idea de que las quinasas de
proteínas de todos los sistemas pueden actuar sobre múltiples
sustratos.
La distribución de las quinasas de proteinas en los distintos
tejidos se determinó utilizando histona, caseina o protamina como
sustratos proteicos exógenos. Estos sustratos resultaron ser unaherramiEnta muyútil para el estudio de las quinasas de protei
nas sin entrar a investigar la importancia Fisiológica de la fosforilación de los mismos.
Hrebs propuso en 1973 (82) un conjunto de criterios que de
bian ser satisfechos para poder decidir si un efecto particular
del AMPcera mediado por fosforilación proteica o no. Estos cri
terios son en cierto modoanálogos a los propuestos por Robíson,
Butcher y Sutherland (75) para decidir si un cierto efecto hormg
29
nal está mediado por el AMPc.Los criterios de-Hrebs son los si
guientes:
1.- El tipo de célula involucrada en el efecto del AMPccon
tiene una quinasa de proteína dependiente de AMPc.
2.- Existe un sustrato proteico que tiene una relación fun
cional con el proceso mediado por AMPc.
3.- La fosforilación del sustrato altera su Función in vitro.
h.- El sustrato proteico se modifica in vivo en respuesta al
AMPc.
5.- Existe una fosfatasa de Fosfoproteina para revertir el
proceso.
El primer criterio parece ser universalmente satisfecho en
células animales. Hay tres efectos del AMPcque hoy ya son Cláfii
cos, para los cuales se cumplentodos estos criterios: l) acele
ración de la glucogenolisis, proceso en el cual ya se ha demostrg
do la cadena de fosforilaciones que llevan a la activación de la
glucógeno fosforilasa (83, BA); 2) reducción de la sintesis de
glucógeno, por inactivación de la glucúgeno síntetasa (85-87);
3) aumentode la lipólisis en tejido adiposo por activación de
la lipasa (BB-9D).
Se ha demostrado que estos efectos primarios del AMPcson más
complejos. Por ejemplo, el aumento de la lipólisis en tejido adi
3D
poso no está mediado unicamente por Fostorilación de 1a lipasa,
sino que también son capaces de ser reguladas de 1a misma mane
ra otras enzimas que intervienen en este proceso, tales comola
acetil BoA-carboxilasa(91), la glicerofosfato acil transferasa
(92), colesterol éster hidrolasa e hidrolasas de di y monogli
céridos (93).
UI. FÜSFÜRILACIDN — DESFÜSFÜRILACIÜN DE PRDTEINEQ
VI. 1_Modificggiones covalentes de proteínas
El reconocimiento de la modificación covalente y reversible
de proteinas, como un proceso regulatorio muyimportante, fue
el resultado de varios trabajos sobre el metabolismo del gluco
geno realizados hace un cuarto de siglo (9h,95). Así se demos
tró que la enzima glucógeno fosforilasa puede existir en dos
formas interconvertibles y de distinta actividad, una forma fos
Forilada y otra desfosforilada. A partir de este primer ejemplo
se han ido describiendo otras muchasmodificaciones covalentes
reversibles de proteinas.Se ha estimado que las proteinas sufren
al menos125 modificaciones covalentes post-traduccionales que
involucran reacciones que originan derivados de los residuos ami
noácídos individuales por formación de enlaces covalentes (96).
No obstante, dentro de este amplio espectro de reacciones de
31
modificación, sólo se pueden identificar cinco o seis tipos de
modificaciones covalentes y reversibles de proteínas en condicig
nes fisiológicas: 1. Fosforílación-desfosforilación; 2. acetila
ción-desacetilación (97); 3. adenilílación-desadenililación (98);
h. uridililación-desuridililación (99); 5. metílación-desmetila
ción (lÜÜ) y 6. interconversiones S-S - SH. (lÜl).
Las modificaciones covalentes reversibles se consideran de
naturaleza regulatoría. Nosreferiremos específicamente a las
reacciones de fosforilación-desfosforilación.
VI. 2.Fosforilaciún y desfosforilación de enzimas
El mecanismode fosforilacifin-desfosforilación de enzimas
no difiere de cualquier reacción reversible de fosforilación
desfosforilación de proteínas no enzimáticas en las cuales intervienen quinasa de proteínas y fosfatasas de fosfoproteínas,
y puede esquematizarse comose ve en la fig.3.
Para que las reacciones de Fosforilacíón-desfosforilación
tengan una Función regulatoria, es evidente que señales apro
piadas deben producir cambiosen las concentraciones relativas
de las formas fosforiladas y no Fosforiladas del sustrato pro
teico. Del esquemaanterior surge que esto puede ocurrir a tra
vés del control del paso en donde intervienen las quinasas de
proteínas o aquel en el que intervienen las fosfatasas de fosfg
32
NTP NDPOuinoso de_—_\
// Proteína\\
Proteína Proteín\o-Fosfoto
Fosfotoso de
P, Fosfoprotel'noI
Figura 3: Mecanismode Fosforilación-desfosforilación de proteinas.En general NTP es ATP.
proteínas o a través de la regulación simultánea de ambas reaccyo
nes. Estos controles pueden involucrar respuestas rápidas e inme
diatas, comopuede ocurrir debido a fluctuaciones en los niveles
de las moléculas efectoras; o puede estar mediada por cambios
adaptativos que alteren la relación quinasa de proteína/fosfatasa
de FosFoproteína dentro de la célula.
Hreos y Beavo (lÜl) proponen los criterios que deben satisfa
cerse para establecer si el prooeso de fosforilación-desfosforila
ción de una enzima es fisiológicamente relevante:
33
1.- Demostración in vitro que la enzima puede ser fosforila-'
da estequiométricamente a velocidades significativas, en
una reacción catalizada por una quinasa de proteina apra
piada y desfosforilada por una-fosfatasa de fosfoproteina.
2.- Demostración de que las propiedades Funcionales de la en
zima sufren cambios significativos que se correlacionan
con el grado de fosforilación.
3.- Demostración de que la enzima puede ser fosforilada y des
fosforilada in vivo o en un sistema de células intactas
con los cambios Funcionales acompañantes.
h.- Correlación entre los niveles celulares de los efectores
de la quinasa de proteina y/o Fosfatasa de fosfoproteina
y el grado de Fosforilación de la enzima.
En la Tabla l se encuentra una lista de enzimas cuya actividad
está regulada por fosforilación-desfosforilación.
UI. 3.guinasas de proteinas
Las quinasas de proteinas catalizan la siguiente reacción:
proteina + NTP-———-——)proteína-fosfato + NDP
La reacción de fosforilacíón requiere la presencia de un metal
divalente, generalmente Mg2+o Mn2+.
TABLA 1
3h
Enzimascuya actividgd está regulada por fosfprilación-desfpsfp
rilación (101).
Año en el que se informó
Fdsfdrilasa de glucógenoFosfdrilasa quinasaSintetasa de glucógenpLipasa sensible a hormonasFructpsa 1,6 difpsfatasaPiruvatd deshidrpgenasaHidrdximetilglutaril BOAreductasaAcetil CDAcarbdxilasa
ARNpolimerasa dependiente de ADNPiruvato quinasa (higado)Colesterol éster hidrolasaSubunidad R de la quínasa de proteinadependiente de AMPC del tipo IITranscriptasa reversaFusfdfructpquinasa (higado)Tirosina hidroxilasaInhibiddr l de la Fpsforilasa FpsfatasaFenilalanina hidroxilasaQuinasa del Factor de iniciación F2Triptpfand hidraxilasaQuinasa de proteína dependiente de GMPcGlutamatd deshidrpgenasa dependiente deNAD(levaduras)Glicerplfpsfatp aciltransferasa
1955
1959
1963l96h1966
1969
1973
1973
1973
197b
l97h
l97h
1975
1975
1975
1975
1976
1977
1977
1977
1978
1978
35
La mayoria de las quinasas de proteinas funcionan con ATP,
aunque algunas pueden utilizar BTP(102,103). La fosforilación
ocurre principalmente sobre el grupo hidroxilo de la serina dela proteína sustrato y en muchomenor grado sobre el hidroxilo
de la treonina, aunque algunas quinasas especificas pueden trans
ferir el Fosfato a histidina, lisina o tirosina (10h,105).
UI. b.Clasífícaci6n de las guinasas de proteínas
Se puede tener un esquema de clasificación de las quinasas
de proteínas basada en los agentes que interactúan directamen
te y regulan la actividad de estas enzimas, y que también sirven
comomensajeros en la transmisión de señales desde el exterior
de la célula. Dicha clasificación tomada de Krebs y Beavo (lÜl)se encuentra en la Tabla 2.
TABLA 2
Clasificación de las guinasas de proteinas basada en su regulación por agentes específicos.
Categoria Nombre Entidades reconocidas
1 uinasas de roteinas de en . . (a)Sientes de AñPc p —' Tlpo I y Tlpu II
2 Quinasas de proteínas depen . .dientes de GMPC —- una entidad conoc1da
3 Quinasas de proteinas depen quinasas de fosforilasadientes de Ca * y quinasa de la cadena
liviana de la miosinah Quinasas de proteínas depen . .
dientes de ARNde doble cadena una entldad CDnDCIÜG5 Quinasas de proteinas sin mg numerosos ejemplos co
dulador conocido nocidos(a) Los dos tipos de quinasas de proteinas dependientes de AMPc
difieren en la naturaleza de sus subunidades regulatorias pgro tienen subunidadescatalíticas idénticas (106-107).
36
VI. 5.guinasas de proteinas dependientes de AMPc
En 1970 se dilucidú en varios laboratorios, en forma indepeg
diente, el mecanismode activación de las quinasas dependientes
de AMPc(lÜB-lll), luego de descubrir que este tipo de enzimas
estaban formadas por dos tipos de subunidadeszcatalíticas (C),
que catalizan la transferencia del fosfato'ï del ATPa ciertas
proteínas, y subunidades regulatorias (R), que en ausencia de
AMPcinhiben la actividad de la subunidad C. El AMPcactiva a es
tas proteínas provocando la disociación de la holoenzima inacti
va (R282) en un dimero de la subunidad regulatoria (R2) y dossubunidadescatalíticas libres activas (28) (112,113). Estudios
recientes (11h,115) indican que se unen 2 moles de AMPcpor mo
nómero de subunidad R, según la ecuación:
R C + h AMPC é———-—* R .AMPC + ZC2 2 2 h
La activación pudo proceder por dos rutas mecanísticamente
diferentes (116):
l. El AMPcpuede ejercer su efecto por unión al dímero R2 y
desplazar un equilibrio prexistente entre la holoenzima y sus
subunidades hacía la formación de C actiVa, según la ecuación:
R282 c——ï R2 + 20
a AMPc
R .h AMPC2
37
2. El AMPcpuede unirse a la holoenzima Formando un complejo
ternario que luego se disociaría en sus subunidades componentes
según la reacción:
R282 + h AMPC q———-á R2C2.AMPCQ v—-¿ R2.AMPoh + ZC
Las evidencias cinéticas de la existencia de un complejo te;
narío en eucariontes superiores, comoun paso obligatorio en el
proceso de disociación (117,119) favorecen la segunda hipótesis.
Este complejo ternario ha sido aislado recientemente en nuestro
laboratorio (120).
Las numerosas quinasas de proteinas dependientes de AMPcque
han sido caracterizadas, independientemente de su origen, mues
tran gran similitud con respecto a propiedades que se relacionan
aparentemente con la Función biológica, tales comoafinidad por
el AMPcy especificidad de sustrato. Hay numerosos ejemplos en
la literatura que muestran la semejanza de diferentes quinasas
de proteinas (121,122). En apoyo de esta analogía están los ex
perimentos en los que se demuestra la actividad de la enzima
de un tejido sobre sustratos de otros tejidos y otros en los que
se reconstituyen quinasas de proteinas dependientes de AMPcut;
lizando subunidadescatalitícas y regulatorias de distinto ori
gen (88,89,122). Estas analogías se hacen extensivas aún a las
quinasas de proteinas dependientes de AMPcfirmemente unidas a
componentessubcelulares (123,125).
38
Se podria suponer que hay múltiples quinasas de proteinas
dependientes de AMPc,cada una con especificidad para un solo
sustrato proteico y con respuesta probablemente diferencial reg
pecto de las concentraciones de AMPc.Sin embargo, la evidencia
experimental indica que no hay diferencias con significado Fun
cional evidente entre laa quinasas de proteinas aisladas de va
rias fuentes.
La mayoria de las quinasas de proteinas estudiadas tienen
un peso molecular que oscila entre lhÜ y 190 H y un coeficiente
de sedimentación entre 6,8 y 7 s (126-129). Los pesos molecula
res de la subunidad catalitica (C) y del dimero de la subunidad
regulatoria (R2) son aproximadamente ADy llÜ H respectivamente(130).
Las diversas quinasas de proteinas dependientes de AMPcse
distinguen por cromatografía de intercambio aniónico y cada te
Jido tiene una distribución caracteristica de las mismas
(106,107). Algunos tejidos, comoel corazón bovino, poseen una
forma predominante de la enzima mientras que en otros, como
músculo esquelético porcino y cerebro bovino, aparecen dos for
mas enzimáticas (131).
Se puede agrupar a casi todas las quinasas de proteinas
dependientes de AMPcen dos categorias principales; tipos I y II
según el orden de elución de estas enzimas de una columna de in
39
tercambio aniónico (106,107).
Las quinasas de proteinas de tipo I eluyen de una columna
de DEAE-celulosa con D,UB-Ü,10 M de ClNa, mientras que las de ti
po II lo hacen con concentraciones mayores de sal (0,15-Ü,20 M).
Las diferentes propiedades de los dos tipos de isoenzimas
son atribuibles a diferencias en el componente receptor de AMPc
ya que la subunidad catalitica de ambasparece ser idéntica
(107,129).
Las diferencias más notables entre ambostipos de quinasas
de proteinas pueden resumirse de la siguiente manera:
a) Las quinasas de proteinas de tipo II sólo se disocian
por AMPc,mientras que las de tipo I lo hacen por AMPc,
histona o alta concentración salina (132).
b) Las quinasas de proteinas tipo II son de muyfácil rea
sociación. Al disminuir la concentración del agente di
sociante (AMPc)se produce la recombinación inmediata
de las subunidades, a no ser que haya en el medio ClNa
0,5 M. Las subunidades de las quinasas de proteina de
tipo I pueden mantenerse disociadas aún en ausencia de
AMPcy ClNa (132).
Vc Las quinasas de proteina de tipo I y II se diferencian
por las propiedades de sus subunidades regulatorias, las
AD
cuales pueden ser distinguidas inmunologioamente(133).
Las quínasas
prototipo de
(13h). Se ha
la subunidad
sensibilidad
Las quinasas
de proteinas de corazón bovino y porcino,
las enzimas de tipo II, se autofosforilan
demostrado que la fosforilación ocurre en
regulatoria. Esta fosforilación aumentala
de la holoenzima a la disociación por AMPc.
de proteina de tipo I si bien no se auto
fosforilan por una reacción comparable a la de autofos
forilación de la enzima de tipo II (135), pueden unir 2
moléculas de ATPpor molécula de enzima con muy alta
afinidad, esta unión de ATPreduce la afinidad de la en
zima por el AMPc,siendo entonces necesaria una concen
tración mayordel nucleótido ciclico para su disociación
y activación.
VI. 6. guinasggde proteinas dependientes de AMPcen eucariontes
inferiores.
A diferencia de lo que ocurre en organismos eucariontes su
periores, es muypoca la información que se tiene sobre la estrdg
tura y función de las quinasas de proteínas dependientes de AMPc
en eucariontes inferiores. Takai y colaboradores (136) aislaron y
caracterizaron una quinasa de proteinas de Saccharomycescerevisiae.
La enzima posee una estructura polimérica similar a la de las enzi
bl
mas de organismos superiores, aunque es de menor peso molecular.
La subunidad catalitica es capaz de interactuar con la subunidad
regulatoria purificada de higado de rata para formar una holoen
zima híbrida.
En Eoprinus macrorhizus se encontró una actividad de quina
sa de proteina dependiente de AMPcestimulaole por iones M92+y
Mn2+ . La actividad quinésica total aumenta durante la Formación
de basidiocarpos (137). En Dictyostelium discoideum se encontra
ron dos tipos de quinasas de proteinas dependientes de AMPccon
propiedades cromatográficas similares e las enzimas de tipo I y
II de mamíferos (138).
En Blastocladiella emersonií Maia y colaboradores (139,1hD)
describieron una quinasa de proteina dependiente de AMPcsoluble
que se separa de las otras actividades quinásicas en columnas de
DEAE-celulosa.
En Neurospora crassa Powers y Pall (lhl) y Torres y colabo
radores (142) encontraron formas múltiples de quinasas de protei
nas que se resuelven en columna de DEAE-celulosa. La enzima que
eluye a menor Fuerza iónica resultó ser la única con actividad
dependiente de AMPc.Este último grupo determinó los parámetros
moleculares de esta enzima y encontró que es una proteina de bajo
peso molecular (118 H),cuya estructura seria dimérica y no tetra
mérica (lh3).
#2
VI. 7. guinasa de proteina dependiente de AMPcen Mucor rouxii
Passeron y colaboradores demostraron la existencia de una
quinasa de proteína dependiente de AMPcen extractos solubles de
ambasmorfologias del hongo (lhh). Estudiaron la estructura poli
mérica de la enzima y las condiciones necesarias para su disocüg
ción y reasociación in vitro (lu5,lA6). La holoenzima parcialmen
te purificada seria un tetrámero y tendria un peso molecular apra
ximado de 210 H y se dísocia por la acción conjunta de AMPce his
tona o ClNa (lhs). Recientemente demostraron que comopaso obliga
torio en el mecanismo de activación de la holoenzima se forma un
complejo ternario holoenzima-AMPc(120).
VI. 8. Fosfatasas de Fosfoproteingg
Las reacciones de fosforilación de enzimas deben ser reveg
sibles para que cumplan un papel regulatorio en los eventos me
tabólicos. La desfosforilación de las enzimas fosforiladas se
lleva a cabo por la acción de fosfatasas de Fosfoproteinas. Des
de esta perspectiva, estas enzimas son una parte integral del me
canismo de regulación por Fosforilación.
La actividad fosfatásica de Fosfoproteinas cataliza la des
fosforilación de una variedad de sustratos proteicos en forma
inespecifica (lÜl,lb7). Se han podido aislar Fosfatasas de fosfigproteinas a partir de varios tejidos superiores; las enzimasde
b}
higado y corazon, llevadas a homogeneidad con etapas que inclu
yen tratamiento con etanol, presentaron un peso molecular de 35 K
(lh8-151).
Lee y colaboradores (152) aislaron de varios tejidos de ma
míferos un complejo "nativo" u holoenzima de la Fosfatasa de al
to peso molecular (260 H) al que llamaron fosfatasa de Fosfopro
teina H. Por acción de etanol, urea o mercaptoetanol, esta holo
enzima se disociaria y activaria para dar lugar a la Formade bg
jo peso molecular (35 H) y a'la que los autores llamaron fosfo
proteina fosfatasa C. Los mismosautores postulan que podrian
existir formas de peso molecular intermedio entre la holoenzima,
de alto peso molecular y 1a forma catalitica, de bajo peso mole
cular. Se han aislado de distintos tejidos de mamíferos Fosfate
sas de peso molecular intermedio (v.g. 3DG, 170, 75, A5 H) (153).
No se sabe si estas Formasrepresentan derivados proteoliticos de
la fosfatasa H descripta por el grupo de Lee o son otras formas
nativas de fosfatasa de fosfoproteinas (151,15h).
Inhibidores de la actividad fosfatásica
Cohen y colaboradores (155,156) y Huang y Glinsmann (157-159)
describieron en distintos tejidos, dos proteinas termoestables y
de bajo peso molecular que son inhibidoras de la actividad fosfa
tásica y a las que llamaron inhibidor l y 2. El inhibidor l solo
presenta actividad inhibitoria cuandoestá Fosforilado (157).
kb
La capacidad inhibitoria de ambasproteinas es diferente s2
bre las distintas formas de fosfatasas de fosfoproteinas
(156,160,161).
VI. 9. Fosfatasas de fosfoproteinas en Mucorrouxii
Prácticamente no se ha realizado ningún estudio de estas en
zimas en eucariontes inferiores. En nuestro laboratorio, se ini
ció recientemente el estudio de estas actividades enzimáticas en
la forma filamentosa del hongo. Experimentos preliminares indica
rian que existen al menos dos Formas de fosfatasa, ambas de bajo
peso molecular, aproximadamente 3D H, con distintos requerimien
tos de iones Mn2+(M. Seigelchiefer, comunicación personal).
VII. METABOLISMO DEL AMPc
En todos los sistemas biológicos estudiados hasta el momen
to, el AMPoes sintetizado por la enzima adenilato ciclasa y de
gradado por la enzima fosfodiesterasa. Los niveles intracelula
res del nucleótido cíclico están regulados por las actividades
relativas de las enzimas que lo sintetizan y degradan y por la
expulsión del nucleótido cíclico a1 medio extracelular.
#5
VIII. ADENILATÜCICLASA
La adenilato ciclasa es la enzimaque cataliza la sintesis
de AMPcsegún la ecuación general:2+
MeATP—-—" AMPc+ PPi
Donde Me2+puede ser M92+o Mn2+. El sustrato de esta reacción2parece ser el complejo ATP.Me y los cationes divalentes libres
serian activadores de la reacción. En casi todas las células animales estudiadas la adenilato ciclasa es sensible a la acción de
hormonas. Esta enzima parece formar un complejo compuesto exclu
sivamente por proteínas intrínsecas de la membranacelular. Las
proteinas que constituyen la adenilato ciclasa son un pequeñopor
centaje de las proteinas de membranay probablemente no existan
en una concentración superior a lÜ pmoles/mg de proteina de mem
brana y algunas veces son 100 veces menos abundantes (162).
Se sabe que la adenilato ciclasa sensible a hormonasestá
compuestapor al menostres proteinas interactuantes (162): l) una
proteína catalitica (C) que es relativamente inactiva y que no es
regulable; 2) una proteina ligadura de nucleótídos de guanina
(G/F) que media la acción activedora de los nucleótidos de guani
na (163) y del ión F" (16h) y 3) uno o más receptores hormona
les (R) (165). Estas tres proteinas han podido ser aisladas fis;
camente (166-169) y se han estudiado sus propiedades. La proteina
h6
catalítica C presenta baja actividad con ATP. M92' y no es es
timulable por hormonas, nucleótidos de guanina o F-. La proteína
G/F permite que la proteina C utilice el complejo ATP. M92"como
sustrato y puede unir nucleótidos de guanina y F' permitiendo
que modulenla actividad de la subunidad catalítica.
Los receptores hormonales (R) presentan el sitio de unión
para la hormona en la cara externa de la membrana. En la misma
célula puedenexistir receptores con distinta especificidad de
hormona. Aún no hay evidencias de la interacción directa del re
ceptor hormonal con la proteina catalïtica (162). aunque se ha
postulado (170) que el receptor, que es una entidad independien
te de la subunidad C, podría moverse dentro de la membrana y
cuando la hormona activante se une al receptor aumenta la afini
dad de éste por la enzima, modificando la actividad catalïtica
de la adenilato cíclasa. Este modelo se basa en el concepto de
la naturaleza dinámica y Fluida de las membranascelulares (171),
ya que el contacto entre el receptor y la subunidad catalítica
se produciría por movimientolateral de estas proteinas de la
membrana.
VIII. 1. Adenilato ciclgsa en eucariontes inferiores
Esta enzima ha sido estudiada en numerosas especies de hon
gos y protozoarios (52,172-189).
A7
Las características generales de las adenilato ciclasas de. . . . . 2+eucariontes inferiores son: baja act1v1dad con iones Mg
2+
y alta
actividad con Mn ; no son estimulables por iones F' o nucleóti
dos de guanina y son insensibles a la estimulación por hormonas.
Las enzimas de Neurospora crassa (181,182), Phycomyces
blakesleeanus (176) y Tetrahymggagpyríformis (179) constituyen
excepciones, ya que se encontró que son estimuladas por hormonas.
La mayoría de las adenilato cíclasas de eucariontes inferio
res están debilmente unidas a la membranaplasmática, de la cual
pueden ser extraídas por detergentes o sales (179,183).
Tambiénse ha observado que la actividad de adenilato ciclasa
de algunos eucariontes inferiores varía durante el ciclo de vida
(52,150,1eu,1a5).
En Dictyostelium discoideum se ha descripto una actividad
de adenilato ciclasa activa con iones Mg2+(186) y estimulable
por AMPc(187). Recientemente se ha demostrado que esta enzima
esta asociada a pequeñas vesículas membranosasno relacionadas
con las membranasplasmáticas (188).
En esporangióforos de thcomyces blakesleeanus (176) se des
cribió una actividad de adenilato ciclasa con propiedades simi2+
!lares a la enzima de mamíferos: activa con iones Mg activable
por GTP,inhibible por altas concentraciones de nucleósidos tri
LB
fosfatos y activable por catecolaminas.
En Neurospora crassa Torres y colaboradores estudiaron
exhaustivamente esta enzima tanto en la cepa salvaje comoen una
cepa mutante carente de pared celular (57,181,182,189). Esta en
zima particulada pudo solubilizarse mediante el empleo de sales.
La enzima soluble fue purificada por métodos clásicos y se deteg
minaron sus parámetros moleculares y propiedades cataliticas,
siendo éstas semejantes a lasde la enzima de membrana; en cuanto
a los parámetros moleculares Éstos son similares a los descriptos
para la subunidadcatalitica de la adenilato ciclasa de tejidos
sensibles a hormonas (183).
VIII. 2. Adenilato ciclasa en Mucorrouxii
En nuestro laboratorio se aisló y caracterizó una adenila
to ciclasa de Fracciones particuladas de la forma filamentosa y
levaduriforme del hongo (un). Por acción de detergentes esta ac
tividad se separa de los fragmentos de pared celular y se la en
cuentra en una fracción membranosa que sedimenta a 105.000 x g
(18h). Las propiedades cinéticas de la enzima unida a membrana
son semejantes a las de las enzimas de otros eucariontes infe
2+ y la insensibilidadriores en cuanto a requerimiento de iDn Mn
a iones F' y a nuclefitídos de guanina (190). Parte de la activi
dad particulada pudo ser solubilizada por la acción de 81H 'D,5 M
h9
(190). La enzima soluble tiene un peso molecular significativa
mente más alto (500 H) que el encontrado para la enzima soluble
de N. crassa (202 H) (183), pero muy semejante a la enzima de
levadura de panaderia (173).
IX. FÜSFÜDIESTERASA
Hace aproximadamente un cuarto de siglo Sutherland y Rall
(191), describieron brevemente una enzima, presente en varios
tejidos de mamíferos, posiblemente una diesterasa, que era ca
paz de catalizar la hidrólisis de AMPca 5' AMP.Casi contempo
raneamente Drummondy Perrott-Yee (192) Encontraron en cerebro
de conejo que la conversión.de AMPca 5' AMPestaba catalizada
por una actividad diesterásica presente en ese tejido. En 1962,
Butcher y Sutherland (193) purificaron parcialmente la enzima
de corazón bovino y describieron sus propiedades y distribución
subcelular.
La reacción general que cataliza esta actividad enzimática
puede verse en la Figura h.
50
NH2 NH2
N/ N N/ N
K'J KN'NJ
\N N
Fosfodiestercsa
H2 o CH‘Z O
o\/O<—P/\
O OH
0
o<—\°/-0 -0 O- OH
AMPC 5 AMP
Figure h: Hidrólisis del AMPcpor le fosfudíesterasa de AMPC.
Ü en forma general, para la actividad de fosfddiesterasa de nu
cleótidds cíclicus:
NMPCFdsfddiesterase =: 5' NMP2+ '
Me
Donde NMPcindica.generalmente: AMPco GMPC.
