bogiaoduc.edu.vn---thu nhận và xử lý ngà răng người làm giá t

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ NHẬT UYÊN

THU NHẬN VÀ XỬ LÝ NGÀ RĂNG NGƯỜI LÀM GIÁ THỂ NUÔI CẤY

TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG NGƯỜI

Chuyên ngành: Sinh lý động vật

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. TRẦN LÊ BẢO HÀ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2012

LỜI CẢM ƠN

Luận văn tốt nghiệp này là thành quả của những năm học tập, nghiên cứu cùng

với sự quan tâm, chia sẻ nhiệt tình của gia đình, thầy cô và bạn bè. Nếu không có sự

giúp đỡ và động viên của nhiều người có lẽ tôi khó hoàn thành tốt luận văn này.

Trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn TS. Trần Lê Bảo Hà, đã tận tình hướng

dẫn, góp ý và động viên tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp.

Tôi xin gởi lời cảm ơn đến Ths. Phan Kim Ngọc, người đã tạo mọi điều kiện tốt

nhất về vật chất lẫn tinh thần để tôi học tập và nghiên cứu tại PTN Nghiên cứu và

Ứng dụng Tế bào gốc, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM.

Tôi xin cảm ơn chị Tuyền, các bạn Giang, Xuân và các em Vũ, Quân, Hương,

Hằng đã luôn sát cánh cùng tôi trong thời gian thực hiện đề tài.

Lời cảm ơn cuối cùng, tôi xin gởi đến ngoại, cha mẹ và em gái đã hết lòng quan

tâm và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này.

Tp Hồ Chí Minh, 02/2012

Nguyễn Thị Nhật Uyên

i

MỤC LỤC

Bìa chính

Bìa phụ

Lời cảm ơn

Trang

Mục lục ............................................................................................................ i

Danh mục từ viết tắt ......................................................................................... iv

Danh mục bảng và đồ thị .................................................................................. vi

Danh mục hình ................................................................................................. vii

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................. 1

Chương 1. TỒNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Kỹ nghệ mô ............................................................................................... 3

1.1.1. Giá thể ba chiều ................................................................................. 3

1.1.1.1. Các đặc tính của giá thể ba chiều................................................ 4

1.1.1.2. Nguyên liệu thiết kế giá thể ........................................................ 4

1.1.2. Tế bào trong kỹ nghệ mô ................................................................... 4

1.1.3. Khả năng tương tác của tế bào với giá thể ......................................... 5

1.1.3.1. Sự bám dính ............................................................................... 5

1.1.3.2. Sự di chuyển .............................................................................. 5

1.1.3.3. Sự tăng trưởng và biệt hóa.......................................................... 6

1.1.4. Giá thể dùng trong nha khoa . ............................................................. 8

1.2. Ngà răng .................................................................................................... 11

1.2.1. Cấu trúc ngà răng ............................................................................... 12

1.2.2. Thành phần cấu tạo và các đặc tính của ngà răng................................ 13

1.2.2.1. Thành phần hữu cơ..................................................................... 13

1.2.2.2. Thành phần vô cơ....................................................................... 14

1.2.2.3. Đặc tính của ngà răng................................................................. 14

1.2.3. Giá thể ngà răng ................................................................................. 15

1.3. Tế bào gốc trong mô tủy răng .................................................................. 15

ii

1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ............................................. 16

1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ....................................................... 16

1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước........................................................ 18

Chương 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu ..................................................................................................... 19

2.1.1. Mẫu vật ............................................................................................. 19

2.1.2. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................ 20

2.1.3. Hóa chất ............................................................................................ 21

2.2. Phương pháp............................................................................................. 24

2.2.1. Sơ đồ quy trình thí nghiệm tổng quát .................................................. 24

2.2.2. Tạo giá thể từ ngà răng người ............................................................ 25

2.2.3. Qui trình nuôi cấy tế bào tủy răng người............................................. 26

2.2.3.1. Nuôi cấy sơ cấp ........................................................................ 26

2.2.3.2. Phương pháp cấy chuyền tế bào tủy răng .................................. 27

2.2.4. Đánh giá tế bào tủy răng thu được ...................................................... 28

2.2.4.1. Phương pháp xác định kiểu hình miễn dịch............................... 28

2.2.4.2. Khảo sát sự tăng trưởng của tế bào thu được từ mảnh mô ......... 28

2.2.5. Khảo sát sự bám dính và tăng sinh của tế bào tủy răng trên giá thể

ngà đã xử lý ................................................................................................. 29

2.2.5.1. Phương pháp đưa tế bào lên giá thể........................................... 29

2.2.5.2. Phương pháp MTT.................................................................... 30

2.2.5.3. Phương pháp SEM .................................................................... 31

Chương 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

3.1. Thu nhận và xử lý giá thể từ mô ngà răng người .................................... 32

3.1.1. Thu nhận các mẫu ngà từ thân răng người .......................................... 32

3.1.2. Đánh giá kết quả xử lí bề mặt của giá thể ngà răng ............................. 32

3.2. Kết quả nuôi cấy tế bào gốc từ tủy răng người ....................................... 36

3.2.1. Kết quả nhuộm Hematoxylin – Eosin (H&E) mô tủy răng. ................. 36

3.2.2. Kết quả nuôi cấy sơ cấp...................................................................... 37

3

3.2.3. Kết quả cấy chuyền tế bào .................................................................. 40

3.3. Kết quả đánh giá tế bào thu được từ tủy răng. ....................................... 41

3.3.1. Sự biểu hiện một số marker của tế bào gốc trung mô. ......................... 41

3.3.2. Kết quả đánh giá sự tăng sinh của tế bào trên bề mặt nuôi cấy ............ 42

3.4. Kết quả khảo sát sự tăng sinh của tế bào tủy răng trên bề mặt giá thể.. 44

3.5. Khả năng bám của tế bào gốc tuỷ răng trên giá thể................................ 46

Chương 4. KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ

Kết luận ...................................................................................................... 48

Kiến nghị .................................................................................................... 48

Danh mục công trình của tác giả ...................................................................... viii

Tài liệu tham khảo ............................................................................................ ix

Phụ lục ..............................................................................................................

4

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BMPs Bone morphogenetic proteins

DFCs Dental follicle cells

DMEM Dullbecco Modification of Eagle’s Medium

DMSO Dimethyl sulfoxide

DPCs Dental Pulp Cells

DPSCs Dental Pulp Stem Cells

ECM Extra Cellular Matrix

EDTA Ethylene Diaminetertraacetid Acid

EGF Epithelial Growth Factor

FBS Fetal Bovine Serum

FGF Fibroblast Growth Factor

g Gram

HE Haematoxylin Eosin

l Litre

mg Miligram

ml Mililitre

mm Milimetre

NaCl Sodium Chlorite

NaOCl Sodium Hypochlorite

NCPs Non – collagenous proteins

hTDM Hunan treated dentin matrix

PBS Phosphatev - Buffered Saline

PDL Periodontal ligament

SEM Scanning Electron Microscope

HA Hydroxyapatite

TCP Tricalcium phosphate

TGF-β Transforming Growth Factor-β

5

WNTs

J.Ll

J.lill

Wingless- and int-related proteins

Microlitre

Micrometre

6

DANH MỤC BẢNG VÀ ĐỒ THỊTrang

Bảng 2.1. Danh sách các dụng cụ sử dụng ........................................................ 20

Bảng 2.2. Danh sách các thiết bị sử dụng.......................................................... 21

Đồ thị 3.1. Đường cong tăng trưởng của tế bào tủy răng người nuôi cấy ở lần

cấy chuyền thứ 3................................................................................................ 42

Đồ thị 3.2. Biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang (OD) với các mốc thời

gian nuôi cấy ..................................................................................................... 45

vii

DANH MỤC HÌNHTrang

Hình 1.1. Các nhân tố trong kĩ nghệ mô............................................................ 3

Hình 1.2. Ba yếu tố quan trọng cho kỹ nghệ mô trong nha khoa: tín hiệu cho

sự phát triển, tế bào gốc và khung nâng đỡ của chất nền ngoại bào ................ 8

Hình 1.3. Ngà răng – tủy hình thành phức hợp với định hướng tối ưu cho các

ứng dụng lâm sang của liệu pháp tái sinh.......................................................... 9

Hình 1.4. Nguyên bào ngà và ống ngà .............................................................. 13

Hình 1.5. Hình dạng ống ngà ........................................................................... 13

Hình 1.6. Bề mặt ngà chưa xử lý dưới SEM ...................................................... 15

Hình 2.1. Mẫu răng người sau khi thu nhận...................................................... 19

Hình 2.2. Cách cắt răng tạo hình mẫu ngà........................................................ 25

Hình 2.3. Nguyên tắc phương pháp MTT .......................................................... 30

Hình 3.1. Mẫu ngà thu nhận để làm thí nghiệm sau khi xử lý ............................ 32

Hình 3.2. Mẫu chứng bề mặt ngà chưa xử lý..................................................... 33

Hình 3.3. Bề mặt ngà xử lý bằng EDTA / Axit Citric ......................................... 33

Hình 3.4. Mô tủy răng sau khi nhuộm H&E (100X) .......................................... 36

Hình 3.5. Mô tủy răng sau khi nhuộm H&E (200X) .......................................... 36

Hình 3.6. Quần thể tế bào sau khi thu nhận ...................................................... 37

Hình 3.7. Quần thể tế bào sau 5ngày nuôi cấy. ............................................... 38

Hình 3.8. Quần thể tế bào sau 14 ngày nuôi cấy ............................................... 39

Hình 3.9. Quần thể tế bào sau 21 ngày nuôi cấy ............................................... 39

Hình 3.10. Quần thể tế bào sau 4 ngày (a) và sau 15 ngày (b) cấy chuyền ........ 40

Hình 3.11. Kết quả phân tích sự biểu hiện một số marker của tế bào tủy răng

sau 3 lần cấy chuyền.......................................................................................... 41

Hình 3.12. Giá thể ngà sau khi ủ hóa chất MTT: a) Giá thể không có tế bào,

(b) Giá thể có tế bào .......................................................................................... 44

Hình 3.13. Tế bào bám trên giá thể xử lý bằng EDTA / Axit citric (x600).......... 47

Hình 3.14. Tế bào bám trên giá thể xử lý bằng EDTA / Axit citric (x7.000)....... 47

viii

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

I. BÀI BÁO KHOA HỌC

1. Đoàn Nguyên Vũ, Phạm Trần Hương Trinh, Nguyễn Thị Nhật Uyên, Tô

Minh Quân, Phan Kim Ngọc, Trần Lê Bảo Hà, Nguyễn Thị Thư, Đặng Vũ Ngọc

Mai, Hoàng Đào Bảo Trâm, Hoàng Tử Hùng, Trịnh Thị Trúc Ly (2011). Nuôi

cấy tế bào gốc từ tủy răng người. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 9(3), 297-301.

1

ĐẶT VẤN ĐỀCác bệnh về răng miệng như sâu răng, bệnh lý tủy răng và nha chu là các loại

bệnh phổ biến nhất nhưng cũng ít được chú ý, đề phòng nhất ở Việt Nam hiện nay.

Trong khi Việt Nam có tới 90% dân số mắc các bệnh về răng miệng.

Khác với các bệnh khác, người ta có thể mắc bệnh răng miệng ngay từ lúc mới

sinh cho đến khi sắp từ giã cõi đời, bệnh ảnh hưởng lớn đến sức khỏe do không

được chăm sóc và điều trị đúng cách, dẫn đến rụng răng, hạn chế khả năng nói và

nhai của con người và mất răng sớm, từ đó làm giảm chất lượng cuộc sống. Do tính

chất phổ biến với mọi lứa tuổi như vậy mà việc phòng chống và chữa trị các bệnh

về răng miệng là một nhiệm vụ có tính xã hội hoá cao.

Ngày nay, với sự tiến bộ của công nghệ trong thế kỷ 21, người ta mong đợi sẽ

giữ được răng tự nhiên hoặc thay thế răng chức năng trong suốt cuộc đời họ. Các kỹ

thuật nha khoa hiện nay công trong việc giữ răng, nhưng răng của nhiều người

không phục hồi chức năng hoàn toàn; đồng thời, các phương pháp điều trị này

đòi hỏi phải tuân theo những nguyên như phương pháp trám ống tủy (loại bỏ tủy

hư) và cấy ghép răng (implant) giúp tăng tỷ lệ thành tắc nghiêm ngặt, kỹ thuật phức

tạp, theo dõi và chăm sóc răng định kỳ nên các nhà khoa học trên thế giới đã và

đang hướng đến nghiên cứu những phương pháp nhằm tái tạo răng.

Đã có nhiều công trình trên thế giới tiến hành nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế

bào gốc tủy răng cũng như tạo khung nâng đỡ, dùng để phục hồi tủy răng trong

chữa trị mà không cần loại bỏ hoàn toàn tủy răng. Khi đó, tế bào tủy răng đã được

nuôi trên giá thể polymer tổng hợp như giá thể alginate, giá thể polymer poly

(lactic-co-glycolic) acid, giá thể composite và giá thể polymer tự nhiên dùng trong

công nghệ nội nha như collagen. Tuy nhiên, sự phân hủy các polymer tổng hợp, cả

trong điều kiện in vitro và in vivo, giải phóng các sản phẩm phụ khiến cho vi môi

trường giá thể không lý tưởng cho sự tăng trưởng mô, có hại đến chức năng của tế

bào và các polymer tự nhiên có thể gây ra các đáp ứng miễn dịch.

Để khắc phục nhược điểm của các giá thể polymer tự nhiên và polymer tổng

hợp, hiện nay, các nhà khoa học hướng tới việc sử dụng ngà răng. Ưu điểm của giá

2

thể ngà là giá thể tự nhiên, chi phí thấp, nguồn mẫu thu dồi dào và hỗ trợ sự bám

dính, tăng sinh của tế bào gốc tủy răng người. Ngoài ra, giá thể ngà đã được chứng

minh có khả năng kích thích tế bào tủy răng người biệt hóa thành nguyên bào ngà in

vitro và hình thành nên ngà mới in vivo.

Những thành tựu gần đây đã mở ra một triển vọng về xây dựng một quy trình tái

tạo mô tủy và hình thành lớp ngà mới, nhằm để tái tạo phức hợp ngà - tủy ứng dụng

trong chữa trị nội nha lâm sàng. Với sự phát triển không ngừng và kết hợp của

nhiều ngành khoa học, các ứng dụng của kỹ nghệ mô ngày càng phong phú như da,

xương, mạch máu, thần kinh và răng. Trong đó, việc lựa chọn giá thể thích hợp là

mục tiêu cần thiết để thành công trong việc tạo mô và cơ quan thay thế.

Với những tiềm năng ứng dụng to lớn như trên, đề tài luận văn này được tiến

hành nhằm mục tiêu “Thu nhận và xử lý ngà răng người làm giá thể nuôi cấy tế

bào gốc”. Các kết quả thu được như một bước khởi đầu cho những nghiên cứu sau

này trong lĩnh vực chữa trị và phục hồi nha khoa lâm sàng.

