TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

BİR SÜT SIĞIRCILIĞI İŞLETMESİNDE BoHV-1

IgG ANTİKOR AVİDİTESİNİN ARAŞTIRILMASI

Ayşe Başak DEMİR

VİROLOJİ ANABİLİM DALI

DOKTORA TEZİ

DANIŞMAN

Prof. Dr. Yılmaz AKÇA

2006-ANKARA

iii

İÇİNDEKİLER

Kabul ve Onay ii

İçindekiler iii

Önsöz vi

Simgeler ve Kısaltmalar vii

Şekiller viii

Çizelgeler ix

Resimler xii

1. GİRİŞ 1

1.1. BoHV-1 Enfeksiyonu 2

1.1.1. Etiyoloji 2

1.1.2. Epidemiyoloji 3

1.1.3. Patogenez ve Patoloji 5

1.1.4. Klinik Bulgular 9

1.1.5. İmmunoloji 10

1.1.6. Teşhis 14

1.1.6.1. Klinik Teşhis 14

1.1.6.2. Laboratuvar Teşhisi 14

1.1.6.2.1. Virus İzolasyonu ve Viral Antijen Tespiti 14

1.1.6.2.2. Viral Nükleik Asit Tespiti 15

1.1.6.2.3. Serolojik Testler 16

1.1.7. Kontrol ve Eradikasyon 17

1.1.7.1. Eradikasyon 18

1.1.7.2. Aşılar 19

1.2. Antikor Aviditesi 20

1.3. Araştırmanın Amacı 25

iv

2. GEREÇ VE YÖNTEM 26

2.1. Gereç 26

2.1.1. Hücre Kültürü 26

2.1.2. Viruslar 26

2.1.3. Kontrol Serumlar 26

2.1.4. Araştırmada Kullanılan Hayvanlar 26

2.2. Yöntem 29

2.2.1. Antijen Hazırlanması 29

2.2.1.1. Virusların Üretilmesi 29

2.2.1.2. Virusların Saflaştırılması 29

2.2.2. ELISA Bileşenleri ve Prosedürün Optimizasyonu 30

2.2.2.1. Antijen ve Serum Sulandırmalarının Optimizasyonu 31

2.2.2.2. Konjugat ve Boş Kontrollerin Test Edilmesi 33

2.2.2.3. Diğer Parametrelerin Kontrolü 34

2.2.2.4. Pozitif ve Negatif Kontrol Serumlar ile Antijen Sulandırmalarının Son

Nokta Titrasyon Değerlerinin Tespit Edilmesi 34

2.2.2.5. Pozitif ve Negatif Kontrol Serumların Test Edilmesi 36

2.2.3. Avidite Testi 39

2.2.4. İstatistiksel Analizler 40

3. BULGULAR 41

3.1. ELISA Antijeni Hazırlanması 41

3.2. ELISA Bileşenleri ve Prosedürün Optimizasyonu 41

3.2.1. Antijen ve Serum Sulandırmalarının Optimizasyonu 41

3.2.2. Konjugat ve Boş Kontrollerin Değerlendirilmesi 43

3.2.3. Diğer Parametrelerin Kontrolü 43

3.2.4. Pozitif ve Negatif Kontrol Serumlar ile Antijen Sulandırmalarının

Son Nokta Titrasyon Değerlerinin Tespit Edilmesi 44

3.2.5. Pozitif ve Negatif Kontrol Serumların Sulandırma Oranlarının

Test Edilmesi 48

3.3. Avidite Testi 48

3.3.1. Örneklemelerin Tümünde Bulunan Serumların Avidite ELISA Testi 48

v

3.3.2. İlk 6 Örneklemede Bulunan Serumların Avidite ELISA Testi 55

3.3.3. Son 6 Örneklemede Bulunan Serumların Avidite ELISA Testi 59

3.3.4. İlk 4 Örneklemede Bulunan Serumların Avidite ELISA Testi 62

3.3.5. Örneklemelere Ait Bireysel Avidite Değerleri ile Nötralizasyon SN50

Değerlerinin Karşılaştırılması 68

4. TARTIŞMA 71

5. SONUÇ ve ÖNERİLER 81

ÖZET 83

SUMMARY 84

KAYNAKLAR 85

ÖZGEÇMİŞ 94

vi

ÖNSÖZ

BoHV-1 enfeksiyonu, sığırlarda dünya çapında oldukça yaygın olarak görülmekte ve ciddi ekonomik kayıplara yol açması nedeni ile yetiştiricilik yönünden büyük önem taşımaktadır.

Çoğunlukla subklinik olarak seyreden hastalığın dünya çapındaki yayılımı, sığır popülasyonlarındaki prevalansı ve sığır endüstrisi üzerindeki önemli etkileri nedeni ile birçok ülke hastalığın kontrol ve eradikasyonu çalışmalarını yoğun bir şekilde sürdürmektedir.

Araştırmada, BoHV-1 enfeksiyonunun varlığının ve olası rekürrensilerin önceki bir

çalışmada tesbit edildiği bir süt sığırcılığı işletmesindeki hayvanlara ait serum örneklerinde, IgG antikor aviditesinin araştırılması ve böylelikle mevcut antikorların kaynağının primer enfeksiyon mu yoksa bir reenfeksiyon veya reaktivasyon mu olduğunun belirlenmesi amaçlanmıştır. Bunun yanısıra BoHV-1 enfeksiyonlarında antikor aviditesinin ölçülmesinin pratikte getirebileceği diyagnostik avantajların araştırılması hedeflenmiştir.

BoHV-1 enfeksiyonun başlangıç döneminde ve ilerleyen dönemlerindeki antikor düzeyleri

ile aviditelerini ayrıca primer ve sekonder enfeksiyonlar ile reaktivasyonların antikor aviditesinde oluşturduğu değişimleri belirlemek için BoHV-1 IgG avidite ELISA tekniğinin kullanılabileceği ayrıca, indirekt ELISA testi kullanılarak geliştirilen IgG avidite testinin longitudinal çalışmalar veya taramalarda, primer ve tekrarlayan virus enfeksiyonlarının veya viruslara karşı yapılan aşılamalardan sonra bağışık yanıtın sorgulanması amacıyla kullanılabilecek uygun bir araç olduğu sonucuna varılmıştır.

Doktora eğitimim ve tez çalışmam süresince yardım ve desteklerini esirgemeyen, bilgi ve

tecrübelerinden yararlandığım danışman hocam Sayın Prof. Dr. Yılmaz AKÇA’ya, eğitimim süresince bilgi ve önerilerinden yararlandığım Ankara Üniversitesi Viroloji Anabilim Dalı Başkanı Sayın Prof. Dr. İbrahim BURGU’ya, eğitimim ve tez çalışmam süresince her konuda bana destek ve yardımcı olan Sayın Prof. Dr. Feray ALKAN’a, çalışmalarımın tüm aşamalarında beni destekleyen, değerli önerileri ile bana yön veren Sayın Prof. Dr. Aykut ÖZKUL’a, bana her konuda sonsuz destek ve yardımcı olan Sayın Doç. Dr. Seval BİLGE DAĞALP’e, tez izleme komitesindeki olumlu katkılarıyla Sayın Prof. Dr. Jale PARACIKOĞLU’na ve Sayın Doç. Dr. Mehmet ÇABALAR’a, eğitimim sırasında birlikte çalıştığım tüm Araştırma Görevlisi ve Doktor arkadaşlarıma, bu çalışma için materyal sağlamakta yardımcı olan Saray Halı Tarım İşletmesi Veteriner Hekimi Vet. Hek. İsmail KOCAER’e, çalışmamda yardımlarını esirgemeyen Şap Enstitüsü Teşhis Bölüm Başkanı Uzm. Vet. Hek. Naci BULUT’a ve Şap Enstitüsü çalışanlarına ve tüm eğitim hayatım boyunca verdikleri sonsuz maddi ve manevi destekten dolayı sevgili aileme teşekkürü bir borç bilirim.

vii

SİMGELER VE KISALTMALAR

A.I. : Avidite İndeksi BoHV-1 : Bovine Herpesvirus Tip-1 BVDV : Bovine Viral Diarrhoea Virus CPE : Sitopatolojik Etki DNA : Deoksiribonükleik asit DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay FDS : Fötal Dana Serumu H2O2 : Hidrojen Peroksit H2SO4 : Sülfirik Asit IBR : Infectious Bovine Rhinotracheitis IPB : Infectious Pustular Balanopostitis IPV : Infectious Pustular Vulvovaginitis Ig : İmmunglobulin IFT : İmmun Florasan Tekniği M : Molar MDBK : Madin Darby Bovine Kidney mg : Miligram mL : Mililitre µg : Mikrogram µl : Mikrolitre moi : Multiplicity of Infection nm : Nanometre NK : Natural Killer Hücreleri O.D. : Optik Dansite O.F.D. : Ortofenilen Diamin PBS : Phosphate Buffered Saline PDFA : Primer Dana Fötal Akciğer PK-15 : Pig Kidney-15 PMN : Polymorfonükleer Nötrofiller PZR : Polimeraz Zincir Reaksiyonu rpm : Roll per minute (Devir/Dakika) SD : Standart Sapma SNT : Serum Nötralizasyon Testi SN50 : Serum Nötralizasyon 50

viii

ŞEKİLLER

Şekil 2.1. : ELISA testinin uygulanma aşamaları 30 Şekil 3.1. : Şekil 3.1 1/600 antijen sulandırması sabit tutularak pozitif ve negatif serumların sulandırmaları 46 Şekil 3.2. : 1/50 pozitif ve negatif serum sulandırmaları sabit tutularak antijenin bir seri sulandırılması sonucu elde edilen O.D. ortalamaları 47 Şekil 3.3. : 1/200, 1/400, 1/600 ve 1/800 oranında antijen

sulandırmalarına karşılık pozitif kontrol serumun 1/50, 1/75 ve 1/100 oranında sulandırılması 51 Şekil 3.4. : 1/200, 1/400, 1/600 ve 1/800 oranında antijen sulandırmalarına karşılık negatif kontrol serumun 1/50, 1/75 ve 1/100 oranında sulandırılması 51 Şekil 3.5. : Örneklemelere göre ortalama A.I.(%) ve O.D. değerleri 54 Şekil 3.6. : Bazı bireylere (3015, 3083, 3040, 3012 ve 3021 kulak no’lu hayvanlar) ait SN50 ve A.I. (%) değerleri 70

ix

ÇİZELGELER

Çizelge 2.1.: Yapılan örneklemelerde hayvanlardan alınan ve mevcut olan serum numunelerinin tarihleri ve örneklemelere göre sayısal dağılımları 27 Çizelge 2.2.: Tüm örneklemeler, ilk 6 örnekleme, son 6 örnekleme ve ilk 4 örneklemede bulunan hayvanların kulak numaraları 28 Çizelge 2.3.: ELISA optimizasyonunda kullanılan 11 basamak antijen sulandırmaları 32 Çizelge 2.4.: ELISA optimizasyonunda kullanılan 8 basamak serum sulandırmaları 32 Çizelge 2.5.: ELISA optimizasyonu için 1/600 antijen sulandırma oranı sabit tutularak pozitif ve negatif serumların sulandırılması 35 Çizelge 2.6.: ELISA optimizasyonu için 1/50 serum sulandırma oranı sabit tutularak antijenin sulandırılması 35 Çizelge 2.7.: Antijenin 1/200, 1/400, 1/600 ve 1/800 oranında sulandırmalarına karşılık pozitif ve negatif kontrol serumun 1/50, 1/75 ve 1/100 oranında sulandırmaları 38 Çizelge 3.1.: Antijen ve pozitif kontrol serum checker-board titrasyonlarına ait O.D. değerleri 42 Çizelge 3.2.: Konjugat ilave edilmeden (1-3) ve ilave edilerek (4-6) elde edilen O.D. değerleri 43 Çizelge 3.3.: Tablet 1, 1/600 antijen sulandırması sabit tutularak pozitif ve negatif serumların sulandırılması sonucu elde edilen O.D. değerleri 45 Çizelge 3.4.: Tablet 2, 1/50 pozitif ve negatif serum sulandırmaları sabit tutularak antijenin sulandırılması sonucu elde edilen O.D. değerleri 45 Çizelge 3.5.: 1/200, 400, 600 ve 800 antijen sulandırmalarına karşılık pozitif ve negatif kontrol serumların 1/50, 1/75 ve 1/100 oranında sulandırılmasıyla elde edilen O.D. değerleri 49 Çizelge 3.6.: Farklı antijen konsantrasyonlarında kontrol serumların 1/50, 1/75 ve 1/100 oranında sulandırılmaları ile elde edilen O.D. Değerleri 50

x

Çizelge 3.7.: Tüm örneklemelerde bulunan serum örneklerinin avidite ELISA testi ile saptanan O.D. ve % A.I. değerleri 52 Çizelge 3.8.: Bütün örneklemelerde bulunan serumlara ait O.D. değerlerinin ortalama ve standart sapmaları 48 Çizelge 3.9.: Tüm örneklemelerde bulunan serumların % A.I. değerlerinin ortanca, minimum ve maksimum değerleri 53 Çizelge 3.10.: Tüm örneklemelerde bulunan serumların logaritmik avidite değerlerinin ortalama ve standart sapmaları 55 Çizelge 3.11.: İlk 6 örneklemede bulunan serum örneklerinin avidite ELISA testi ile saptanan O.D. ve % A.I. değerleri 56 Çizelge 3.12.: İlk 6 örneklemede bulunan serumlara ait O.D. değerlerinin ortalama ve standart sapmaları 57 Çizelge 3.13.: İlk 6 örneklemede bulunan serumların % A.I. değerlerinin ortanca, minimum ve maksimum değerleri 58 Çizelge 3.14.: İlk 6 örneklemede bulunan serumların logaritmik avidite değerlerinin ortalama ve standart sapmaları 58 Çizelge 3.15: Son 6 örneklemede bulunan serum örneklerinin avidite ELISA testi ile saptanan O.D. ve A. I. Değerleri 60 Çizelge 3.16.: Son 6 örneklemede bulunan serumlara ait O.D. değerlerinin ortalama ve standart sapmaları 59 Çizelge 3.17.: Son 6 örneklemede bulunan serumların %A.I. değerlerinin ortanca, minimum ve maksimum değerleri 61 Çizelge 3.18.: Son 6 örneklemede bulunan serumların logaritmik avidite değerlerinin ortalama ve standart sapmaları 61 Çizelge 3.19.: İlk 4 örneklemede bulunan serum örneklerinin avidite ELISA testi ile saptanan O.D. ve A.I. değerleri 63 Çizelge 3.20.: İlk 4 örneklemede bulunan serumlara ait O.D. değerlerinin ortalamaları ve standart sapmaları 62 Çizelge 3.21.: İlk 4 örneklemede bulunan serumların % A.I. değerlerinin ortanca, minimum ve maksimum değerleri 64 Çizelge 3.22.: İlk 4 örneklemede bulunan serumların logaritmik avidite değerlerinin ortalama ve standart sapmaları 64

xi

Çizelge 3.23.: Tüm örneklemelerde mevcut olan 21 hayvana ait serum örneklerinin %A.I. değerlerinin sayısal ve % dağılımları 65 Çizelge 3.24.: İlk 6 örneklemede mevcut olan 16 hayvana ait serum örneklerinin %A.I. değerlerinin sayısal ve % dağılımları 66 Çizelge 3.25.: Son 6 örneklemede mevcut olan 21 hayvana ait serum örneklerinin %A.I. değerlerinin sayısal ve % dağılımları 66 Çizelge 3.26.: İlk 4 örneklemede mevcut olan 13 hayvana ait serum örneklerinin %A.I. değerlerinin sayısal ve % dağılımları 67 Çizelge 3.27.: Bazı bireylere ait SN50 ve A. I. (%) değerleri 68

xii

RESİMLER

Resim 3.1.: 1/600 antijen sulandırması sabit tutularak pozitif ve negatif serumların sulandırılması ile yapılan ELISA sonucunda oluşan renk dağılımı 46 Resim 3.2.: 1/50 pozitif ve negatif serum sulandırmaları sabit tutulup antijenin sulandırılması ile yapılan ELISA testi sonucunda oluşan renk dağılımı 47

1

1. GİRİŞ

Bovine Herpesvirus Tip-1 (BoHV-1), sığırlarda Infectious Bovine Rhinotracheitis

(IBR) ve Infectious Pustular Vulvovaginitis/Balanopostitis (IPV/IPB) olarak bilinen

ve dünya çapında oldukça yaygın olarak görülen hastalıkların etiyolojik ajanıdır

(Wyler ve ark., 1989).

Etkenin meydana getirdiği akut enfeksiyonda genellikle konjuktivitis,

tracheitis ve üst solunum yolları enfeksiyonu görülmekte, sekonder bakteriyel

enfeksiyonların komplikasyonunda ise bronkopnöymoniler gelişebilmektedir.

Genital sistem etkilendiğinde ise abortlar, repeat breeding (döl tutmama), embriyonal

ölümler gibi fertilite problemleri ve mastitis şekillenebilmektedir (Straub, 1991).

Virus, aynı zamanda, özellikle genç danalarda, Bovine viral diarrhoea virus

(BVD), Parainfluenza-3 virus (PI-3) veya Bovine respiratory syncytial virus (BRSV)

ve Mannheimia haemolytica veya Pasteurella multocida gibi bakterilerle beraber

‘Sığır Solunum Hastalıkları Kompleksi’ ne neden olmaktadır (Yates 1982).

Çoğunlukla subklinik olarak seyreden hastalık, dünyada oldukça yaygın

düzeyde bulunmaktadır. BoHV-1’in dünya çapındaki yayılımı, sığır

popülasyonlarındaki prevalansı ve sığır endüstrisi üzerindeki önemli etkileri, etkeni,

sığır yetiştiricilerinin üzerinde durması gereken en önemli enfeksiyöz ajanlardan biri

konumuna getirmiştir. Enfeksiyona bağlı olarak oluşan ekonomik kayıplar da dikkate

alınarak birçok ülke hastalığın kontrol ve eradikasyonu çalışmalarını yoğun bir

şekilde sürdürmektedir (Straub, 1990).

2

1.1. BoHV-1 Enfeksiyonu

1.1.1. Etiyoloji

Etken, Herpesviridae familyası içinde yer alan Alfaherpesvirinae altfamilyasına bağlı

varicellovirus genusu içerisinde Bovine Herpesvirus-1 (BoHV-1) olarak

sınıflandırılmıştır (Fenner ve ark. 1987). BoHV-1 suşları, viral DNA’daki

farklılıkların restriksiyon endonükleaz enzim kesimleri veya polimeraz zincir

reaksiyonu ile analizine dayanarak, BoHV-1.1, BoHV-1.2a ve BoHV-1.2b olmak

üzere üç alt tipe ayrılmaktadır (Metzler ve ark., 1985; Engels ve ark., 1986; Rijsewijk

ve ark., 1999).

BoHV-1, genetik materyal olarak yaklaşık 136 kilobaz (kb) büyüklüğünde,

çift iplikçikli ve linear yapıda DNA genomu içermektedir (Fenner ve ark., 1987).

Genom, yaklaşık 100 nm çapında ve 162 kapsomerden oluşan ikozahedral bir kapsid

ile çevrilmiştir. Nükleokapsid, tegümen adı verilen elektrondens bir materyal ile

sarılmıştır. En dışta ise viral glikoproteinleri içeren tek katmanlı bir zar

bulunmaktadır (Wyler ve ark., 1989).

Yapılan çalışmalar neticesinde, BoHV-1 virionunun, 10 tanesi zarda bulunan

glikoproteinler olmak üzere kapsid ve tegümende bulunan yapısal ve yapısal

olmayan yaklaşık 69 adet protein içerdiği tespit edilmiştir. Bunlardan özellikle zarda

bulunan glikoproteinler (gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gK, gL, gM), immun sistemin

aktivasyonu, konak hücreye adsorbsiyon ve penetrasyon, hücreden hücreye yayılma

gibi fonksiyonlara sahiptirler. Bunların dışında, bazı enzimler (ribonükleotid

redüktaz, DNA polimeraz gibi) ve bir grup düzenleyici protein (BICP0, 4, 22, 27 ve

αTIF) bulunmaktadır (Schwyzer ve Ackermann, 1996).

BoHV-1 virusu, 63°C nin üzerindeki ısılarda hızla inaktive olurken, 4°C de

çok yavaş inaktive olmaktadır. 37°C de yaklaşık 10 gün canlı kalabilmekte, -20°C de

en az bir yıl enfektivitesini korumakta, -65°C nin altında ise stabil kalmaktadır

(Straub, 1990). Fenner ve ark (1987), virusun dondurulmuş spermada bulunma

3

olasılığını ve bu durumun hastalıkla mücadelede dikkat edilmesi gereken önemli bir

konu olduğunu belirtmişlerdir.

Çapraz nötralizasyon testleri, BoHV-1 izolatlarının serolojik olarak tek tip

olduğunu göstermiştir. Aynı zamanda CapHV-1 ile BoHV-1 arasında yakın antijenik

ilişki gözlenmiştir (Wyler ve ark., 1989). Bunun dışında Equine Herpes Virus-1

(EHV-1) ile BoHV-1’in antijenik olarak yakın ilişkili olduğu da bildirilmiştir

(McKercker, 1973). Etkenin referens suşu IBR/Colorado BoHV-1/Cooper

varyantıdır (Fenner ve ark., 1987).

Diğer herpesviruslarda olduğu gibi, BoHV-1 de konakçı hücreye füzyon yolu

ile penatre olur. Replikasyon nükleus içerisinde meydana gelir ve yeni oluşan

nükleokapsitler zarlarını nüklear membranın iç lamelinden, sitoplazmik

membranlardan veya plazma membranından alırlar. BoHV-1’e, doğal konakçısı olan

sığırların dışında, gelincik, vizon ve tavşanlar da duyarlı olup deneysel çalışmalarda

yaygın olarak kullanılmaktadırlar (Wyler ve ark., 1989). Virusun fare, sıçan, kobay

ve tavuk embryolarını enfekte etmediği tespit edilmiştir (Gibbs ve Rweyemamu,

1977). Bununla birlikte, interferon reseptörleri olmayan farenin periton boşluğuna

virusun enjekte edilmesiyle enfeksiyon şekillenmiştir (Abril ve ark., 2004). Virusun

üretilmesinde; sığır orijinli primer hücre kültürleri (böbrek, testis, akciğer), Madin

Darby Bovine Kidney (MDBK), Bovine Turbinata (BT), RK-13 ve Mink Lung (ML)

hücre kültürleri kullanılmaktadır. Virus, bu hücre kültürlerinde yuvarlaklaşma ve

lizis odakları ile karakterize sitopatik effekt (cpe) oluşturarak üremektedir (Wyler ve

ark., 1989).

1.1.2. Epidemiyoloji

BoHV-1 enfeksiyonlarının tüm dünyada yaygın olarak bulunduğu, antikor prevalans

çalışmaları ile gösterilmiştir (McKercker, 1973). Diğer alfaherpesviruslarda olduğu

gibi, BoHV-1 de sınırlı konakçı spektrumuna sahiptir ve tür bariyerlerini genellikle

geçememektedir (Brake ve Studdert, 1985).

4

BoHV-1’in bulaşması, enfekte hayvanla direkt temas veya indirekt olarak

çeşitli mekanik vektörlerle olmaktadır. Direkt bulaşmada enfekte hayvana ait burun,

göz ve boğaz akıntıları (Fenner ve ark., 1987; Miller, 1991), gaita (Miller, 1991),

vajinal salgı ve sperma (Deas ve Johnston, 1973), süt (Probst ve ark., 1983) gibi

sekret ve ekskretler önemli rol oynamaktadır. Gibbs ve Rweyemamu (1977),

enfeksiyöz virusun, akut solunum enfeksiyonu sırasında 10-14 gün boyunca

saçıldığını bildirmişlerdir. Kontamine materyaller ve sperma ile virusun bulaştığı

tespit edilmiştir (Mars ve ark., 2000a,b).

Enfeksiyonun bulaşmasında önemli rol oynayan bir diğer faktör latent enfekte

hayvanlardır. Latent enfekte hayvanlarda virus stres, doğum, nakil, aşlama ve

kortikosteroidlerin uygulanması sonucunda yeniden aktive olarak saçılmaya başlar.

Sonuçta, virusun duyarlı hayvanlara geçişine neden olurlar. Akut, subklinik veya

latent enfekte boğalara ait sperma, sıvı azot ortamında saklandığında virus sperma

içerisinde muhafaza olduğundan suni tohumlama yoluyla enfeksiyonun yayılmasına

neden olmaktadır (Wyler ve ark., 1989; Engels ve Ackerman, 1996).

Sığırlar BoHV-1’in doğal konakçısı durumundadırlar (Gibbs ve Rweyemamu,

1977). Bununla birlikte yapılan araştırmalarda vahşi hayvanlarda da hastalığa karşı

antikor oluştuğu tespit edilmiş, ancak belirgin klinik semptomların sadece sığırlarda

geliştiği gözlenmiştir (Straub, 1990). Metzler ve ark. (1990) asya fillerinde BoHV-

1’e karşı antikor tespit etmiş, ancak hastalık ile sonuçlanan BoHV-1 enfeksiyonu

saptayamamıştır. BoHV-1, hastalık belirtileri olmadan antilop, gelincik ve

vizonlardan izole edilmiştir (Porter ve ark., 1975). Kuzey Amerika, Avustralya ve

Avrupa’da yapılan serolojik araştırmalar diğer bazı vahşi ruminantlarda da BoHV-1

spesifik antikor varlığını ortaya koymuştur (Ackerman ve ark., 1986).

Diğer yandan, BoHV-1’in koyun ve keçileri enfekte ederek hastalığa sebep

olduğu bildirilmiştir (Whetstone ve Evermann, 1988). Ackermann ve ark. (1986)

BoHV-1 enfeksiyonunun keçilerde nadir olarak görüldüğünü ve bu enfeksiyonun

reaktivasyonunun kolay şekillenmediğini göstermişlerdir.

