borsa di studio effetti dei peptidi natriuretici cardiaci su … · 2017-10-25 · dieta...

Introduzione

L’obesità è una condizione sempre più comune, associa-ta a dismetabolismo, ipertensione arteriosa ed aumen-tato rischio cardiovascolare1. L’eziopatologia dell’obesi-tà è multifattoriale, inclusa predisposizione genetica, potenti influenze ambientali obesogeniche e complessi meccanismi biologici2,3. In particolare, l’incremento del grasso viscerale è un fattore chiave nella patogenesi del-le anomalie metaboliche e cardiovascolari associate all’obesità4. Il nesso fisiopatologico tra adiposità visce-rale e complicazioni cardiovascolari si è focalizzato sulla sensibilità all’insulina, sistema nervoso simpatico, sistema renina-angiotensina-aldosterone (SRAA) e re-centemente sul sistema dei peptidi natriuretici cardiaci (CNP)5. SRAA e CNP sono sistemi endogeni antagoni-sti per quanto riguarda il bilancio del sodio, il sistema cardiovascolare e il metabolismo6. SRAA è disregolato nei pazienti obesi e il tessuto adiposo ha un sistema renina-angiotensina che è attivo sia a livello locale che a livello sistemico7. I CNP, il peptide natriuretico atria-le (ANP) e il suo omologo prodotto a livello ventricola-re (BNP), sono ormoni in grado di indurre natriuresi e diuresi attraverso un effetto diretto a livello del tubulo renale prossimale, un’aumentata filtrazione glomerula-re ed un’inibizione del riassorbimento distale di sodio attraverso il canale epiteliale del sodio, svolgendo quin-di un ruolo centrale nell’omeostasi dei fluidi e nel con-trollo dell’emodinamica8.Oltre a questo ruolo ormai noto da diverso tempo, a questo sistema ormonale viene anche attribuito un ruo-lo di complessiva “cardioprotezione” per le loro ben documentate azioni anti-ipertrofia, anti-fibrosi e anti-aritmica su cardiomiociti e fibroblasti cardiaci9. Il re-cettore di tipo A (NPRA), biologicamente attivo, e quel-

lo di tipo C (NPRC), di clearance, sono entrambi co-espressi nel tessuto adiposo umano10. Il rapporto tra l’espressione di NPRA e l’espressione di NPRC è ridot-to nel tessuto adiposo sottocutaneo dei pazienti obesi-ipertesi, suggerendo una maggiore clearance, NPRC-mediata, e/o una ridotta attività dei CNP in questo tessuto11. Il recettore di clearance per i CNP (codificato dal gene NPR3), nel tessuto adiposo del ratto, viene in-tensamente down-regolato dal digiuno12, mentre una dieta ipocalorica in obesi ipertesi aumenta la risposta biologica e clinica all’infusione di ANP13. Questo sug-gerisce da un lato un ruolo metabolico dei CNP nel metabolismo adipocitario e dall’altro un possibile ruo-lo del tessuto adiposo nella rimozione, ovvero nella clea-rance, dei CNP dalla circolazione tramite l’abbondante espressione di NPR314. Recentemente è stato dimostrato che i CNP, in partico-lare l’ANP, agendo via NPRA e cGMP, sono potenti ormoni lipolitici con potenza analoga a quella delle ca-tecolammine. Questo postulato mette quindi in stretto rapporto il sistema dei CNP con il metabolismo lipidico del tessuto adiposo15,16. I CNP appaiono quindi gli or-moni “ideali” per facilitare l’utilizzo degli acidi grassi liberi come preferenziale fonte energetica a livello car-diaco e del muscolo scheletrico in quanto capaci, con-temporaneamente, di incrementare il numero di mito-condri funzionali attraverso il cGMP, un mediatore chiave della mitocondriogenesi17,18. L’effetto finale, ri-sultante da questo insieme di attività a livello del tessu-to adiposo e muscolare dei peptidi natriuretici, appare essere quello di migliorare il metabolismo energetico attraverso un miglioramento del metabolismo lipidico e glicemico. A conferma di ciò, sia l’obesità che la sin-drome metabolica sono caratterizzate da una riduzione dei livelli circolanti dei CNP che si manifesta insieme

