BIOFARMACIA

“PROTOCOLO DE UN MEDICAMENTOBUPRENORFINA”

PRESENTA: SANDRA CASTILLO BRAVOSANDOVAL ANGUIANO PAULINA

REYES VAZQUEZ ALEJANDRA

La buprenorfina es un medicamento aprobado para el tratamiento de la dependencia de opiáceos

Propiedades fisicoquímicas Soluble en agua Peso molecular : 419 uma Unión a proteínas: 96% Metabolismo: hepático

FARMACOCINETICA. Tras la inyección intramuscular, la buprenorfina

alcanza rápidamente la concentración plasmática máxima. La absorción también se produce a través de la mucosa bucal tras la administración sublingual, y la concentración plasmática máxima se alcanza al cabo de 90 min.

La buprenorfina se une aproximadamente en un 96% a las proteínas plasmáticas.

La semivida de eliminación plasmática oscila entre 1,2 y 7,2 h; no existe correlación entre las concentraciones plasmáticas y la actividad analgésica.

ELIMINACIÓN. Una parte se metaboliza en el hígado a N-

desalquilbuprenorfina (norbuprenorfina) y a metabolitos conjugados, pero la buprenorfina se excreta predominantemente inalterada por las heces; hay indicios de recirculación enterohepática. La semivida de eliminación terminal es de 20 a 25 h. Los metabolitos se excretan por la orina, pero con muy poca cantidad de fármaco inalterado.

CONTROL DE CALIDAD. MGA 0351. El espectro de IR de una dispersión de

la muestra en bromuro de potasio corresponde con el obtenido con una preparación de similar de la SRef de clorhidrato de buprenorfina.

MGA 0161.- Una solución (1 en 100) de la muestra da reacción positiva a las pruebas de identidad para cloruros.

pH MGA 0701.- Entre 4.0 y 6.0. Determinar en una solución que contenga 10 mg/mL de la muestra.

RESIDUO DE LA IGNICIÓN MGA 0751.- No más del 0.1%

VALORACIÓN MGA 0991.-Titulación no acuosa Disolver 0.8 g de clorhidrato de buprenorfina en 50 mL de ácido ácetico glacial , adicionar 10 mL de SR de acetato mercúrico y dos gotas de SI de cristal violeta , titular con una SV de ácido Perclórico 0.1 N en ácido ácetico glacial hasta el vire a color verde .

Realizar la determinación para el blanco y corregir en caso necesario. Cada mililitro de SV de ácido perclórico 0.1 N en ácido ácetico glacial equivale a 50.41 mg de clorhidrato de buprenorfina.

HPLC-MASAS PLASMA

ESTÁNDAR PRIMARIO: d4 buprenorfina DISOLVENTE: METANOL

CONDICIONES. Concentraciones para la curva de calibración: 5,10,20,100,500,800,1200,2000,2500 ng/mL. Disueltos en metanol. CARACTERISTICAS DEL EQUIPO. HPLC acoplado a masas.- MOD. Agilent Serie 1100

con bomba binaria y muestreador Fase móvil 20% acetonitrilo en 20 mm de acetato

de amonio Flujo de 1mL por minuto. Volumen de Inyección 10 µL. Columna C18.

BIODISPONIBILIDADMETODO

RESULTADOSCmax y ABC para el intervalo de 6 horas fueron más altos para la solución y la más baja de buprenorfina en monoterapia tabletas, los valores para las tabletas de combinación son más similares a los de la solución.

Voluntarios para pacientes externos No.

10

Administracion diaria

Dosis: 8 mg

Toma de muestras de

sangre 7 y 14 dia

En un estudio de 10 h de duración, la concentración plasmática máxima obtenida después de la administración de 400 a 800 µg por vía sublingual se alcanzó aproximadamente a los 200 min (intervalo, 90-360 min) y aún se detectó buprenorfina en plasma al final del estudio.

BIOEQUIVALENCIA

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

-10

0

10

20

30

40

50

60

f(x) = 1.37542718446602 x − 9.77339805825243R² = 0.999163883200737f(x) = 1.23378640776699 x − 8.72330097087379R² = 0.996398470852639

f(x) = 1.00079611650485 x − 7.6595145631068R² = 0.993451120139922

PERFIL DE DISOLUCIÓNBUPRE-MORFINA

Linear (BUPRE-MORFINA)

BUPRENORFINA + NALOX-ONA

Linear (BUPRENORFINA + NALOX-ONA)

BUPRENORFINA EN SOLN.

