bsc final project

Universidade do Algarve

Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina

Effect of enzymes in the

efficiency of particle transfection

‘Efeito de enzimas na eficiência da transfecção de partículas’

Andreia Catarina Pereira Afonso, nº39042

Junho, 2013

Effect of enzymes in the efficiency of particle transfection

iii

Universidade do Algarve

Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina

Effect of enzymes in the efficiency of particle

transfection

‘Efeito de enzimas na eficiência da transfecção de partículas’

Licenciatura em Ciências Biomédicas

Monografia

Andreia Catarina Pereira Afonso, nº39042

Orientado por: Profª. Dr.ª. Gabriela Silva e Mestre Ana Vanessa Oliveira

Laboratório de Terapia Génica

Junho, 2013


iv

Agradecimentos

Em primeiro lugar quero agradecer aos meus pais pois sem eles e sem o seu

apoio eu não estaria, se tudo correr bem, a terminar a licenciatura.

Gostaria de agradecer à profª Gabriela Silva por me ter proporcionado a

oportunidade de fazer este trabalho no seu laboratório e pelo facto da grande parte da

experiência laboratorial que tenho hoje resultar destes últimos meses.

Quero também agradecer a todos no laboratório por me terem ajudado. À Sofia,

à Susana, ao Diogo e à Sónia, e claro à Vanessa que mesmo à distância sempre me

orientou no melhor caminho a seguir.

Obrigado!


v

Lista de abreviaturas

ADN - Ácido desoxirribonucleico

CS - Quitosano

HA - Ácido hialurónico

NPs - Nanopartículas

Chn - Quitosanase

Hy - Hialuronidase

GFP - “Green Fluorescent Protein”

pDNA - ADN Plasmídico

AAV - “Adeno-Associated Vírus”, vírus adeno-associados

CMV - Citomegalovirus

eGFP - “Enhanced Green Fluorescent Protein”

pH - Potencial de hidrogénio

pKa - Constante de acidez

DDA - “Degree of deacetylation”, grau de deacetilação

MW - “Molecular weight”, peso molecular

HEK293- “Human Embryonic Kidney Cells”

DMEM - “Dulbecco´s Eagle Modified Medium”, meio de cultura

FBS - “Fetal Bovine Serum”

PBS - “Phosphate Buffer Saline”


vi

Índice

Resumo .............................................................................................................................. 1

1. Introdução .............................................................................................................. 2

2. Materiais e métodos ............................................................................................... 7

2.1.Materiais .......................................................................................................... 7

2.1.1. Polímeros ............................................................................................. 7

2.1.2. Plasmídeo............................................................................................. 7

2.1.3. Chitosanase e hialuronidase................................................................. 8

2.1.4. Linha celular: Manutenção e propagação ............................................ 8

2.2.Métodos ........................................................................................................... 8

2.2.1. Preparação das nanopartículas ............................................................. 8

2.2.2. Caracterização das nanopartículas ....................................................... 9

2.2.3. Avaliação da eficiência de encapsulação do polímero e da ação das

enzimas ................................................................................................ 9

2.2.4. Transfecção in vitro ............................................................................. 9

2.2.5. Tratamento com chitosanase ............................................................. 10

2.2.6. Análises estatísticas dos dados .......................................................... 10

3. Resultados e Discussão ........................................................................................ 11

3.1.Caracterização das nanopartículas ................................................................. 11

3.2.Avaliação da eficiência de encapsulação dos polímeros e da ação das

enzimas .......................................................................................................... 12

3.3.Eficiência da transfecção e expressão de GFP .............................................. 14

4. Conclusão ............................................................................................................ 20

5. Bibliografia .......................................................................................................... 21


1

Resumo

Atualmente, o sucesso da terapia génica está limitado pela falta de vetores

eficientes. São usados dois tipos de vetores: virais e não-virais. Apesar dos primeiros

apresentarem uma elevada taxa de transfecção provocam, entre outros, respostas

imunitárias indesejadas. Assim os vetores não-virais surgem como alternativa,

particularmente os polímeros naturais como o quitosano (CS) e o ácido hialurónico

(HA). O quitosano é um polímero catiónico, com baixa toxicidade e imunogenicidade,

que já demonstrou encapsular eficientemente o ácido desoxirribonucleico (ADN),

apesar da libertação deste já no núcleo não ser tão eficiente. O ácido hialurónico é um

polímero glicosaminoglicano aniónico largamente distribuído pelo corpo humano sendo

um dos principais componentes da matriz extracelular.