5

Taylor ve ark. (1982), yumuşak kabuklu keneden (Ornithodoros coriaceus)

BoHV-1 izole etmiştir. Ancak, kenelerin virus bulaşmasındaki rolü henüz netlik

kazanmamıştır. Yüz sineklerinin (Musca autumnalis), enfekte hayvanlardan

beslendikten sonra virusu taşıdıkları fakat bulaşmada rol oynamadıkları bildirilmiştir

(Johnson ve ark., 1991).

1.1.3. Patogenez ve Patoloji

BoHV-1’in organizmaya ilk giriş yerleri nazal kavite, oropharynx, göz, genital

kanaldır. Primer enfeksiyon sonrasında ilk çoğalma, giriş noktasındaki epitel

hücrelerde meydana gelmektedir. Bu noktadan itibaren gelişen enfeksiyonun 3

muhtemel seyri bildirilmektedir; lokal olarak sınırlanma, viremi ile sistemik yayılım

ve nöronal yayılım. Lokal alanlardaki sınırlı enfeksiyon çoğunlukla üst solunum

yolu, göz (IBR) ve genital (IPV/IPB) dokulardaki viral invazyondan sonra meydana

gelmektedir. Hastalık semptomları temelde virus replikasyonuna bağlı olarak enfekte

hücrelerin hasarı ile ilişkili olmaktadır. İmmun yanıt neticesinde bu tip enfeksiyonlar

sınırlı kalmakta ve çoğunlukla bir iki hafta içerisinde iyileşme meydana gelmektedir.

Viremi aracılığıyla sistemik yayılım, BoHV-1 enfeksiyonlarında karşılaşılan abort

veya enteritis olaylarına neden olmaktadır (Engels ve Ackerman, 1996).

BoHV-1 enfeksiyonunda viremiyi inceleyerek, Nyaga ve McKercher (1980)

BoHV-1’in kan monositlerini enfekte ettiğini, sınırlı virus replikasyonu ve saçılımın

mümkün olduğunu göstermişlerdir. Araştırıcılar aynı zamanda, nötralizan

antikorların bulunmadığı dönemde BoHV-1’in lenfositlere adsorbe olabildiğini ve bu

şekilde yayıldığını göstermişlerdir. Genel bir kural olarak, lenfosit bağımlı viremiyi

takiben virusun sistemik yayılımı, lenf nodüllerine yerleşmesi ile sonuçlanmaktadır.

BoHV-1 replikasyonu enfeksiyonun ilk iki saati içerisinde başlar (Meurens ve

ark., 2004). Hücre yüzeyinde antijen ekspresyonu enfeksiyondan 3-4 saat sonra

şekillenir ve virusun hücre dışına çıkması ve yayılma enfeksiyondan 8 saat sonra

gerçekleşir (Babiuk ve ark., 1996).

6

Virus, vücuda giriş yerindeki primer replikasyon sırasında lokal sinir

hücrelerinin aksonlarına invaze olabilmekte, daha sonra intra-aksonal yayılım ile

bölgesel gangliyonlardaki nöronlara ulaşmakta ve latentlik şekillenmektedir (Engels

ve Ackerman, 1996).

BoHV-1 ile merkezi sinir sisteminin enfeksiyonunun aksonal yayılım yoluyla

mı, yoksa viremi ile mi gerçekleştiği henüz kesin olarak bilinmemektedir. Viremi ile

yayılımda virus kan-beyin bariyerine geçer ve bu durum BoHV-1 nedeniyle oluşan

ensefalitlerin neden sadece sporadik olarak oluştuğunu ve deneysel olarak

oluşturmanın güç olduğunu açıklayabilmektedir. (McKercher ve ark., 1970).

Zar glikoproteinleri viral tutunma, penetrasyon ve hücreden hücreye

yayılımda görev almaktadırlar. Glikoprotein C (gC) hücre yüzeyindeki heparan sülfat

proteoglikanlarına bağlanmak suretiyle hücreye tutunmakta, ikinci bir hücresel

reseptöre glikoprotein D’nin (gD) bağlanması ile viral giriş şekillenmektedir (Karger

ve ark., 1995; Thaker ve ark., 1994).

Virusun hücreye girişi ve viral zarın hücre membranı ile füzyonu gB, gH,

gL’nin etkileşimleri sonucu gerçekleşmektedir. Glikoproteinler, virusun virulensinde

rol oynarken in vitro ve in vivo koşullarda virus replikasyonu için esansiyel

değildirler (Schwyzer ve Ackerman, 1996). BoHV-1’in gE gen bölgesi

çıkartıldığında, vahşi tip virus ile aynı bölgedeki dokular enfekte olmaktadır ancak

enfeksiyon daha kısa sürmektedir (Van Engelenburg ve ark., 1994). Bu durum,

gE’nin hücreden hücreye yayılımındaki fonksiyonunu yansıtmaktadır.

Bütün herpesviruslar gibi BoHV-1 de latent enfeksiyon oluşturabilmektedir.

Latentlik, enfeksiyöz virusun izole edilememesi ve latent enfekte hücrelerde viral

antijenin tespit edilememesi ile karakterizedir. BoHV-1 ile meydana gelen primer

enfeksiyon sonrasında, etkenin organizmada oluşan kendisine ilgili immun yanıttan

kaçabilmek için öncelikle merkezi sinir sistemi ve buna ilgili gangliyonlar (Engels ve

7

Ackerman, 1996) ve daha nadiren lenfoid doku, makrofajlar, epitel hücreleri ve

olfaktör bulbus da (Wyler ve ark., 1989) saklanmasıdır.

Ackermann ve ark. (1982) viral DNA’yı, in situ hibridizasyon ile lokal sensör

ganglionlarda tespit etmişlerdir. Latentliğin diğer bölgeleri olan lenf nodülleri ve

nazal mukozada BoHV-1 genomu, PCR ile tespit edilmiştir (Van Engelenburg ve

ark., 1994). Attenüe canlı aşılar ve mutant suşları (ısıya duyarlı ve timidin kinaz

negatif mutantlar) da dahil olmak üzere tüm BoHV-1 suşlarının latentlik

oluşturabildiği bildirilmiştir (Wyler ve ark., 1989; Engels ve Ackerman, 1996).

Latentliğin oluşumu için en az iki koşulun yerine getirilmesi gerekmektedir;

birincisi, nöronlar veya lenfoid hücreler gibi uzun yaşam süreli, replike olmayan ve

yüksek derecede farklılaşmış hücreler, latentlik sırasında virusun yerleşmesi için

idealdir. İkincisi, üretken enfeksiyon ve perifer dokularda replikasyonda görülenin

aksine latent enfekte hücreler yıkımlanmamalıdır. Bu sebeple, apoptozun

indüklenmesi ve immun mekanizmalar tarafından yıkımlama önlenmelidir. Ayrıca,

latentlik sırasında viral protein sentezi olmamalı veya protein immun sistem

tarafından tolare edilebilmelidir. Prodüktif viral replikasyon erken dönemde

kesilmelidir. Latent enfekte hücrelerde sınırlı bir viral transkripsiyon tespit edilmiş

ve latentlik bağımlı transkriptlerin (LAT) oluştuğu bildirilmiştir (Engels ve

Ackerman, 1996).

Latent virus immun bireyde uzun süre bulunmakta ve reaktivasyon ile tekrar

etkin duruma geçmektedir. Stres faktörleri veya deneysel kortikosteroid uygulaması

gibi çeşitli uyarılar latentlikten reaktivasyona sebep olmaktadır. Latentlik

bölgelerinde yeni virus sentezlenmekte ve tekrar saçılım gerçekleşmektedir. BoHV-1

enfeksiyonunda, reaktive olan virus intra-aksonal olarak organizmaya ilk giriş yerine

geri gelerek sekonder lezyonları oluşturmasıyla rekürrent (tekrarlayan) enfeksiyonlar

meydana gelmekte ve virus diğer duyarlı konaklara saçılmaktadır (Engels ve

Ackerman, 1996). Thiry ve ark (1987) transport stresinin viral reaktivasyona neden

olduğunu ve transport sonrası 1-4 gün virus saçılımı olduğunu bildirmişlerdir.

8

Reaktivasyonun etkinliğinde sadece virus değil aynı zamanda konakçı da

önemli rol oynamaktadır. Örneğin, kortikosteroid uygulamaları ile BoHV-1 ile latent

enfekte sığırlardan virusu reaktive etmek oldukça kolay olmaktadır ancak, yüksek

dozlarda kortikosteroid uygulansa bile, aynı virus keçilerden reaktive edilememiştir

(Ackermann ve ark., 1986).

Kaashoek ve ark. (1996) primer BoHV-1 enfeksiyonunu takiben oluşan

immun yanıtın takibi ve olası reaktivasyonları deneysel şartlarda araştırmışlardır.

Araştırıcılar 3 yıl boyunca takip ettikleri hayvanlarda BoHV-1 e karşı yüksek

düzeyde antikorun tespit edilebildiğini ve olası bir reaktivasyondan sonra nötralizan

antikor yanıtının 4 kat artabileceğini bildirmişlerdir. Antikor yanıtı olmaksızın da

reaktivasyon görülebileceği bildirilmesine rağmen elde edilen bulgular,

reaktivasyona uğrayan virusun izole edilebileceği ya da trigeminal gangliyonda

DNA’sının tespit edilebileceği yönündedir.

Hage ve ark. (1996) bir süt sığırcılığı işletmesinde BoHV-1 enfeksiyonunun

popülasyon dinamiğinin tespiti için yaptıkları çalışmada, sadece 3 seropozitif

hayvanın dekzametazon ile immunsupresyonu neticesinde sürü içindeki tüm

seronegatif hayvanların seropozitif duruma geçtiğini ve antikor yanıtına sahip

hayvanlarda önemli titre artışlarının olduğunu tespit etmişlerdir. Ayrıca bu

araştırmada incelenen sürünün BoHV-1 yönünden popülasyon dinamiği

çıkartılmıştır. Bu sonuca göre BoHV-1’in sürü içindeki dolaşımı immunsupresyonu

izleyen 5. günde başlayıp yaklaşık 49. gün civarında tamamlanmıştır. Aynı dönem

süresince seronegatif ve seropozitif hayvan sayıları 3-4. haftadan itibaren değişerek

7. hafta sonunda tüm hayvanların seropozitifliğe ulaşmasıyla tamamlanmıştır. Bu

veriler ışığında BoHV-1 enfeksiyonunun seyir süresi en az 7 hafta olarak

bildirilmiştir.

Genç sığırlar, maternal antikorların varlığında latent enfekte olabilmekte ve

enfeksiyona bağlı antikor yanıtı göstermektedirler (Scahw, 2000). BoHV-1’in canlı

aşı suşlarının inokülasyonu latent enfeksiyona neden olabilmektedir (Kit ve ark.,

1985).

9

1.1.4. Klinik Bulgular

BoHV-1’in sığırlarda oluşturduğu hastalığın şiddeti, virusun suşuna ve alt tipine

bağlı olmaktadır. Akut hastalıktaki klinik belirtilere, BoHV-1 ile enfekte hücrelerin

yıkımı sebep olmaktadır (Engels ve Ackermann, 1996). Virusun konak hücreye

bağlanması, programlanmış konak hücre ölümünü (apoptosis) tetiklemektedir

(Lovato ve ark., 2003).

BoHV-1 enfeksiyonu sığırlarda, reprodüktif problemlere, solunum sistemi,

santral sinir sistemi ve deri hastalıklarına, enterik ve neonatal hastalıklara neden

olabilmektedir (Gibbs ve Rweyemamu, 1977; Biuk-Rudan ve ark., 1999; Kahrs,

2001). Ayrıca Wellenberg ve ark. (2001), virusun deneysel şartlarda mastitise neden

olabildiğini bildirmişlerdir.

IBR, beden ısısı artışı (40,5-42°C), solunum sayısında artış, kuru öksürük,

anoreksi, depresyon ve sütçü ineklerde süt üretiminde ciddi bir düşüş ve zayıflama

ile karakterizedir. Bir veya iki gün içerisinde bilateral, berrak bir nazal akıntı gelişir

ve nazal mukozada hiperemik bir görüntü (kırmızı burun) şekillenir (Kahrs, 1977).

Bazı hayvanlarda IBR enfeksiyonu sırasında uni veya bilateral bir konjuktivitis ve

hastalığın ilerleyişine bağlı olarak berraktan mukopurulente kadar değişebilen bir

okuler sekresyon bildirilmiştir (Rebhun ve ark., 1978). Hastalığın akut fazı genellikle

5-10 gün sürmekte ve hayvanlar bu sürenin sonunda genellikle iyileşmektedirler.

Hastalıktan etkilenen hayvanların yaklaşık %10’unda sekonder enfeksiyonlar ile

komplikasyon olabilmekte ve sonuçta ölüm şekillenebilmektedir (Wyler ve ark.,

1989).

BoHV-1, stres, bazı viral (BVD, PI-3, BRSV) ve bakteriyel (Mannheimia

haemolytica veya Pasteurella multocida) ajanlarla birlikte Sığır Solunum Hastalıkları

Kompleksini (BRD) oluşturmaktadır (Yates, 1982). BoHV-1, immunsupresyona

sebep olmak suretiyle hastalığı başlatabilmekte (Winkler ve ark., 1999; Lovato ve

10

ark., 2003) ve sekonder enfeksiyonlara predispozisyon yaratarak şiddetli pnömoni ve

ölüme neden olmaktadır (Hanon ve ark., 1998; Lovato ve ark., 2003).

Infectious Pustular Vulvovaginitis (IPV) ve Balanopostitis (IPB) dişi ve erkek

hayvanlarda çiftleşmeden yaklaşık 1-3 gün sonra gözlenmekte ve genellikle ağrılı bir

yangıya yol açmaktadır. Vulva ödematöz ve hiperemiktir, mukozal yüzeye yayılmış

küçük püstüller görülmektedir. Hastalığın akut fazı 2-4 gün içerisinde sona ermekte

ve lezyonlar hastalığın başlamasından yaklaşık 10-14 gün içerisinde iyileşmektedir

(Gibbs ve Rweyemamu, 1977).

BoHV-1 ile enfeksiyon, tek başına sağlıklı erişkin sığırlarda ölüme neden

olmamaktadır (Kahrs, 2001). Ancak, virus gebe ineklerin genital enfeksiyonunu

takiben fötal enfeksiyon, viremi, ölüm ve abortlara neden olabilmektedir (Gibbs ve

Rweyemamu, 1977; Kahrs, 2001). Enfeksiyonun gebe ineklerin bulunduğu bir

sürüde geliştiği durumlarda, 3-6 haftalık inkübasyon süresini takiben özellikle

gebeliğin 5-8. aylarındaki hayvanlarda abortlar meydana gelebilmekte ve bu durum

gebe ineklerin yaklaşık %25’inde gözlenebilmektedir (Wyler ve ark., 1989). Yeni

doğanların maternal antikor alamadığı durumlarda, ölümle sonuçlanan şiddetli

enfeksiyon tablosu oluşabilmektedir (Mechor ve ark., 1987).

1.1.5. İmmunoloji

Birçok viral enfeksiyonda olduğu gibi, BoHV-1’e karşı oluşan immun yanıt,

enfeksiyonun oluşmasını önleyen (humoral) ve iyileşmeye yardımcı olan (selüler ve

humoral) immun yanıt olarak ikiye ayrılır. Bağışıklık düzeyi hastalık tablosunun

seyrine, hastalığın genel veya lokal oluşmasına göre değişmektedir. Genel

enfeksiyonlardan sonra kazanılan bağışıklığın süresi uzun olmasına rağmen, lokal

enfeksiyonlarda bu sürenin çok daha kısa olduğu ortaya konulmuştur (Babiuk ve

ark., 1996). Aynı zamanda, B- ve T-hücreleri tarafından kontrol edilen spesifik

yanıtlar ve polimorfnükleer nötrofiller (PMN), makrofajlar ve NK (natural killer)

hücreleri, interferon, komplement ve diğer faktörler tarafından kontrol edilen spesifik

11

olmayan immun yanıt solunum epiteline virusun tutunmasını sınırlamaktadır (Denis

ve ark., 1994). Bu mekanizmaların herbirinin önemi, enfeksiyonun primer

enfeksiyon veya antikor ve bellek hücrelerinin önceden varolduğu sekonder

enfeksiyon oluşuna bağlı olarak değişmektedir (Babiuk ve ark., 1996).

İlk enfeksiyonun ardından viral protein sentezi, konağın nonspesifik immun

yanıtını uyaran bir seri olayı başlatır. Primer enfeksiyonu takiben, virus intraselüler

olarak hücreden dışarı çıkmadan yayılır ve antikorlar tarafından nötralize edilemez.

Antikor varlığında virus intraselüler olarak yayılabildiği için, antikor varlığı

hücreden hücreye yayılımı önlemekte yetersiz kalır. Ancak sekonder enfeksiyonlarda

veya reaktivasyonun ardından viral tutunmanın antikorlar tarafından inhibisyonu

virus enfektivitesi ve yayılımı üzerinde önemli etkiye sahiptir (Babiuk ve ark., 1996).

Sonuçta, primer enfeksiyon için antikorlar hücresel immuniteye göre daha az öneme

sahiptir. Bunun aksine sekonder enfeksiyonlarda antikorlar enfeksiyonu önlemede ve

virusun temizlenmesinde hücresel immuniteye göre daha önemlidir (Babiuk ve ark.,

1996).

BoHV-1 ile primer enfeksiyonda güçlü humoral ve hücresel immun yanıt

oluşur. Hücresel immun yanıt enfeksiyon sonrası yaklaşık 5. günde ilk kez tespit

edilir ve yaklaşık 8-10 günde en yüksek seviyeye ulaşır. Nötralizan antikorlar, IgM

ve bunu takiben IgG sınıfı, genellikle enfeksiyon sonrası 10.gün civarında tespit

edilir. BoHV-1 enfeksiyonunu takiben nazal ve genital salgılarda nötralizan IgA da

bulunabilir. Nötralizan antikorların hücre dışı virusu elimine edebilmelerine rağmen,

hücresel immun yanıtın hastalığın iyileşmesinde etkili olduğu belirtilmiştir (Wyler ve

ark., 1989; Scott, 1989; Straub, 1990; Babiuk ve ark., 1996).

Sistemik humoral immun yanıtta öncelikle IgG ve IgM türünden antikorlar

görev alır. BoHV-1’e karşı gelişen antikorların üretiminin enfeksiyondan sonraki

yaklaşık 7-12. günlerde başladığı ve 5,5 yıl kadar vücutta kaldığı bildirilmiştir

(Chow, 1972; Gibbs ve Rweyemamu, 1977). Bu antikorların 5,5 yıl kadar vücutta

kalabilmesinin arasıra tekrar uyarımların meydana gelmesine bağlı olduğu da

12

bildirilmiştir (Kahrs, 1977). Aşılama sonrasında ise, antikorların 3 yıl süreyle tespit

edilebilir seviyelerde kaldığı gösterilmiştir (Hage ve ark., 1998).

BoHV-1 enfeksiyonunda, gB, gC, gD ve gE glikoproteinlerine karşı üretilen

antikorlar (Tikoo ve ark., 1995), viremi ve buna bağlı gelişen hastalığı önlemektedir

(Mechor ve ark., 1987).

BoHV-1 enfeksiyonlarında oluşan immunitede, lokal olarak nazal ve genital

sekresyonlarda tespit edilebilen IgA sınıfı antikorların da rolü bulunmaktadır

(Ludwig, 1983).

Doğal kazanılmış herpesvirus bağışıklığı hastalığın şiddetini azaltmaktadır.

Fakat bu, latentliğin oluşmasını, tekrarlayan hastalığın veya reenfeksiyonun

gelişmesini engellememektedir (Aynı virus suşu ile otoinokulasyon yapılsa bile). Bu,

virusa tekrar maruz kalmada herpesvirus spesifik T hücresi cevabının geçici ters-

düzenlenmesine bağlıdır (Lemaire ve ark, 2000). BoHV-1 gC bölgesi üçüncü

komplement bileşenine (C3) bağlanabilmektedir. Bu bağlanma C3 dönüşümünü

engellemekte ve bu durum komplement sisteminin alternatif yolunu bloke etmektedir

(Huemer ve ark., 1993). BoHV-1 enfeksiyonunu takiben MHC sınıf 1 ekspresyonu

azalmaktadır (Hariharan ve ark., 1993). Bu durum viral patogenezde önemli

olmaktadır; çünkü antijen varlığının gösterilememesi virusun sitotoksik lenfositler

tarafından tespit edilememesine neden olmaktadır (Engels ve Ackerman, 1996).

BoHV-1 enfeksiyonunun indüklediği immun yanıt, bir erken spesifik-

olmayan faz ve bir geç herpesvirus spesifik efektör fazı içermektedir. Enfeksiyonun

spesifik-olmayan fazında görev alan ana faktörler NK hücreleri ve/veya

interferondur. Bunlar erken enfeksiyonda görev almakta ve böylelikle enfeksiyonun

büyümesini kısıtlamakta ve virus miktarını azaltmaktadırlar. Humoral ve hücre

aracılı cevaplar spesifik efektör fazda görev alırlar. Herpesvirus spesifik antikorları

enfeksiyondan sonraki 5-10’uncu günde ilk kez gözlenirler ve bunlar uzun süreli

persiste kalırlar. Bir rekürrent (tekrarlayan) hastalık durumunda antikor titreleri,

13

rekürrensi göstermeyenlere oranla daha yüksektir. Bu durum latent virusun reaktive

olma eğilimini açıklamaktadır (Lemaire ve ark. 2000).

BoHV-1’e karşı oluşan humoral immun yanıt, virusun latentliğini

önleyememekte ancak tekrarlayan (rekürrent) enfeksiyonların sıklığını ve saçılan

virus miktarını etkileyebilmektedir (Gregersen ve Wagner, 1985).

Guy ve Potgieter (1985) BoHV-1’in primer ve sekonder inokulasyonu ve

indüklenmiş abort olaylarından sonra antikor oluşum kinetiğini incelemişlerdir. Bu

araştırıcılar IgM ve IgG antikorlarının primer enfeksiyondan 7 gün sonra ortaya

çıktığını bildirmişlerdir. Araştırıcılar ayrıca, gebe olmayan ineklerde maksimum IgG

düzeyine enfeksiyondan 35 gün sonra, gebe olanlarda ise 14 gün sonra ulaşıldığını

belirtmişler ve IgM aktivitesinin ise her iki grupta da enfeksiyondan 14 gün sonra

oluştuğunu ortaya koymuşlardır.

Maternal antikorların, hayvanların 2 aylıkken sütten kesilmesinden sonra 123

gün kadar bulunabildiği bildirilmiştir (Fulton ve ark., 2004). Yeni doğanlar, BoHV-1

enfeksiyonundan, aşılı annelerin kolostrumunu alarak korunabilmekte (Mechor ve

ark., 1987), ancak maternal antikorlar BoHV-1 ile latent enfeksiyonu

önleyememektedirler (Scahw, 2000). Bununla birlikte, IBR-IPV enfeksiyonlarının,

maternal antikor almamış ya da yetersiz almış hayvanlarda çok daha şiddetli

seyrettiği, bunun yanısıra kolostrum alan hayvanların 1-6 ay kadar pasif olarak

korunabildiği tespit edilmiştir (Menanteau-Horta ve ark., 1985).

14

1.1.6. Teşhis

1.1.6.1. Klinik Teşhis

BoHV-1 enfeksiyonlarında belirgin klinik bulgular ve histopatolojik lezyonlar

gözlenebilmekle birlikte, herhangi bir patognomonik bulgu bulunmamaktadır.

Ayrıca, BoHV-1’in sebep olduğu atipik hastalık olguları da tanımlanmıştır (Gibbs ve

Rweyemamu, 1977). Bu nedenle tam bir teşhis, virusun ve spesifik antikorların

tespitine dayanan laboratuvar metotları ile yapılabilmektedir (Wyler ve ark., 1989).

1.1.6.2. Laboratuvar Teşhisi

1.1.6.2.1. Virus İzolasyonu ve Viral Antijen Tespiti

Virus izolasyonu için primer ve sekonder dana böbrek, akciğer ve testis hücreleri,

fötal dana trachea veya turbinata hücreleri ile MDBK gibi devamlı hücre kültürleri

kullanılabilmektedir (Wyler ve ark., 1989). Virusun üremesini takiben monospesifik

BoHV-1 antiserumu kullanılarak yapılan nötralizasyon ile virusun identifikasyonu

mümkün olabilmektedir (Straub, 1987).

Semende BoHV-1’in tespit edilmesi, seminal plazmanın hücre kültürlerine

toksik etkisi ve virus nötralizasyon aktivitesine sahip olması nedeniyle oldukça güç

olmaktadır (Drew ve ark., 1987; Goffaux ve ark., 1976). Semenin hazırlanmasındaki

bazı uyarlamaları içeren birkaç hücre kültürü tekniği bildirilmiştir. Bunlar,

toksisitenin giderilmesi için semenin sulandırılması, adsorbsiyondan sonra fazla

miktarda yıkama ve santrifuj basamaklarını içermektedir (Goffaux ve ark., 1976).

Teşhis için, hücre kültürü uygulamalarına gerek duyulmayan, antijen tespitine

dayalı metotlar geliştirilmiştir. Bunlardan biri, nazal, okuler ve genital swablardan

immunfluoresan teknikleri (IFT) ile direkt antijen tespiti olarak gösterilmiştir (Reed

ve ark., 1971; Terpstra 1979; Slim ve Elazhary, 1983). Bu tekniğin, hızlı bir teşhise

15

olanak vermesi avantajının yanısıra, virus izolasyonuna göre daha az duyarlı olduğu

bildirilmiştir (Edwards ve ark., 1983). Ayrıca, IFT ile test edilecek nazal sürüntülerin

taze olması (Slim ve Elazhary, 1983), mukopurulent veya hemorajik değil de seröz

olması durumunda daha iyi sonuç alındığı bildirilmiştir (Terpstra, 1979).

