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Semina: Cincias Agrrias

ISSN: 1676-546X

semina.agrarias@uel.br

Universidade Estadual de Londrina

Brasil

Martins Oliveira, Antonio; Hernan C. Gmez, Raul Jorge

Otimizao da extrao de protenas da levedura Saccharomyces cerevisiae

Semina: Cincias Agrrias, vol. 26, nm. 4, octubre-diciembre, 2005, pp. 521-534

Universidade Estadual de Londrina

Londrina, Brasil

Disponvel em: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=445744078009

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521Semina: Cincias Agrrias, Londrina, v. 26, n. 4, p. 521-534, out./dez. 2005

Determinao das condies de extrao de protenas da levedura Saccharomyces cerevisiae

Recebido para publicao 18/02/05 Aprovado em 08/07/05

1 Professor do Curso de Qumica Industrial do Instituto Municipal de Ensino Superior de Assis Fema/Imesa - Assis SP. E-mail:quimica@femanet.com.br

2 Professor Orientador do Departamento de Tecnologia de Alimentos e Medicamentos, Centro de Cincias Agrrias/CCA -Universidade Estadual de Londrina. Caixa Postal 6001, CEP 86051-970 Londrina. PR. E-mail: rcastrog@yahoo.com

* Autor para correspondncia.

Otimizao da extrao de protenas da leveduraSaccharomyces cerevisiae

Optimization of protein extraction from the yeastSaccharomyces cerevisiae

Antonio Martins Oliveira1; Raul Jorge Hernan C. Gmez2*

Resumo

Este trabalho objetivou determinar os melhores nveis de temperatura, pH e concentrao de cloreto desdio para a extrao de protenas de clulas de levedura pelo processo de autlise. O extrato celular foiobtido a partir da levedura comercial prensada Saccharomyces cerevisiae e para anlise estatstica edefinio dos nveis das variveis temperatura (32,0 a 52,0C), pH (1,32 a 7,00) e NaCl (2,0 a 75,0%)utilizou-se a metodologia da Anlise de Superfcie de Resposta. Os resultados obtidos por meio destametodologia mostraram como melhores condies: temperaturas entre 49,0 e 51,0C combinadas comvalores de pH entre 3,8 e 5,0 e concentraes de cloreto de sdio entre 10,0 e 12,0% (p/v), entretanto,concentraes de NaCl superiores a 12,0% no se mostraram favorveis.Palavras-chave: Levedura, extrao de protenas, autlise

Abstract

This work aimed to determine the optimum temperature, pH and sodium chloride sodium concentrationfor protein extraction of yeast cells during autolysis process. The cellular extract was obtained usingcommercial compressed bakers yeast Saccharomyces cerevisiae and for statistical analysis and definitionof the variation levels of temperature (32,0 to 52,0C), pH (1,32 to 7,00) and NaCl (2,0 to 75%) theResponse Surface Analysis Methodology was used. The result obtained showed that the best extractionconditions were: temperature between 49,0 and 51,0C combined with pH values between 3,8 and 5,0 andsodium chloride concentration between 10,0 and 12,0% (w/v), however, sodium chloride concentrationhigher than 12% was not recommended.Key words: Yeast, extraction of proteins, autolysis

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Oliveira, A. M.; Gmez, R. J. H. C.

Introduo

A utilizao de derivados de microrganismosunicelulares, para gerao de produtos de interessecomercial, tem recebido considervel ateno porparte da indstria alimentcia. As protenas delevedura, devido ao seu elevado valor nutricional epropriedades fsico-qumicas desejveis, seapresentam como uma alternativa tecnolgicafavorvel para aplicao em diversas formulaesde alimentos (KINSELLA, 1987 apud SGARBIERIet al., 1999).

As indstrias cervejeiras e sucro-alcooleiras comexcedentes de produo de leveduras, tem interesse,e destacado a necessidade de diversificao de seusprodutos. O aproveitamento de biomassa por meiode seu fracionamento para a produo de derivadoscom propriedades diferenciadas, poder abrir umleque de aplicaes e agregar valor aos produtos,tornando mais rentveis esses setores agroindustriaise a criao de novas alternativas para indstriaalimentcia (ASSIS, 1996; SGARBIERI et al., 1999).

Dentre os processos conhecidos para extraode protenas de microrganismos, a autlise tem semostrado como sendo uma alternativa decaractersticas simples e com amplas possibilidadesque oferece alm do uso de aceleradores baratoscomo cloreto de sdio, a utilizao de concentraode levedura em torno de 15,0 a 30,0% por 24 a 36horas em temperaturas variando entre 30,0 a 70,0C.A adio de solventes orgnicos como toluol eclorofrmio, favorece a autlise e previne adeteriorao por microrganismos, entretanto, taissubstncias no so aprovadas como aditivos paraalimentos processados e poder necessitar ainda deum tempo elevado de extrao (SUGIMOTO;YOKOTSUKA; TAKEUCHI, 1973; REED;NAGODAWITHANA, 1991).