No sentido de aumentar a eficiência de transfecção e ultrapassar a barreira da

libertação do ADN têm surgido na literatura novos métodos onde as células são tratadas

com as enzimas quitosanase (Chn) e hialuronidase (Hy). O objetivo deste trabalho é

determinar o efeito da quitosanase e/ou hialuronidase na eficiência da transfecção das

nanopartículas (NPs) de CS e CSHA.

Foram preparadas nanopartículas com os polímeros CS e HA, usando um

plasmídeo que codifica para a proteína GFP. Estas NPs foram caracterizadas em relação

ao seu tamanho, polidispersão, potencial zeta, capacidade de encapsulação e efeito das

duas enzimas sobre estas. A eficiência de transfecção foi avaliada na linha celular

HEK293 usando FuGENE como controlo positivo.

Pode-se observar que as NPs transfectam as células apesar de o fazerem com

uma taxa de transfecção cerca de sete vezes inferior ao controlo positivo e que o

tratamento celular com a quitosanase parece não produzir nenhum efeito na eficiência

de transfecção celular, apesar de funcionar quando incubada com as NPs a

concentrações elevadas. Já com a enzima hialuronidase não foram obtidos resultados

positivos.

Contudo, os métodos usados podem ser otimizados num futuro trabalho, no que

diz respeito a diferentes concentrações de enzima e diferentes tempos de incubação, na

tentativa de obter uma maior eficácia de transfecção.


2

1. Introdução

A terapia génica é uma abordagem importante na cura de doenças congénitas e

adquiridas1. O seu principal objetivo consiste no tratamento de doenças através da

introdução de material genético em células alvo do paciente2, com o propósito de

regular o efeito resultante da produção de proteína, que estava ausente ou deficiente

devido à desordem genética pré-existente3.

Ensaios clínicos em terapia génica sugerem que a baixa eficácia com que o

material terapêutico é entregue no núcleo continua a ser uma barreira essencial para

uma terapia génica eficiente e segura4. Contudo um dos grandes problemas é a ausência

de vetores de transfecção adequados, e isto deve-se a diversos fatores como a sua

instabilidade nos fluidos corporais, a não especificidade celular e à degradação por

enzimas5.

Idealmente um vector deve transportar o material genético até um tipo de células

específico e entregá-lo ao núcleo sem se tornar tóxico, mutagénico e imunogénico

tornando a transfecção o mais eficiente possível6. Com o objetivo de tornar esta

transferência genética mais eficiente, segura e específica têm sido estudadas inúmeras

técnicas usando dois tipos de vetores de transfecção: virais e não-virais.

Inicialmente os vetores virais eram os mais utilizados devido a uma elevada

eficiência de transfecção e a uma rápida transcrição do material genético exógeno

inserido no genoma viral2. Mas estes vetores têm algumas desvantagens associadas, tais

como, toxicidade, baixa especificidade celular, possível recombinação com o genoma

humano, baixa capacidade de encapsular ADN exógeno e também desencadear

respostas imunitárias indesejadas7.

Devido às limitações e desvantagens do uso dos vetores virais têm surgido

estudos no sentido de utilizar um vector mais seguro. Os vetores não-virais têm surgido

como alternativa aos vetores virais e oferecem muitas vantagens, tais como, segurança a

nível imunológico e mutagénico, baixa toxicidade e possibilidade de produção em larga

escala. A maioria dos vetores não-virais não tem limitação de empacotamento do ADN

exógeno e têm a possibilidade de serem modificados com ligandos para se tornarem

específicos a um tipo de célula ou tecido7. Apesar das vantagens sobre os vetores virais,

os vetores não-virais continuam a ter uma taxa de transfecção inferior, e isto deve-se,

entre outros, às barreiras biológicas que têm que ser ultrapassadas na internalização


3

celular das nanopartículas (fig.1). Estas barreiras incluem degradação enzimática8, como

a de nucleases que estão presentes no sangue e na matriz extracelular9, entrada

ineficiente na célula e no núcleo, degradação endo-lisossomal e dissociação do

polímero8.