Mục tiêu chuyên biệt

- Thu nhận và xử lý được giá thể từ ngà răng người

- Nuôi cấy và nhận diện được tế bào gốc tủy răng người

- Đánh giá được sự bám dính và tăng sinh của tế bào tủy răng người trên giá

thể ngà đã xử lý.

3

1.1. Kỹ nghệ mô [4], [46]

Kỹ nghệ mô là ngành khoa học mới kết hợp nhiều lĩnh vực như sinh học tế bào,

khoa học vật liệu, giải phẫu, … để tạo ra các mô, cơ quan có chức năng, sử dụng tế

bào sống và một chất nền hay còn gọi là giá thể.

Kỹ nghệ mô đã khắc phục những hạn chế của phương pháp điều trị truyền thống

bằng cách tạo ra các mô, cơ quan nhân tạo có tính tương hợp sinh học và không gây

ra các phản ứng thải loại.

Các tế bào được nuôi cấy theo phương pháp truyền thống có thể tăng trưởng tạo

lớp đơn nhưng không thể tổ chức thành mô hay cơ quan được. Bởi vì, chúng thiếu

các tín hiệu cơ học, tín hiệu điện và các thành phần cấu trúc, hóa học từ thành phần

ngoại bào giống như môi trường in vivo (thành phần cấu trúc giống chất nền ngoại

bào của mô hay cơ quan). Do đó, để tạo ra mô hay cơ quan nhân tạo phải thỏa mãn

những yêu cầu sau: giá thể, tế bào, nhân tố tăng trưởng thích hợp và điều kiện nuôi

cấy tối ưu. Trong đó, giá thể là một thành phần rất quan trọng trong kỹ nghệ mô.

Hình 1.1. Các nhân tố trong kĩ nghệ mô

1.1.1. Giá thể ba chiều [4]

Giá thể là khuôn ngoại bào nhân tạo có cấu trúc lỗ xốp, giúp điều tiết tế bào,

hướng dẫn tế bào tăng trưởng và tái tạo mô ba chiều. Sau khi được cấy vào giá thể,

các tế bào sẽ bám dính, tăng sinh, biệt hóa và tổ chức tạo mô song song với quá

trình tiết ra các chất nền ngoại bào (ECM). Vì thế để tạo ra các mô và cơ quan có

4

hình dạng và kích thước mong muốn, cần chọn lựa giá thể có hình dạng và cấu tạo

phù hợp.

1.1.1.1. Các đặc tính của giá thể ba chiều [4]

Có cấu trúc lỗ xốp bên trong (đường kính lỗ ít nhất 60-100 m) để cung cấp

dưỡng chất, giúp tăng trưởng mô, phân bố các mạch máu….

Có khả năng tự phân hủy sinh học để khi các tế bào tiết các thành phần ngoại bào

sẽ thay thế giá thể.

Có bề mặt hỗ trợ cho quá trình bám dính, tăng sinh và biệt hóa của tế bào.

Có các đặc tính cơ học thích hợp để tương xứng với vùng ghép.

Không kích thích bất kỳ phản ứng có hại cho tế bào.

Dễ tạo hình dáng và kích thước mong muốn.

1.1.1.2. Nguyên liệu thiết kế giá thể

- Các giá thể sinh học: các mô, cơ quan đồng loại, dị loại được sử dụng để tạo

giá thể. Các mô, cơ quan được hủy tất cả tế bào và thành phần tế bào, thu bộ khung

ECM.

- Polymer tổng hợp: các polyester như polyglicolic acid (PGA), polylactic

acid (PLA) và các chất đồng trùng hợp (copolymer) của chúng thường được sử

dụng để thiết kế các giá thể.

- Polymer tự nhiên: các polymer là protein hoặc carbohydrate có nguồn gốc

tự nhiên được sử dụng làm giá thể để kích thích sự tăng trưởng của một số dòng tế

bào. Collagen là dạng polymer tự nhiên phổ biến nhất thường được sử dụng tạo giá

thể ba chiều.

1.1.2. Tế bào trong kỹ nghệ mô

Các loại tế bào có thể được sử dụng cho sửa chữa và tái tạo mô bao gồm các tế

bào trưởng thành được lấy từ bệnh nhân hoặc các tế bào gốc (trưởng thành hoặc

phôi thai) [13]. Trong đó, tế bào gốc là loại tế bào có khả năng tự làm mới và khả

năng biệt hóa thành những dạng tế bào chuyên hóa của cơ thể trưởng thành. Thêm

nữa, việc sử dụng tế bào gốc có nguồn gốc từ mô trưởng thành tránh được những

vấn đề về đạo đức và xã hội trong các ứng dụng nghiên cứu [13].

5

Tế bào gốc hiện diện trong các mô chuyên biệt như mô xương, mỡ, tụy, gan,

máu, tủy răng. Chúng có thể duy trì tính gốc và tiềm năng biệt hóa trong suốt quá

trình nuôi cấy tăng sinh. Vì vậy, tế bào gốc trưởng thành được xem là một nguồn tế

bào hữu ích cho việc phát triển liệu pháp tế bào.

1.1.3. Khả năng tương tác của tế bào với giá thể

1.1.3.1. Sự bám dính [9]

Sự bám dính của tế bào thông qua các thành phần của ECM như fibronectin,

vitronectin, collagen hay laminin gắn lên các thụ thể integrin của tế bào. Ở vật liệu

thế hệ mới, các thụ thể và trình tự phụ trợ đều được gắn trực tiếp trên vật liệu.

Các phân tử ECM này có thể được hấp thu trên bề mặt vật liệu từ môi trường

xung quanh. Bề mặt mềm và thấm nước có khả năng hấp thu các protein ngoại bào

tốt. Tuy nhiên, vật liệu sử dụng trong kĩ nghệ mô đa số là polymer tổng hợp như

polyethylene, polyurethane, polypropylene hoặc polystyrene rất kị nước ở trạng thái

chưa biến đổi. Do đó các giá thể ba chiều thường được phủ một lớp dung dịch ECM

tự nhiên như matrigel, gelatin, collagen...

1.1.3.2. Sự di chuyển [9]

Sự di chuyển của tế bào trên giá thể rất được quan tâm vì chúng đóng vai trò

quyết định tính đa dạng của các hiện tượng sinh lý và bệnh lý học, cũng như thành

phần giá thể trong kỹ nghệ mô. Hoạt động đó bị chi phối bởi các tác nhân sinh hóa

và tương tác tế bào.

Sự di chuyển của tế bào được chia thành hai giai đoạn là quá trình dàn trải (bám

dính) và chuyển động của tế bào. Dàn trải là một quá trình kết hợp sự bám dính liên

tục và sự co thắt có chọn lọc của tế bào. Đầu tiên, tế bào nhô ra các phiến mỏng

chứa nhiều vi sợi và bám dính chủ yếu ở phiến nhô ra này. Ở giai đoạn sau, tế bào

chất ở chỗ nhô ra cũng được mở rộng, hoàn thiện sự dàn trải tế bào. Nếu tế bào gặp

tế bào khác, quá trình ức chế sẽ xảy ra và ngăn chặn sự di chuyển xa hơn của tế bào

trong giá thể

Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự di chuyển tế bào: bề mặt giá thể, độ gồ ghề,

trạng thái lỗ của giá thề và gradient trong môi trường nuôi cấy…

6

- Bề mặt giá thể: sự bám dính của tế bào bị tác động bởi các đặc trưng hóa lý

của bề mặt rắn nằm bên dưới. Sự dàn trải diễn ra tốt hơn trên bề mặt ưa nước ở cả

trường hợp môi trường có hoặc không có huyết thanh. Điều đó cho thấy tính chất

thể nền có vai trò quan trọng đối với sự bám dính và dàn trải tế bào thông qua các

protein được hấp thu trước.

- Trạng thái lỗ: bao gồm kích thước và sự phân bố, chúng có ảnh hưởng trực

tiếp lên sự di chuyển của tế bào. Khi kích thước lỗ quá lớn sẽ làm giảm khả năng di

chuyển của tế bào, do tế bào không thể dàn trải được và tốn nhiều thời gian hơn cho

việc định hướng di chuyển.

Ngoài ra, sự phân bố các rãnh giữa các vi lỗ giá thể có tác động mạnh đến sự

di động và tính định hướng tế bào. Các rãnh nhỏ, ngay cả các rãnh hẹp 3µm cũng

dẫn đến định hướng tế bào. Trong khi đó, các rãnh lớn 120 µm sẽ không còn thấy

sự liên kết tế bào. Do đó, điều này đã đưa ra một cơ chế lý sinh mới trong quá trình

kiểm soát sự vận động của tế bào bằng những cấu trúc vi ngoại bào.

- Nồng độ phân tử trong môi trường: sự di động của tế bào còn được định

hướng bằng các nồng độ khác nhau trong môi trường (hóa học, điện, haptotaxis…).

Sự cảm ứng đó được gọi là tính hóa hướng động “chemotaxis”. Mặc dù có nhiều

loại phân tử hóa học khác nhau như đường, peptide, chất chuyển hóa tế bào, vách tế

bào hay màng lipid, nhưng tất cả đều thực hiện một cơ chế chung. Chúng gắn lên

các thụ thể bề mặt tế bào, hoạt hóa các con đường truyền tín hiệu nội bào và tổ chức

lại bộ xương tế bào.

Hiện nay, các nhà khoa học vẫn đang nghiên cứu sâu hơn tính hóa hướng động

của tế bào khi tế bào di chuyển trong giá thể, giúp tế bào di chuyển sâu hơn bên

trong giá thể nhằm sử dụng hoàn toàn nguồn dinh dưỡng, tăng sinh và biệt hóa tốt

hơn.

1.1.3.3. Sự tăng trưởng và biệt hóa

Sự tăng sinh và biệt hóa của tế bào trên giá thể phụ thuộc rất nhiều yếu tố như

chất liệu, cấu trúc giá thể trong đó quan trọng nhất là các nhân tố biệt hóa.

7

- Chất liệu tạo giá thể: đóng vai trò quyết định khi thiết kế giá thể. Tuy nhiên,

người ta nhận thấy nếu có sự kết hợp nhiều loại chất liệu với nhau khi thiết kế giá

thể ba chiều dùng để nuôi cấy tế bào hoặc đưa vào cơ thể làm vật ghép thì hoạt tính

sinh học sẽ tăng lên và giúp tế bào tăng sinh tốt hơn cũng như vật liệu ghép tốt hơn.

Điều này có thể giải thích do thành phần cấu trúc trong các mô là hỗn hợp

của rất nhiều loại chất liệu. Sự kết hợp nhiều loại vật liệu tạo ra một khung sườn

giống môi trường của tế bào sinh sống, do đó làm tăng quá trình tăng sinh và biệt

hóa của tế bào cũng như tạo ra một cấu trúc phù hợp với chức năng mô thay thế

[16].

- Cấu trúc giá thể

Kích thước các lỗ trên giá thể không chỉ ảnh hưởng đến sự di chuyển của

các tế bào trong giá thể mà cũng ảnh hưởng đến sự biệt hóa và tăng sinh của tế bào.

Đặc biệt kích thước lỗ ảnh hưởng trực tiếp đến việc phân phối chất dinh dưỡng và

các nhân tố biệt hóa đều khắp giá thể.

Tế bào sẽ biệt hóa nhanh hơn trên giá thể có kích thước lỗ tương đối so

với giá thể có kích thước lỗ lớn. Giá thể có kích thước lỗ lớn làm gia tăng tỉ lệ tăng

sinh tế bào do đó tế bào không chuyển sang giai đoạn biệt hóa.

Như vậy, có thể kết luận độ thông thoáng của vật liệu xốp giúp tế bào tăng

sinh mạnh. Tuy vậy, sự thông thoáng quá mức có thể giảm hiệu quả của quá trình

biệt hóa do cung cấp nhiều không gian cho tế bào tăng sinh [53].

- Các nhân tố biệt hóa [48]

Giá thể cần được bổ sung các nhân tố tăng trưởng để có được các tính

chất sinh học chuyên biệt cho từng loại tế bào. Chất tăng trưởng có thể tồn tại tự do

trong dung dịch hoặc cố định lên bề mặt giá thể.

Sự hỗ trợ bề mặt vật liệu sinh học với những phân tử có hoạt tính sinh

học là con đường đơn giản để tạo ra vật liệu có tính sinh học cao hay còn gọi là vật

liệu có khả năng phỏng sinh học. Giá thể có thể được gắn trình tự peptide đơn giản

của protein ngoại bào hoặc các nhân tố tăng trưởng. Khi đó, các tế bào bám dính tốt

hơn, tăng trưởng mạnh và nhanh chóng đi vào con đường biệt hóa [36].

8

1.1.4. Giá thể dùng trong nha khoa

Điều trị tái tạo mô của phức hợp ngà – tủy răng đòi hỏi yếu tố quan trọng thứ hai

bên cạnh tế bào gốc tủy răng (DPSCs) đáp ứng là một giá đỡ phù hợp. Việc lựa

chọn một vật liệu khung nâng đỡ thích hợp có tầm quan trọng quyết định để tạo ra

và hình thành giá thể ngà răng tối ưu. Qua đó, sự phù hợp của các khung nâng đỡ

phụ thuộc vào cả hai đặc tính vật liệu sinh hóa cũng như cấu trúc hình học.

Hình 1.2. Ba yếu tố quan trọng cho kỹ nghệ mô trong nha khoa: tín hiệu cho sự

phát triển, tế bào gốc và khung nâng đỡ của chất nền ngoại bào [36]

Việc xác định và phát triển của khung nâng đỡ phù hợp có khả năng tái sinh các

cấu trúc răng, chẳng hạn như ngà răng, là những khía cạnh thiết yếu của kỹ nghệ mô

trong điều trị nha khoa. Ngoài ra, vật liệu của khung nâng đỡ phải có tính chất cơ

học và sinh lý tương thích khi đưa trở lại cho bệnh nhân. Một số polymer tổng

hợp và tự nhiên, như calcium/phosphate, đã được thử nghiệm trong kỹ nghệ mô tái

tạo ngà răng. Tuy nhiên, rất ít vật liệu có thể tái tạo hoàn chỉnh mô ngà răng, chúng

có thể hỗ trợ tế bào tăng trưởng nhưng không có khả năng gây ra sự khác

biệt hướng tới chuyên hóa tạo răng [17] [29].

9

Hình 1.3. Ngà răng – tủy hình thành phức hợp với định hướng tối ưu cho các ứng

dụng lâm sàng của liệu pháp tái sinh [35]

Một tập hợp các vật liệu sinh học đã được sử dụng trong các nghiên cứu gần đây

cho quy trình tái tạo mô răng. Ứng dụng vật liệu hoạt tính sinh học có sẵn như

khung nâng đỡ tiềm năng bao gồm vật liệu hữu cơ tự nhiên như collagen,

fibronectin, polymer hữu cơ như alginate (PLA), polyglycolic acid (PGA) và chất

đồng trùng hợp (copolymer) của chúng.