BoHV-1 teşhisinde kullanılan antijen tespitine dayalı yöntemlerden bir diğeri

de fikse edilmiş akciğer dokularının immunperoksidaz tekniği ile boyanması olarak

bildirilmiştir (Wyler ve ark., 1989).

Viral antijenin direkt ve hızlı tespitinde diğer bir yöntem, enzyme-linked

immunosorbent assay (ELISA) tekniğinin kullanımıdır. Antijen, mikrotabletin

gözlerine kaplanmış monoklonal veya poliklonal antikorlar ile tutulabilmekte, bu

şekilde nazal sürüntülerde BoHV-1 antijeninin tespiti mümkün olabilmektedir

(Collins ve ark., 1988).

1.1.6.2.2. Viral Nükleik Asit Tespiti

Son yıllarda, şüpheli materyallerde BoHV-1 DNA’sının tespiti için DNA-DNA

hibridizasyon ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi birçok yöntem

bildirilmiştir. Rutin teşhiste PCR yöntemi, giderek artan bir kullanım alanı

bulmaktadır (Moore ve ark., 2000). PCR, virus izolasyon yöntemlerine göre daha

duyarlı ve hızlı olmasının yanısıra, latent enfekte gangliyonda viral DNA’nın

tespitine olanak sağlamaktadır (Van Engelenburg ve ark., 1993).

Xia ve ark. (1995) deneysel olarak enfekte edilmiş, Van Engelenburg ve ark.

(1993) ise doğal enfekte semen örneklerinde BoHV-1 DNA’sının tespiti için PCR

yöntemini kullanılmışlardır. Araştırıcılar, örnek hazırlanması, primer ve enzimlerin

konsantrasyonları gibi PCR şartlarının iyi bir şekilde optimize edilmesinin önemli

olduğunu bildirmişlerdir.

16

BoHV-1’e ait tymidinkinaz (TK), gB, gC, gD ve gE genleri PCR

amplifikasyonu için hedef olarak kullanılmaktadır. gE dizinlerinin tespitine dayalı

PCR yöntemleri, vahşi tip virus ile gE gen bölgesi çıkarılmış marker aşı suşlarının

ayrımında kullanılabilmektedir (Fuchs ve ark., 1999; Schynts ve ark., 1999). Aynı

zamanda, BoHV-1 ile BHV-5 viruslarının birbirinden ayrımında kullanılan PCR

teknikleri de geliştirilmiştir (Ashbaugh ve ark., 1997; Ros ve ark., 1999).

1.1.6.2.3. Serolojik Testler

Virus nötralizasyon (VN) testleri ve çeşitli ELISA sistemleri BoHV-1’e karşı

serumda oluşan antikorların tespitinde kullanılmaktadır (Kramps ve ark., 1993).

İndirekt fluoresan antikor tekniği, alternatif bir serolojik test olarak

uygulanabilmektedir (Miller ve Wilkie, 1979).

VN testleri çeşitli modifikasyonlarla uygulanabilmektedir. Testler, kullanılan

virus suşuna, serumun başlangıç sulandırmasına, inkubasyon periyoduna, kullanılan

hücre tipine ve testin okunma zamanına bağlı olarak farklılıklar göstermektedir

(Perrin ve ark., 1993). VN testi, BoHV-1 spesifik antikorları tespit etmede oldukça

duyarlı ve spesifik olup, eradikasyon programlarında referans test olarak

kullanılmaktadır (Wyler ve ark., 1989).

Son yıllarda, BoHV-1’e karşı oluşan antikorların tespitinde VN testlerinin

yerini ELISA teknikleri almaktadır. ELISA için standart bir prosedür henüz

oluşturulmamıştır. İndirekt ve blocking ELISA’ları içeren bir çok ELISA tipi

mevcuttur. Serum ve sütte antikorların tespitine olanak sağlayan birçok ELISA kiti

ticari olarak bulunmaktadır. Ülke bazında standardizasyon için kitlerin niteliği ve

kalitesi karşılaştırılmalı ve her grup örnek, ulusal referens laboratuvarı tarafından

önceden tanımlanan kriterler ile test edilmeli, daha sonra ülkedeki diğer

laboratuvarlarda kullanılmalıdır.

17

ELISA prosedürlerinin birçok varyasyonu bulunmaktadır. En çok kullanılan;

antijen hazırlanması ve kaplama, test örneklerinin sulandırılması, antijen ve test

örneklerinin inkubasyon periyodu, konjugat eklenmesi ve substrat/kromojen

solüsyonunun eklenmesidir. Rutin kullanıma başlamadan önce, ELISA sisteminin

geçerliliği, sensitivite ve spesifitesinin tespitiyle sağlanmalıdır. Bunun için bir grup

iyi tanımlanmış (örn. VN testi ile) güçlü pozitif, zayıf pozitif ve negatif serum test

edilmelidir. BoHV-1 testlerinin standardizasyonu için OIE’nin öngördüğü

uluslararası standartlara göre hazırlanmış güçlü pozitif, zayıf pozitif ve negatif

serumlar, OIE IBR/IPV referens laboratuvarlarında bulunmaktadır (Perrin ve ark.,

1994).

Blocking veya competitive ELISA tekniklerinin prensibi, antijenin enzimle

işaretli BoHV-1 antiserumu veya anti-BoHV-1 monoklonal antikoruna

bağlanmasının test örneğindeki antikorlar tarafından bloke edilmesi temeline

dayanmaktadır. İndirekt ELISA sistemleri ile blocking ELISA’lar

karşılaştırıldığında, blocking ELISA’ların genellikle daha duyarlı olduğu tespit

edilmiştir (Perrin ve ark., 1993). Son zamanlarda, marker aşılarla birlikte kullanım

alanı bulan ve aşılı popülasyonlardaki enfekte sığırları tespit etmede kullanılan gE

ELISA sistemleri geliştirilmiştir (Van Oirschot ve ark., 1997; Wellenberg ve ark.,

1998).

1.1.7. Kontrol ve Eradikasyon

BoHV-1 enfeksiyonunun kontrolünde temel strateji, ekonomik kayıpların ve

salgınların önlenmesi ile sığır populasyonlarında saha virusu sirkülasyonunun

azaltılması olarak bildirilmiştir (Kaashoek ve ark., 1994). Enfeksiyonun, kombine bir

kontrol programı ile önlenebileceği (Ackermann ve ark., 1990), sığır

popülasyonlarında oldukça yaygın olarak görüldüğü ve bu nedenle düzenli bir

aşılama programının gerekliliği belirtilmiştir (Straub, 1990; Van Donkersgoed ve

Babiuk, 1991).

18

1.1.7.1. Eradikasyon

Hayvan Hastalıkları Dünya Örgütü (OIE), IBR/IPV enfeksiyonunu B grubu ihbari

mecburi hastalık olarak bildirmiştir (OIE, 2004). OIE B grubu hastalıkları,

sosyoekonomik ve/veya halk sağlığında önemi olan ve uluslararası ticarette dikkate

alınması gereken bulaşıcı hastalıklardır.

BoHV-1 tüm dünyada sığırcılık işletmelerinde yaygın olarak görülmektedir.

Enfeksiyon prevalansının yüksek olduğu ülkelerde, enfekte sığırların oranını

azaltmak için, marker aşılara dayalı aşılama programı uygulanmasının, BoHV-1

eradikasyonunda ilk aşama olabileceği bildirilmiştir (Van Oirschot, 1999).

Birçok Avrupa ülkesinde, aşılama, sürü izolasyonu, sınır kontrolü ve kesim

uygulamalarını içeren eradikasyon programları uygulanmaktadır (Kahrs, 2001).

Amerika Birleşik Devletleri’nde solunum sistemi enfeksiyonları büyük ekonomik

kayıplara yol açtığından söz konusu hastalığın kontrolü, aşılama stratejisine

dayanmaktadır (Wyler ve ark., 1989).

Kontrol programlarının amacı, klinik hastalığı kontrol etme ve enfeksiyonu

elimine etme temeline dayanmaktadır. Aşılamalar bireyleri hastalığa karşı korurken,

enfeksiyona karşı koruma oranları düşük olabilmektedir (Rouse ve Babiuk, 1978).

Aşılama temeline dayanan bir eradikasyon programı planlanırken,

kullanılacak aşı türünün seçimi oldukça önemlidir. İnaktive ve atenüye marker aşılar

birçok ülkede bulunmaktadır (Kaashoek et al., 1994, 1995). Aşılar oldukça güvenli

olmakla birlikte, canlı marker aşılar bazen latentlik oluşturabilmektedir (Scahaw,

2000).

19

1.1.7.2. Aşılar

BoHV-1 enfeksiyonunun kontrolünde, inaktif virus aşıları ve modifiye canlı virus

aşılarını içeren konvansiyonel aşılar ile marker aşılar kullanılmaktadır (Frerichs ve

ark., 1982; Kaashoek ve ark., 1994). Aşıların, hastalığın şiddetini azalttığı fakat

genellikle enfeksiyonun oluşmasını önleyemediği bildirilmiştir (Fenner ve ark.,

1993). Çok çeşitli konvansiyonel ve marker aşılar bulunmakta, genellikle multivalan

aşı olarak diğer patojenlere (solunum hastalıkları kompleksinin kontrolü) karşı olan

aşılarla kombine olarak kullanılabilmektedir (Fulton ve ark., 2003).

Konvansiyonel aşılar kullanılarak uygulanan aşılama programlarının,

latentlik, abortlar, immunsupresyon, virulens kazanma ve enfeksiyondan korumada

başarısızlık gibi problemleri beraberinde getirdiği bildirilmiştir (Van Drunen Littel-

van den Hurk ve ark., 1993).

Diğer taraftan, konvansiyonel aşıların kullanımı, aşılama sonrası oluşan

antikor yanıtı ile enfeksiyondan sonra meydana gelen antikor yanıtının ayırt

edilmesini engellemektedir. Etkin bir kontrol programı uygulayabilmek için aşılı ve

enfekte hayvanların birbirinden ayrılması gerekliliği nedeniyle son yıllarda,

glikoprotein E taşımayan aşı virusları ile hazırlanan marker aşılar geliştirilmiştir.

Böylelikle spesifik serolojik testler kullanılmak suretiyle, marker aşılar, aşılama ile

enfeksiyonu ayırt etmeye olanak sağlamaktadırlar (Kaashoek ve ark., 1994; Van

Oirschot ve ark., 1996; Lemaire ve ark., 1999). Marker aşıların aynı zamanda BoHV-

1’in bulaşma oranını azaltmakta etkili olduğu, güvenilir ve etkin bir aşı olarak

kontrol veya eradikasyon programlarında kullanılabildiği bildirilmiştir (Kaashoek ve

ark., 1994, 1995).

20

1.2. Antikor Aviditesi

Avidite, antijenlerle antikorlar arasında oluşan kompleksin genel stabilitesinin bir

ölçümüdür. Bir antijen–antikor etkileşiminin toplam gücü, 3 büyük faktör tarafından

düzenlenir; antikorun epitopa göre intrinsik affinitesi, antikor ve antijenin etkinliği ve

etkileşime giren komponentlerin geometrik düzeni. Avidite tam bir reaksiyonu

tanımladığından, bu değer sonuçta tüm immunokimyasal tekniklerin başarısını tespit

etmektedir (Harlow ve Lane, 1988).

Antikor aviditesi, serum antikorlarının antijenlere bağlanmak için olan

fonksiyonel affinitelerinin bir ölçümüdür. Mikroorganizmaların yüzeyinde bulunan

çok sayıda antijenik determinant ile poliklonal antikorlar arasında bir multivalan

bağlanma söz konusudur. Bu bağlanmanın gücü de tüm itici ve çekici güçlerin

toplamıdır ve antikor aviditesi (fonksiyonel affinite) olarak tanımlanır. Monovalan

bir antijen ile monoklonal bir antikor arasındaki bağlanmanın gücü ise antikor

afinitesi (intrinsik afinite) olarak tanımlanır (Harlow ve Lane, 1988).

Antikorların multivalan antijenlere bağlanma gücü olarak adlandırılan avidite

genellikle primer akut enfeksiyonlarda düşüktür ve immun sistemin matürasyonu ile

yükselir. Avidite, katı faz elüsyon yönteminin kullanıldığı ve spesifik IgG

antikorlarının tespit edildiği ELISA metotlarıyla hızlı bir şekilde saptanabilir. Primer

immun yanıtın erken dönemlerinde düşük aviditeli, geç dönemlerinde ise yüksek

aviditeli spesifik IgG antikorları mevcuttur. Reaktivasyon/reenfeksiyon gibi sekonder

immun yanıt durumlarında da yine yüksek aviditeli antikorlar tespit edilmektedir.

Serum örneklerinde spesifik IgG aviditesinin hesaplanması viral enfeksiyonların

tanısına yardımcı olmanın yanında, özellikle primer ve sekonder enfeksiyonların ve

reaktivasyonun ayırdedilmesinde oldukça güvenilir bulgular sağlamaktadır (Yan ve

Fedorko, 2002).

Antikorların aviditelerinin artması, antijen-antikor komplekslerinin ortamda

bulunan protein denatüre edici maddelere karşı daha stabil olmalarına neden

21

olmaktadır ve buna bağlı olarak da, bu maddelerle düşük aviditeli antikorlar

ortamdan uzaklaştırılabilirken, yüksek aviditeli antikorlar stabil kalabilmektedir.

Buna dayanarak immunolojik testlerde üre, dietilamin, guanidin hidroklorid gibi

protein denatüre edici maddelerin kullanılması ile antikorların aviditeleri

hesaplanabilmektedir (Blackburn ve ark., 1991).

Antikor aviditesinin hesaplanmasında 2 yöntem kullanılmaktadır; Dilüsyon

yönteminde, protein denatüre edici madde serum dilüentine eklenerek düşük aviditeli

antikorların solid fazdaki antijene bağlanmaları engellenmekte, yüksek aviditeli

antikorlar ise bağlanabilmektedir. Elüsyon yönteminde ise protein denatüre edici

madde antijen-antikor kompleksi oluştuktan sonra ortama eklenmekte böylece düşük

aviditeli antikorlarla oluşmuş antijen-antikor kompleksi arasındaki bağların

ayrışmasına neden olmakta, ancak yüksek aviditeli antikorlarla meydana gelen

antijen-antikor komplekslerine etki etmemektedir. Her iki yöntemde de serumların

protein denatüre edici madde içeren ve içermeyen solüsyonlarla paralel olarak

çalışılması öngörülmekte ve test sonucunda her bir serum örneği için elde edilen iki

absorbans (optik dansite:OD) karşılaştırılarak antikor aviditesi hesaplanmaktadır.

Ticari olarak kullanıma sunulmuş olan enzim immün assay prensibi ile çalışan

kitlerde elüsyon yöntemi kullanılmakta ve sonuçta Avidite İndeksi (AI) şu formül ile

hesaplanmaktadır;

AI = OD (protein denatüre edici madde içeren test) / OD (protein denatüre

edici madde içermeyen test) x 100 (Tuokko, 1995).

Antikorun affinitesi veya aviditesi hayvanların immunizasyonundan sonra

zaman içerisinde progresif olarak artar; bu durum, immün yanıtın matürasyonu adını

alır. Bu fenomen, virus enfeksiyonlarından sonraki konakçı immun yanıtında da

görülmektedir ve tek bir serum örneğinde IgG antikorunun aviditesinin ölçümü ile

bir virus enfeksiyonunun teşhisine olanak sağlamaktadır. Genellikle, virusa karşı

serumda oluşan IgG antikorunun tespiti diyagnostik bir değer taşımamaktadır. Çünkü

IgG antikoru virus enfeksiyonlarından sonra uzun süre varlığını devam ettirir. Bu

nedenle çift serum örneği arasındaki antikor titrelerindeki artışın tespiti gereklidir.

Bunun için ilk serum örneği, enfeksiyondan sonra mümkün olabilen en erken

22

zamanda alınmalıdır. Ancak, çift serumun iyi zamanlamalı toplanması genellikle zor

olmaktadır. Serumda IgG antikorunun yüksek veya düşük seviyeli olarak tespit

edilmesiyle, serumun enfeksiyondan kısa veya uzun bir süre sonra alındığı

saptanabilir. Bununla birlikte viruslara karşı antikor aviditesinin ölçümü kolay

değildir. Viral antijenler büyük ölçüde tekrarlayan antijenik determinantlar

içerdiğinden, hapten-antikor interaksiyonları için equilibrium diyaliz tekniği veya

%50’lik ammonyumsülfat ile çökmeyen çözünebilir proteinlere karşı antikor

düzeyinin tespiti gibi yöntemler kullanılamamaktadır (Inouye ve ark, 1984).

Inouye ve ark.’nın (1984) bildirdiğine göre, Webster, influenza virusları ile

tavşanların immunizasyonundan sonra avidite değişimini equilibrium filtrasyon

tekniği ile çalışmıştır. Fakat bu teknik zaman alıcı ve zahmetli olduğundan rutin

diyagnostik olgular için uygun bulunmamıştır. Sonraki zamanlarda, Lehtonen ve

Meurmann rubella enfeksiyonundan sonra, avidite değişimini ELISA yöntemini

kullanarak çalışmıştır. Bu ELISA sisteminde, enfeksiyondan sonraki kısa ve uzun

dönemde alınan serumlar arasındaki antikor titrasyon eğrilerinin farklılıkları tespit

edilmiştir. Inouye ve ark. (1984) relatif antikor aviditesini değerlendirmek için, viral

enfeksiyonların diyagnozunda tek serum örneğinin kullanılabildiği basit bir ELISA

prosedürü geliştirmişlerdir. Bu teknikte, solid-faz antijenlere düşük aviditeli

antikorların bağlanmasını önlemek için serum sulandırmalarına düşük

konsantrasyonda protein denatürantı eklenmiştir ve denatüranın olduğu ve olmadığı

gözlerden elde edilen antikor titrasyon eğrileri karşılaştırılmıştır.

HSV, CMV, EBV ve HHV6 enfeksiyonlarında, IgM antikorunun varlığı

primer enfeksiyonun, reenfeksiyon veya reaktivasyonun teşhisi için yeterli değildir.

Bu antikorlar, küçük miktarlarda üretildiklerinden veya hiç üretilmediklerinden tespit

edilmeleri zor olmakta ve bu nedenle yanlış negatif sonuç verebilmektedirler. Yanlış

pozitif sonuçlar ise IgM antikorlarının uzun süreli persistensinden ve söz konusu

enfeksiyonla ilgisiz olarak bulunabilmelerinden kaynaklanmakta, pozitif bulgularda

reaktivasyon veya reenfeksiyondan da kaynaklanabilmektedir (Gutierrez ve ark.,

1997).

23

Ayrıca HSV enfeksiyonunda IgM yanıtı primer faza özgü değildir, IgM

persistensi veya tekrar oluşumu, tekrarlar sırasında çoğunlukla gözlenmektedir. Bu

zorlukları gidermek ve primer HSV enfeksiyonlarının ayrımını yapmak için

polimerik formda spesifik IgA antikorlarını varlığına yönelik bir serodiyagnostik

yaklaşım geliştirilmiştir. Ancak bu teknik birçok karmaşık prosedürü

gerektirdiğinden fazla pratik bir metot olarak görülmemektedir (Hashido ve ark.,

1997).

IgA antikorları ve düşük aviditeli IgG antikorları, yeni oluşmuş primer

enfeksiyonun belirleyicisidir. IgA antikorları primer enfeksiyonda, IgM

antikorlarından daha sonra oluşur ve reaktivasyonda da bulunur. Spesifik IgG antikor

aviditesinin tespiti, serolojik diyagnozda oldukça duyarlı ve spesifik bir metottur. Bu

metot aynı zamanda primer enfeksiyonun yaklaşık noktasını ve reaktivasyondan

ayrımını tespit etmek için de kullanılabilir. Genellikle, ilk antijen etkisinden sonra,

IgG aviditesi düşüktür ve takip eden haftalarda ve aylarda B-lenfositlerin

matürasyonu ve antijen uyarımının azalmasından dolayı yükselir (Gutierrez ve ark.,

1997).

Primer herpesvirus enfeksiyonlarının %70-80’i asemptomatik seyrettiğinden

primer enfeksiyonlar ile primer olmayan enfeksiyonların ayrımı klinik olarak

yapılamaz. Bu nedenle serolojik testler sadece epidemiyolojik ve etiyolojik

çalışmaları değil, aynı zamanda herpesvirus enfeksiyonlarındaki klinik çalışmaları da

aydınlatmaktadır. Viral enfeksiyonların teşhisinde primer enfeksiyonların tespiti IgM

veya IgG saptanması ve titrelerinin akut ve konvalasen-faz serum örneklerinde

karşılaştırılmasına dayanmaktadır. Bununla birlikte çift serum örneğinin doğru

zamanda toplanması çok mümkün olmamaktadır. Son zamanlarda yapılan

çalışmalarla, primer enfeksiyonlardan sonra düşük aviditeli antikorları kapsayan

erken spesifik IgG yanıtı ve birkaç ay içerisinde aviditenin matürasyonu

gözlenmiştir. Düşük aviditeli antikor denatürasyon teknikleri rubella, varicella-

zostervirus, cytomegalovirus, Epstein-Barr virus, human herpesvirus 6 ve

toxoplasma gibi birçok enfeksiyöz ajanın neden olduğu hastalıkların teşhisinde

24

başarıyla kullanılmaktadır (Kangro ve ark., 1991; Ward ve ark., 1993; Gray, 1995;

Hashido ve ark., 1997; Akingbade ve ark., 2003).

Protein denatüre edici ajanlar ve bir ELISA testinin modifikasyonu

kullanılarak, primer genital herpes simplexvirus (HSV) enfeksiyonları ile primer

olmayan enfeksiyonların ayrımında bir IgG antikor avidite testi uygulanmıştır.

Primer, rekürrent ve primer olmayan ilk dönem genital herpes enfeksiyonu bulunan

49 serum örneği çalışılmıştır. Denatüre edici ajanlar olarak 6 M üre, 8 M üre ve 35

mM diethylamin (DEA) kullanılmıştır. En iyi ayrım 6 M üre muamelesi ile elde

edilmiştir ve avidite indeksleri enfeksiyon sonrası 100. güne kadar olan serumlarda

0.398 ve enfeksiyon sonrası 100. günden sonraki serumlarda 0.879 olarak

belirlenmiştir. Rekürrent ve primer olmayan ilk dönem enfeksiyonları arasında

belirgin bir avidite indeksi farkı gözlenmemiştir. Primer ve rekürrent veya primer

olmayan ilk dönem genital herpes enfeksiyonlarının ayrımında IgG aviditesinin

serolojik bir belirleyici olduğu gösterilmiştir ve bu prosedürün, IgM veya IgG

antikor titrelerindeki artışın tespitinin fazla önem taşımadığı kronik enfeksiyöz

hastalıkların teşhisinde özellikle faydalı olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmada aynı

zamanda, rekürrent enfeksiyon gösteren hastalardan alınan serumlar, primer olmayan

ilk dönem enfeksiyonu gösteren hastalardan alınan serumlara göre daha geniş çapta

ve daha düşük değerlerde avidite indeksi göstermiştir fakat belirgin bir farklılık tespit

edilmemiştir (Hashido ve ark., 1997).

Inouye ve ark. (1984) tarafından yapılan bir çalışmada, viruslara karşı ELISA

yöntemi ile serum IgG aviditesini saptamak için, serumun bir seri iki katlı

sulandırmaları için çift sıra göz kullanılmış; bir sıraya düşük konsantrasyonda protein

denatüranı eklenmiş ve düşük aviditeli antikorların solid fazdaki viral antijenlere

bağlanması engellenmiştir. Daha sonra, her iki gözden elde edilen antikor titrasyon

eğrileri karşılaştırılmıştır. Denatüranın eklenmesi, eğrilerin paralel olarak sola

kaymasına neden olmuş ve kaymanın derecesi, çalışılan üç enfeksiyonda da

(Japanese Encephalitis Virus, Rotavirus, Rubella Virus Enfeksiyonları) erken serum

örneklerinde geç serum örneklerinden fazla bulunmuştur. Bu prosedür serumda

25

antikor aviditesinin tespitinde ve viral enfeksiyonların tek serum örneği ile teşhisinde

yararlı bulunmuştur (Akingbade ve ark., 2003).

IgG antikor aviditesinin tespiti, tek serum ile teşhiste IgM antikor tespitine

alternatif bir metot olarak gösterilebilmektedir. Bu metodun yanlış negatif ve yanlış

pozitif sonuçlarının minimum düzeyde olduğu tespit edilmiştir. IgG antikoru avidite

prosedürünün, sadece yeni geçirilmiş ve eski viral enfeksiyonların ayrımında değil,

aynı zamanda reenfeksiyon (yüksek antikor titresi, yüksek avidite) ile primer

enfeksiyonun (yüksek antikor titresi, düşük avidite) ayırt edilmesinde de yol gösterici

olduğu tespit edilmiştir (Inouye ve ark., 1984; Bodeus ve ark., 1998; Yan ve

Fedorko, 2002).

1.3. Araştırmanın Amacı

Anabilim dalımızda BoHV-1 sürü dinamiğinin izlenmesi amacıyla yapılan bir

çalışmada, tespit edilen nötralizan antikor düzeylerinin çok kısa süreli stabilitesi, bu

antikorların aviditesi ile ilgili soruları gündeme getirmiştir (Güngör, 2003).

Araştırmada, yukarıda bahsedilen çalışma ile BoHV-1 enfeksiyonunun

varlığının ve olası rekürrenslerin tespit edildiği serum örneklerinde IgG antikor

aviditesinin hesaplanması ve böylelikle mevcut antikorların kaynağının primer

enfeksiyon mu, yoksa bir reenfeksiyon veya reaktivasyon mu olduğunun

belirlenmesi ve BoHV-1 enfeksiyonlarında antikor aviditesinin ölçülmesinin pratikte

getirebileceği diyagnostik avantajların araştırılması amaçlanmıştır.