BORSA DI STUDIO

Effetti dei peptidi natriuretici cardiaci su metabolismo lipidico, mitocondriogenesi

e termogenesi in adipociti umaniAntonella Pocognoli

Clinica di Medicina Interna e Geriatria, Dipartimento di Scienze Cliniche e Molecolari, Università Politecnica delle Marche, Ospedale “U. Sestilli”, INRCA, Ancona

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ad una riduzione della loro attività biologica19,20. Molto più recentemente, la “riscoperta” della presenza nell’uo-mo di un tessuto adiposo bruno funzionante ha ripor-tato l’attenzione sul ruolo che gli adipociti bruni posso-no avere nel dispendio energetico attraverso la via della UCP1 (uncoupling protein 1)21. In una recente rassegna è stato ipotizzato che l’incremento dopo restrizione calorica del cGMP, che a sua volta stimola la mitocon-driogenesi, possa dipendere almeno in parte da un’au-mentata attività dei CNP22. È stato anche ipotizzato che in presenza di UCP1, gli acidi grassi non esterificati (NEFA) possano essere ampiamente utilizzati non per produrre ATP ma possano essere “bruciati” per pro-durre calore conferendo quindi ai CNP il potenziale ruolo di ormoni cardiometabolici anti-obesità23. Sulla base della conoscenza degli effetti dei CNP e dal mo-mento che ormai da anni è documentata la capacità degli adipociti maturi uniloculari di diventare multi-loculari e dividersi24, è in corso uno studio su colture primarie di adipociti umani e su una linea cellulare umana Simpson-Golabi-Behmel (SGBS) proveniente da tessuto sottocutaneo.

Materiali e metodi

Colture cellulari primarie

Tessuto adiposo viscerale (omentale e/o perirenale) è stato ottenuto durante interventi chirurgici in elezione eseguiti su pazienti ricoverati presso l’Azienda Ospeda-liero-Universitaria “Umberto I-Lancisi-Salesi” di An-cona. Il protocollo di studio è stato approvato dal comi-tato etico locale e tutti i pazienti hanno firmato il con-senso informato. Da ciascun paziente sono state ricavate almeno tre col-ture primarie al fine di eseguire tutti gli esperimenti in triplicato. Il tessuto adiposo è stato digerito per 2-3 ore a 37°C in soluzione salina tamponata con collagenasi tipo I (Gentaur), filtrato con garza sterile e successiva-mente con un filtro di nylon da 250 μm. La centrifuga-zione (1100 rpm per 10 min) è servita per separare la frazione vascolare stromale (SVF) dagli adipociti flot-tanti maturi. Il pellet corrispondente alla SVF è stato risospeso e incubato in un tampone di lisi per gli eritro-citi (155 mmol/l NH4Cl, 5.7 mmol/l K2HPO4, and 0.1 mmol/l EDTA; pH 7.3). Le cellule sono state filtrate con un filtro di nylon (150 μm) e dopo centrifuga addizio-nale, lavaggio e filtrazione (70 μm), sono state risospese in terreno di Dulbecco modificato da Eagle (DMEM)/Ham F-12 supplementato con il 10% di siero e seminate

in coltura alla concentrazione di 30 000 cellule/cm2. Dopo 24 ore di incubazione il terreno è stato cambiato con un terreno privo di siero consistente di DMEM/Ham F-12 supplementato con pennicillina (100 unità/ml), streptomicina (50 mg/l), gentamicina (50 μg/ml), biotina (33 μmol/l), pantotenato (17 μmol/l), transfer-rina umana (10 μg/ml), insulina (23 μmol/l), triiodoti-ronina (50 μmol/l), cortisolo (100 nmol/l) e ciglitazone (1 μg/ml). Tre giorni dopo il terreno è stato cambiato senza l’aggiunta del ciglitazone. Le cellule sono state in coltura per 10 giorni a 37°C con il 5% di CO2, cambian-do il terreno di differenziazione senza ciglitazone ogni 2 giorni per 10 giorni. Dopo aver raggiunto la differen-ziazione, le cellule sono state trattate overnight con ANP e/o BNP umano sintetico. È stato valutato anche l’effet-to dell’isoproterenolo quale β-agonista non selettivo.