Dos vários vetores não-virais utilizados na terapia génica, os polímeros

catiónicos são dos mais usados para condensar o ADN devido à sua estabilidade e ao

facto de conseguirem proteger o ADN da degradação por nucleases10

. Esta condensação

é promovida através de interações electroestáticas entre a carga negativa do ADN,

conferida pelos grupos fosfato, e a carga positiva do polímero, normalmente conferida

por grupos amina, formando assim complexos polímero/ADN que também podem ser

chamados poliplexos.

Para obter uma transfecção mais eficiente, os polímeros, contribuem com fatores

que ajudam a ultrapassar algumas das barreiras biológicas acima mencionadas. O

polímero permite aumentar a entrada do ADN nas células, via endocitose, devido às

interações electroestáticas entre os poliplexos e os proteoglicanos presentes na

superfície celular11

, protege o ADN da degradação de enzimas e facilita ao escape endo-

lisossomal diminuindo a hipótese de serem degradados.

Fig. 1. Representação esquemática das barreiras biológicas à transferência de genes in vivo7

(adaptado a partir de Yuan, E. X. 2011).


4

A utilização do quitosano como um vector não-viral tem despertado à atenção de

muitos investigadores pois é um biomaterial biocompatível e biodegradável, com

elevado potencial catiónico e com baixa toxicidade, sendo considerado um bom vector

de transfecção5. O quitosano (fig.2) é um polímero natural com baixa

imunogenicidade12

derivado da deacetilação alcalina da chitina, um polissacárido que

pode ser encontrado no exosqueleto de crustáceos e insectos2.

Existem vários fatores, como o peso molecular (MW), grau de deacetilação

(DDA), potencial de hidrogénio (pH), rácio N/P e tamanho das nanopartículas que

podem influenciar a eficácia da transfecção. O MW e o DDA influenciam o tamanho

das nanopartículas bem como a estabilidade destas, na medida em que o quitosano com

maior MW consegue ligar-se mais fortemente ao ADN facilitando a entrada na célula.

Mas esta forte ligação pode dificultar a libertação do ADN já no núcleo, após a

endocitose. O DDA corresponde ao número de aminas livres, e assim quanto maior o

DDA, maior será a eficácia da ligação com o ADN. O rácio N/P é definido pelo rácio

entre o nitrogénio (N) do quitosano e o fosfato (P) do ADN, podendo influenciar a

capacidade das partículas condensarem eficazmente o plasmídeo e de interagirem com a

membrana celular que tem carga negativa8. A um pH de 5,5-5,7 o grau de protonação

dos grupos amina é maior, facilitando a ligação com ADN e podendo formar poliplexos

mais estáveis e pequenos8.

Apesar das vantagens do uso do quitosano como vector não viral, é possível

complexar este polímero com um outro, o ácido hialurónico, no sentido de obter

nanopartículas mais pequenas, e assim facilitar a entrada destas nas células, e ao mesmo

tempo menos estáveis facilitando a libertação do ADN, já no núcleo13

.

Fig. 2. Estrutura química do quitosano. É uma molécula linear composta aleatoriamente por

duas subunidades: N-acetil-D-glucosamina (unidade acetilada) e β-(1-4)-D-glucosamina

(unidade deacetilada)7 (adaptado a partir de Yuan, E. X. 2011).


5

O ácido hialurónico é um glicosaminoglicano aniónico e não-sulfatado

largamente distribuído pelo corpo humano sendo um dos principais componentes da

matriz extracelular14

. O facto do seu principal recetor celular (CD44) estar associado à

endocitose15

faz prever um aumento da internalização celular das nanopartículas

complexadas com este polímero. Devido à sua natureza pensa-se que a introdução deste

composto no organismo não irá provocar nenhum efeito adverso e também que a sua

carga aniónica, juntamento com a carga aniónico do ADN e a catiónica do quitosano, irá

destabilizar as nanopartículas ao ponto das interações electroestáticas não se tornarem

muito fortes e assim haver uma fácil libertação do ADN.

Contudo e apesar de todas as vantagens e métodos acima indicados tanto as

nanopartículas de quitosano como as de quitosano e ácido hialurónico continuam a ter

uma taxa de transfecção relativamente baixa. No sentido de ultrapassar esta

desvantagem têm sido descritos na literatura novos métodos de aumentar a libertação de

ADN das nanopartículas. Estudos recentes sugerem que um pré-tratamento ou co-

transfecção com a enzima quitosanase (fig.3) poderá aumentar a eficiência da

transfecção das nanopartículas de quitosano16,17

. Existem também estudos que mostram

que o pré-tratamento com a enzima hialuronidase (fig.4) aumenta a eficiência da

transfecção18

.

