biyoteknoloji ve genetik kopyalama

7/12/2019 Biyoteknoloji ve Genetik Kopyalama

http://slidepdf.com/reader/full/biyoteknoloji-ve-genetik-kopyalama 1/76

1

İçindekiler BĠYOTEKNOLOJĠ ................................................................................................................................................... 3

BĠTKĠ BĠYOTEKNOLOJĠSĠ .................................................................................................................................... 3KLONLAMA ............................................................................................................................................................ 5

KLONLAMANIN TARĠHÇESĠ ............................................................................................................................... 6

KLONLAMA TEKNOLOJĠSĠNĠN GELĠġĠMĠ ........................................................................................................ 7

REKOMBĠNANT DNA TEKNOLOJĠSĠ ............................................................................................................... 9

VEKTÖRLER KLONLANACAK DNA PARÇALARI ........................................................................................ 13

PROKARYOTĠK VEKTÖRLER ............................................................................................................................ 13

RESTRĠKSĠYON ENZĠMLERĠ ĠLE KLONLAMA............................................................................................... 16

HĠBRĠT VEKTÖRLERĠ ĠÇĠN SEÇĠM ................................................................................................................... 18

KÖR UÇLU EKLENME......................................................................................................................................... 19

BELĠRLĠ BĠR GENĠN KLONLANMASI .............................................................................................................. 21

GENOM KÜTÜPHANESĠ OLUġTURMA............................................................................................................ 24

KLONLANMIġ GEN ĠÇĠN SONDA ..................................................................................................................... 28

WESTERN BLOTTING ......................................................................................................................................... 29

KROMOZOM YÜRÜYÜġÜ, KOMUġU GENLERĠN TANIMLANMASI .......................................................... 31

HETERODUPLEX ANALĠZ.................................................................................................................................. 32EUKARYOTĠK VEKTÖRLER .............................................................................................................................. 34

MAYA VEKTÖRÜ ................................................................................................................................................. 34

HAYVAN VEKTÖRLERĠ...................................................................................................................................... 35

BĠTKĠ VEKTÖRLERĠ ............................................................................................................................................ 37

YABANCI DNA‟NIN EUKARYOTĠK HÜCREDE FAALĠYETĠNĠN SAĞLANMASI...................................... 38

NAKAUT (KNOCKOUT) FARE ........................................................................................................................... 39

BĠLDĠRĠCĠ SĠSTEMLER........................................................................................................................................ 40

RESTRĠKSĠYON HARĠTALAMA ........................................................................................................................ 41

RESTRĠKSĠYON HARĠTALARININ YAPIMI .................................................................................................... 43

ÇĠFT KESĠNTĠ........................................................................................................................................................ 47

RESTRĠKSĠYON PARÇACIK UZUNLUĞU POLĠMORFĠZMĠ.......................................................................... 47

POLĠMERAZ ZĠNCĠR REAKSĠYONU ................................................................................................................. 49

DNA DĠZĠLĠġ SIRASI BELĠRLENMESĠ.............................................................................................................. 52

DĠ DEOKSĠ METODU ĠLE DĠZĠLĠġ SIRASI BELĠRLEME................................................................................ 52

DĠZĠLĠġ SIRASI ANALĠZĠNDE GEREKLĠ OLAN PRĠMER (BASLAMA YERĠ)............................................. 58

KONFIGURASYONU OLUġUMUNUN MEYDANA GETĠRĠLMESĠ ............................................................... 58

GEN KLONLAMANIN PRATĠK SONUÇLARI................................................................................................... 60



2

2- ÜREME AMAÇLI KLONLAMA ...................................................................................................................... 62

3- ĠYĠLEġTĠRME AMAÇLI KLONLAMA ........................................................................................................... 63

KLONLAMANIN SÜPER STARI DOLLY‟NĠN KOPYALANMA AġAMALARI VE SONRASI .................... 64

KLON CANLILARIN SAĞLIĞI ........................................................................................................................... 68

