cÁc phƯƠng phÁp chẨn ĐoÁn bỆnh nhiỄm vi sinh vẬt

PGS. TS. Cao Minh Nga

BM Vi sinh - Khoa Y - ÑH Y Döôïc TP. HCM

IV

Môû ñaàu I

II

III

Phöông phaùp Vi sinh hoïc

Phöông phaùp Mieãn dòch hoïc

Phöông phaùp Sinh hoïc phaân töû

V Keát luaän

I. Môû ñaàu

Vi sinh vật (VSV): - gây nhiều bệnh nhiễm nguy hiểm.

- có thể gây dịch, đại dịch.

Các bệnh nhiễm VSV:

- thường có triệu chứng lâm sàng điển hình

VD: bệnh tả, sốt xuất huyết, …

- một số khác: không có triệu chứng điển hình

VD: viêm gan virus A, B, C, D, E và G, …

Xét nghiệm chẩn đoán () đóng vai trò quan trọng:

(+) từng bệnh lý cụ thể

là tiêu chuẩn vàng: nhiều bệnh nhiễm VSV

I. Môû ñaàu (tt)

Các phương pháp (pp) bệnh nhiễm VSV chính:

- pp vi sinh học: soi, nhuộm, cấy.

- pp miễn dịch học: phản ứng kháng nguyên – kháng thể

- pp sinh học phân tử: phát hiện gen đặc hiệu

Các pp (sinh hóa, huyết học, giải phẫu bệnh, … )

Cần chọn lựa pp thích hợp tùy loại bệnh lý, giai đoạn bệnh

, theo dõi diễn tiến bệnh nhiễm VSV.

II. Phöông phaùp Vi sinh hoïc

Quan sát trực tiếp:

1. Soi tươi

2. Nhuộm

Nuôi cấy vi vi khuẩn (VK):

1. Nuôi cấy - Phân lập VK

2. Kháng sinh đồ

Nuôi cấy virus

1. Định danh

2. Định typ huyết thanh, …

II. PP Vi sinh hoïc (tt) Quan sát trực tiếp:

1. Soi tươi: phát hiện VSV còn sống, di động

VD: VK tả, VK giang mai, Leptospira.

2. Nhuộm: nhiều pp

- nhuộm Gram: quan sát hình thể & cách bắt màu Gram của VK

II. PP Vi sinh hoïc (tt)

Quan sát trực tiếp:

1. Soi tươi

2. Nhuộm: - nhuộm Gram

- Nhuộm kháng acid - Nhuộm bạc:

M. tuberculosis trên phết nhuộm Legionella_Silver_Stain


Quan sát trực tiếp

Nuôi cấy vi khuẩn:

1. Nuôi cấy phân lập VK: trên các môi trường thích hợp

Môi trường BA - S. aureus Môi trường EMB - E. coli




1. Phân lập VK

2. Kháng sinh đồ:

2.1. Phương pháp khuếch tán

trên đĩa thạch (Kirby Bauer)

2.2. Xác định MIC bằng phương pháp pha loãng

4 2 1 0,5 0,25 0,12 0

104 cfu

mg/ml

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) = 0,5mg/ml

(Minimum inhibitory concentration - MIC)



Nuôi cấy vi khuẩn

Nuôi cấy virus:

Định danh bằng kỹ thuật Miễn dịch hoặc Sinh học phân tử

II. Phöông phaùp Mieãn dòch hoïc

Khái niệm

Phân loại

Các phản ứng miễn dịch (MD) thường dùng

trong Vi sinh lâm sàng: 1. Phản ứng ngưng kết

2. Phản ứng MD đánh dấu:

- MD huỳnh quang

- ELISA

Nhận định kết quả

II. PP Mieãn dòch hoïc (tt)

Khái niệm:

1. ĐN: Là phản ứng kháng nguyên - kháng thể (KN - KT)

2. Mục đích: Xác định hoặc / và

- chuẩn độ một KN

- định lượng hiệu giá một KT

- đo lường một phức hợp KN-KT

- đo lường các nhân tố tham gia / hệ thống MD.

VD: kiểm tra hoạt tính của bổ thể.