Các vật liệu hứa hẹn nhất trong việc tái tạo mô răng sẽ được mô tả tóm tắt sau

đây:

- Collagen [1], [25], [57]

Collagen thuộc về các polymer tự nhiên, là một protein quan trọng trong cơ

thể con người bao gồm các sợi không hòa tan. Nó là một thành phần chủ yếu của

giá thể ngà răng và hỗ trợ sự khởi đầu vôi hóa, nhưng không tự gây ra sự khoáng

hóa. Collagen có lợi thế về tương hợp tế bào và hoạt tính sinh học. Tuy nhiên,

collagen cấy ghép có thể phân hủy trong cơ thể và đôi khi có thể gây ra phản ứng

viêm nhẹ [56].

Trong quá trình thiết kế giá thể collagen ba chiều, có bốn đặc tính cần phải

được kiểm soát: một số nhóm chức trong sợi collagen phải được loại bỏ để tránh

ngưng tụ tiểu cầu, thành phần hóa học phải phù hợp với sự bám dính của tế bào

10

chuyên biệt, kích thước lỗ phải nằm trong khoảng giới hạn và tốc độ phân hủy sinh

học của giá thể.

Zhang và cộng sự (2006) thực hiện thí nghiệm đưa DPSCs vào một khung

nâng đỡ collagen, kết quả DPSCs bám dính, tăng sinh trên bề mặt, tế bào tăng sinh

rõ rệt bởi collagen trong cơ thể sống. Tuy nhiên nó không thể chứng minh rằng vật

liệu sinh học collagen dựa trên kích thích DPSCs để tổng hợp khoáng mô cứng [59]

Vì vậy, collagen đã được sử dụng như một loại vật liệu tiên phong cho sự tái

tạo phức hợp ngà-tủy răng, nhiều nhà nghiên cứu đã tập trung vào loại vật liệu

khung nâng đỡ này.

- Gelatin [1], [44]

Gelatin là sản phẩm từ thủy phân giới hạn sợi collagen không hòa tan. Thành

phần và trình tự axit amin của gelatin tương tự collagen. Gelatin có hàm lượng

glycin, prolin và hydroxyprolin cao. Cấu trúc xoắn ba của tropocollagen được bảo

tồn trong gelatin, vì vậy gelatin có thể giữ nước để tạo thành gel.

- Alginate [23], [1]

Giá thể ngoại bào tổng hợp cũng đã được phát triển như là khung nâng đỡ

tiềm năng cho chữa trị nha khoa, alginate hydrogel tạo điều kiện chữa lành tổn

thương tủy và có thể cung cấp các yếu tố tăng trưởng như TGF-1 để tăng cường

khả năng tái sinh tự nhiên tủy răng nha khoa.

- Gốm (ceramic)

Ceramic phosphate calcium cũng là một loại vật liệu thường được sử dụng để

tái tạo mô cứng bởi vì có tính chất tương hợp sinh học cao và khả năng hỗ trợ sự

khác biệt của các tế bào.

Vật liệu này là một ứng dụng khá thích hợp cho răng nhân tạo và tái sinh

răng. Mặc dù vậy, nó được giới hạn để cấy ghép hoặc vật liệu phủ hay dạng bột vì

độ dai chỗ xương gãy kém, cũng phụ thuộc vào các kỹ thuật chuẩn bị (chế biến,

hình thành, mật độ) và độ xốp [51].

Gronthos và cộng sự (2000, 2002) đã chứng minh hoạt động của DPSCs liên

kết với bột hạt gốm (TCP / HA) do việc cấy ghép vào chuột suy giảm miễn dịch.

11

Kết quả cho thấy phát sinh thế hệ của một lớp giá thể như ngà răng trên bề mặt

khung nâng đỡ của các hạt TCP / HA cho thấy tiềm năng của nó như là vật liệu hoạt

tính sinh học cho việc sửa chữa phức hợp ngà – tủy. [10]

- Nhựa tổng hợp (composites) [10]

Một lựa chọn khác cho việc sử dụng khung nâng đỡ tổng hợp là sử dụng nuôi

cấy ba chiều với một chuỗi khung nâng đỡ ngoại bào nội sinh. Sản xuất và ứng

dụng vật liệu tổng hợp từ các polymer tái hấp thụ tổng hợp và có hoạt tính sinh học

calcium/phosphate như HA, TCP hoặc kích hoạt tính sinh học trở nên ngày càng

quan trọng, lợi dụng tính chất hoạt tính sinh học và tái hấp thụ dẫn tới các quá trình

hình thành mô. Qua đó, thiết kế tập trung vào việc giảm thiểu những bất lợi và sử

dụng các thuộc tính có lợi của các thành phần đơn để phát triển giá thể kỹ nghệ mô

tối ưu hóa với những đặc tính bao gồm cả tỷ lệ thoái hóa trong cơ thể cân bằng để

hình thành mô mới

Gần đây, hệ thống nuôi cấy khung nâng đỡ tự do có tên là "kỹ thuật tế bào viên"

đã được phát triển. Hệ thống này bao gồm việc hình thành dạng viên hay tập hợp tế

bào, cho phép tương tác ba chiều giữa các tế bào lân cận, thiên về tổng hợp giá thể

ngoại bào trong dạng viên [57].

- Giá thể ngà răng

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng giá thể ngà răng là một khung nâng đỡ phù

hợp với kỹ nghệ mô răng do tính tương hợp miễn dịch, tính chất cơ học phù hợp và

sự đa dạng các yếu tố di truyền răng. Các giá thể ngà răng đã được nghiên cứu chứa

khoảng 30% lượng collagen, protein không tạo keo (NCPs), các yếu tố tăng trưởng

[34] [43], nhiều protein và các yếu tố này được chứng minh là quan trọng trong việc

phát triển, khoáng hóa và tái sinh của ngà răng [14] [40].

1.2. Ngà răng [2], [3]

Ngà răng, chiếm phần lớn cấu trúc răng, ít cứng hơn men răng. Ngà răng gồm

70% chất vô cơ, 30% chất hữu cơ (hầu hết là collagen dạng sợi) và nước. Ngà liên

tục từ thân đến chân, tận cùng ở chóp răng, trong lòng chứa buồng tủy và ống tủy.

Trong ngà có nhiều ống ngà, chứa đuôi bào tương của nguyên bào ngà.

12

Ngà răng là một mô sống, cùng với tủy răng tạo thành hệ thống (phức hợp) ngà - tủy có chức năng quan trọng đối với toàn bộ hoạt động và sự sống của răng.

1.2.1. Cấu trúc ngà răng

- Đuôi bào tương của nguyên bào ngà: Nguyên bào ngà nằm ở bề mặt phía

trong của ngà răng, trong vùng ngoại vi của tủy răng. Từ khi biệt hóa chúng không

phân chia. Sau khi quá trình hình thành răng kết thúc, các tế bào này giúp nâng đỡ

về mặt sinh lý học cho toàn bộ lớp ngà răng bên ngoài và đắp dày thêm lớp ngà nhờ

việc tạo ngà thứ phát. Các đuôi của chúng xuyên suốt toàn bộ bề dày của ngà răng,

từ lớp tiền ngà sát tủy răng cho tới đường nối men - ngà hoặc đường nối ngà - xê

măng. Bào tương của các đuôi nguyên bào ngà chứa ty lạp thể và các vi quản chạy

song song theo trục của nó.

Về mặt phát triển cá thể và chức năng, nguyên bào ngà có mối liên hệ với

nguyên bào xương và nguyên bào sợi, là những tế bào chuyên biệt của mô liên kết.

Nguyên bào ngà cũng như toàn bộ tập đoàn tế bào của nhú răng có nguồn

gốc ngoại trung mô, bắt nguồn từ mào thần kinh. Khi đã được biệt hóa, nguyên bào

ngà bước vào một vòng đời liên quan đến việc tạo thành, duy trì và sửa chữa ngà

răng.

- Ống ngà: Trong quá trình tạo ngà, các đuôi nguyên bào ngà bị kéo dài dần,

chúng nằm trong những ống dài chạy xuyên qua lớp ngà đã khoáng hóa. Đó là ống

ngà, ống ngà được lấp đầy bởi các đuôi bào tương của nguyên bào ngà, dịch mô và

các thành phần cấu trúc hữu cơ như sợi collagen và chất khuôn của ngà quanh ống,

có vai trò nâng đỡ sinh lý cho ngà răng.

Các ống ngà có đường đi hình chữ S ở ngà thân răng, khá thẳng ở ngà chân

răng.

13

Nguyên bào

ngà

Ống ngà

Hình 1.4. Nguyên bào ngà và ống ngà [11]

a. Ở răng cửa

b. Ở răng nanh

c. Ở răng cối

d. Ngà răng

e. Men

ac. Xê măng không tế bào

cc. Xê măng tế bào

M: Buồng tủy

Hình 1.5. Hình dạng ống ngà [3]

1.2.2. Thành phần cấu tạo và các đặc tính của ngà răng

1.2.2.1. Thành phần hữu cơ

Khuôn hữu cơ của ngà răng chứa 91% đến 92% collagen và 8% đến 9% khuôn

hữu cơ không collagen. Phần lớn collagen thuộc loại I, chỉ có dưới 3% thuộc loại V

(Butler, W.T., 1984). Thành phần acid amin của collagen ở răng vĩnh viễn chỉ hơi

khác răng sữa nhưng thành phần khuôn lại hoàn toàn khác.

14

1.2.2.2. Thành phần vô cơ

Tất cả các dạng ngà răng như ngà vỏ, ngà quanh tủy, ngà gian ống và ngà quanh

ống đều có thành phần tinh thể phosphate calcium dạng apatide. Các tinh thể của

ngà răng nhỏ hơn các tinh thể ở men răng, chúng có hình dạng và kích thước tương

tự như tinh thể ở xê-măng và xương.

Thành phần khoáng của ngà răng (các tinh thể hydroxyapatide) chứa calcium,

phosphate. Trong thành phần của ngà răng có một lượng nhỏ carbon, magnesium và

fluor với nồng độ thay đổi. Thành phần khoáng của ngà quanh tủy tương đối đồng

nhất và có tỉ lệ cao hơn so với thành phần hóa học trung bình của ngà răng.

1.2.2.3. Đặc tính của ngà răng

- Độ cứng: Ngà răng không cứng so với men răng nhưng cứng hơn xương và

xê măng. Độ cứng của ngà răng ở thân răng, cổ răng và chân răng tương tự nhau.

Ngà răng cứng nhất được thấy là ở khoảng cách 0,4 đến 0,6 mm cho tới khoảng

giữa lớp ngà. Ở gần tủy, ngà răng mềm hơn khoảng 30% và vùng ngà răng ở ngoại

vi tương đối mềm. Ngà xơ hóa cứng hơn hẳn so với ngà bình thường.

- Các đặc tính khác của ngà răng

Ngà răng tự nhiên có màu vàng nhạt.

Trong ngà có nhiều ống nhỏ chứa các đuôi nguyên sinh chất của các tạo ngà

bào, ống ngà có đường kính khoảng 5-10 m ( 1m = 10–6 m, 1nm = 10–9 m)

Trên 1mm2 cắt ngang qua ngà răng có khoảng từ 20.000 đến 50.000 ống ngà,

như vậy ngà răng là một mô có độ đàn hồi cao, tương đối xốp và có tình thấm. Khả

năng thẩm thấu tăng khi lớp ngà mỏng và đối với các phần tử kích thước nhỏ, khả

năng thẩm thấu giảm khi mức xơ hóa tăng

Các đuôi nguyên bào ngà với mật độ cao và có chiều dài tổng cộng rất lớn

tạo nên một tổng thể tích lớn hơn hẳn so với tổng thể tích thân tế bào và thể tích tủy

răng. Trên một răng đã mọc và đang hoạt động chức năng, nguyên bào ngà là thành

phần chức năng quan trọng nhất của răng.

15

1.2.3. Giá thể ngà răng

Giá thể ngà đã được chứng minh có khả năng kích thích tế bào tủy răng người

biệt hóa thành nguyên bào ngà in vitro(trong ống ng) và hình thành nên ngà mới in

vivo [10]. Để đảm bảo cho tế bào giảm tính kháng nguyên và tế bào có thể bám,

tăng sinh trên bề mặt ngà thì cần tiến hành xử lý loại bỏ lớp mùn ngà trên bề mặt.

Lớp mùn ngà là lớp giữa cấu trúc ngà - tủy, gồm có các nguyên bào ngà, các sợi

collagen và các protein bề mặt

Lớp mùn

Nguyên

bào ngà

Ống ngà

Hình 1.6. Bề mặt ngà chưa xử lý dưới SEM [52]

1.3. Tế bào gốc trong mô tủy răng

Những nghiên cứu đã chỉ ra rằng mô tủy của người trưởng thành chứa một quần

thể đa tiềm năng tế bào gốc tủy răng trung mô, tăng sinh cao cho sự tự đổi mới và

khả năng biệt hóa dạng tế bào khoáng hóa thành nguyên bào ngà, đã làm nổi lên

cuộc cách mạng nghiên cứu nha khoa và mở con đường mới đặc biệt cho điều trị và

tái tạo nha khoa nói riêng và kỹ nghệ mô nói chung.

Điều trị nha khoa bằng liệu pháp tế bào gốc cho phép sử dụng nguồn tế bào tự

thân, có nghĩa là tế bào gốc đã biệt hóa có thể được thu nhận và sử dụng điều trị trên

cùng một bệnh nhân, do vậy loại trừ khả năng không tương thích miễn dịch.

Đã có rất nhiều nghiên cứu về việc phân lập tế bào tủy răng của nhiều loài khác

nhau và chứng minh rằng chúng có tỉ lệ tăng sinh cao; đồng thời có khả năng biệt

hóa thành dạng tế bào khoáng hóa trong môi trường thích hợp (Nakashima, 1991;

16

Nakashima và cộng sự, 1994; Kettunen và cộng sự, 1998; Buchaille và cộng sự,

2000; Yokose và cộng sự, 2000). Tuy nhiên, cơ chế của việc tạo ngà răng vẫn chưa

được hiểu rõ. Đầu thế kỷ 21, Gronthos và cộng sự (2000, 2002) đã cố gắng nghiên

cứu đặc điểm độc đáo của quần thể tế bào gốc tủy răng người. Những tế bào này có

khả năng tự làm mới và biệt hóa thành nguyên bào ngà in vitro. Từ năm 2003,

Miura và cộng sự cũng tách được quần thể tế bào gốc trung mô từ răng sữa của trẻ

em.