BEDEN HÜCRELERĠNĠNKROMOZOMLARI NASIL OLUYOR DA AKTARILDIĞI YUMURTA

HÜCRESĠNĠN KROMOZOMLARI GĠBĠ DAVRANMAYA BAġLIYOR?......................................................... 69KLONLANMIġ CANLILAR VERĠCĠ HÜCRENĠN ALDIĞI CANLININ TAM BĠR KOPYASI MI? ............... 69

ĠNSAN KLONLAMA ............................................................................................................................................. 70

KENDĠ ORGANINI KENDĠN YAP ...................................................................................................................... 72

ĠNSAN KLONLANMASINDA BĠR ADIM DAHA .............................................................................................. 73

KLONLAMANIN TEHLĠKELERĠ ........................................................................................................................ 73

KLONLAMA ĠLE ĠLGĠLĠ YAPILMIġ ÖNEMLĠ ÇALIġMALAR ....................................................................... 74

DONMUġ FAREDEN KOPYA ............................................................................................................................. 74

KLONLANMIġ 3 BEBEK YAġIYOR ................................................................................................................... 75

KAYNAKLAR: ...................................................................................................................................................... 76



3

BĠYOTEKNOLOJĠ

Biyoteknoloji; Hücre, doku ve organ kültürü, moleküler biyoloji, fizyoloji, biyokimya,mikrobiyoloji, moleküler genetik gibi doğa bilimleri ile temel mühendislik ve bilgisayar bilimlerinden yararlanarak, genetik ve moleküler DNA teknikleriyle bitki, canlıların genetik haritalarını çıkartmak, çoğaltmak, ıslah etmek, değiĢtirmek, geliĢtirmek, yeni ve az bulunan ürünleriyine canlılara (organizma, hücre ve dokulara) ürettirmek veya bunların daha fazla elde etmek içinkullanılan teknolojilerin tümüdür. Doku kültürü ve Genetik mühendisliği olmak üzere 2 ana kolaayrılır.

Biyoteknoloji ve genetik mühendisliği, biyoteknoloji ve moleküler biyoloji, biyoteknoloji vedoku kültürü gibi ifadeler bu nedenle doğru ifadeler olmayıp biyoteknoloji hem doku kültürü hem de

genetik mühendisliğini kapsamaktadır. Üniversitelerde çeĢitli lisans programları veya derslerin benzer isimlerde olması da yanlıĢtır.

Biyoteknoloji geleneksel ve modern olmak üzere grupta değerlendirilir. Mikroorganizmalarcasütün yoğurt ve peynir,e dönüĢtürülmesi, sirke yapımı geleneksel gıda biyoteknolojisi konusu, yinegenetik mühendisliği iĢlemeleriyle özellikleri geliĢtirilmiĢ mikroorganizmalarca daha nitelikli (örnek:Enzimler, proteinler vb.) ile çeĢitli etken maddeler (ilaç hammaddesi, aĢılar vb.) veya ürünler (biyoetanol vb.) geliĢtirmek modern gıda, tıbbi veya mikrobiyal biyoteknoloji konularıdır. Bu nedenle

biyoteknolojinin bitki, hayvan, gıda, tıbbi, mikrobiyal, endüstriyel (beyaz biyoteknoloji) ve çevrebiyoteknolojileri olarak uygulama dalları geliĢmiĢtir. Bu sitede ağırlıklı olarak Bitki Biyoteknolojisiüzerinde durulmaktadır. Aslında sistem tüm dallarda benzer çalıĢmaktadır. Doku kültürüne hücre doku