26

2. GEREÇ VE YÖNTEM

2.1. Gereç 2.1.1. Hücre Kültürü ELISA antijeni hazırlamak için kullanılacak virusların üretilmesi amacıyla Primer

Dana Fötal Akciğer (PDFA) hücre kültürü kullanıldı. Hücrelerin üretilmesi amacıyla

ise % 10 Fötal Dana serumu (FDS) içeren, Streptomisin ve Penisilin ile desteklenmiş

Dulbecco’s Modified Essential Medium (DMEM; Biochrom) dan yararlanıldı.

2.1.2. Viruslar

Antijen hazırlamak amacıyla, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji

Anabilim Dalı virus koleksiyonunda yer alan BoHV-1 referenz suşu (Cooper) ile 5

adet BoHV-1 izolatı (ANK 1, ANK 2, ANK 3, ANK 4 ve ANK 5) kullanıldı.

2.1.3. Kontrol Serumlar

Pozitif kontrol serum olarak, BoHV-1 nötralizasyon pozitif olup SN50 değeri 1/64

değerinden büyük olan bir sığır serumu, negatif kontrol serum olarak ise fötal dana

serumu kullanıldı.

2.1.4. Araştırmada Kullanılan Hayvanlar

Daha önce Anabilim Dalımızda yapılan bir çalışmada (Güngör, 2003), tüzel nitelikli

bir süt sığırcılığı işletmesindeki hayvanlardan 2 yıl boyunca 3’er ay aralıklarla

yapılan toplam 6 örneklemede alınan kan serumu örnekleri ile bu çalışmadaki son

27

örneklemeden 1,5 yıl sonra ve bunu takiben 1. yıl sonunda alınan kan örnekleri

kullanıldı.

Söz konusu çalışmada, ilk örnekleme döneminde hayvanların 6-8 aylık, aşısız

ve seronegatif olmalarına özen gösterilmiştir. Bu hayvanların ikinci örnekleme

sırasında serokonverte oldukları, bunu takip eden örneklemelerde serokonversiyonun

artarak devam ettiği tespit edilmiştir.

Zaman içerisinde değişik nedenlerle meydana gelen kayıplar sebebiyle

hayvan sayılarında azalmalar meydana geldi. Bu hayvanların örneklemeler bazında

sayısal dağılımları Çizelge 2.1. de gösterildi.

Çizelge 2.1. Yapılan örneklemelerde hayvanlardan alınan ve mevcut olan serum

numunelerinin tarihleri ve örneklemelere göre sayısal dağılımları

ÖRNEKLEME TARİH HAYVAN SAYISI

I 23 Kasım 2000 68*

II 23 Şubat 2001 69* III 21 Mayıs 2001 96* IV 25 Eylül 2001 114* V 11 Şubat 2002 99* VI 5 Kasım 2002 96* VII 30 Haziran 2004 84 VIII 12 Mayıs 2005 61

TOPLAM 687

* Güngör, 2003’de kullanılan materyallerdir.

Yapılacak çalışmada, hayvanların birbirini takip eden örneklemeleri

sonucunda tespit edilen avidite indekslerindeki değişimlerin değerlendirilmesi

planlandığından, ard arda örneklemelere ait kan serumları var olan hayvanlar

belirlendi. Bu doğrultuda, birbiri ardına 8 kez örneklemenin her birinde bulunan

hayvanlar ile ilk 6, son 6 ve ilk 4 örneklemede materyal sağlanan hayvanların kulak

numaraları çizelge 2.2. de gösterildi.

28

Çizelge 2.2. Tüm örneklemeler, ilk 6 örnekleme, son 6 örnekleme ve ilk 4 örneklemede bulunan hayvanların kulak numaraları

Tüm örneklemeler İlk 6 örnekleme Son 6 örnekleme İlk 4 örnekleme

3128 3059 3112 3033

3117 3154 3071 3141

3052 3067 3114 326

3186 3031 3107 3002

3138 3061 3023 3006

3158 3184 3075 3147

3096 3066 3083 286

3087 3157 3086 3165

3060 3094 3099 3152

3025 3139 3189 3089

3057 3137 3124 3169

3008 3088 3076 3185

3018 3106 3014 3049

3148 3188 3007

3135 3015 3027

3090 3004 3072

3180 3101

3131 3019

3068 3129

3143 3054

3166 3116

21 ADET 16 ADET 21 ADET 13 ADET

29

2.2. Yöntem

2.2.1. Antijen Hazırlanması

2.2.1.1. Virusların Üretilmesi

ELISA antijeni hazırlanması amacıyla üretilecek virusların inokule edileceği hücre

kültürünün herhangi bir intrinsik kontaminant içermemesi gerekliliği göz önünde

bulundurularak, PFDA hücre kültürü, BVDV kontaminasyonu yönünden Polimeraz

Zincir Reaksiyonu (PZR) tekniği ile kontrol edildi. Hücre, BVDV yönünden negatif

bulunduktan sonra 25 cm2 lik hücre kültürü şişelerinde üretildi. BoHV-1 referenz

suşu (Cooper) ve izolatların (ANK1, ANK2, ANK3, ANK4, ANK5), hücre

kültürlerine ayrı ayrı inokule edilmek suretiyle adaptasyonları sağlandı. Bunu takiben

150 cm2 lik hücre kültürü şişelerinde üretilen PFA hücre kültürlerinin her birine,

adapte edilmiş olan izolatlardan 0,01 moi oranında inokule edildi. 24-36 saat

içerisinde %80’in üzerinde CPE oluşumu gözlendi ve viruslar saflaştırma işleminde

kullanılmak üzere -80°C’ de muhafaza edildi.

2.2.1.2. Virusların Saflaştırılması

Bu amaç için Bolton ve ark. (1981) ile Collins ve ark. (1984) tarafından bildirilen

teknikler kullanıldı. BoHV-1 izolatları ayrı ayrı 4°C’de 3500 rpm devirde 30 dakika

süreyle santrifüj edildi ve süpernatantlar ayrıldı. 35 mL sıvı kapasitesine sahip

ultrasantrifüj tüplerine %30’luk sükroz çözeltisinden 10 mL koyuldu. Viruslara ait

süpernatantlar %30’luk sükroz çözeltisi üzerinde 2. fazı oluşturacak şekilde 20 mL

hacimde yerleştirildi ve 26000 rpm’de 4 saat süreyle santrifüj edildi. Santrifüj

sonunda elde edilen pelletler yaklaşık 200 mikrolitre (μl) Phosphate Buffered Saline

(PBS) ile sulandırıldı ve tüm tüpler birleştirildi. Karışımdan 20 μl alınarak 1/100

oranında sulandırıldı ve spektrofotometrede 290 nm’de okutularak protein

konsantrasyonu 0,075 olarak tespit edildi. Antijenin, 1mL hacimde içerdiği protein

miktarı önceden bildirilen formüle göre;

0,075 x 100 / 1,35 = 5,6 mg/mL

30

olarak hesaplandı. Daha sonra ELISA antijeni, kullanılacağı zamana kadar -80°C’de

saklandı.

2.2.2. ELISA Bileşenleri ve Prosedürün Optimizasyonu

ELISA antijeninin hazırlanışı, bileşenlerinin standardizasyonu ve prosedürün

uygulanışı ile ilgili şema, şekil 2.1’de gösterildi.

Şekil 2.1 ELISA testinin uygulanma aşamaları

Virusların Üretilmesi

Virusların Saflaştırılması

ELISA Prosedürü ve Bileşenlerin Standardizasyonu

Konjugat ve Blank kontrollerin Optimizasyonu

Antijen ve Serum Sulandırmalarının Optimizasyonu

Diğer Parametrelerin Kontrolü

Bloklama Parametrelerinin Belirlenmesi

Pozitif ve Negatif Serumun Belirlenmesi

Kontrol Serumların Belirlenen Konsantrasyonlarda Test Edilmesi

Kontrol Serumlar ile Antijen Sulandırmalarının Son Nokta Titrasyon Değerlerinin Belirlenmesi

Avidite ELISA Testi

31

2.2.2.1. Antijen ve Serum Sulandırmalarının Optimizasyonu

Purifiye antijenin ELISA tabletlerinde (Maxisorb; Nunc) 1/100 oranından başlayarak

iki katlı artan sulandırmaları hazırlandı. Bu amaçla, purifiye antijen, karbonat-

bikarbonat çözeltisi (pH:9,6) içerisinde 1/100 oranında sulandırıldı ve ELISA

tableti’nin ilk sırasına (A-H) 100’er μl koyuldu. Diğer gözlere 50 μl karbonat-

bikarbonat çözeltisi koyuldu. Çok kanallı mikropipet yardımıyla ilk sıradan

başlayarak 11. sıraya kadar 50 μl hacminde antijen sulandırması aktarılarak antijenin

1/102400 e kadar (1/100, 1/200,...1/102400) sulandırması hazırlandı. 12. sıra boş

bırakıldı (Çizelge 2.3). Daha sonra tablet, 4°C’de bir gece boyunca inkübe edildi.

İnkübasyon sonrası tablet içerikleri döküldü ve tüm gözler 0,01 M PBS çözeltisi

(pH:7,4) ile 4 kez yıkama işlemi yapıldı.

Bloklama çözeltisi olarak PBS içerisinde %0.05 Tween-20 (Tw-20), %3 süt

tozu, %3 at serumu hazırlanarak tabletin tüm gözlerine 100’er μl ilave edildi ve

37°C’de 1 saat süreyle inkübasyona bırakıldı. Sürenin sonunda tablet içerikleri

döküldü ve PBS çözeltisi ile yukarıda belirtilen şekilde yıkama işlemi yapıldı.

Serum sulandırma çözeltisi olarak PBS içerisinde %0,05 Tw-20, %3 süt tozu

hazırlandı. BoHV-1 Nötralizasyon SN50 değeri ≥64 olan bir serum örneği pozitif

serum olarak kullanılmak üzere seçildi. Başka bir tablet içerisinde, pozitif serumun

1/10 dan başlayarak iki katlı artan sulandırmaları hazırlandı (1/10, 1/20,....1/1280).

ELISA tabletinin A(1-12) sırasından başlayarak H(1-12) sırasına kadar hazırlanmış

olan sulandırmalar aktarıldı (Çizelge 2.4). 1 saat 37°C’de inkübasyona bırakıldıktan

sonra tablet içerikleri dökülerek PBS çözeltisi ile daha önce belirtilen şekilde yıkama

işlemi yapıldı.

Konjugat sulandırma çözeltisi olarak PBS içerisinde %0,05 Tw-20

hazırlandı. Konjugat (Tavşan (Rabbit) Anti-bovine IgG peroksidaz konjugat; Sigma)

önerilen konsantrasyonda (1/20.000) PBS-Tw-20 içerisinde hazırlandı. Tüm gözlere

100’er μl ilave edildi. 1 saat 37°C’de inkübasyon sonrası tablet içerikleri dökülerek

PBS çözeltisi ile yıkama yapıldı.

33

Substrat çözeltisi olarak, fosfat-sitrat tampon çözeltisi içerisinde Ortophenilen

Diamin (OPD) hazırlandı. Bu amaçla, 50 mL fosfat-sitrat çözeltisi içerisinde 1 adet

(30mg) OPD tablet çözüldü. Bu çözeltiye 1/2000 oranında hidrojen peroksit (H2O2)

eklenerek hazırlanan substrat çözeltisinden tüm gözlere 100’er μl ilave edildi. Oda

sıcaklığında ve karanlık ortamda 20 dakika süreyle inkübasyona bırakıldı. Süre

sonunda, distile su içerisinde % 6,8 konsantrasyonunda hazırlanan sülfirik asit

çözeltisinden tabletin tüm gözlerine 100’er μl eklenmek suretiyle reaksiyon

durduruldu. Tablet, ELISA okuyucusunda 492 nm’de okutularak optik dansite (OD)

değerleri tespit edildi.

2.2.2.2. Konjugat ve Boş (Blank) Kontrollerin Test Edilmesi

ELISA tableti’nin ilk 6 sırası (A-H) ayrılarak 1/600 oranında antijen ile kaplandı.

4°C’de bir gece bekletildikten sonra 4 kez PBS ile yıkama işlemi yapıldı. Bloklama

solüsyonundan (PBS, %0.05 Tw-20, %3 süt tozu, %3 at serumu) ayrılan gözlere

100’er μl ilave edildi ve 37°C’de 1 saat süreyle inkubasyona bırakıldı. Tablet içeriği

dökülüp PBS ile 4 kez yıkandı. Konjugat 1/20000 konsantrasyonunda olacak şekilde

PBS-%0.05 Tw-20 içerisinde hazırlandı. 1, 2 ve 3. sıralar (A-H) blank olarak ayrıldı

ve bu gözlere 100’er μl PBS-Tw-20 ilave edildi. 4., 5. ve 6. sıralar (A-H) konjugat

kontrol olarak ayrıldı ve bu gözlere hazırlanmış olan konjugat dilüsyonundan 100’er

μl eklendi. 37°C’de 1 saat süreyle inkubasyona bırakıldı. Tablet içeriği dökülüp

yıkama işlemi yapıldı. Substrat çözeltisi hazırlandı (sitrat buffer-OPD çözeltisi

içerisinde 1/2000 oranında H2O2). Kullanılan tablet gözlerine 100’er μl substrat ilave

edildi ve 20 dakika oda sıcaklığında bırakıldı. %6,8’lik H2SO4 ile reaksiyon

durduruldu ve 492 nm’de optik dansite değerleri saptandı.

34

2.2.2.3. Diğer Parametrelerin Kontrolü

Testin uygulanması esnasında oluşan yüksek background değerlerinin giderilmesi

için bloklama çözeltilerinin içeriği iki ayrı şekilde hazırlanarak test edildi. Bloklama

solüsyonlarından biri PBS içerisinde %0,05 Tween-20, %3 süt tozu ve %3 at serumu

olacak şekilde, diğeri ise aynı şekilde ancak at serumu ilave edilmeden hazırlandı ve

ayrı ayrı test edildi. Ayrıca, bloklama işlemi 100 μl ve 300 μl miktarında çözelti ile,

1 saat ve 2 saat inkubasyon süresi ile uygulanarak test edildi.

Test sisteminde kullanılacak pozitif ve negatif kontrol serumun belirlenmesi

için farklı serum örnekleri, belirtilen prosedür dahilinde test edildi ve elde edilen

O.D. değerleri karşılaştırıldı.

2.2.2.4. Pozitif ve Negatif Kontrol Serumlar ile Antijen Sulandırmalarının Son

Nokta Titrasyon Değerlerinin Tespit Edilmesi

Purifiye antijen, karbonat-bikarbonat çözeltisi (pH:9,6) içerisinde 1/100 oranında

sulandırıldı. ELISA tabletinin (Tablet-2) ilk sırasına (A-H) 100’er μl antijen

sulandırması ilave edildi. Diğer gözlere 50 μl karbonat-bikarbonat çözeltisi eklendi.

Ilk sıradan başlayarak son sıraya kadar antijenin 1/600 hariç iki katlı artan (1/100,

1/200, 1/400, 1/600,....1/102400) sulandırmaları yapıldı (Çizelge 2.6). Başka bir

tabletin (Tablet-1) tüm gözlerine karbonat-bikarbonat içerisinde 1/600 oranında

sulandırılmış antijen ilave edildi (Çizelge 2.5). Tabletler 4°C’de bir gece süreyle

inkübasyona bırakıldı. Süre sonunda, tablet içerikleri dökülüp 0,01 M PBS çözeltisi

(pH:7,4) ile 4 kez yıkama işlemi yapıldı. Daha sonra, bloklama çözeltisi olarak PBS

içerisinde %0,05 Tw-20 ve %3 süt tozu hazırlandı ve tabletin tüm gözlerine 300’er μl

hacminde çözelti ilave edildi. 37°C’de 2 saat süreyle inkübasyon sonrası tablet

içerikleri döküldü ve PBS çözeltisi ile az önceki basamakta belirtilen şekilde yıkama

işlemi yapıldı.

36

Tabletler pozitif ve negatif serum örnekleri için 4’er sıra (A-D, E-H)

kullanılacak şekilde düzenlendi. Bir numaralı tablet, serumların bir seri

sulandırmaları yapılarak (1/10, 1/20, 1/40, 1/50, 1/60…...1/200), iki numaralı tablet

ise her iki serumunda 1/50 oranında sulandırmaları yapılarak çalışıldı (Çizelge 2.5,

2.6). Bu amaçla, serum sulandırma çözeltisi, PBS içerisinde %0,05 Tw-20 ve %3 süt

tozu olacak şekilde hazırlandı ve başka iki tablet içerisinde serumlar belirtilen şekilde

sulandırıldı. Daha sonra hazırlanan bu sulandırmalar, ELISA tabletine çok kanallı

mikropipet yardımıyla ve her bir serum sulandırması için 100 μl hacimde olacak

şekilde aktarıldı. 37°C’de 1 saat süreyle inkübasyona bırakıldıktan sonra tablet

içerikleri dökülüp, PBS ile bir önceki basamakta belirtilen şekilde yıkandı. Konjugat

1/20000 konsantrasyonunda olacak şekilde PBS-%0,05 Tw-20 içerisinde

hazırlanarak tabletin tüm gözlerine 100’er μl hacimde ilave edildi ve 1 saat süreyle

37°C’de inkübasyona bırakıldı. Süre sonunda yıkama işlemini takiben substrat

solüsyonu (fosfat-sitrat çözeltisi içerisinde OPD + 1/2000 hidrojen peroksit) tabletin

tüm gözlerine 100’er μl hacminde ilave edildi ve 20 dakika süreyle oda ısısında,

karanlık ortamda inkübasyona bırakıldı. Süre sonunda, distile su içerisinde %6,8

konsantrasyonunda hazırlanan H2SO4 çözeltisinden tabletin tüm gözlerine 100’er μl

eklenmek suretiyle reaksiyon durduruldu. Tablet, ELISA okuyucusunda 492 nm’de

okutularak optik dansite (OD) değerleri tespit edildi.

2.2.2.5. Pozitif ve Negatif Kontrol Serumların Test Edilmesi

Purifiye antijen karbonat-bikarbonat çözeltisi (pH:9,6) içerisinde 1/200, 1/400, 1/600

ve 1/800 oranlarında sulandırıldı. ELISA tabletinin her 1/3 lük kısmına bu

sulandırmalar yerleştirildi, 4°C’de bir gece bekletildi. Tablet içerikleri dökülüp 0,01

M PBS çözeltisi (pH:7,4) ile 4 kez yıkama işlemi yapıldı. Bloklama çözeltisi, PBS

içerisinde %0,05 Tw-20 ve %3 süt tozu olacak şekilde hazırlandı. Tablet’in tüm

gözlerine 300’er μl çözelti ilave edildi ve 37°C’de 2 saat süreyle inkubasyona

bırakıldı. İnkubasyon sonrası tablet içerikleri dökülüp, PBS çözeltisi ile az önceki

basamakta belirtilen şekilde yıkama işlemi yapıldı. Tablet, pozitif ve negatif kontrol

örnekleri için 4’er sıra (A-D, E-H) kullanılacak şekilde düzenlendi. Pozitif kontrol

37

olarak, BoHV-1 nötralizasyon pozitif serum, negatif kontrol olarak da fötal dana

serumu kullanıldı. Kontrol serumlar 1/50, 1/75 ve 1/100 oranında PBS-Tw-20, %3

süt tozu içerisinde sulandırılarak sırasıyla tabletin her 1/3’lük bölümüne yerleştirildi

(Çizelge 2.7). 37°C’de 1 saat süreyle inkubasyona bırakıldıktan sonra tablet içeriği

dökülüp PBS ile yıkandı. Konjugat 1/20000 konsantrasyonunda olacak şekilde PBS-

%0,05 Tw-20 içerisinde hazırlandı. Tüm gözlere 100’er μl ilave edildi ve 1 saat

37°C’de inkubasyona bırakıldı. Yıkama işlemini takiben substrat çözeltisi (fosfat-

sitrat solüsyonu içerisinde OPD + 1/2000 H2O2) tüm gözlere 100’er μl ilave edildi ve

20 dakika oda ısısında bekletildikten sonra H2SO4 ile reaksiyon durduruldu. 492

nm’de O.D. değerleri tespit edildi.

39

2.2.3. Avidite Testi

Purifiye antijen, karbonat-bikarbonat çözeltisi (pH:9,6) içerisinde 1/600 oranında

sulandırılarak ELISA tabletlerinin tüm gözlerine 50 μl hacimde ilave edildi.

Tabletler 4°C’de bir gece süreyle inkübasyona bırakıldı. Süre sonunda, tablet

içerikleri dökülüp 0,01 M PBS çözeltisi (pH:7,4) ile 4 kez yıkama işlemi yapıldı.

Daha sonra, bloklama çözeltisi olarak PBS içerisinde %0,05 Tw-20 ve %3 süt tozu

hazırlandı ve tabletin tüm gözlerine 300’er μl hacminde çözelti ilave edildi. 37°C’de

2 saat süreyle yapılan inkübasyon sonrası tablet içerikleri döküldü ve PBS çözeltisi

ile az önceki basamakta belirtilen şekilde yıkama işlemi yapıldı.

Çizelge 2.1 ve 2.2 de gösterilen hayvanlara ait serum örnekleri, serum

sulandırma çözeltisi (PBS içerisinde %0,05 Tw-20 ve %3 süt tozu) içerisinde 1/50

oranında sulandırılarak ELISA tabletinin çift gözüne 100’er μl ilave edildi. Tabletin

4 gözü pozitif kontrol (A1, A2, B1, B2); 4 gözü negatif kontrol (C1, C2, D1, D2) ve

4 gözü blank (serum içermeyen) kontrol (E1, E2, F1, F2) olarak ayrıldı. Pozitif ve

negatif kontrol gözlerine, serum sulandırmaları ile aynı oranda sulandırılan pozitif ve

negatif serumlar ilave edildi. Blank için ayrılan gözlere sadece serum sulandırma

çözeltisi koyuldu. 1 saat süreyle 37°C’de inkübasyon sonrası tablet içerikleri

döküldü. Tabletin ilk sıralarına (1,3,5,7…) 150 μl hacimde PBS, ikinci sıralarına

(2,4,6,8...) PBS içerisinde hazırlanmış 8 M Üre solüsyonundan 150 μl hacimde ilave

edildi. 6-8 dakika süreyle 37°C’de inkübe edildikten sonra dökülüp PBS ile 3 kez

yıkama işlemi yapıldı. Konjugat 1/20000 konsantrasyonunda olacak şekilde PBS-

%0,05 Tw-20 içerisinde hazırlanarak tabletlerin tüm gözlerine 100’er μl hacimde

ilave edildi ve 1 saat süreyle 37°C’de inkübasyona bırakıldı. Süre sonunda PBS ile

yıkama işlemini takiben substrat solüsyonu (fosfat-sitrat solüsyonu içerisinde OPD +

1/2000 H2O2) tabletlerin tüm gözlerine 100’er μl hacminde ilave edildi ve 20 dakika

süreyle oda ısısında, karanlık ortamda inkübasyona bırakıldı. Süre sonunda, distile su

içerisinde %6,8 konsantrasyonunda hazırlanan H2SO4 çözeltisinden tüm gözlere

100’er μl eklenmek suretiyle reaksiyon durduruldu. Tabletler, ELISA okuyucusunda

492 nm’de okutularak O.D. değerleri tespit edildi ve avidite indeksleri (A.I.)

hesaplandı.

40

Gerek ELISA ve gerekse bunun temelinde yapılan Avidite testlerinin

değerlendirilmesinde daha önce bildirilen yöntemler kullanıldı. Buna göre ELISA

testinin cut-off değeri aşağıdaki formül ile hesaplandı:

ELISA cut-off = %50 Ort. Pozitif O.D.* ± S.D.*

%50 Ort. Pozitif O.D.* : Pozitif kontrollerin optik dansite ortalamalarının %50’si.

S.D.* : Standart sapma değerleri.

Avidite İndeksi (%A.I.) ise, BoHV-1 antikor pozitif olduğu tespit edilen

serum örnekleri için aşağıdaki formüle göre hesaplandı:

% A.I. = O.D.ÜRE * / O.D.PBS * x 100

O.D.ÜRE * : Ayrıştırıcı çözelti (8M ÜRE) ile yıkanan gözlerde tespit edilen optik dansite

değeri.

O.D.PBS * : Yıkama solüsyonu (PBS) ile yıkanan gözlerde tespit edilen optik dansite değeri.

2.2.4. İstatistiksel Analizler

Verilerin analizi SPSS 11.5 paket programında yapıldı. Tanımlayıcı istatistikler

ortalama ± std.sapma şeklinde gösterildi. Örneklemeler arasında O.D. ve A.I.

değerlerine yönelik farklılıkların istatistiksel olarak anlamlı olup olmadığı Tekrarlı

Ölçümlü Varyans Analizi’yle değerlendirildi. Farkın görüldüğü yerlerde Bonferroni

Çoklu Karşılaştırma testi kullanılarak farka neden olan ölçüm zamanları tespit edildi.

Avidite indeksine ilişkin karşılaştırmalarda Avidite indeksinin logaritmik dönüşüm

değerleri kullanıldı.

41

3. BULGULAR

3.1. ELISA Antijeni Hazırlanması

Bölüm 2.2.1.2. de belirtilen şekilde hesaplanarak 1 mL hacimdeki protein

konsantrasyonu 5,6 mg olarak tespit edilen saflaştırılmış virusun, ELISA antijeni

olarak kullanılması için protein konsantrasyonunun 50 μl hacimde 1-10 μg/ml olması

gerekliliği (Crowther, 1995) göz önünde bulundurularak, saflaştırılmış virusun 1/500

oranında sulandırılabileceği tespit edildi.

3.2. ELISA Bileşenleri ve Prosedürün Optimizasyonu

3.2.1. Antijen ve Serum Sulandırmalarının Optimizasyonu

Aynı tablet içerisinde, yukarıdan aşağıya ve soldan sağa doğru bir seri sulandırmaları

yapılarak (checker-board) ELISA testi uygulanan antijen ve pozitif serumun çeşitli

konsantrasyonlarında elde edilen O.D. değerleri Çizelge 3.1. de sunuldu.