Fig. 3. Especificidade da enzima chitosanase que cliva as ligações β-(1-4) entre as unidades

N-acetil-D-glucosamina e D-glucosamina16

(adaptado a partir de

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c9830?lang=pt&region=PT acedido

em 2013/06.24).

.

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c9830?lang=pt&region=PT


6

O objetivo deste trabalho é determinar o efeito da quitosanase e/ou hialuronidase

na eficiência da transfecção das nanopartículas de quitosano e quitosano-ácido

hialurónico. O efeito destas enzimas foi avaliado nas nanopartículas e na eficiência da

transfecção celular na presença de diferentes concentrações de enzima.

Fig. 4. Especificidade da enzima hialuronidase que catalisa as ligações entre a unidade β-D-

(1-3) ácido glucurónico e a β-D-(1-4)-N-acetilglicosamina (adaptado a partir de

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4272?lang=pt&region=PT; acedido

em 2013/06.24).

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4272?lang=pt&region=PT


7

2. Material e métodos

2.1.Materiais

2.1.1. Polímeros

O quitosano (Polysciences) tem um peso molecular de 15 kDa e um grau de

deacetilação de 84%. O ácido hialurónico (Lifecore Biomedical) tem um peso molecular

de 214 kDa.

2.1.2. Plasmídeo

O plasmídeo pAAV2.1CMV-eGFP codifica para a proteína GFP e tem o

promotor citomegalovirus humano (CMV) (fig.5). Este plasmídeo foi amplificado em

E.coli TOP10 e purificado com o Kit Plasmid Maxi (Qiagen). Este plasmídeo tem 5504

pb e um peso molecular de aproximadamente 3401 kDA. O plasmídeo foi dissolvido em

tampão TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) e a sua concentração foi

determinada no espectrofotómetro NanoDrop 2000c (Thermo SCIENTIFIC) a 260 nm.

Fig. 5. Mapa do plasmídeo pAAV2.1CMV-eGFP desenhado utilizando o software

NetPlasmid disponível no site www.justbio.com.


8

2.1.3. Chitosanase e hialuronidase

As enzimas quitosanase tipo III extraída da bactéria Streptomyces griseus e a

hialuronidase tipo IV-S de testículos bovinos (SIGMA-ALDRICH), ambas sob a forma

de pó liofilizado, foram utilizadas sem qualquer purificação.

A primeira foi diluída em tampão acetato 100 mM pH 5,1 enquanto a segunda

foi diluída em NaCl 0,9%.

2.1.4. Linha Celular: Manutenção e propagação

A linha celular usada nas experiências in vitro foi a HEK293, uma linha celular

específica derivada de rim embrionário humano. Esta linha celular é bem caracterizada

e fácil de transfectar.

As células foram mantidas a 37ºC e 5% CO2, usando meio “Dulbecco´s Eagle

Modified Medium” (DMEM) (SIGMA) suplementado com 10% soro fetal bovino

(FBS, SIGMA), 1% de L-glutamina e 1% de penicilina-streptomicina (SIGMA).

Quando as células atingiam 70-80% de confluência, eram subclonadas e para os ensaios

descritos foram utilizadas células entre as passagens 24 e 26.

2.2. Métodos

2.2.1. Preparação das nanopartículas

Foram preparadas duas soluções stock de 1 mg/mL de CS e HA, e a primeira foi

posteriormente diluída para 0,2 mg/mL. O quitosano foi dissolvido em ácido acético

100 mM pH 5,1 a 35ºC e as restantes soluções foram preparadas em água MilliQ. Todas

as soluções usadas foram filtradas com um filtro estéril de 0,22 µm.

Foram preparadas quatro diferentes tipos de partículas: CS, CSpDNA, CSHA e

CSHApDNA.

Para a formação das nanopartículas CS foram usadas duas soluções: CS 0,2

mg/ml e fosfato de sódio 5mM que foram aquecidas em separado durante 3min a 55ºC,

rapidamente misturadas e vortexadas por 30s, postas no gelo e armazenadas a 4ºC.