En general esta enzima es activada por cationes divalentes
Mg2+ o Mn2+.
El gran cambio de energia libre CAF:- 8.000 cal/mol) que
está asociado a la hidrólisis del AMPC,en condiciones fisioló
gicas, sugiere que la hidrólisis del AMPCestá muyfavorecida
(19h).
51
IX. 1. Formas múltiples
Los primeros trabajos sobre actividad de fosfodiesterasa
(PDE)en diversos tejidos de mamíferos (192,193,195,l96), mostra
ron que aparecia una actividad soluble de PDEcon una Hmde apra
ximadamente lÜ-h para el AMPc.En base a estos resultados se cueg
tionó el significado Fisiológico de esta enzima con tan baja afi
nidad para el sustrato, ya que la constante de afinidad es dos o;
denes de magnitud superiores a los niveles intracelulares de AMPc
en esos tejidos (197). Con el desarrollo de métodos de ensayo más
sensibles, varios autores (198,199) lograron detectar una activi
dad de PDEmás afin por el sustrato. Actualmente se sabe que la
mayoría de los tejidos de mamíferos contienen al menos dos formas
de PDE.de AMPc(Ac-PDE) con distinta afinidad para el nucleótido
cíclico. Las primeras evidencias de la existencia de más de una
forma de PDEFueron de orden cinético (198-201).
Thompsony Appleman (202) lograron por primera vez, a partir
de tejido de cerebro, la separación fisica de dos Formas de pESU
molecular y caracteristicas cinéticas diferentes. La forma de al
to peso molecular (bÜÜ H) era capaz de hidrolizar AMPcy GMPcy
tenia baja afinidad relativa para ambossustratos. La Formade ba
jo peso molecular (ZÜÜH) tenia alta afinidad para el AMPcy no
hidrolizaba GMPc,presentó una cinética indicativa de cooperativi
dad negativa y se postuló que representaría la forma fisiológicade la enzima.
52
A partir del trabajo ya clásico de Thompsony Appleman, se
han ido encontrando más de una forma de PDEen casi todos los te
jidos de mamíferos estudiados, habiéndose detectado hasta siete
isoenzimas en tejidos de ratón y conejo, con no más de cuatro
formas distintas por tejido (203). Muchasde las formas de PDE
de mamíferos son interconvertibles (20h,205).
En los trabajos de revisión de Applemany colaboradores (197).
Appleman y Terasakí (206), Uells y Hardman (207) y Strada y
Thompson(208) se pueden encontrar excelentes recopilaciones de
las distintas formas de PDEencontradas en diferentes organismos.
Las distintas formas de PDEdifieren en: comportamiento cinética,
especificidad y afinidad por el sustrato, peso y forma molecular,
sensibilidad diferencial a la temperatura y cationes, localización
tisular y distribución subcelulsr, punto isoeléctrico, sensibili
dad a agentes farmacológicos, modulación por distintos efectores
(V.g.calmodulina), sensibilidad s enzimas proteoliticas. Pocas de
estas formas múltiples han sido purificadas a homogeneidad,sien
do posible que una o más de estas formas representen una composi
ción de actividades (207).
Los métodos más utilizados para separar fisicamente las dig
tintas formas de PDEincluyen: filtración por gel (199,202,209,210),
cromatografía de intercambio anifinico (lh3,2ll-215), electrofore
sis en gel de almidón (203,216), electroforesis en gel de poliacri
53
lamida (217-219), centrifugaciún en gradientes de densidad
(lh3,20h,220), isoelectroenfocado (221-223) y cromatografía de
afinidad (213).
Las principales Formas de PDEencontradas en los distintos
tejidos estudiados y sus caracteristicas, puedenresumirse de
la siguiente manera:
(I) Fosfodiesterasa de GMPco Fosfodiesterasa de alta Hm
para AMPc.Corresponde a la descripta originalmente por Butcher
y Sutherland (193) en corazón bovino y que fuera posteriormente
purificada en otros laboratorios (22h,225) y en otros tejidos
(226,227). Seria representativa de una de las Formasprincipales
de PDE; hidrolíza el GMPcen el rango pM y el AMPcal menos en
un orden de magnitud mayor. Esta enzima es generalmente soluble
y activable por calmodulina (228). La enzima parcialmente puri
ficada presenta una cinética clásica para la hidrólisis de ambos
nucleótidos ciclicos en un rango amplio de concentración de sus
trato y en presencia o ausencia de calmodulina. Esta forma enzi
mática se ha encontrado en la mayoria de los tejidos de mamífe
ros estudiados; a veces en ciertos tejidos en donde se informó
su ausencia se encontró que en realidad estaba en muybajas con
centraciones, como por ejemplo en médula adrenal de vaca y de
rata (229).
Se piensa que es una sola enzima la que cataliza la hidróli
sis de ambosnucleótidos, ya que la hidrólisis de cada uno de
51.
ellos es inhibida competitivamente por el otro con una Hi semejag
te a sus valores respectivos de Hm,lo que indicaria que está in
volucrsdo un solo sitio catalïtico; además: las actividades
diesterásicas de AMPcy GMPc(Ac-PDE y Gc-PDE) permanecen en re
lación constante durante la purificación de la enzima y la inag
tivaciún térmica de ambas actividades se produce a velocidades
similares (227,230).
(II) Fosfodíesterasa especifica de AMPcde alta afinidad.
Esta Forma ha sido encontrada en casi todos los tejidos de mami
feros estudiados (207) y en otros vertebrados (231) y aparece
asociada a Fraccionea particuladas (211,232,233). Puede ser libe
rada parcialmente a la fracción soluble por tratamiento con deter
gentes y shock osmfitico (197) o por sonicación (202,23h). Aparen
temente esta enzima particulads es una proteina integral de las
membranasy algunas de sus propiedades enzimáticas (v.g. sensibi
lidad a la calmodulina) dependende la integridad estructural de
las membranas.Tambiénse han descripto fosfodiesterasas especifii
cas para AMPcsolubles (215,235,236).
La actividad enzimática particulads es insensible a calmodu
lina pero sensible a hormonasy aumenta en respuesta a niveles ele
vados de AMPcen células intactas (23h,237,238).
Tanto la Formaparticulads comola soluble se caracterizan
por una alta afinidad para el AMPc,siendo inhibida la hidrólisis
55
de este nucleótido por concentraciones crecientes de GMPcen el
rangolpM (211). En muchos casos la hidrólisis del AMPcpresenta
una cinética no michaeliana (197,201). Este comportamiento cinÉ
tico puede explicarse de varias maneras: l) presencia de formas
múltiples con distinta afinidad por al sustrato (239), 2) una
enzima alostérica que presenta cooperatividad negativa (ZQÜ),
en la cual la enzimatendria dos sitios cataliticos. Inicialmente ambossitios son idénticos en cuanto a sus constantes de li
gado; luego de la unión de la primer molécula de AMPcla interag
ción sitio—sitio o subunidad-subunidad puede provocar una modifii
cación conformacional del segundo sitio, haciendo que este últi
mo una en forma más dificultosa otra molécula de AMPC.Este mode
lo fue propuesto por Russell y colaboradores (Zul) y puede asque
matizarse comose ve en la Figura 5, y es el resultado del análi
sis por computadora de los datos cinéticos de una enzima parcial
mente purificada de riñón de rata, 3) una enzima con más de un si
tio de unión, cuyas respectivas constantes de afinidad son dife
rentes e independientes del grado de saturación con el sustrato
(sitios no interactuantes); este modelo, aunque termodinamicameg
te es equivalente al anterior, no lo es Fisicamente (Ebl), h) una
enzima que se agrega en formas que tienen distinta afinidad por
el sustrato (20h).
Tambiénse han encontrado en distintos tejidos actividades
de PDEaltamente especificas para AMPcque presentan una cinéti
ca michaeliana (235,2h2, 2h3).
56
AMPc bajo
AMPc alto.E. D
Figura 5: Representación hipotética de un modelo de Ac-PDEcon 2
sitios de unión al sustrato que exhiben cooperatividad
negativa (2hl).
Pichard y Cheung (205) encuentran que en la fracción soluble
de cerebro bovino e higado de rata y en homogenados de plaquetas
¡humanas, se obtiene una representación linear de las dobles recí
procas para la hidrólisis del AMPcsolamente cuando la concentra
ción enzimática es muy baja.
(III) Fosfodiesterasa mixta o fosfodiesterasa de AMPcesti
mulable por GMPc.Otra Forma de PDEsoluble, tal vez menos distri
buida que las anteriores, se caracteriza porque cataliza la hidrg
lisis tanto de AMPccomo de GMPcpresentando baja afinidad para
ambos. Además bajas concentraciones de GMPcestimulan la hidróli
sis del AMPc(también a bajas concentraciones) pero no a la inveg
sa (211,212,2hh-2h7). La cinética de esta forma enzimática no es
58
y por isoelectroenfocado (221), seis fracciones de PDEen prepa
raciones sonicadas de cerebelo de rata, una sola de estas fraccig
nes podria ser similar a la forma I anteriormente descripta, uni
camente por su sensibilidad a la calmodulina, las otras formas pue
den representar enzimas distintas o ser formas originadas por
proteólisis o por agregación de una o más formas de las presentesoriginalmente. La existencia de distintos tipos celulares en los
tejidos estudiados hace dificil dicernir si las diferentes Formas
enzimáticas derivan del mismoo de diferentes tipos celulares (207).
En algunos casos es posible asimilar, por alguna característica,
una forma enzimática aislada a alguno de los tres tipos principa
les mencionados;pero se encuentran caracteristicas diferenciales.
Por ejemplo la PDEaislada y purificada extensivamente de retina
de sapo (25h) por su afinidad para ambosnucleótidos ciclicos se
podria asimilar a la forma I, pero difiere de esta última por su2+insensibilidad al Ca , EGTAo calmodulina (25b,255).
Se han señalado formas múltiples de PDEen larva de gusano de
seda, una de las cuales fue purificada extensivamente (256-257).
La enzima purificada degrada ambosnucleótidos ciclicos y compa;
te con algunas de las formas múltiple de plantas superiores
(210,258) la capacidad de hidrolizar nuclefitidos ciclicos de
purinas 2'-3' y 3'-5' monofosfatos (210,259). El producto de hi
drólisis de los monoFosfatos 3'-5' por la enzima de gusano de se
da es exclusivamente el 5' monofosfato (256), mientras que en
59
plantas se producen tanto 3' como5' monofosfatos (210).
Muchas Formas de PDE que aparecen en homogenados celulares
son producto del método de aislamiento (223) y a veces no estén
presentes en las células intactas (22h). Los métodospreparati
vos a la proteólisis limitada durante la extracción pueden con
tribuir a la multiplicidad aparente de las formas enzimáticas
(211); además la agregación de distintas formas enzimáticas pue
de explicar la aparición de múltiples Formasluego de filtración
en geles (260).
Se puede_concluir que hay que tener muy en cuenta las condi
ciones experimentales utilizadas al informar la separación y ca
racterización de formas múltiples de PDEde nucleótidos ciclicos,
sobre todo al comparar los resultados con los encontrados por
otros autores. Ademásde la posibilidad de error que puede exis
tir al tratar de extrapolar los resultados obtenidos in vitro
con lo que sucede in vivo.
IX. 2. Activadores de la actividad de fosfodíesterasa
Imidazol
El primer informe del efecto estimulatorio del ímidazol sobre
una actividad de PDEin vitro fue el de Butcher y Sutherland (193).
quienes encontraron que la actividad de PDEaislada de corazón og
60
vino, ensayada a alta concentración de AMPcen buffer contenien
do imidazol presentaba una actividad mayor comparada a la activi
dad en buffer Tris. Mástarde otros laboratorios encontraron efeg
to estimulatorio del imidazol sobre la PDEaislada de otros teji
dos superiores, tanto sobre la enzima de alta Hm(196,226) como
sobre la de baja Hm(201).
Utilizando altas concentraciones de AMPcen el ensayo, Roberts
y Simonsen (261) demostraron que tanto el imidazol como el imida
zol-h-ácido acético a concentraciones altas estimulaban la PDEsig
lada de cerebro de ratón aumentando la velocidad de disociación
de la enzima del producto de la reacción (5' AMP).
Otros investigadores demostraron que el imidazol antagoniza
un número de efectos hormonales, que son, o se piensa que son, me
diados por AMPc.Asi la lipóliais in vivo puede ser contrarresta
da por el imidazol,-el cual por activación de la PDE,haria dismi
nuir los niveles de AMPc(262). Un mecanismo similar Fue propuesto
para la acción de la histamina en corazón bovino (263,26h). En
músculoliso el imidazol antagoniza los efectos de la teofilina
(265). Comolos niveles de AMPcen los tejidos son generalmente
bajos, 1 a 3‘pM o menos (75,266) se supone que los agentes que
afectan la actividad de PDEactúan sobre la forma de baja Km;
no obstante la mayoria de los estudios del efecto del imidazol
sobre la actividad de PDEdescriptos anteriormente se realiza
61
ron a altas concentraciones de AMPc.Chasín y Harris (267) trsog
jando con dos PDE de la misma fuente, una de alta Km(l x lÜ'hM)
y otra de baja Hm(h x 10-6 M), demostraron que la enzima de ba
ja Kmes inhibida por el imidazol en el mismo rango de concentra
ción en que la enzima de alta Kmes estimulada de 3D a ED %.
Estos resultados sugieren que los efectos "anti-AMPc"del
imidazol en los tejidos, son mediados por un efecto sobre la
PDEde alta Kmo bien que los efectos del imidazol no están re
lacionados a alteraciones en la actividad de PDE.
Nucleótidos ciclicos
En cultivos de varias lineas celulares se vió que los meca
nismos responsables de los cambios en la actividad de PDEestán
relacionados, a veces, con los niveles intracelulares de AMPc.
Por ejemplo, se observó que los niveles altos de AMPcinducen la
síntesis de novo de la Ac-PDE,principalmente la forma de alta
afinidad, en fibroblastos de distintos origenes (23h,2h5,268,269),
células de glíoma (27D), linfoma (271) y hepatoma (272). Estos
trabajos demostraron que en presencia de agentes capaces de sumen
tar los niveles intracelulares de AMPc,como Bt AMPcy/o metil2
xantinas, se logra un aumento en la actividad de Ac-PDE. Este aumen
to de actividad puede ser bloqueado por tratamiento de las células
con inhibidores de la síntesis proteica, comocicloheximida y de
la sintesis de ARN,como actinomícina D. Ciertas hormonas como la
62
nbr-epinefrina y el isoproterenol, que aumentanlos niveles de
AMPcen las células de glioma, inducen la actividad de PDEtag
to de alta comode baja afinidad, requiriendo esta inducción
síntesis de proteina y de ARN,y se propone una regulación hdr
monal del AMPca largo plazo mediado por síntesis proteica
(270,273).
Calmodulina
Varios investigadores, al tratar de purificar la actividad de
PDEde distintos origenes, encontraron que se producía una gran
pérdida de la actividad enzimática durante la purificación
(192,193,27h). Contemporaneamentedos laboratorios trabajando
con cerebro bovino (275) y de rata (276), demostraron que la sepa
ración de un factor proteico durante la purificación, determina
ba la pérdida de actividad enzimática. Más tarde este último grg
po (277) demostró que este Factor proteico de cerebro de rata ag
tivaba solamente a la PDEen presencia de calcio. Actualmente se
conoce a esta proteina activadora con el nombre de calmodulina
(228). Aparece ampliamente distribuida, tal vez en forma ubicua,
en el reino animal. Se la halló en todas las especies de verte
brados estudiadas en concentraciones generalmente mayores que la
PDEa la cual activa y aparece en tejidos con actividad de PDE
independiente de calcio (197,207,278). Constituye el 0,5% de la
proteína total de corteza de cerebro de rata (279) y el 2%de la
proteina total del órgano eléctrico de la anguila (280).
63
Se la ha purificada a homogeneidada partir de varios teji
dos superiores (281-28h). Se han estudiado detalladamente sus prg
piedades fisico-químicas, éstas pueden resumirse diciendo que es
una proteina acidica termoestable, de estructura flexible, que
presenta una composición particular de aminoácidos y un peso mo
lecular de aproximadamente 19 H (228,278).
La relación entre la calmodulina y la actividad de PDEvaria
muchode tejido en tejido (285), lo mismoque durante el desarrollo
ontogenético del tejido u organismo, sugiriendo que ambasproteinas
estarian bajo controles genéticos separados (279). Esta variabili
dad puede explicarse también en base a la heterogeneidad celular
de cada tejido, a las distintas Formas de PDE, algunas de las cua
les no son activables, o porque el activador tenga otra Función no
relacionada con el metabolismode los nucleótidos ciclicos.
Aunquela mayoría de los trabajos sobre calmodulina se refie
ren a la Formasoluble de esta proteina, varios autores (279,282,
286) han señalado la presencia de calmodulina en fracciones parti
culadas de diversos tejidos. La partición de la proteina entre la
fracción soluble y la particulada en cerebro de rata depende de
2+ o EGTAen el medio de homogenización (279-282).la presencia de Ca
Gnegy y col. (286), trabajando con cerebro y médula adrenal de ra
ta, mostraron que en un sistema libre de células el activador es
liberado a la fracción soluble en respuesta a la adición de quina
6h
sa de proteina dependiente de AMPc, ATPy AMPc.En varios teji
dos de rata la actividad de PDEde nucleótidos ciclicos estimula
ble por calmodulina y la calmodulina quedan asociadas a la frac
ción microsomal luego de someter a esta fracción a tratamiento
hiposmótico y centrifugación (279). El tratamiento con detergeg
tes desenmascara la actividad latente de calmodulina unida a
membrana.
Se ha aislado una proteina similar a la calmodulina en pro
tozoos (287-288), hongos (288-291), invertebrados (292-295) y
plantas superiores (296-298), capaz de activar la PDEdependían
te de calcio de tejidos superiores.
La Función que desempeña esta proteina en organismos inferio
res no se conoce ya que es incapaz de activar a la PDEhomóloga.
La activación de la PDEde mamíferos por extractos de eucariontes
inferiores sugeriria que la estructura del activador proteico se
conservó durante la evolución (292). En procariontes, aunque no
se ha demostrado definitivamente su presencia, se vió que la ade
nilato ciclasa de Bordetella Eertusis es activada por calmodulina
de cerebro de ternero (299).
Teo y Uang (388) fueron los primeros en demostrar que la cal
modulina purificada de corazón bovino, es una proteina ligante de
calcio y que la PDEno es activada a menos que estén presentes
iones Ca2+. La calmodulina purificada contiene un mol de Ca2+
65
asociado (283), esto explicaría la presencia de calcio en fosfo
diesterasas parcialmente purificadas que conservan su máximaac
tividad hidrolítica (301,302). Estudios de ligado de Baz+mostra
2+ con alta afinidadron que la calmodulina une b moles de Ca
(303-305). La PDEactivable por calmodulina requiere, aparte de
Ea2*, un catión divalente para su actividad, en general Mgz+;
ambos cationes no pueden reemplazarse en sus respectivas Funcio
nes (283,300); no obstante el Mn2+, pero no el M92+, puede sus
2+ en los ensayos'in vitro (30h). Comola concentratituir al Ca
ción de calcio necesaria para lograr el 50%de la activación má
xima es del orden de su.concentraci6n celular (1-5 fM)
(283,300,306) y comola concentración intracelular total de 0a2+2+es 100 veces superior a la del Mn2+,el 0a sería el metal uti
lizado fisiologicamente (304).
El mecanismo de acción de la calmodulina sobre la PDE, fue
establecido por primera ve; por Teo y Uang en 1973 (300). Dicho
mecanismopuede resumirse de la siguiente manera (278).t
CaM + A Ca2+ ‘=—v CaM.Ca2+ ¿-—p CaM.Ca2+ (l)h h
n- l t nt
BaM.Ca2++ E ¿—_ (caM.Ca2*). E 4-, (CaM.Ca2+).E (2)A b h
Donde: CaM=calmodu1ina, E=apoenzima inactiva o parcialmente
activa y (‘) indica una nueva conformación.
66
2+ por mol deEn la primera etapa la CaMliga h moles de Ca
CaMde acuerdo a la ecuación (l), y la CaMadopta una conforma
ci6n más helicoidal transformándose en la especie activa, la que
se une reversiblemente a la apoenzima en la segunda etapa de
acuerdo a la ecuación (2)'y da como resultado la formación de una
holoenzima activa. De acuerdo a este esquema, el Flujo celular
de calcio tiene un papel fundamental en la regulación de la ac
tividad de la enzima. Sólo una de las formas múltiple de PDEes
activada por CaM, la que ha sido identificada como la enzima so
luble de alta Hm(ver sección IX. 1) aunque recientemente se ha
informado que la PDE de baja Hmde membrana de higado es depen
diente de CaMpara su actividad (307).
El efecto activador de la calmodulina sobre la actividad de
PDEde nuclefitidos ciclicos, se debe a cambios en la V (308,309),
cambios en la Hmaparente (227,310) o cambios de ambos paráme
tros (215,281).
Aparte de activar a la PDEde nucleótidos ciclicos, la cal
modulina es capaz de regular diversas actividades enzimáticas:
adenilato ciclasa de cerebro, ATPasa y bomba de Ca2+ de membra
na plasmática de eritrocitos, quinasa de la cadena liviana de la
miosina, quinasas de membranade cerebro, fosforilasa b quinasa
de músculo esquelético, quinasa dependiente de NADde plantas y
fosfolipasa A2 de plaquetas humanas. La calmodulina interviene
67
además en la regulación de otros procesos celulares tales como:
armado y desarmado de microtúbulos y estimulación de funciones
postsinápticas. A través del control de las quinasas de proteínas
ejerce una influencia indirecta sobre una variedad de procesos
celulares (278,311).
IX. 3. Efecto de hormonas
Se conoce desde hace mucho tiempo que la insulina tiene numg
rosos efectos sobre tejido adiposo y hepático, que son antagoni
cos a los producidos por la epinefrína y el glucagón. Los efectos
de estas últimas hormonas están relacionados con el aumento de
los niveles de AMPccomo consecuencia de la estimulacion de la
adenilato ciclasa (197). Butcher y colaboradores (312,313) encon
traron que la insulina puede reducir los niveles de AMPcen tail
do adiposo. El efecto antagónico de la insulina con el glucagón ylas catecolaminas sobre los niveles de AMPcfue demostrado en hí
gado por Exton y colaboradores (31h).
Los estudios del efecto de la insulina sobre la PDEarrojaron
resultados contradictorios que a veces no guardaban una correla
ción aparente con el tipo de tejido elegido u otra variable idea
tificable. Así, la actividad de PDEde tejido adiposo no mostró
una respuesta evidente en relación al estado diabético del animal
68
o al tratamiento con insulina (315,316). La mayoria de las inveg
tigaciones en las que no se encontró una relación clara entre el
efecto de la insulina y la actividad de PDE, se llevaron a cabo
ensayando la actividad enzimática a altas concentraciones de AMPc,
capaces de enmascarar cambios sutiles de la actividad enzimática;
Loten y Sneyd (317) señalaron este hecho e informaron por prime
ra vez, en forma concluyente, un aumento de la actividad de la
PDEde alta afinidad para AMPccuando incubaron in vitro células
grasas con insulina. Estos resultados fueron confirmados poste
riormente por otros investigadores (318-320). Este aumentode ac
tividad implica un aumento en la U de la enzima de alta afinidad
particulada. En adipocitos de rata el efecto de la insulina, lo
mismo que el de la epinefrina y del glucagón, se observa en la
fracción particulada, mientras que en hepatocitos se demuestra
más facilmente sobre la enzima solubilizada por schock osmfitico
(237,238,320). En células grasas y hepatocítos de rata la enzi
ma activable por insulina parece estar asociada con el reticulo
endoplasmático más que con la membranaplasmática (207,320).
En la Tabla 3 extraída del trabajo de Strada y Thompson(208)
se resume el efecto de varias hormonas sobre la actividad de PDE,
el tejido en el cual se estudió, el sustrato de la enzima y el
efecto sobre esta.
TABLA 3
69
Hormonasque afectan la actividad de FosFodiesterasa de nucleo
tídos cíclicos.52mmInsulina Célula grasa
HígadoMúsculoCultivo celularHepatocito
Glucagón HepatocitoHormona delcrecimiento HígadoCatecolaminas Célula grasa
PinealCultivo celular
ACTH Célula grasaProstaglandinas Cultivo celularColecistoqulnina Vesícula biliarTiroxina Célula grasa
TiroideTiroide
Glucocorticoldes Hígado
MúsculoCorazónPulmón
HepatomaLinfocito
Aldosterona VejigaEstrógeno UteroGonadotropinas -' Testículos
Preparación Sustrato Efecto
Particulada AMPc AumentaParticulada AMPc Aumenta
Tejido entero RMPc Aumenta
Homogenado AMPc,GMPc AumentaParticulada AMPc AumentaParticulada AMPc Aumenta
Particulada AMPc AumentaParticulada AMPc Aumenta
Homogenado AMPc AumentaSoluble AMPc Aumenta
Particulada AMPc Aumenta
Homogenado AMPc Aumenta
Homogenado AMPc Aumenta
Particulada AMPc DisminuyeSoluble AMPc,GMPc Disminuye
Particulada AMPc Redistribuye
Homogenado AMPc,GMPc Disminuye
Homogenado AMPc,GMPc Disminuye
Homogenado AMPc Disminuye
Homogenado AMPc Disminuye
Homogenado AMPc Disminuye
Sonicado AMPc DisminuyeHomogenado AMPc DisminuyeSoluble AMPc Disminuye
Soluole GMPc Disminuye
70
IX. h. Inhibidores de la actividad de fosfodiesterasa
Metilxantinas y papaverina
Conel objeto de estudiar los posibles tratamientos de dis
tintos trastornos metabólicos y/o endocrinológicos, se comenróa
estudiar la incidencia de ciertos compuestosfarmacologícamente
activos sobre la actividad de fosfodiesterasa. Este tipo de esto
dio sirvió, al mismotiempo, para una mejor caracterización del
sitio activo de la enzima.
Los compuestos más estudiados, en cuanto al efecto inhibito
rio de la actividad de PDEson las metílxantinas, análogos estrug
turales del núcleo de adenina. Ya en los primeros trabajos de ca
racterización de la actividad de Ac-PDEde mamíferos se describe
el efecto inhibitorio de estos compuestos (191,193). Las metilxagtinas más utilizadas comoinhibidores de la actividad enzimática
son: cafeína, teobromina, teofilina y l-metil, 3-isobutil xantina
(MIX). La estructura de estos compuestos se observa en la Fig. 6.
Comopuede verse, estos compuestos son derivados alquilados del
núcleo xantina en las posiciones 1,3 y 7.
Estos compuestosse utilizaron con frecuencia para evitar la
degradación "no deseada" de los nucleótidos ciclicos en ensayos
de la actividad ciclásica o comoagentes sinergisticos para estu
diar tanto in vitro comoin vivo el efecto de los nucleótidos
71
O O
H3C\N I I N/CH3 H3C\N N/HI k I
MKT/LN/ 0/ N/\N/CH3 LH3
® R II R
1 N II T 7O/KNAN/¿a ®
Íï ïï
H\N N CH3 H3C N N/H IO/KNAN/I O/KNAN/CH3 H3C—C—-CH2—CH3
© ® “Figura 6: Estructura de las metílxantínas. Cafeína (A), teufilina (B),
teobromina (B), l-metil,3-isobutil xantina (D), nucleo xanfil
na indicando la posición de las sustituyentes alquilo (E).
72
ciclicos agregados en forma exógena. Ademásse han utilizado pa
ra estudiar el papel de estos nucleótidos en la acción hormonal
(197,267).