Checker-board sistemine göre, O.D. değerlerinin linearite gösterdiği

konsantrasyonlar (C3-D3 ile C4-D4), optimum sulandırmalar olarak değerlendirildi.

Antijenin 1/100 den başlayarak 2 katlı artan sulandırmaları yapılmak suretiyle 3

tablet kaplanarak, herhangi bir BoHV-1 nötralizasyon pozitif ve negatif serum ile

fötal dana serumu aynı şekilde test edildi ve sonuçlar değerlendirildi. Bu

uygulamalar neticesinde antijenin 1/400-1/800, serumların ise 1/40-1/80 oranında

sulandırıldığı gözlerin en optimal O.D. değerlerini verdiği gözlendi.

43

3.2.2. Konjugat ve Boş (Blank) Kontrollerin Değerlendirilmesi

ELISA tabletine konjugat ilave edilerek ve edilmeksizin uygulanan ELISA testi

sonucunda elde edilen O.D. değerleri Çizelge 3.2. de sunuldu.

Çizelge 3.2. Konjugat ilave edilmeden (1-3) ve ilave edilerek (4-6) elde edilen O.D. değerleri.

1 2 3 4 5 6

A 0.040 0.036 0.036 0.052 0.050 0.058

B 0.040 0.038 0.038 0.055 0.064 0.049

C 0.038 0.037 0.037 0.055 0.057 0.063

D 0.039 0.038 0.039 0.056 0.054 0.076

E 0.038 0.039 0.037 0.063 0.058 0.063

F 0.041 0.042 0.045 0.058 0.060 0.089

G 0.039 0.041 0.038 0.060 0.061 0.064

H 0.037 0.038 0.038 0.070 0.073 0.101

Blank ve konjugat kontrol olarak ayrılan gözlerin ortalama ± standart sapma (SD)

değerleri tespit edildi. Buna göre; blank için ortalama 0,04 ve SD ± 0,002, konjugat

için ortalama 0,06 ve SD ± 0,009 olarak hesaplandı. Elde edilen veriler ışığında,

konjugatın antijenle herhangi bir spesifik olmayan (yalancı pozitif) reaksiyon

vermediği tespit edildi.

3.2.3. Diğer Parametrelerin Kontrolü

Test sistemindeki bloklama işleminin değişik parametreler yönünden kontrol

edilmesi sonucunda, PBS içerisinde %0,05 Tw-20, %3 süt tozu olacak şekilde

hazırlanan ve at serumu içermeyen bloklama çözeltisi ile daha düşük background

değerleri elde edildi. Ayrıca, bloklama işleminin 100 μl yerine 300 μl çözelti ile ve 1

saat yerine 2 saat inkubasyon süresi ile uygulanmasının daha iyi sonuçlar verdiği

(düşük background) gözlendi. Bu veriler ışığında, test sisteminde bloklama işleminin

PBS-%0,05 Tw-20 ve %3 süt tozu olacak şekilde hazırlanan çözelti ile 300 μl

miktarında ve 2 saat inkubasyon süresi ile yapılması uygun görüldü.

44

Pozitif kontrol serumun tespiti için 4 ayrı serum örneği test edildi. Bunlar

arasında, son nokta sulandırma oranı düşük olup, başlangıç titresi (O.D.) yüksek olan

ve SN50 >1/64 olan serum pozitif kontrol olarak seçildi. Negatif kontrol serum

olarak kullanılmak üzere ise fötal dana serumu belirlendi.

3.2.4. Pozitif ve Negatif Kontrol Serumlar ile Antijen Sulandırmalarının Son

Nokta Titrasyon Değerlerinin Tespit Edilmesi

1/600 antijen sulandırması sabit tutularak, pozitif ve negatif kontrol serumların 1/10-

1/200 oranında sulandırılmaları ile uygulanan ELISA testi sonucunda elde edilen

O.D. değerleri Çizelge 3.3 de sunuldu.

1/600 oranında sabit antijen sulandırmasında, pozitif ve negatif kontrol

serumların her sulandırma basamağı için elde edilen O.D. değerlerinin ortalamaları

alınarak değerlendirildiğinde, serum sulandırmalarının son nokta titrasyon değerleri

1/160, en uygun sulandırma oranları ise 1/50 olarak belirlendi (Şekil 3.1). Pozitif ve

negatif kontrol serumların 1/10-1/200 oranında sulandırılmaları ile uygulanan ELISA

testi sonucunda oluşan renk dağılımı, Resim 3.1’de gösterildi.

1/50 oranında pozitif ve negatif serum sulandırmaları sabit tutularak, antijenin

1/100 den başlayıp, 1/102400 e kadar sulandırması yapılarak uygulanan ELISA testi

sonucunda elde edilen O.D. değerleri Çizelge 3.4 de sunuldu.

Pozitif ve negatif kontrol serumların 1/50 oranında sulandırıldığı durumda,

antijene ait her sulandırma basamağında elde edilen O.D. değerlerinin ortalamaları

alınarak değerlendirildiğinde, en uygun antijen sulandırma oranı 1/600 olarak

belirlendi (Şekil 3.2). Antijenin 1/100-1/102400 oranında sulandırılması ile

uygulanan ELISA testi sonucunda oluşan renk dağılımı, Resim 3.2’de gösterildi.

48

3.2.5. Pozitif ve Negatif Kontrol Serumların Sulandırma Oranlarının Test

Edilmesi

Antijeni 1/200, 1/400, 1/600 ve 1/800, pozitif ve negatif serumları 1/50, 1/75 ve

1/100 oranlarında sulandırmak suretiyle uygulanan ELISA testi sonucunda elde

edilen O.D. değerleri ile ortalama O.D. değerleri Çizelge 3.5. ve 3.6. da sunuldu. Her

bir sulandırmadaki O.D. değerlerinin ortalamaları karşılaştırıldığında, kontrol

serumların 1/50, antijenin 1/600 oranında sulandırılmasının uygun olduğu tespit

edildi (Şekil 3.3, 3.4).

3.3. Avidite Testi

3.3.1. Örneklemelerin Tümünde Bulunan Serumların Avidite ELISA Testi

Ard arda yapılan 8 örneklemenin tümünde bulunan serum örneklerinin avidite

ELISA tekniği ile test edilmesi sonucunda, PBS ve üre uygulanan gözlerden elde

edilen O.D. ve A.I. değerleri Çizelge 3.7. de sunuldu.

Her bir örnekleme dönemi için O.D. değerlerinin ortalamaları ve standart sapmaları

Çizelge 3.8 de sunuldu. 1. örneklemeye ait serumların BoHV-1 antikor negatif olarak

tespit edilmesinden dolayı söz konusu örneklemeye ait veriler gösterilmedi.

Çizelge 3.8. Bütün örneklemelerde bulunan serumlara ait O.D. değerlerinin ortalama ve

standart sapmaları Örnekleme

Dönemi Serum Sayısı

O.D. Ortalamaları

Standart Sapma

2 21 1,23 0,305 3 21 1,65 0,370 4 21 1,38 0,431 5 21 1,93 0,236 6 21 1,96 0,205 7 21 2,07 0,152 8 21 1,93 0,125

53

Örneklemelere ilişkin O.D. değerleri, ortalama O.D. ± SD olarak değerlendirildi.

Buna göre 2,3,4,5,6,7 ve 8. örneklemeler için ortalama O.D. değerleri sırasıyla; 1,23

± 0,305, 1,65 ± 0,370, 1,38 ± 0,431, 1,93 ± 0,236, 1,96 ± 0,205, 2,07 ± 0,152 ve 1,93

± 0,125 olarak tespit edildi. Bu veriler değerlendirildiğinde, örneklemeler arasında

O.D. değerleri bakımından anlamlı bir fark olduğu sonucuna varıldı (p<0,001).

Örneklemelerin tümünde bulunan serum örneklerinin O.D. değerleri

arasındaki farklılık incelendiğinde, 2. örneklemeye göre 4. örnekleme hariç diğer tüm

örneklemelerden elde edilen ölçümler daha yüksek bulundu (p<0,001). 3.

örneklemeye göre ise, 6. ve 7. örneklemelerin O.D. değerleri daha yüksek olup, p

değerleri sırasıyla 0,027 ve 0,006 olarak belirlendi. 4. örnekleme dönemi ele

alındığında; 5,6,7 ve 8. örneklemelere ait değerlerin tümünün 4’e göre daha yüksek

olduğu tespit edildi (p<0,001; p=0,003). 5. örneklemeden itibaren ilerleyen

örneklemelerde O.D. değerleri bakımından anlamlı bir farklılık olmadığı belirlendi.

Avidite ELISA testi sonucunda elde edilen A.I değerlerinin ortanca,

minimum ve maksimum değerleri ile A.I. değerlerinin logaritması alındığında elde

edilen ortalama ve standart sapmaları Çizelge 3.9 ve 3.10 da sunuldu.

Çizelge 3.9. Tüm örneklemelerde bulunan serumların % A.I. değerlerinin ortanca, minimum

ve maksimum değerleri Örnekleme

Dönemi Serum Sayısı

Ortanca (%)

Minimum (%)

Maksimum (%)

2 21 64,0 44,0 79,0 3 21 74,0 65,0 89,0 4 21 86,0 70,0 98,0 5 21 86,0 75,0 98,0 6 21 90,0 79,0 96,0 7 21 93,0 82,0 99,0 8 21 88,0 74,0 96,0

2, 3, 4, 5, 6, 7 ve 8. örneklemelere ilişkin ortanca A.I. değerleri sırasıyla %64

[44-79], %74 [65-89], %86 [70-98], %86 [75-98], %90 [79-96], %93 [82-99] ve

%88 [74-96] olarak tespit edildi (Şekil 3.5).

55

Çizelge 3.10. Tüm örneklemelerde bulunan serumların logaritmik avidite değerlerinin ortalama ve standart sapmaları

Örnekleme Dönemi

Serum Sayısı

Logaritmik A.I. Ortalamaları

Standart Sapma

2 21 1,79 0,063 3 21 1,88 0,041 4 21 1,93 0,042 5 21 1,93 0,039 6 21 1,94 0,025 7 21 1,96 0,022 8 21 1,94 0,030

Örneklemelere ait AI değerleri, logaritmik A.I. ortalamaları ± SD olarak

değerlendirildi. Buna göre 2,3,4,5,6,7 ve 8. örneklemeler için logaritmik A.I.

ortalama değerleri sırasıyla; 1,79 ± 0,063, 1,88 ± 0,041, 1,93 ± 0,042, 1,93 ± 0,039,

1,94 ± 0,025, 1,96 ± 0,022 ve 1,94 ± 0,030 olarak tespit edildi. Bu verilerin analizi

sonucunda, örneklemeler arasında A.I. değerleri bakımından istatistiksel olarak

anlamlı bir fark olduğu sonucuna varıldı (p<0,001).

Örneklemeler arasında A.I. değerlerindeki farklılıklar incelendiğinde, 2.

örneklemeye göre diğer tüm örnekleme dönemlerinde tespit edilen logaritmik A.I.

değerleri daha yüksek bulundu (p<0,001). 3. örnekleme dönemi incelendiğinde 4, 5,

6, 7 ve 8. örneklemelere ait avidite değerlerinin 3. örneklemeye göre arttığı ve p

değerlerinin 4. ve 5. örneklemeler için sırasıyla p=0,007, p=0,003; 6,7 ve 8.

örneklemeler için p<0,001 olduğu tespit edildi. 4. örneklemeden itibaren yapılan

örneklemelere ait A.I. ölçümlerinde istatistiksel olarak anlamlı bir fark

görülmemesine karşın, 5. ile 7. örnekleme arasında istatistiksel olarak anlamlı bir

artış tespit edildi (p=0,043). 6,7 ve 8. örneklemeler arasında avidite değerlerinde

anlamlı bir farklılık görülmedi.

3.3.2. İlk 6 Örneklemede Bulunan Serumların Avidite ELISA Testi

İlk 6 örnekleme döneminde mevcut olan 16 serum örneğinin avidite ELISA tekniği

ile test edilmesi sonucunda, PBS ve Üre uygulanan gözlerden elde edilen O.D. ve

A.I. değerleri Çizelge 3.11 de sunuldu.

57

Her bir örnekleme için O.D. değerlerinin ortalama ve SD değerleri çizelge

3.12 de gösterildi. 1. örneklemeye ait serumların BoHV-1 antikor negatif olarak

tespit edilmesinden dolayı söz konusu örneklemeye ait veriler gösterilmedi.

Çizelge 3.12. İlk 6 örneklemede bulunan serumlara ait O.D. değerlerinin ortalama ve standart

sapmaları Örnekleme

Dönemi Serum Sayısı

O.D. Ortalamaları

Standart Sapma

2 16 1,42 0,238 3 16 1,68 0,326 4 16 1,23 0,296 5 16 1,94 0,266 6 16 1,99 0,177

Örneklemelere ilişkin değerler, ortalama O.D. ± SD olarak değerlendirilerek

analiz edildiğinde, 2,3,4,5 ve 6. örneklemeler için ortalama O.D. değerleri sırasıyla;

1,42 ± 0,238, 1,68 ± 0,326, 1,23 ± 0,296, 1,94 ± 0,266, 1,99 ± 0,177 olarak tespit

edildi. Bu veriler değerlendirildiğinde, örneklemeler bazında O.D. değerleri arasında

anlamlı bir fark olduğu sonucuna varıldı (p<0,001).

İlk 6 örneklemede bulunan serumların, örneklemeler arası O.D. değerlerinin

farklılıkları incelendiğinde, 2. örneklemeye göre 5. ve 6. örnekleme arasındaki artış

istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,001). 3. örneklemeye göre ise, 5. ve 6.

örneklemelerin O.D. değerleri daha yüksek olup, p değerleri sırasıyla 0,009 ve 0,039

olarak tespit edildi. 4. örnekleme dönemi ele alındığında; 5. ve 6. örneklemelere ait

değerlerin 4 örneklemeye göre daha yüksek olduğu tespit edildi (p<0,001). 5 ve 6.

örneklemeler arasında O.D. değerleri bakımından anlamlı bir farklılık olmadığı

belirlendi.

Avidite ELISA testi sonucunda elde edilen A.I ve logaritmik A.I.

değerlerinin ortalama ve standart sapmaları ile ortanca, minimum ve maksimum

değerleri Çizelge 3.13 ve 3.14 de sunuldu.

58

Çizelge 3.13. İlk 6 örneklemede bulunan serumların % A.I. değerlerinin ortanca, minimum ve maksimum değerleri.

Örnekleme Dönemi

Serum Sayısı

Ortanca (%)

Minimum (%)

Maksimum (%)

2 16 67,50 52,00 88,00 3 16 77,00 65,00 98,00 4 16 87,00 70,00 97,00 5 16 86,50 71,00 99,00 6 16 94,00 79,00 99,00

2, 3, 4, 5 ve 6. örneklemelere ilişkin ortanca A.I. değerleri sırasıyla %67,5

[52-88], %77 [65-98], %87 [70-97], %86,5 [71-99] ve %94 [79-99] olarak tespit

edildi (Şekil 3.5).

Çizelge 3.14. İlk 6 örneklemede bulunan serumların logaritmik avidite değerlerinin ortalama ve standart sapmaları.

Örnekleme Dönemi

Serum Sayısı

Logaritmik A.I. Ortalamaları

Standart Sapma

2 16 1,82 0,055 3 16 1,90 0,051 4 16 1,92 0,041 5 16 1,93 0,040 6 16 1,96 0,028

Örneklemelere ait AI değerleri, logaritmik A.I. ortalamaları ± standart

sapmaları olarak analiz edildiğinde, 2,3,4,5 ve 6. örneklemeler için logaritmik A.I.

ortalama değerleri sırasıyla; 1,82 ± 0,055, 1,90 ± 0,051, 1,92 ± 0,041, 1,93 ± 0,040

ve 1,96 ± 0,028 olarak tespit edildi. Bu verilerin analizi sonucunda, örneklemeler

arası A.I. değerlerinde istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğu belirlendi

(p<0,001).

2. örneklemeden sonra yapılan tüm örneklemelerde avidite değerlerinde

anlamlı bir artış tespit edildi (3. örnekleme için p=0,006; 4,5,6. örneklemeler için

p<0,001). 3. ile 6. örnekleme ve 4. ile 6. örnekleme arasında A.I. değerlerinde

anlamlı bir fark olduğu (p=0,003 ve p=0,021), 3. ve 4. örneklemelere göre 6.

59

örneklemede elde edilen A.I. değerlerinin daha yüksek olduğu belirlendi. 3. ve 4., 3.

ve 5. örneklemeler ile 5. ve 6. örneklemeler arasında istatistiksel olarak anlamlı bir

fark tespit edilmedi.

3.3.3. Son 6 Örneklemede Bulunan Serumların Avidite ELISA Testi

Son 6 örnekleme döneminde mevcut olan 21 serum örneğinin avidite ELISA tekniği

ile test edilmesi sonucunda, PBS ve Üre uygulanan gözlerden elde edilen O.D. ve

A.I. değerleri Çizelge 3.15 de sunuldu.

Her bir örnekleme için O.D. değerlerinin ortalama ve SD değerleri çizelge

3.16 da sunuldu.

Çizelge 3.16. Son 6 örneklemede bulunan serumlara ait O.D. değerlerinin ortalama ve

standart sapmaları Örnekleme

Dönemi Serum Sayısı

O.D. Ortalamaları

Standart Sapma

3 21 1,57 0,335 4 21 1,23 0,342 5 21 1,82 0,384 6 21 1,89 0,290 7 21 2,02 0,147 8 21 2,05 0,197

3,4,5,6,7 ve 8. örneklemeler için ortalama O.D. değerleri sırasıyla; 1,57 ±

0,335, 1,23 ± 0,342, 1,82 ± 0,384, 1,89 ± 0,290, 2,02 ± 0,147 ve 2,05 ± 0,197 olarak

belirlendi. Verilerin analizi sonucunda, örneklemeler arasında O.D. değerlerinde

istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğu tespit edildi (p<0,001).

Son 6 örneklemede bulunan serumlarda, 3. örneklemeye göre 6,7 ve 8.

örneklemelere ait O.D. değerlerindeki artış istatistiksel olarak anlamlı bulundu

(p=0,033, p<0,001). Diğer taraftan, 4. örneklemeye göre 5,6,7 ve 8.

örneklemelerdeki O.D. değerlerinde anlamlı bir artış tespit edildi (p<0,001).

61

5. örneklemeden itibaren yapılan ileriye dönük örneklemeler karşılaştırıldığında,

anlamlı bir farklılık tespit edilmedi.

Avidite ELISA testi sonucunda elde edilen A.I ve logaritmik A.I.

değerlerinin ortalama ve standart sapmaları ile ortanca, minimum ve maksimum

değerleri Çizelge 3.17 ve 3.18 de sunuldu.

Çizelge 3.17. Son 6 örneklemede bulunan serumların % A.I. değerlerinin ortalama ve standart sapmaları ile ortanca, minimum ve maksimum değerleri.

Örnekleme Dönemi

Serum Sayısı

Ortanca (%)

Minimum (%)

Maksimum (%)

3 21 75,00 61,00 100,00 4 21 84,00 65,00 99,00 5 21 87,00 66,00 100,00 6 21 88,00 69,00 100,00 7 21 95,00 76,00 100,00 8 21 94,00 79,00 100,00

3, 4, 5, 6, 7 ve 8. örneklemelere ilişkin ortanca A.I. değerleri sırasıyla %75

[61-100], %84 [65-99], %87 [66-100], %88 [69-100], %95 [76-100] ve %94 [79-

100] olarak tespit edildi (Şekil 3.5).

Çizelge 3.18. Son 6 örneklemede bulunan serumların logaritmik avidite değerlerinin ortalama ve standart sapmaları

Örnekleme Dönemi

Serum Sayısı

Logaritmik A.I. Ortalamaları

Standart Sapma

3 21 1,89 0,052 4 21 1,91 0,048 5 21 1,93 0,049 6 21 1,93 0,047 7 21 1,96 0,032 8 21 1,96 0,031

3,4,5,6,7 ve 8. örneklemelerde bulunan serumlardan elde edilen logaritmik

A.I. ortalama değerleri sırasıyla; 1,89 ± 0,052, 1,91 ± 0,048, 1,93 ± 0,049, 1,93 ±

62

0,047, 1,96 ± 0,032 ve 1,96 ± 0,031 olarak tespit edildi. Bu verilerin analizi

sonucunda, örneklemeler arası A.I. değerlerinde istatistiksel olarak anlamlı bir fark

olduğu belirlendi (p<0,001).

3. örneklemeye göre 5,7 ve 8. örneklemelere ait A.I. değerlereinde anlamlı bir

artış tespit edildi (5. örnekleme için p=0,028; 7. ve 8. örneklemeler için p<0,001). 4.

örnekleme ile 7. ve 8. örneklemeler arasında istatistiksel olarak anlamlı bir artış

gözlendi ve p değerleri sırasıyla p=0,011 ve p=0,024 olarak belirlendi.

3.3.4. İlk 4 Örneklemede Bulunan Serumların Avidite ELISA Testi

İlk 4 örnekleme döneminde mevcut olan 13 serum örneğinin avidite ELISA tekniği

ile test edilmesi sonucunda, PBS ve Üre uygulanan gözlerden elde edilen O.D. ve

A.I. değerleri Çizelge 3.19 da sunuldu.

Her bir örnekleme için mevcut serumlardan elde edilen O.D. değerlerinin

ortalamaları ve standart sapmaları Çizelge 3.20 de gösterildi.

Çizelge 3.20. İlk 4 örneklemede bulunan serumlara ait O.D. değerlerinin ortalamaları, standart sapmaları

Örnekleme Dönemi

Serum Sayısı

O.D. Ortalamaları

Standart Sapma

2 13 1,31 0,250 3 13 1,51 0,394 4 13 1,26 0,413

Sadece ilk 4 örnekleme içinde bulunan serumlarda, O.D. ölçümlerindeki

değişim istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p=0,227).

A.I. ve logaritmik A.I. değerlerinin ortalama ve standart sapmaları ile

ortanca, minimum ve maksimum değerleri Çizelge 3.21 ve 3.22 de sunuldu.

64

Çizelge 3.21. İlk 4 örneklemede bulunan serumların % A.I. değerlerinin ortanca, minimum ve maksimum değerleri.

Örnekleme Dönemi

Serum Sayısı

Ortanca (%)

Minimum (%)

Maksimum (%)

2 13 64,00 57,00 91,00 3 13 77,00 47,00 100,00 4 13 86,00 68,00 95,00

2,3 ve 4. örneklemelere ilişkin ortanca A.I. değerleri sırasıyla %64 [57-91],

%77 [47-100] ve %86 [68-95] olarak tespit edildi (Şekil 3.5).

Çizelge 3.22. İlk 4 örneklemede bulunan serumların logaritmik avidite değerlerinin ortalama

ve standart sapmaları Örnekleme

Dönemi Serum Sayısı

Logaritmik A.I. Ortalamaları

Standart Sapma

2 13 1,82 0,065 3 13 1,88 0,080 4 13 1,91 0,055

Örneklemeler arasında A.I. değerleri açısından istatistiksel olarak anlamlı bir

fark tespit edildi (p=0,014). 4. örnekleme dönemine ait serumların avidite

değerlerinin, 2. örneklemeye ait olanlarla kıyaslandığında anlamlı bir artış gösterdiği

belirlendi (p<0,01).

65

Tüm örnekleme dönemlerinde, ilk 6, son 6 ve ilk 4 örnekleme dönemlerinde mevcut

olan hayvanlara ait serum örneklerinde, %65’in altında, %65 ile %75 arasında ve

%75’in üzerinde A.I. değeri tespit edilen serum sayıları ve bunların yüzde oranları

Çizelge 3.23, 3.24, 3.25 ve 3.26’da sunuldu.

Çizelge 3.23. Tüm örneklemelerde mevcut olan 21 hayvana ait serum örneklerinin %AI değerlerinin sayısal ve % dağılımları

AI < %65 %65 ≤ AI ≤ %75 AI > %75 ÖRNEKLEME DÖNEMİ H.S. * % H.S. * % H.S. * %

2. Örn 12 57 8 38 1 5 3. Örn 0 0 10 48 11 52 4. Örn 0 0 3 14 18 86 5. Örn 0 0 1 5 20 95 6. Örn 0 0 0 0 21 100 7. Örn 0 0 0 0 21 100 8. Örn 0 0 1 5 20 95

*H.S. : Hayvan Sayısı

Tüm örneklemelerde bulunan 21 hayvana ait % avidite indeksi değerleri

incelendiğinde, 2. örnekleme döneminde 12 adet hayvanın (%57) %65’in altında, 8

hayvanın (%38) %65-75 arasında, 1 adet hayvanın (%5) ise %75’in üzerinde

aviditeye sahip olduğu tespit edildi. 3. örneklemede ise, hiçbir hayvanda (%0)

%65’in altında A.I. değeri tespit edilmemiş olup, %65-75 arası 10 (%48), %75

değerinin üzerinde ise 11 adet (%52) hayvan tespit edildi. 4. örneklemeye

gelindiğinde, yine %65’in altında A.I. değerine sahip hayvan bulunmamakla birlikte

(%0), %65-75 arasında değere sahip hayvan sayısının 3 (%14) olduğu, %75 üzeri ise

18 (%86) hayvan bulunduğu belirlendi. 5, 6, 7 ve 8. örneklemelerde hiçbir hayvan

%65’in altında A.I. değerine sahip olmamakla birlikte, %65-75 arasında 5. ve 8.

örneklemede 1’er adet (%5) hayvan olup 6 ve 7. örneklemelerde bu aralığa dahil

hayvan bulunmadığı tespit edildi. 6. ve 7. örneklemelerde, hayvanların tümünün

(%100) %75 üzeri A.I. değerlerine ulaştığı, 5. ve 8. örneklemelerde ise 21 hayvanın

20’sinin (%95) %75’in üzerinde A.I. değerine ulaştığı belirlendi.