ve organlar, genetik mühendisliğinde ise DNA temel hedeftir. Tüm canlıların DNA'nın iĢleyiĢi vetemel mekanizmaları bakımından birbirine hemen hemen benzer olduğu düĢünülürse temel genetik mühendisliği tekniklerini iyi bilmek her türlü biyolojik materyal ile çalıĢabilmeye imkan verirkendoku kültürü uzmanlığı daha geniĢ bir alan istemektedir. Çünkü insan, hayvan, bitki vemikroorganizmalarda hücre, doku ve organ iĢleyiĢi ve mekanizmaları bakımından derin farklar olabilmektedir. Oysaki bu canlıların herhangi birisinin DNA'sı bir diğerine uyum gösterebilmektedir.Dolayısıyla, canlılar hatta bir türün bireyleri arasında bile doku, hücre, organ vb. uyumazlıklar görüldüğü halde canlılar arasında DNA bakımından uyuĢmazlık görülmemektedir. Bu da DNA'nıntemel molekül olduğunu göstermektedir.

BĠTKĠ BĠYOTEKNOLOJĠSĠ

Biyoteknolojik tekniklerin bitkilere uygulanmasına bitki biyoteknolojisi denir. Bitkilerin vehücrelerin çoğaltımı doku kültürüyle, bunların genetik özelliklerinin araĢtırılması genetik mühendisliği, özelliklerin değiĢtirilmesi veya geliĢtirilmesi de her iki tekniğin birlikte uygulanmasıve/veya bitki ıslahı teknikleriyle yapılmaktadır.

Klonlama (kopyalama) terimi insan ve hayvanlar (Dolly) için daha 10 yıl önce kullanılmaya baĢlanmasına karĢın bitkiler (Örnek: Havuç, tütün) 1950'li yıllardan itibaren klonal olarak çoğaltılmaya yani kopyalanmaya baĢlanmıĢtır. Buna rejenerasyon (organogenesis, somatik



4

embriyogenesis, meristemlerden sürgün) veya klonal çoğaltım denilmektedir. Bir çok bitki türü hiç bir eĢeysel üreme hücresi içermeyen vücut (somatik) hücrelerinden (örnek: yaprak, sap vb. doku veorganlar) çok rahatlıkla çoğaltılabilmektedir. Rejenerasyon bir hücreden baĢlayabileceği gibi (somatik embriyogenesis, protoplast-callus- bitki), birden fazla hücrenin birlikte oluĢturduğu bir faaliyet sonucu(organogenesis) veya bir çok hücrenin organize olarak bir doku ve organları ve sonuçta bitkiyioluĢturmasıyla da ortaya çıkabilmektedir. Bitkilerin bir çoğunda uygun doku kültürü Ģartlarında

(besin, büyüme düzenleyicileri, sıcaklık, ıĢık vb.) rejenerasyon ortaya çıkabilmektedir. Tek bir vücuthücrenin kendisinin alındığı ana bitkiye benzer bitkiler üretebilme yeteneğine totipotensidenilmektedir.

Genetik mühendisliği teknikleriyle bir çok bitki türünün genom haritası çıkarılmıĢ ve genleritespit edilmeye baĢlanmıĢtır. Arabidopsis adlı ilkel bir ot olan bitkinin hemen hemen tüm genetik özellikleri halen ortaya konulmuĢtur. Bir çok önemli bitki türünün genom haritası çıkarılmak üzeredir.

Genetiği/Genetik olarak DeğiĢtirilmiĢ Organizmalar (GDO veya GMO) (bitki, hayvan, insanveya mikroorganizmalar) çeĢitli biyoteknolojik metotlarla genetik yapıları bir veya daha fazla özellik (gen) bakımından değiĢtirilmiĢ organizmalar, bunlardan elde edilen ürünlere ise Genetiği DeğiĢtirilmiĢ(GD) ürünler veya gıdalar, içerisinde belirli sınırın üzerinde GD içeren ürünlere ise GD‟li ürünler adıverilmektedir. Genetiği değiĢtirilmiĢ bir canlıya „gen transferi yapılmıĢ‟ anlamında 'transgenik' dedenilir. Biyoteknoloji sadece GD veya GM demek değildir. GDO, GD‟li ürünler çeĢitli soru iĢaretleriolmasına karĢın Türkiye‟de çeĢitli kampanyalar nedeniyle çok tehlikeli ürünler gibi anlaĢılmaktadır.Benzer bir tartıĢma hormonlar konusunda da mevcuttur. Bu konuda detaylı tartıĢma ve bilgilere siteninGDO-GMO tartıĢması kısmından ulaĢılabilir. Sunularda biyoteknoloji ve GDO'lar bakımındanTürkiye ve Ġç Anadolu Bölgesi için öneriler ve değerlendirmeler de bulunmaktadır.