Los estudios in vitro de la inhibición de la actividad de PDE
por teofilina, indicaron que este compuesto es un inhibidor compg
ititivo de la actividad Fosfodiesterásica de alta y baja afinidad
aislada de distintas fuentes (193,196,201.321).
Se ha informado (321) que la teofilina y el MIX, en el rango
mMde concentración, estimulan la actividad fosfodiesterásica de
nucleútidos ciclicos de varios tejidos de rata, cuandoestas en
zimas se ensayan a una concentración l mMde sustrato. El MIXre
sultó un inhibidor muypotente de la PDEaislada de adrenales y
adipocitos de rata; se encontró que este compuesto es lD a 15 ve
ces más efectivo que la teofilina comoinhibidor de la actividad
de PDE.
Goodsell y colaboradores (322) ensayaron distintos derivados
B sustituidos de la teofilina comoinhibidores de 1a actividad
de PDEtotal de corazón bovino, los derivados no ramificados me
til a n-hexil, ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil, isopropil eisobutil resultaron inhibidores máspotentes que la teofilina.
. La Eagaverina, un alcaloide derivado del opio, relajante de
la musculatura lisa, resultó ser un potente inhibidor de la PDE
de nuclefitidos ciclicos aislada de varios tejidos (323,32h).
73
Su acción inhibitoria es de lÜ a lÜÜ veces superior a la de la
teofilina (321,325). El tipo de inhibición por papaverina es de
tipo competitivo o no competitivo dependiendo del grado de pure
za de la enzima (326). Derivados de la papaverina (v.g. quinopg
rina, isoquinoleina, 6-Br papaverina) son inhibidores potentes
de la PDEde distintas Fuentes, siendo los 6,7 metoxi sustituyen
tes importantes para el efecto inhibitorio (267).
Chasin y Harris (267) dan una excelente recopilación de com
puestos farmacologicamente activos inhibidores de la actividad
fosfodiesterésica.
Bases purinicas y pirimidinicas, nuclgfisidos y nucleótidos
Estos compuestos resultaron en muchos casos inhibidores de
la actividad de PDE. Cheung (327) fue el primero en informar que
concentraciones altas de ATPy pirofosfato inhiben a la Ac-PDE
de cerebro, siendo la inhibición del tipo mixto. Este mismoautor
(196) encontró que el GTP, UTP, TTP, ITP y CTP inhiben a la
PDEde cerebro de rata, actuando probablemente por el mismo meca
nismo que el ATP. Esto se debería al quelato del metal divalente
en la mezcla de reacción por concentraciones altas de este nucleg
tido. Huang y Hemp1971 (201) encontraron que la adenina y la ade
nosina son inhibidores de la PDEde músculo esquelético de conejo
aun a bajas concentraciones.
7h
Se encontró que varios nucleúsidos y bases libres (adenosina,
inosina, guanosina y deoxiadenosina) inhiben la PDEde células
grasas (328,329) y de plaquetas humanas (33D).
Inhibidores proteicos
Además de los inhibidores ya mencionados, se ha demostrado
la presencia de numerosos factores endógenos, en general protei
nas, capaces de inhibir la actividad de PDE. Miki y Yoshida (226)
fueron los primeros en describir, en preparaciones de cerebro de
rata, la presencia de un inhibidor proteico cuya acción estaba
regulada por iones calcio.
Dumler y Etingof (331) aislaron y purificaron de retina de
buey una proteina inhibidora de la PDEde nucleótidos ciclicos,
principalmente de la actividad de Ac-PDE.Esta proteina es ter
moestable a pH ácido y posee un peso molecular de 38 H. El efeg
to sobre la actividad enzimática se traduce en una disminución
de la V. Aparentemente este inhibidor seria un complejo protéi
co y tendría asociada una subunidad termoestable de peso molecu
lar 15 H activadora de la PDE. Más tarde Liu y Uong (332) deteg
taron, en retina bovina, la presencia de una proteína termoestg
ble inhibidora de la actividad de PDEde nucleótidos ciclicos
homólogay de otros tejidos; esta proteina al igual que la de
Dumler y Etingof inhibe la actividad de PDEno activable por Baz+
75
pero su peso molecular es de SADH.
Uang y Desai (333) y Sharma y colaboradores (33h) describie
ron en tejido cerebral dos proteínas inhibidoras de la actividad
de PDEactivable por Ca2+. Ambasproteínas inhiben la actividad
enzimática ligando la calmodulina en presencia de Ca2+. Una de
estas proteínas es termolábil, de peso molecular BÜH y se la co
noce comocalcineurina (335). Se demostró que esta proteína inhi
bidora forma un complejo ternario con el calcio y la calmodulina
(336). Hlee y colaboradores (335) purificaron esta proteína a
homogeneidad a partir de cerebro bovino y encontraron que poseía
una estructura dimérica formada por dos subunídades A y B de pesos
moleculares 61 y 16 H respectivamente. La calcineurina seria el
principal componenteligante de calmodulina en cerebro bovino, y
su cantidad en este tejido sería 52 mg/Hg de peso húmedo(337).
molf y Hofmann(338) aislaron y purificaron de corazón bovino una
proteina estructuralmente similar a la calcineurina.
La segunda proteína ligante de calmodulina aislada de cerebro
bovino, es termoestable. El peso molecular de la proteína homoge
nea Fué determinado por Sharma y colaboradores (33h) quienes obtu
vieron un valor de 7D H. Estos mismos autores demostraron que se
trata de una proteína monomérica.
Beale y colaboradores (339) purificaron de testículo de rata
un inhibidor de la PDEdependiente de calcio de peso molecular 20 H,
76
que seria análogo al inhibidor termoestable de la quinasa de pro
teina caracterizado por Ualsh y colaboradores (BhÜ) en músculo es
queletal de conejo.
En plantas superiores también se han aislado Factores protei
cos endógenosinhibidores de la actividad diesterásica (210).
IX. 5. Fosfodiesterasa en eucariontes inferiores
En algunos eucariontes inferiores, principalmente hongos, se
ha informado de la presencia de más de una forma de PDE, pero en
muchos casos no se han podido asimilar a las tres Formas princi
pales descriptas para tejidos superiores (ver sec. IX. l.)
Asi, se ha descripto en distintas especies del orden Acrasia
les, principalmente en Dictyostelium discoideum, la existencia de
al menos dos y posiblemente más, formas de Ac-PDE (3hl-3h3). Una
de las formas es extracelular (ePDE) y se excretaria al medio co
mo una forma de alta afinidad (Hm, 15 pM) y coeficiente de sedimen
tación 6 5;en ausencia de DTTesta forma pasaria espontáneamente
s otra Forma de baja afinidad (Hm, 2 mM)y coeficiente de sedimen
tación 6,7 S (3bh,3h5). El aumento del coeficiente de sedimenta
ción y la disminución de la afinidad por el sustrato, se deberian
aparentemente a la asociación de la enzima con un inhibidor extra
celular, el cual seria inactivado por DTT(3h5-3h7). Este inhibi
dor de naturaleza proteica y de bajo peso molecular fue descripto
77
por primera vez por Riedel y Gerish (BAS)yse excretaria al me
dio cuando se detiene el crecimiento por agotamiento de nutrien
tes (3h7).
Malchou y colaboradores (3h9) describieron otra forma de
Ac-PDE asociada a membranas (mPDE) y cuyo nivel aumenta en los
estadios previos a la agregación; Pannbacker y Bravard (3h3)
encontraron que esta actividad es de alta afinidad para el AMPc
(Hm. lÜ FM).
La ePDEfue considerada parte del sistema de señalización
que determina la agregación de las amebas en respuesta a gradiql
tes de AMPc.Posteriormente Yeh y colaboradores (350) cuestio
naron esta hipótesis, ya que encontraron que el AMPcexógeno in
duce no solo la PDEextracelular sino también la enzima unida
a membrana.
Otros hongos en los cuales se ha informado la presencia de
formas múltiples de PDEson Physarum polyceghalum y Aspergillus
21253 (351»353). En el caso de la primera especie una de las for
mas es particulada y la otra es soluble y se excreta al medio.
Ambas Formas requieren Mgz+, son de baja afinidad para el AMPc
(Kmen el rango mM)y son inhibibles por metilxantinas y por
ATP(351). Hincaid y Mansour (352) encuentran que las activida
des de PDEen este organismo difieren en sus caracteristicas ci
néticas, presentando la forma particulada una cinética no michag
78
liana para la hidrólisis del AMPc;las dos formas difieren en su
respuesta a distintos inhibidores (v.g. metilxantinas, quazodina)
que al igual que el AMPcson agentes quimiotácticos para el movi
miento de las mixamebas. En el caso de A.niger, también se ha de
tectado la presencia de dos actividades de Ac-PDE,una extracelg
lar (E-PDE)y otra intracelular (I-PDE). La enzima intracelular
es soluble siendo la Hmpara el AMPcdel orden mM,mientras que
la Hmde la E-PDEpara este nucleótido ciclico es de 18 pM; ade
más, la enzima extracelular sensible a un inhibidor dializable
endógeno (353).
En Saccharomyces cerevisiae, Fujimoto y colaboradores (35h)
describieron y purificaron una actividad de Ac-PDEsoluble, inhi
bible por GMPcy por metilxantinas. El peso molecular calculado
para esta enzima es de 6h H. En S. carlbergensis se describió una
actividad de Ac-PDEsoluble de baja afinidad para el sustrato2+
(Hm0,2 mM), estimulable por iones Mn e inhibible por ATP, PPi
y polifosfato inorgánico (355).
En Blastocladiella emersonii, Maia y Camargo (#9) demostra
ron la existencia de una actividad de Ac-PDEen la fracción solu
ble de extractos de zoosporas. Dicha actividad es estimulable por
iones Mg2+,Mn2+y H+; las metilxantinas ensayadas y ciertos ca
tiones (Ca2+y Li+) resultaron inhibitorios de la actividad enzi
mática. En este organismo la adenina es un inhibidor más potente
que las metilxantinas. Vale y colaboradores (220) describieron
79
una actividad de Gc-PDEsoluble, ligeramente estimulable por iones
Mg2+o Mn2+e inhibible por metilxantinas. Estos mismos autores lg
graron separar en gradientes de glicerol tres picos de actividad
de PDE, dos de los cuales hidrolizan especificamente GMPcpresen
tando una cinética no michaeliana con Hm(s) h y AUPM y que posi
blemente representen un equilibrio de asociación entre subunidades.
El tercer pico de actividad, que aparece en la zona de menor coefii
ciente de sedimentación, es especifico para la hidrólisis de AMPc,
presentando una cinética michaeliana con una Km2 - AFM.
En Neurospora crassa, Scott y Solomon (356) describieron una
actividad de Ac-PDEasociada a la fracción particulada que sedimeg
ta a 100.000 x g, inhibible por metilxantinas, ADP,ATPy estimula
ble por imidazol. Recientemente Torres y colaboradores (lh3,357)
señalaron la existencia de Formas múltiples de PDEen esta especie.
Estos autores encuentran que por cromatografía en DEAE-celulosa de
la fracción soluble de extractos de mícelio se separan dos picos
de actividad de PDE. La actividad que eluye a menor fuerza iónica
presenta alta afinidad para GMPcy AMPc.Esta actividad pudo ser
resuelta en gradientes de sacarosa y filtración por gel en tres
formas de distinto peso molecular (225, 126 y 57 H). La actividad
que eluye de la columna de DEAE-celulosa a mayor fuerza iónica,
resultó especifica para la hidrólisis de GMPc.Esta actividad tql
bién se presenta bajo formas múltiples de diferente peso molecu
lar (320 y l7D H).
BD
En Coprinus macrorhizug se describió una actividad de Ac-PDE
que aparece durante la formación de los basidiomas y disminuye
durante la maduración de éstos. Esta enzima es inducida por pa
saje de la oscuridad a la luz, es activada por cationes divalen
tes, Mg2+y Mn2+, e inhibida por 3' AMP,teofilina y cafeína (358).
Finalmente Cohen y Atkinson (359) trabajando con esporangiúfo
ros de Phycomycesblakesleeanus, describieron una actividad de
Ac-PDEactivable por luz azul en presencia de GTP. Los autores pos
tulan que la enzima puede formar parte de un agregado proteico he
terogeneo fotoreceptor, explicando asi la relación entre la respueg
ta fototrópica de los esporangióforos y los bajos niveles de AMPc
(AB)..Cohen (360) demostró que esta actividad fosfodiesterásica es
soluble, estimulable por Mg2+y de alta afinidad (Hm3 y 12,5 pm).
El GMPcque no es sustrato de la enzima resultó un inhibidor de la
misma a pH neutro. La enzima es ligeramente inhibibla por imidazol
y por metilxantinas.
X. OBJETIVOS
Dada la importancia del AMPcen la morfogénesis de Mucor, el
presente estudio está orientado a esclarecer la regulación del me
tabolismo del nucleótido cíclico en una especie de este hongo:
Mucor rouxii.
81
La hipótesis de trabajo toma comobase el hecho experimental
conocido de que en todos los organismos en donde se ha estudiado
el metabolismo del AMPc,los niveles intracelulares de este meta
bolito están regulados principalmente por las actividades de las
enzimas que lo sintetizan y degradan: adenilato ciclasa y fosfo
diesterasa de AMPcrespectivamente. La existencia de ambas acti
vidades enzimáticas ya había sido detectada en nuestro laborato
rio (un).
La primera parte de este trabajo, se dedicó al estudio de la
variación de la actividad de fosfodiesterasa de AMPcdurante la
morfogénesis aeróbica del hongo. La segunda parte, se centró en
el aislamiento y caracterización de la forma soluble de esta en
zima, poniendo especial Énfasis en la búsqueda de posibles meca
nismos de regulación de esta actividad enzimática.
MATERIALES Y METÜDÜS
82
I. PREPARACIQfl DEL MATERIAL BIDLDGICÜ
I. l. Organismo
Mucor rouxií (Calmette) Mehmercepa NRRL189h, original del
Dr. c.m. Hesseltine (Northern Utilization Research and Development
Division, Peoria, 111), fue cedida gentilmente por el Dr. Roger
Storck (Rice University, Houston, Texas).
I. 2. Obtención y cosechas de esporas
Todas las operaciones se realizaron en condiciones de esteri
lidad. Para obtener las esporas del hongo, el organismo se cultivó
en un medio conteniendo agar en polvo al 5% y jugo de tomate comer
cial (Valle de Üro, Noel, etc.) en partes iguales. El agar y el 1g
go de tomate se autoclavaron por separado para evitar que la acidez
del jugo de tomate hidrolizara el agar en caliente, impidiendo su
posterior gelificación. El medio fundido se trasvasfi en alicuotas
de 50 ml a botellas de Roux que se dejaron 2h horas a temperatura
ambiente comoprueba de esterilidad,al cabo de ese tiempo se sem
bró en cada botella 2 ml de una suspensión de esporas (lÜÜ espo
ras/ml). Las esporas se cosecharon cuando se observó la aparición
83
de esporangíos maduros, los cuales se producen al cabo de 5 a 7
días de cultivo a la luz a 28-3098. La cosecha de esporas se reg
lizó de la siguiente manera: se agregaron a cada botella 20 m1
de agua destilada estéril, se rasparon suavemente los esporangíos
con un ansa de vidrio y se filtro la suspensión de esporas a tra
vés de una malla de nylon para separar las hifas y pequeños tro
zos de agar. Las esporas filtradas se lavaron varias veces por
resuspensifin con agua destilada estéril y centrifugacíón a 3.000
x g durante 15 min a hDC. Finalmente las esporas se suspendieron
en agua destilada estéril, se conto una dilución de las mismas
en una cámara cuentaglúbulos de Neubauer y se trasvasaron a vía
les de vidrio estériles los cuales se sellaron y mantuvieron en
heladera hasta el momentode ser utilizadas.Bajo estas condicio
nes las esporas permanecen viables aproximadamente 2 meses. La
concentración de las esporas osciló generalmente entre 3.108
3.109 esporas/ml.
Para el mantenimiento de la cepa se inocularon paralelamen
te dos tubos en pico de flauta con medio agar-jugo de tomate,
los que se mantuvieron en heladera luego de producida la esporu
lación.
I. 3. Medio de cultivo
Se utilizó medio de cultivo YPG(2h) compuesto por: extracto
Bb
de levadura (Difco) 0,3%, peptona (Inorp Tipo MC3) 1%, glucosa
(Roux-Ucefa) 3%. El pH del medio ae ajustó a h,5 con SDL‘H25 N.
El medio se esterilizó en autoclave a 12108 durante 20 min. La
glucosa se esterilizó separadamente del resto del medio para ev;
tar su caramelización (361) y se mezcló esterilmente con el res
to del medio de cultivo.
I. b. Obtención de micelio
Los cultivos se realizaron en frascos Erlenmeyer de dos litros
conteniendo SUDml de medio YPB, estas condiciones favorecen una
buena aereación del cultivo (362). Cada frasco se inoculó con 5.105
esporas/ml y se incubó a 26°C durante 15 horas con agitación cons
tante provista por un agitador rotatorio NewBrunswick.
El micelio obtenido se cosechó por Filtración al vacio sobre
papel whatman nD l, se lavó con abundante agua fria hasta que el
filtrado fuese incoloro y se escurrió entre dos hojas de papel de
filtro. Se obtuvieron de 7 a lÜ g de micelio (peso húmedo) a partir
de SÜÜml de medio. El micelio, cortado en trozos, se molió en mor
tero de porcelana con nitrógeno liquido y el polvo obtenido se guar
dó a - 7onc.
I. 5. Obtención de las distintas formas celulares producidas duran
te la morfogenesis aeróbica.
85
Los cultivos para la medición de las actividades enzimáticas
se realizaron de la siguiente manera: se inocularon 3-h l de me
dio YPGcon 106 esporas/ml y luego de obtener una suspensión ho
mogénea se la fraccionó en tantos Erlenmeyers comomuestras se
quisieran obtener. Los frascos se incubaron a 28°C con agitación
constante durante los tiempos requeridos. Los volúmenes de medio
se variaron según las horas de cultivo de manera de obtener en
cada caso una cantidad apreciable de material: BÜÜml para las
muestras que se incubaron durante un periodo de 7 horas, hÜÜml
para las que se incubaron entre 7 y lÜ horas y lÜÜml para las
que se incubaron periodos de tiempo mayores. En todos los casos
se controló la morfología del cultivo por observación microscópica.
Los cultivos de hasta 7 horas se cosecharon por filtración al va
cio a través de filtros de membranay los restantes sobre papel
Uhatman nD l. Todas las muestras se guardaron a - 70°C hasta el
momentode ser utilizadas.
Los cultivos para medir el crecimiento y aquellos utilizados
para valorar los niveles intra y extracelulares de AMPcdurante
la morfogénesis aeróbica se obtuvieron con el mismoprocedimiento
anterior, excepto que los volúmenes de los medios de cultivo fue
ron diferentes; asi para los cultivos de hasta h horas se utiliza
ron lDÜ ml de medio, para los cultivos entre h y 7 horas 50 ml y
para los periodos de tiempo mayores lÜ ml. Al cabo de los tiempos
establecidos los cultivos se filtraron a través de Filtros de mqn
86
brana. Las células utilizadas para medir el crecimiento, aquellas
destinadas a valorar el AMPcintracelular y los Fíltrados emplea
dos para la valoración del nucleótido cíclico extracelular se pro
cesaron comose indica en las secciones II y III. l.
II. MEDICION DEL CRECIMIENTO
El crecimiento se expresó comoproteina total por mililitro
de medio de cultivo. Las células obtenidas en los distintos esta
dios durante la morfogénesis aeróbica se cosecharon como se indí
c6 en la sección anterior. Las células se rasparon de los Filtros
y se sometieron a hidrólisis alcalina para determinación de pro
teina en el sobrenadante (ver sección X. h.).
III. DETERMINACIQE DE LÜS NIVELES INTRA Y EXTRACELULARES DE AMPC.
III. l. Procesamiento de las muestras gara el ensayo de AMPc.
Para la medición de los niveles de AMPcintra y extracelular,
se obtuvo el material comose indicó en la sección I. 5). A los
diferentes tiempos indicados las muestras,por duplicado, se Fil
traron rapidamente a través de Filtros de membrana.Los filtros
con las células retenidas se sumergieron inmediatamente en 2,5 m1
de ClH 0,1 N y se congelaron y descongelaron 3 veces por inmersión
B7
en un baño de hielo seco - etanol; las células se centrifugaron
a 3.000 rpm durante 10 min y el precipitado celular obtenido se
utilizó para la determinación de proteinas. El sobrenadante ae
llevó a sequedad a presión reducida y el residuo, disuelto en
0,2 ml de buffer acetato de sodio 0,05 M, pH 6,2;,se utilizó pa
ra la medición del AMPcintracelular.
Los filtrados obtenidos de los mismosfrascos de cultivo se
utilizaron para la determinación de los niveles extracelulares
del nucleótido cíclico. Para ello se tomaron alicuotas de b ml
de cada muestra, se calentaron 2 min a 10000 y se centrifugaron
a 2.000 x g durante 10 min. El sobrenadante obtenido se pasó por
una columna de 0,52 x 12 cm de resina AGSÜU-XB(100 - 200 mesh)
en la forma H+ (363), previamente calibrada con AMPCL3H].El nu
cleótido cíclico se eluyó con agua y el eluido se evaporo a se
quedad. El residuo, resuspendido en 0,2 ml de buffer acetato de
sodio 0,05 M, pH 6,2;,se utilizo para la valoración del AMPcextracelular.
La recuperación del nucleótido cíclico, al final de los pro
cesos de extracción descriptos, se determinó agregando al comieg
zo de cada proceso una cantidad conocida de AMPc[3H](15.000 cpm).
La recuperación osciló siempre entre el 70 y el 85%.
88
III. 2. Valoración del AMPcde las muestras
El contenido de AMPcde las diferentes muestras se determinó
empleando el método del radioinmunoensayo (RIA) (36h,365) utili
zando los reactivos provistos por NewEngland Nuclear. Las mues
tras fueron previamente acetiladas con el objeto de sensibilizar
el ensayo (366).
Para confirmar que la sustancia medida por el método del radio
inmunoensayo era efectivamente AMPc,algunas muestras tomadas al
azar se preincubaron a 30°C durante 20 min con un exceso de Ac-PDE
de corazón bovino. La reacción se detuvo por calentamiento a IÜÜDC
durante 2 min. Los tubos se centrifugaron y los sobrenadantes se
acetilaron y sometieron al radioinmunoensayo.
IV. PREPARACION DE Egg EXTRACTQEVENZIMATICQQ
Todas las operaciones se realizaron entre D y ADC.
IV. l. Preparación de extractos de los distintos estadios de la
morfogénesis aeróbica
El material biológico proveniente de los distintos estadios se
molió en un mortero preenfriado con 0,5 volúmenes de buffer
Tris-ClH 50 mM, pH 7,5; DTT l mM,(buffer A) y 2 volúmenes de arena
89
de mar hasta que por lo menos el 90%de las células estuviesen
rotas. La ruptura celular se controló con el microscopio óptico,
considerando comocélula rota aquella que habia perdido el con
tenido celular. Se añadieron 2 volúmenes de buffer A y la suspen
sión se filtró a través de una malla de acero inoxidable de 50 ¡m
de malla apoyada sobre un embudo Büchner aplicando una leve
succión; la arena retenida se lavó con buffer A hasta que el fil
trado fuese limpido. El filtrado se utilizó directamente como
fuente de PDE.
Para medir la actividad enzimática extracelular se siguieron
los lineamientos generales de Chang (Bhl). Se tomaron alicuotas
de 20 m1de medio de cultivo filtrado proveniente de los distin
tos estadios del desarrollo y a cada una se le agregó 2 ml de bu
ffer Tris-ClH l M, pH 7,5 y lD mg de BSA. La proteina se precipi
tó hasta 80%de saturación con sulfato de amonio sólido. La suspeg
sión obtenida se centrifugó a 8.000 x g durante 20 min en una cen
trífuga refrigerada Sorvall RC-Z,el precipitado se resuspendió en
un volumen minimo de buffer A y se dializó contra 200 volúmenes
del mismobuffer. El dializado se utilizó comofuente de enzima.
IV. 2. Obtención de las fracciones subcelulares de micelio
El polvo de micelio proveniente de un cultivo de 16 horas se
homogenizó en un homogenizadcr de vidrio tipo Ten-Broeck con 2
9D
volúmenes de buffer A. A partir de este extracto total ae prepa
raron distintas fracciones subcelulares de la siguiente manera:
el homogenizado se centrifugú a 8.000 x g durante 30 min y se
separaron el precipitado y el sobrenadante. La fracción precipi
tada (P8) se lavo con el volumen original de buffer A y se volvió
a centrifugar a 8.000 x g. Se juntaron ambos sobrenadantes y se
centrifugaron a 100.000 x g durante 60 min en una ultracentrífuga
Spinco L. El sobrenadante obtenido constituyó la fracción SlÜÜy
el precipitado la fracción P . Los precipitados obtenidos a oalÜÜ
ja y a alta velocidad de centriFugación (PB y PlÜÜrespectivamente)se resuspendieron por separado en el volumenoriginal con buffer A
y se lavaron dos veces antes de su resuspensión final en el mismo
buffer.
IU. 3. Preparación de los extractos para la purificación, caracte
rización y regulación gg la fosfodiesterasa de AMPc
La homogenización del micelio se llevó a caoo en buffer
Tris-ClH lÜ mM, pH 7,5; EDTAh mM, 2-mercaptoetanol 2 mM, henzami
dina 20 mM (buffer B). Cuando se trabajó con pequeñas cantidades
de polvo de micelio, hasta lÜ g, se utilizó un homogenizador de
vidrio tipo Ten-Broeck y dos volumenes de buffer B; para cantida
des mayores se utilizó un homogenizador tipo Ümni-Mixer,un volu
men de buffer B y dos volúmenes de perlas de vidrio de 75-150 Fm.
91
La homogenízacifin se realizó en ambos casos hasta que por lo me
nos el 90%de las hifas estuvieran reducidas a pequeños trozos y
vacías de citoplasma. El extracto obtenido se centrifugó a 8.000
x g durante 20 min, se guardó el sobrenadante y el precipitado
se resuspendió en el volUmenoriginal de buffer B y se volvió a
centrifugar en las mismascondiciones; se juntaron los sobrena
dantes y se centrifugaron EUmín a 100.000 x g. El sobrenadante
final recuperado constituyó la fracción 5100.
V. DETERMINACION DE ACTIVIDADES ENZIMATICAS
V. l. Ensayo de la actividad de la fosfodiesterasa de AMPc
Para la valoración de esta actividad enzimática se utilizaron
principalmente dos métodos, A y B, que difieren en la forma de se
parar los productos de la hidrólisis del AMPcL3H3empleadocomo sus
trato. Ücasionalmente se ensayo la actividad enzimática con un ter
cer método C en el cual no se utiliza sustrato radioactivo.
MétodoA. Este método, utilizado de rutina, está basado en la téc
nica en dos etapas de Thompson y Appleman (199); el 5' AMP[3HJfor
mado por la acción de la Ac-PDEen la primera etapa de la reacción
es convertido en una segunda etapa a adenosinaLBHJ por acción de
un exceso de fosfatasa alcalina o de veneno de serpiente. La valora
92
ción de la adenosina [3H] constituye una medida de la actividad
de Ac-PDE. La actividad de Ac-PDE se ensayó en una mezcla que CQE
tenía, en un volumen Final de 0,1 ml, buffer Tris-ClH 50 mM,
Mg cuando se indique) 10 mM, 2-mercaptoetanol2
2 mM, BSA 50 pg, AMPC[3H] 6-8. 10h cpm, AMPc no radiactívo a una
pH 7,5; 012Mn (o Cl
concentración que, a menos que se indique, Fue de S'pM y una dilu
ción apropiada de la preparación enzimática. Las incubaciones se
realizaron a 3000 durante 20 min.