Tiempo (min)

% Disuelto de buprenorfina

CV: 16.5%F2 =65 %

Criterio NOM: ≤20 %F2 =50 %

PARAMETROS FARMACOCINETICOS Los parámetros farmacocinéticos se analizaron

mediante análisis de varianza; bioequivalencia fue evaluado por el Schuirmann dos caras de prueba. El 3 - la exposición y 5 minutos sublingual cada permitido 29 + / - 10% de biodisponibilidad (área bajo la curva concentración-tiempo unextrapolated) y fueron bioequivalentes. La buprenorfina recuperadas de la saliva después de 2 -, 4 -, y fue de 10 minutos la exposición, en promedio, 52% a 55% de la dosis. PH de saliva se correlaciona con la recuperación de disminución de la saliva.

FARMACOCINETICA Cpm = 90-120 minutos 3,29 y 1,9 ng/ml, respectivamente. T1/2= 1.2-7.2 hrs.

DESARROLLO DE UN FLUROINMUNOENSAYO PARA LA DETECCIÓN DE BUPRENORFINA EN ORINA

El Desarrollo de un fluoroinmunoensayo para la detección de buprenorfina en muestras de orina se lleva a cabo con la fluoresceina norbuprenorfina y con la pseudobuprenorfina , el dímero de la buprenorfina se sintetizo como moléculas traza. Los anticuerpos se prepararon acoplando los dos derivados del acido 2-diazobenzoico derivado de la buprenorfina con albumina de suero bovino usando el método de la carboiimida. El método esta calculado para ser utilizado para la detección del fármaco a una concentración de 20 ng/mL en humano.

MATERIALES Y MÉTODO Isotiocianato de Fluoresceina(FITC

isomero I) y eter de 5-(6)-carboxifluoreceina-N-hidroxisuccinimida (FLUOS).

Silica Gel (0.063 a 0.200 mm) Hidóxido de Potasio , Fosfato dihidrogeno de potasio. Sulfato de Sodio Anhidro Hexacianoferrato de potasio Metanol Cloroformo Diclorometano Metilsulfoxido Trietilamina (TEA) Β-glucoronidasa arilsulfatasa. Suero normal de Conejo y Antigamma

globulina de Conejo Antiinmunoglobulina de conejo Norbuprenorfina y buprenorfina

sintetizadas por el método de Kleeman y Engel

Espectroscopia de Masas.Espectrómetro de masas(L-SIMS) para superficie liquida con ionización asistida llevada con el concepto Kratos de proton usando un diodo de 7-keV Cs, *Pseudobuprenorfina se disolvió en glicerol en la prueba.

Preparación de Pseudobuprenorfina

Preparación de Norbuprenorfina

SINTESIS DE LOS TRAZADORES FLUORESCENTES

La Fluoresceina norbuprenorfina se preparo usando fluoresceina activada. Los mejores resultados se obtuvieron usando la soln. de Norbuprenorfina (100mg) en MeOH-TEA(9:1).

Se pesaron 100 mg se disolvieron en MeOH se disolvió y se reflujo por 2 horas, para evaporar el solvente y purificar con (CH2Cl:MeOH-TEA(99-1,(9:1).

Posteriormente se llevo a HPLC con detección de fluorescencia (F-1050) a una sensibilidad de 20 λex a 490 nm y λem a 525nm y acoplado a una bomba Merck-Hitachi L 6200 acoplada a una columna LiChrosorb C18 (25cmx0.4cm) Merck. La fase movil sonsitio en una mezcla de acetonitrilo-agua (8:2)y se bombeo a una velocidad de 1mL/min

Después de cada inyección el pico apareció a los 7.2 min. Las fracciones fluorescentes colectadas se secaron por vapor de

nitrógeno y sus residuos se estudiaron con Espectrofotometría infrarroja.

PREPARACIÓN DE PSEUDOORIPAVINA

Una solución madre de 1 mg/mL de MeOH se almaceno en el refrigerador a -18°C

Oripavine se puede oxidar para formar sus bases la pseudooripavina por medio de la reacción con hexacianoferrato (III) en soln. acuosa.