1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Vào cuối những năm 1980, nhà phẫu thuật cấy ghép cơ quan Joseph P. Vacanti

thuộc khoa y của trường đại học Harvard và nhà hóa học polymer Robert S. Langer

thuộc viện kỹ thuật Massachusetts đã bước đầu thành công trong việc tái tạo mảnh

mô gan từ những tế bào gan và hướng tới việc tái tạo những mô phức tạp hơn như

cơ tim, ruột và xương [43].

Năm 2000, Pamela C. Yelick và John D. Bartlett thuộc viện Thực vật học

(Forsyth Institute) tại Boston bắt đầu hợp tác với Vacanti. Họ muốn thử nghiệm

công nghệ mới này để tái tạo bộ răng trên heo [37].

Paul T. Sharpe là một giáo sư tại trường cao đẳng King, London. Ông cùng

nhóm của mình theo đuổi chiến lược tái tạo răng dựa trên việc mô phỏng gần giống

quá trình hình thành răng từ phôi trong tự nhiên, tiến hành thí nghiệm trên chuột.

Đây được đánh giá là cột mốc quan trọng của công nghệ mô tái tạo răng [7], [8].

Trong những năm gần đây, với những kĩ thuật hiện đại, các nhà khoa học đã có

những bước tiến đáng kể khi họ tiến hành nghiên cứu phân lập và nuôi cấy thành

công tế bào gốc tủy răng. Bên cạnh đó là việc tạo khung nâng đỡ ba chiều dùng

trong kỹ nghệ mô tủy răng để phục hồi tủy răng trong chữa trị. Một số công trình

được công bố gần đây:

Năm 2006, George T.-J. Huang và cộng sự thu nhận tế bào gốc tủy răng theo

nhiều phương pháp khác nhau; sau đó biệt hóa thành nguyên bào ngà. Họ cũng

17

chứng minh được tế bào tủy răng tăng sinh được trong collagen và trên bề mặt ngà

răng [20].

Năm 2006, Shunji Kumabe và cộng sự tách tế bào tủy răng và biệt hóa thành

nguyên bào ngà. Đồng thời, họ cấy tế bào vào giá thể alginate; sau đó cấy dưới da

bụng chuột. Sau 6 tuần cấy ghép, trong giá thể xuất hiện những thể khoáng hóa

[49].

Năm 2007, C. Mauth và cộng sự đã giới thiệu những phương pháp nuôi tế bào

tủy và những khung nâng đỡ hiện nay dùng trong công nghệ nội nha như collagen,

composite... [10].

Năm 2008, Rania M. El-Blackly và cộng sự tiến hành nuôi tế bào tủy răng trong

giá thể polymer poly (lactic-co-glycolic) acid và cấy giá thể dưới da bụng chuột.

Sau khi ghép giá thể 12 ngày, trong giá thể xuất hiện cấu trúc giống phức hợp ngà-

tủy [42].

Năm 2008, Eric L. Gotlieb và cộng sự tiến hành nuôi cấy tế bào gốc từ răng sữa

người đã rụng trên các giá thể D, DL, L-polylactic acid được bổ sung các yếu tố

tăng trưởng; sau đó, đánh giá cấu trúc mô tủy thu nhận bằng phương pháp SEM, kết

quả cho thấy có tế bào trong mô tủy với sự khác biệt giữa các loại giá thể [18].

Năm 2009, Weihua Guo và cộng sự tiến hành thử nghiệm sử dụng ngà răng

được xử lý làm giá thể nuôi cấy các tế bào bao răng (DFCs) cho tái tạo ngà răng.

Kết quả cho thấy có sự hỗ trợ và tái tạo ngà răng đầy đủ [55].

Năm 2010, A Tonomura và cộng sự tiến hành cấy ghép tế bào có nguồn gốc từ

tủy răng lên giá thể polyglycolic acid (PGA) và hydroxyapatite/beta-tricalcium

phosphate (HAp/β-TCP), kết quả cho thấy rằng hình dạng giá thể ảnh hưởng đến sự

tái tạo mô của tế bào có nguồn gốc tủy răng [5].

Năm 2011, Rui Li và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm giá thể ngà răng người đã

được xử lý (hTDM) làm khung nâng đỡ tự nhiên để tái tạo mô giống ngà răng

người. Kết quả cho thấy hTDM gây ra và hỗ trợ tái sinh các mô ngà răng hoàn

chỉnh [45].

18

1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Năm 2011, Trần Lê Bảo Hà và cộng sự tiến hành nghiên cứu quy trình nuôi cấy

tế bào gốc tủy răng áp dụng trong kỹ nghệ mô. Kết quả cho thấy đã phân lập và

nuôi cấy thành công tế bào gốc từ mô tuỷ răng người [54].

19

2.1. Vật liệu

2.1.1. Mẫu vật

- Răng cối và răng tiền cối được thu từ:

Khoa Nội Nha, Bệnh viện Răng Hàm Mặt Thành phố Hồ Chí Minh.

Khoa Răng Hàm Mặt, Trường Đại Học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

- Tiêu chuẩn chọn mẫu:

Được sự đồng ý của người hiến tặng (bệnh nhân).

Bệnh nhân nhổ răng phải được thực hiện các xét nghiệm máu (thời gian

đông máu, công thức máu); răng không bị sâu, không bị viêm nha chu và răng phải

còn nguyên vẹn.

Bệnh nhân có răng mọc lệch hay ngầm cần nhổ hoặc có chỉ định nhổ.

Răng được nhổ theo yêu cầu của chỉnh hình.

Bệnh nhân có răng dư gây biến chứng.

- Tiêu chuẩn loại trừ:

Bệnh nhân không đồng ý cho mẫu.

Răng mọc lệch hay ngầm phức tạp phải nhổ bằng phương pháp chia cắt

răng.

Răng bị tổn thương cấu trúc ảnh hưởng đến tủy trong khi nhổ.

Hình 2.1. Mẫu răng người sau khi thu nhận

20

2.1.2. Dụng cụ và thiết bị

Bảng 2.1. Danh sách các dụng cụ sử dụng

STT Tên STT Tên

1 Bercher (50ml, 100ml, 250ml) 15 Gạc vô trùng

2 Erlen (50ml, 100ml) 16 Bông gòn

3 Bình Duran (50ml, 100ml) 17 Giấy nhôm

4 Màng lọc vô trùng 0,22µm 18 Giấy thấm

5 Đĩa 35mm 19 Parafilm

6 Đĩa 96 giếng 20 Lọ thu mẫu

7 Bình Roux 25cm2 21 Buồng đếm hồng cầu

8 Bình định mức (50 ml, 100 ml) 22 Lame, lamelle

9 Đĩa Petri 23 Lưỡi dao phẫu thuật

10 Cá từ 24 Kéo, kiềm cắt mẫu

11 Eppendorf 1,5ml 25 Kẹp cong, kẹp thẳng

12 Đầu tip (100µl, 1000µl) 26 Ống bóp

13 Micropipette 100µl, 1000µl 27 Ống falcon 15ml

14 Pipette 1ml, 10ml

21

Bảng 2.2 Danh sách các thiết bị sử dụng

STT Tên Hãng

1 Tủ nuôi cấy mô và tế bào Sanyo

2 Kính hiển vi đảo ngược Narishage

3 Nồi hấp khử trùng Daihan

4 Máy ly tâm Hettich

5 Máy khuấy từ Stuart

6 Máy đo OD Sanyo

7 Tủ lạnh chứa hóa chất Sanyo, Toshiba

8 Cân điện tử A & D

2.1.3. Hóa chất

Dung dịch PBS 1X

Dung dịch PBS 10X thương mại (Sigma) 10 ml

Nước cất 90 ml

Bảo quản ở nhiệt độ 40C

Dung dịch PBS Kháng sinh

Dung dịch PBS 1X 900 ml

Antibiotic-antimycotic (Sigma) 01 ml

Bảo quản ở nhiệt độ 40C.

Dung dịch tách tế bào: Trypsin/EDTA 0,25 %

Trypsin thương mại (Sigma) 0,25 g

EDTA thương mại (Sigma) 0,093 g

PBS 1X đủ 100 ml

Bảo quản ở nhiệt độ 40C.

22

Dung dịch EDTA 17%

EDTA thương mại (Sigma) 17g

Nước cất 100 ml

Chuẩn về pH 8

Bảo quản ở nhiệt độ phòng

Dung dịch Axit citric 19%

Axit citric thương mại (Sigma) 19g

Nước cất 100 ml

Bảo quản ở nhiệt độ phòng

Dung dịch khử trùng

Povidine Iod 10% (Betadine) bảo quản trong tủ lạnh 40C

Dung dịch NaOCl 5,25% (Sodium Hypochlorite) bảo quản ở nhiệt độ phòng

Dung dịch bảo quản mẫu răng

D′MEM bổ sung 300UI/ml penicillin, 300μg/ml streptomycin, 0,75μg/ml

amphotericin B (fungizone®)


Môi trường nuôi cấy mảnh mô

D′MEM/F12

10% FBS (Fetal bovine serum – Huyết thanh bào thai bò)

2mM L-glutamin

100U/ml penicillin, 100µg/ml streptomycin


Hóa chất chạy Flow cytometry

Sheath Fluid (BD Bioscience, San Jose, CA) 2 l

FACSflow (BD Bioscience, San Jose, CA) 2 l

Kháng thể phân tích Tế bào gốc trung mô: anti-CD13-PE, anti-CD166-PE, anti-

CD34-FITC, anti-CD44-PE, anti-CD45-FITC, anti-CD90-FITC, fluorescein

isothiocyanate (FITC)-conjugated goat anti-mouse IgG (BD Biosciences).

23

Dung dịch MTT (3-[4,5-dimethylthiazoyl]-2-5-diphenyltetrazolium bomide)

Dung dich MTT (thương mại) 05mg

Nước cất 01ml


Dung dịch DMSO/ethanol (thương mại)

Cồn 700

Thuốc nhuộm Trypan Blue (thương mại)

Formalin 4% đệm phosphate (thương mại)

24

2.2. Phương pháp

2.2.1. Sơ đồ quy trình thí nghiệm tổng quát

Mẫu răng Thu tủy răng

Cắt thành những mẫu ngà có kích thước 1 x 2 x 1mm

Nuôi tế bào thu từ tủy

Cấy chuyền

Xử lý bề mặt ngà

Xác định tế bào gốc tủy răng

Đưa tế bào lên giá thể

Khảo sát sự bám dính và

tăng sinh

Chụp SEM Phương phápMTT

25

2.2.2. Tạo giá thể từ ngà răng người

- Cơ sở khoa học

Lớp mùn ngà là lớp giữa cấu trúc ngà - tủy, gồm có các nguyên bào ngà, các

sợi collagen và các protein bề mặt. Do đó, ngà răng sau khi được thu nhận, để đảm

bảo cho giá thể giảm tính kháng nguyên và tế bào có thể bám, tăng sinh trên bề mặt

ngà thì cần tiến hành xử lý loại bỏ lớp mùn ngà trên bề mặt.

- Thu nhận các mẫu ngà từ thân ngà răng người

Sau khi nhổ, răng được loại bỏ tối đa các phần mô mềm như bao răng, dây

chằng nha chu và ngâm cồn 700 trong 30 giây.

Tiêu chuẩn để chọn mẫu ngà cho thí nghiệm

Buồng tủy của răng rộng và có kích thước tương đối bằng nhau.

Cắt phần thân ngà răng theo kích thước mẫu 1 x 2 x 1mm.

Bề mặt ngà sạch, không bị hư hại

Mẫu răng được cắt dọc theo bề rộng nhất để thu ngà.

Vị trí cắt

dọc mẫu

răng

Vị trí thu

mẫu ngà

răng

Hình 2.2. Cách cắt răng tạo hình mẫu ngà

26

- Xử lý bề mặt ngà

Mẫu ngà thu nhận được sau khi tạo hình sẽ được tiến hành xử lý bề mặt. Bề

mặt ngà được chà bằng phần nhám ở đầu của mũi máy cắt. Sau đó, tiến hành xử lý

với dung dịch EDTA / Axit citric: ngâm các mẫu ngà trong dung dịch EDTA 17%

trong 10 phút và dung dịch axit citric 19% trong 1 phút.

- Phương pháp khử trùng

Sau khi xử lý bề mặt, các mẫu ngà sẽ lần lượt được khử trùng bằng Povidine

Iod 10% (Betadine) và NaOCl 5,25%, mỗi hóa chất trong 30 phút và trong điều kiện

vô trùng.

- Đánh giá kết quả xử lí bề mặt của giá thể ngà răng

Các giá thể ngà răng sẽ được cố định trong dung dịch formalin 10% đệm

phosphate, bảo quản trong điều kiện lạnh bằng đá gel. Sau đó, mẫu sẽ được chuyển

đến phòng thí nghiệm Công nghệ Nano, Đại học Quốc gia TP.HCM để chụp bằng

kính hiển vi điện tử quét (SEM).

2.2.3. Qui trình nuôi cấy tế bào tủy răng người

2.2.3.1. Nuôi cấy sơ cấp


Miệng là môi trường dễ nhiễm nấm, vi khuẩn, vi rút,….Do đó, việc thu

nhận răng từ bệnh nhân, thu nhận mô tủy và bảo quản được ở tình trạng vô trùng

cho đến khi thực hiện thí nghiệm là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong nuôi

cấy tế bào.

Sau khi được thu nhận, ba quần thể tế bào chủ yếu gồm: tế bào hồng cầu, tế

bào bạch cầu và tế bào tủy (trong đó có quần thể tế bào gốc trung mô ứng viên).

Các tế bào hồng cầu và bạch cầu trưởng thành là những tế bào không có khả năng

bám dính trên bề mặt dụng cụ nuôi cấy. Ngoài các tế bào bạch cầu non có khả năng

bám dính còn có quần thể tế bào tủy răng. Do đó, việc chọn lọc tế bào gốc trung mô

được tiến hành trên môi trường nuôi cấy chuyên biệt cho phép tế bào gốc trung mô

ứng viên sống sót và tăng sinh.

27

- Phương pháp thực hiện

Sau khi nhổ, răng được loại bỏ tối đa các phần mô mềm (như bao răng, dây

chằng nha chu) bằng dụng cụ vô trùng. Các mẫu răng này sẽ được bảo quản trong lọ

có chứa dung dịch D′MEM bổ sung 300UI/ml penicillin, 300μg/ml streptomycin,

0,75μg/ml amphotericin B (fungizone®). Sau đó, khử trùng bằng Betadine trong 10

phút và rửa lại bằng PBS.

Tủy răng được lấy ra trong điều kiện vô khuẩn và sang chấn tối thiểu. Sau

đó, mẫu tủy được cắt thành những mảnh nhỏ (1x 2 x 1 mm) bằng lưỡi dao phẫu

thuật và được chuyển vào đĩa 35mm; sau đó, thêm 2 ml môi trường D′MEM/F12 bổ

sung 10% FBS (Fetal bovine serum), 2mM L-glutamin, 100U/ml penicillin,

100µg/ml streptomycin. Các mảnh mô được nuôi cấy ở 370C, 5% CO2. Môi trường

được thay hai ngày một lần.