La reacción se inició por el agregado de la Fracción enzimá
tica y se detuvo por inmersión de los tubos en un baño de agua a
10000 durante #5 segundos. Luego que la mezcla alcanzara la tempg
ratura ambiente, se agregó a cada tubo 1,5 - 6,5 unidades de fos
fatasa alcalina o 15-30lug de veneno de serpiente y la mezcla se
incubó a 3000 durante 10 min. La reacción se detuvo por el agre
gado de l ml de una suspensión 1:3 (v/v) de resina A01 - X2
(200-h00 mesh) en etanol 50%conteniendo adenosina 0,25 mM,para
disminuir la adsorción inespecífica del nucleósido a la resina de
intercambio (367,368). Los tuboa se mantuvieron en un baño de
agua-hielo durante 15 min con agitación periódica; al cabo de es
te tiempo la suspensión se centrifugó a 3.000 rpm durante 5 min.
Del sobrenadante se tomó una alícuota de 0,5 ml y se contó la ra
dioactividad en solución centelleadora en contador de centelleo
liquido (ver sección X.7.).
93
MétodoB. Este ensayo se utilizó para las medidas de actividad
enzimática durante la morfogénesis aeróbica y para estudiar la
distribución subcelular de la actividad de Ac-PDE.Se siguieron
los lineamientos generales del método A hasta la segunda etapa
de incubación. La'adenosina L3H] se aisló de acuerdo al procedi
miento de Hidaka y Asano (212); para ello se detuvo la reacción
por el agregado de l ml de agua destilada y la mezcla se aplicó
a una columna de 0,8 x 2 cm de resina AG5ÜM-Xh(ZÜÜ-MÜÜmesh).
Luego de la entrada de la muestra, la resina se lavó con 15 ml
de agua destilada y la adenosina [3H] se eluyó con 3 ml de
HÜNHLb M. El eluido se recogió sobre lÜ ml de solución centelleg
dora y se contó en contador de centelleo liquido (ver sección X.7.).
La recuperación de la adenosina [BH] de la columna de intercam
bio catiónico osciló siempre entre el 88-85%y se la calculó pasan
do por las columnas una mezcla incubada en las mismas condiciones
pero conteniendo Ü,l—D,3 nanomoles de adenosina [IAC] en lugar de
AMPc [3H] .
Independientemente del método utilizado, todos los ensayos se
llevaron a cabo en condiciones en las cuales la velocidad fue li
neal con el tiempo de incubación y respecto a la cantidad de ex
tracto enzimático. En los ensayos de rutina la cantidad de extras
to se ajustó de tal manera que menos del 20%del sustrato fuese
convertido en producto. Los ensayos enzimáticos se llevaron a ca
9h
bo por triplicado, representando los valores obtenidos el prome
dio de los mismos.
En todos los casos, los blancos se prepararon añadiendo la
preparación enzimática al final de la primera etapa de incubación.
Los valores de los blancos nunca superaron el 2%de la radioacti
vidad total aportada por el sustrato radioactivo y las incorpora
ciones minímas superaron en por lo menos tres veces el valor de
los blancos.
Los resultados se expresaron como picomoles de AMPc[BH] hi
drolízados en 20 min y la actividad específica comopicomoles de
AMPc[3H]hidrolízados/min/mg de proteina, a 3000.
Método C. Este método se utilizó en algunos experimentos con el
objeto de detectar la posible existencia de Ac-PDEde baja afini
dad por el sustrato. Las condiciones de incubación Fueron las mig
mas que las del método A, con la diferencia que se utilizó como
sustrato, AMPcno radioactivo a una concentración l mM,y el volg
men final de incubación fue 0,5 ml. En la segunda etapa del ensa
yo se agregaron 6,5 unidades de fosfatasa alcalina. La reacción
se detuvo por el agregado de 0,05 ml de una solución de ácido tri
cloroacético 55%, seguido por 0,75 ml de agua y 0,15 ml de una s2
lución de molibdato de amonio al 2,5% en SÜAHZ5 N. El precipita
do obtenido se descartó por centrifugacíón, el sobrenadante se
95
decantó a tubos de ensayo limpios y en alicuotas apropiadas del
mismo se valoró el fosfato inorgánico producido por el método
Fiske y SubbaRow (369).
V. 2. Ensayo de la actividad de la fggfodiesterasa de AMPceg
geles de poliacrílamida
Para determinar la actividad enzimática en los geles, cada
rodaja del gel (ver sección IX ) se incuoó durante 2 horas a
3008 con agitación constante en una mezcla de reacción que con
tenía, en un volumen Final de 0,25 ml: buffer Tris-ClH SU mM,
pH 7,5; 2-mercaptoetanol 2 mM, ESA lSÜlpg, Cl Mn lÜ mM, AMPc l pM2
y AMPc[BH] 1,2.105 cpm. Al Final del tiempo de incubación se to
maron alícuotas de 0,1 ml de cada tubo y se prosiguió el ensayo
de Ac-PDEsegún los lineamientos del método A.
Vo 3o Ensayo de la actividad de la Fosfodiesterasa de GMPc.
Se utilizó el método A descripto anteriormente reemplazando
el AMPc[3H] por GMPc[3+1] (1.105 cpm) y a una concentración de
este nucleótido cíclico de l pM. La suspensión de resina anióni
ca utilizada-contenía 0,5 mMde guanosina en lugar de 0,25 mMde
adenosina.
V. h. Ensayo de la activación de la fosfodiesterasa de AMPcpor
ATP. Mg v AMPc
96
El efecto activador del ATP.Mgy AMPcse estudió incubando
los extractos con actividad de Ac-PDEen distintas condiciones.
“V.h.l. Ensayo directo de la activación enzimática
La mezcla de incubación contenía, en un volumen Final de 0,1
ml: buffer fosfato de potasio 20 mM,pH 7,5; 2-mercaptoetanol
2 mM, Cl Mg lÜ mM, BSA 50 pg, ATP 0,1 mM, AMPc 5 pM y AMPc [3H]2
(6-8.lÜh cpm) y una dilución apropiada del extracto enzimático.
En algunos ensayos se agregó quínasa de proteina exógena a las
concentraciones indicadas en cada experimento. Esta mezcla se
incubfi y proceso siguiendo los lineamientos del método A. Los
controles, no activados, fueron incubados en las mismascondi
ciones pero omitiendo el ATPde la mezcla de incubación.
V.b.2. Ensayo de la activación enzimática Eor Ereincubación
Se preincubaron los extractos en una mezcla igual a la del
{ensayo de activación directo pero omitiendo el sustrato radioac
tivo. En algunos casos el volumen final de la mezcla de preincu
bación se varió de acuerdo a la cantidad de extracto enzimático
utilizado. La preincubación se realizó a 30°Cpor períodos de
tiempo que variaron de 6 a lÜ min, al cabo de los cuales la mez
cla se proceso por dos métodos diferentes, a los que se llamo a;
bítrariamente:
Dilución: Luego de preincubados, los tubos conteniendo la mez
cla de reacción se colocaron en baño de hielo y se les agregó
97
lü‘pl de EDTA0,1 M; se tomaron slicuotss convenientes de la mea
cls en las cuales se ensayo actividad de Ac-PDEpor el método A
utilizando an+ comocatión divalente. La alícuota de le mezcla
de preincubación se eligió de tal manera que la concentración de
los agentes aotivantes quedare diluida por lo menosveinte veces
en el ensayo de PDE.
Sulfato de amonio. Los tubos conteniendo la mezcla de preincuba
ción se colocaron en baño de hielo y se les agrególcuando fue ne
cesario/ESA hasta una concentración final de 10 mg/ml y h volúme
nes de una solución saturada y neutralizada de sulfato de amonio
preparado en buffer fosfato de potasio 20 mM,pH 7,5. Se dejó la
suspensión en baño de hielo lD min con agitación periódica y lue
go se oentrifugó a 10.000 x g durante 20 min en centrífuga refri
gerada. El precipitado se resuspendió en el volumenoriginal de
la mezcla de preincubación (s menos que se indique lo contrario)
con buffer fosfato de potasio 20 mM,pH 7,5; 2-mercaptoetanol
2 mMy se tomó una alícuota para ensayar actividad de Ac-PDEcon
el método A.
V. 5. Otros ensayos enzimáticos
V.5.1. guinasa de proteina dependiente de AMPc.
Para la medida de la actividad de quinasa de proteina depen
diente de AMPc(Ac-QP) se utilizó una mezcla de incubación que
98
contenía en un volumen Final de 0,1 ml: buffer Tris-ClH 5D mM,pH
7,5; Cl Mg lÜ mM, 2-mercaptoetanol 2 mM, AMPc 5 FM, ATPÜÍ -329J2
D,l_mM (200 - lÜÜÜ cpm/pmol) e histona 1,5 mg/ml. Cuando se midió
la capacidad del extracto de fosforilar sustrato endógeno, se om;
tió la histona de la mezcla de incubación. Las incubaciones se
realizaron a 300Gdurante lÜ min, al cabo de los cuales se detuvo
la reacción por el agregado de 20,ul de ESAde 50 mg/ml, seguidos
de l ml de ácido tricloroacético 10%. La suspensión se centrífugó
5 min a 3.000 rpm en centrífuga clinica y se decantó el sobrena
dante. El precipitado se resuspendió en 0,2 ml de PDQHNaNHhl M y
la proteina se reprecipitó con l ml de ácido tricloroacético lÜ %.
El procedimiento de centrifugacíón, resuspensión y reprecipitación
se repitió dos veces más. La resuspensión Final se realizó en Ü,l
ml de HÜKl N. Se sembró la totalidad de cada muestra en un cuadra
do de papel Mhatman ng 3 de 2 x 2 cm., que se aecó bajo lámpara in
fraroja. Los papeles secos se contaron en solución centelleadora
en un contador de centelleo líquido (ver sección X.7.).
La técnica de aislamiento de la proteína fosfarilada por cen
trifugación, detallada anteriormente, es una modificación de la
descripta por Huo y Greengard (79).
Los blancos de los ensayos se realizaron agregando la fracción
enzimática después del ácido tricloroacético. Los valores de los
blancos oscilaron entre hÜÜ- ZÜÜÜcpm dependiendo de la activi
99
dad específica del ATPÍÉ-Jz P] utilizado. Las incorporaciones
mínimas superaron por lo menos cuatro veces el valor del blanco.
Los resultados se expresaron comounidades de quinasa de org
teína. Una unidad se definió como la cantidad de enzima capaz de
transferir un picomol de fosfato [32P] a la histona en lÜ min en
las condiciones del ensayo standard.
V. 5.2. Glucosa oxidasa
Para doaar esta actividad enzimática se utilizó la técnica
de Hugget y Nixon (37D) modificada. La mezcla de incubación con
tenía, en un volúmen final de 1,2 ml: 150 pl de glucosa de 16 mg/
ml, 9DGpl de reactivo de o-dianisidina preparado en el momento
. con l ml de o-dianisidina al 1%en metanol y 50,ul de buffer ace
tato de Na l M, pH 5; 30 pl de solución de peroxidasa de lÜ mg/ml
y una alícuota de la fracción a ensayar. Se incubó la mezcla de
reacción a 37°C durante 30-60 mins, hasta la aparición del color,
y se midió la absorbancia a #20 nm. Los blancos, preparados e ig
cubados en las mismas condiciones, carecían de la alícuota a en
sayar.
V. 5.3. Peroxidasa
Esta actividad enzimática se ensayó de acuerdo a las direc
tivas del Manual de Morthington (371).
lÜÜ
Para la reacción se mezclaron 3 m1 de HZÜ2al Ü,ÜÜB%(prepa
rada Fresca a partir de una solución madre de HZÜ20,3%) con 20
Fl de o-dianisidina 1%en metanol (preparada fresca) y una alí
cuota de la preparación a ensayar. Luego de incubar a 3000 durag
te 15 min, se leyó la absorbancia a ASDnm. Para los blancos se
preparó la mismamezcla de incubación sin el agregado de la alí
cuota a ensayar, y se incuoó en las mismas condiciones.
V. 5.h. Fosfatasa alcalina
Para dosar esta actividad enzimática se utilizó la técnica
de Garen y Levinthal (372). La mezcla de incubación contenía, en
un volumen final de 2 ml: l m1 de una solución 0,01% de p-nitro
fenilfosfato en buffer Tris-ClH Ü,l M, pH B y una alícuota de la
fracción a ensayar. Luego de incubar a 3008 durante 15 min, se
midió la absorbancia a hlÜ nm. Los blancos, preparados e incuba
dos en las mismascondiciones, carecían de la alícuota a ensayar.
VI. TECNICA; CRÜMAÏQEBAFICAQ
VI. l. Cromatografía en DEAÉ- celulosa
La DEAE-celulosa a utilizar se trató previamente comolo
indican Peterson y Sorber (373). La resina regenerada por este
método se guardó a ADCen agua destilada o en el buffer de equi
librio utilizado en cada caso.
lDl
Las columnas se sembraron manteniendo una relación de 7 —lÜ
mg de proteina/ml de resina empaquetada y se lavaron con 1-2 vo
lúmenes de buffer de equilibrio.s
La elución de la proteina se realizó utilizando gradientes
salinos lineales continuos. El volUmentotal del buffer con el
cual se eluyó la proteína fue de 10 veces el volúmen de resina
empaquetada. Generalmente se recogieron fracciones de l/lÜ del
volümen de la resina a una velocidad de flujo de 0,5-1 ml/min
utilizando un colector de fracciones automático marca Gilson,
modelo UFC.
VI. 2. Cromatografía en gagel
Se utilizó la técnica de cromatografía descendente en papel
MhatmannD l. Se utilizaron dos sistemas de solventes: (l) 2-prg
panol: acetato de etilo: amoniaco 13 M(59:29:16) (37h) y (2)
etanolzácido acético l M: acetato de amonio].M (75:26:h), pH 3,8
(375).
VI. 3. Cromatografía de afinidad
Se emplearon columnas de Azul 2-Agarosa equilibradas en bu
ffer Pípes lÜ mM,pH 6,3; 2-mercaptoetanol 2 mM,glicerol 10%
(buffer C). La muestra se sembró diluida en buffer C conteniendo
102
Cleg 2 mM.El sembrado se realizó a una velocidad de flujo no
superior a 0,1 ml/min y la velocidad se mantuvo durante todo el
desarrollo del cromatograma. El gel se lavó con b volúmenes de
buffer C que contenía ClNa 0,2 My la actividad de Ac-PDEse elo
yó con h volúmenes de buffer C con el agregado de ClNa 0,2 M y
AMPc2 mM. Finalmente se pasó por la columna 3 volúmenes da una
solución de ClNa l M en buffer C.
El volumen de las fracciones recogidas Fue de aproximadamen
te 1/20 voIUmendel gel. Luego de ser utilizado, el gel se rege
neró según el método de Morrill y colaboradores (376) que consis
te en lavados sucesivos con soluciones acuosas de urea 6 My
ClNa 2 M (h volúmenes cada vez). El gel se conservó a ADCen ClNa
2 My antes de ser utilizado nuevamente se equilibró con el buffer
correspondiente.
UI. h. Filtración en gel de SeEhadex G-ZÜÜ
Esta técnica se utilizó para la determinación de algunos pa
rámetros hidrodinámicos y moleculares de la Ac-PDE.
Se utilizó una columna de Sephadex G-ZÜÜde 1,7 x 60 cm equi
librada con buffer B. El volúmen de la muestra sembrada fue de l ml
y la columna se eluyó con buffer de Equilibrio a una velocidad de
flujo de 0,25 ml/min a ADC.Se recogieron Fracciones de l,h m1.
103
El volümen de exclusión de la columna se determinó utilizan
do dextrano azul. Para calibrar el gel se utilizaron las siguieg
tes proteinas marcadores: glucosa oxidasa (JÜD‘pg), BSA(l mg),
pero;idasa (3Dpg) y citocromo C (3 mg). Se utilizó la vitamina
812 comoindicador de inclusión total en este gel. Loa marcado
res se valoraron como se indica en las secciones U.5, X.3 y X.h.
A partir de los volúmenes de elución de cada proteina se de
terminó el Hav de cada una de ellas. Este parámetro se define cg
mo la Fracción del volUmendel gel que es accesible al soluto
(377) y se puede calcular por la relación:
H = ----------- -- (377)
donde: Ve es el volUmende elucíón de la proteina en cuestión,
VÜes el "volumen muerto" de la columna o el volúmen de elución
de una sustancia que no penetra la fase solvente interior a las
particulas del gel y Vt es el volumentotal del gel.
VII. GRADIENTES DE SACARÜSA
Esta técnica se utilizó en la purificación, estudios de reg!
lación y determinación del coeficiente de sedimentación y del
coeficiente de difusión de la Ac-PDE.Se prepararon gradientes de
5 a 20%(p/v) de sacarosa en el buffer que se indica en cada caso.
lÜb
Los gradientes se formaron, a temperatura ambiente 2 horas antes
de ser utilizados, con 7 capas de 0,65 m1 cada una de soluciones
de concentración decreciente de sacarosa en tubos de nitrocelulg
sa de 1,2 x 5 cm. Las muestras se sembraron en volúmenes de SU a
200 pl y se incluyó en algunos casos una mezcla de las siguientes
proteínas marcadores: citocromo c (l mg), peroxidasa (20 pg), Fog
fatasa alcalina (Bülpg) y glucosa oxidasa (lÜÜpg).
La centrifugacifin de los gradientes se llevó a cabo en un ro
tor Beckman SU 50.1 a 38.000 rpm durante 15 horas a ADC.Se reco
gieron fracciones de 0,2 ml cada una, haciendo sifón con un caté
ter desde el fondo del tubo.
VIII. CALCULO DE ALGUNOS PARAMETRQÉ HIDRÜDINAMICÜS Y MÜLECULARES
DE LA FoíFoDIESTERAgA DE AMPc
VIII. l. Coeficiente de sedimentación (820 ) y coeficiente de
difu516n (020, ).
Estos parámetros se calcularon a partir de los datos de cen
trifugación en gradiente de sacarosa de acuerdo a los métodos de
Martin y Ames(378) y Thompsony colaboradores (236) respectiva
mente. Para ello se graficaron las distancias recorridas por ca
da proteína marcadora desde el borde superior del gradiente en
función del S U o del logaritmo de D de estas proteínasgg. ZÜ,w
105
(ver Tabla h). De la relación lineal obtenida en ceda caso se ob
tuvo el valor de dichos parámetros para la Ac-PDEpor interpola
ción en las rectas respectivas conociendo la posición de la enzima
en el gradiente.
VIII. 2. Radio de Stokes (a)
El valor de g_fue calculado de loa datos de elución de la co
lumna de Sephadex G-ZÜÜ.De la relación lineal obtenida al grafi
car el logaritmo negativo de los valores de HBVelevados a la 1/2versus los radios de Stokes de las proteínas marcadores (Tabla h),se
obtuvo el valor de_¿¿ para la PDEa partir del valor de Hav deesta enzima (379).
VIII. 3. Peso molecular (PM)
Se calculó con los valores 52o,u
PM=6'IT(?ZD’UNa520U/(1-vf’20,u) (379)
y_g según la ecuación:
Dondezg)2ü m es la viscosidad del agua a 20°C (1,1.lD_2 g/cm.seg),Í
U es el volUmenespecifico parcial (que se supone igual a 0,725
cm3/g, por tratarse de una proteina soluble),P20 U es la densidad' 7
del agua a 20°C (0,98 g/cm3) y N es el número de Avogadro
(6,02 . 1023 ).
106
UIII. h. Coeficiente friccional (f/fÜ)
El coeficiente Friccional de la Ac-PDEse calculó utilizando
los valores de PMy.g de acuerdo a la ecuación
f/fo = a / 3 U PM1/3 (379)
h WÍN
VIII. 5. Parámetros hidrodinámicos y moleculares de las Eroteínas
marcadoras
En la Tabla h se resumen los coeficientes de sedimentación,
radios de Stokes, coeficientes de difusión y pesos moleculares delas proteinas marcadoras utilizadas en la centrifugación en gra
dientes de sacarosa y en la filtración por Sephadex G-ZÜÜ.En ca
da caso se indica la fuente bibliográfica de donde fueron obteni
dos dichos parámetros.
107
TABLA h
Parámetros hidrodinámicos y moleculares de las proteínas marca
doras utilizadasN
PRDTEINA CÜEFICIENTE DE CÜEFICIENTE RADIO DE PEsoSEDIMENTABIDN, DE DIFUSION STDHES MOLECULAR
528,u DZÜ,w a7 2 o
(S) (18 cm /seg) ( A) (H)
Glucosa oxidasa 8,3 (388) 5.13 (388) hl,8 (*) 152 (380)
Fosfataaaalcalina 6,3 (372) 7.3 (377) 29,3 (*) 88 (372)
85A (379) (,3 -— 35,0 65
Peroxidasa 3,5 (351) 7.05 (381) 3o,u (*) 39,8 (381)
Citocromo c(382) 1,7 11.u 18,7 12,u
(‘)Los valores del radio de Stokes (a) se obtuvieron de la for
mula a = k T/61T‘3720,U.020,U tomada de Haga y colaboradores(382) utilizando los valores de los coeficientes de difusión
corregidos (DZÜ’U)tabulados (377,388,381), donde_5 es la cons
tante de Boltzmann‘3720'u es la viscosidad del agua a 28°C y_les 293 OH.
IX. ELECTRÜFDRESIS EN EEL DE PULIACRILAMIDA
Las electroforesis se realizaron a bDC.
108
Se utilizó 1a técnica descripto por Davis (383). Se preparó
un gel de separación (0,7 x 12 cm) de una composición de acrila
mida de 7%. Se omitió el gel de concentración.
Los geles se precorrieron 6 horas a 2 mA/tuboutilizando co
mo buffer catódico Tris-ClH, 0,37 MpH 8,9, para eliminar el per
sulfato de amonioutilizado en la polimerización.
Se sembraron muestras de 0,2 ml que contenían, como máximo,
0,1 mg de proteina y 30%de glicerol (v/v) más 5 pl de azul de
bromofenol al 0,06 % (p/v).
Se hizo circular una corriente de 2 mA/tubo hasta que el co
lorante indicador del frente penetrara 1 cm en el gel y luego se
elevó la corriente a h mA/tubo durante aproximadamente h horas,
tiempo en el cual el colorante recorrió aproximadamente 10 cm.
Para visualizar las proteínas,los geles se tiñeron durante
una hora con una solución de azul de comasina al 0,25% (p/v) en
metanol:ácido acético (90:10). El exceso de colorante se elimi
nó por lavados con ácido acético:metanol:agua (75: 50:875). La
densitometria del gel se realizó con un espectro densitómetro
integrador Crudo Caamaño.
La actividad de Ac-PDEse localizó, en geles no teñidos,
cortando el gel en rodajas de 3 mm.En cada rodaje se determinó
la actividad enzimática comose indica en la sección V. 2.
109
X. ÜTRAS TECNICAÉÍY PRDCEDIMIENTQÉVANALITICQQ
X. l. Identificación de los productos de la reacción de la
t Fosfodiesterasa de AMPc.
Se utilizó la técnica de cromatografía en papel desoripta en
la sección X.2. Los sobrenadantes de las distintas mezclas de in
cubación de los ensayos de Ac-PDEde extractos provenientes de al
gunos estadios de la morfogénesis aeróbica y los blancos oorrequg
dientes, se evaporaron a sequedad a temperatura ambiente utilizan
do un evaporador rotatorio. Los residuos se tomaron en 25 }d.de
agua destilada y se sembraron en forma puntual en el orígen del
cromatograma. Se utilizaron comopatrones internos 0,1 pmol de los
siguientes compuestos: AMPC,5' AMPyyadenosinapara el sistema 2.
A esta mezcla se añadió inosina e hipoxantina cuando se utilizó
el sistema l.
Los cromatogramas se dejaron desarrollar durante una noche y
luego se vísualizaron los marcadores bajo lámpara ultravioleta a
25h nm. La zona correspondiente a las distintas manchas se corta
ron, se colocaron en viales con solución centelleadora y se conta
ron en contador de oentelleo liquido (ver sección X.7.).
X. 2. Determinación de los volúmenes celulares _
La determinación de los volúmenes celulares se realizó en
llD
las esporas y en los estadios posteriores del desarrollo aeróbi
co anteriores a la emisión de los tubos germinativos. Para ello
se midieron los diámetros de las células en cada estadío. Se reg
lizaron mediciones de 3Dcélulas de cada estadio bajo microsco
pio óptico con 1.000 aumentos y con la ayuda de un ocular micro
métrico. Los valores obtenidos para cada estadio se promediaron.
X. 3. Valoración de otros marcadores dggpeso molecular
Estos marcadores Fueron valorados midiendo su absorbancia a
la longitud de onda óptima de cada compuesto
Dextrano azul 63D nm
Citocromo c blÜ nm
Vitamina 812 LDU nm
X. h. Valoración de Eroteinas
Para la valoración de proteinas se utilizaron alternativamen
te dos métodos:
El método de Loury y colaboradores (38A) se utilizó de rutina.
La proteína de las muestras solubles Fue precipitada con ácido tri
cloroacético en una concentración final de 10%y luego resuspendi
da en HÜNal N. Las proteínas totales de células enteras, de los
extractos crudos, y de las fracciones subcelulares particuladas,
se determinaron en los sobrenadantes obtenidos luego de hidroli
lll
zar las muestras en HÜNa1 N a lÜÜDCdurante 30 min.
El método de Bradford (385) se utilizó como un método rápido
para estudiar el perfil de las proteinas en las cromatografïas,
Filtracionas moleculares y gradientes de sacarosa. Par ambosmé
todos se empleó 85A como patrón.
X. 5. Purificación del AMPc[3d]
Este nucleótido radioactivo se purificó por pasaje a través
de una columna de 0,6 x h cm de resina'AGSÜhFXB (lÜÜ-ZÜÜ mean).
Se sembraron 0,2 ml del nucleótido cíclico y la columna se eluyó
con agua en porciones de BDpl. Una alícuota de las fracciones
obtenidas se contó para radioactividad en mezcla centelleadora
(ver sección X. 7.). Se descartaron las tres primeras fracciones
con radioactividad y las siete restantes se juntaron y evapora
ron a sequedad en un evaporador rotatorio. El residuo se resus
pendió en el volúmen original con etanol 50% y se guardó a - ZÜDC
fraccionado en alícuotas de 50 pl hasta el momentode ser utilizado.
Se constató la pureza del nucleótido por cromatografía en pa
pel utilizando el sistema 2 comosolvente (ver sección VI. 2.).
x. 5. Síntesis de ATPHÍ 4213]
Para la sintesis de este nucleótido radioactivo se siguió,
112
en lineas generales, la técnica de Glynn y Ehappell (386) con
las modificaciones introducidas por Changy colaboradores (387).
Luego de la etapa de elución del ATP[\K’32?) del carbón, la so
lución se llevó a sequedad a presión reducida a temperatura am
biente. El residuo se disolvió en etanol: 0,2 mMEDTA(1:1,v/v).
se dividió en alícuotas y se guardó a - 2000.
X. 7. Contaje de radioactividad
Para el contaje de las muestras radioactivas se utilizó un
contador de centelleo liquido marca Packard.
Las muestras resultantes de los ensayos de Ac-PDEse contaron
utilizando dos métodosalternativos: (l) se utilizó solución cen
telleadora de Bray. Las muestras se contaron en viales de vidrio,
con lÜ ml de solución centelleadora. Los viales se dejaron 20 min
en frio para disminuir la autoabsoroión antes de colocarlos en el
contador. Este método se utilizó cuando la actividad enzimática
se determinó por el método B (ver sección U.l.). (2) se utilizó
solución centelleadora de tritón X-lÜÜ-tolueno(1:3 v/v). Las
muestras se contaron en viales de plástico chicos con 3 ml de so
lución centelleadora, apoyadossobre viales de vidrio. Esta técni
ca se empleó cuando se ensayó la actividad de Ac-PDEcon el méto
do A (ver sección U.l.).