As NPs CSpDNA e CSHApDNA foram feitas com um ratio NH 3 + :PO4

− de

5:1, usando 50 µg de CS para 16,08 µg de ADN plasmídico, e as NPs CSHA e

CSHApDNA com um rácio de CS:HA de 7:1. O ADN plasmídico e o HA foram

misturados na solução de fosfato de sódio e misturado com a solução de quitosano,

como foi acima descrito.


9

2.2.2. Caracterização das nanopartículas

As medições de tamanho, polidispersidade e potencial zeta das partículas foram

determinados usando o Zetasizer Nano ZS (Malvrem Instruments) através de

espectrometria de dispersão de luz. A solução das partículas foi diluída em água MilliQ

num volume final de 1mL e as medições foram realizadas a 25ºC.

2.2.3. Avaliação da eficiência de encapsulação do polímero e da ação das

enzimas

As nanopartículas foram também caracterizadas em relação à eficácia de

encapsulação através de vários ensaios de retardação em géis de agarose, onde a ação

das enzimas quitosanase e hialuronidase foi testada.

Foram feitos ensaios de retardação em géis de agarose para verificar a ação da

quitosanase nas NPs CSpDNA e CSHApDNA, separadamente. As amostras foram

preparadas em meio sem soro com um volume de NPs proporcional a 300 ng de ADN.

Foram testadas três concentrações diferentes de quitosanase: 10 mU, 100 mU e 500 mU.

Um volume total de 50 µL foi incubado a 37ºC durante aproximadamente 3h.

Para verificar a ação da hialuronidase e da hialuronidase com quitosanase em

conjunto nas NPs CSHApDNA as amostras foram preparadas da mesma forma acima

descrita, onde foram testadas três concentrações de hialuronidase: 15 µg, 30 µg e 65 µg

e apenas uma de quitosanase: 22 mU.

2.2.4. Transfecção in vitro

As células HEK293 foram semeadas numa placa de 6 poços com uma densidade

de 20x104 células/poço e 24h depois realizou-se a transfecção.

Aquando da transfecção o meio foi aspirado e foram adicionados 31 µL de

partículas/poço correspondendo a 1 µg ADN/poço e logo em seguida foram adicionados

2 mL de meio sem soro. Após 5h de incubação o meio foi aspirado e substituído por

meio completo. O agente de transfecção FuGENE HD® (Promega) foi usado como

controlo positivo com um ratio de 1:3, 1 µg ADN: 3 µL de FuGENE, de acordo as

instruções do fabricante.

A eficiência de transfecção foi avaliada por microscopia de fluorescência e

citometria de fluxo. A expressão de GFP das células foi observada usando um

microscópio de fluorescência invertido (Leica DMIL com camara Leica DC500) às 24h,

48h e 72h.


10

Setenta e duas horas após a transfecção, as células foram tripsinizadas, lavadas

em PBS e analisadas no citómetro FACSCalibur para a expressão da proteína GFP.

Todas as experiências foram feitas em triplicado.

2.2.5. Tratamento com chitosanase

Quarenta e oito horas após a transfecção, as células incubadas com as

nanopartículas CS, CSpDNA, CSHA e CSHApDNA, foram tratadas com a chitosanase

a diferentes concentrações. Foi preparada uma solução stock da enzima de 1,756

mU/µL e posteriormente diluída em meio completo a pH 6,5.

Foram testadas as concentrações 10 mU, 19 mU e 40 mU, separadamente, para

cada uma das NPs acima mencionadas.

2.2.6. Análises estatísticas dos dados

Foram realizados testes estatísticos, comparações múltiplas e t-tests, usando o

software GraphPad Prism versão 6, onde foram também feitas análises de variância (1

way e 2 way ANOVA) com um intervalo de confiança de 95%.


11

3. Resultados e Discussão

3.1.Caracterização das nanopartículas

As nanopartículas foram caracterizadas no que diz respeito ao tamanho,

polidispersão e potencial zeta (fig.6). As NPs CS apresentaram um tamanho médio de

565,59 ± 64,84, polidispersão 0,380 ± 0,076 e potencial zeta 16,9 ± 2,4, enquanto as

NPs CSpDNA apresentaram um tamanho médio de 367,90 ± 66,46, polidispersão 0,358

± 0,078 e potencial zeta 19,2 ± 2,9. Já as NPs CSHA apresentaram um tamanho médio

de 445,17 ± 48,60, polidispersão 0,369 ± 0,120 e potencial zeta 19,6 ± 2,2 e as NPs

CSHApDNA apresentaram um tamanho médio de 317,77 ± 61,82, polidispersão 0,272

± 0,086 e potencial zeta 21,0 ± 2,4.