Linea cellulare sottocutanea Simpson-Golabi-Behmel

La linea cellulare sottocutanea SGBS è stata mantenuta in terreno DMEM/Ham F-12 supplementato con il 10% di siero. Quando hanno raggiunto la confluenza (80-90%), le cellule sono state differenziate in DMEM/Ham F-12 con aggiunta di transferrina (1 mg/ml), insulina (100 μM), cortisolo (100 μM), T3 (200 nM), desameta-zone (25 μM), isobutil-metilxantina (IBMX) (250 mM) e rosiglitazone (10 mM). Quattro giorni dopo, è stato aggiunto il medium preparato senza desametazone, IBMX e rosiglitazone, per i successivi 10 giorni.

Valutazione della lipolisi

Il glicerolo rilasciato nel terreno di coltura dagli adipo-citi differenziati in presenza o assenza di trattamento con ANP (100 nM) o isoproterenolo (100 nM) è stato utilizzato come indice di lipolisi ANP-mediata ed è sta-to valutato utilizzando il Free Glycerol Assay kit (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) a 540 nm e le concentra-zioni sono state determinate tramite confronto con la curva standard.

Analisi di espressione genica: reazione polimerasica a catena in tempo reale

L’RNA è stato estratto da adipociti differenziati in vitro provenienti da colture primarie e dalla linea cellulare SGBS utilizzando il MiniKit Rneasy (Qiagen). La tra-scrizione inversa di 1.5 μg di RNA è stata eseguita con il kit commerciale High-Capacity cDNA reverse Tran-scription Kits with RNase Inhibitor (Applied Biosy-

34A Pocognoli

Figura 1. Immagini rappresentative di cellule SGBS non differenziate (A) e di cellule SGBS rispettivamente a 1, 5, 7 e 14 giorni di differenziamento adipogenico (B-E). Ingrandimento 10x.

stems). Ciascun esperimento di espressione genica è stato effettuato in triplicato. Le differenze di RNA to-tale o la diversa efficienza nella sintesi del cDNA tra i campioni è stata normalizzata utilizzando l’espressione del GAPDH umano sia per le colture primarie che per le SGBS. La reazione polimerasica a catena (PCR) in tempo reale è stata eseguita utilizzando sonde TaqMan (Applied Biosystem).

Analisi statistica

Tutti gli esperimenti sia con le colture primarie che con la linea cellulare SGBS sono stati effettuati in duplicato. Tutti gli esperimenti di espressione genica sono stati effettuati in triplicato. Le differenze nei livelli di espres-sione genica per campioni appaiati sono stati valutati utilizzando il test t di Student. Tutti i valori sono stati presentati come media ± errore standard. L’analisi sta-tistica è stata effettuata con SPSS 11.0 e valori di p<0.05 sono stati considerati significativi.

Risultati

L’espressione dei geni UCP1 e β3, codificanti rispettiva-mente la UCP1 e il recettore β3, è stata valutata, attra-verso la tecnica di PCR in tempo reale, sia per la linea cellulare SGBS che per le colture primarie. Per quanto

riguarda la linea cellulare, è stata valutata la misura dei profili di espressione genica dell’UCP1 e β3 oltre a due marker tipici di adipogenesi quali adiponectina e lepti-na in cellule raccolte a 1, 2, 4, 5, 7, 10, 14 giorni (Figura 1). La Figura 2 mostra che sia l’espressione dell’UCP1 che del β3 aumenta durante il differenziamento in sen-so adipogenico delle SGBS. In particolare, si nota come l’espressione dell’UCP1 aumenti in maniera proporzio-nale alla differenziazione cellulare. Per il β3 invece, es-so raggiunge il massimo di espressione al 7° giorno per poi decrescere leggermente a completa differenziazione (14° giorno) (Figura 2).L’adiponectina e la leptina sono entrambe up-regolate durante il processo di differenziazione adipogenico, come mostrato in Figura 3. Dopo 14 giorni, infatti, più del 90% delle cellule è totalmente differenziato (presen-za di grande quantità di vacuoli lipidici). Dal momento che il focus di questo lavoro è di studiare l’effetto dei CNP sui preadipociti differenziati, sono stati analizzati i livelli di espressione genica dei recet-tori dei CNP (NPRA e NPRC) per valutarne la presen-za. La Figura 4 mostra l’espressione dei recettori NPRA e NPRC nei preadipociti differenziati delle SGBS. Sono stati valutati gli stessi geni per le colture primarie, nella SVF e nei preadipociti differenziati (DVPA) (Figura 5).Nella Figura 6 sono mostrati i livelli di espressione geni-ca dell’UCP1 e del β3 che risultano entrambi aumentati nei preadipociti differenziati rispetto alla SVF. In parti-