Khaùng nguyeân

• Điểm quyết định KN (epitope):

phần trên phân tử KN có khả

năng liên kết đặc hiệu vào phần

liên kết với KN trên phân tử KT

Animation/Animation Quiz 5 - Antigenic Determinants (Epitopes)2.swf

Tương tác KN - KT

Hiện tượng vùng


Phân loại:

A. Phản ứng dựa trên sự tạo thành “hạt”:

1. Kết tủa (precipitation reaction): KN hòa tan.

2. Ngưng kết (agglutination reaction): KN hữu hình

B. Phản ứng dựa trên hoạt động sinh học của KT:

1. Kết hợp bổ thể (complement binding reaction)

2. Trung hòa (neutralization reaction)

C. Phản ứng MD đánh dấu:

1. MD huỳnh quang (immunofluorescence reaction)

2. MD men (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA)

3. MD phóng xạ (radio immmuno assay - RIA).

Các phản ứng MD có độ nhạy khác nhau

Loại phản ứng MD Ngưỡng phát hiện (mg/ml)

Kết tủa / môi trường lỏng

Kết tủa / thạch:

- khuếch tán đơn (Mancini)

- khuếch tán kép (Ouchterlony)

- MD điện di (Immuno electrophoresis )

20

10

3

50

Ngưng kết: - trực tiếp

- gián tiếp

- ngưng kết vi khuẩn

0,5

0,001

0,001

Cố định bổ thể (CF) 0,1

Miễn dịch huỳnh quang (IF) 0,1

Định lượng MD phóng xạ (RIA) 0,0001

Định lượng MD enzym (EIA) 0,0001


Các phản ứng MD thường dùng / Vi sinh lâm sàng:

A. Phản ứng ngưng kết (agglutination reaction):

- Ngưng kết: nhóm máu, nhóm VKĐR, …

- Latex, ngăn ngưng kết (HI)

B. Phản ứng MD đánh dấu:

- MDHQ (IF),

- ELISA


A. Phản ứng ngưng kết (agglutination reaction)

Tạo mạng

Phản ứng NK hồng cầu gián tiếp

(thụ động)

Ngưng kết hồng cầu thụ động

KN hoặc hapten KT / mẫu

gắn trên giá khoác

Phản ứng NK hồng cầu gián tiếp

(thụ động) - 2

Ngưng kết hồng cầu thụ động đảo ngược

KT / giá khoác KN / mẫu

Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu

(Hemagglutination Inhibition - HI)


B. Phản ứng MD đánh dấu:

1. MD huỳnh quang (immunofluorescence - IF)

VD: RSV, thể négri / bệnh dại, Chlamydiae, …

* Đếm tế bào dòng chảy (flow cytometry):

đếm & phân loại TB.

2. MD men (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA).

VD: HBV, HCV, HIV, Rubella, …

1. PƯ MD huyønh quang: nguyeân lyù

Định týp virus DEN bằng IF với KT đơn dòng

(thuốc nhuộm fluorescein)

Virus sởi tạo hợp bào từ các tế bào Vero bị nhiễm.

Chất huỳnh quang gắn vào KT kháng virus sởi đã biết

(thuốc nhuộm rhodamin)

2. Phản ứng ELISA

(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay )

* Muïc ñích:

ñònh löôïng KN hoaëc KT hoøa tan / dòch sinh hoïc.

* Nguyeân lyù cô baûn:

KT/pha raén + KN/maãu + KTE

+ Subtrate

KN/pha raén + KT/maãu + Khaùng KT

E + Subtrate

maøu: So maøu (maét / maùy ño OD)

* Kyõ thuaät thöïc hieän: - "Caïnh tranh”

- "Khoâng caïnh tranh"

ỏ

ỏ

E E E E E H2SO4

E E E E E

E E E E E TMB

a.MD Cạnh tranh ELISA:

Phản ứng màu tỉ lệ nghịch với nồng độ kháng thể

b. ELISA theo phương pháp “sandwich”

c. ELISA “Tóm bắt”: MAC-ELISA

(IgM antibody capture-ELISA)

Máy đo quang

Máy ủ Máy rửa

Kháng IgM

IgM /maãu

KN ñaõ bieát

Cộng hợp

Cơ chất

Đo Mật độ quang (OD)


Nhận định kết quả:

1. Độ nhạy (ngưỡng phát hiện hàm lượng KN & KT):

Mỗi phản ứng có ngưỡng phát hiện nhau

nên định lượng.