É de esperar que com a adição de ADN às nanopartículas o tamanho destas

diminua19

, pois o ADN tem um teor aniónico mais elevado formando mais ligações

electroestáticas com o quitosano20

. Estas ligações promovem o enrolamento do

polímero modificando a conformação das NPs e tornando-as mais pequenas, o que pode

ser comprovado pela análise estatística realizada (fig.6a) onde se verificou que existe

uma diferença estatística entre o tamanho de todas as nanopartículas, exceto nas NPs

CSpDNA e CSHApDNA que são estatisticamente iguais. Espera-se também que o HA,

com a sua carga aniónica, quando adicionado às NPs contribua também para a

diminuição do tamanho destas, o que se verifica nos dados apresentados (fig.6a). Há

Fig. 6. Caracterização das NPs: tamanho (a), polidispersão (b) e potencial zeta (c). As barras

representam os valores médios ± desvio padrão, quando assinaladas (ns) não são

estatisticamente diferentes e (*,**) são estatisticamente diferentes.


12

realmente uma diferença significativa no tamanho das NPs CS e CSHA, o que sugere a

presença do HA nas NPs.

A polidispersão está relacionada com a homogeneidade da solução de

nanopartículas. De acordo com os resultados obtidos das medições das NPs (fig.6b), os

valores de polidispersão são muito semelhantes, onde podemos ver que só as duas NPs

sem ADN são estatisticamente diferentes das NPs CSHApDNA e as NPs CSpDNA são

iguais a todas as outras.

No que diz respeito ao potencial zeta (fig.6c), que mede a carga à superfície da

nanopartícula, a diferença é notada quando o HA é adicionado a NPs, havendo somente

uma diferença estatística no que diz respeito às NPs CS e as NPs CSHApDNA. Tendo

em conta que o HA é um polímero aniónico seria de esperar que a carga diminuísse, o

que não acontece. Isto pode estar relacionado com a conformação do polímero na

nanopartícula. Como já referi anteriormente não é conhecido ao certo qual a posição do

HA na conformação da nanopartícula, e assim sendo, estes dados podem indicar que o

HA se encontra no seu interior, não contribuindo deste modo para uma diminuição da

carga superficial.

3.2. Avaliação da eficiência de encapsulação dos polímeros e da ação das

enzimas

Foi verificado através do ensaio de retardação em géis de agarose (fig.7 e 8) a

eficácia de encapsulação do ADN das nanopartículas CSpDNA (fig.7) e CSHApDNA

(fig.8) e a libertação do mesmo em função da dose de enzima.

Ambas as NPs CSpDNA e CSHApDNA complexam o ADN eficazmente como

se pode verificar no poço 4 de ambos os géis de agarose (fig.7 e 8). Foram testadas três

concentrações bem distintas de quitosanase (10 mU, 100 mU e 500 mU) e verifica-se

libertação do ADN em todos os poços apesar de com a menor concentração de enzima

testada (10 mU) (poço 5, fig.7) se detetar em menor quantidade. Nos restantes dois

poços (com 100 mU e 500 mU) observa-se libertação completa do ADN, em ambos os

géis.


13

Fig. 8. Libertação do ADN em função da dose da enzima chitosanase nas CSHApDNA NPs,

em gel de agarose 1%, com o ADN visualizado com GreenSafe Premium. Incubação a 37ºC.

(1) Marcador, (2) Plasmídeo livre, (3) NPs CSHA, (4) NPs CSHApDNA, (5) NPs

CSHApDNA + 10 mU Chn, (6) NPs CSHApDNA + 100 mU Chn, (7) NPs CSHApDNA +

500 mU Chn.

Fig. 7. Libertação do ADN em função da dose da enzima chitosanase nas NPs CSpDNA, em

gel de agarose 1%, com o ADN visualizado com GreenSafe Premium. Incubação a 37ºC. (1)

Marcador, (2) Plasmídeo livre, (3) NPs CS, (4) NPs CSpDNA, (5) NPs CSpDNA + 10 mU

Chn, (6) NPs CSpDNA + 100 mU Chn, (7) NPs CSpDNA + 500 mU Chn.