113
Los cuadrados de papel conteniendo las muestras de los ensa
yos de quinasa de proteina, y los que se obtuvieron luego del
desarrollo de las cromatografias en papel, se contaron en 3 ml de
solución centelleadora de tolueno, utilizando también viales de
plástico chicos.
La radioactividad del [3H] se midió a 60%de ganancia y con
una ventana de 50-1.ÜDÜdurante un minuto. La radioactividad del
[325] y del [lhól se midió con 25%de ganancia y con una ventana
de SÜ-wdurante un minuto.
XI. READTIVDS UTILIZAQgg
Los siguientes reactivos fueron adquiridos en Sigma Chemical
Company:Fosfodiesterasa de AMPcde corazón bovino activable por
calmodulina,fosfatasa alcalina de E.coli tipo III-S, p-nitrofenil
fosfato disódico (sustrato de la fosfatasa alcalina), peroxidasa
de rábano picante tipo I, citocromo c de corazón de caballo tipo
III, venenos de serpiente (Ughioghagus hannah y Crotalus atrox),
trípsina de pancreas bovino tipo III, inhibidor de tripsina de
clara de huevo tipo III, inhibidor de quinasa de proteina depen
diente de AMPcde músculo de conejo, calmodulina de corazón bovi
no, seroalbúmina bovina cristalina fracción U, histona tipo II-S
de timo de ternera., benzamidina. Dextrano azul (PM2.000 H),
reactivo de Azul 2-agarosa (l-h‘pmol de reactivo Azul 2/ml de gel).
IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
11h
AMPc, GMPc, 5' AMP,ATP, adenosina, hipoxentina, inosina. Imida
Zol (grado I), cafeína, teofilina y teobromina. Trizma base,
Pipes, EDTA,EGTA,DTT. Sacarosa (grado I), sulfato de amonio
(grado III). PPo, dimetil POPUPy Triton x-1oo.
La glucosa oxidasa de Penicillium notatum fue de Merck.
El AMPc[3H](actividad especifica 3B Ci/nmol), el GMPc{BH}
(actiuidad específica 30 Ci/nmol) y el Fosfato inorgánica [32PX
para la preparación del ATdï?z% Fueron adquiridos en The
Radiochemical Centre, Amersham.La edenosina[lh61(actividad es
pecifica SDmCi/nmol) y los reactivos para el radioinmunoensayo
fueron provistos por NewEngland Nuclear.
La o-dianisídina y la arena de mar purificada con ácido y la
acrilamida fueron BDH;
Bio Rad proveyó las resinas de intercambio AGl-XZ (ZÜÜ-AÜÜ
mesh). AGSÜU-Xh (ZÜÜ-hÜÜ mesh), AGSÜw-XB(lÜÜ-ZÜÜ mesh).
Las resinas de filtración molecular Sephadex 8-25 y G-ZÜÜ,fueron de Pharmacia Fine Chemicals.
La DEAE-celulosa fue de Serva (Serva DEAE-SS,capacidad 0,71
mEq/mg).
El papel de filtro utilizado fue Uhatman.Los filtros de mem
brana BA85, poro Ü,h5 umfueron de Schleicher y Schüll.
115
El TEMEDy la Bis-acrilamida fueron de Eastman-Hndak C0.
El Azul de Comasina R 250 Fue obtenido en Fluka.
Lás membranas de ultrafiltracíón Minicon- B 15 Fueron de Amícon
Corporation.
El resto de los reactivos fue de grado analítico.
RESULTADOS Y DISCUSION
116
I. VALIDEZ DEL ENSAYO DE FÜSFDDIESTERAÉA
A lo largo de todo el trabajo se utilizaron dos métodos para
medir la actividad de Ac-PDE, en el método A se emplea una resina
de intércambio aniónico para separar la adenosina[ a4] del sustrgto sin reaccionar el cual queda retenido en la resina; mientras
que en el método B se utiliza una columna de intercambio catiúni
co que retiene la adenosina [BH formada y pasa de largo el AMPc
[3H] sin reaccionar, posteriormente la adenosina se eluye con unasolución acuosa de amoniaco.
Cuando se utiliza el método B para el dosaje de la actividad
enzimática es muyimportante valorar en los extractos, sobre todo
si son poco purificados, la presencia de enzimas desaminantes pues
la eliminación de la carga positiva de la molécula de adenosina
hace que esta no se retenga en la resina de intercambio catiúnico,
a consecuencia de lo cual hay una subestimación de la actividad en
zimática. El camino metabólico de la hidrólisis del AMPcen homogg
nizados de tejidos se resume en la Figura 7.
AMPc -—EEE-—-—o5' AMP1rí¿¿——-0Adenosina1¡—ígl———v AdenínaPi Ribosa3
( ) NH3 (3) NH3 (3) NH3 (3) NH3
IMFE-L. 5' IMP¿"L-oInosina TL» HipoxantinaPi Ribosa
(l): 5' nucleotidasa; (2) nucleosidasa; (3) desaminasa
Figura 7. Camino metabólico de la hidrólisis del AMPcen homogenirgdos totales de tejidos, resumido de Dedmany Means (388).
117
Se investigó la posible existencia de actividades de 5' nu
cleotidasa y desaminasas en extractos crudos de tres estadios de
la morfogénesis aeróbica (cultivos de h, 7 y 1h horas), ya que,
la presencia de dichas actividades en cantidades significativas
en los extractos, podria invalidar el método B del ensayo enzima
tico.
Se ensayó actividad de Ac-PDEen alicuotas de los extractos
en la mezcla de incubación standard a una concentración de AMPc
[3H] de lÜ pM y se omitió el segundo paso de la incubación. La
reacción se detuvo por calentamiento como se indicó en la sección
V.l. de Materiales y Métodos. Los tubos conteniendo la mezcla de
reacción se centrifugaron durante lÜ min a 3.000 x g y los sobre
nadantes, decantados a tubos limpios, se evaporaron a sequedad y
se procesaron comose indicó en la sección X.l. de Materiales y
Métodos. Los productos de la reacción se resolvieron por cromato
grafía en papel con el sistema 2 (ver Materiales y Métodos, seccig
nes UI.2 y X.l). Este sistema separa el AMPcdel 5'AMPy a ambos
de los nucleósidos y bases (adenosina, inosina, e hipoxantina), los
cuales corren todos con el mismoRF. Se determinó que en los extrag
tos existe actividad de nucleotidasa de 5'AMPya que del 20%del
AMPc[3H1 hidrolizado solo el 30-35% apareció en la zona del 5'AMP
patrón mientras que el 60-65%restante apareció en la zona del crg
matogramacorrespondiente a los nucleósidos.
118
En ensayos paralelos se tomaron alicuotas similares de los
extractos, las que se incubaron y procesaron comose indicó arri
ba, excepto que se incluyó 1a segunda etapa de incubación con ex
ceso de Fosfatasa alcalina. Los productos de la reacción se read;
vieron por cromatografía en papel utilizando el sistema l (ver
Materiales y Métodos secciones V1.2 y X.l). Este sistema no resuel
ve bien el AMPcdel 5'AMPpero separa bien entre si adenosina, hi
poxantina e inoeina. En ningún caso la cantidad de inosina más hi
poxantina resultó mayor del 10%de la adenosina formada.
De acuerdo a estos resultados, se concluyó que la desaminación
no es significativa en estos extractos, similarmente a lo que ocurre
en extractos poco purificados de micelio de Neurospora crassa (356)
y de Phycomyces blakesleeanus (360). De esta manera se confirmó la
validez del ensayo de Ac-PDEcuando ae utilizó el método B para
valorar 1a actividad enzimática.
II. ACTIVIDAD DE FQÉEDDIESTERAÉB DE AMPC Y VARIACIDEES DE ng
NIVELES DE AMPC DURANTE LA MÜRFDGENESIS AERDBICA
Dadoque en todos los sistemas biológicos estudiados las acti
vidades enzimáticas que regulan los niveles intracelulares de AMPc
son la adenilato ciclasa y la fosfodiesterasa de AMPc,seestudiaron
las variaciones de la actividad especifica de la Ac-PDEy su rela
119
ción con los niveles intra y ektracelulares de AMPcdurante el
crecimiento aeróbico de M.rouxii. Al mismo tiempo se compararon
con las variaciones de actividad especifica de adenilato ciclasa;
dichos valores se incluyen en este trabajo con el objeto de compa
rarlos con la actividad de Ac-PDEy se reproducen de un trabajo
realizado en este laboratorio (18h).
El cultivo del organismo para estos ensayos se realizó como
se indicó en Materiales y Métodos (sección 1.5). Las muestras se
cosecharon a distintos intervalos de tiempo, siendo el tiempo tg
tal de crecimiento de 2h horas. Los tiempos de cosecha de los
distintos estadios se Fijaron teniendo en cuenta por observación
microscópica de muestras tomadas esterilmente, el momentoen que
el 80%de la población de células tuviera la morfología requerida.
Las morfologias que corresponden a los distintos estadios del crg
cimiento elegido se pueden observar en las abscisas de las Figuras
B y 9. El tiempo de aparición de las distintas Formas es variable
y dependiente de la cantidad de inóculo, por lo que en cada experi
mento se inoculó siempre la misma cantidad de esporas en cada frag
co (106 esporas/ml). Al cabo de los tiempos indicados las muestras
se procesaron como se indicó en Materiales y Métodos (sección IU.l).
En el gráfico de barras de la Figura B se comparan las varia
ciones de las actividades específicas de Ac-PDEy de adenilato ci
clasa en Función del tiempo de crecimiento aeróbico. Se observó que
°/odeloactividaddeesporas
O
100
75
50
25
_. ‘ . .
0h 1h30' 2h30'
120
Figura B: Morfologíal actividades de adenilato ciclasa v Ac-PDEdurante el
crecimiento aeróbico
Los ensayos de Ac:PDE se llevaron a cabo por el método B según se indicóen Materiales y Métodos (sección U.l.) utilizando extractos crudos comofuente de enzima (sección IV.1.). La medida de actividad de adenilato ciolaaa de los mismosextractos fué realizada por Ma. Leonor Cantore (18h).Los resultados se expresan comoel porcentaje de la actividad especificarespectiva de los extractos de esporas, que resultaron ser para la adenilsto ciclasa ADpmoles/mn/mg y para la Ac-PDE30 pmoles/min/mg. Todaslas determinaciones se llevaron a cabo en condiciones de linealidad respecto de la concentración enzimática. Los valores grsficados representanel promedio de cuatro experimentos por separado.
Ac-PDE:barras llenas; Adenilato ciclass: barras vacías.
121
las esporas sin germinar poseen los niveles más altos de activi
dades especificas de adenilato ciclasa y de Ac-PDE: AUy 30 pmoles
de AMPcsinetizados e hidrolizados por mg de proteina y por minuto,
respectivamente. A estas actividades especificas se les asignó ar
bitrariamente el valor lÜÜ. Las actividades especificas en los dis
tintos estadios se expresaron comoporcentaje de dichos valores. Se
vió que durante la germinación y hasta el estadio de células esféri
cas disminuyeron ambas actividades siendo más pronunciada la caida
de la actividad especifica de la adenilato ciclasa que la de la
Ac-PDE,así a las 2,5 horas de crecimiento las actividades especi
ficas remanentes Fueron el 25 y el 50%respectivamente. A partir de
ese momentola actividad específica de la adenilato ciclasa comenzó
a aumentar gradualmente y alcanzó valores del 75%en el estadio de
micelio joven, manteniéndose en este nivel hasta el final del crecí
miento. La actividad especifica de Ac-PDEno cambió significativa
mente luego de la caida inicial, manteniendo el valor alcanzado du
rante la fase del crecimiento exponencial y hasta el final del desarrollo.
Los niveles de AMPcintra y extracelular se midieron a diferen
tes intervalos de tiempo durante el desarrollo aeróbico. En la Figg
ra 9 se ve que la concentración de AMPcintracelular permaneció ca
si constante, en un valor de aproximadamente 20 pmoles/mg de prota;
na durante las primeras tres horas de germinación, excepto por un
122
_ '650 /_A—55—A 20° 20 .2
A E É¿0- E -'- o/°—‘5‘o —1503-15 É
o És É?30- j Q
a) CD
A /——o—5&-—. —100 8710 ¿5,J: BÉ ac)
¿g Éz 8< ¿3
4AMPcintrocelulor(pmol/mgprotH')
O
\. — 50 — 510- \o
¿A0M ' 1 l J__I( Ll. 8 12 16 2L
c o o v A: >R<
T|_EMPO(hs)
Figura 9: Niveles intra y extracelulares gg AMPCdurante la morfogénesisaeróbica
Se inocularon esporangiosporas cosechadas en el dia, en frascos decultivo individuales (lÜ6 esporas/ml). A los tiempos indicados, lasmuestras se procesaron por duplicado comose describió en la sección III;1.de Materiales y Métodos. Los niveles intra (O) y extracelulares (O) de AMPcse midieron comose indicó en la sección III.2. El crecimiento (A) se expresó como mg de proteinas/ml de cultivo. La Flecha indica el momentoen elcual el 80%de la población habia comenzado a emitir los tubos germinativos.
123
pequeño aumento observado a las 2 horas de crecimiento, para log
go decaer gradualmente alcanzando un minimo (10 pmoles/mg) e las
5-7 horas de desarrollo. Es en este momentocuando el 80% de la
población celular completó su transformación de esporas e células
esféricas y comenzóla aparición de los tubos germinativos. Luego,
y a medida que estos se elongan, los niveles intracelulares de
AMPcaumentaron continuamente con respecto e la proteina total
indicando sintesis neta de AMPc.La caida en los niveles intrace
lulares de AMPc,que coinciden con una transición diferenciativa
durante el crecimiento, Fueron observados en otros hongos afines
a M. rouxii: M. racemosus (31), M. genevensis y M. mucedo (389) y
Blastocladiella emersonii (51). En estos casos la aparición de los
tubos germinativos está precedida por una caida dramática del
AMPcintracelular, manteniéndose estos niveles bajos durante el
crecimiento vegetativo. Por otro lado, en estas especies hay un
aumentomuysignificativo de los niveles intracelulares de este
nucleótido durante'las primeras horas de germinación, aumento que
no se observó en.M. rouxii.
La Figura 9 muestra además que el AMPcextracelular se acumuló
en el medio de cultivo desde los primeros estadios de la germina
ción siguiendo un perfil similar al de la curva de crecimiento. EE
tos valores del nucleótido cíclico probablementerepresenten el
AMPcreal expulsado de las células ya que no pudo detectarse acti
12h
vidad extracelular de Ac-PDEen ningún estadio del crecimiento,
a pesar de ensayar cantidades de medio filtrado que cubrian una
amplia gama de concentración proteica (datos que no se muestran).N
De los datos de las Figuras B y 9 se concluye que existe una
correlación bastante estrecha entre los niveles intracelulares
del nucleótido cíclico y los cambios de las actividades especifii
cas de ambas enzimas. Estos datos sugieren que durante la trans;
ción de esporas a células esféricas existe una predominsncia de
la degradación sobre la sintesis del AMPc.A partir de la emisión
de los tubos germinativos la situación se invierte; a lo largo de
este periodo la sintesis del nucleótido cíclico predominasobre
su degradación, los niveles de AMPcaumentan gradualmente a medi
da que los tubos germinativos se alargan, alcanzando una meseta
al final de la fase logaritmica del crecimiento. La acumulación
total del AMPcintra más extracelular durante la fase logaritmi
ca no puede explicarse exclusivamente por cambios en las activi
dades especificas de la fosfodiesterasa y de la adenilato ciclasa.
Tal vez 1a síntesis a degradación de algún otro componente del
metabolismo del AMPc(inhibidores y/o activadores de ambas activi
dades) o la capacidad de las enzimas para responder a tales facQg
res estén alterados durante 1a morfogénesis.
Recientemente Ürlowski (389) trabajando con otras dos espe
cies dimórficas de Mucor, encontró que a lo largo de la germina
125
ción aeróbica de las esporangiosporas no se producen cambios sig
nificativos en las actividades de Ac-PDE,pero si en las adenils
to ciclasa y concluye que la concentración intracelular de AMPc
en estas especies es Función directa de la actividad de adenilato
ciclasa.
III. CONCENTRACION CELULAR DE AMPc
Se calculó la concentración de AMPcpor célula para quellos
estadios del crecimiento aeróbico en donde fue posible medir los
diámetros celulares, asimilando groseramente el volumende las
células al de una esfera, excepto en el caso de las esporangiospo
ras en donde el volumen celular se asimiló al de un eliosoide. Los
estadios del crecimiento considerados fueron desde esporangiospo
ras (t: Ü horas) hasta células esféricas (t: 5 horas) que es un es
tadio anterior al de aparición de los tubos germinativos
(t: 7 horas).
Se calculó la concentración de AMPcpor célula en cada estadío.
Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 5.
126
Mi
Concentración celular de AMPc
Estadio UOIUmencelular Proteína/célulg9 Concentración de AMF;(cEj
(horas) gp3) (mg.lÜB) (pmoles/mg por céluproteina) la (pMy
0 36,8 0,“. 19,3 2,3
1 07 0,63 19,8 1,1.
2 lb} 1,06 23,5 1,7
3 321 2,02 20,1 1,3
1+ 6h1 a,00 1a,0 0,9
5 1317 10,00 1h,2 1,0
Las células de los distintos estadios se obtuvieron de los culti
vos realizados para la morfogénesis aeróbica. (a) y (b) los velo
res se obtuvieron de los datos de la Figura 9.
De los valores de la tabla se deduce que durante la morfogé
nesis aeróbica, al menosen los estadios considerados, las varía
ciones del AMPcson significativas, ya que desde el estadío de es
pora hasta el estadio de célula esférica (t =Shoras) las concen
traciones de AMPcdisminuyen en más de un 100%, considerando al
nucleótido uniformemente distribuido en una solución acuosa; posi
blemente los niveles de AMPclibres sean menores. Los valores obte
nidos son semejantes a los hallados comovalor promedio para célu
127
las de eucariontes superiores (75,266) y para células de algunos
hongos (50,51).
IU. DISTRIBUCION SUBCELULAR DE LA FÜSFÜDIESTERASA DE AMPC EN
EXTRACTQQ DE LA FORMA FILAMENTQQE
Se comenzó el estudio de la caracterización de la Ac-PDEde
Mucorrouxii analizando su distribución en las distintas fraccio
nes subcelulares del mícelio.
En cada Fracción subcelular obtenida se midió la actividad
especifica y total de la enzima. Para los cálculos de la activi
dad enzimática se utilizó la zona lineal del gráfico de actividad
versus la concentración de extracto, observándose para todas las
fracciones, linealidad hasta una concentración de 100 ug de pro
teina.
La Tabla 6 resume los valores de las actividades especificas
y totales encontrados cuando se sometió l g de polvo de micelio
a1 fraccionamiento subcelular descripto. Los resultados son el
promedio de tres experimentos por separado. Se observó que más
del 65%de la actividad de AMPc-PDEse encuentra en el sobrenadag
te postmicrosomsl (5100), además dicha Fracción fue la única que
exhibió una actividad especifica mayor que la del extracto crudo.
Tabla6
DistribuciónsubcelulardelaAc-PDEdelaFormamicelianadeMucorRouxii
4
FracciónProteinaActividadespecíficaActividadtotalDistribución
(mg)(pmoles/min/mg)(pmoles/min)(%)
Homogenizado121,613,11593 P860,86,9¿.2028 P1008v58.9765 SlÜÜ32,231,2lÜÜS67 Sehomogenizúl g(pesohúmedo)depolvodemiceliocomosedescribióenlasecciónIU.2. deMaterialesyMétodos.Elextractocrudoobtenidosesometióacentrífugacíóndiferen cialcomoseindicóenlamismasección.EncadaFracciónseensayóactividaddeAc-PDE conelmétodoB.LasumadelasactividadestotalesdelasfraccionesP8,PlÜÜy5100se tomócomoel100%.
128
129
La actividad asociada a la Fracción PB, probablemente cons
tituida por Fragmentos de pared celular con membranasasociadas,
membranasprovenientes de organelas tales comonúcleos y mitg
condrias y tal vez por células no totalmente rotas, permaneció
dentro de los valores observados luego de rehomogenización y su
sesivos lavados con buFFer A, indicando que cerca del 30%de la
actividad total de la Ac-PDEestá asociada a esta Fracción y no
se debe a contaminación por el sobrenadante. La baja actividad
enzimática de la Fracción microsomal (P100) puede ser intrínsecade esa Fracción o deberse a contaminación con el sobrenadante
postmicrosomal, ya que el lavado del PlÜÜresultó diFicultoso de
bido al pequeño volumen obtenido de esta Fracción.
Cuandose estudió la distribución subcelular de la enzima en
esporas del hongo, se encontró que el 65%de la actividad de PDE
esta asociada a la Fracción P8, mientras que solo un 28%es solu
ble. Esta distribución puede explicarse por el gran porcentaje de
pared y membranascelulares que existen en esporas respecto de la
Fracción citoplasmática.
Al comparar la distribución subcelular de ls Ac-PDEde M.rouxii
con la descripta por otros autores para otros hongos, se encuentra
que hongos aFines a flgggï poseen una distribución subcelular similar de la FosFodiesterasa. Asi en Blastocladiells emersoníi la ma
yoría de la actividad de Ac-PDEes soluble (A9) y en Phycomyces
blakesleeanus lo es el 95%(360). En otros hongos no taxonómica
130
mente relacionados a M.rouxii se encontraron variaciones en cuan
to a la distribución subcelular de la Ac-PDE.Asi en NeurosEora
crassa la mayorparte de la actividad enzimática es soluble (lb3),
enEaceharomycescerevisiae el 80%de la actividad es soluble (35h),
en Physarum Eolyceghalum el 90% de la actividad total de Ac-PDEes
extracelular y el 10%intracelular está particulada en más de un
80%(351) y en Dictyostelium discoideum en el estado de culminación
la mayoria de la actividad es soluble (390).
En tejidos de mamíferos la situación es más compleja debido
a la existencia de Formasmúltiples de la enzima (ver Introducción
sección IX.l.). En términos generales las formas de la Ac-PDEcon
baja afinidad por el sustrato son solubles, mientras que la de al
ta afinidad es particulada (197,206-208).
U. ACTIVIDADES DE FqgfÜDIESTERAÉfi DE AMPo y de GMPc EN EXTRACTÜS
SÜLUBLES DE MICELIÜ
Se determinó la actividad de Ac-PDEy de Gc-PDEen la fracción
SlÜÜde micelio de Muoor rouxii. Para la determinación de ambas a5tividades enzimáticas se utilizaron tres concentraciones diferentes
de cada nucleótido cíclico. Los resultados obtenidos se pueden ver
en la Tabla 7.
131
Tabla 7
Actividades de Ac-PDE y de Gc-PDE en la fracción S1ÜÜ
Sustrato Actividad especifica(pM) (pmoles/min/mg )
AMPC D GMPC RC-PDE BC-PDE
Mn2+ M 2+ Mn2+ M 2+
0,2 u,2 1,7 Ü,Lo U,I+
1 12,7 5,0 1,u 1,5
lÜ 31,8 11,7 a,o 3,6
t Se ensayo actividad de Ac-PDEy de Gc-PDEen alicuotas apro
piadas de la fracción 510Üobtenida como se indicó en la sección
IU.3 de Materiales y Métodos. Ambasactividades enzimáticas se
ensayaron con el método A (secciones U.1. y V.3. de Materiales
y Métodos) a las concentraciones indicadas de cada nucleótído2+ 2+cíclico y con Mg o Mn como catión divalente a una concen
tración de lÜ mM.
Comose vé, la actividad especifica de Ac-PDEes de 3 a 10
veces mayor que la de Gc-PDE, siempre que los valores de activi
dades se comparen a la misma concentración de cada nucleótído
cíclico. La magnitud de estas diferencias dependió de la concen
tración del nucleótido cíclico y del catión utilizado.
132
V.l. Perfil de elución de las actividades de fogfodiesterasa de
AMPc y de GMPc en columna de DEAE-celulosa
ge investigó la existencia de formas múltiples de la PDEen
la fracción 5100 de micelio con el objeto de caracterizar mejorla(s) actividad(es) de PDEde este organismo. Para ello se uti
lizó la técnica de cromatografía en DEAE-celulosa a pH 6 desa
rrollada por Russfll y colaboradores (211) para separar las for
mas múltiples de Fosfodiesterasa de nucleótidos ciclicos presea
tes en hígado de rata. Esta técnica es una de las más utilizadas
para la separación Fisica de las distintas formas de PDEen tel;
dos superiores. Ademásde ser una técnica sencilla provee un
buen método de comparación con los resultados obtenidos por otros
autores utilizando el mismoprocedimiento (212,233,23h,3917.
La cromatografía en DEAE-celulosa de la fracción SlÜÜdializa
da dió comoresultado el perfil de elución de las actividades de
fosfodiesterasa que se muestran en la Figura lÜ.
Se observa que la actividad de Gc-PDE eluyó como un pico simé
trico a una concentración de 0,15 M de acetato de Na, acompañado
por un pico de proteina. La recuperación de la actividad de Gc-PDE
fue solamente de 15%con respecto a la actividad sembrada en la
columna. La actividad de Ac-PDEtambién eluyó como un único pico
simétrico a una concentración salina mayor (Ü,h Mde acetato de
(..... “JUÜÜL'O'G 133
3 ïï
(H’H) (WSZ/UNJ OZ/SGIOLUd)30d'3‘v’8 C)__ _ N ,0 o
deFRACCION
NO
375 250 L25e
(H) (¡riowmw02/salowd)30d-39Figura lq: Cromatografía en columna de DEAE-celulosa de la Fracción¿100MSe sembró lÜÜ mg de proteina de la fracción S UUdializada contra bufferTrio-acetato 30 mM,pH6; 2-mercaptoetanol A má en una columna de DEAEcelulosa de lÜ ml equilibrada en el mismo buffer. La columna se lavo con 20 mlde buffer y la proteína se eluyó con lÜÜml de un gradiente lineal de acetato de Na Ü-lMpreparada en el buffer de equilibrio. Las demás condicionesfueron descriptas en Mat.y Mét.(secc.VI.l.). La actividad de Ac-PDEse ensayó en alicuotas de 25 pl a l(0) y lÜ«))lpM de AMPc[3H].La actividad deGc-PDE se ensayo en alícuotas de ADpl a 0,2 pM de GMPc [3H](A)o La líneapunteada indica el perfil de elución de la proteina.
13h
Na) independientemente que la actividad enzimática se ensayara
a 1 o lܑpM de sustrato. No se pudo detectar actividad de Ac-PDE
en ninguna fracción de la columna cuando se ensayo la actividad
eniimática por la liberación de Fosfato inorgánico a una concen
tración de sostrato no radioactivo de l mM.La recuperación de
la actividad de la Ac-PDEfue del 75-80%respecto de la activi
dad sembrada. El pico de actividad de Ac-PDErecromatografiado
en las mismascondiciones anteriores volvió a eluir en la misma
posición (datos que no se muestran)..No se detectó actividad
fosfodiesterásica en las Fracciones correspondientes al lavado
de la columna.