2. Hiệu giá ranh giới: ranh giới giữa bình thường & bệnh lý.

VD: hiệu giá ranh giới của ASLO là 1:200

(200 đơn vị/ml huyết thanh) (+) khi 400 đ.v/ml.


Nhận định kết quả (tt):

3. Kết quả (+) tính giả:

thường dùng nhiều phản ứng cùng lúc.

4. Đáp ứng KT: có thay đổi về lớp Ig

- IgM: xuất hiện trước

- IgG: xuất hiện sau, thay thế nhanh chóng cho IgM.

5. Tiến triển của hiệu giá KT trong HTh BN:

“huyết thanh kép”

Schematic diagram representing the course of

acute rubella infection from the time of initiation

of the infection by droplet spray

III. Phöông phaùp Sinh hoïc phaân töû

(khuếch đại đoạn gen đặc hiệu)

Mở đầu:

- 1985: Kary Mullis California, USA

- 1993: giải Nobel Hoùa học

Ứng dụng kỹ thuật SHPT

trong chẩn đoán bệnh nhiễm VSV

III. PP Sinh hoïc phaân töû (tt)

Mở đầu: Các kỹ thuật SHPT thông dụng:

1. PCR (Polymerase Chain Reaction)

* RT-PCR (Reverse Transcriptation-PCR)

* Real-time PCR

* Multiplex-PCR

* Nested PCR

2. Lai phân tử (Dot-Blot)

3. Giải trình tự chuỗi

(Sequencing)

4. RFLP


Mở đầu (tt):

Ứng dụng kỹ thuật SHPT:

1. Chẩn đóan & nghiên cứu vi sinh học (VSH)

2. Chẩn đóan & nghiên cứu di truyền học

3. Nghiên cứu & ứng dụng công nghệ sinh học

4. Giải trình tự bộ gen người & động vật


Mở đầu

Ứng dụng trong chẩn đoán () bệnh nhiễm VSV:

1. Phát hiện & định lượng VSV gây bệnh

2. Phát hiện gen sinh độc tố của VSV gây bệnh

3. Xác định gen kháng thuốc của VSV gây bệnh

4. Xác định kiểu gen của VSV gây bệnh

5. Xác định kiểu gen của ký chủ


Ứng dụng trong bệnh nhiễm VSV (tt):

1.1. Phát hiện VSV gây bệnh

Xác định tác nhân gây bệnh mới

VD: HCV (1989), HGV (1995), virus SARS (2003), ….

VSV không thể hoặc khó nuôi cấy thường qui

virus: HBV, HCV, HIV, HPV, …

VK: Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, …



1.1. Phát hiện VSV gây bệnh (tt)

VSV cho KQ chậm / nuôi cấy: M. tuberculosis

VSV khó nuôi cấy vì có rất ít / BP, đã KS

- Lao thất bại nuôi cấy,

- Viêm màng não mủ, lậu đã KS

Phát hiện sản phẩm PCR/ lao

• Điện di trên gel agarose (1,5%)

• Nhuộm bằng ethidium bromide (10mg%)

• Đo bằng thang DNA (DNA ladder)

• Sản phẩm PCR có kích thước 450 bp

và/ hoặc 225 bp

Giếng T: Thang chuẩn 100bp.

Giếng 1-8: Mẫu (+) MTB.

Giếng 9-10: Mẫu (-) MTB.

1 2 3 4 5 T 6 7 8 9 10



1.2. Định lượng VSV gây bệnh

Đánh giá tình trạng bệnh lý.

Vd: HCV, HBV, ….

Theo dõi điều trị

Vd: HCV, HBV, HIV, ….

Phát hiện sớm sự kháng thuốc trong điều trị

Vd: HBV, HIV, ….