Ġnsanlarda etik konular nedeniyle büyük tartıĢmaların yaĢandığı genetik mühendisliği

alanında bitkilerde oldukça baĢarılı sonuçlar üretilmiĢtir. Doku kültürü ve genetik mühendisliğiteknikleri tek baĢına veya birlikte uygulanabilmektedir. Tüm dünya ülkelerinde biyoteknolojik çalıĢmalar öncelikli desteklenmektedir. ABD bu alanda dünyada öncü konumdadır.

AĢağıda bitki biyoteknolojisinin faydaları ve bazı uygulamaları verilmiĢtir.

Biyoteknolojinin faydaları ve uygulama alanları

Biyoteknoloji ile yüksek besin içeriği, hasat sonrası dayanıklılık, hastalık, zararlı, kuraklık ve otilacına genetik dayanıklılığın artırılması, yenilebilir aĢılar (elma, muz), bitkilerce biyolojik olarakayrıĢabilir plastik üretimi vb. gibi transgenik (GDO) üretimi yanında; Hücre, doku ve organ kültürü iletohum (sentetik), fide, fidan, yumru, miniyumru, soğan üretimi (klonal çoğaltım veya mikroçoğaltım)

* Sentetik tohum üretimi

* Somaklonal varyasyonların oluĢturulması

* In vitro tozlanma

* Protoplast izolasyonu ve somatik melezlemeler

* Hücre seleksiyonu



5

* Apomiktik bitkilerin oluĢturulması

* Haploit bitkilerin oluĢturulması ve embriyo kültürü ve kurtarması

* Biyoteknolojik germplazm muhafazası (özelikle Türkiye endemik bitki türlerinin korunmasıamacıyla çok gereklidir)

* Tıbbi amaçlı protein ve sekonder metabolit üretimi * Moleküler markörlerin geliĢtirilmesi yoluyla seleksiyon ve ıslahta klasik ıslaha destek

sağlanması

* Yabani ve kültür bitkilerinde genom sekanslaması ve genetik -moleküler özelliklerinin ortayakonulması

* Sinyal iletim mekanizmalarının belirlenmesi

* Endüstriyel ürünlerin (proteinler, yağ, vitaminler, enzimler vb.) üretilmesi

* Biyoyakıtların üretilmesi

* Moleküler test, tanı ve tedavilerin yapılması gibi bir çok iĢlem yapılabilmektedir.

KLONLAMA

Bir memeli hayvan yumurtasından, vücut hücresinin çekirdeğinin yeniden programlanabileceği ve onu bütün bir birey oluĢturabilme potansiyeline sahip kılabileceği gerçeğine dayanan bir süreç olduğu belirtilmektedir. Yani Klonlama (kopyalama), tek bir hücre çekirdeğindeki genetik malzemeden, birbirinin özdeĢi çok hücreli canlıların üretilmesidir.

Klonlama terimi, biyolojide birçok farklı anlamda kullanılabiliyor. Bedenimizdeki her hücre, tek bir hücrenin, baĢlangıçtaki döllenmiĢ bir yumurta hücresinin klonudur. Bazı bitkiler ve az sayıda hayvantürü, partenogenez yoluyla kendilerini klonlayarak üreyebilirler. Moleküler klonlamaysa, bir DNA

parçasından daha fazla genetik malzeme elde etmek üzere kullanılan laboratuar yöntemlerine verilenad; DNA‟nın protein kodlayan bölümlerinin yalıtılarak çoğaltılmasıdır. Tek yumurta ikizleri de

birbirlerinin, tek bir embriyonun ikiye bölünmesiyle oluĢmuĢ klonlarıdır. Bir yetiĢkin hücresinden

yeni bir canlı oluĢturmak için kullanılan yöntemse, “bedensel hücre çekirdeği aktarımı” dır.