14

Foi também testada a ação da hialuronidase e da hialuronidase em conjunto com

a quitosanase na libertação do ADN. Nenhuma das quantidades de hialuronidase usadas

parece ter funcionado, como se pode ver na fig.9 nos poços 5,6 e 7. No poço 8 volta-se a

confirmar a ação da quitosanase mas no poço 9 quando se conjuga a ação das duas

enzimas parece haver apenas uma libertação de ADN incompleta, como se pode ver

pela ténue banda presente.

3.3.Eficiência da transfecção e expressão de GFP

A eficiência de transfecção das nanopartículas CS e CSHA foram avaliadas na

linha celular HEK293 pois é uma linha bem caracterizada, fácil de transfectar e muito

usada em estudos semelhantes2. O plasmídeo usado codifica para a proteína GFP e a

expressão desta foi avaliada através de microscopia de fluorescência e citometria de

fluxo às 72h.

As nanopartículas CSpDNA e CSHApDNA alcançaram uma eficiência de

transfecção de 4,85 ± 1,26 e 3,75 ± 1,24, respetivamente. Quando submetidas ao

tratamento com a quitosanase onde foram testadas as concentrações 10 mU, 19 mU e 40

mU a cada uma das NPs CSpDNA e CSHApDNA obteve-se nas primeiras uma

Fig. 9. Acão das enzimas hialuronidase e chitosanase, em separado e em conjunto, nas NPs

CSHApDNA, em gel de agarose 1%, com o ADN visualizado com GreenSafe Premium.

Incubação a 37ºC. (1) Marcador, (2) Plasmídeo livre, (3) NPs CSHA, (4) NPs CSHApDNA,

(5) NPs CSHApDNA + 65 µg Hy, (6) NPs CSHApDNA + 30 µg Hy, (7) NPs CSHApDNA

+ 15 µg Hy, (8) NPs CSHApDNA + 22 mU Chn, (9) NPs CSHApDNA + 22 mU Chn + 65

µg Hy.


15

eficiência de transfecção de 4,69 ± 1,80, 4,86 ± 2,05 e 5,45 ± 1,70, respetivamente e nas

segundas 3,43 ± 0,30, 3,71 ± 2,43 e 5,69 ± 2,43 seguindo a mesma ordem (fig.10).

A eficiência de transfecção com FuGENE, um agente de transfecção comercial

usado como controlo positivo foi de 35,13 ± 3,82, cerca de sete vezes superior à

transfecção das NPs. Quando submetidas ao tratamento com a quitosanase onde foram

testadas as mesmas concentrações que anteriormente obteve-se 38,00 ± 3,64, 41,99 ±

3,94 e 37,19 ± 1,93 (fig.10).

A transfecção das NPs é limitada por alguns fatores como degradação

enzimática, entrada na célula, encapsulação endo-lisossomal, entrada núcleo e

dissociação do polimero8. Polímeros catiónicos como o quitosano ligam-se

electrostaticamente à membrana celular devido à presença de proteoglicanos11

, e estas

interações facilitam a entrada das nanopartículas na célula. Desta forma o facto de as

NPs apresentarem uma carga à superfície positiva (fig.6c) contribui para a percentagem

de fluorescência obtida.

Foi feita uma análise estatística onde se confirmou que existe uma diferença

entre os agentes de transfecção FuGENE, NPS CSpDNA e CSHApDNA (fig.10).

Contudo não se verifica nenhuma diferença estatística entre os vários tratamentos com

Fig. 10. Eficiência de transfecção nas células HEK293 às 72h. Células transfectadas com

FuGENE, NPs CSpDNA e CSHApDNA com tratamento de várias concentrações de

enzima quitosanase (10mU, 19mU e 40mU).


16

enzima nos diferentes agentes de transfecção (fig.10), como seria de esperar de acordo

com outros trabalhos descritos na literatura16,17

. Estes resultados são também suportados

pelas imagens de microscopia de fluorescência onde se observa uma grande diferença

entre a transfecção com FuGENE (fig.11) e com as NPs (fig.12 e 13), apesar de não se

assinalar diferenças entre os diferentes tratamentos com quitosanase.

A análise de variância estatística demostrou juntamente que apesar de não haver

nenhuma alteração positiva, com o tratamento da quitosanase, na eficiência de

transfecção também não existe nenhuma alteração negativa, tanto nas células

transfectadas como nas não transfectadas (fig.14) o que também pode ser sustentado

pelas imagens de microscopia de fluorescência (fig.11, 12, 13 e 14) onde não se observa

nenhuma alteração considerável a nível de número ou aspeto das células.