66

Çizelge 3.24. İlk 6 örneklemede mevcut olan 16 hayvana ait serum örneklerinin %AI değerlerinin sayısal ve % dağılımları.

AI < %65 %65 ≤ AI ≤ %75 AI > %75 ÖRNEKLEME DÖNEMİ H.S. * % H.S. * % H.S. * %

2. Örn 6 38 8 50 2 12 3. Örn 0 0 5 31 11 69 4. Örn 0 0 2 12 14 88 5. Örn 0 0 1 6 15 94 6. Örn 0 0 0 0 16 100

*H.S. : Hayvan Sayısı

İlk 6 örneklemede bulunan 16 hayvana ait veriler incelendiğinde, 2.

örnekleme döneminde 6 hayvanın (%38) %65’in altında, 8 hayvanın (%50) %65-75

arasında, 2 hayvanın (%12) ise %75’in üzerinde aviditeye sahip olduğu tespit edildi.

3. örneklemede ise, hiçbir hayvanda (%0) %65’in altında A.I. değeri tespit edilmemiş

olup, %65-75 arası 5 (%31), %75’in üzerinde ise 11 (%69) hayvan belirlendi. 4.

örneklemeye gelindiğinde, yine %65’in altında A.I. değerine sahip hayvan

bulunmamakla birlikte (%0), %65-75 arasında değere sahip hayvan sayısının 2

(%12) olduğu, %75 üzeri ise 14 (%88) hayvan bulunduğu gözlendi. 5. ve 6.

örneklemelerde de %65’in altında A.I. değeri bulunmayıp, 5. örneklemede 1 (%6), 6.

örneklemede 0 (%0) hayvan %65-75 arasında belirlenirken, %75’in üzerinde ise 5.

örneklemede 15 (%94), 6. örneklemede ise 16 (%100) hayvan tespit edildi.

Çizelge 3.25. Son 6 örneklemede mevcut olan 21 hayvana ait serum örneklerinin %AI değerlerinin sayısal ve % dağılımları.

AI < %65 %65 ≤ AI ≤ %75 AI > %75 ÖRNEKLEME DÖNEMİ H.S. * % H.S. * % H.S. * %

3. Örn 1 4 10 48 10 48 4. Örn 0 0 4 19 17 81 5. Örn 0 0 2 10 19 90 6. Örn 0 0 2 10 19 90 7. Örn 0 0 0 0 21 100 8. Örn 0 0 0 0 21 100

*H.S. : Hayvan Sayısı

Son 6 örneklemeyle ilgili değerler incelendiğinde, 3. örnekleme döneminde

21 hayvan içerisinde yalnız 1 (%4) hayvan %65 düzeyinin altında A.I. değerine sahip

iken, 10 (%48) hayvanda %65-75 arasında, yine 10 hayvanda (%48) %75’in üzerinde

A.I. tespit edildi. 4. örneklemede %65 düzeyinin altında hayvan bulunmazken, %65-

75 değerinde 4 (%19), %75’in üzerinde 17 (%81) hayvan tespit edildi. 5. ve 6.

67

örneklemelerde %65’in altında değere sahip hayvan olmayıp, %65-75 arası 2 (%10),

%75’in üzerinde 19 (%90) hayvan tespit edildi. 7. ve 8. örneklemelere gelindiğinde

ise, hayvanların tamamının (%100) A.I. düzeylerinin %75’in üzerine çıktığı

gözlendi.

Çizelge 3.26. İlk 4 örneklemede mevcut olan 13 hayvana ait serum örneklerinin %AI değerlerinin sayısal ve % dağılımları

AI < %65 %65 ≤ AI ≤ %75 AI > %75 ÖRNEKLEME DÖNEMİ H.S. * % H.S. * % H.S. * %

2. Örn 7 54 3 23 3 23 3. Örn 2 15 2 15 9 70 4. Örn 0 0 5 38 8 62

*H.S. : Hayvan Sayısı

İlk 4 örneklemede bulunan 13 hayvana ait veriler incelendiğinde, 2.

örnekleme döneminde 7 hayvanın (%54) %65’in altında, 3 hayvanın (%23) %65-75

arasında, 3 hayvanın (%23) ise %75’in üzerinde aviditeye sahip olduğu tespit edildi.

3. örneklemede ise, 2 hayvanın (%15) %65’in altında A.I. değeri tespit edilmiş olup,

%65-75 arası 2 (%15), %75’in üzerinde ise 9 (%70) hayvan tespit edildi. 4.

örneklemeye gelindiğinde, yine %65’in altında A.I. değerine sahip hayvan

bulunmamakla birlikte (%0), %65-75 arasında değere sahip hayvan sayısının 5

(%38) olduğu, %75 üzeri ise 8 (%62) hayvan bulunduğu belirlendi.

68

3.3.5. Örneklemelere Ait Bireysel Avidite Değerleri ile Nötralizasyon SN50

Değerlerinin Karşılaştırılması

Örneklemeler bazında bazı bireylerin nötralizasyon SN50 ve %A.I. değerleri Çizelge

3.27 de sunuldu.

Çizelge 3.27. Bazı bireylere ait SN50 ve A.I. (%) değerleri

1.örnekleme 2.örnekleme 3.örnekleme 4.örnekleme 5.örnekleme 6.örnekleme Kulak

No SN50* A.I. SN50* A.I. SN50* A.I. SN50* A.I. SN50* A.I. SN50* A.I.

3012 - T.E. 1/6 T.E. 1/6 73 1/16 94 1/128 100 1/48 94

3083 - T.E. 1/6 T.E. 1/32 90 1/32 65 1/128 96 1/48 89

3021 - T.E. 1/6 71 1/6 T.E. 1/6 97 1/128 96 1/96 98

3040 - T.E. 1/8 63 1/8 T.E. 1/6 94 1/192 100 1/64 97

3015 - T.E. 1/8 61 1/12 75 1/16 73 1/48 98 1/24 96

* Güngör (2003) den alınmıştır.

T.E.: Test edilmedi.

Örneklemeler bazında bireysel nötralizan antikor düzeyleri ile avidite değerleri

incelendiğinde, 3015 kulak numaralı hayvanın, 2. örneklemede A.I. değeri %61 ve

SN50 değeri 1/8 iken, 3 ve 4. örnekleme dönemlerinde sırasıyla A.I. değerleri %75 ve

%73, SN50 değerleri 1/12 ve 1/16 olarak tespit edildi. 5. örnekleme döneminde ise

A.I. değerinin %98, SN50 değerinin 1/48 düzeyine çıktığı belirlendi. 6. örnekleme

döneminde, SN50 değeri 1/24 düzeyine düşerken, A.I. değeri %96 olarak tespit edildi

(Şekil 3.6-A).

3083 kulak numaralı hayvanda, 3 ve 4. örneklemeler arasında SN50 değeri 1/32

düzeyinde kalırken, A.I. değerinin %90 dan %65 düzeyine düştüğü belirlendi. 5.

örneklemede ise, SN50 değerinin 1/128, A.I. değerinin %96 düzeyine ulaştığı, bunu

takip eden 6. örnekleme sonunda SN50 değeri 1/48 düzeyine düşerken A.I. değerinin

%89 olduğu tespit edildi (Şekil 3.6-B).

3040 kulak numaralı hayvana ait değerler incelendiğinde, 2. örnekleme döneminde

SN50 ve A.I. değerlerinin sırasıyla 1/8 ve %63 olduğu, 4. örnekleme döneminde SN50

69

değerinin 1/6 düzeyinde kalırken, A.I. değerinin %94 olduğu tespit edildi. 5.

örnekleme döneminde SN50 değerinin 1/192 düzeyine çıktığı, A.I. değerinin ise

%100 olduğu ve son örnekleme döneminde ise SN50 ve A.I. değerlerinin sırasıyla

1/64 ve %97 olduğu belirlendi (Şekil 3.6-C).

3012 ve 3021 numaralı hayvanlarda, SN50 değeri 4 ile 5. örneklemeler arasında 4

katlı artış ve 5. ile 6. örneklemeler arasında 4 katlı azalma gösterirken, A.I.

değerlerinde belirgin bir değişim olmadığı ve %94 düzeyinin altına inmediği tespit

edildi (Şekil 3.6-D,E).

71

4. TARTIŞMA

BoHV-1 enfeksiyonu sığırlarda dünya çapında oldukça yaygın olarak görülen, sığır

popülasyonlarındaki prevalansı ve sığır endüstrisi üzerindeki olumsuz etkileri ile

önem arz eden bir enfeksiyon konumundadır. Enfeksiyona bağlı olarak oluşan

ekonomik kayıplar nedeniyle birçok ülke hastalığın kontrol ve eradikasyonu

çalışmalarını yoğun bir şekilde sürdürmektedir (Straub, 1990).

Anabilim dalımızda BoHV-1 sürü dinamiğinin izlenmesi amacıyla yapılan bir

çalışmada, tespit edilen nötralizan antikor düzeylerinin çok kısa süreli stabilitesi, bu

antikorların aviditesi ile ilgili soruları gündeme getirmiştir (Güngör, 2003).

Bu araştırmada, yukarıda bahsedilen çalışma ile BoHV-1 enfeksiyonunun

varlığının ve olası rekürrensilerin tespit edildiği serum örneklerinde IgG antikor

aviditesinin IgG avidite ELISA tekniği ile saptanması ve böylelikle mevcut

antikorların kaynağının primer enfeksiyon mu yoksa bir reenfeksiyon veya

reaktivasyon mu olduğunun belirlenmesi amaçlanmıştır. Bunun yanısıra BoHV-1

enfeksiyonlarında antikor aviditesinin ölçülmesinin pratikte getirebileceği

diyagnostik avantajların araştırılması amaçlanmıştır.

Virus nötralizasyon (VN) testleri ve çeşitli ELISA sistemleri BoHV-1’e karşı

serumda oluşan antikorların tespitinde kullanılmakta olup (Kramps ve ark., 1993)

VN testi BoHV-1 eradikasyon programlarında referans test olarak bildirilmektedir

(Wyler ve ark., 1989). Ancak son yıllarda, BoHV-1 enfeksiyonunun teşhisinde

ELISA tekniği, bir çok laboratuvarda rutin olarak kullanılmakta ve sahip olduğu

avantajları nedeniyle VN testinin yerini almaktadır. Bununla birlikte, ELISA testinin

uluslararası standart test olarak kabul edilmesini engelleyen en büyük dezavantajı,

ELISA teknikleri arasındaki büyük farklılıklar ve laboratuvarlar arası

standardizasyon sağlamadaki zorluklar ile birlikte sonuçların sunulması için kabul

edilmiş bir sistemin bulunmayışı olarak bildirilmiştir (Lyaku ve ark., 1990).

72

BoHV-1 serolojisi için standardize ELISA’nın ana hatlarını kesin ve açık

olarak belirtmek için, uluslararası kontrol referans serumun tanımlanması gerekliliği

bildirilmiştir. BoHV-1 e karşı oluşan antikorların tespiti için farklı laboratuvarlarda

uygulanan testlerin performanslarını değerlendirmek için, Avrupa karşılaştırmalı

çalışmaları gerçekleştirilmiştir (Perrin ve ark., 1993; Kramps ve ark., 1996). Çeşitli

testlerin harmonizasyon ve standardizasyonu amacına ilave olarak, üç Avrupa Birliği

BoHV-1 referans serumu seçilmiş (Perrin ve ark., 1994), bunlar aynı zamanda OIE

tarafından kabul edilmiştir (OIE, 2000).

Bolton ve ark (1981) yeni bir ELISA sistemi geliştirileceği zaman, optimal

test koşullarını tespit etmek için bir çok parametrenin kontrol edilmesi gerekliliğini

vurgulamışlardır. Herrmann ve ark. (1979), kontamine antijenler ile reaksiyona bağlı

olarak oluşan yanlış pozitif sonuçların oranının azaltılması ve elimine edilmesinin

gerekliliğini ayrıca spesifik antijenin yüzeye bağlanmasının artırılması gerektiğini ve

bu sayede kontaminant makromoleküllerin bağlanma bölgeleri için antijenle

yarışmasının engelleneceğini bildirmişlerdir. Bu çalışmada öncelikle antijen

hazırlamak üzere kullanılacak virusun üretileceği hücre kültürünün herhangi bir

intrinsik kontaminant içermediği tespit edilmiştir. Antijenin kaplanacağı yüzeyin,

yüksek düzeyde antijen bağlama kapasitesine sahip (maxisorp; Nunc) ELISA tableti

olarak seçilmesine özen gösterilmiştir.

ELISA testi için gereken viral antijenin saflığı ve niteliğinin, test sisteminin

oluşturulması için önemli bir parametre olduğu bildirilmiştir (Chia ve Spence, 1979;

Denoyel ve ark., 1980). Bu araştırmada, BoHV-1 referans suşu ile 5 BoHV-1 saha

izolatının birleştirilmesi ile oluşturulmuş karma bir ELISA antijeni kullanılmıştır.

Antijenin protein yoğunluğuna dayanarak yapılan hesaplamada, 1/500 oranında

sulandırılabileceği tespit edilmiştir. Daha sonra yapılan son nokta sulandırmaları ile

antijenin 1/600 oranında sulandırılması ile optimum ELISA sonuçlarının elde

edildiği belirlenmiştir. Frazier ve Shope (1979) antijenin en uygun sulandırma

oranının belirlenmesi ile tabletin her gözü için daha az antijenin kullanılmasının

mümkün olduğunu ve böylece yüksek konsantrasyonlarda antijen ile kaplamaya

bağlı oluşan non spesifik reaksiyonların azaltılabileceğini bildirmişlerdir.

73

Bir ELISA testinin duyarlılığının, direkt olarak, spesifik olmayan

reaksiyonları elimine etmek için serumun sulandırılması gerekliliğine dayandığı

bildirilmiştir (Bolton ve ark., 1981). Collins ve ark. (1984) ELISA testinde

kullanılacak kontrol serumlar ile test serumlarının sulandırma oranının dikkatli bir

şekilde tespit edilmesi gerektiğini ve son nokta sulandırmalarının, her sulandırma

basamağındaki reaktiviteyi belirlemek için ideal olduğunu bildirmişlerdir. Bu

çalışmada, pozitif ve negatif kontrol serumların son nokta sulandırmaları ile elde

edilen eğriler, 1/600 antijen konsantrasyonunda serumların 1/50 oranında

sulandırılmasıyla uygulanan test sisteminin, oldukça kabul edilebilir sonuçlar

verdiğini göstermiştir. Son nokta sulandırmaları ve tek serum sulandırması ile ELISA

testinin uygulanması ile ilgili yapılan çalışmalar ile, bir çok antijene karşı tek bir

serum sulandırması kullanılarak ELISA testinin uygulanabileceği bildirilmiştir.

(Loon ve ark., 1981; Beccaria ve ark., 1982; Blomberg ve ark., 1983; Toma, 1983).

Bu araştırmada, pozitif kontrol serumun belirlenmesi için çeşitli serum

örnekleri test edilmiş, elde edilen veriler ışığında son nokta sulandırma oranı 1/160

olup başlangıç titresi (O.D.) yüksek (>2,000) olan ve SN50 değeri >1/64 olan serum

pozitif kontrol olarak kullanılmak üzere belirlenmiştir. Crowther (1995) pozitif

kontrol serumun tespitinde, son nokta sulandırma oranı yüksek olup başlangıç titre

değeri yüksek olan serumun seçilmesinin uygun olduğunu bildirmiştir.

Bolton ve ark. (1981) konjugat sulandırmalarının optimal şartlarının,

incelenen sisteme bağlı olduğunu, her sistem ve konjugat türü için ayrı ayrı tespit

edilmesinin gerekliliğini bildirmişlerdir. Aynı araştırıcılar, enzim substratlar için ise

optimal şartların, çoğunlukla konjuge edilmiş enzimle igili olduğunu ve aynı enzimi

kullanan farklı konjugatlar için yaklaşık aynı değerlerde olması gerektiğini

vurgulamışlardır. Bu çalışmada, konjugat olarak kullanılan peroksidaz enzimi ile

işaretli anti-sığır IgG’nin (ağır ve hafif zincirler) belirtilen (1/20000)

konsantrasyonda kullanılması yapılan değerlendirmeler sonucunda uygun

bulunmuştur. Substrat çözeltisi olarak fosfat-sitrat tamponu içerisinde hazırlanan

OPD çözeltisine 1/2000 oranında H2O2 eklenerek uygulanan test ile optimum

74

sonuçlar elde edilmiştir. Peroksidaz enziminin, yüksek H2O2 konsantrasyonlarından

etkilenebileceği ve her substrat için uygun ve kullanılabilir konsantrasyonların

belirlenmesi gerekliliği bildirilmiştir (Bolton ve ark., 1981).

Yapılan çalışmada, bloklama parametrelerinin dikkatli bir şekilde

belirlenmesi gerektiği tespit edilmiştir. Bloklama çözeltisini hazırlamada kullanılan

bileşenlerin, test sistemi ile uyum sağlayacak şekilde ve background değerlerini

minimize edecek şekilde seçilmesi gerektiği ayrıca bloklama işlemi için kullanılan

çözelti miktarı ve sürenin optimize edilmesi gerektiği tespit edilmiştir.

Collins ve ark. (1984) belirgin veya koruyucu ELISA titresinin

belirlenmesinin oldukça zor olduğunu ve bazı viral hastalıklarda özellikle

herpesviruslarda, enfeksiyon antikor varlığında tekrarlayabildiği için koruyucu

titrenin anlamlı olmayacağını bildirmişlerdir. ELISA titreleri ile enfeksiyondan

korunma arasındaki olası korrelasyonun, izole sığır popülasyonlarında yapılan

kontrollü deneysel çalışmalarla gösterilebileceği belirtilmiştir (Bolton ve ark., 1981).

Bolton ve ark (1981) ELISA nın serum nötralizasyona göre artan bir

sensitivitesi olduğunu, ancak belirgin bir ELISA titresi tanımlamanın mümkün

olmadığını bildirmişlerdir. Bununla birlikte herhangi bir pozitif reaksiyonun viral

antijenlere maruz kalmayı göstermekle birlikte, bunun önceki bir aşılamaya veya

subklinik, persiste veya aktif klinik enfeksiyona bağlı olarak oluşabileceğini öne

sürmüşlerdir.

IBR enfeksiyonlarına karşı gelişen immun yanıtın ölçülmesi için, ELISA aynı

zamanda akut ve konvalesan faz serum örneklerine uygulanmıştır. Murphy ve ark

(1980) çalışmalarında, akut ve konvalesan serumun 2 son nokta sulandırma ELISA

eğrisindeki alanı karşılaştırmış, küçük serolojik titre değişikliklerini ölçmek için bu

metodun yüksek derecede duyarlı olduğunu bildirmişlerdir. Ek olarak, çift serum

örneğinin test edilmesi, serokonversiyon değerinin olguların büyük çoğunluğunda

tespit edilebilmesi için özellikle düşük VN titresi olan serumların seçilmesi

gerekliliği belirtilmiştir.

75

Bu çalışmada, BoHV-1 enfeksiyonun başlangıç döneminde ve ilerleyen

dönemlerindeki antikor düzeyleri ile aviditelerini ayrıca primer ve sekonder

enfeksiyonlar ile reaktivasyonların antikor aviditesinde oluşturduğu değişimleri

belirlemek için BoHV-1 IgG avidite ELISA tekniği geliştirilmiştir.

Bu araştırmada, ilk örnekleme dönemindeki hayvanların tümü ELISA testi ile

negatif tespit edilmiştir. İlk örneklemeden 3 ay sonra yapılan ikinci örnekleme ve

bunu takip eden örneklemelerde hayvanların serokonverte olduğu tespit edilmiştir.

Avidite ELISA testi, hayvanların antikor pozitif bulunduğu 2. örneklemeden itibaren

uygulanmış olup, ardarda örneklemeleri bulunan hayvanlar gruplanmış ve

değerlendirmeler bu şekilde yapılmıştır.

Buna göre, tüm örneklemelerde bulunan 21 hayvana ait sayısal ve % avidite

indeksi dağılımları incelendiğinde, 2. örnekleme döneminde 12 hayvanın (%57)

%65’in altında, 8 hayvanın (%38) %65-75 arasında, 1 hayvanın (%5) ise %75’in

üzerinde aviditeye sahip olduğu tespit edilmiştir (Çizelge 3.23). Çalışmada, %65’in

altında A.I., düşük avidite (primer enfeksiyon) olarak değerlendirilmiştir.

Örneklemeler arasında A.I. değerleri arasındaki farklılık istatistiksel olarak anlamlı

bulunmuştur (p<0,001). 2. ve 3. örneklemelere göre ilerleyen örneklemelerin A.I.

değerleri daha yüksek bulunmakla birlikte, 4. örneklemeden itibaren belirgin bir fark

tespit edilememiştir. Bunun yanı sıra, 5. ile 7. örneklemeler arasında belirgin bir artış

tespit edilmiştir (Çizelge 3.9).

Örneklemeler bazında O.D. değerleri incelendiğinde ise, tüm örneklemelerde

bulunan serumlar için, 2. örneklemeden sonra 4. örnekleme hariç diğerlerinde O.D.

değerlerinin arttığı tespit edilmiştir (p<0,001). 4. örneklemede A.I. değerleri artış

gösterirken O.D. değerlerinin azalma eğilimi göstermesi, A.I. değerleri ile O.D.

değerleri (antikor düzeyleri) arasında bir etkileşim bulunmadığını düşündürmüştür. 5.

örneklemeden sonra O.D. değerlerinin platoya ulaştığı gözlenmiştir (Şekil 3.5).

76

İlk 6 örneklemede bulunan hayvanlar için, 2. örneklemeden sonra A.I.

değerlerinde artış belirlenmiş olup, özellikle 3. ve 4. örneklemeye göre 6.

örneklemeye ait A.I. değerlerinin anlamlı bir artış gösterdiği, 5. örneklemede ise 3 ve

4’e göre anlamlı bir fark olmadığı tespit edilmiştir (Çizelge 3.13). Bununla birlikte,

4. örneklemeye göre 5. ve 6. örneklemelere ait antikor düzeylerinin anlamlı bir artış

gösterdiği tespit edilmiştir (Şekil 3.5). 4. örneklemede antikor düzeylerinin (O.D.)

düşük olması, 5. örneklemede antikor düzeylerinde anlamlı bir artış tespit edilirken

A.I. düzeylerinde anlamlı bir fark olmaması ve bunu takip eden 6. örnekleme

A.I.’lerinde 3. ve 4. örneklemelere göre anlamlı bir fark oluşması, sürüde 4. ile 5.

örnekleme dönemleri arasında bir reaktivasyon veya reenfeksiyon oluştuğunu

(Güngör, 2003) destekler niteliktedir.

Son 6 örnekleme döneminde de A.I. değerlerindeki değişim anlamlı

bulunmuştur (p<0,001). 3. ve 4. örneklemeye göre ilerleyen dönemlerde A.I.

değerlerinin arttığı, 5. ile 6. örnekleme arasında sabit kaldığı, 6 ve 7. örneklemeler

arasındada artış gösterdiği tespit edilmiştir. Antikor düzeylerinin ise yine 4.

örneklemede azaldığı, 5. örneklemede arttığı ve daha sonrada sabit kaldığı

saptanmıştır (Şekil 3.5). Elde edilen veriler, antikor düzeyinde azalmaya rağmen

A.I.’nin arttığını (4. örnekleme), 6 ve 7. örneklemeler arasında da, antikor düzeyinde

belirgin bir farklılık olmamasına rağmen A.I. düzeyinin arttığını göstermiştir. İlk 4

örneklemede bulunan hayvanlara ait veriler incelendiğindede benzer sonuçlar

bulunmuştur.

Düşük ve yüksek aviditeli antikorların oranlarındaki farklılıkların, bireysel

heterojenite, kan alımı sırasındaki immun statü, enfeksiyonun başlangıcına göre kan

alınma zamanı, test tekniği, antijen hazırlanması, denatüran ajanın türü ve

konsantrasyonu ve antikor aviditesinin hesaplanmasında kullanılan metot gibi bir çok

faktöre bağlı olabileceği bildirilmiştir (Souza ve ark., 2003).

Yapılan çalışmada, 8M üre çözeltisi, 5-10 dakika arasında değişen sürelerde

uygulanmış, düşük ve yüksek aviditeli antikorların en iyi ayrımının 8M ürenin 7

77

dakika uygulanması ile yapılabildiği tespit edilmiştir. Araştırmada, düşük ve yüksek

antikor aviditesi sırayla AI<%65 ve A.I.>%75 olarak belirlenmiştir.

İstenilen koşulları sağlamak için gerekli denatüran konsantrasyonunun

antijene göre farklılık gösterdiği bildirilmiştir (Inouye ve ark., 1984). Bodeus ve ark.

(1998), yakın primer ve uzun-dönem HCMV enfeksiyonunu izlemek için 8M Üre

kullanarak gerçekleştirdikleri avidite testinde, A.I.<%50 değerleri primer, A.I. >%65

değerleri ise geçmiş enfeksiyon belirtisi olarak kabul etmişlerdir. Grangeot-Keros ve

ark. (1997), denatüran solüsyon olarak 8M üre kullanmışlar ve düşük aviditeyi A.I.

<%50 ve yüksek aviditeyi A.I. >%60 olarak belirlemişlerdir. Literatürde, düşük

aviditeli antikorlar için sınır değerleri bazı çalışmalarda %70-75 arasında değişirken

(Thomas ve ark., 1993; Joynson ve ark, 1990), bazılarında %30 olarak gösterilmiştir

(Kangro ve ark., 1991; Enders ve Knotek, 1989). Gutierrez ve ark. (1997) Herpes

simplex virus, Cytomegalovirus, Epstein Barr virus ve Human Herpesvirus 6’ya

karşı oluşan spesifik IgG antikor aviditesinin araştırılmasında %55 sınır noktası

kullanmışlar ve bu değerlendirmelerin, uygulanan denatüre edici ajana, söz konusu

virus tipine ve araştırıcının gereksinimlerine bağlı olduğunu bildirmişlerdir. Böttiger

ve Jensen (1997) düşük ve yüksek aviditenin farklı seviyelerinin, farklı antijenlerin

kullanımına ve farklı test sistemlerine bağlanabileceğini bildirmişlerdir.