Oripavina (100 mg) se adicionaron a una soln. Caliente de hidróxido de potasio (200mL de 2g/L .

La mezcla se sonica y enfriada a temp. Ambiente. Con agitación constante se disuelven 120 mg de la muestra en 2mL de agua por 60 min. Después de 30 min, la mezcla es alcalina(pH 8.5)con buffer de boratos (0.1 mol/L) y se extrae con CHCl3. Se seca en sulfato de sodio anhidro. El residuo se purifica por cromatografía de columna (sílica g e l 0.063--0.200 mm; CHCI3: M e O H / T E A ( 9 9 - 1 ) ; 95:5).

La columna se acopla a un detector UV (SP8-400 UV/VIS espectrofotómetro con un flujo de 1mL

RESULTADO: 11.9 mg del dimero fluorescente se aislo. Una solución de 1mg/mL en metanol se congelo. Para mantener las

condiciones fluorescentes el PH debe ser neutro(Buffer Fosfatos 0.1 mol/L)

AFINIDAD DE LOS TRAZADORES FLUORESCENTES A LOS ANTICUERPOS.

Los derivados fluorescentes de oripavina se probaron para medir su habilidad de unirse a los anticuerpos.

Se hicieron diluciones de los trazadores (nororipavina y pseudoripavina) en buffer de fosfatos pH 7.4

La reactividad cruzada de los trazadores a iodooripavina se examinó

Mediante una matriz de 300 µL (2% BSA en buffer de fosfatos) 100 µL de la iodooripavina y 100 µL de los compuestos fluorescentes y las diferentes concentraciones se pipetearon por duplicado a tubos de polipropileno.

Se coloco en un vortex y se le adicionan 100 µL de antisuero. Se incuba por 1.5 horas se le adiciona 50 µL de anti gamma globulina de conejo y 50 µL de suero normal de conejo, se incuba por toda la noche , se centrifuga , se decanta y el boton es el gamma trazador.

RESULTADOS: Pseudoripavina muestra la mas alta afinidad por los anticuerpos y es la

que se selecciona para el inmunoensayo.

1ng/100 µL 10 ng/100 µL 100 ng/100 µL

1000 ng/100 µL

Para el fluoroinmunoensayo todos los experminetos de llevaron a cabo en buffer de Fosfatios pH 7.4 con un 1% de BSA y 0.05% Triton-X405.

100 µL de orina hidrolizada toda la

noche con β glucoronidasa/aril

sulfatasa.

Se colocan en 300 µL de buffer de

fosfatos

Se le adicionan 100 µL de

pseudooripavine (10 ng/ 100 µLµL)

Agitar en vortex y al finalizar

adicionar 100 µL de antisuero

Después de 1h 30 min se le

adiciona 100 µL de inmunobead , se homogeniza .

Después de 2 horas se

centrifuga a 1880rpm por 10

min,

Se decanta el sobrenadante , y

se lavan los remanentes por

triplicado con buffer de fosfatos

Se le adicionan 2.5 mL de (MeOH- bicarbonato pH

Se sonica por 60 s se separan las partículas y se

filtra a través de un filtro 0.2 µm

CURVA DE CALIBRACIÓN Los valores adicionados del estándar

para la curva fueron:

20 ng/mL 50 ng/mL 100 ng/mL

200 ng/mL

500 ng/mL

RESULTADOS. La nororipavina y el FLUOS se disolvió

en diferentes proporciones de DMSO y buffer de fosfatos 0.1 mol/L, pH 7.0 , la reacción se detuvo en diferentes intervalos de tiempo , se observo mediante TLC que FLUOS no se acoplo con la amina secundaria de la nororipavina, no se observaron mejores resultados con valores de pH mayores.

Utilizando FITC en una mezcla con MeOH-TEA fue posible unir la fluoresceina a la nororipavina, esto se comprobó en espectrómetro de infrarrojo(1430cm-1).

AFINIDAD DE LOS TRAZADORES FLUORESCENTES A LOS ANTICUERPOS.

La afinidad de los anticuerpos a la fluoresceina norbuprenorfina fue muy baja.