Fig. 11. Efeito da quitosanase nas células HEK293 transfectadas com FuGENE.

Observação às 72h. (a) controlo -, (b) HEK293 + 10 mU Chn, (c) HEK293 + 19 mU Chn,

(d) HEK293 + 40 mU Chn.


17

Fig. 13. Efeito da quitosanase nas células HEK293 transfectadas com NPs CSHApDNA.


(d) HEK293 + 40 mU Chn.

Fig. 12. Efeito da quitosanase nas células HEK293 transfectadas com NPs CSpDNA.


(d) HEK293 + 40 mU Chn.


18

Como já podemos observar anteriormente (fig. 7 e 8) a quitosanase liberta de

facto o ADN ao quebrar as ligações do quitosano, porém as concentrações de enzima

utilizadas nos géis de agarose são muito superiores às usadas nas células.

Sabendo que a quitosanase não existe naturalmente em células de mamíferos não

era apropriado usar concentrações tão elevadas aquando da transfecção correndo o risco

de saturar e obter efeitos adversos. Assim foram testados valores mais baixos de acordo

com outros estudos descritos na literatura16

.

As células e os géis de agarose são dois sistemas bem diferentes e têm

sensibilidades diferentes à adição de enzima. Enquanto nos géis de agarose a enzima

está em contacto direto com as NPs, nas células o efeito da enzima sobre as NPs vai

depender da internalização desta.

Um outro fator a considerar é o tempo de incubação que nas células é de 24h e

nos géis de agarose é cerca de 3h. Talvez uma solução para otimizar o efeito da enzima

seja variar o tempo de incubação, aumentando ou diminuindo. É também de referir que

é utilizado num outro estudo similar a este uma diferente forma de facilitar a

internalização da quitosanase nas células através de um processo chamado pinossomas

de lise osmótica, onde as células são lavadas, centrifugadas e incubadas com diferentes

Fig. 14. Efeito da quitosanase nas células HEK293 controlo. Observação às 72h. (a)

controlo -, (b) HEK293 + 10 mU Chn, (c) HEK293 + 19 mU Chn, (d) HEK293 + 40 mU

Chn.


19

compostos. Este processo é exequível em células in vitro mas como o principal objetivo

de toda a terapia génica é tratar doenças in vivo não seria uma opção viável em estudos

futuros.


20

4. Conclusão

Foi descrito neste trabalho a importância da utilização dos vetores não virais,

principalmente dos polímeros catiónicos, na terapia génica como vetores de entrega de

ADN.

O uso das nanopartículas como agentes de transfecção é limitado pela baixa

eficiência de transfecção como pode ser comprovado pelos resultados deste trabalho.

Numa tentativa de melhorar estes resultados foi feito um tratamento das células

transfectadas com a enzima quitosanase, algo que tem sido descrito recentemente na

literatura. Os resultados obtidos mostraram que este tratamento parece não ter

influenciado a eficiência de transfecção positiva ou negativamente.

Contudo, e sendo esta uma nova abordagem, nada impede que este processo não

possa ser otimizado em trabalhos futuros. Visto que no ensaio de retardação em géis de

agarose a enzima quitosanase funciona é possível que nas células esta também funcione.

Talvez alterando alguns parâmetros no decorrer da experiência, como a concentração de

enzima usada, o tempo de incubação nas células ou até mesmo o pH do meio em que

esta é diluída, seja o necessário para obter resultados positivos. Já no caso da

hialuronidase tendo em conta que não se obteve nenhum resultado positivo o ideal seria

começar por alterar as concentrações usadas nos ensaios de retardação e talvez, mais

tarde, fosse possível testar um pré-tratamento desta enzima nas células uma vez que a

hialuronidase degradando o ácido hialurónico e este fazendo parte da matriz extracelular

das células pudesse facilitar a internalização das nanopartículas aquando da transfecção.

Um futuro resultado positivo do decorrer destas experiências seria muito

importante para a terapia génica já que a combinação destas duas enzimas no tratamento

das células transfectadas com NPs de CS e HA seria fundamental para uma maior

libertação de ADN no núcleo e talvez uma maior internalização das nanopartículas nas

células.


21

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