U.2. Efecto del GMPcsobre la actividad de fosfodiesterasa de
AMPc
En principio, de la observación del perfil de elución de la
Figura lÜ, resulta obvio que la actividad de PDEque eluyó a
una 00ncentraci6n salina de Ü,h Mde acetato de Na es especifi
ca para la hidrólisis del AMPc,al menos a la concentración de
GMPcutilizada (0,2 pM). Sin embargo para confirmar los resul
tados se ensayo el efecto de concentraciones crecientes de GMPc
no radiactivo sobre la actividad de Ac-PDEdel pico obtenido de
la columna. Los resultados obtenidos se grafican en la Figura
ll. Se observa que para lograr una inhibición del 32%de la
135
A HLOii. 1D 1Q e\cÉ e105C3N\U)
¿0’ —7oEE2
L6Q_ -35
lL)<
k l l l
(7-5 J 1 1o 100 1000
GMPc [pM]Figura 11: Efecto del GMPcsobre la actividad de Ac-PDE
Las Fracciones limitadas por la barra en la Figura lD (18 ml) se Juntaron y dializaron contra buffer Tris-acetato 30 mM,pHE; 2-mercaptoetanol h mM.Para concentrar la actividad enzimática el dializado se sembró en una columnade DEAE-celulosa de 1 m1 Equilibrada con el buffer de diálisis. La columna selavó con 2 volúmenes de buffer de equilibrio y la proteina se eluyó con elmismo buffer conteniendo 0,8 Mde acetato de Na. Se reco ieron fracciones de
0,1 ml y se ensayó actividad de Ao-PDE a lipM de AMPc[3Hjen alícuotae decada fracción. Se juntaron las fracciones con actividad nzimática (l ml)y se dializaron contra buffer A. La recuperación de la actividad de estasegunda DEAE-celulosa Fue del 100%.
De la Fracción resultante se ensa 6 actividad de Ac-PDEen alicuotas delÜ pl a una concentración de AMPc3H de 10 pM y Mn2+ 10 mMy en presenciade concentraciones crecientes de MPc.
136
hidrólisis del AMPc[3H] fue necesario alcanzar en el ensayo una
concentracion de GMPclÜÜ veces superior a la del AMPc[BH] .
De los resultados de la Tabla 7 y de las Figuras lÜ y ll se
-puede concluir que:
a) La actividad especifica de Gc-PDEde extractos solubles de
M.rouxii es de 3 a lÜ veces menor que la actividad específica de
Ac-PDEa todas las concentraciones de nucleótido cíclico ensaya
das.
b) Las dos actividades de fosfodiesterasa parecen ser dos entida
des diferentes ya que: l) se separan en columna de DEAE-celulosa,
2) cada actividad es específica para su respectivo nucleótido c1
clico, 3) a Juzgar por las recuperaciones de ambasactividades
luego de la cromatografía en DEAE-celulosa, la actividad de Gc-PDE
sería menos estable que la de Ac-PDE, h) ambas actividades enzimá
ticas presentan un requerimiento diferencial para los cationes en
sayados, así la Gc-PDEfunciona igualmente bien con iones Mg2+o
Mn2+, mientras que el Mn2+
Mg2+para la hidrólisis del AMPcpor su enzima.
resultó 2 a 3 veces más efectivo que el
137
UI. PURIFICACIÜN PARCIAL DE LA ACTIVIDAD DE FÜSFÜDIESTERASA DE
AMPC SÜLUBLE
[a estrategia de purificación seguida en el presente estudio
tuvo como objetivo 1a separación de la actividad de Ac-PDEsol!
ble de micelio de Mucor rouxii de la mayor cantidad posible de
otras proteinas, poniendo especial énfasis en la separación de
la actividad de Ac-QP, que como se verá más adelante participa
directamente en el proceso de activación de la PDE.
1.- Preparación de la Fracción SlDU
Se partió de 20 g de polvo de micelio, y se preparó la frac
ción 5100 como se indicó en Materiales y Métodos (sección IU.3.).
Se obtuvieron AEml de 5100 la cual se consideró como primera
etapa de purificación. Se incluyó benzamidina 20 mMen el buffer
de homogenizacifin con el objeto de minimizar el ¡fecto de pro
teesas celulares. Comose verá más adelante, la proteólisis li
mitada de la Ac-PDEde este hongo produce una forma enzimática
que presenta mayor actividad que la de la Forma no proteolizada
de la enzima e insensible a la activación por Fosforilación.
2.- Fraccionamiento con sulfato de amonio
La fracción SlDDobtenida en el paso anterior se llevó a 55%
de saturación con una solución de sulfato de amonio saturada y
138
neutralizada (pH 7). La suspensión obtenida se centrifugó a
8.000 x g durante 20 min, se descartó el sobrenadante y el preci
pitado se guardó a -209C. En estas condiciones la enzima se con
serva durante varias semanas sin pérdida apreciable de actividad.
Esta etapa de purificación fué buena comotal, ya que se sepa
ró el 75%de la proteina del S Ü y la recuperación de la activilÜ
dad fue del orden del 80%.
3.- Cromatografía en DEAE-celulosa
El precipitado obtenido en la etapa anterior se resuspendiú
en un volumen mínimo de buffer B, obteniéndose h,3 ml de extrac
to (fracciún de sulfato de amonio), que contenía 17h mg de pro
teína, y se cromatografió en una columna de DEAE-celulosa de l,b
16 cm equilibrada en buffer B. Para bajar la fuerza iónica y
permitir la adsorción de la muestra a la resina se utilizaron
dos métodos alternativos: a) la fracción de sulfato de amonio se
desaló por pasaje a través de una columna de Sephadex 8-25 equi
librada con buffer B conteniendo glicerol 20%(V/V) o b) la mueg
tra se sembró diluida en buffer B en porciones de AUml de modo
de obtener una concentración de proteína de l mg/ml. Luego del
sembrado, la columna se lavo con un volúmen de buffer de equili
brio y se desarrolló la cromatografía con un gradiente lineal de
ClNa entre Ü-Ü,h5 Mpreparado en buffer de equilibrio.
139
Los resultados obtenidos se grafican en la Figura 12. Se ob
servó un solo pico de actividad de Ac-PDEque eluyó a una concefl
tración de ClNa de 0,25 My que co-cromatografió con el pico de
actividad de Ac-QF.La Figura 12 muestra un perfil tipico de el!
ción de ambas actividades enzimáticas.
Las Fracciones limitadas por la barra en la Figura 12, se jua
taron y concentraron por precipitación con sulfato de amoniosó
lido hasta 80%de saturación, cuidando de mantener el pH de la
suspensión en el rango 7-7,5 con buffer Tris-ClN lDÜ mM,pH 7,5.
La suspensión se centrifugó a 8.000 x g durante 20 min y el pre
cipitado obtenido, resuspendido en un volumen minimo de buffer B,
se dializó contra lÜÜ volúmenes del mismobuffer durante 2 horas.
El dializado se clarificó por centrifugación. El sobrenadante ob
tenido (Fracción de DEAE-celulosa)se utilizó en la etapa siguieg
te de la purificación.
En la cromatografía en DEAE-celulosa se separó una cantidad
apreciable de proteina y la actividad de Ac-PDEse purificó apro
ximadamente 6 veces respecto del paso anterior.
h.- Gradiente de sacarosa
La fracción de DEAE-celulosa se sembró, dividida en alicuotas
iguales, en 6 gradientes de sacarosa 5-20%preparados en buffer B.
Se recogieron, unas sobre otras, las 26 fracciones obtenidas de
musss- - m(“n”) C)C]
oo LD 4' N
o‘ o‘ cr e OII l
(H) (INOL/SGPDPWNdO-ÜV<9: . SP. ' o Ql Í f
O52
a DCW
'oooZZ9E oL)<0:LL
8 m“o
.3 oz
D.m
.C)N
'É Ol l l
ca c3 C3 c3co x: C“
(H) (¡”OL/uwoaselowdeod-ov_9_Fiura12:WMde sulfato de amonio
Se aplicó la fracción de sulfato de amonio en una columna de 25 ml deDEAE-celulosa equilibrada en buffer B. La columna se lavú con 25 ml debuffer de Equilibrio y la proteina se eluyó con un gradiente lineal deClNa Ü-Ü,h5 Mpreparado en el buffer de equilibrio. Las demás condiciones se indicaron en Mat. y Mét. (sección UI.l.). Las actividades de Ac-PDEy Ac-QPse ensayaron en alicuotas apropiadas según se indicó en las secciones V.l. y V.5.l.. La linea de puntos indica el perfil de elución de laproteina.
lhl
cada gradiente, resultando Fracciones de aproximadamente 1,1 m1.
-Se ensayó actividad de Ac-PDEy de Ac-QP en alicuotas de cada
una de estas Fracciones. Unperfil de sedimentación tipico de
ambas actividades se muestra en la Figura 13. Las fracciones limitades por la barra, se juntaron y concentraron a través de una
columna de DEAE-celulosa de l m1. El concentrado se dializó con
tra buffer B y se guardó a -ZÜQC(Fracción de gradiente de saca
rosa). Las fracciones con actividad de Ac-QPse juntaron y conceg
traron a través de un concentrador Minicon —B 15. La Fracción og
tenida se guardó a -ZÜDCpara ser utilizada en algunos ensayos de
activación de la Ac-PDE.
Resultó útil incluir esta etapa de purificación, ya que, como
se vé en la Figura 13 con este procedimiento se separa completameg
te la actividad de Ac-PDEde la de Ac-QP.
5.- Cromatografía de afinidad en columna de Azul 2-Agarosa
Se utilizó esta etapa en la puriFicación de la Ac-PDE,ya que
se ha demostrado que la cromatografía de afinidad que utiliza como
ligando dextrano azul puede emplearse ventajosamente para la puri
Ficación de proteinas que tienen afinidad para los nucleótidos li
neales de adenosina (v.g. ATP, NADo Coenzima A) (392).
Morrill y colaboradores (376) describieron el uso de esta téc
nica para purificar a homogeneidad la Ac-PDEde cerebro bovino.
1h2
'I‘ 160- _..I -50Á'5. s 2.4381 I“x” e.s E .7g 8 —0,6..N o É} 80- .12 ¿35-3 L25 g up
(ED V—0,l.o_.5} ......... _. 83 C3
UJ óo _¡L < 0,2ó< .__-__4
i l
o 10 20
N° de FRACCION
Figura 13: Sedimentación en gradiente de sacarosa de la fracciónde DEAE-celulosa
Se sembró la fracción de DEAE-celulosa en 6 gradientes de sacarosa5-20%preparados en buffer B. Las condiciones de la corrida se indicaron en Mat. y Mét. (secc. VII.). Las actividades de Ac-PDEy deAc-QPse ensayaron en alícuotas apropiadas según se indicó en lassecciones V.1. y V.5.l.. La línea de puntos indica el perfil deelución de la proteína. ‘
1h}
Con la Ac-PDEde M.rouxíi purificada hasta la etapa h se reg
lizeron numerosos ensayos preliminares buscando las mejores con
diciones de adsorción de la enzima al gel y su posterior elución.
Asi; se encontró que a pH 7,5 la mayoria de la actividad de PDE
no fue retenida en la columna, mientras que a pH 6,3 más del 90%
de la actividad enzimática se adsorbió al gel.
En base a estos ensayos preliminares se adoptó el siguiente
protocolo en esta etapa de la purificación: la fracción de gra
diente de sacarosa (l ml) se dializó contra lÜÜ volúmenes de
buffer C conteniendo Cl Mg 2 mMy se sembró dividida en 2 fraccig2
nes de 0,5 ml cada una. Después de sembrar cada alícuota, la co
lumna se cerró durante una hora para permitir la adsorción de la
muestra al gel. Todas las operaciones se realizaron a ADCy la
cromatografía se desarrolló comose indicó en Materiales y Méto
dos (sección V1.3.).
Unperfil tipico de elución de la actividad enzimática y de
la proteina se muestra en la Figura 1h. Se observa que con el la
vado salino se separó una cantidad apreciable de proteina no en
zimática; la actividad de Ac-PDEeluyó como un pico agudo por
acción del AMPcagregado al buffer de elución. Del gráfico tem
bién se observe que un lavado posterior del gel con alta concen
tración salina hace que eluya otra cantidad considerable de pro
teina sin actividad de Ac-PDE.
lhh
Figura 1h: Cromatografía en columna de Azul 2-Agarosa de la
fracción de gradiente de sacarosa
:1
msog s05 .7
oE Éo.
El, —0,25 aLn
E O.ó D<
‘--I III-——-——d>
:bufferC+ÓlNo 0.2M bufferC+Cl No 0.2 M buffer c + Cl No 1M
+ AMPc ZmM
N° de PA NEL
Se sembró la fracción de gradiente de sacarosa dializada contrabuffer C, en una columna de 1,5 ml de Azul Z-Agarosa equilibrada en elmismobuffer. Las condiciones de cromatografía se indicaron en Mat.y Mét.(secc. VI.3.). De cada panel se recogieron 1h fracciones de 0,5 ml. Paradeterminar la actividad enzimática en las Fracciones correspondientes a laelucíón con buffer conteniendo AMPc,(Panel II) se tomaron alícuotas de SUplde cada fracción y se agregó 50 pl de una solución de BSAde lÜ mg/ml. Laproteína se precipitó con 0,3 ml de una solución saturada de sulfato de amonio; luego de centrifugación, el precipitado se resuspendió en 50 pl de buffe:Tris-ClH lÜ mM, pH 7,5; 2-mercaptoetanol 2 mM, y se ensayó actividad de Ac-PDEen alicuotas de l pl. La actividad enzimática de las fracciones correspondientes al lavado (Panel I) y a la elución con BlNa l M(Panel III) se ensayó dírectamente en alícuotas apropiadas. En todos los casos la actividad de Ac-PDEse determinó a l pM de AMPc[3H} La linea de puntos indica el perfíl de elución de la proteina.
le
Las fracciones limitadas por la barra se Juntaron y concen
traron por ultrafiltración a través de un concentrador
Minicon-B 15 y el concentrado se dializó contra buffer A conte
niendo glicerol-20% (v/v).
La actividad especifica de Ac-PDEen la fracción de este Q;
timo paso de purificación fue de 8.200 pmoles de AMPchidrolira
do/min/mgde proteina, lo cual representó una purificación de
aproximadamente 260 veces respecto de la fracción SIDO. (Ver IEbla 8).
VII. ELECTRÜFÜRESIS EN EEL DE PDLIACRILAMIDA DE LA FÜSFÜDIESTE
RASA DE AMPC.
La Figura 15 muestra el perfil de proteinas (15 A) y de ac
tividad enzimática (15 B) de la preparación de Ac-PDEde la últi
ma etapa de purificación alcanzada (Fracción de Azul 2-Agarosa).
Comose vé en la Figura 15 A la preparación no es homogénea.
Por densitometria del gel se pudieron detectar h picos principa
les de proteina; designados I, II, III y IU de acuerdo a su moqi
lidad electroforética, solo el pico III, cuyo RFfue 0,62, coin
cidió con el pico de actividad de Ac-PDE(Figura 15 B). Por el
área de los distintos picos de proteina se puede estimar que la
Ac-PDEes aproximadamente el 30%de la proteína total.
Tabla8'
PurificaciónparcialggilaAc-PDEsolubledemicelíct
FracciónVclUmenProteinaActividadespecíficaActividadtotalRecuperaciónPurificación
(ml)(mg)(pmcles/min/mg)(pmcles/min)(%)(veces)
l.5100b66h531.220.12hlÜÜl 2.Sulfato
deamo nich,317h93.616.286813
3.DEAE-cg
lulcsa1,82061612.3206120
h.Gradiqg
tede sacarosal512206.1003G39
5.Azul2
Agarüsa0,20,28.2001.6hÜ8262
i Separtióde20grdepolvodemicelíc(pesohúmedo)ysepreparólafracción5100comose
indicóenlasecciónIU.3.deMaterialesyMétodos).
lh6
Ac-PDE(pmoles/ZOmin/100pl)
cf
Figura 15: Electroforesis en gel de goliacrilamida de
la fracción de Azul 2-Agarosalb?
AAc- PDE ABF
20
Rf : 0.62
III0123 lll/¡lll#5678910Distancia de Migración (cm)
Dos alicuotas de 50 pl deniendo 50 pg de proteina, sede poliacrilamida al 7%comoUno de los geles se cortó ense midió actividad de Ac-PDE
la fracción de Azul Z-Agarosa, contesometieron a electroforesis en gelesse indicó en Mat. y Mét. (secc.IX).rodajas de 3 mmy en cada una de ellascomo se indicó en la secc. U.2.. El
otro gel se tiñó para visualizar las proteinas y se procesó comoseindicó en la seco. IX. A) densitometria del gel teñido y B) perfilde actividad de AC-PDE. ABF indica la distancia recorrida por elcolorante indicador de frente.
lhB
VIII. PARAMETRQggfilNETICQg DE LA FQfifÜDIESTERfigfi DE AMPc
Se calculó la constante de afinidad para el sustrato y la
velocidad máxima de hidrólisis del AMPcde la Ac-PDEsoluble.
Para estas medidas cinéticas ee utilizó la enzima de la etapa 3
de purificación (Tabla 8).
La representación de Lineweaver-Burk (393) para la activi
dad de Ac-PDErespecto de la concentración de sustrato puede og
servarse en 1a Figura 16.
Se vé que la representación es linear hasta una concentración
de sustrato de aproximadamente lÜ pM; de esta parte del gráfico se
calculó una Kmaparente de 2,5 pM y una V de 920 picomoles de AMPc
hidrolizados/min/mg de proteina. A concentraciones mayores de sus
trato (20,50 y lÜÜpM) la representación se aparta de la linealidad.
Este tipo de comportamiento bifásico se observó en preparacig
nes enzimáticas poco purificadas de tejidos de mamíferos (197,207,
211,2h1) y de algunos eucariontes inferiores (v.g., 3h3,352,356,
360) y puede explicarse comose vió en la Introducción (sección
IX.1.) por: a) un sistema de isoenzimas con diferente afinidad por
el sustrato, b) una enzima alostérica con cooperatividad negativa,
c) una enzima con dos sitios para el sustrato, no interactuantes
y d) una enzima que se agrega en formas que representan distinta
afinidad por el sustrato.
lh9
_\ LNÏ
10
Km c1pr 2,5 uM
V 2920pmohsúnm/mg1/V
Ípmoles/min/mgl-1x103
3
1/AMPc lpM 1’1
Figura 16: Regresentación de Lineweaver-Burk para la Ac-PDEsoluble
I.—\ _¡ U1.
La actividad de Ac-PDEse determinó con el ensayo standard variando la concentración de AMPcno radioactivo desde 0,2 a lÜÜpM,a una concentración constante de AMPc[3H]de 0,035 pM. La concentración de extractos enzimática se ajustó de tal manera que paraninguna de las concentraciones de AMPcutilizadas se consumieramás del 20-25%del sustrato. Las velocidades iniciales se obtuvieron de curvas de tiempo obtenidas para cada concentración utilizada de AMPc. /
150
En el caso de la enzima de Mucor rouxíi se podrian descar
tar las posibilidades a) y d) ya que ambas implican la presencia
de más de una forms enzimática de Ac-PDE, mientras que los resul
tados hallados a lo largo del presente trabajo indicarían que al
menoslos extractos solubles poseen una sola especie enzimática
que no Forma agregados, ya que la enzima eluye como un pico simg
trico por filtración en gel (Figura 19), sedimenta comoun solo
pico simétrico en un gradiente lineal de sacarosa (Figura 18) y
da un solo pico de actividad en columna de DEAE-celulosa a pH 6
o 7,5 (Figuras lÜ y 12).
Aunquede los resultados experimentales obtenidos no pueden
descartarse las posibilidades b y c es importante señalar que
las concentraciones intracelulares de AMPcdel hongo oscilaron
entre l y 2‘uM; de tal modo que un segundo sitio de baja afini
dad por el sustrato, mayor de 20 pM, no sería actuante en condi. . . fi .c1onesfisiologicas.
De todas maneras la existencia de una forma cinética de
Ac-PDEde Hmaproximadamente 2,5 pM seria coherente con la con
centración intracelular de AMPcen este organismo e indicaria el
papel Fisiolfigico que cumple esta actividad enzimática en la re
gulación de los niveles intracelulares de este nucleótido. Dado
que los valores de la Hmde las fosfodiesterasas de ÁMPcencon
trados en los distintos sistemas oscilan aproximadamenteentre
151
0,8 y 3 yM para las formas de alta afinidad y entre lÜ y lÜÜyM
para las formas de baja afinidad (197), la enzima de M.rouxii
estaría comprendidaen la primera categoria.
s
IX. REQUERIMIENTO DE BATIÜNES DIVALENTES PARA LA ACTIVIDAD DE
FÜSFÜDIESTERASA DE AMPc
Ya en los trabajos en los cuales describió por primera vez
una actividad de fosfodiesterasa (191,192) se señalaba el reque
rimiento de iones M92+para la expresión de su actividad máxima.
Este requerimiento de catión divalente, generalmente Mg2+o Mn2+,
fue descripto para la mayoria de las actividades de PDEestudia
das, tanto de eucariontes superiores (v.g. 193,196) comode eucg
riontes inferiores (v.g. h9,lBÜ,3h1,360) y de procariontes
(39h,395).
En ciertos casos otros cationes divalentes pueden reemplazar2+ 2+parcial o totalmente al Mg o Mn2+. Así el Co resultó el catión
más efectivo para la forma partículada de la Ac-PDEde corteza re
nal de conejo (250). En general los cationes monovalentes producen
solo una ligera estimulación de la actividad enzimática (h9,lBÜ,2+39h). En ciertos procariontes el Fe resultó un activador más
efectivo que el Mg2+de la actividad de PDE (39h). En el caso de
la Ac-PDEde levadura de panadería los metales divalentes resulta
152
ron inhibitorios aún utilizados a concentraciones de l mM(35h).
El Mg2+a concentraciones superiores a 0,8 mMresultó inhibito
rio de la enzima de cerebro de conejo (192). También se ha obser
vado gue la combinación de dos cationes estimulatorios de la ac
tividad enzimática resultó inhibitoria de la misma(396). En al
gunos casos el efecto estimulatorio o inhibitorio de un catión
depende de la concentración de sustrato utilizada en el ensayo,
como se demostró para la forma soluble de la Ac-PDEde corteza
renal de conejo (250). Finalmente y para destacar la importancia
del estudio del efecto de los cationes sobre la actividad de PDE,
podemosdecir que el entorno iónico puede influenciar las formas
especificas de la PDEde nuclefitidos cíclicos al influenciar la
estabilidad y actividad de las enzimas y de las proteinas en ge
neral.
Con el objeto de caracterizar la actividad de Ac-PDEde
Mucorrouxii, se estudió el requerimiento de cationes divalentes
tales como Mg2+y Mn2+. Para determinar este requerimiento se mi2+dió la actividad enzimática en presencia de Mg o Mn2+a distin
tas concentraciones en el ensayo. Los resultados obtenidos se
ilustran en la Figura 17 donde se grafican curvas dosis-respuesta
para los dos cationes empleados. Se hicieron controles para slim;
nar la posibilidad de algún efecto de estos metales sobre la acti
vidad de fosfatasa alcalina utilizada en la segunda etapa de la
reacción.
Figura17:EfectdïlasionesMg2+yMn2+sobrelaactividaddeAc-PDE
Mn2+
<(
1
200
Kmupp:1,1mM
VuLLOpmoles/nin/mg
I \m 0-,
100
Mg2+
Kmappulij
V«1160pmolcslminIm;
o121/Me”[mMÏ1
...l
E0L " L_[6Lu/UILu/s;>¡ouud]A/l
(¡HZ/UMJOZ/salowd)3nd- 3V
/EDTA 02
lll\l68104“50.
Me2*[mM]
SeensayóactividaddeAc-PDEaunaconcentracióndeAMPc[3H] delÜ¡JMenalicuctasapropiadasde laFraccióndeDEAE-celuldsayconconcentracionescrecientesdeCleg(o)oClen(o).EIA1nd1 calaactividadenausenciademetalyenpreseznciade2EDTA0,5mM.LosinsertadosAyBmuestran 1+ .Mp.+_______—__4-__4Innn_pl-l¡manu-unn“Ein-nl,“nn-aMn¡
4x7
153
nnannauF-É|1nmnn+fl
2+2+
Figura17:EfectodelosionesMgyMnsobrelaactividaddeAc-PDE
200---A
ngppgïjmM
VuloLOpmoles/I'nh/mg
204B
_2+io-o0
Mg Kmappg1,8mM
V11160pmoles¡min/mg
...l
O121/Me2+[mM1'1
¿Ol x L_[Í5LU/UILLJ/Sa10Lud]A/l
(IWZ/UMOZ/salowd)30d- 3V
/EDTA
llll\l z."681ofl50.
Me2*[mM]
SeensayúactividaddeAc-PDEaunaconcentracióndeAMPc[3H] de10¡JMenalicuctasapropiadasde lafraccióndeDEAE-celuldsayconconcentracionescrecientesdeClZMQ(O)aClen(0).EIAlndl calaactividadenausenciademetalyenpresenciadeEDTA0,5mM.LosinsertadosAyBmuestranlasrepresentacionesdeLineweaver-BurkparaMn2+yM92+
02
respectivamente.
153
15h
En ausencia de catión divalente se observó una actividad en
zimática residual que se anuló en presencia de EDTA0,5 mMposi
blemente por quelación de trazas de metales presentes en la pre
paración. En la Figural? se observa que la estimulación máxima
se alcanza con 10 mMde Mg2+ o 5 mMde Mn2+, siendo la estimula
2+ de 2 a 3 veces mayor que por Mgz+. En aquellosción por iones Mn
experimentos en donde se midió la actividad enzimática en presen
cia de ambos cationes, a una concentración de 5 mMpara cada uno,
se observó que el valor de la velocidad de hidrólisis del AMPc
fue intermedio al que se alcanza agregando al ensayo los cationes
por separado a una concentración de lÜ mMcada uno. Este hecho
puede explicarse por la afinidad semejante de la enzima para am
bos metales y las distintas velocidades máximasalcanzadas con2+
Mn o Mg2+. Los valores de Hmy de U para ambos metales se dedu
jeron de la representación de Lineweaver-Burk (insertado de la
Figura 17,A y B), obteniéndose valores de 1,1 y 1,8 mMpara las
constantes de afinidad del Mn2+y Mg2+respectivamente y de hhÜ
y 160 picomoles de AMPc[BH] hidrolizado/min/mg de proteína para
los respectivos valores de U.
En términos generales la concentración intracelular de Mg2+
en los tejidos es lÜ veces superior a la de Mn2+.Por otra par2+
te el Mg es considerado un macroelemento para el crecimiento
de los hongos. Dado que la afinidad de la enzima para ambos me
155
tales es semejante, es dificil decidir con que metal actúa la
enzima in vivo; no obstante la mayorvelocidad de hidrólisis delT 2+AMPcalcanzada cuando se ensaya la actividad con Mn debe tener
se en cuenta desde el punto de vista del mecanismo de la reacción
in vitro.
X. EFECTO DE ALEyNÜSAEEfiIBIDÜRES Y ACTIVADÜRES CLASICOS DE LA
FÜSFÜDIESTERASA DE AMPc ÉQERE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA DE
MUCDR RÜUXII
A partir de los primeros trabajos en los cuales se describió
una actividad de PDE(191,193) se ha encontrado que la mayoria
de las fosfodiesterasas de tejidos de mamíferos son inhibidas en
forma competitiva por metilxantinas. A1 mismo tiempo se ha des
cripto el efecto activador del imidazol sobre dicha actividad
(193,198,199).
El ATPa concentraciones fisiológicas inhibe la actividad de
PDEtanto de eucariontes superiores (196,327,397) comode algu
nos eucariontes inferiores (351,356) mientras que la enzima de
otros eucariontes inferiores es relativamente insensible a la
inhibición por ATP(360) o no es inhibida en absoluto por este
nucleótido (35h). Casos singulares los constituyen la Ac-PDE
extracelular de Dictyostelíum discoideum (398) y la GC-PDEalta
156
afinidad para el sustrato de retina de vertebrados (255) las que
son estimuladas por ATP.