A literatura pouco informa sobre os melhoresnveis de pH, temperatura e concentrao de cloretode sdio para um eficiente processo de autlise deleveduras, entretanto, Feuillat e Charpentier (1982),demonstraram que em uma soluo tampo pH 5, a

liberao dos componentes intracelulares maisrpida numa faixa de temperatura compreendidaentre 44,0 e 55,0C em relao a 36,0C. Por outrolado, verificou-se tambm que, aps aquecimento a55,0C durante 4 horas, a concentrao deaminocidos na suspenso celular no aumenta,entretanto, temperatura de 36,0C a autlisecontinua por 48 horas ou at mais e as concentraesde nitrognio obtidas podero ser to altas quanto quelasobtidas a 44,0C. Sugimoto, Yokotsuka e Takeuchi(1973) e Jimenez, Badia e Diaz (1993), mencionamprocessos realizados em pH 4,0 e Rvillion e Pibernat(1996), afirmam que uma alta atividade autoltica poderocorrer em pH em torno de 3,0 a 5,0.

Visando estudar tais condies, este trabalho tevepor objetivo avaliar o efeito e as interaes entre asvariveis temperatura, pH e concentrao de cloretode sdio no processo de rompimento e liberao doscomponentes intracelulares por autlise,especialmente as protenas intracelulares.

Material e Mtodos

Microrganismo

Levedura comercial prensada, Saccharomycescerevisiae mida, com viabilidade celular inicial emtorno de 98%.

Viabilidade Celular

Mtodo da colorao de clulas mortas comvermelho de eritrosina e leitura no microscpio pticocomum segundo Bonneu. (1991).

Protena Bruta

Sistema automatizado, Leco FP-528, certificadopela Association of Official Agricultural Chemists,(1990) com converso do teor de nitrognio total emprotena pelo fator 5,8 segundo Sgarbieri et al. (1999),para compensao dos cidos nuclicos presentesnas clulas.

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Determinao das condies de extrao de protenas da levedura Saccharomyces cerevisiae

Protenas Solveis no Extrato Lquido autolisado

Aplicou-se o mtodo de Lowry et al. (1951) noextrato lquido obtido aps a eliminao dos resduoscelulares por centrifugao a 18.000 G por 15 minutosa 10C.

Porcentagem de Solubilizao Protica ()

Para a determinao da eficincia da extraoou porcentagem de solubilizao protica (),determinou-se inicialmente a concentrao deprotenas, em mg/mL, na suspenso de clulas ntegrasantes da autlise () cujo clculo procedeu-se com ouso da seguinte expresso:

% protena bruta em base seca de biomassa xmassa de levedura seca inicial (mg)

=100 x volume da suspenso de leveduras (mL)

Em seguida, quantificou-se pelo mtodo de Lowry,a concentrao de protenas solveis (mg/mL)presente no extrato lquido obtido da centrifugaoaps a autlise () e calculou-se ento a % deextrao protica em relao a quantidade mximade protena presente em cada mL de suspenso declulas ntegras pela seguinte expresso:

= x 100

= Porcentagem de solubilizao protica (oueficincia de extrao), = Concentrao de protena solvel (mg/mL)presente no extrato lquido (aps autlise), = Concentrao de protena total (mg/mL) nasuspenso de clulas ntegras (antes da autlise).

Fluxograma da Extrao Protica

Suspenso de clulas ntegras ()

(biomassa lavada)

Autlise(Temperatura constante)

Centrifugao

(18.000 G /15 minutos/10C)

_________________________

Parede celular Sobrenadante ()

(Lavada)

Definio dos Ensaios e Nveis das Variveis deTrabalho

O trabalho foi desenvolvido em trs ensaios e osresultados avaliados pela metodologia de superfciede resposta basearam-se na concentrao deprotena solvel (mg/mL) presente no extrato lquidoaps autlise () e na porcentagem de solubilizaoprotica ().

Ensaio ()

Definio dos Nveis das Variveis Independentes

Utilizou-se o delineamento fatorial incompleto compontos eqidistantes para trs (3) variveis, em trs(3) nveis de variao (33). O planejamentoexperimental, foi constitudo por um grupo de ensaioscom doze experimentos e outro com trs repetiesno ponto central, totalizando 15 ensaios. Osparmetros estudados e seus nveis de variao sodemonstrados na Tabela 1.

Preparo das Suspenses e Autlise

As suspenses celulares, preparadas em frascosde Erlenmeyer de 500 mL, corresponderam a um

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