Bu çalışmada, %65 ile %75 arası değerlerdeki avidite indeksleri şüpheli aralık

(orta düzeyde avidite) olarak kabul edilmiştir. BoHV-1 IgG aviditesi ile ilgili benzer

çalışmaların olmayışı, BoHV-1 enfeksiyonu için düşük ve yüksek aviditeyi ayırt

etmede belirgin bir cut-off değeri tanımlamayı olanaksız kılmaktadır. Buna rağmen,

örneklemeler bazında zaman içerisinde avidite indeksi değerlerinin anlamlı bir

şekilde yükselmesi, ilerleyen örnekleme dönemlerinde aviditenin çeşitli nedenlere

bağlı matürasyonunu ortaya koymuştur.

IgG antikor avidite testinin güvenilirliğinin oldukça yüksek olduğu, yanlış

pozitif veya negatif sonuçların ise eski enfeksiyon veya reaktivasyon gösteren

bireylerde immatür antikor persistensi, primer enfeksiyona sahip bireylerde antikor

aviditesinin hızlı matürasyonu ve kullanılan ticari antijendeki problemler gibi

78

nedenlerden kaynaklanabileceği bildirilmiştir (Gutierrez ve ark. 1997, Blackburn ve

ark. 1991).

Orta düzey aviditeye sahip olduğu tespit edilen serumların 2. ve 3. örnekleme

dönemlerinde yığılım gösterdiği dikkate alındığında, BoHV-1 antikoru varlığı

saptanamayan 1. örneklemeden sonra 2. ve 3. örneklemelere kadar geçen süre

zarfında, erken dönemde oluşmuş olabilecek bir enfeksiyona bağlı olarak bazı

bireylerde aviditenin matürasyonu gerçekleşmiş ve bu nedenle orta düzey avidite

gösteren bireylerin bu dönemlerde yığılım göstermiş olabileceği düşünülmüştür. Bu

durum nedeniyle aynı zamanda, düşük avidite sınırı da %65 düzeyinde belirlenmiştir.

Hedman ve Rousseau (1989) yaptıkları bir çalışmada, orta düzeyde avidite tespit

edilen serumların büyük olasılıkla oldukça yakın geçirilmiş CMV enfeksiyonunu

gösterdiğini, ancak serum örneği alındığında, enfeksiyonun üzerinden 1 aydan fazla

süre geçtiğini bildirmişlerdir. Tuokko (1995), düşük aviditeli kızamık antikorlarının

akut enfeksiyon sonrası 7 haftaya kadar tespit edilebildiğini ve 17-20 hafta içerisinde

kızamık IgG antikorlarının yüksek aviditeye ulaştığını öne sürmüştür. HHV-6

enfeksiyonu için; antikorların yüksek aviditeye ilk yanıtın ardından 5 ay içerisinde

ulaştığı bildirilmiştir (Ward ve ark., 1993). Hashido ve ark (1997), HSV spesifik IgG

aviditesinin plato değerlere ulaşmadan önce enfeksiyon sonrası 100. günden sonraya

kadar arttığını öne sürmüşlerdir.

IgG antikor avidite prosedürünün, yeni geçirilmiş (kısa dönem) ve eski (uzun

dönem) viral enfeksiyonların ayrımının yanısıra reenfeksiyon (yüksek antikor titresi,

yüksek avidite) ile primer enfeksiyonu (yüksek antikor titresi, düşük avidite) ayırt

etmede yararlı olduğu bildirilmiştir (Inouye ve ark., 1984). Bu çalışmada, 4.

örnekleme döneminde A.I. değerinin yükselmesine rağmen antikor düzeyinin

düşmesi, 4. örneklemeye kadar olan dönemin sürü genelinde 2. örneklemede varlığı

saptanan primer enfeksiyonun ilerleyen dönemi (eski enfeksiyon) olabileceğini, 5. ve

sonraki örnekleme dönemlerinde hem A.I. hemde antikor düzeylerinin artışının bu

dönemlerde bir reenfeksiyon veya reaktivasyonun oluştuğunu düşündürmektedir.

79

Avidite testinin uygulanmasında dikkat edilmesi gereken parametrelerden bir

diğerinin, taze hazırlanmış antijenlerin kullanımının gerekliliği olduğu öne

sürülmüştür (Inouye ve ark. 1984). Miyazawa ve ark (1982) rubella IgG antikor

tespiti için bir ELISA kitiyle enfeksiyondan 1 ay sonra alınan serumun düşük

reaksiyon verdiğini bildirmişlerdir. Aynı şekilde Inouye ve ark. (1984) erken serum

örneklerindeki IgG titreleri yüksekken ELISA kiti ile düşük reaksiyon verdiğini,

bunun yanında geç serum örneklerindeki IgG antikorlarının ELISA ile daha güçlü

reaksiyon verdiği fakat düşük titrede olduğunu bildirmişlerdir. Araştırıcılar, başka bir

kitlede aynı sonucu bulmuşlar ve bu kitlerin avidite prosedürü için uygun olmadığını,

bu ELISA kitlerinde viral antijenlerin dondurma-kurutma ve saklanma sırasında

denatürasyona uğradığını ve böylece düşük aviditeli antikorların bağlanamadığını

öne sürmüşlerdir. Çalışmada, taze hazırlanmış karma antijen kullanılmış, her test bir

gece önce antijen sulandırılıp kaplanarak uygulanmış olup, reaksiyonun ve

antikorların bağlanmasının oldukça güçlü şekillendiği gözlenmiştir.

Avidite testinin, grup veya sürülerin analizinde kullanıldığında oldukça

güvenilir epidemiyolojik bilgiler verdiği ancak, bireysel farklılıklardan dolayı,

avidite sonuçlarının tek bir hayvan için değerlendirilmesinin daha az belirleyici

olduğu bildirilmiştir (Björkman ve ark., 2005). Benzer şekilde, 8. örnekleme ve

sonrasında işletmeyle yapılan görüşmelerde, hayvanlarda BoHV-1 nedenli olabilecek

solunum ve genital hastalık problemlerinin hemen hemen yok denecek kadar az

olduğu bildirilmektedir. Bu durumun, sürü genelinde şekillenen avidite matürasyonu

ile ilişkili olarak gerçekleşmiş olabileceği düşünülmüştür. Aynı zamanda bu

çalışmada, bazı bireylerin primer enfeksiyon döneminde (2. örnekleme) yüksek

aviditeye sahip olduğu ve yine bazı bireylerin ilerleyen dönemlerde (5. ve 6.

örnekleme) yeterli avidite matürasyonu göstermediği tespit edilmiştir.

Araştırmada takip edilen hayvanların bir kısmında fluktuan IgG seyrine

rağmen stabil IgG aviditesi tespit edilmiştir. Bu durum, bireysel verilerin sürü

ortalamasına etkisinin izlenmesinde, avidite değerlerinin mutlaka göz önüne alınması

gerekliliğini ortaya koymaktadır. Güngör (2003) tarafından ileri sürülen antikor titre

80

düşüklüğünün düşük aviditeli antikorlara bağlı olmadığı, aksine bu serumlarda

belirlenen IgG’lerin avidite değerlerinin yüksek olduğu tespit edilmiştir.

Benzer şekilde, IgG avidite tekniklerinin, Cytomegalovirus (Blackburn ve

ark., 1991), Epstein-Barr virus (Gray, 1995), Human herpesvirus 6 (Ward ve ark.,

1993), Varicella-Zoster virus (Kangro ve ark., 1991), Herpes simplex virus (Hashido

ve ark., 1997) gibi, IgM ve IgG titrelerindeki artışın pratikte öneminin az olduğu

insan kronik enfeksiyöz hastalıklarının teşhisinde oldukça yararlı olduğu

bildirilmiştir. Bu tekniklerin aynı zamanda, enfeksiyondan sonraki zamanlarda da tek

bir serum örneğindeki araştırmalar için oldukça yararlı olduğu öne sürülmüştür

(Gutierrez ve ark., 1997).

81

5. SONUÇ ve ÖNERİLER

Araştırmada, BoHV-1 enfeksiyonunun varlığının ve olası rekürrensilerin daha

önceden yapılan bir çalışmada tespit edildiği bir süt sığırcılığı işletmesindeki

hayvanlara ait serum örneklerinde IgG antikor aviditesinin araştırılması ve böylelikle

mevcut antikorların kaynağının primer enfeksiyon mu yoksa bir reenfeksiyon veya

reaktivasyon mu olduğunun belirlenmesi ve BoHV-1 enfeksiyonlarında antikor

aviditesinin ölçülmesinin pratikte getirebileceği diyagnostik avantajların araştırılması

amaçlanmıştır. Yapılan araştırma sonucunda elde edilen veriler değerlendirildiğinde;

1. Gerekli parametreler test edilip, optimizasyon sağlandığı taktirde, indirekt

ELISA testinin IgG antikor tanısına yönelik uygun bir test olduğu,

2. BoHV-1 enfeksiyonunun başlangıç döneminde ve ilerleyen dönemlerindeki

antikor düzeyleri ile aviditelerini ayrıca primer ve sekonder enfeksiyonlar ile

reaktivasyonların antikor aviditesinde oluşturduğu değişimleri belirlemek için

BoHV-1 IgG avidite ELISA tekniğinin kullanılabileceği,

3. Indirekt ELISA testi kullanılarak geliştirilen IgG avidite testinin

longitudinal çalışmalar veya taramalarda, primer ve tekrarlayan virus

enfeksiyonlarından sonra bağışık yanıtın sorgulanması amacıyla kullanılabilecek

uygun bir araç olduğu,

4. IgG Avidite testinin, aralıkları daha kısa tutulan örneklemelere

uygulandığında, sürü geneli için yukarıda bahsedilen parametreler yönünden değerli

bilgiler vereceği,

5. Bireysel değerlendirmeler için antikor titre değerlerinin tek başına yeterli

olmadığı, mutlak suretle bireysel avidite indekslerinin de izlenmesine ihtiyaç

duyulduğu,

82

6. Avidite İndeksi ile eşik değerin tespitinde, kullanılan test tekniği ve

enfeksiyonun genel özellikleri dikkate alınmak suretiyle birbirine yakın iki değerin

sorgulanması gerekliliği sonucuna varılmıştır.

7. Araştırmadan elde edilen bulgular, doğal enfeksiyona benzer şekilde IgG

matürasyonunun, gerek marker ve gerekse konvansiyonel BoHV-1 aşılamalarından

sonra avidite indeksinin tespiti yoluyla yapılabileceğini de düşündürmüştür.

83

ÖZET

Bir Süt Sığırcılığı İşletmesinde BoHV-1 IgG Antikor Aviditesinin Araştırılması

Bu çalışmada, BoHV-1 enfeksiyonun başlangıç döneminde ve ilerleyen dönemlerindeki antikor aviditelerini ayrıca primer ve sekonder veya tekrarlayan enfeksiyonlardan sonra antikor aviditesindeki değişimleri belirlemek için BoHV-1 IgG avidite ELISA tekniği geliştirilmiştir.

Bu amaçla, daha önce yapılan bir çalışmada, tüzel nitelikli bir süt sığırcılığı işletmesindeki

hayvanlardan 2 yıl boyunca 3’er ay aralıklarla toplanan kan serumu örnekleri ile bu çalışmadaki son örneklemeden 1,5 yıl sonra ve bunu takiben 1. yıl sonunda alınan kan serumu örnekleri kullanılmıştır.

Çeşitli parametreler yönünden değerlendirilip optimizasyonu sağlanan bir indirekt ELISA sistemi ile, ilk örnekleme dönemindeki hayvanların tümü BoHV-1 antikor negatif tespit edilmiştir. İkinci örnekleme döneminden itibaren hayvanların serokonverte olduğu tespit edilmiş, avidite ELISA testi, antikor pozitif olarak bulunan hayvanlara uygulanmıştır.

Avidite ELISA testi sonucunda bulunan avidite indeksi (A.I.) değerleri, örneklemeler bazında, logaritmik A.I. ortalamaları ± SD olarak değerlendirilmiştir. Bu verilerin analizi sonucunda, örneklemeler arasında A.I. değerleri bakımından istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğu bulunmuştur (p<0,001).

Örnekleme dönemlerine göre A.I. (%) değerleri incelendiğinde, 2. örnekleme döneminde A.I. %65’in altında kalan hayvanların oranı %38-57 arasında değişirken, 3. örneklemede bu oran % 0-4 seviyesine düşmüş, 4. örneklemeden itibaren ilerleyen örneklemelerde %65’in altında A.I. tespit edilmemiştir. %75’in üzerinde A.I. değerine sahip hayvanların oranı ise, 2. örnekleme döneminde %5-12 oranında iken, 3. örneklemede %48-69 seviyesine yükselmiş, 4. örneklemede %81-88 olarak tespit edilmiş olup, bundan sonraki dönemlerde ise bu oran %90-100 düzeyine ulaşmıştır. Araştırmada, düşük ve yüksek antikor aviditesi sırasıyla AI<%65 ve A.I.>%75 olarak belirlenmiştir. %65 ile %75 arası değerlerdeki avidite indeksleri şüpheli aralık (orta düzeyde avidite) olarak kabul edilmiştir. A.I. değerlerinde örneklemeler arasındaki artış anlamlı bulunmuştur (p<0,001).

Elde edilen verilere göre, örneklenen popülasyonda zaman içerisinde aviditenin çeşitli

nedenlere bağlı matürasyonu ortaya konmuştur. Bunun yanı sıra BoHV-1 enfeksiyonunun başlangıç döneminde ve ilerleyen dönemlerindeki antikor düzeyleri ile aviditeleri ayrıca primer ve sekonder enfeksiyonlar ile reaktivasyonların sonrasında antikor aviditesindeki değişimler ortaya konmuştur. Gerekli parametreler test edilip optimizasyon sağlandığı taktirde, indirekt ELISA testinin IgG antikor tanısına yönelik uygun bir test olduğu ve bu test kullanılarak geliştirilen BoHV-1 IgG avidite testinin longitudinal çalışmalar veya taramalarda, primer ve tekrarlayan virus enfeksiyonlarında oluşan bağışık yanıtın incelenmesi amacıyla kullanılabilecek uygun bir araç olduğu sonucuna varılmıştır.

Anahtar Sözcükler: avidite, BoHV-1, ELISA, IgG antikor aviditesi , süt sığırcılığı

84

SUMMARY

Detection of BoHV-1 IgG Antibody Avidity In a Dairy Herd

In this study, a BoHV-1 IgG avidity ELISA test was developed to detect the antibody avidity at the early and late phases of BoHV-1 infection and to determine the changes in the antibody avidity after primary and secondary or recurrent infections. For this purpose, sera collected at 2 years period at 3 months intervals from a dairy herd in a past study and sera collected 1,5 and following 1 year after the last sampling of this study were used. Using an Indirect ELISA, which were evaluated according to various parameters and optimised, all of the animals at the first sampling were found antibody negative for BoHV-1 infection. Beginning from the second sampling, the animals were seroconverted and avidity ELISA test were applied to the animal which were found antibody positive for BoHV-1.

The avidity index (A.I.) values, which were found in the Avidity ELISA test were log transformed and presented as mean A.I. ± SD. When the data were analyzed, the A.I. values between the sampling periods were found significantly different (p<0,001).

When the A.I. (%) values according to sampling periods were investigated, at the second

sampling, the animals which have A.I. values below 65% ranged between 38% and 57%, at the third sampling this range decreased to 0-4% and from the fourth sampling on, none of the animals were found having A.I. below 65%. The range of the animals, which show A.I. values above 75% were found 5-12% for the second sampling, 48-69% for the third sampling, 81-88% for the fourth sampling and for the following sampling periods this range increased to the level of 90-100%. In this study, the low and high antibody levels were determined as <65% and >75% respectively. The avidity indices ranged between 65-75% were accepted as moderate avidity (grey zone). Increasing in the A.I. values between the progressive sampling periods were found statistically significant (p<0,001).

According to data, the avidity maturation were established in this population with time during

the sampling periods. Besides this, the antibody levels and avidities in the primer and following infection periods and changes in antibody avidities after the primary and secondary or recurrent infections were determined. It was found that, when the parameters which were required for the Indirect ELISA were evaluated and optimized, this test is suitable for the detection of IgG antibody and BoHV-1 IgG avidity ELISA is a useful tool for screening the antibody response after primer and recurrent viral infections in the longitudinal surveys.

Key Words: avidity, BoHV-1, ELISA, IgG antibody avidity, dairy herd

85

KAYNAKLAR

ABRIL,C., ENGELS, M., LIMAN, A., HILBE, M., ALBINI, S., FRANCHINI, M., SUTER, M., ACKERMANN, M., (2004). Both viral and host factors contribute to neurovirulence of bovine herpesviruses 1 and 5 in interferon receptor-deficient mice. Journal of Virology 78: 3644-3653. ACKERMANN, M., PETERHANS, E., WYLER, R., (1982). DNA of bovine herpesvirus type 1 in the trigeminal ganglia of latently infected calves. Amer. J. Vet. Res. 43: 36-40. ACKERMANN, M., METZLER, A.E., MCDONAGH, H., BRUCKNER, L., MTILLER, H.K., KIHM, U., (1986). BHV-1 und Cape-i-Infektions und Reaktivierungsversuche an Ziegen, Virst Spezifichtt der humoralen Antikorper und Charakterisienmg der viralen Antigene. Schweiz. Arch. Tierheilk. 128: 557-573. ACKERMANN, M., BELAK, S., BITSCH, V., EDWARDS, S., MOUSSA, A., ROCKBORN, G., THIRY, E., (1990). Round table on IBR/IPV Virus Infection Diagnosis and Control. Vet. Microbiol. 9: 53-63. AKINGBADE, D., COHEN, B.J., BROWN, D.W.G., (2003). Detection of Low-Avidity Immunoglobulin G in Oral Fluid Samples: New Approach for Rubella Diagnosis and Surveillance. Clin. Diag. Lab. İmmun. 10(1): 189-190. ASHBAUGH, S.E., THOMPSON, K.E., BELKNAP, E.B., SCHULTHEİSS, P.C., CHOWDHURY, S., COLLİNS, J.K., (1997). Specific detection of shedding and latency of bovine herpesvirus 1 and 5 using a nested polymerase chain reaction. J. Vet. Diagn. Invest. 9 :387–394. BABIUK, L.A., VAN DRUNEN LITTEL-VAN DEN HURK, S., TIKOO, S.K., (1996). Immunology of Bovine Herpesvirus-1 Infection. Vet. Microbiol. 53: 31-42. BECCARIA, E., FERRARI, A., NACHTMANN C, BONIOLO, A., BOVIS, M., ZANNIO, M., PETRUZELLI, E., (1982). Rapid detection of antibodies to infectious bovine rhinotracheitis by macro ELISA. Dev. Biol. Stand. 52: 141-146. BIUK-RUDAN, N., CVETNIC, S., MADIC, J., RUDAN, D., (1999). Prevalence of antibodies to IBR and BVD viruses in dairy cows with reproductive disorders. Theriogenology 51: 875-881. BJÖRKMAN, C., GONDIM, L.F.P., NÄSLUND, K., TREES, A.J., McALLISTER, M.M., (2005). IgG avidity pattern in cattle after ingestion of Neospora caninum oocysts. Vet Parasitol. 128: 195-200. BLACKBURN, N.K., BESSELAAR, T.G., SCHOUB, B.D., O’CONNELL, K.F., (1991). Differentiation of Primary Cytomegalovirus Infection From Reactivation Using the Urea Denaturation Test for Measuring Antibody Avidity. J. Medical Virol. 33: 6-9. BLOMBERG, J., NILSSON, I., ANDERSON, M., (1983). Viral antibody screening system that uses a standardized single dilution immunoglobulin G enzyme immunoassay with multiple antigens. J. Clin. Microbiol. 17: 1081-1091. BODEUS, M., FEYDER, S., GOUBAU,P., (1998). Avidity of IgG Antibodies Distinguishes Primary from Non-Primary Cytomegalovirus Infection in Pregnant Women. Clin. Diag. Virol. 9: 9-16.

86

BOLTON, D.C., CHU, H.J., ARDANS, A.A., KELLY, B., ZEE, Y.C., (1981). Evaluation of the critical parameters of a sensitive ELISA test using purified infectious bovine rhinotracheitis antigens. Vet. Microbiol. 6: 265-279. BÖTTIGER, B., JENSEN, I. P., (1997). Maturation of rubella IgG avidity over time after acute rubella infection. Clin. Diag. Virol. 8: 105-111. BRAKE, F., STUDDERT, M., (1985). Molecular epidemiology and pathogenesis of ruminant herpesviruses including bovine, buffalo and caprine herpesviruses 1 and bovine encephalitis herpesvirus. Austral. Vet. J. 62: 331-334. CHIA, W.K., SPENCE, L., (1979). Quantitative determination of cytomegalovirus IgG antibody by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Can. J. Microbiol. 25: 1082-1086. CHOW, T.L., (1972). Duration of immunity in heifers inoculated with infectious bovine rhinotracheitis virus. J.A.V.M.A. 160: 51-54. COLLINS, J.K., BULLA, G.A., RIEGEL, C.A., BUTCHER, A.C., (1984). A single dilution Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative detection of antibodies to bovine herpesvirus type 1. Vet. Microbiol. 10: 133-147. COLLINS, J.K., AYERS, V.K., CARMAN, J., (1988). Evaluation of an antigen-capture ELISA for the detection of bovine herpesvirus type 1 shedding from feedlot cattle. Vet. Microbiol. 16: 101–107. CROWTHER, J.R., (1995). ELISA Theory and Practice, Humana Press, Totowa, New Jersey, s: 64-160. DEAS, D.W., JOHNSTON, W.S., (1973). The Isolation and Transmission of the Virus of Infectious bovine rhinotracheitis/ Infectious Pustular Vulvovaginitis (IBR/IPV). Vet. Rec. 92: 636-639. DENIS, M., SPLITTER, G., THIRY, E., PASTORET, P.P., BABIUK, L.A., (1994). Infectious bovine rhinotracheitis (bovine herpesvirus l) Helper T cells, cytotoxicity T cells and NK cells. Goddeeris and I. Morrisons, Cell Medicated Immunity in Ruminants. CRC Press, Boca Raton, pp. 157-172. DENOYEL, G.A., GASPAR, A., NOUYRİGAT, C., (1980). Enzyme immunoassay for measurement of antibodies to herpes simplex virus infection: Comparison with complement fixation, immunofluorescent-antibody and neutralization techniques. J. Clin. Microbiol. 11: 114-119. DREW, T.W., HEWITT-TAYLOR, C., WATSON, L., EDWARDS, S., (1987). Effect of Storage Conditions and Culture Technique on the Isolation of Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus From Bovine Semen. Vet. Rec. 121(23): 547-548. EDWARDS, S., CHASEY, D., WHITE, H., (1983). Experimental infectious bovine rhinotracheitis: comparison of four antigen detection methods. Res. Vet. Sci. 34: 42–45. ENDERS, G., KNOTEK, F., (1989). Rubella IgG total antibody avidity and IgG subclass specific antibody avidity assay and their role in the differantiation between primary rubella and rubella reinfection. Infection 17: 218-226. ENGELS, M., GIULIANI, C., WILD, P., BECK, T.M., LOEPFE, E., WYLER, R., (1986). The genome of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) strains exhibiting a neuropathogenic potential compared to known BHV-1 strains by restriction site mapping and cross-hybridization. Virus Research 6: 57-73. ENGELS, M., ACKERMANN, M., (1996). Pathogenesis of Ruminant Herpesvirus Infections. Vet. Microbiol. 53: 3-15. FENNER, F., BACHMANN, P.A., GIBBS, E.P.J., MURPHY, F.A., STUDDERT, M.J., WHITE, D.O., (1987). Veterinary Virology. Herpesviridae. Academic Press Inc.