6

KLONLAMANIN TARİHÇESİ

Ġlk defa, Leipzig Üniversitesinden Hans Adolph Eduard Dreisch deniz kirpikleriyle yaptığıdeneylerde erken dönemdeki bir deniz kirpisi embriyosunun blastomerlerini bir birinden ayırarak “Blastomere Separation” yöntemini buldu.

Blastomere Seperation yönteminde döllenmiĢ yumurtanın besi ortamında 4-8 hücreli blastomer aĢamasına kadar bölünmesine izin verilmektedir. Daha sonraları, blastomer aĢamasınagelen bu 8 hücreli yapıdaki her bir hücre alınarak bir blastosit oluĢturulmakta ve sanki yeni döllenmiĢ zigot gibi taĢıyıcı anneye aktarılarak genetik olarak birbirinin aynısı klonlar meydana getirilmektedir.

*1902 de Hans Speamann aynı yöntemi kullanarak semender blastomerlerini ayırdı ve her blastomerden yeni bir semender oluĢtu. Bu yöntemin keĢfiyle klonlamanın temeli atılmıĢ oldu.

*1938- Hans Speamann, fantastik bir deney olarak tanımladığı halbuki klonlama diyebileceğimiz bir deneyde geç evredeki bir embriyonun çekirdeği çıkarılarak çekirdeği olmayan bir yumurtaya

aktarıyordu. Speamann 1938 yılında yayınladığı “Embrionic Development and Induction” adlıkitabında bu deneyi fantastik olarak nitelendiriyordu. Halbuki bu deney 1952 yılındagerçekleĢtirilmiĢtir.

*1952- Robert Briggs ve T. J. King ilk klonlama deneyini gerçekleĢtirdiler. Ġleri aĢamadaki bir kurbağa yumurtasının çekirdeği çıkarıldı ve baĢka bir kurbağa yumurtası içine aktarıldı. Ancak deneysonunda yumurta geliĢmedi. Briggs ve King bu yönteme “Nüklear Transfer” ismini verdiler.

*1970- Aynı deney yine kurbağalar üzerinde John Gordon tarafından denendi. Daha iyi bir sonuçalındı. Kurbağa yumurtaları, iribaĢ olana kadar geliĢti ama daha sonra öldüler.

*1984- Steen Willadsen, Nüklear Transfer yöntemini kullanarak olgunlaĢmamıĢ koyun embriyohücrelerinden yaĢayan bir kuzu klonladığını açıkladı. Daha sonra Willadsen, inek, domuz, keçi, tavĢanve rhesus maymunu da klonladı. Bu deneylerde çok hücreli koyun embriyosundan çekirdek alınıpyumurta hücresine aktarılıyordu. Daha sonra hücre bölünmesi baĢlıyor, fetus oluĢuyor ve geliĢmedevam ediyordu.

*1994- Daha geliĢkin embriyo hücrelerinin ilk klonlamasını Neal First gerçekleĢtirdi. En az 120hücrelik buzağı embriyosu klonlandı. Bu çok hücreli inek embriyosunun çekirdeği çıkarıldı veçekirdek yumurta hücresine aktarıldı.

*1996- Ian Wilmut, Neal First"in deneyini koyunlar üzerinde yaptı. Ancak embriyo hücrelerinin

çekirdeğini almak için hücrelerin duraklama dönemine gelmesini bekledi. Sonra çekirdekleri çıkarıpyumurta hücresine aktardı.