35CNP e metabolismo lipidico, mitocondriogenesi e termogenesi

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Figura 2. Curva rappresentativa del gene UCP1 e β3 durante il differenziamento delle SGBS.

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Figura 3. Curva rappresentativa dei geni adiponectina e leptina durante il differenziamento delle SGBS.

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Figura 4. Livelli di espressione genica dell’NPRA e dell’NPRC nelle cellule SGBS differenziate (14 giorni) rispetto a quelle non differenziate (0 giorni).

Figura 5. Immagini rappresentative di cellule derivanti da coltura primaria non differenziate (A) e di preadipociti differenziati a 12 giorni di differenziamento adipogenico (B).

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Figura 6. Livelli di espressione genica dell’UCP1 e del recettore β3 nei preadipociti differenziati (DVPA) derivanti da coltura primaria rispetto alla frazione vascolare stromale (SVF). ** p<0.01.

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Figura 7. Livelli di espressione genica di adiponectina e leptina nei preadipociti differenziati (DVPA) derivanti da coltura primaria rispetto alla frazione vascolare stromale (SVF).* p<0.05; ** p<0.01.

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Figura 8. Livelli di espressione genica di NPRA e di NPRC nei preadipociti differenziati (DVPA) derivanti da coltura primaria rispetto alla frazione vascolare stromale (SVF).* p<0.05; ** p<0.01.

colare, l’UCP1 (marker dell’adipocita bruno) risulta for-temente up-regolato nei DVPA totalmente differenziati. I marker adipocitari tipici del tessuto adiposo (adipo-nectina e leptina) risultano essere up-regolati durante il processo di differenziamento adipogenico (Figura 7), con un’espressione dell’adiponectina di circa 120 volte superiore nei DVPA rispetto alla SVF.

Sono stati infine valutati i recettori dei CNP. Sia per l’NPRA che per l’NPRC l’aumento di espressione nei DVPA rispetto alla SVF è risultato essere statisticamen-te significativo (Figura 8). Come per la linea cellulare, anche nelle colture primarie il recettore quantitativa-mente più espresso è l’NPRA.


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Figura 9. Capacità dell’ANP e dell’isoproterenolo nell’indurre lipolisi nei preadipociti differenziati.

Peptide natriuretico atriale e lipolisi

È ben dimostrato che la lipolisi è stimolata dal sistema nervoso simpatico attraverso la via β-adrenergica-cAMP. Recentemente i CNP si sono dimostrati in grado di in-durre lipolisi negli adipociti umani via cGMP. Per veri-ficare l’eventuale lipolisi, l’effetto dell’ANP sui DVPA è stato comparato con l’isoproterenolo (β-agonista), uti-lizzato come controllo positivo dell’effetto lipolitico. Come mostrato in Figura 9, l’ANP è in grado di indurre lipolisi a livelli simili dell’isoproterenolo.

Effetto dei peptidi natriuretici negli adipociti differenziati

Dal momento che gli adipociti umani presentano un livello di espressione di NPRC più basso rispetto a quel-lo dell’NPRA, è stato valutato se l’ANP e/o il BNP po-tessero aumentare l’espressione dei geni rappresentativi degli adipociti bruni, quali UCP1, CYTO C e PGC-1α. In questi esperimenti sono stati utilizzati preadipociti differenziati, da linea cellulare SGBS e da colture pri-marie. Per le prime, il trattamento con l’ANP a diverse concentrazioni (10-100 nM) è stato capace di aumenta-re significativamente l’espressione dei geni considerati (Figura 10) solo nel caso del PGC-1α per il trattamento con ANP 10 nM non si è raggiunta la significatività, ma il trend è stato mantenuto. Per quanto riguarda il BNP invece, la significatività è stata raggiunta solo nel caso dell’UCP1 in seguito a trattamento con BNP 100 nM. Anche se in assenza di significatività statistica, il trat-tamento con BNP 100 nM è in grado di aumentare l’espressione del CYTO C e del PGC-1α (Figura 11).Per i preadipociti differenziati derivanti da coltura pri-maria, data l’esiguità del campione di partenza e in ba-