2.2.3.2. Phương pháp cấy chuyền tế bào tủy răng


Khi mật độ tế bào trong bình nuôi đạt khoảng 70 – 80%, tiến hành cấy

chuyền nhằm cung cấp không gian và chất dinh dưỡng cho tế bào tăng sinh và phát

triển đạt hiệu quả cao.


Khi tế bào đạt 75 – 80% bề mặt đĩa nuôi thì tiến hành cấy chuyền. Khi đó,

hút bỏ môi trường nuôi cấy cũ, rửa bề mặt đĩa nuôi 2 – 3 lần với PBS. Sau đó, cho

1ml trypsin/EDTA vào đĩa nuôi, ủ ở 370C trong 2 phút. Khi toàn bộ tế bào đã tách

khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy và có dạng hình tròn thì thêm vào đĩa nuôi 1ml môi trường

để bất hoạt trypsin/EDTA.

Chuyển toàn bộ dịch tế bào trên vào bình Roux 25cm2, tiến hành thêm 3ml

môi trường vào Roux và tiếp tục nuôi ở 370C, 5% CO2.

Trong toàn bộ các nghiên cứu sau, các tế bào ở thế hệ P4 được lựa chọn để

thực hiện.

28

2.2.4. Đánh giá tế bào tủy răng thu được

2.2.4.1. Phương pháp xác định kiểu hình miễn dịch


Flow cytometry là phương pháp định lượng và phân tích đa đặc điểm của

đơn vật thể, thông thường là tế bào khi chúng chảy thành dòng xuyên qua một chùm

ánh sáng. Các tính chất được định lượng bao gồm kích thước, tính chất hạt hoặc

mức độ phức tạp bên trong và mật độ phát huỳnh quang. Các đặc điểm này được

xác định bởi hệ thống: quang học – điện tử, nhằm ghi nhận sự phát quang của tế

bào. Các tín hiệu phát quang này được cảm nhận bằng máy dò, chuyển đến máy tính

xử lí và cung cấp thông tin.

Tế bào P4 được phân tích marker đặc trưng cho tế bào gốc trung mô dựa

theo quy trình chuẩn bị tế bào cho phân tích Flow cytometry theo hướng dẫn của

BD Bioscience.


Phương pháp flow cytometry được tiến hành khi tế bào P4 đạt độ phủ kín

khoảng 80-90% để xác định sự biểu hiện của các marker tế bào gốc trung mô trên

bề mặt tế bào.

Các tế bào P4 được thu nhận bằng trypsin/EDTA 0,25%, điều chỉnh mật độ

tế bào đạt 106 tế bào/ml. Huyền phù tế bào trong 1 ml Facs Flow và nhuộm với 10µl

kháng thể trong 30 phút ở nhiệt độ phòng (CD34-FITC, CD45-FITC, CD13-PE,

CD44-PE, CD90- FITC, CD166-PE, BD Sciences, San Jose, CA). Làm lạnh mẫu

trong 15 phút ở 40C. Tiến hành đánh giá marker tế bào bằng máy FACS Calibur sử

dụng phần mềm Cell Quest Pro.

2.2.4.2. Khảo sát sự tăng trưởng của tế bào thu được từ mảnh mô


Đường cong tăng trưởng được thiết lập để phân tích các đặc điểm tăng

trưởng của kiểu tế bào hay dòng tế bào. Sử dụng buồng đếm hồng cầu để đếm trực

tiếp số lượng tế bào và từ đó suy ra sự tăng trưởng. Ngoài ra, việc sử dụng trypan

blue khi đếm tế bào sẽ làm tăng độ chính xác và dễ dàng tiến hành .

29


Cấy chuyền tế bào P3 sang đĩa 96 giếng với mật độ 3x104 tế bào/ml cho mỗi

giếng, nuôi trong môi trường D′MEM/F12 bổ sung 10% FBS, 2mM L-glutamin,

100U/ml penicillin, 100µg/ml streptomycin ở 370C, 5% CO2 và thay môi trường hai

ngày một lần.

Mỗi ngày đếm số tế bào ở 3 giếng ngẫu nhiên, mỗi giếng đếm 3 lần và đếm

trong 11 ngày.

- Xử lí số liệu

Các số liệu sau khi thu nhận được xử lý bằng chương trình Excel 2003, tính

toán thống kê sai số chuẩn và độ khác biệt có ý nghĩa nhỏ nhất (Least Significant

Different – LSD) ở mức xác suất p=95% bằng phương pháp phân tích phương sai

(Analysis of Variance – ANOVA) theo chương trình Statgraphic 7.0, 1997 của

trường đại học Michigan (Mỹ)..

2.2.5. Khảo sát sự bám dính và tăng sinh của tế bào tủy răng trên giá thể ngà

đã xử lý

2.2.5.1. Phương pháp đưa tế bào lên giá thể

- Phương pháp tách tế bào

Khi các tế bào P3 đạt 75 – 80% bề mặt bình nuôi, tiến hành thu nhận tế bào.

Khi đó, hút bỏ môi trường cũ, rửa lại với PBS từ 2 – 3 lần. Sau đó, thêm 2 ml

trypsin/EDTA vào Roux, ủ 370C trong 2 phút. Khi các tế bào có hình tròn và nổi lên

trên bề mặt dung dịch, thêm môi trường nuôi vào Roux để bất hoạt trypsin (1:1).

Tiến hành ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó, loại bỏ dịch nổi, tái huyền

phù cặn tế bào với 1 ml môi trường và xác định mật độ tế bào.

- Phương pháp đưa tế bào tủy răng người lên giá thể ngà

Agar hòa tan với nước cất ở nồng độ 1% và được hấp khử trùng ở 1210C

trong 30 phút. Sau đó, agar được giữ ở máy ổn nhiệt 700C. Tiến hành cho agar 1%

vào 15 giếng của đĩa 96 giếng (50 µl /giếng); sau 30 phút, cố định giá thể ngà vào

agar. Khi đó, đưa tế bào lên giá thể (mật độ 3x104 tế bào / ngà), thêm 100 µl môi

trường vào mỗi giếng. Sau mỗi hai ngày thay môi trường một lần.

30

2.2.5.2. Phương pháp MTT


Dung dịch MTT là một loại tetrazole có màu vàng. MTT (tên đầy đủ là [3-

(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]) được chuyển hóa

thành tinh thể formazan màu tím trong tế bào sống dưới tác dụng của enzym

sucinate dehydrogenase, một loại enzym reductase trong ti thể. Số lượng tế bào

càng lớn sẽ tạo ra một lượng formazan càng lớn, do đó làm tăng mật độ quang.

Phương pháp này giúp ta đánh giá được số tế bào còn sống hoặc khả năng tăng

trưởng của tế bào ở thời điểm khảo sát.

Phương pháp MTT cho kết quả tương đối chính xác, đơn giản, an toàn hơn

phương pháp đo độ hấp thu phóng xạ, đặc hiệu cho khả năng biến dưỡng ở tế bào

sống, có khả năng đo được số lượng mẫu lớn, đặc biệt là có khả năng đo được cả

những mẫu có cấu trúc 3 chiều.

Enzym reductase của ti thể

tetrazole formazan

Hình 2.3. Nguyên tắc phương pháp MTT [3]


Tiến hành khảo sát MTT qua các mốc thời gian 2, 4, 6, 8, 10 ngày trên 2

nhóm:

Nhóm 1: nhóm đối chứng – tế bào P4 được nuôi trên giếng không có

giá thể ngà răng.

Nhóm 2: tế bào P4 được nuôi trên giá thể ngà đã được xử lý.

Ở các mốc thời gian, mỗi nhóm chọn ba giếng, cho vào mỗi giếng 200 µl

môi trường D′MEM/F12 bổ sung 10% FBS và 20µl dung dịch MTT 5mg/ml, trộn

31

đều dung dịch, ủ 4 giờ trong tủ ấm 370C, 5% CO2. Sau đó, hút bỏ toàn bộ môi

trường và cho 220 µl DMSO/ethanol, ủ 4 giờ trong tủ ấm 370C, 5% CO2. Tiếp theo,

hút toàn bộ dung dịch trong ba giếng vào ống eppendorf và cho thêm 780 µl

DMSO. Khi đó, sử dụng dung dịch DMSO/ethanol chỉnh mật độ quang máy đo OD

về 0. Chuyển dung dịch cần đo OD vào cuvet, tiến hành đo OD lặp lại 3 lần và ghi

nhận kết quả.

- Xử lí số liệu

Số liệu sau khi thu nhận được xử lý bằng chương trình Excel 2003, tính toán

giá trị trung bình, thống kê sai số chuẩn và độ tin cậy ở mức xác suất p=95% bằng

phương pháp t-test so sánh thống kê 2 mẫu dị phương sai (t-test: Two-sample

Assuming Unequal Variances).

2.2.5.3. Phương pháp SEM


Kính hiển vi điện tử quét là một loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với

độ phân giải cao của bề mặt mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử (chùm

các electron) hẹp quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện

thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện

tử với bề mặt mẫu vật.


Xử lý mẫu giá thể và tiến hành nuôi tế bào tuỷ răng người lên bề mặt ngà, cố

định giá thể trên trong dung dịch formalin 10% đệm phosphate, bảo quản trong điều

kiện lạnh bằng đá gel. Sau đó mẫu sẽ được chuyển đến phòng thí nghiệm Hiển vi

điện tử, Viện Vệ sinh Dịch tể Trung ương để chụp SEM.

32

3.1. Thu nhận và xử lý giá thể từ mô ngà răng người

3.1.1. Thu nhận các mẫu ngà từ thân răng người

Từ một mẫu răng thu nhận được một hoặc hai mẫu ngà, có kích thước 1 x 2 x 1

mm.

Tổng số mẫu răng cắt: 9 mẫu.

Tổng số mẫu ngà thu được: 18 mẫu, trong đó, có 15 mẫu ngà thích hợp để làm

thí nghiệm.

Dựa vào kết quả trên, để thu nhận được giá thể ngà tốt nên dùng các mẫu răng:

răng cối lớn, răng khôn và răng phải còn nguyên vẹn.

Hình 3.1. Mẫu ngà thu nhận để làm thí nghiệm sau khi xử lý

3.1.2. Đánh giá kết quả xử lí bề mặt của giá thể ngà răng

Sau khi mẫu ngà được cắt và tạo hình từ mẫu răng, tiến hành xử lý bề mặt ngà

bằng những dung dịch hóa học. Các chất hóa học có trong các dung dịch ấy sẽ có

tác động đến bề mặt ngà và có thể làm loại bỏ được lớp mùn ngà (smear - lớp giữa

tủy và ngà răng).

Các giá thể ngà răng sau khi xử lý đã được đánh giá hiệu quả bằng kính hiển

vi điện tử quét. Kết quả được trình bày ở hình 3.2 và hình 3.3.

33

Hình 3.2. Mẫu chứng bề mặt ngà chưa xử lý

Lỗ ngà

Hình 3.3. Bề mặt ngà xử lý bằng EDTA / Axit Citric

Qua kết quả chụp SEM ta nhận thấy:

- Ở mẫu đối chứng, lớp mùn ngà được quan sát thấy khá rõ. Vì không có tác

động hóa học cũng như vật lý lên bề mặt ngà nên không loại bỏ được lớp mùn ngà.

- Bề mặt ngà được xử lý để lộ ra các ống ngà trên bề mặt có mật độ dày với

kích thước các lỗ ngà khá đồng nhất. Chứng tỏ giá thể đã loại được lớp mùn ngà.

Trước khi xử lý bằng dung dịch EDTA / Axit Citric, bề mặt ngà được xử lý cơ học.

34

Chính tác động cơ học này đã làm tăng khả năng loại bỏ được lớp mùn ngà một

cách hiệu quả.

- Bề mặt ngà tạo ra có cấu trúc xốp và kích thước lỗ bên trong giá thể dao

động từ 2-3 μm, điều này phù hợp với công trình nghiên cứu trước đây: đặc tính của

ngà răng là một mô có độ đàn hồi cao, tương đối xốp và có tính thấm; đường kính

bề mặt ngà răng người trung bình 2,94 μm [38].

Sousa Neto và cộng sự cho thấy sự cần thiết phải loại bỏ lớp mùn của ngà răng

để bề mặt giá thể có độ bám dính cao hơn. Trong nghiên cứu in vitro, Orstavik và

Haapasalo đã chỉ ra tầm quan trọng của việc loại bỏ lớp mùn và sự hiện diện của

ống ngà răng nhằm giảm thời gian cần thiết để đạt được hiệu quả khử trùng của

thuốc intracanal. Bystrom và Sundqvist cũng nhận thấy rằng sự hiện diện của một

lớp mùn ngà có thể ngăn chặn hoặc trì hoãn đáng kể sự xâm nhập của các tác nhân

kháng khuẩn như irrigants intracanal và thuốc vào các ống ngà. Kouvas và cộng sự,

Kennedy và cộng sự báo cáo rằng lớp mùn ngà là một yếu tố tiêu cực trong việc bịt

kín ống chân răng [32].

Các nhà nghiên cứu rất quan tâm đến việc loại bỏ các lớp mùn trước khi thâm

nhập vào rãnh nhỏ ngà răng [32]. Trong điều trị nội nha, EDTA thường được sử

dụng để loại bỏ các mảnh vụn hữu cơ và vô cơ được tạo ra trong điều trị tủy, do khả

năng hòa tan hàm lượng khoáng trong ngà răng [6]. Ngoài ra, trong in vitro, có

nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng EDTA trong việc loại bỏ lớp mùn ngà,

đồng thời làm lỏng lẻo cấu trúc ngà sẽ giúp giải phóng các yếu tố kích tạo. Các yếu

tố này sẽ kích thích sự biệt hóa của tế bào gốc tủy răng được nuôi cấy trên giá thể

ngà thành nguyên bào ngà.

Axit Citric là một axit hữu cơ thuộc loại yếu. Trong lĩnh vực thí nghiệm thì nó

đóng vai trò như là một chất tẩy rửa, an toàn đối với môi trường và đồng thời là tác

nhân chống oxy hóa. Ở nhiệt độ phòng, axit citric là chất kết tinh màu trắng, có khả

năng hòa tan trong nước, làm sạch bề mặt ngà.

35

Tác động của việc ngâm các mẫu ngà trong PBS từ 5 – 7 ngày giúp loại bỏ các

bụi bẩn trong quá trình tạo hình giá thể và các hóa chất xử lý, khử trùng; không gây

ảnh hưởng đến sự tăng sinh của tế bào trên bề mặt ngà.

Vậy qui trình thu nhận và xử lý giá thể ngà đã được xác lập:

Mẫu răng

Loại bỏ mô mềm, dây chằng nha chu

Cắt dọc mẫu theo bề rộng nhất để thu ngà.