*1997- Dr. Wilmut, 6 yaĢındaki bir koyunun meme hücresinden klon üretti. Bu defa çekirdek eriĢkin bir hücreden yani meme hücresinden alınıp yumurta hücresine aktarılmıĢtı. Bu olaya “Somatik Nüklear Transfer” adı verilmiĢtir. Dolly 277 yumurta içinde tek hayatta kalan kuzuydu. Dolly"ninoluĢtuğu hücre Ocak 1996"da birleĢtirilmiĢti.

*1998- Tıp doktoru G. Richard Seed, o günlerde anne rahminden aldığı insan embriyosunu baĢka bir annenin rahmine aktarıyordu. Ġnsan klonlamaya karĢı duyduğu ilgiyi ilan etti. Bu konudaki hassasdenge, ahlakî tartıĢmalara yol açtı. TartıĢmalar sonucu Amerika BirleĢik Devletlerinde insan

klonlamaya karĢı yasalar konuldu.



7

*1999- 19 Avrupa ülkesi insanın genetik olarak kopyalanmasını yasaklayan sözleĢmeyi Paris"teimzaladı.

KLONLAMA TEKNOLOJĠSĠNĠN GELĠġĠMĠ

Bu teknolojinin geliĢim aĢamalarını Ģöyle özetleyebiliriz;

1. Transgenik Teknolojisi

Gen veya gen parçalarının bir fertten alınıp bir baĢka ferdin DNA‟sına transferi Ģeklinde düĢünülebilir.Bu teknolojide gen veya genler döllenmiĢ yumurtaya aktarılır. Mesela kanser oluĢturan insan genlerifare embriyolarına aktarılarak ilaç sanayinde tedavilerin testinde kullanılabilmektedir. Bu teknoloji ileinsandan koyuna, domuza, sığıra ve keçiye gen aktarımı yapılmakta, sütlerinde insan proteiniüretilmesi yanı sıra organ, doku ve kan üretme imkânı da bulunmaktadır. Bu protein ile emphysema vecystic fibrosis gibi hastalıklar tedavi edilebilmektedir.

2. Çekirdek Transfer Teknolojisi

Bu teknoloji bir hücredeki bütün genomu yani somatik kromozomların bir hücreden diğerine nakliniifade eder. Çekirdek, döllenmiĢ yumurta hücresinden alınmakta ve çekirdeği alınmıĢ fakatdöllenmemiĢ yumurta hücresine yerleĢtirilmektedir. Bu sistemle uygulanan böyle bir teknik klonlamaolarak değerlendirilmemektedir. Zira bir duplikasyon iĢlemi bulunmamaktadır. Ancak buradasitoplâzmada bulunan mitokondri DNA‟ları farklıdır.

Çekirdek Teknolojisini Kullanarak Yapılan Klonlama

Ġki Ģekilde yapılmaktadır;

a) Embriyo Klonlama: Alınan örnek, döllenmiĢ bir embriyodan alınıp yine aynı anneninyumurtasında çekirdek transferi yapılırsa bu durumda mitokondri DNA‟ları aynı olacaktır. Buteknoloji benzer ikizlerin oluĢturulmasında kullanılmakta ve embriyo klonlama olarak bilinmektedir.Sığır, kurbağa ve farede de baĢarılı Ģekilde denenmiĢtir. Ġnsanlarda da bu tip klonlama yapılmıĢ ancak

bu ikizler yaĢatılamamıĢtır. Bununla beraber basında klonlama olarak isimlendirilmesine rağmen buuygulamada farklı çekirdekler kullanıldığı için bunlar gerçek klonlar değillerdir.