Real-Time PCR

Laø 1 kyõ thuaät PCR söû duïng chaát huyønh quang ñeå

phaùt hieän & ñònh löôïng

1 hoaëc nhieàu trình töï DNA ñích trong phaûn öùng PCR



2. Phát hiện gen sinh độc tố của VSV gây bệnh

Gen mã hóa cho độc tố LT của E. coli

Gen mã hóa cho độc tố SEA, SEB của S. aureus

(pp Multiplex PCR)

Gen mã hóa cho độc tố CT của V. cholerae

…



3. Xác định kiểu gen (genotype) của VSV gây bệnh

Định typ dựa trên trình tự nucleic acid:

Sự khác biệt >10% : loại (type) mới

2 – 10%: thứ type (subtype)

< 2% : biến thể (variant)

VD:

- HCV có 6 genotyp (1-6),

- HPV có hơn 100 genotype, …

* Real-time RT-PCR

xác định Genotype HCV

Đọc KQ:

Genotype HCV 1

Mẫu

Chứng âm

Nếu mẫu chỉ dương

tính (có chu kỳ

ngưỡng vượt qua

Threshold Position)

với probe 1

Reverse Dot-Blot xaùc ñònh genotype HPV

• Nguyeân lyù:

- PCR phaùt hieän HPV-DNA: duøng caëp primer (181 bp) gen

L1 / HPV genome (trình töï ñích)

- Lai phaân töû: saûn phaåm PCR ñaùnh daáu + caùc maãu doø ñaëc

hieäu cho 24 typ HPV ñaõ coá ñònh saün / maøng lai nylon

+ 8 typ Low-risk : 6, 11, 42, 43, 61, 70, 71 & 81.

+ 16 typ High-risk: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,

52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 82.

- Phaûn öùng taïo maøu: khi (+) tính

Nguyên tắc phương pháp lai Reverse Dot blot

(Lai phân tử)

Reverse Dot-Blot xaùc ñònh genotype HPV

• Ñoïc keát quaû treân maøng lai:

Töø sô ñoà caùc typ treân maøng lai trong hoäp RDB ñaõ bieát

=> Ñoïc keát quaû: ñònh genotype HPV

Ví duï:

Chứng +: Dương tính.

Mẫu đồng nhiễm type 6, 11, 81, 16, 18, 33, 58, 66, 68.



4. Xác định gen kháng thuốc của VSV gây bệnh

Lao: PCR phát hiện đột biến (ĐB)

- kháng rifamicin / gen rpoB

- kháng INH do thiếu gen catalase (gen Kat G)

Staphylococcus aureus:

Multiplex PCR phát hiện gen kháng methicillin

Streptococcus pneumoniae: pp PCR-SSCP

khảo sát đột biến kháng penicillin / gene pbp 2X



4. Xác định gen kháng thuốc của VSV gây bệnh (tt)

HBV: phát hiện ĐB kháng Lamivudin, kháng Adefovir, …

HIV: phát hiện các ĐB kháng thuốc khác nhau.

…

pp: Real-Time PCR, PCR-RFLP, Sequencing



5. Xác định kiểu gen của ký chủ

VD: Đối với bệnh nhân viêm gan C phát hiện điểm đa

hình đơn nucleotide (SNP – Single Nucleotide Polymorphism)

nằm gần gen IL28B trên nhiễm sắc thể 19 của người.

KQ: - Kiểu gen đáp ứng thuốc tốt: đồng hợp tử

- Kiểu gen đáp ứng thuốc kém: dị hợp tử

V. Keát luaän

Có nhiều pp chẩn đoán xác định bệnh nhiễm VSV.

Cần chọn lựa pp chẩn đoán phù hợp với:

- tình trạng bệnh lý

- mục đích chẩn đoán

- điều kiện trang thiết bị, tay nghề của nhân viên

- tình hình và nhu cầu thực tiễn

Nâng cao hiệu quả: chẩn đoán & điều trị bệnh,

kiểm soát dịch bệnh.

cÁc phƯƠng phÁp chẨn ĐoÁn bỆnh nhiỄm vi sinh vẬt

Health & Medicine