se ai risultati ottenuti nella linea cellulare, è stata utiliz-zata una concentrazione di 100 nM di ANP. Come mostrato nella Figura 12, i risultati sono simili a quelli ottenuti nella linea cellulare SGBS, l’espressione dei ge-ni UCP1, CYTO C e PGC-1α viene infatti indotta dal trattamento con ANP, anche se i livelli di espressione dei geni in esame sono più bassi.

Discussione

Diversi studi negli ultimi anni hanno mostrato un’in-terazione reciproca tra il sistema dei CNP e il tessuto adiposo. È stata infatti dimostrata la presenza dei recet-tori dei CNP (NPRA e NPRC) nel tessuto adiposo di ratto e dell’uomo10. Inoltre è stata provata una downre-gulation del NPRC, determinata dal digiuno, sull’espres-sione del medesimo gene12 nel tessuto adiposo di ratto. Nell’uomo è stato osservato un incremento degli effetti biologici dell’ANP, come un maggior effetto ipotensivo, in pazienti obesi dopo dieta ipocalorica13 confermando come la relativa abbondanza dell’NPRC a livello del tessuto adiposo sia determinante per gli effetti biologi-ci mediati dall’ANP. Infatti con la riduzione della mas-sa adiposa tramite digiuno e la conseguente minor espressione dell’NPRC, si ottiene un’aumentata effica-cia, sia pressoria che natriuretica, dell’ANP, per la mag-gior disponibilità biologica di tale peptide.Al fine di studiare in vitro l’effetto dei CNP sugli adi-pociti umani, è stata per prima cosa testata la presenza dei recettori nei due modelli cellulari utilizzati. I risul-tati ottenuti dimostrano la presenza dei recettori dei CNP (NPRA e NPRC) sia nelle colture primarie di adi-pociti che nella linea cellulare SGBS. In particolare, l’NPRC essendo sia il recettore di clearance dei CNP che il modulatore del legame ANP/BNP all’NPRA a livello cellulare, è il modulatore dell’effetto finale dei CNP sulle cellule target. Recentemente è stata dimostrata l’azione lipolitica dei CNP, primate-specifica. Questo gruppo ha osservato che, sia in vivo che in vitro, gli adipociti rispondono alla somministrazione di ANP con un’aumentata lipo-lisi, paragonabile a quella indotta dal β-agonista isopro-terenolo, un farmaco che simula gli effetti di un’aumen-tata scarica adrenergica15. È stato inoltre dimostrato come l’effetto lipolitico dell’ANP sia indipendente dal pathway lipolitico intracellulare delle catecolamine e da quello antilipolitico dell’insulina, bensì agisca tramite una nuova pathway cGMP mediata16, con fosforilazione della lipasi ormone-sensibile. Pertanto, al fine di verifi-care se il modello in vitro utilizzato rispondesse all’ANP

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Figura 10. Espressione genica dei marker tipici dell’adipocita bruno nelle cellule SGBS. Le cellule sono state trattate overnight con ANP (10 nM e 100 nM) e sono stati poi misurati i livelli di espressione genica di UCP1, CYTO C e PGC-1α.* p<0.05.

come atteso, è stata valutata la liberazione di glicerolo nel terreno di coltura dopo trattamento degli adipociti maturi con ANP. I risultati ottenuti mostrano che tale peptide è in grado di indurre lipolisi negli adipociti umani, confermando così i dati presenti in letteratura. Gli adipociti impiegati in questo progetto rispondono infatti sia all’ANP via cGMP sia all’isoproterenolo, clas-sico composto utilizzato per stimolare i recettori β-adrenergici, mediatori del meccanismo lipolitico.