8

b) Normal Canlı Klonlama (Somatik Nükleer Transfer): Dolly doğuncaya kadar, normal bir canlıyı klonlamak mümkün değildi. Organizma döllenmiĢ bir yumurtadan meydana gelmekte ve her bir hücre döllenme sonucunda oluĢan tüm bir genomu içermektedir. Her bir hücre birbirinin tamamenaynısıdır. Ancak, büyüme ve geliĢme olayları hücrelerde farklılaĢma meydana getirmekte ve beyindokusu, kalp dokusu, deri, kemik vs oluĢmaktadır. Bazı genler somatik hücrelerde bu Ģekilde özelgörevlere ayrıldığı zaman çalıĢmasını durdurmakta ve sadece ilgili deri, kemik gibi genleri

çalıĢmaktadır. Embriyonik klonlamada farklılaĢmaya baĢlamamıĢ döllenmiĢ yumurta hücresininçekirdeği (genom) kullanılmaktadır. Dolly‟nin oluĢumunda ise somatik bir dokudan alınan hücreyle bu iĢlem baĢarılmıĢtır. Bu transfer sonunda, somatik dokudaki çalıĢmayan genler tekrar çalıĢmaya baĢlamıĢ ve genlerin çalıĢması organların oluĢmasıyla durmuĢtur. Genlerin gerektiği zamandaçalıĢması veya çalıĢmasını durdurması klonlamanın esasını oluĢturmaktadır. Bu uygulamadadöllenmemiĢ yumurtanın çekirdeği çıkarılarak, somatik hücre çekirdeği bu yumurtanın içineyerleĢtirilmiĢtir. OluĢan zigot, herhangi bir koyuna nakledilerek geliĢmeye bırakılmıĢtır. Bu uygulamanın embriyonik klonlamadan farkı, mitokondriyal DNA‟nın farklı olmasındankaynaklanmaktadır. Burada ilginç olan diğer nokta, Dolly bir babaya sahip değildir, fakat 3 anneyesahip olabilir. Mesela, annesi;

- Genomu kullanılan bir diĢi olabilir

- Yumurta hücresini veren diĢi olabilir

- Gameti taĢıyan bir diĢi olabilir

Genetik İkizlik

Ġkizlik kavramı iki veya daha fazla benzer kardeĢlerin oluĢması anlamındadır. Ġkizlik, seksüel bir üretim sonucudur. Hücredeki bütün DNA iki farklı ferdin DNA‟larının yarısını taĢımaktadır.DöllenmiĢ yumurta iki ya da daha fazla parçaya tekrar bölünecek ve aynı cinsiyette fertler meydanagetirecektir. Bu olayın çekirdek transferi ile ilgisi yoktur. Klonlama ise aseksüel bir üretimle ilgilidir.Klonlamada mitokondri DNA‟ları farlı olabilir ancak ikizlikte hepsi aynı olmak zorundadır.

Klonlamayla IVF (In Vitro Fertilizasyon) Arasındaki Farkı

IVF, yumurta hücresinin (Ģansı artırmak için birkaç tanesi) sperm tarafından tüpte döllendirilmesi vedaha sonra rahime implante edilmesi olayıdır. Klonlamada ise yumurta hücresinin çekirdeği tüpteçıkarılıyor ve klonlanacak canlının çekirdeği bu hücreye veriliyor. Dolayısıyla, yumurta hücresi artık

büyüyeceğini sağlayan çekirdeğe sahip oluyor. Bundan sonra bu yeni hücre rahime implante ediliyorve normal embriyolar gibi büyümeye devam ediyor. Klon embriyolar, normal ve IVF (in vitrofertilizasyon) embriyoları birbirlerine çok fazla benzemezler. Roslin Enstitüsündeki araĢtırmacılar,

klon embriyolarının normal embriyolardan daha büyük olduğunu ve hamileliklerin baĢarısızlığının vefetüs ölümüyle sonuçlanmasının daha çok rastlandığını veya sezeryan ameliyatlara ihtiyaçduyulduğunu saptamıĢlar.



9

1970 ortalarında moleküler genetik alanı sadece genetikçiler için değil tıpçılar bitkisel üretimciler; hayvansal üretimciler yatırımcılar genel olarak kamu için oldukça önemli geliĢmelere maruz kalmıĢtır.

Tıpçılar bakımından yeni hastalık tedavi stratejıleri hizmete sunulmuĢtur. Bitkisel üretimciler için verimi arttırılmıĢ bitkiler üretilmiĢtir.