87

FENNER, F., GIBBS, E.P.J., MURPHY, F.A., ROTT, R., STUDDERT, M.J., WHITE, D.O., (1993). Diseases caused by alphaherpesviruses. Veterinary Virology, Edition 2. Academic Press, San Diego p: 345-348. FRAZIER, C.L., SHOPE, R.E., (1979). Detection of antibodies to alphaviruses by enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 10: 583-585. FRERICHS, G.N., WOODS, S.B., LUCAS, M.H., SANDS, J.J., (1982). Safety and efficiacy of live and inactivated infectious bovine rhinotracheitis vaccines. Veterinary Record 11 (1):116-122. FUCHS, M., HUBERT, P., DETTERER, J., RZIHA, H.J., (1999). Detection of bovine herpesvirus type 1 in blood from naturally infected cattle by using a sensitive PCR that discriminates between wild-type virus and virus lacking glycoprotein E. J. Clin. Microbiol. 37: 2498–2507. FULTON, R.W., SALİKİ, J.T., BURGE, L.J., PAYTON, M.E., (2003). Humoral immune response and assessment of vaccine virus shedding in calves receiving modified live virus vaccines containing bovine herpesvirus-1 and bovine viral diarrhoea virus 1 a. J. Vet. Med. 50: 31-37. FULTON, R.W., BRIGGS R.E., PAYTON, M.E., CONFER, A.W., SALİKİ, J.T., RIDPATH, J.F., BURGE, L.J., DUFF, G.C., (2004). Maternally derived humoral immunity to bovine viral diarrhoea virus (BVDV) 1a, BVDV 1b, BVDV 2, bovine herpesvirus-1, parainfluenza-3 virus, bovine respiratory syncytial virus, mannheimia haemolytica and pasteurella multocida in beef calves, antibody decline by half life studies and effect on response to vaccination. Vaccine 22: 643-649. GIBBS, E.P.J., RWEYEMAMU, M.M., (1977). Bovine herpesviruses part I. Bovine herpesvirus 1. Vet. Bull. 47: 317–343. GOFFAUX, M., HARLAY, T., ALLIETTA, M., (1976). Studies on the IBR/IPV Virus in the Semen of Insemination Bulls. Dtsch. Tierartzl. Wochenschr. 83 (12): 544-547. GRANGEOT-KEROS, L., MAYAUX, M.J., LEBON, P., FREYMUTH, F., EUGENE, G., STRICKER, R., DUSSAIX, E., (1997). Value of Cytomegalovirus (CMV) IgG avidity index for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. J. Infect. Dis. 175: 944-946. GRAY, J.J., (1995). Avidity of EBV VCA-specific IgG Antibodies: Distinction Between Recent Primary Infection, Past Infection and Reactivation. J. Virol. Methods. 52: 95-104. GREGERSEN, J.P., WAGNER, K., (1985). Persistent Infection of the Genital Tract and Excretion of the Vaccine Strain After Live Virus immunization with Bovine Herpesvirus 1. Zbl. Vet. Med. B 32: 354-360. GUTIERREZ, J., RODRIGUEZ, M., MAROTO, M.C., PIEDROLA, G., PEIRON, J., (1997). Behaviour of IgG Antibody Avidity for the Antigen and of IgA Antibody in Active Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, Herpes Simplex Virus and Human Herpes Virus 6 Infections. J. Infection. 35: 25-30. GÜNGÖR, B., (2003). Bir süt sığırcılığı İşletmesinde Tekrarlayan (Rekürrent) BHV-1 Enfeksiyon oranı, Virus İzolasyonu ve Karakterizasyonu. Ank. Üniv. Sağl. Bil. Enst. Doktora Tezi. GUY, J.S., POTGIETER, L.N.D., (1985). Bovine Herpesvirus-1 Infection of Cattle: Kinetics of Antibody Formation After the Reactivation of Bovine Herpesvirus-1 Infection in Cattle. Am. J. Vet. Res., 46(4): 899-901. HAGE, J.J., SCHUKKEN, Y.H., BERKEMA, H.W., BENEDICTUS, G., RIJSEWIJK, F.A., WENTİNK, G.H., (1996). Population dynamics of BHV-1 Infection in Diary Herd. Vet. Microbiol. 53: 169-180.

88

HAGE, J.J., SCHUKKEN, Y.H., DİJKSTRA, T., BERKEMA, H.W., VAN VALKENGOED, P.H., WENTİNK, G.H., (1998). Milk production and reproduction during a subclinical bovine herpesvirus 1 infection on a dairy farm. Prev. Vet. Med. 34:97–106. HANON, E., LAMBOT, M., HOORNAERT, S., LYAKU, J., PASTORET, P.P., (1998). Bovine herpesvirus-1-induced apoptosis: phenotypic characterization of susceptible peripheral blood mononuclear cells. Arch Virol 143: 441–52. HARIHARAN, M.J., NATARAJ, C., SRIKUMARAN, S., (1993). Down regulation of murine MHC class I expression by bovine herpesvirus 1. Viral Immunol. 6: 273-284. HARLOW, E., LANE, D., (1988). Antibodies. Cold Spring Harbor Laboratory . HASHIDO, M., INOUYE, S., KAWANA, T., (1997). Differantiation of Primary from Nonprimary Genital Herpes Infections by a Herpes Simplex Virus-Specific Immunoglobulin G Avidity Assay. J. Clin. Microbiol. July: 1766-1768. HEDMAN, K., ROUSSEAU, S.A., (1989). Measurement Of Avidity Of Specific IgG For Verification Of Recent Primary Rubella. J. Med. Virol. 27: 288-292. HERMANN, J.E., HENDRY, R.M., COLLINS, M.F., (1979). Factors involved in enzyme-linked immunoassay of viruses and evaluation of the method for identification of Enteroviruses. J. Clin. Microbiol. 10: 210-217. HUEMER, H.P., LARCHER, C., VAN DRUNEN LITTEL-VAN DEN HURK, S., BABIUK, L.A., (1993). Species selective interaction of Alphaherpesvirinae with the ‘unspecific’ immune system of the host. Arch. Virol. 130:353-364. INOUYE, S., HASEGAWA, A., MATSUNO, S., KATOW, S., (1984). Changes in Antibody Avidity After Virus Infections: Detection by an Immunosorbent Assay in which a Mild Protein-Denaturing Agent is Employed. J. Clin. Microbiol. 20(3): 525-529. JOHNSON, G.D., CAMPBELL, J.B., MINOCHA, H.C., BROCE ,A.B., (1991). Ability of Musca Autumnalis (Diptera:Muscidae) to acquire and transmit bovine herpesvirus-1. Journal of Medical Entomology 28: 841-846. JOYNSON, D.H.M., PAYNE, R.A., RAWAL, B.K., (1990). Potential role of IgG avidity for diagnosing toxoplasmosis. J. Clin. Pathol. 43: 1032-1033. KAASHOEK, M.J., MOERMAN, A., MADIC, J., RIJSEWIJK, F.A., QUAK, J., GIELKENS, A.L., VAN OIRSCHOT, J.T., (1994). A conventionally attenuated glycoprotein E-negative strain of bovine herpesvirus type 1 is an efficacious and safe vaccine. Vaccine 12: 439-444. KAASHOEK, M.J., MOERMAN, A., MADIC, J., WEERDMEESTER, K., MARIS- VELDHUIS, M., RIJSEWIJK, F.A., VAN OIRSCHOT, J.T., (1995). An inactivated vaccine based on a glycoprotein E-negative strain of bovine herpesvirus 1 induces protective immunity and allows serological differentiation. Vaccine 13 (4): 342–346. KAASHOEK, M.J., RIJSEWIJK, F.A.M., VAN OIRSCHOT, J.T., (1996). Persistence of Antibodies Against Bovine Herpesvirus 1 and Virus Reactivation Two to Three Years After Infection. Vet. Microbiol. 53: 103-110. KAHRS, R.F., (1977). Infectious Bovine Rhinotracheitis; A Review and Update. J.A.V.M.A. 171 (10): 1055-1064. KAHRS, R.F., (2001). Infectious Bovine Rhinotracheitis and Infectious Pustular Vulvovaginitis. Chapter 18. Viral Diseases of Cattle, Edition 2. Iowa state University Pres, p: 159-170.

89

KANGRO, H.O., MANZOOR, S., HARPER, D.R., (1991). Antibody Avidity Following Varicella-Zoster Virus Infections. J. Med. Virol. 33: 100-105. KARGER, A., SAALMIILLER, A., TUFARO, F., BANFIELD, B.W., METTENLEITER, T.C., (1995). Cell surface proteoglycans are not essential for infection by pseudorabies virus. J. Virol. 69: 3482-3489. KIT, S., QAVI, H., GAINES, J.D., BILLINGLSEY, P. AND MCCONNELL, S., (1985). Thymidine kinase negative bovine herpesvirus type 1 mutant is stable and highly attenuated in calves. Arch. Virol. 86: 63-83. KRAMPS, J.A., QUAK, S., WEERDMEESTER, K., VAN OIRSCHOT, J.T., (1993). Comparative study on sixteen enzyme-linked immunosorbent assays for the detection of antibodies to bovine herpesvirus 1 in cattle. Vet. Microbiol. 35: 11–21. KRAMPS, J.A., PERRIN, B., EDWARDS, S., VAN OIRSCHOT, J.T., (1996). A European inter-laboratory trial to evaluate the reliability of serological diagnosis of bovine herpesvirus 1 infections. Vet. Microbiol. 53: 153-161. LEMAIRE, M., SCHYNTS, F., MEYER, G., THIRY, E., (1999). Antibody response to glycoprotein E after bovine herpesvirus type 1 infection in passively immunised, glycoprotein E-negative calves. Vet. Rec. 144(7): 172–176. LEMAIRE, M., WEYNANTS, V., GODFROID, J., SCHYNTS, F., MEYER, G., LETESSON, J.J., THIRY, E., (2000). Effects of Bovine Herpesvirus 1 Infection in Calves With Maternal Antibodies on Immune Response and Virus Latency. J. Clin. Microbiol. 1885-1894. LOON, A.J., VAN LOGT, T.M., VAN DER VEEN, J., (1981). Enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of antibody against cytomegalovirus and rubella virus in a single serum dilution. J. Clin. Pathol. 34: 665-669. LOVATO, L., INMAN, M., HENDERSON, G., DOSTER, A., JONES, C., (2003). Infection of cattle with a bovine herpesvirus 1 strain that contains a mutation in the latency-related gene leads to increased apoptosis in trigeminal ganglia during the transition from acute infection to latency. J. Virol. 77: 4848-4857. LUDWIG, H., (1983). The Herpesviruses. Vol.2. (Ed. B. Roizman) Plenum Press. New York. 135-214. LYAKU, J.R.S., NETTLETON, P.F., SCOTT, G.R., (1990). A quantitative enzyme-linked immunosorbent assay for Bovine Herpesvirus Type 1 (BHV-1) Antibody. Biologicals 18: 199-205. MARS, M.H., DE JONG, M.C., VAN OIRSCHOT, J.T., (2000 a). A gE-negative BHV-1 vaccine virus strain cannot perpetuate in cattle populations. Vaccine 18 (20): 2120–2124. MARS, M.H., DE JONG, M.C., VAN OIRSCHOT, J.T., (2000 b). A gE negative bovine herpesvirus 1 vaccine strain is not re-excreted nor transmitted in an experimental cattle population after corticosteroid treatments. Vaccine 18 (19): 1975–1981. Mc KERCHER, D.G., BIBRACK, B., RICHARDS, W.P.C., (1970). Effects of the infectious bovine rhinotracheitis virus on the central nervous system of cattle. J.A.V.M.A. 156: 1460-1467. Mc KERCHER, D.G., (1973). Bovine Herpesvirus-1 Infections: Infectious bovine rhinotracheitis, Infectious Pustular Vulvovaginitis. The herpesviruses. Academic Pres, New York 428-442.

90

MECHOR, G.D., ROUSSEAUX, C.G., RADOSTITS, O.M., BABIUK, L.A., PETRIE, L., (1987). Protection of newborn calves against fatal multisystemic infectious bovine rhinotracheitis by feeding colostrum from vaccinated cows. Can. J. Vet.Res.51:452–459. MENANTEAU-HORTA, A.M., AMES, T.R., JOHNSON, D.W., MEISKE, J.C., (1985). Effect of Maternal antibody upon vaccination with Infectious Bovine Rhinotracheitis and Bovine Virus Diarrhea Vaccines. Can. J. Comp. Med. 49: 10-14. METZLER, A.E., MATILE, H., GASSMANN, U., ENGELS, M., WYLER, R. (1985). European isolates of bovine herpesvirus 1: a comparison of restriction endonuclease sites, polypeptides, and reactivity with monoclonal antibodies. Arch. Virol.85:57–69. METZLER A.E., OSSENT, P., GUSCETTI, F., RUBEL ,A., LANG, E.M., (1990). Serological evidence of herpesvirus infection in captive Asian elephants (Elephas maximus). J. Wild. Dis. 26: 41-49. MEURENS, F., KEIL, G.M., MUYLKENS, B., GOGEV, S., SCHYNTS, F., NEGRO, S., WIGGERS, L., THIRY, E., (2004). Interspesific recombination between two ruminant alphaherpesviruses, Bovine herpesviruses 1 and 5. J. Virol. 78: 9828-9836. MILLER, R.B., WILKIE, B.N., (1979). The Indirect Fluorescent Antibody Technique as a Method For Detecting Antibodies in Aborted Fetuses. Can. J. Comp. Med. 43(3): 255-261. MILLER, J.M., (1991). The effects of IBR Virus Infection on Reproductive Function of Cattle. Vet. Med. 1: 95-98. MIYAZAWA, H., ASHIWARA, Y., TOKIEDA, M., YAMABE, Y., (1982). Serological investigation of rubella infection by the hemagglutination-inhibition test and enzyme- linked immunosorbent assay. Rinsho Byori 30: 269-272. MOORE, S., GUNN, M., WALLS, D., (2000). A rapid and sensitive PCR-based diagnostic assay to detect bovine herpesvirus 1 in routine diagnostic submissions. Vet.Microbiol.75:145–153. MURPHY, B.R., TIERNEY, E.L., BARBOUR, B.A., YOLKEN, R.H., ALLING, D.W., HOLLEY, H.P., MAYNER, R.E., CHANOCK, R.M., (1980). Use of the enzyme-linked immunosorbent assay to detect serum antibody responses of volunteers who received attenuated influenza A virus vaccines. Infect. Immun. 29: 342-347. NYAGA, P.N., Mc KERCHER, D.G., (1980). Pathogenesis of bovine herpesvirus (BHV-1) infections: Interactions of the virus with peripheral bovine blood ceilular components. Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 2: 587-602. OIE, (2000). Infectıous Bovine Rhinotracheitis / Infectious Pustular Vulvovaginitis. Chapter 2.3.5. Manual of Standards Diagnostic Tests and Vaccines 2000, Edition 4. Office International des Epizooties. PERRIN, B., BITSCH, V., CORDIOLI, P., EDWARDS, S., ELOIT, M., GUERIN, B., LENIHAN, P., PERRIN, M., RONSHOLT, L., VAN OIRSCHOT, J.T., VANOPDENBOSCH, E., WELLEMANS, G., WIZIGMANN, G., THIBIER, M. (1993). A European comparative study of serological methods for the diagnosis of infectious bovine rhinotracheitis. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz. 12: 969–984. PERRIN, B., CALVO, T., CORDİOLİ, P., COUDERT, M., EDWARDS, S., ELOİT, M., GUERİN, B., KRAMPS, J.A., LENİHAN, P., PASCHALERİ, E., PERRİN, M., SCHON, J., VAN OİRSCHOT, J.T., VANOPDENBOSCH, E., WELLEMANS, G., WİZİGMANN, G., THİBİER, M., (1994). Selection of European Union standard reference sera for use in the serological diagnosis of infectious bovine rhinotracheitis. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz. 13: 947–960.

91

PORTER, D.D., LARSEN, A.E., COX, N.A., (1975). Isolation of infectious bovine rhinotracheitis virus from Mustelidae. J. Clin. Microbiol. 1: 112-113. PROBST, U., EHRENSPERGER, F., ACKERMANN, M., MULLER, H., KIHM, U., (1983). Bovine herpesvirus-1 (BHV-1) Shedding in the milk during the acute and Latent State of Infection. Exper. 39:1425. REBHUN, W.C., SMITH, J.S., POST, J.E., HOLDEN, H.R., (1978). An Outbreak of Conjunctival Form of Infectious Bovine Rhinotracheitis. Cornell Vet. 68(3): 297-301. REED, D.E., BICKNELL, E.J., LARSON, C.A., KNUDTSON, W.U., KIRKBRIDE, C.A., (1971). Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus-Induced Abortation: Rapid Diagnosis by Fluorescent Antibody Technique. Am. J. Vet. Res. 32(9): 1423-1426. RIJSEWIJK, F.A., KAASHOEK, M.J., LANGEVELD, J.P., MELOEN, R., JUDEK, J., BİENKOWSKA-SZEWCZYK, K., MARİS-VELDHUİS, M.A., VAN OİRSCHOT, J.T., (1999). Epitopes on glycoportein C of bovine herpesvirus-1 (BHV-1) that allow differentiation between BHV-1.1 and BHV-1.2 strains. J. Gen. Virol. 80: 1477–1483. ROS, C., RIQUELME, M.E., OHMAN FORSLUND, K., BELAK, S., (1999). Improved detection of five closely related ruminant alphaherpesviruses by specific amplification of viral genome sequences. J. Virol. Methods 83: 55–65. ROUSE, B.T., BABIUK, L.A., (1978). Mechanisms of Recovery From Herpesvirus Infections. A Review. Can. J. Comp. Med. 24(9): 1076-1081. SCAHAW, EU., (2000). Report on BoHV-1 marker vaccines and the accompanying diagnostic tests, [URL: http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/scah/out49-en.pdf]. SCHWYZER, M., ACKERMANN, M., (1996). Molecular Virology of Ruminant Herpesviruses. Vet. Microbiol. 53(1-2): 17-29. SCHYNTS, F., BARANOWSKI, E., LEMAIRE, M., THIRY, E., (1999). A specific PCR to differentiate between gE negative vaccine and wildtype bovine herpesvirus type 1 strains. Vet. Microbiol. 66: 187–195. SCOTT, F.M.M., 1989. Bovine herpesvirus 2 infection. In: Cl. Wittmann (Editor), Herpesvirus Diseases of Cattle, Horses, and Pigs. Kluwer Academic Publishers, Boston, Dordrecht, London, pp. 73-95. SLIM, A., ELAZHARY, M.A., (1983). Detection of Infectious Bovine Rhinotracheitis and Bovine Viral Diarrhea Viruses in the Nasal Epithelial Cells by the Direct Immunflourescence Techniques. Can. J. Comp. Med. 47(1): 18-22. SOUZA, S., BONON, S.H.A., COSTA, S.C.B., ROSSI, C.L., (2003). Evaluation of an in-house specific immunoglobulin G (IgG) avidity ELISA for distinguishing recent primary from long-term human cytomegalovirus (HCMV) infection. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo 45(6): 323-326. STRAUB, O.C., (1987). Untersuchungen zur bestimmung der rinderinfektio sen dosis bei einem virulenten und einem avirulenten BHV-1 stamm zur ermittlung der Viruslatenz. Tierarztliche Umschau 42:231–234. STRAUB, O.C., (1990). Infectious bovine rhinotracheitis virus. Virus Infections of Ruminants. Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Oxford, New York, Tokyo, pp. 71-108. STRAUB, O.C., LORENZ, R.J., (1991). Behandlung von im Atmungstrakt Latent BHV-1 Infizierten Rindem mit Verschiederen Immunsuppressiva. Tierarztliche Umschau 46: 344-354.

92

TAYLOR, R.E., SEAL, B.S., St. JEAR, S., (1982). Isolation of infectious bovine rhinotracheitis virus from the soft-shelled tick, Ornithodoros coriaceus. Science 216: 300-301. TERPSTRA, C., (1979). Diagnosis of Infectious Bovine Rhinotracheitis by Direct Immunofluorescence. Vet. Q. 1: 138–144. THAKER, S.R., STINE, D.L., ZAMB, T.J., SRIKUMARAN, S., (1994). Identification of a putative cellular receptor for bovine herpesvirus 1. J. Gen. Virol. 75: 2303-2309.

THIRY, E., SALIKI, J.T., BUBLOT, M., PASTORET, P.P., (1987). Reactivation of infectious Bovine Rhinotracheitis Virus by Transport. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 10: 59-63. THOMAS, H.J., MORGAN-CAPNER, P., CRADOCK-WATSON, J.E., ENDERS, G., BEST, J.M., O’SHEA, S., (1993). Slow maturation of IgG1 avidity and persistence of specific IgM in congenital rubella: implications for diagnosis and immunopathology. J. Med. Virol. 41(3): 196-200. TIKOO, SK., CAMPOS, M., BABIUK, L.A., (1995). Bovine herpesvirus 1 (BHV-1): Biology, pathogenesis and control. Adv. Virus Res. 45: 191-223. TOMA, B., (1983). Serological Diagnosis of pseudorabies using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). R.C. In: R.C. Wardley and J.R. Crowther (Editors), The ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay in Veterinary Research and Diagnosis. Martinus Nijhoff, The Hague, s: 212-216. TUOKKO, H., (1995). Detection of acute measles infections by indirect and u-capture enzyme immunoassays for immunoglobulin M antibodies and measles immunoglobulin G antibody avidity enzyme immunoassay. J. Med. Virol. 45: 306-311. VAN DONKERSGOED, J., BABIUK, L.A., (1991). Diagnosis and managing the respiratory form of infectious bovine rhinotracheitis. Vet. Med. 86: 86-94. VAN DRUNEN LITTEL-VAN DEN HURK, S., PARKER, M.D., MASSIE, B., VAN DEN HURK, J., HARLAND R., BABIUK, L.A. and ZAMB, T.J., (1993). Protection of cattle from BHV-1 infection by immunization with recombinant glycoprotein gIV. Vaccine 11: 25-35. VAN ENGELENBURG, F.A.C., MAES, R.K., VAN OIRSCHOT, J.T., RIJSEWIJK, F.A.M., (1993). Rapid and sensitive detection of bovine herpesvirus type 1 in bovine semen by a polymerase chain reaction based assay. J. Clin. Microbiol. 31: 3129–3135. VAN ENGELENBURG, F.A.C., KAASHOEK, M.J., VAN OIRSCHOT, J.T., RIJSEWIJK, F.A.M., (1994). A glycoprotein E deletion mutant of bovine herpesvirus 1 infects the same limited number of tissues in calves as wild-type virus, but for a shorter period. Pathogenesis of bovine herpesvirus 1 infections. Prospects for a gE-negative marker vaccine and molecular diagnosis. University of Utrecht, The Netherlands, pp. 33-50. VAN OIRSCHOT, J.T., (1996). Advances in the development and evaluation of bovine herpesvirus I vaccines. Vet. Microbiol. 53: 43-54. VAN OIRSCHOT, J.T., KAASHOEK, M.J., MARIS-VELDHUIS, M.A., WEERDMEESTER, K., RIJSEWIJK, F.A., (1997). An enzyme-linked immunosorbent assay to detect antibodies against glycoprotein gE of bovine herpesvirus 1 allows differentiation between infected and vaccinated cattle. J. Virol. Meth. 67 (1): 23–34. VAN OIRSCHOT, J.T., (1999). Bovine Viral Vaccines, Diagnostics and Eradication: Past, Present and Future. Adv. Vet. Med. 41: 197-216.

93

WARD, K.N., GRAY, M.E., JOSLIN, M.E., SHELDON, M.J., (1993). Avidity of IgG Antibodies to Human Herpesvirus-6 Distinguishes Primary from Recurrent Infection in Organ Transplant Recipients and Excludes Cross-Reactivity with Other Herpesviruses. J. Med. Virol. 39: 44-49. WELLENBERG, G.J., VERSTRATEN, E.R.A.M., MARS, M.H., VAN OİRSCHOT, J.T., (1998). Detection of bovine herpesvirus 1 glycoprotein E antibodies in individual milk samples by enzyme-linked immunosorbent assays. J. Clin. Microbiol., 36: 409–413. WELLENBERG, G.J., MARS, M.H., VAN OİRSCHOT, J.T., (2001). Antibodies against bovine herpesvirus (BHV) 5 may be differentiated from antibodies against BHV-1 in a BHV-1 glycoprotein E blocking ELISA. Vet. Microbiol. 78: 79-84. WHETSTONE, C.A., EVERMANN, J.F., (1988). Characterization of bovine herpesviruses isolated from six sheep and four goats by restriction endonuclease analysis and radioimmunoprecipitation. Am. J. Vet. Res. 49: 781-785. WINKLER, M.T.C., DOSTER, A., JONES, C., (1999). Bovine herpesvirus 1 can infect CD4+ T lymphocytes and induce programmed cell death during acute infection of cattle. J. Virol. 73: 8657–8668. WYLER, R., ENGELS, M., SCHWYZER, M., (1989). Infectious Bovine Rhinotracheitis / Vulvovaginitis. Advances in Virology. 1-72. XIA, J.C., YASON, C.V., KIBENGE, F.S.B., (1995). Comparison of dot blot hybridisation, polymerase chain reaction, and virus isolation for detection of bovine herpesvirus-1 (BHV-1) in artificially infected semen. Can. J. Vet. Res. 59: 102-109. YAN, S.S., FEDORKO, D.P., (2002). Recent Advances in Laboratory Diagnosis of Human Cytomegalovirus Infection. Clin. Appl. Immunol. Rev. 2: 155-167. YATES, W.D.G., (1982). A review of infectious bovine rhinotracheitis, shipping fever pneumonia and viral-bacterial synergism in respiratory disease of cattle. Can. J. Comp. Med. 46: 225-263.

94

ÖZGEÇMİŞ

I- Bireysel Bilgiler

Adı : Ayşe Başak Soyadı : Demir Doğum yeri ve tarihi : Ankara, 1977 Uyruğu : T.C. Medeni durumu : Bekar İletişim adresi ve telefonu : Şerefli sokak 19/1 Mebusevleri 06580 Tandoğan / Ankara 0532 556 90 44

II- Eğitimi

Doktora: Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı, (2000-2006)

Lisans: Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi, 1994-1999 İlk ve Ortaöğretim: Özel Yükseliş Koleji, Ankara, 1983-1994 Yabancı dili: İngilizce

III- Mesleki Deneyimi

Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı, Araştırma Görevlisi, 2002-2006 T.C. Sağlık Bakanlığı Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı Viroloji Laboratuvar Şefliği, Veteriner Hekim, 2006

IV- Bilimsel İlgi Alanları

Yayınları: • Burgu, İ., Alkan, F., Karaoglu, T., Bilge Dağalp, S., Can-Şahna, K.,

Güngör, B., Demir, A. B. (2005): Control and eradication programme of EBL in selected herds in Turkey, DTW, 112: 271-274.

• Gencay, A., Öncel, T., Karaoğlu, T., Sancak, A., Demir, A. B., Özkul, A. (2004): Antibody prevalence to Canine Distemper Virus (CDV) in stray dogs in Turkey. Rev Med Vet, 155: 432-434.

V- Bilimsel Etkinlikleri

• Ayşe Başak Demir, BLV Enfeksiyonu, Tigem Meslekiçi Eğitim Semineri II., Tigem Toplantı Salonu, Ankara, 28 Haziran 2005.

• Özkul, A., Alkan, F., Demir, A. B., Karaoğlu, T., Bilge Dağalp, S., Akça, Y., Burgu, İ. Sığır Herpesvirus Tip 1(BHV-1) İzolatlarında gE Kodlayan Gen Bölgelerinin Karakterizasyonu ve gE Silinmiş Marker BHV-1 (Rekombinant) Üretimi, 2.Ulusal Viroloji Kongresi, 13-17 Eylül 2005, Kemer, Antalya, Poster Sunumu.