Xử lý cơ học

Ngâm EDTA 17% trong 10 phút

Ngâm axit citric 19% trong 1 phút

Ngâm Povidine iod 10% trong 30 phút

Ngâm NaOCl 5,25% trong 30 phút

Rửa bằng PBS

Giá thể ngà răng đã xử lý

Đây là qui trình đã được công bố bởi George T.-J. Huang và cộng sự (2005), có

ưu điểm là sử dụng những hóa chất được dùng trong điều trị nội nha. Tuy nhiên, qui

trình do chúng tôi xác lập có sự khác biệt với qui trình của George T.-J. Huang ở

36

việc đã sử dụng bề mặt nhám của máy cắt răng để tạo lực tác động cơ học mạnh và

đều khắp bề mặt ngà nên cho kết quả tốt trong việc thu nhận và xử lý giá thể ngà so

với công trình nghiên cứu khác đã được công bố.

3.2. Kết quả nuôi cấy tế bào gốc từ tủy răng người

3.2.1. Kết quả nhuộm Hematoxylin – Eosin (H&E) mô tủy răng

Nhằm xác định sự hiện diện của tế bào trong mô tủy răng sau khi tách ra khỏi

mô cứng (men, ngà), chúng tôi đã nhuộm H&E.

Kết quả được trình bày ở hình 3.4 và 3.5.

Hình 3.4. Mô tủy răng sau khi nhuộm H&E (100X)

Tế bào

Hình 3.5. Mô tủy răng sau khi nhuộm H&E (200X)

37

Kết quả nhuộm H&E mô tủy răng cho thấy:

- Mật độ tế bào trong tủy răng là khá dày đặc. Tế bào có nhiều hình dạng

nhưng chiếm đa số là các tế bào có hình thoi kéo dài. Các tế bào này có thể là tế bào

gốc trung mô hay nguyên bào sợi.

- Thành phần ngoại bào trong mô tủy có dạng sợi, sắp xếp dày đặc và đều đặn.

Điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho rằng tủy răng là một mô giàu

thành phần lưới sợi và chủ yếu là sợi collagen.

- Dựa vào những phân tích kết quả nhuộm mô học tủy răng cho thấy tủy răng

sau khi thu nhận chứa nhiều tế bào và khuôn nền ngoại bào có mật độ cao. Do đó,

có thể tồn tại nhiều loại tế bào khác nhau khi tủy răng được nuôi cấy.

3.2.2. Kết quả nuôi cấy sơ cấp

Mô tuỷ sau khi lấy ra khỏi răng có dạng sệt, màu đỏ. Môi trường bảo quản đã

giúp tủy giữ được trạng thái nguyên vẹn tốt, tỉ lệ nhiểm thấp hơn khi tiến hành bảo

quản bằng các môi trường đã được nghiên cứu trước đây. Khi đó, mô tuỷ sẽ được

xử lý theo phương pháp tiến hành nuôi cấy mảnh mô.

Kết quả ban đầu cho thấy có nhiều tế bào rời rạc và hầu hết các tế bào đều có

hình dạng tròn, chứng tỏ tế bào chưa bám xuống đĩa nuôi và mật độ tế bào còn rất

thấp.

Hình 3.6. Quần thể tế bào sau khi thu nhận.

38

Sau 24 giờ nuôi cấy, tế bào bắt đầu bám trên bề mặt dụng cụ nuôi cấy. Trong khi

đó, tế bào hồng cầu trưởng thành và tế bào chết không có khả năng bám dính trên

bề mặt nuôi cấy và trôi lơ lửng trong dịch huyền phù.

Từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 4: có rải rác các tế bào bám nhưng hình dạng chưa

trải dài. Môi trường nuôi cấy được thay mới nhằm loại bỏ tế bào nổi, đồng thời

cung cấp thêm dinh dưỡng cho sự phát triển của các tế bào bám dính.

Vào ngày nuôi cấy thứ 5, bắt đầu thấy xuất hiện các tế bào trải, lúc này các

protein bám dính đã được tổng hợp đầy đủ cho sự bám của tế bào vào bề mặt đĩa

nuôi, hình dạng của tế bào được dàn trải rộng. Các tế bào có rất nhiều hình dạng

khác nhau như dạng hình thoi, dạng kéo dài, dạng hình sao, dạng giống tế bào nội

mô… và bắt đầu phân bào mạnh.

Hình 3.7. Quần thể tế bào sau 5ngày nuôi cấy.

Sau 7 ngày nuôi cấy, các tế bào trải đều trên bề mặt nuôi cấy, hầu hết các tế bào

có dạng hình thoi giống các nguyên bào sợi và bắt đầu tăng sinh. Đây là hình dạng

bám dính đặc trưng của tề bào gốc trung mô. Ngoài ra, còn sự tồn tại một số dòng tế

bào có khả năng bám dính nhưng không trải dài.

Trong những ngày nuôi cấy sau đó, các dạng tế bào dần dần thu hẹp lại; dạng tế

bào chiếm ưu thế là dạng tế bào trải rộng, nhân lớn hình oval và có nhiều đuôi bào

tương.

39

Đến ngày thứ 15, tế bào tiếp tục trải rộng trên bề mặt nuôi cấy và tăng sinh

mạnh về số lượng, hầu hết các tế bào đều ở dạng giống nhau, chỉ còn vài tế bào

dạng hình sao. Ngày thứ 19, các tế bào bắt đầu hợp dòng, trải thành một lớp đơn

phủ kín bề mặt nuôi cấy.

Hình 3.8. Quần thể tế bào sau 14 ngày nuôi cấy

Sau 21 ngày nuôi cấy, mật độ tế bào chiếm 80-90% diện tích bề mặt nuôi cấy.

Lúc này, tế bào sẽ được tiến hành cấy chuyền.

Hình 3.9. Quần thể tế bào sau 21 ngày nuôi cấy

40

Kết quả này phù hợp với một số công trình đã công bố trước đây: đối với mô tủy

được nuôi cấy theo phương pháp nuôi mảnh mô, tế bào ở phần rìa của mảnh mô sẽ

bám vào bề mặt đĩa nuôi vào khoảng tuần thứ hai hay thứ ba. Ban đầu, các tế bào có

rất nhiều dạng và kích cỡ khác nhau rất khó phân biệt, có thể gồm nguyên bào ngà,

nguyên bào sợi, tế bào gốc trung mô, các loại bạch cầu, do mô tủy là một mô liên

kết lỏng lẻo chứa tế bào, khuôn gian bào dạng oxytalan (dạng kháng acid), lưới và

các sợi collagen; tủy là một mô giàu mạch máu và thần kinh. Do đó, có sự tồn tại

nhiều loại tế bào khác nhau khi tủy răng được nuôi cấy. Trong những ngày nuôi cấy

sau, dạng tế bào giống nguyên bào sợi chiếm ưu thế. Sau 1 tháng tế bào đạt đủ mật

độ để cấy chuyền [10], [20].

3.2.3. Kết quả cấy chuyền tế bào

Khi các tế bào đạt 70 - 85% độ phủ kín bề mặt đĩa nuôi, tiến hành cấy chuyền

thu nhận tế bào P1.

Tế bào bắt đầu bám trên bề mặt bình Roux sau 24 giờ tách cấy chuyền. Tế bào

lúc này có hình dạng trải rộng giống nguyên bào sợi, nhân lớn hình oval; tế bào chất

nhiều, có đuôi bào tương.

Tốc độ tăng sinh của tế bào khi được nuôi cấy thứ cấp cao hơn so với tế bào khi

được nuôi cấy sơ cấp. Sau 5-7 ngày có thể cấy chuyền.

(a) (b)

Hình 3.10. Quần thể tế bào sau 4 ngày (a) và sau 15 ngày (b) cấy chuyền

41

3.3. Kết quả đánh giá tế bào thu được từ tủy răng

3.3.1. Sự biểu hiện một số marker của tế bào gốc trung mô

Các marker bề mặt trên mẫu tế bào thu được sau 3 lần cấy chuyền được phân

tích bằng kỹ thuật flow cytometry trên hệ thống FACS. Các marker âm tính và

dương tính được phân tích đồng thời trên cùng một mẫu tế bào.

Hình 3.11. Kết quả phân tích sự biểu hiện một số marker của tế bào tủy răng sau 3

lần cấy chuyền

42

Kết quả phân tích tế bào gốc trung mô ứng viên sau 3 lần cấy chuyền (Hình

3.11.) cho thấy, tế bào âm tính với 2 marker CD34 (0,42%), CD45 (0,08%)và

dương tính với 4 marker CD13 (99,97%), CD44 (99,84%), CD90 (97,34%), CD166

(98,18%).

Từ các kết quả thu được, chúng tôi thấy rằng quần thể tế bào thu nhận từ tủy

răng người đã có tính đồng nhất và độ ổn định ở thế hệ nuôi cấy thứ tư. Các tề bào

biểu hiện dương tính với các marker bề mặt của tế bào gốc trung mô.

3.3.2. Kết quả đánh giá sự tăng sinh của tế bào trên bề mặt đĩa nuôi

Các tế bào thế hệ thứ 3 được cấy chuyền sang đĩa 96 giếng với mật độ 3x104 tế

bào/cm2.

Mật độ tế bào được xác định mỗi ngày bằng buồng đếm hồng cầu với tế bào

được nhuộm trypan blue. Sử dụng buồng đếm hồng cầu để đếm trực tiếp số lượng tế

bào và từ đó suy ra sự tăng trưởng, việc sử dụng trypan blue khi đếm tế bào sẽ làm

tăng độ chính xác và dễ dàng tiến hành.

Đường cong tăng trưởng của tế bào sau lần cấy chuyền thứ ba được xây dựng

dựa vào mật độ tế bào xác định được.

Đồ thị 3.1. Đường cong tăng trưởng của tế bào tủy răng người nuôi cấy ở lần cấy

chuyền thứ 3

43

Đồ thị 3.1 cho thấy:

- Trong ngày đầu tiên, mật độ tế bào thấp hơn so với mật độ ban đầu (104 tế

bào/cm2) đưa vào giếng nuôi. Tế bào phát triển rất chậm trong 24 giờ cấy chuyền.

Trong thời gian này, tế bào chết nhiều hơn tế bào mới sinh ra, do một số tế bào chết

do hoạt tính của trypsin, còn số còn lại sau khi xử lý bởi trypsin, các protein bám bị

phá vỡ, tế bào cần có thời gian để tổng hợp các protein bám bị mất, do đó hoạt động

phân bào kém.

- Trong 2 ngày tiếp theo, mật độ tế bào tăng nhưng không nhiều, không có sự

khác biệt về mặt thống kê.

- Từ ngày 3 đến ngày 5, tế bào tăng sinh mạnh mẽ. Lúc này, tế bào đã được

tổng hợp đầy đủ các yếu tố bám dính, đồng thời tế bào đã thích nghi với môi trường

mới nên phân bào nhanh chóng. Mật độ tế bào thu được cao nhất ngày 6.

- Từ ngày 7 đến ngày 8, mật độ tế bào bắt đầu giảm và giảm mạnh ở ngày 7,

do số lượng tế bào quá nhiều, dẫn đến sự kìm hãm tiếp xúc giữa các tế bào với

nhau, cũng như diện tích bề mặt nuôi cấy bị giới hạn khi mật độ tế bào cao, dẫn đến

hạn chế sự tăng sinh của tế bào.

- Từ ngày 9, tế bào tiếp tục giảm, có thể do tế bào không đủ không gian nên

khả năng phân bào kém.

Như vậy, sau khi được cấy chuyền, tế bào tăng sinh mạnh từ ngày 2 đến ngày 6,

đạt cao nhất vào ngày 6, sau đó giảm nhanh đến ngày 9. Điều này chứng tỏ tế bào

đã tăng sinh và đạt mức tối đa vào ngày thứ 6.

Kết quả flow cytometry và đường cong tăng trưởng cho thấy các tế bào thu nhận

từ tủy răng có khả năng bám dính trên bề mặt của dụng cụ nuôi cấy và tăng sinh

mạnh mẽ. Hình thái của các tế bào này khá giống với hình thái của nguyên bào sợi

người [30]. Các tế bào phân tích dương tính với các marker như CD13, CD90,

CD44, CD166 và âm tính đồng thời với các marker như CD34, CD45. Kết quả của

nghiên cứu này đã chứng minh rằng tế bào tủy răng có khả năng bám dính, tăng

sinh và duy trì được đặc tính gốc trong điều kiện nuôi cấy in vitro.

44

3.4. Kết quả khảo sát sự tăng sinh của tế bào gốc tủy răng trên bề mặt giá thể

ngà

Nhằm khảo sát khả năng bám, tăng sinh của tế bào gốc tủy răng trên bề mặt giá

thể ngà, phương pháp MTT đã được sử dụng.

(a) (b)

Hình 3.12. Giá thể ngà sau khi ủ hóa chất MTT:

a) Giá thể không có tế bào, (b) Giá thể có tế bào

Quan sát hình 3.12. ta thấy:

- Giá thể ngà răng nuôi tế bào sau khi ủ với dung dịch MTT thì trên bề mặt

xuất hiện tinh thể formazan màu tím.

- Tinh thể formazan do dung dịch MTT chuyển hóa thành dưới tác dụng của

enzym sucinate dehydrogenase, một loại enzym reductase trong ti thể của tế bào

sống. Điều này chứng tỏ có tế bào bám trên bề mặt ngà. Số lượng tế bào càng lớn sẽ

tạo ra một lượng formazan càng lớn, do đó làm tăng mật độ quang (OD).

Phương pháp này giúp ta đánh giá được số tế bào còn sống hoặc khả năng tăng

trưởng của tế bào ở thời điểm khảo sát.

45

Đồ thị 3.2. Biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang (OD) với các mốc thời gian

nuôi cấy

Phương pháp MTT là phương pháp so màu nhạy, có tính định lượng, đáng tin

cậy để xác định sự sống, tăng sinh của tế bào. Trong thử nghiệm MTT, mật độ

quang của dịch nuôi cấy tế bào tỉ lệ với số lượng tế bào trên giá thể.

Kết quả từ đồ thị 3.2 cho thấy:

- Mật độ quang cả 2 nhóm ở ngày thứ 2 xấp xỉ nhau, do tế bào đang hồi phục

sau cấy chuyền, do đó hoạt động phân bào kém, tốc độ tăng trưởng chậm.

- Từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 6, tế bào tăng dần, có sự khác biệt về mặt thống

kê ở cả 2 nhóm. Chứng tỏ từ ngày 4 đến ngày 6 là thời điểm tế bào được kích thích

tăng sinh rất mạnh; tế bào đều tăng sinh đạt ngưỡng vào ngày 6; đến ngày 8, giá trị

OD giảm nhiều so với ngày 6 và giảm mạnh vào ngày 10. Có thể do sau khi tăng

sinh mạnh, đạt ngưỡng vào ngày 6, tế bào bước vào giai đoạn tăng sinh ổn định nên

tốc độ tăng sinh ngày càng giảm và vào pha suy tàn vào ngày 8.