Comoparte de la caracterización de la Ac-PDEde Mucor rouxii
se estudió el efecto de las metilxantinas, del imidazol y del ATP
sobre la actividad enzimática de la etapa A de purificación. La
Tabla 9 resume los resultados obtenidos.
Comopuede observarse la enzima de M. rouxii no fue inhibida
en forma significativa por las metilxantínas ensayadas, aún a CQE
centraciones altas (lÜ mM),contrariamente a lo que sucede con la
enzima de tejidos de mamíferos en donde concentraciones de l mMde
estos compuestos inhiben en un 50 - 70%la actividad fosfodiesterá
sica (193). En este sentido la Ac-PDEde M.rouxii se asemeja a la
enzima de otros hongos (3h1,35h,360), de plántulas de arveja (210)
y Trgganosoma cruzi (180).
El imidazol tuvo un ligero efecto estimulatorio a la concentra
ción más baja utilizada y un leve efecto inhibitorío a la concen
tración más alta.
En la Tabla 9 puede verse que el ATPhasta una concentración
1 mMno tuvo un efecto significativamente importante sobre la act;
vidad de Ac-PDEsoluble de M.rouxii. De acuerdo con las resultados
obtenidos con una enzima parcialmente purificada, el ATPno seria
un modulador fisiológico de la actividad de Ac-PDEdel hongo.
157
Tabla 9Á Ü
Efecto de inhibidores y activadores clásicos sobre la actividadgg AcePDE de Mucor rouxii
Adiciones a la mezcla Concentración Actividad de Ac-PDEde incubación (%)
Ninguna '——— lÜÜ
Imidazol 5 115lD 92
Cafeina 5 8210 75
Teofilina 5 BDlD 73
Teobromina 5 BD
10 86
ATP 0,05 lll0,5 11hl 106
’ Los resultados obtenidos se obtuvieron utilizando lÜ ¡g de laenzima de la fracción de gradiente de sacarosa (Tabla B). La act;
vidad de Ac-PDE se midió s 10 pM de AMPcPaily con Mn2+ como catión divalente. Las actividades enzimáticas se expresaron comoporcentaje de la actividad sin adiciones, ls que se tomó comoel100%.
Se estudió el efecto de estos compuestos sobre la segunda etapa de la reacción para descartar cualquier posible acción sobre laactividad de fosfatasa alcalina; los valores de actividad de Ac-PDEencontrados no difirieron de los del control sin adiciones.
158
XI. EFECTO DE CALMDDULINA EEPRE LA EggfÜDIESTERASA DE AMPc
DE MUCDR RDLIXÏI
Se trató de probar si la Ac-PDEsoluble de M.rouxii ers act;
2+ lo cual sería una forma indirecta de demostrar lavable por Ca
presencia de una proteina activadora similar a la calmodulina, en
extractos poco purificados del hongo. Se trabajó con la Fracción
SlDDporque una fracción más purificada podria haber perdido la
proteina regulatoria putativa,ya que está demostradoque en teji
dos superiores la calmodulina se puede separar de la fosfodieste
rasa por pasaje a través de una columna de intercambio aniónico
(150,301).
Se sabe que la activación de la PDEpor calmodulina requiere
concentraciones micromolares de Baz+ y que este efecto activador
es anulado por EGTA.En base a estos datos se diseñó el experimeg
to resumido en la Tabla lÜ, para ver si la presencia de Ca2+ en
el ensayo de la Ac-PDEestimulaba la actividad enzimática. Los re
sultados de la Tabla indican que la actividad de Ac-PDEno se modi
ficó por el agregado de ClZCa hasta una concentración 0,5 mM,ni
se inhibió por el agregado EGTA.
Los resultados obtenidos sugieren que la Ac-PDEde M.rouxii es
insensible a calmodulina 882+ o bien que la enzima es sensible al
activador proteico pero este no está presente en el extracto. Para
159
Tab a lÜ
Efecto del Cazt, EGTAy calmcdulina sobre la Ac-PDEsoluble des ItMuccr rcuxii
Adiciones a la mezcla Bcncentracifin Actividad de Ac-PDE
de incubación (pmcles/min/mg)
l. Ninguna 19,3
2. 81205ID pM 18,1
lDU pM 28
SUD pM 18,6
3. EGTA
200 pM 19,8
500 pM 19,2
lÜDÜ pM l7,hA. Calmcdulina
50 pg/ml 18,5lÜÜ pg/ml 19,7
5. Calmcdulina
+ ClZCB (a)50 pg/ml + lÜÜ yM l9,h
lÜÜ pg/ml + lÜÜ pM 19,72+O
La actividad de Ac-PDE de la fracción 5100 se ensayó con Mgccmd metal divalente y a una concentración de sustrato de 10 pM conlas adiciones indicadas. Las alicuctas de la fracción se tomaron detal manera que nc más del 10%del sustrato fuera hidrclizadc en elensayo en ausencia de calmcdulina.Ca2+.
(a) En estas condiciones la actividad basal de la Ac-PDEde corazón bovino fue estimulada 3 veces.
160
descartar la primera posibilidad se estudió el efecto del Baz+
sobre la Ac-PDEen presencia de calmodulina exógena (de corazón
bovino). Los resultados obtenidos se ven en la mismaTabla y su
gieren que la actividad de Ac-PDEno es activable al menos por
calmodulina heteróloga. La insensibilidad a calmodulina, homólg
ga o heteróloga, es un hecho general para la mayoria de las fqg
fodiesterasas de los eucariontes inferiores (180,288,289.291)
y para las enzimas especificas para AMPcde tejidos superiores.
(Ver Introducción, sección IX.2.).
XII. ALGUNOS PARAMETRQÉÍHIDRÜDINAMICÜS Y MÚLECULARES DE LA
FÜSFÜDIESTERAEB DE AMPC'
Para la determinación de los parámetros hidrodinámicos y mo
leculares de la Ac-PDEsoluble de Mucorrouxii se utilizaron los
datos obtenidos de la ultracentrifugación en gradiente de sacarg
sa y de filtración molecular en columna de Sephadex 8-200.
XII. l. Coeficiente de sedimentación y coeficiente de difusión
Estos parámetros se determinaron utilizando los datos de ul
tracentrifugación en gradiente de sacarosa. Para ello se utilizó
una preparación de la fracción de sulfato de amonio (etapa 2 de
la purificación). La Figura 18 muestra el perfil de sedimentación
161
G.0. P.A. Px Ci’t c
a l lCD
Q.E 10* AE E12
o s _ G.0.N .9."B ¡58-2 Tv .C) .9E ‘á 4'o. E .
E 20-1 o cncC3O.ó<
0l l I l l
0 5 10 15 20 25
20% 5% SACAROSA. I
N° de FrQCCIon
Figura 18: Ultracgptrifugación en gradiente de sacarosa de la fracciónde sulfato de amonio
Se sembraron en un gradiente de sacarosa 5-ZÜ%preparado en buffer B1,2 mg de la preparación enzimática junto con las proteinas marcadores,en un volumen final de 0,1 m1. Las condiciones de la centrifugación se igdicaron en la sección VII. de Materiales y Métodos.
En cada una de las Fracciones del gradiente se ensayó actividad deAc-PDEen alicuotas apropiadas. La flechas indican la posición de las proteínas marcadoras: glucosa oxidasa (8.0.), peroxidasa (Px), fosfatasa alcalina (P.A.) y citocromo c (Cit c). En el gráfico insertado se encuentra
la relación entre los coeficientes de sedimentación (SZÜ,U)y las distancias recorridas desde el borde superior del gradiente por la Ac-PDE(o)y por las proteinas marcadores (I).
162
de la actividad de Ac-PDEy la posición de las proteinas marcada
ras{_En el insertado se observa la relación entre las distanciasrecorridas por las proteinas marcadores y sus respectivos coefi
cientes de sedimentación; también se señala la ubicación sobre
la recta de la Ac-PDEsegún su movilidad en el gradiente. Los rg
sultados obtenidos muestran que la PDEde M.rouxíi sedimentó ba
jo la forma de un pico simétrica entre la fosfatasa alcalina y
la peroxidasa. El valor del coeficiente de sedimentación obteni
do Fue de h,2 S, que corresponde al de una proteina pequeña. Con
esta técnica no se detectaron Formas de mayor coeficiente de se
dimentación.
El valor del coeficiente de difusión de la Ac-PDEfue de
7 cm2/seg y se obtuvo de los datos del gradiente utilizan8.7.10
do la relación descripta en la sección UIII. 1. de Materiales y
Métodos.
XII.2. Radio de Stokes
Para la determinación de este parámetro de la enzima se uti
lizó la técnica de filtración molecular a través de una columna
de Sephadex 8-200. Se utilizó una preparación de la fracción de
sulfato de amonio. En base al Hav hallado para la Ac-PDEde la
Filtración molecular se determinó su radio de Stokes.
En la Figura 19 se muestra el perfil de elucíón de la Ac-PDL
163
: 30:L s Vo GD. BSA PX CHt: Bu
° l 1 lc0\\ ..EEE ' .
ga 204 1 — GO.
:3 3% " BSA2 .3 0'6' PxO cnEE .? cn c
- .9: 10- V “2"
UJ o 20 040
E o(A)ó<
0l 1 I l Í
10 30 50 70 90
o IN° de Froccnon
Figura 19: Filtración en una columna de Seghadex G-ZÜÜde la fraccióngdgsulfato de amonio
Se sembró l ml de muestra conteniendo 30 mg de proteina de la preparación enzimática y los marcadores, a excepción de la BSAque se cromatografiúpor separado. Las condiciones de la cromatografía se indicaron en la secciónUI.h. de Materiales y Métodos. Se ensayo la actividad de Ac-PDEen alicuotas
[3H] 1 pM. Las Flechas indican la posición de los marcadores: glucosa oxidasa (8.0.), seroalogapropiadas de las fracciones a una concentración de AMPc
mina bovina (ESA), peroxidasa (Px) citocromo c (Bit c) y Vitamina 812 (812).Vo indica el volumen de elucíón del azul dextrano. El grafico insertado
muestra la relación entre los radios de Stokes (a) y los Havpara la actiyidad de Ac-PDE(o) y para las proteinas marcadores (o).
16h
y la posición de las proteínas utilizadas comomarcadores.
La actividad de Ac-PDEeluvó como un pico agudo y Simétrico
entre la actividad de glucosa oxidasa y la BSA.Por esta técnica
tampoco se detectaron formas de mayor o menor peso molecular.
Por otra parte la enzima eluída del gel, concentrado y recromatg
grafiada en las mismas condiciones, volvió a dar el mismoperfil
de elución (no se muestran los datos). En el insertado de la Fido
ra 19 se resúmen los datos de la filtración por gel en términos
de HEVen funcion del radio de Stokes de las proteínas marcadoras.
De acuerdo a estos datos la Ac-PDEdel hongo presentó pn radio deStokes de aproximadamente 39 ñ.
XII. 3. Cálculo del peso molecular y del coeficiente friccional
A partir de los valores obtenidos del coeficiente de sedimen
tación y del radio de Stokes para la Ac-PDE, se calculó el peso mg
lecular y el coeficiente friccional de la enzima según las ecuacig
nes indicadas en Materiales y Métodos(secciones UIII.3. y VIII.h.).
Los valores obtenidos para estos dos parámetros fueron de 70,6 H y
l,h respectivamente, indicando este último valor que se trataría de
una proteina ligeramente asimétrica.
165
Noexisten en la literatura datos de parámetros físicos de
fosfodiesterasas de eucariontes inferiores especificas para AMPc
y de alta afinidad. Sin embargopareció interesante la compara
ción de los valores hallados para los parámetros físicos de la
enzima de M.rouxii con los encontrados por Thompsony colabora
dores (236) para una Ac-PDEde riñón de perro de alta afinidad
purificada a homogeneidad. De la comparación surge que ambas en
zimas no solo son muy similares en cuanto a sus parámetros fis;
cos sino en cuanto a sus propiedades cinéticas, regulacion por
ciertos moduladoresy distribución subcelular. En la Tabla ll
se tabulan las principales caracteristicas de ambasenzimas.
De la observación de los datos tabulados surgen similitudes
notables y algunas diferencias. Los valores de los parámetros
Físicos y cinéticos son muy semejantes. Ambasenzimas son solu
bles y especificas para la hidrólisis’de AMPce insensibles a
la activación por calmodulina.Ca2+ y por bajas concentraciones
de GMPo.La diferencia más notable es el distinto comportamien
to frente a las de enzimas proteolïticas, así mientras que la
enzimade riñón es insensible a la proteólisis limitada de
Ac-PDEde Mucor es activada de 2 a 3 veces por tripsínización
controlada ver más adelante la sección XIV.
Mi
166
Caracteristicas fisico-Quimicas de la Ac-PDEqe Mucorrouxii y
de la Ac-PDE de riñón de Eerro (236).
Característica
M2111
Distribución subcelular soluble
Especificidad para hidrólisis de AMPo total
Km para AMPC (yM) 2,5
Coeficiente de sedimentaCión (SZÜ'U, L'IZ
Coeficiente o? difusión 8,9(DZÜ,U.10 cm /seg)Peso molecular 70,6
Radio de Stokes(ñ) 39
Coeficiente friccional(f/fg) 1,4Activación por calmodulina no
Activación por bajasconcentraciones de GMPc no
Activación por proteólisis si
Activación por fosforilaoión si
(a)
riñón de Eerro
soluble
altamente especifica
2,2
3,6
8,6
60,6 (a)
35
DCI
no
no
valor más probable hallado por análisis de aminoácidos
167
XIII. REGULACION DE LA ACTIVIDAD DE FÜSFÜDIESTERASA DE AMPc DE
\MUCÜR RÜUXII PUR FQEfÜRILACIÜN-DESFÜSFÜRILACIÜN
XIII. l. Activación por ATPde la Ac-PDEde una fracción enzimá
tica poco purificada
A pesar de la Falta de respuesta al ATPde la Ac-PDEde
M.rouxii parcialmente purificada (ver Tabla 9), cuando se estu
dió el efecto de este nuclefitido sobre la actividad enzimática
de un extracto poco purificada se encontró que el ATPactivaba
a la enzima. Comose vé en la Tabla 12 la actividad enzimática
aumentó por la presencia de ATPen la mezcla de incubación sien
do este aumento de actividad proporcional a la cantidad de ex
tracto presente.
Con la mayor cantidad de proteina ensayada se logró una ac
tivación de casi dos veces sobre la actividad basal.
XIII. 2. Conservación de la activación por ATP
Se investigó si el efecto activante del ATPrequería la pre
sencia constante del nucleótido durante el ensayo enzimático.
Para ello se preincubaron alicuotas convenientes del extracto
con ATP.Mgy AMPcy se hicieron controles preincubados en las
mismas condiciones pero omitiendo el ATP. Luego de la preincu
168
MActivación por ATPde la chEQg_gggiaifracción de sulfato de
¡y
amonio
yg de preparación Actividad de Ac-PDE r
enzimática (pmcles/ZÜ min)
-ATP + ATP Ü¡2 mM
100 se 82 1, 2
ZÜÜ 130 201 1,5
bÜÜ ZhÜ #22 1,8
Se utilizó un extracto enzimática de la etapa 2 de purifica
ción (Tabla 8). La actividad enzimática se midió según se indi
c6 en la sección V.h.l. de Materiales y Métodos a lÜ FM de
AMPc [3+1].
3_se definió ccmcel cociente entre la actividad en presen
cia de ATPy la actividad en su ausencia.
169
bación, ambas muestras se pasaron por una columna de Sephadex
8-25 para separar las metabolitos presentes en la preincubaciún.
Se ensayo actividad de Ac—PDEen ausencia y en presencia de ATP
en los Filtrados. Los resultados obtenidos en estos.ensayos se
muestran en la Tabla 13.
Tabla 13*
Conservación de 1a activación por ATPluego de filtración por gel
Condiciones de preincubacíón Actividad de Ac-PDE
(pmoles/20 min)
— ATP + ATP
c12Mg, AMPc, 63 113
012Mg, AMPc, ATP 120 119Í
Se preincubaron alicuotas de 10 pl de la fraccion de sulfato
de amonio (0,33 mg de proteina) en una mezcla de incubación que
contenía en un volUmenfinal de 0,1 m1: buffer Fosfato de potasio
20 mM, pH 7,5; 2-mercaptoetanol 2 mM, AMPc 10 pM y Cl Mg 10 mM.2
Una de las mezclas contenía además ATP 0,2 mM. Al cabo de 10 min
a 3000, los tubos se colocaron en un baño de hielo y se agregó a
cada uno 10 pl de EDTA0,1 M. Las mezclas se Filtraron por una
pequeña columna de Sephadex 0-25 de l ml equilibrada con buffer
fosfato de potasio 20 mM,pH 7,5; 2-mercaptoetanol 2 mM.La pro
teina se eluyó con buffer de equilibrio y se ensayo actividad de
Ac-PDEen alicuotas de 20 pl con M92+como catifin divalente en
presencia y en ausencia de ATP 0,1 mM.
170
Comopuede observarse en la Tabla el extracto enzimático pre
incubado en presencia de ATPpresentó una actividad basal de Ac—PDE
100%superior a la del control preincubado sin ATP. Ademásla enzi
ma preincubada en presencia de ATPno respondió al agregado poste
rior de este nucleótido en el ensayo enzimática, mientras que en
el extracto preincubado sin ATPla enzima fue capaz de ser activa
da casi dos veces sobre el nivel basal por el agregado de ATP.
Estos resultados indican que no es necesaria la presencia
constante de ATPpara la activación de la enzima y que una vez pro
ducida ésta, se mantiene en ausencia del activador.
XIII. 3. Dependencia con el tiempo de la activación de la Ac-PDE
por ATP.Mg y AMPc.
Se estudió como variaba la activación de la PDEpor ATP.Mgy
AMPcen función del tiempo de preincubacifin con estos metabolitos.
Para ello se preincubaron alícuotas convenientes de la fracción
enzimática de la etapa 2 de purificación distintos tiempos a 30°C
y cantidades fijas de ATP.Mgy AMPc.Los valores obtenidos se com
pararon con los de los controles preincubados en las mismas condi
ciones pero sin el agregado de ATP.. Se observó que a 30°C la ac
tivación fue máximaa los 2 minutos de preincubaciún.
Los resultados que se muestran en la Figura 20 se obtuvieron
171
3 +ATP21 = e =E: .//, rE ¿.0- /g ‘ . 1,8Q /És 1/,.¡,r. MC)
E BNC -ATP ‘.9: 5 0‘0‘0 o o 2 4 6 .8 1ogg 20 v fiempoümn)
. or 0TL) l 1 l l I
<1: 0 2 l. 6 8 10
Tiempo de preincuboción (min)Figura 20: De endencia de la activación de la Ac-PDEcon el tiempo de
Ereíncubaciñn
Se preincubaron alicuotas de AUpl de la fracción de sulfato de amonioen buffer fosfato de potasio 20 mM,pH 7,5; en un volumen final de 0,2 mlen presencia de Cl Mg 1D mM, AMPc SluM y ATP 0,1 mM(o) o en ausencia deATP(o). A los disgintos tiempos indicados sa tomaron alícuotas de 20 plde cada mezcla y se les agregó 2 pl de EDTA0,2 Mpara detener la reacción. De cada una de estas alícuotas se tomaron 5 pl y se ensayó la actividad de Ac-PDEen presencia de buffer fosfato de potasio 20 mM,pH 7,5;y con Mg como catión divalente.
En el insertado se grafican los cúcientes (r) de las actividades read;tantes de las preincubaciones con ATPsobre los valores obtenidos en ausancia de este nucleótido en Función del tiempo de preincubación.
disminuyendo la temperatura de preincubación a 21°C con el objeto
de poder observar mejor la cinética de activación. En estas con
diciones se observo que la activación alcanzó su valor máximoa
los 5 min de preincubacíón,
Paralelamente a la cinética de la activación de la Ac-PDEse
estudió la cinética de incorporación de PD“ [-32P] a proteinasendógenas del extracto,reemplazando el ATPno radioactivo por
ATPfÍ-32P] . Los resultados se ven en la Figura 21. Puede observarse que ambosprocesos: activación de la enzima y fosFori
lación de proteinas siguieron una cinética similar.
XIII. b. Efecto de la concentración de ATPsobre la activación
de la Ac-PDE
Se estudió el efecto de concentraciones variables de ATPen
la mezcla de preincubacíón sobre la activación de la Ac-PDEen
un extracto enzimática de la etapa 2 de purificación. Los resul
tados, graficados en la Figura 22 muestran que.la activación de
la enzima depende de la concentración de ATPalcanzéndose,
en las condiciones de ensayo, un máximo de activación con una
concentración de ATP 0,1 mM.
Si bien estos resultados muestran que existe una dependen
cia de la activación de la enzima con la concentración de ATP,
173
E I l I l I a)
L5: 100— 100 "0c:Oi. .‘Qg) L)< 80- -80 E AQ 8 ocv 5 Tn,
“o U CJ
.8 60- —so g E
.__ c3 ¿y8 .E 8
% ¿.0- —¿0 .5 oo E Ucv c) 0.
U 20- —2o EaOo\ 1:
0 l n 1 1 1 0 o\°
0 2 l. 6 8 10
tiempo (min)
Figura 21: Cinética de la activación de la Ao-PDEy de la Fosforilación de Eroteinas endógenas
Las condiciones de los ensayos Fueron similares a las desoriptas en
la leyenda de la Figura 20, a excepción de que para la medición de P04-32inoorporado a proteínas endógenas se reemplazó el ATPpor ATPÏL3ZP(20.106 cpm/min). A los tiempos indicados se tomaron alicuotas de lÜ pl yse procesaron como se indicó para el ensayo de Ac-QPen la sección V.5.l.
32de Materiales y Métodos. La radioactividad máximade P incorporado a
proteina fue de 20.000 cpm/10yl.
17h
Ac-PDE(pmoles/ZOmin/1pl) _<—Ac1ividod bosol - _.s 1 l
0,1 0,2
ATleM]Figura 22: Efecto de la concentración de ATPsobre la activación de
la AC-PDE
301
Se preincubaron alicuotas de 0,3 mg de proteina de la Fracción desulfato de amonio durante lÜ min a 3000 en un volumen Final de Ü,l m1
en presencia de Cleg lÜ mM,AMPc5 pM y ATP en concentraciones variables. Al cabo de este tiempo los tubos se colocaron en baño de hielo yla reacción se detuvo por el agregado de 5 pl de EDTA0,2 M. La actiqidad de Ac-PDE se ensayo en alicuotas de lÜ pl con AMPc3H lÜ pM enbuffer fosfato de potasio 20 mM,pH 7,5 y con M92+como catión divalente
175
pareció aventurado calcular algún parámetro cinético para este
nucleútido ya que su concentración en el ensayo queda indetermi
nada debido a la presencia de ATPasasen este extracto.
XIII. 5. Reguerimientos para la activación de la Ac-PDE
Dado que los experimentos de activación de la Ac-PDEreali
zados hasta el momento se hicieron en presencia de ATP.Mgy AMPc,
pareció obvio estudiar si todos estos metabolitos eran requeridos
para la activación de la enzima.
La Tabla lb muestra los resultados obtenidos cuando se compa
raron las actividades de Ac-PDEde un extracto de la etapa 3 de
purificación preincubado en presencia de ATP.Mgy AMPccon las
actividades obtenidas cuando se omitieron de a uno por vez, o to
dos ellos, de la mezcla de preincubación. Comopuede verse la pre
incubación en presencia de ATP.Mgy AMPcprodujo un aumento de la
actividad de Ac-PDEde casi dos veces respecto del control prein
cubado en ausencia de los metabolitos. La omisión de cualquiera
de ellos en la mezcla de preincubación mantuvo la actividad de la
enzima en los valores del control. No se observó activación de la
Ac-PDEcuando se reemplazó el ATPen la mezcla de preincubaciún
por un derivado€;K imido cuyo fosfato" no es hidrolizable.
176
Tabla lb
JReguerimientos para la activación de la Ac-PDE.
Condiciones de Actividad de Ac-PDE % de la actividad
preincuoación (pmoles/ZÜ min) máxima
a. Mezcla completa 82,2 lÜÜ
b. -ATP, -AMPc, -Mg‘2+ A2 51
c. -ATP ¿6,8 53,2
d. —AMPc ¿»8,6 59,1
e. ¿M923 EDTA lo mM . ¿+1,t+ 50,3
1’. -ATP+ (¿ix-imidoATP [1,2 mM Los ¿»9,6
‘ Se preincubó una alícuota de 0,2 mg de proteina de la frac
ción de DEAE-celulosa durante lÜ min a 30°C en un volumen Final
de 0,1 ml de la siguiente mezcla: buffer fosfato de potasio 20 mM,
pH 7,5; 2-mercaptoetanol 2 mM, El Mg lU mM, AMPc 5 pM, ATP 0,1 mM2
(mezcla completa). Alicuotas iguales del extracto enzimático se
preincubaron en las mismas condiciones de la mezcla completa con
las omisiones y/o adiciones indicadas en la tabla (E, a f3). Al
cabo del período de preincubación las mezclas se precipitaron con
sulfato de amonio y se procesaron como se indicó en la sección
V.h.2. de Materiales y Métodos.
Se ensayo actividad de Ac-PDEen alicuotas de 2 pl de los
precipitados resuspendídos.
177
De estos resultados se puede concluir que la activación por
ATPde la Ac-PDEde M. rouxii tiene los mismos requerimientos
que los de una fosforilación mediada por una quinasa de proteína
dependiente de AMPc.
XIII. 6. Dependencia de la activación de la Ac-PDEcon la quinasa
de proteina dependiente de AMPc
Los resultados presentados en las Tablas 13 y 1h sugieren
que la activación de la Ac-PDEde M.rouxii podria estar mediada
por fosforilación en la que intervendría una quinasa de proteína
dependiente de AMPc.Resultados obtenidos en el laboratorio ya
habían demostrado que en la fracción de sulfato de amonio (etapa
2 de la purificación) existia actividad de Ac-QP,actividad que
acompañaa la fosfodiesterasa en la cromatografía de dicha frac
ción en una columna de DEAE-celulosa (Figura 12). Coincidente
Con estos resultados son los de la Tabla 1h que muestran que en
esta etapa de la purificación la Ac-PDEpudo ser activada en pre
sencia de ATP.Mg y AMPcy sin agregado de Ac-QP exógena. Sin em
bargo cuando ambas actividades enzimáticas se separaron en gradieg
te de sacarosa debido a sus diferentes coeficientes de sedimenta
ción, la activación de la Ac-PDEse hizo dependiente del agregado
de Ac-QP. Los resultados obtenidos pueden verse en la Tabla 15.
Comopuede observarse el agregado de ATP o Ac-QP por separado no
178
Fueron capaces de elevar la actividad basal de la Ac-PDE,mien
tras gue esta actividad enzimática se duplicó por la presencia
conjunta de ATPy quinasa. MActivación de la Ac-PDEmediada por proteina guinasa dependien
te de AMPc'I
Ac-PDE Ac-QP ATP Actividad de Ac-PDE
(pg) (unidades) (0,1 mM) (pmoles/ZÜ min)
lÜ - - 98
lÜ - + lÜ3
lÜ 60 — 96
lÜ 60 + 187
2+_ como catión divalenSe ensayo actividad de Ac-PDE, con Mg
te, en alicuotas de 2 ¡d de la fracción de gradiente de sacarosa
(etapa h de la purificación) con las adiciones indicadas.
Se utilizó como Fuente de Ac-QPuna preparación proveniente
del mismogradiente.de sacarosa y cuya actividad especifica era
3.800 unidades/mg de proteina. Esta actividad está libre de qui
nasas independientes de AMPc(Moreno. 5-» comuniCBCiónpersonal)“
179
Comopuede verse en la Figura 23 la activación de la Ac-PDt
resultó dependiente de la cantidad de Ac-QPpresente en la mezcla
de incubación, alcanzandose un valor máximode activación
(2 veces) con SU unidades de quinass. La activación de la PDEfue
completamente anulada por el agregado de un exceso de inhibidor
termoestable de la quinssa. A ninguna concentración de Ac-QPuti
lizada se observó activación en ausencia de ATP.