Considerando quindi i parallelismi tra CNP e catecola-mine in termini di effetti biologici sugli adipociti, è stato successivamente verificato se i CNP, come è ben noto per le catecolamine, fossero in grado di stimolare il program-ma di termogenesi tipico degli adipociti bruni. Sono sta-ti quindi valutati gli effetti dell’ANP e del BNP sull’adi-pocita differenziato per verificarne l’influenza (l’aumen-to di espressione) sui geni marker degli adipociti bruni. Come modelli di studio in vitro sono stati scelti la coltu-


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Figura 11. Espressione genica dei marker tipici dell’adipocita bruno nelle cellule SGBS. Le cellule sono state trattate overnight con BNP (10 nM e 100 nM) e sono stati poi misurati i livelli di espressione genica di UCP1, CYTO C e PGC-1α.* p<0.05.

ra cellulare primaria, allestita da tessuto adiposo umano, e la linea cellulare SGBS. La prima rappresenta un ap-proccio scientifico valido e riproducibile per lo studio della fisiologia e della fisiopatologia cellulare e tissutale; consente di sottoporre i vari campioni alle stesse condi-zioni chimico-fisiche; permette un’esposizione diretta delle cellule al principio attivo oggetto di studio; infine, costituisce un modello che si avvicina molto alla realtà

fisiopatologica in vivo. D’altra parte le SGBS, provenien-ti da pazienti con sindrome di Simpson-Golabi-Behmel, rappresentano una linea cellulare umana con grandi ca-pacità di differenziamento in senso adiposo. In più, i preadipociti differenziati SGBS mostrano livelli di espres-sione di marker tipici di adipogenesi specifici per il WAT (adiponectina e leptina) e di marker tipici del BAT (UCP1), molto simili a quelli ottenuti dai preadipociti

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Figura 12. Espressione genica dei marker tipici dell’adipocita bruno nei preadipociti differenziati derivanti da coltura primaria. Le cellule sono state trattate overnight con ANP (100 nM) e sono stati poi misurati i livelli di espressione genica di UCP1, CYTO C e PGC-1α.* p<0.05.

differenziati ottenuti da colture primarie. Questo fa sì che le SGBS siano una linea cellulare umana utilizzabile come modello per lo studio del tessuto adiposo. Molto più recentemente, la “riscoperta” della presenza nell’uomo di un tessuto adiposo bruno funzionante ha riportato l’attenzione sul ruolo che gli adipociti bruni possono avere nel dispendio energetico attraverso la via della UCP121. In una recente rassegna è stato ipotizzato che l’incremento dopo restrizione calorica del cGMP, che a sua volta stimola la mitocondriogenesi, possa di-pendere almeno in parte da un’aumentata attività dei CNP22. È stato anche ipotizzato che in presenza di UCP1, i NEFA possano essere ampiamente utilizzati non per produrre ATP ma possano essere “bruciati” per produrre calore conferendo quindi ai peptidi natriure-tici il potenziale ruolo di ormoni cardiometabolici anti-

obesità23. I risultati ottenuti dalla linea cellulare SGBS e dalle colture primarie permette di affermare che i CNP sono in grado di promuovere l’acquisizione di ca-ratteristiche e funzionalità dell’adipocita bruno. Quest’ul-timo, in particolar modo dopo trattamento con ANP a livelli simili a quelli fisiologici, esprime elevati livelli di espressione dei geni rappresentativi del BAT, quali UCP1, PGC-1α e CYTO C. Futuri studi saranno necessari per determinare la rego-lazione del recettore attivo NPRA e del recettore di clea-rance NPRC in modo da determinare come il rapporto NPRA/NRPC possa inf luenzare e predisporre al-l’obesità. In futuro verrà inoltre proposto di studiare nuove vie metaboliche in grado di controllare la pres-sione arteriosa e allo stesso tempo avere effetti positivi sul metabolismo lipidico.

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Per la corrispondenza:

Dr.ssa Antonella Pocognoli

Laboratorio di Medicina Interna, Dipartimento di Scienze Cliniche e Molecolari, Università Politecnica delle Marche Via Tronto, 10/A - 60126 Torrette di Ancona (AN)

e-mail: [email protected]

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