46

Điều này phù hợp về thời gian tăng trưởng của tề bào tuỷ răng người thu

được từ kết quả thí nghiệm ở mục 3.3.2, tế bào tăng trưởng cao nhất ở ngày thứ 6 và

giảm mạnh đến ngày thứ 9.

So sánh kết quả đo giá trị OD giữa hai nhóm 1

- Ở ngày 4, mật độ quang nhóm 1 (nhóm đối chứng) cao hơn 1,32 lần so với

nhóm 2 (nhóm tế bào được nuôi trên giá thể ngà đã được xử lý), nhưng đến ngày 6,

nhóm 2 tăng lên 1,08 lần so với nhóm 1, điều này có thể do những ngày đầu, tuy tế

bào ở cả 2 nhóm đều phân chia kém nhưng ở nhóm 1 được nuôi trên giếng nên diện

tích tiếp xúc lớn, tế bào bám và lan rộng hơn nên đạt mật độ cao hơn.

- Từ ngày 4 đến ngày 6, tốc độ tăng sinh của nhóm 2 cách biệt khá lớn so với

nhóm 1. Sau ngày 6, giá trị OD ở nhóm 2 cao hơn nhóm 1 vào các mốc thời gian

khảo sát. Điều này chứng tỏ tế bào đã tăng sinh nhanh khi được nuôi trên giá thể

ngà được xử lý EDTA/axit citric. Đối với tế bào nhóm 1, sau ngày 6 giá trị OD

giảm mạnh là do khi mật độ tế bào tăng sẽ dẫn đến kìm hãm tiếp xúc và sự cạnh

tranh môi trường sống diễn ra làm cho các tế bào sẽ giảm ở các ngày tiếp theo.

Giá thể ngà xử lý bề mặt bằng dung dịch EDTA / Axit citric loại sạch hoàn toàn

lớp mùn ngà, để lộ ra các ống ngà và khuôn nền ngoại bào gồm các collagen dạng

sợi nên giúp tế bào tăng sinh tốt.

3.5. Khả năng bám của tế bào gốc tuỷ răng trên giá thể

Kết quả chụp SEM giá thể ngà xử lý bề mặt có chứa tế bào gốc tủy răng sau một

thời gian nuôi cấy, được trình bày ở hình 3.13 và hình 3.14.

47

Hình 3.13. Tế bào bám trên giá thể xử lý bằng EDTA / Axit citric (x600)

Hình 3.14. Tế bào bám trên giá thể xử lý bằng EDTA / Axit citric (x7.000)

Quan sát hình 3.13, hình 3.14, ta nhận thấy có sự hiện diện và bám dính của tế

bào gốc tủy răng trên giá thể xử lý bằng dung dịch EDTA / Axit citric.

48

KẾT LUẬN

- Đã thu nhận và xử lý được ngà răng người bằng phương pháp cơ học kết hợp

phương pháp hóa học sử dụng EDTA và axit citric.

- Đã thu nhận và nuôi cấy thành công tế bào từ mảnh mô tủy răng người. Quần

thể tế bào thu nhận được có khả năng bám dính trên bề mặt dụng cụ nuôi cấy, tăng

sinh mạnh và có biểu hiện với một số marker đặc trưng tế bào gốc trung mô

- Giá thể ngà đã xử lý có khả năng hỗ trợ sự bám dính tế bào gốc tủy răng

người trên bề mặt và tăng sinh mạnh, đạt ngưỡng vào ngày nuôi cấy thứ 6 trong

điều kiện nuôi cấy in vitro.

KIẾN NGHỊ

Để tiếp tục phát triển đề tài và hướng tới việc ứng dụng các kết quả nghiên cứu

đạt được, một số kiến nghị được đưa ra như sau:

- Đánh giá thành phần giá thể ngà răng đã xử lý nhằm tăng khả năng hỗ trợ

của giá thể ngà trong nuôi cấy tế bào gốc tủy răng và hình thành phức hợp ngà –

tủy.

- Nghiên cứu quy trình nuôi cấy tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào tủy răng và

giá thể ngà để đạt mật độ tế bào cao hơn trong thời gian ngắn.

- Đánh giá tính tương hợp sinh học của mảnh ghép giá thể ngà răng chứa tế

bào gốc tủy răng trên mô hình động vật và các thử nghiệm lâm sàng.

9

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tài liệu tham khảo tiếng Việt

[1] Trần Lê Bảo Hà (2004), Thiết kế và đánh giá màng Gelatin-Aginate trong điều

trị tổn thương bỏng, luận văn thạc sỹ sinh học, trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên

TPHCM.

[2] Hoàng Tử Hùng (2001), Mô phôi răng miệng, Nhà xuất bản Y học, thành phố

Hồ Chí Minh, 119-188.

[3] Hoàng Tử Hùng (2003), Giải phẫu răng, Nhà xuất bản Y học, thành phố Hồ

Chí Minh, 20-38.

[4] Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc (2006), Công nghệ Sinh học trên Người và

Động vật, Nhà xuất bản Giáo dục, thành phố Hồ Chí Minh, 101-114, 171-207,

695-753.

II. Tài liệu tham khảo tiếng Anh

[5] A. Tonomura (2010), Differential Effect of Scaffold Shape on Dentin

regeneration, Annals of Biomedical Engineering, 38, 1664 -1671.

[6] A. Khademi, M. Feizianfard (2004), The Effect of EDTA and Citric Acid on

Smear Layer Removal of Mesial Canals of First Mandibular Molars, A Scanning

Electron Microscopic Study, Journal of Research in Medical Sciences, 2, 80-88.

[7] A. Ohazama, S.A.C. Modino, I. Miletich and P. T. Sharpe (2004), Stem Cell

Based Tissue Engineering of Murine Teeth, Journal of Dental Research, 83,

518–522.

[8] Abigail S. Tucker and Paul T. Sharpe (2004), The Cutting Edge of

Mammalian Development: How the Embryo Makes Teeth, Nature Reviews

Genetics, 5, 499–508.

[9] Brendan A.C. Harley, Hyung-Do Kim, Muhammad H. Zaman, Ioannis V.

Yannas, Douglas A. Lauffenburger, and Lorna J. Gibson. (2008), Micro-

architecture of three-dimensional scaffolds influences cell migration behavior via

junction interactions, Journal of Biophysics.

10

[10] C. Mauth, A.Huwig, U. Graf-Hausner and J-F.Roulet (2007), Restorative

Applications for Dental Pulp Therapy, Topics in Tissue Engineering, 3, 1-32.

[11] C.H. Chu et al. (2011), Dentin hypersensitivity and its management, Featured

in General Dentistry, 115-122.

[12] C.S. Young et al. (2002), Tissue Engineering of Complex Tooth Structures on

Biodegradable Polymer Scaffolds, Journal of Dental Research, 81, 695.

[13] Cheryl T. Gomillion, Karen J.L. Burg (2006), Stem cells and adipose tissue

engineering, Biomaterials, 27, 6052–6063.

[14] Chun SY, Lee HJ, Choi YA, Kim KM, Baek SH, Park HS (2011), Analysis of

the soluble human tooth proteome and its ability to induce dentin/tooth

regeneration. Tissue Engineering Part A, 17, 181-91.

[15] Conan S. Young, Shinichi Terada, Joseph P. Vacanti, Masaki Honda, John D.

Bartlett and Pamela C. Yelick (2002), Tissue Engineering of Complex Tooth

Structures on Biodegradable Polymer Scaffolds, Journal of Dental Research, 81,

695–700.

[16] DA Wahl and JT Czernuszka (2006), Collagen – Hydroxyapatite composites

for hard tissue repair, European cells and materials, 11, 43-56.

[17] Duailibi MT, Duailibi SE, Young CS, Bartlett JD, Vacanti JP, Yelick PC

(2004), Bioengineered teeth from cultured rat tooth bud cells, Journal of Dental

Research, 83, 523-8.

[18] Eric L.Gotlieb et al. (2008), An Ultrastructural Investigation of Tissue –

Engineered Pulp Constructs Implanted Within Endodontically Treated Teeth, The

Journal of the American dental association, 457 – 465.

[19] G.Bluteau et al. (2008), Stem Cells For Tooth Engineering, European Cells

and Materials, 16, 1-9.

[20] George T.-J.Hang et al. (2006), In vitro characterization of human dental pulp

cells: various isolation methods ang culturing enviroment, Cell and Tissue

Research.

11

[21] Ghada A. Karien (2009), Dental Pulp Stem Cells, a New Era in Tissue

Engineering, Smile Dental Journal, 4.

[22] Gottfried Schmalz, Helmut Schweikl, Manfred Eibl (1994), Growth kinetics

of fibroblasts on bovine dentin, Journal of Endodontics, 20, 453-456.

[23] Hatefi A., Amsden B. (2002), Biodegradable injectable in situ forming drug

delivery systems, Journal of Controlled Release, 80, 9-28.

[24] Jakub Suchanek et al. (2007), Human dental pulp stem cell-isolation and long

term cultivation, Acta Medica, 50, 195-201.

[25] James C. Mc Kenzie, Robert M. Klein (2000), Basic concepts in cell biology

and histology, McGraw Hill International Edition, 325-331.

[26] Jinhua Yuet al. (2006), Differentiation of dental pulp stem cell into Regular-

Shaped Dentin-Pulp Complex Induced by Tooth Germ Cell Conditioned

Medium, Tissue Engineering, 12, 3097-3105.

[27] Junjie Wu, Fang Jin et al. (2008), Dentin non – collagenous proteins (dNCPs)

can stimulate dental follicle cells to differentiate into cementoblast lineages,

Biology of the Cell, 291 – 302.

[28] K.U.Zaman, T.Sugaya, H.Kato (1999), Effect of recombinant human platelet-

derived growth factor-BB and bone morphogenetic protein-2 application to

demineralized dentin on early periodontal ligament cell response, Journal of

Periodontal Research, 34, 244 – 250.

[29] Kuo TF, Huang AT, Chang HH, Lin FH, Chen ST, Chen RS (2008),

Regeneration of dentin-pulp complex with cementum and periodontal ligament

formation using dental bud cells in gelatin-chondroitin-hyaluronan tri-copolymer

scaffold in swine, Journal of Biomedical Materials Research Part A, 86A, 1062-

8.

[30] Lee, O.K., Kuo, T.K., Lee, S.L., Chen, T.H. (2004), Isolation of multi-potent

mesenchymal stem cells from umbilical cord blood, Blood, 103,1669-75.

[31] Liu J, Jin T, Chang S, Ritchie HH, Smith AJ, Clarkson BH (2007), Matrix

and TGF-beta-Related gene expression during human dental pulp stem cell

xii

(DPSC) mineralization, In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal, 43,

120-8.

[32] Manoel et al. (2002), Evaluation of the Effect of EDTA, EGTA and CDTA on

Dentin Adhesiveness and Microleakage with Different Root Canal Sealers,

Brazilian Dental Journal, 13(2): 123-128.

[33] Marcy Wong et al. (2004), Alginates in Tissue Engineering, Biopolymer

Methods in Tissue Engineering, 238, 77-87.

[34] Marshall Jr GW, Marshall SJ, Kinney JH, Balooch M (1997), The dentin

substrate: structure and properties related to bonding, Journal of Dentistry, 25,

441-58.

[35] Misako Nakashima and Akifumi Akamine (2005), The Application of Tissue

Engineering to Regeneration of Pulp and Dentin in Endodontics, Journal of

Endodontics, 31, 711-718.

[36] Misako Nakashima1 & A Hari Reddi (2003), The application of bone

morphogenetic proteins to dental tissue engineering, Nature biotechnology, 21.

[37] Monica T. Duailibi, Silvio E. Duailibi, Conan S. Young, John D. Bartlett,

Joseph P. Vacanti and Pamela C. Yelick (2004), Bioengineered Teeth from

Cultured Rat Tooth Bud Cells, Journal of Dental Research, 83, 523–528.

[38] Murilo Baena LOPES et al. (2009), Comparative Study of Tubular Diameter

and Quantity for Human and Bovine Dentin at Different Depths, Brazilian

Dental Journal, 20(4), 279-283.

[39] Nadir Babay et al. (2001), SEM study on the effect of two different

demineralization methods with saturated tetrecyline hydrochloride on diseased

root surfaces, The Journal of contemporary dental practice, 2.

[40] Park, Hye-Sim Cho, Tae-Geon Kwon, Sin-Nam Jang, Sang-Han Lee, Chang-

Hyeon An, Hong-In Shin, Jae-Young Kim, Je-Yoel Cho (2009), Proteomics

analysis of human dentin reveals distinct protein expression profiles, Journal of

Proteome Research, 8, 1338-46.

13

[41] Peter E. Murray et al. (2007), Regenerative Endodontics: A Review of

Current Status ang a Call for Action, Journal of Endodontics, 33, 377-390.

[42] Rania M. El-Backly et al. (2008), Regeneration of dentin/pulp-like tissue

using a dental pulp stem cell/poly(lactic-co-glycolic) acid scaffold construct in

New Zealand white rabbits, Astralian Endodontics Journal, 34, 52-67.

[43] Robert S. Langer and Joseph P. Vacanti (1999), Tissue Engineering: The

Challenges Ahead, Scientific American, 280, 86–89.

[44] Rodney F. Boyer (1993), Modern experimental Biochemistry, The

Benjamin/Cummings Publising Company, 90-95.

[45] Rui Li et al. (2011), Human treated dentin matrix as a natural scaffold for

complete human dentin tissue regeneration, Biomaterials, 1-14.

[46] S.L. Edwards, W. Mitchell, J.B. Matthews, E. Ingham, S.J. Russell (2004),

Design of nonwoven scaffold structures for tissue engineering of the anterior

cruciate ligament, Autex Research Journal.

[47] Schwartz Z, Lohmann CH et al. (2000), Osteoblast proliferation and

differentiation on dentin slices are modulated by pretreatment of the surface with

tetracycline or osteoclasts, Journal of Periodontal, 586 – 597.

[48] Shulamit Levenberg, Ngan F. Huang, Erin Lavik, Arlin B. Rogers, Joseph

Itskovitz-Eldor, and Robert Langer (2003), Differentiation of human embryonic

stem cells on three-dimensional polymer scaffolds, The National Academy of

Sciences,100 (22), 12741-12746.

[49] Shunji Kumabe et al. (2006), Human dental pulp stem cell culture and cell

Transplantation with an alginate scaffold, Okajimas Folia Anatomica Japonica,

84, 147-156.

[50] Sofia S.A. Oliveira, Megan K.Pugach et al. (2003), The influence of the

dentin smear layer on adhesion: a self – etching primer vs. a total – etch system,

Dental Materials, 758 – 767.

14

[51] Suchanek W, Yoshimura M (1998), Processing and properties of

hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants,

Journal of Materials Research, 13(1), 94-117.