Los resultados de la Tabla 15 y de la Figura 23 confirmaron
que la activación de la Ac-PDEde M.rouxii está mediada por la
quinasa de proteins dependiente de AMPc.
XIII. 7. Parámetros cinéticos de la Ac-PDEactivada
Se determinó si la activación de la Ac-PDEpor Fosforilación
afectaba la afinidad de la enzima por el sustrato, la velocidad de
hidrólisis del AMPco ambosparámetros a la vez. Para ello se pre
incubó una alícuota de la Fracción de DEAE-celulosa (etapa 3 de la
purificación) con ATP.Mgy AMFc, al mismo tiempo se preincubó otra
alícuota igual en las mismas condiciones pero en ausencia de ATP.
Ambasmezclas se precipitaron con una solución saturada de sulfato
de amonioy los precipitados resuspendidos y dializados, se utili
zaron para las medidas cinéticas. Los resultados obtenidos se ven
en la Figura 2h. Comopuede observarse la activación de la enzima
lBD
+ATP
1,8
1,6
‘O
1,4
1,2-ATP
147 I f\ I l I
1o 20 30 ¿.0 50 60
Unidades de Ac-OPFigura 23: Dependencia de la activación de la Ac-PDEcon la cantidad
Se ensayó actividad de Ac-PDEen alicuotas de 8 pg de la Fracciónde gradiente de sacarosa con Mg2+comocatión divalente en presencia decantidades crecientes de Ac-QP, en ausencia (o) o en presencia (o) deATP0,1 mM.El A indica la actividad de Ac-PDEensayada en presencia deATP, Ac-QP y 50 pg del inhibidor proteico de la Ac-QP.
Los valores en ordenadas representan el cociente entre la actividadde Ac-PDEensayada en presencia de ATPy Ac-QP y la actividad medida enausencia de ATP.
1/V
_ ENZ|MA ENZlMA
mc) NATIVA ACTIVADA‘- 16.Km QPP(}JM) 52,2 ¿22,5
XT V(pmoles/min/mg) ¿1950 23300
o) eE 12‘x.E
Ém 8BoE0' z.
1 1 1 l l
lBD'
-1 2 l. ‘ 6 8
1/AMPquM1’1
Figura 2h: Regresentaciún de Lineweaver-Burk de la Ac-PDE"nativa"y activada
Para la activación de la enzima se preincubó una alícuota de 0,85 mgde proteina de la fracción de DEAE-celulosa a 30°C durante 6 min. en unvolumen final de Ü,h ml con ATP.Mgy AMPccomo se indicó en la secc.U.h.2.de Mat. y Met. (enzima activada (0)). Otra alícuota igual se preincubúen las mismas condiciones excepto que se omitió el ATPde la mezcla(enzima "nativa" (0)). Las mezclas de reacción se precipitaron con unasolución saturada de sulfato de amonio y se procesaron como se indicó enla misma sección. La actividad de Ac-PDEse ensayfi en alicuotas apropiadas de los precipitados resuspendidos y dializados, a las concentracionesde AMPccuyas inversas se indican en la figura.
181
condujo a.un aumento de la U de aproximadamente 3 veces sin afec
tar en forma significativa la afinidad de la enzima por el AMPc.Es importante señalar que en el rango de concentraciones fisioló
gicas de sustrato (1-2 pM) se observa una activación apreciablede la enzima.
XIII. 8. Reversibilidad del proceso de activación de la Ac-PDE
En casi todos los casos de activación o inactivación de en
zimas por fosforilación se demostró que el proceso puede revertir
se por una reacción en la que intervienen fosfatasas de fosfopro
teínae (101).
Se estudió la reversibilidad de la activación de la Ac-PDE
por ATP.Mgy AMPcutilizando una fracción de sulfato de amonio.
Esta Fracción además de las actividades de PDEy.de quinasa de
proteína presentó actividad de fosfatasa de fosfoproteina la que
fue inhibida 90%por fosfato de potasio 20 mM(M. Seigelchifer,
comunicación personal).
La desactivación de la Ac-PDEde la fracción de sulfato de
amonio, previamente activada, se estudió luego de precipitar la
proteina con sulfato de amonio para separar el ATP.Mgy AMPc
utilizados para la activación inicial. El precipitado obtenido,
resuspendido y dializado, se sometió entonces a condiciones que
182
favorecian la desfosforilación. Se pudo observar que la desacti
vacióngde la Ac-PDEFue dependiente del tiempo al cual la enzima
estuvo sometida a dichas condiciones. En efecto, como se vé en
la Tabla 16 la actividad de Ac-PDEdisminuyó en forma notable
(50% del valor inicial) luego de un periodo de incubación de 20
min en condiciones de desfosforilsción. Esta desactivación fue
completamente bloqueada por 1a presencia de fosfato de potasio
20 mM(datos que no se muestran), resultados consistentes con
el efecto inhibitorio del fosfato sobre la actividad de fosfa
tasas de fosfoproteina.
Se pudo demostrar que la desactivación Fue un proceso rever
sible y no se debió a inactivación por desnaturalización ya que
se logró restaurar casi toda la actividad inicial cuando, luego
de 20 min de incubación en ausencia de fosfato de potasio, la
actividad de Ac-PDEse ensayó en presencia de ATP.
En un experimento control la fracción de sulfato de amonio
se sometió al mismotratamiento descripto anteriormente, excepto
que no se agregó ATPen la etapa de activación. La actividad de
Ac-PDEno decayó significativamente cuando se ensayó actividad
enzimática luego de los distintos tiempos a los que estuvo so
metida a condiciones que favorecian la desfosforilación. Además
la enzima Fue capaz de ser activada casi dos veces por el agre
gado de ATPen el ensayo enzimático.
163
Tabla 16- i
Reversibilidad de la activación por fosforílación de la Ac-PDE
Incubación Actividad de Ac-PDE
(min) (pmoles/ZÜ min)
"Nativa" Activada
- ATP + ATP — ATP + ATP
Ü 69 132 160 17Ü
10 63 11A 99 lAB
20 61 112 7Ü 130
_* Para la activación de la enzima se preincubó una alícuota deSÜlpl (2 mg de proteina) de la fracción de sulfato de amonio durante lÜ min a 30°C con ATP.Mg y AMPcen un volúmen Final de 2 m1como se indicó en la sección V.A.2. de Materiales y Métodos (enzima activada). Otra alícuota igual se preincubó en las mismascondiciones excepto que se omitió el ATPde la mezcla (enzima"nativa"). Al Final del periodo de preincubacifin las mezclas dereacción se precipitaron con sulfato de amonio comose indicó enla misma sección.
Ambosprecipitados se resuapendieron en 0,2 m1 de bufferFosfato de potasio 20 mM,pH 7,5; 2-mercaptoetanol 2 mM,y seensayo actividad de Ac-PDEen alicuotas de lÜ.ul en ausencia yen presencia de ATP 0,1 mM(U min).
El resto de las soluciones se diluyú 9 veces con buffer Bcon el objeto de disminuir la concentración de Fosfato. Las mezclas se incubaron a 30°C durante lÜ y 20 min' y al cabo de estostiempos se tomaron alicuotas de 9Dlpl en las cuales se ensayóactividad de Ac-PDEen ausencia y en presencia de ATP 0,1 mM.
En todos los ensayos de actividad enzimática se utilizó M92+como catión divalente y se agregó 50 unidades de Ac-QP.
18h
Estos resultados avalan la hipótesis de que la actividad de
Ac-PDEsde Mucor rouxíi puede ser regulada por un mecanismo de
fosforilación-desfosforilacíón y que la (s) fosfatasa (s) de fos
foproteína (s), presentes en la fracción de sulfato de amonio
son capaces de desactivar a la enzima.
XIV. ACTIVACIÜN DE LA FQÉFÜDIESTERASA DE AMPC PUR ENZIMAS
PRÜTEDLITICAS
Existen en la literatura muchosantecedentes sobre el efecto
activador de la proteólisis limitada sobre la actividad de fosfo
diesterasa de nucleótidos cíclicos, tanto soluble comoparticula
da, proveniente de distintos tejidos de mamíferos (213,21h,238,
25h,27h,399¡hÜÜ). En general este efecto activador está acompaña
do por una disminución observable del tamaño molecular.
Para estudiar el efecto de la proteólisis limitada sobre la
Ac-PDEsoluble de Mucor rouxii, se preincubaron alicuotas de un
extracto parcialmente purificado de la enzima (fracción de gradíeg
te de sacarosa) en presencia de tripsina a DDCdurante 20 min. Se
observó que la Ac-PDEfue activada de 1,5 a 3 veces por este tra
tamiento. Ademásse determinó que el efecto activador de la trip
sina fue dependiente de la concentración de la enzima proteoliti
ca y del tiempo a que la Ac-PDEestuvo sometida a dicho tratamiento.
Estos resultados se observan en la Figura 25.
.. .. . 165Figura 25: Activación de la Ac-PDEpor tripsing '
EEE _
h 152É
s3 10LU
El 5“
LJ i<
0 l l l
0 10 20 30
Tripsino(pg/ml)
Ac-PDE(pmoles/min)
l l l T
10 15 20
Tiempo (min)Se preincubaron h yg de proteína de la fracción de gradiente de
sacarosa durante 20 min a ADCen buffer A y con concentraciones crecientes de trípsina en un volumen final de 0,05 m1 (Fig. 25 A). Alícuotas iguales se preincubaron en las mismas condiciones con l‘ug detripsina durante los tiempos indicados (Figura 25 B). En todos los casos se agregó 5 pg de inhibidor de tripsina al Final del período depreincubación. La actividad de Ac-PDEse ensayo en la mezcla total completando el volumen final (0,1 m1) con los componentes del ensayo deAc-PDE.
O U1
186
XIV. 1. Relación entre la activación de la Fosfodiesterasa de
AMPcpor fosforilacifingy por proteólisis
Se quiso estudiarsi la activación de la Ac-PDEpor fosfori
lación y la activación por proteólisis limitada eran fenómenos
relacionados o independientes, es decir averiguar si la enzima
una vez activada por uno de estos mecanismos era todavia capaz
de responder al otro. Para estos experimentos se trabajó con un
extracto enzimático de la fracción de gradiente de sacarosa
(etapa h de la purificación). Los tratamientos a los que Fue so
metido el extracto y los resultados obtenidos se resumen en la
Tabla 17. En un grupo de experimentos se activo a la enzima con
ATP.Mg. AMPcy Ac-QP y posteriormente se la sometió, o no, a
tratamiento con tripsína (líneas c. y d.); en un segundo experi
mento se activo a la enzima por preincubación con tripsína y
posteriormente se ensayo a la activación por ATP.Mgy Ac-QP du
rante el ensayo enzimático (linea o). Los resultados obtenidos
muestran que tanto el tratamiento con tripsína (linea b.) como
la preincubación en condiciones fosforilantes (linea c.) lleva
ron a la Ac-PDEel mismo grado de actividad, aproximadamente
100%sobre el control. Los resultados de la tabla muestran tam
bién que una vez que la enzima fue activada por fosforilaciún
resultó insensible al tratamiento posterior con tripsína
(linea d.) y recíprocamente la enzimapretratada con tripsína
187
Tabla 17
Activación secuencial de la Ac-PDEpor Fosforilación o por‘ Ü
proteolisis limitada
Adiciones Actividad de Ac-PDE
(pmoles/ZÜ min/2 El)10 preincubación 20 preincubacion - ATP + ATPlÜ min a 300 C 20 min a AD C (0.1 mM)
a.‘ - - 150 292
b. - tripsina 320 325
c. Ac-QP, AMPc, ATP. _ — 33o
d. Ac-QP, AMPc, ATP tripsina - 305
* Se preincubaron alicuotas de 2 pl (lÜ‘pg de proteina) de lafracción de gradiente de sacarosa (etapa A de la purificación) durante 10 min a 300 C en un volumen final de 9Ü‘ul, en una mezclaque contenía buffer Fosfato de potasio 20 mM,pH 7,5; 2-mercaptog
tanol 2 mMy Cleg lÜ mMcon las adiciones indicadas en la Tabla.Las concentraciones de AMPc.ATPy Ac-QP utilizadas fueron: l pM,0,1 mMy 500 unidades/ml respectivamente. Las mezclas se sometieron a una segunda preincubacion en ausencia o en presencia de tripsina (20¡ug/ml) durante 20 min a ADC. A1 cabo de este tiempo seagrego a todos los tubos inhibidor de tripsina de clara de huevo(S‘pg) y a los tubos a. y c tripsina (20 pg/ml). Luego de las preincubaciones se ensayo actividad de Ac-PDEen la alícuota total enausencia o presencia de ATP. La reacción se comenzó por el agrega
do de AMPc [3H] lÜ pH. Los experimentos b y d suplementaron durante el ensayo de Ac-PDE con 50 unidades de Ac-QP.
no fue capaz de responder a la activación por ATP.Mgy Ac-QP du
_rante\el ensayo enzimático (linea b).
Estos resultados serían consistentes con el modelodel "inhi
bidor interno" propuesto por Haufmany Fisher (#01) para explicar
la activación de la hidroxilasa de la fenílalanina de higado de
rata por lisolecitina y quimiotripsina, modeloque también expli
ca la activación de la enzima por fosforilación (AÜZ). Según este
modelo la enzima contiene una cadena polipeptídica inhibidora, la
que sería desplazada de su sitio inhibitorio, reversiblemente por
1a acción detergente de ciertos fosfolipidos o irreversiblemente
por proteólisis limitada. La introducción de grupos fosfato en
la molécula enzimática también desplazaría reversiblemente, por
repulsión electrostática, al polipéptido inhibidor, activando de
esta manera a la enzima. Así la activación de la enzima por alguno
de estos mecanismosno seria aditiva con la activación por cual
quiera de los otros.
XIV. 2. Perfil de sedimentación en gradiente de sacarosa de la
fosfodiesterasa de AMPcactivada por fosforilación o por
tripsinízación
Los experimentos que se describen en esta sección se realiza
ron con el objeto de ver si los procesos de Fosforilación y trip
sinización producían cambios en el tamaño aparente de la enzima.
189
Para ello se preincubaron alicuotas convenientes de la prepara
ciónxenzimática (fracción de DEAE-celulosa) con ATP.Mgy AMPco
con tripsina; una tercera alícuota se sometió a Fosforilación y
posterior tripsinización. Luegode estos tratamientos se anali
zó el estado de la enzima en gradientes de sacarosa entre 5-20%
y se los comparó con el de un control preincubado sin adiciones
(enzima nativa).
La Figura 26Amuestra un perfil tipico de sedimentación de
la enzima nativa luego de centrifugación en gradiente de sacaro
sa. Solo se observó un pico de actividad cuyo coeficiente de se
dimentación resultó de h,2 5.. El tratamiento de la Ac-PDEcon
tripsina produjo una disminución del E520.LIJde h,2 S a 2,6 S(Figura 268) mientras que la enzima activada por Fosforilación
mostró el mismo valor de 520.“ que el de la enzima nativa (Figu
ra 268) . La enzima activada por fosforilación y posteriormentesometida a proteólisis mostró una disminución en su coeficiente
de sedimentación similar al de la Ac-PDEtratada unicamente con
tripsina (Figura 268). Sin embargoeste tratamiento con tripsi
na luego de la activación por fosforilación, no produjo ninguna
activación adicional de la actividad enzimática, tal comose vé
en la Tabla 17.
190
A P.A. Px Citc B P.A. Px Clitc
:5 6°“ _t)L) _. _CJJ:\ 30- —.gÉ — -18 ----..... _
15 l I I I | I l l Í l
á C DLu 60.4 _C3
0% _. _L)< _
l I 1 I l “ui-“'tï" I l I5 10 15 20 25 5 10 15 20 25
20% 5%
N° de FRACCION SACAROSA
Figura 26: Egptrifugación en gradiente de sacarosa de la Ac-PDE"nativa"y activada
Se preincubaron alicuotas delleg de proteina de la fracción de DEAEcelulosa en buffer fosfato de potasio 20 mM,pH 7,5; 2-mercaptoetanol 2 mM,en un volumenfinal de 0,2 ml; en las siguientes condiciones: A) controlpreincubado sin adiciones, B) tripsina 20 pg/ml durante 20 min a hQC, seguido por 5 pg de inhibidor de tripsina, C) ATP 0,1 mM, AMPc5 pM, Cl Mg lÜ mMdurante lÜ min a 30°C, D) las mismas condiciones que C más un periodo adicional de 20 min a ADCcon 20 pg/ml de tripsina, seguido de la adición de5 pg de inhibidor de tripsina. Al Final de los periodos de incubación, lasmezclas se centrifugaron en un gradiente lineal de sacarosa 5-20%preparado en buffer Fosfato de potasio 20 mM(sección VII. de Materiales y Métodos)La actividad de Ac-PDEse ensayo en alícuotas apropiadas. Las flechas indican la posición de las proteinas marcadores: fosfatasa alcalina (P.A.),peroxidasa (Px) y citocromo c (Bit c).
191
XU. ACTIUACIÜN DE LA FqgfÜDIESTERflgB DE AMPc LUEEQ DE CRUMATÜGRA
FIA EN COLUMNA DE AFINIDAD
Se quiso estudiar si la Ac-PDEluego de la última etapa de pg
rifícación alcanzada en este trabajo seguía siendo sensible a la
activación por ATP.Mgy quinasa de proteína. Para ello se ensayo
la actividad de Ac-PDEde la fracción de Azul 2-Agarosa en preseg
cia y en ausencia de los agentes fosforilantes y a concentraciones
variables de enzima. En todo el rango de proteína ansayada no se
pudo demostrar activación de la Ac-PDEpor fosforilación.
La falta de respuesta de la enzima a la activación por fosfo
rilación luego de ls filtración por la columnade afinidad podría
interpretarse suponiendo que:
a) La activación de la Ac-PDEpor ATP.Mgy Ac-QP ocurriría a tra
vés de la fosforilacion de un factor proteico que permanecería asg
ciado s la enzima hasta la etapa de cromatografía en Azul 2-Agaro
sa. Este factor se separaría de la actividad enzimática durante es
ta etapa de purificación y por lo tanto la enzima eluída del gel de
afinidad ya no sería sensible a la acción de los agentes fosforilag
tes. De acuerdo a esta hipótesis la separación del factor fosforila
ble en esta etapa mantendría a la Ac-PDEen "estado activado".
b) Existiría una "población" heterogénea de fosfodiesterasa de AMPc;
una parte de la población sería aíivable por fosforilación y no se
192
recuperaria luego de la cromatografía de afinidad; unicamente la
forma-de Ac-PDEno activable por fosforilación eluiria de la co-'
lumna de afinidad en las condiciones experimentales descriptas.
La baja de recuperación de la actividad enzimática obtenida de
la columnade afinidad estaria de acuerdo con esta hipótesis.
Por otra parte muyrecientemente se ha demostrado que la elución
de una columna de afinidad de una Ac-PDE de higado de cerdo re
quiere condiciones tan drásticas comoaltas concentraciones de
AMPcy temperatura (#03).
Mientras que en el primer modelo propuesto no seria la enzi
mamisma, o a1 menos la porción catalitica, la que se fosforila
ria, si lo seria en el segundo. La dilucidación final del mecanig
mo de activación por fosforilación de la Ac-PDEde Mucor rouxii
está más allá de los objetivos de esta tesis y requeriría una pu
rificación mayor de la enzima.
Merece sin embargo destacarse que cualquiera sea el mecanismo
íntimo de activación por fosforilación de la Ac-PDEen este orga
nismo, al momentoen que se postuló este posible mecanismo de re
gulación de la actividad de Ac-PDE(AGA)nunca se habia señalado
en la literatura la modulaciónde una actividad de fosfodiestera
sa de nucleótidos cílicos por fosforilación-desfosforilación y es
la primera vez que se describe la activación por proteólisis de
la enzima en un organismo eucarionte inferior.
CONCLUSIONES
193
1. Se encontraron variaciones de la actividad de Fosfodiesterasa
U o
de AMPcdurante la morfogénesis aeróbica de Mucor rouxii que,
junto con las variaciones de la actividad de adenilato cicla
sa, darían cuenta con bastante aproximación de los cambios de
los niveles intracelulares de AMPcque se producen durante ese
proceso morfogenético.
La actividad de PDEes en su mayor parte soluble y eluyó de
una columna de DEAE-celulosa a pH 6 como un solo pico de acti
vidad especifica para AMPca una concentración de acetato de
sodio de Ü,h M, bien separada de un pequeño pico de actividad
de fosFodiesterasa de GMPcque eluyó a una concentración sali
na menor (0,15 M).
Se logró una purificacion parcial de la actividad de Ac-PDE
soluble que llevó a la enzima a un estado de pureza de aproxi
madamente30%, según el criterio de electroforesis en gel de
poliacrilamida. La actividad especifica final alcanzada fue de
8.200 picomoles de AMPchidrolizado/min/mg de proteina, lo que
representó aproximadamente260 veces de purificación respecto
del extracto soluble inicial. Durante la purificación y en las
condiciones experimentales ensayadas no se encontraron Formas
múltiples de la enzima.
19A
h. La Hmaparente para el AMPcde la enzima parcialmente purifi
5.
cada, calculada con concentraciones submicromolares de sustrg
to, fue 2,5 yM y correspondería al de una enzima de alta afi
nidad por el AMPc.El valor de la constante de afinidad es
coherente con el papel fisiológico que desempeñaria la enzima
en esta especie, ya que las concentraciones de AMPcpor célu
la, en los estadios del desarrollo considerados, oscilaron
entre 1-2 pM.
La Ac-PDEpresentó un requerimiento absoluto de catión diva
lente para expresar su actividad máxima. La velocidad de hi
drólisis del ÁMPccuando se ensayo actividad enzimática en
presencia de Mn2+,fue de 2-3 veces superior a la alcanzada
con Mgz+. La afinidad de la enzima para ambos cationes fue
similar.
Se calcularon algunos parámetros hidrodinámicos y moleculares
de la Ac-PDEpor medio de ultracentrifugación en gradiente de
sacarosa y filtración molecular en gel. Los resultados indica
ron que la enzima posee un coeficiente de sedimentación de h,2 S,
7 cmz/seg, un radio deun coeficiente de difusión de 8,9.10'
Stokes de 39 Á y un peso molecular relativo de 70.600. El valor
del coeficiente friccional de la enzima, l,h, indícaria que se
trata de una proteina ligeramente asimétrica.
7.
lÜ.
ll.
195
La Ac-PDEparcialmente purificada no Fue inhibida por'las
metilxantinas ensagadas hasta una concentración de lÜ mM,ni
fue estimulada por imidazol.
El Ca2+ no activó a la enzima ni afin en presencia de un exce
so de calmodulina exfigena.
El ATPno tuvo ningún efecto sobre la enzima parcialmente pu
rificada.
La enzima de un extracto poco purificado fue capaz de ser acti
vada por ATP.Mgy AMPc,siendo la activación dependiente de la
concentración del nucleútido, del tiempo de contacto del mismo
con la enzima y de la temperatura de incubación.
La activación de la enzima se conservó cuando, una vez activa
da por ATP.Mgy AMPc,se separaron los metabolitos activantes.
Los requerimientos para la activación de la Ac-PDE,parcialmen
te purificada, fueron los mismosque los de una fosforilación
mediada por una quinasa de proteina dependiente de AMPc.
Cuando la actividad de Ac-PDEse separó de la de Ac-QP, debido
a sus diferentes coeficientes de sedimentación, la activación
de la fosfodiesterasa se hizo dependiente del agregado de qui
nasa de proteina y creciente con la cantidad de esta enzima.
La activación de la enzima pudo ser anulada por la presencia
12.
13.
1h.
15.
196
del inhibidor termoestable de la quinasa de proteins, confia
mando que la activación de la Ac-PDEestá mediada por una
quinasa de proteina dependiente de AMPc.
La activación de la Ac-PDEpor fosforilación condujo a un
aumento de 3 veces en la velocidad máximade hidrólisis del
AMPcsin producir cambios apreciables en la afinidad de la
enzima para este nucleótido.
La posibilidad de que la activación de la Ac-PDEpor fosfo
rilación pueda ocurrir in vivo está basada en los siguientes
hechos experimentales: a) la Ac-PDEde extractos crudos Fue
activada por incubación con ATP.Mgy AMPcsin agregado de Ac-QP
y b) la activación de la enzima por fosforilación se observó
in vitro a concentraciones fisiológicas de AMPc(1-2 pM).
Se encontró que la activación de la Ac-PDEpudo ser revertida
sometiendo a la enzima a condiciones desfosforilantes. De es
te modo se pudo demostrar que la actividad de la Ac-PDEestá
moduladapor un mecanismoreversible de fosforilación-desfos
forilación.
La Ac-PDEpudo ser activada por proteólisis limitada. Mientras
que la activación de la enzima por este mecanismo estuvo acom
pañada por una disminución en el coeficiente de sedimentación
16.
17.
197
de la enzima, la Ac-PDEactivada por fosforilación no presen
té cambios aparentes en el tamañomolecular.
Se demostro que las activaciones por Fosforilaciún y por pro
teólisis no son aditivas. Este hecho indicaria que existe un
sitio en la molécUla de le Ac-PDEque al Fosforilarse o sepa
rarse por protefilisis permite que la enzima exprese su activi
dad máxima.
En base a los resultados del presente trabajo se propone un
posible mecanismoFisiológico de la regulación de los niveles
de AMPcen M.rouxii: una elevación de los niveles intracelulg
res de AMPcconducirïa a la activación de la quinasa de prote;
na dependiente de este nucleótido; la subunidad catalítica li
bre, en presencia de ATP.Mg,fosforilería a la fosfodiesterssa
de AMPco a un factor íntimamente asociado e elle, llevándola
de una forma menos activa e una forma activada, la cual acele
reria la hidrólisis del AMPc,regulando de esta manera el AMPc
sus propios niveles intraceluleres. (Éste mecanismose esquema
tiza en la Figura 27).
198
MECANISMO PROPUESTO
R2C2 #RzAMPC+2COUINASA DE SUBUNIDAD CATALITICA
PROTEINA INACTIVA AMPC ACTIVA
ATP. Mg2+/
<—-—PDE———, L> PDENPP)
{'VACTIVADA5' AMP
Figura 27: Mecanismode activación de la Ac-PDEpor fosfurilacíón
199
NÜMENCLATURA DE LAS ENZIMEÉ (ADS)
NOMBRE
Adenilato cíclasa
FDsFatasa alcalina
Fosfatasa deFosfnpruteína
Fosfndiesterasa deGMPcíclico
Fusfodiesterasa denucleótidos cíclicos
Glucosa oxídasa
Peroxidasa
Quinasa de proteína
Tripsina
NUMERO E.C.
l‘U60101.
3.1.3.1.
3.1.3.16
3.1.h.35
l.l.3.h.
1.11.1.7.
2.7.1.37
3.“.210h.
NOMBRE SISTEMATICÜ
ATPpírufosfatu-ligasa(cíclanta)
Manaester-ortofusfórico Fosfohidralasa
Fosfoprnteïna Fosfuhi—drolasa
3':5'-GMP-cilíco5'-nucleótíduhídrulasa
3'25': nucleótidn-cíclícn 5'-nucleótid0hidrolasa
P-D.glucosa:nxïgenol-óxidoreductasa
Dador: peróxido de hidrógenooxidnreductasa
ATP:proteína fusfutransFerasa
V WLicenciad\Miguel Angel GALVAGND
Dire tor de Tesis:
Prnfgïgra DoctoraMaría usana Di Bernardode Passeron
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