[52] Thomas D.Larson et al (2005), The Clinical Significance and Management of

Microleakage, Northwest Dentistry, 84.

[53] Tina Mygind, Maik Stiehler, Anette Baatrup, Haisheng Li, Xuenong Zou,

Allan Flyvbjerg, Moustapha Kassem and Cody Bünger (February 2007),

Mesenchymal stem cell ingrowth and differentiation on coralline hydroxyapatite

scaffolds, Biomaterials, 28(6), 1036-1047.

[54] Tran Le Bao Ha et al. (2011), Study on Culture of Human Dental Pulp Stem

Cells to apply in Tissue Engineering, ournal of Biomimetics, Biomaterials &

Tissue Engineering, 11, 13-20.

[55] Weihua Guo et al. (2009), The use of dentin matrix scaffold and dental

follicle cells for dentin regeneration, Biomaterials, 30, 6708-6723.

[56] Wintermantel E, Ha SW (2002), Medizintechnik mit biokompatiblen

Werkstoffen und Verfahren, Berlin Heidelberg New York: Springer, 3, 192-232.

[57] Xuechao Yang, Nijmegen (2009), Dental Pulp Stem Cells for Tissue

Engineering; STRO-1 selection and transfection strategies.

[58] Yim, Evelyn K.F, Leong, Kam W (2005), Proliferation and differentiation of

human embryonic germ cell derivatives in bioactive polymeric fibrous scaffold,

Journal of Biomaterials Science, 16(10), 1193-1217.

[59] Zhang W, Frank Walboomers X, van Kuppevelt TH, Daamen WF, Bian Z,

Jansen JA (2006), The performance of human dental pulp stem cells on different

three-dimensional scaffold materials, Biomaterials, 27(33), 5658-5668.

BẢNG PHỤ LỤC

1. Kết quả xử lý thống kê đường cong tăng trưởng của tế bào sau 03 lần cấy

chuyền

- Mật độ tế bào xác định qua các ngày

Ngày

Số tế bào sống

Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3

1 10 13 7 8 9 12 7 11 12

2 9 13 11 10 14 11 12 10 10

3 11 12 11 16 9 12 11 13 14

4 21 20 17 18 15 16 15 19 14

5 25 27 27 28 25 26 30 29 25

6 42 35 38 39 38 42 46 39 40

7 27 26 28 27 30 23 23 26 29

8 25 27 27 23 25 26 25 29 25

9 15 12 17 18 10 12 11 19 14

10 10 16 10 8 12 13 14 19 9

11 14 15 12 9 10 12 11 13 10

- Kết quả xử lý thống kê

Summary Statistics for MAT DO TE BAO

NGAY Count Averag

e

Standard

deviation

Coeff. of

variation

Minimum Maximum Rang

e

Stnd.

skewness

1 9 9.8888

9

2.26078 22.8618% 7.0 13.0 6.0 -0.0912708

2 9 11.111

1

1.61589 14.543% 9.0 14.0 5.0 0.840872

3 9 12.111

1

2.02759 16.7415% 9.0 16.0 7.0 0.756217

4 9 17.111

1

2.52212 14.7397% 14.0 21.0 7.0 0.392903

5 9 26.888

9

1.83333 6.81818% 25.0 30.0 5.0 0.638071

6 9 39.888

9

3.14024 7.87247% 35.0 46.0 11.0 0.732948

7 9 26.555

6

2.4037 9.05159% 23.0 30.0 7.0 -0.447584

8 9 25.777

8

1.71594 6.65666% 23.0 29.0 6.0 0.537715

9 9 14.222

2

3.23179 22.7235% 10.0 19.0 9.0 0.316047

10 9 12.333

3

3.57071 28.9517% 8.0 19.0 11.0 0.893522

11 9 11.777

8

1.98606 16.8628% 9.0 15.0 6.0 0.330049

Total 99 18.878

8

9.47206 50.173% 7.0 46.0 39.0 3.79015

NGAY Stnd.

kurtosis

1 -0.993658

2 -0.214566

3 0.503515

4 -0.914457

5 -0.565079

6 0.628869

7 -0.339073

8 0.478736

9 -0.906247

10 -0.0757435

11 -0.540093

Total 0.100761

ANOVA Table for MAT DO TE BAO by NGAY

Source Sum of

Squares

Df Mean

Square

F-Ratio P-Value

Between

Groups

8254.32 10 825.432 134.96 0.0000

Within

Groups

538.222 88 6.11616

Total (Corr.) 8792.55 98

Multiple Range Tests for MAT DO TE BAO by NGAY

Method: 95.0 percent LSD

NGAY Count Mean Homogeneous Groups

1 9 9.88889 X

2 9 11.1111 XX

11 9 11.7778 XX

3 9 12.1111 XXX

10 9 12.3333 XX

9 9 14.2222 X

4 9 17.1111 X

8 9 25.7778 X

7 9 26.5556 X

5 9 26.8889 X

6 9 39.8889 X

Contrast Sig. Difference +/- Limits

1 – 2 -1.22222 2.31684

1 – 3 -2.22222 2.31684

1 – 4 * -7.22222 2.31684

1 – 5 * -17.0 2.31684

1 – 6 * -30.0 2.31684

1 – 7 * -16.6667 2.31684

1 – 8 * -15.8889 2.31684

1 – 9 * -4.33333 2.31684

1 - 10 * -2.44444 2.31684

1 - 11 -1.88889 2.31684

2 – 3 -1.0 2.31684

2 – 4 * -6.0 2.31684

2 – 5 * -15.7778 2.31684

2 – 6 * -28.7778 2.31684

2 – 7 * -15.4444 2.31684

2 – 8 * -14.6667 2.31684

2 – 9 * -3.11111 2.31684

2 - 10 -1.22222 2.31684

2 - 11 -0.666667 2.31684

3 – 4 * -5.0 2.31684

3 – 5 * -14.7778 2.31684

3 – 6 * -27.7778 2.31684

3 – 7 * -14.4444 2.31684

3 – 8 * -13.6667 2.31684

3 – 9 -2.11111 2.31684

3 - 10 -0.222222 2.31684

3 - 11 0.333333 2.31684

4 – 5 * -9.77778 2.31684

4 – 6 * -22.7778 2.31684

4 – 7 * -9.44444 2.31684

4 – 8 * -8.66667 2.31684

4 – 9 * 2.88889 2.31684

4 - 10 * 4.77778 2.31684

4 - 11 * 5.33333 2.31684

5 – 6 * -13.0 2.31684

5 – 7 0.333333 2.31684

5 – 8 1.11111 2.31684

5 – 9 * 12.6667 2.31684

5 - 10 * 14.5556 2.31684

5 - 11 * 15.1111 2.31684

6 – 7 * 13.3333 2.31684

6 – 8 * 14.1111 2.31684

6 – 9 * 25.6667 2.31684

6 - 10 * 27.5556 2.31684

6 - 11 * 28.1111 2.31684

7 – 8 0.777778 2.31684

7 – 9 * 12.3333 2.31684

7 - 10 * 14.2222 2.31684

7 - 11 * 14.7778 2.31684

8 – 9 * 11.5556 2.31684

8 - 10 * 13.4444 2.31684

8 - 11 * 14.0 2.31684

9 - 10 1.88889 2.31684

9 - 11 * 2.44444 2.31684

10 - 11 0.555556 2.31684

* Biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.

2. Kết quả khảo sát MTT của tế bào tủy răng trên bề mặt giá thể

- Giá trị OD của dịch nuôi cấy tế bào thu nhận theo phương pháp MTT

Ngày

Mật độ quang OD

LầnNhóm 1 Nhóm 2

Đối chứng Giá thể ngà

Ngày 2

1 0.048 0.095

2 0.022 0.031

3 0.081 0.023

Ngày 4

1 0.127 0.197

2 0.123 0.185

3 0.125 0.199

Ngày 6

1 0.272 0.287

2 0.239 0.283

3 0.279 0.28

Ngày 8

1 0.176 0.236

2 0.172 0.209

3 0.153 0.257

Ngày 10

1 0.014 0.075

2 0.017 0.031

3 0.016 0.047

- Kết quả xử lý thống kê

Nhóm 1

Kết quả tóm tắt nhóm 1 ngày 2

Mean 0.0515

Standard Error 0.0295

Median 0.0515

Standard Deviation 0.0417193

Sample Variance 0.0017405

Range 0.059

Minimum 0.022

Maximum 0.081

Count 2

Confidence level 0.068027

Coefficient of variation 81.00834969


Mean 0.125


Median 0.125


Sample Variance 3.2E-05

Range 0.008

Minimum 0.121

Maximum 0.129

Count 2




Mean 0.259

Standard Error 0.02

Median 0.259



Range 0.04

Minimum 0.239

Maximum 0.279

Count 2




Mean 0.1625


Median 0.1625



Range 0.019

Minimum 0.153

Maximum 0.172

Count 2




Mean 0.0165


Median 0.0165


Sample Variance 5E-07

Range 0.001

Minimum 0.016

Maximum 0.017

Count 2



F-Test Two-Sample for Variances

Ngày 2 Ngày 4

Mean 0.0515 0.2385

Variance 0.001741 0.000113

Observations 2 2

df 1 1

F 15.47111

P(F<=f) one-tail 0.158495

F Critical one-tail 161.4476

F Critical two-tail 647.789

Vì F = 15.47 thuộc [1; 647] nên ta thống kê sai số chuẩn bằng phương pháp t–test

thống kê 2 mẫu đồng phương sai ở ngà 2 và ngày 4.


Ngày 4 Ngày 6

Mean 0.111333 0.263333

Variance 0.000576 0.000456

Observations 3 3

df 2 2

F 1.262966


F Critical one-tail 19


Vì F = 1.26 thuộc [1; 647] nên ta thống kê sai số chuẩn bằng phương pháp t–test 2

mẫu đồng phương sai ở ngày 4 và ngày 6.


Ngày 6 Ngày 8

Mean 0.259 0.1625

Variance 0.0008 0.000181

Observations 2 2

df 1 1

F 4.432133




Vì F = 4.43 thuộc [1; 647] nên ta thống kê sai số chuẩn bằng phương pháp t–test 2



Ngày 8 Ngày 10

Mean 0.1625 0.0165

Variance 0.000181 5E-07

Observations 2 2

df 1 1

F 361




Vì F = 361 thuộc [1; 647] nên ta thống kê sai số chuẩn bằng phương pháp t–test

thống kê 2 mẫu đồng phương sai ở ngày 8 và ngày 10.

t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances

Ngày 2 Ngày 4

Mean 0.0515 0.2385

Variance 0.001741 0.000113

Observations 2 2

Pooled Variance 0.000926

Hypothesized Mean Difference 0

df 2

t Stat -6.14354

P(T<=t) one-tail 0.012743

t Critical one-tail 2.919986

P(T<=t) two-tail 0.025486

t Critical two-tail 4.302653

Vì t = - 6.14 không thuộc [-4.3; 4.3] ở sai số 5% ta thấy tế bào nuôi cấy ở hai ngày

có sự khác biệt nhau.


Ngày 4 Ngày 6

Mean 0.125 0.259

Variance 3.2E-05 0.0008

Observations 2 2


Hypothesized Mean

Difference 0

df 2

t Stat -6.56989





Vì t = - 6.57 không thuộc [-4.3; 4.3] ở sai số 5% ta thấy tế bào nuôi cấy ở hai ngày



Ngày 6 Ngày 8

Mean 0.259 0.1625

Variance 0.0008 0.000181

Observations 2 2



df 2

t Stat 4.358314





Vì t = 4.35 không thuộc [-4.3; 4.3] ở sai số 5% ta thấy tế bào nuôi cấy ở hai ngày



Ngày 8 Ngày 10

Mean 0.1625 0.0165

Variance 0.000181 5E-07

Observations 2 2

Pooled Variance 9.05E-05


df 2

t Stat 15.34718







Nhóm 2


Mean 0.027


Median 0.027



Range 0.008

Minimum 0.023

Maximum 0.031

Count 2




Mean 0.192


Median 0.192



Range 0.014

Minimum 0.185

Maximum 0.199

Count 2




Mean 0.2815


Median 0.2815



Range 0.003

Minimum 0.28

Maximum 0.283

Count 2




Mean 0.233


Median 0.233



Range 0.048

Minimum 0.209

Maximum 0.257

Count 2




Mean 0.039


Median 0.039



Range 0.016

Minimum 0.031

Maximum 0.047

Count 2




Ngày 2 Ngày 4

Mean 0.027 0.192

Variance 3.2E-05 9.8E-05

Observations 2 2

df 1 1

F 0.326531




Vì F = 0.326 không thuộc [1; 647] nên ta thống kê sai số chuẩn bằng phương pháp

t–test 2 mẫu dị phương sai ở ngày 2 và ngày 4.


Ngày 4 Ngày 6

Mean 0.192 0.2815


Observations 2 2

df 1 1

F 21.77778




Vì F = 21.77 thuộc [1; 647] nên ta thống kê sai số chuẩn bằng phương pháp t–test

2 mẫu đồng phương sai ở ngày 4 và ngày 6.


Ngày 6 Ngày 8

Mean 0.2815 0.233

Variance 4.5E-06 0.001152

Observations 2 2

df 1 1

F 0.003906




Vì F = 0.0039 không thuộc [1; 647] nên ta thống kê sai số chuẩn bằng phương pháp

t–test 2 mẫu dị phương sai ở ngày 6 và ngày 8.


Ngày 8 Ngày 10

Mean 0.233 0.039

Variance 0.001152 0.000128

Observations 2 2

df 1 1

F 9




Vì F = 9 thuộc [1; 647] nên ta thống kê sai số chuẩn bằng phương pháp t–test 2


t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances

Ngày 2 Ngày 4

Mean 0.049667 0.193667

Variance 0.001557 5.73E-05

Observations 3 3


df 2

t Stat -6.207





Vì t = -6.2 không thuộc [-4.3; 4.3] ở sai số 5% ta thấy tế bào nuôi cấy ở hai ngày có

sự khác biệt nhau.


Ngày 4 Ngày 6

Mean 0.192 0.2815


Observations 2 2

Pooled Variance 5.13E-05


df 2

t Stat -12.5019





Vì t = -12.5 không thuộc [-4.3; 4.3] ở sai số 5% ta thấy tế bào nuôi cấy ở hai ngày


t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances

Ngày 6 Ngày 8

Mean 0.283333 0.234

Variance 1.23E-05 0.000579

Observations 3 3


df 2

t Stat 3.513864





Vì t = 3.5 thuộc [-4.3; 4.3] ở sai số 5% ta thấy tế bào nuôi cấy ở hai ngày không có

sự khác biệt nhau.


Ngày 8 Ngày 10

Mean 0.233 0.039

Variance 0.001152 0.000128

Observations 2 2


Hypothesized Mean

Difference 0

df 2

t Stat 7.668523







bogiaoduc.edu.vn---thu nhận và xử lý ngà răng người làm giá t

Documents