Hayvansal üretimciler için evcil hayvanlarda verim arttırılması söz konusu olmuĢtur. Genetikçiler ve Moleküler biyologlar gen faaliyetleri ve kontrolü için yeni görüĢler oluĢturmuĢlardır.

DNA ile ilgili iĢlemler onun izolasyonu, çoğaltılması diziliĢ sırasının analizi belli yabancı DNA nın plazmid ya da faj gibi taĢıyıcı (=vektör) aracılığı ile prokoryot ya da eukoryot konukçu hücreye sokulması ve faaliyetinin temini (yani transkripsiyon vetranslasyon sürecinden sonra proteine dönüĢme Ģeklinde gruplanabilir.

Yaygın kullanılan konukçu hücre E.coli‟dir Yabancı DNA çoğaltılıp saflaĢtırılır ve DNA diziliĢ sırası belirlenir. Yabancı DNA‟nın gen ürünü büyük ölçülerde protein olarak üretilmek suretiyle sağladığında iĢlem tamamlanmıĢ olur.

Bu yeni teknoloji Gen klonlama, Rekombinant DNA teknolojisi, Genetik

Mühendisliği gibi çeĢitli adlarda ifade edilir.

Bu bakımdan rekombınant DNA teknolojısı dogal olarak bır arada bulunması mumkun olmayan DNA molekullerının yapay yolla bır araya getırılmesı(kombıne edılmesıdir).bu teknolojı 7 temel safayı içerir

1. Doku yada hucrelerden DNA ızole edılmesı 2. Bu DNA molekullerının RE (Restriksyon Endonükleozlar) denılen ozel enzımlerle

eklenıp aktarılabılecek içerikde kesilmesi

3. RE ıle iĢlem görmüĢ DNA molekullerının vektor adı verılen taĢıyıcı molekuller yüklenmesi

4. Vektor ve tasıdıgı molekul(Bu bırlıktelık artı rekombınant DNA molekuludur) un faalıyet gosterecegı konakçı hücreye naklı

5. Konakçı hucre ve kendı genomu çogalırken bu arada aktarılan DNA da çogalacagından DNA molekulunun klonlanmasının saglanısı.

6. Klonlanmıs DNA nın konakçı hucreden ızole edılıp ıncelenmesı 7. Klonlanmıs DNA nın gen ürününün elde edilmesi yani klonlanmıĢ DNA transripsiyona

ugrayabiilir mRNA‟sı translasyona yönlendirilebilir gen ürünü izole edebilir ve araĢtırma, ticari maksat için kullanılır. Bu basmakların her biri ayrı baĢlık altında bundan sonraki kısımlar da sunulacaktır.

REKOMBINANT DNA TEKNOLOJĠSĠ



ġekil 1. Rekombinant DNA tekniğinin özeti. Önce bir hibrit vektör oluĢturulur. Bu vektöriçerisindekalanyabancı DNA‟yı da içerir. Vektör konukçu organizmayasokulur.Konukçununreplikasyonu ile yabancı DNA da çoğalır. Eğer gen faaliyeti sağlanırsa, bu genin

ürünü çok miktarda eldeedilmiĢ olur. (Robert H.

Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill),isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)

REKOMBĠNANT DNA TEKNOLOJISININ ARAÇLARI

Restriksiyon Endonükleaz Enzimleri

1978‟de Fızyoloji Tıp Nobel ödülü W.Arben ,H.Sımıth ,D.Nathan‟nın Restiriksıyon endonükleaz enzimleri hakkındaki çalıĢmalarından dolayı verilmiĢtir. Bu oluĢumlar bakterinin sahip olduğu yabancı DNA‟ları yok eden enzimlerdir.

Normaldeki iĢlevi bakteri hücresini iĢgal eden iĢgalci virüslerin DNA‟sını nükleotıd zincirini sadece belli bazı özel yerlerden tanıyarak kesmektedir. Bu özel tanıma yerlerine

Restriksiyon (sınırlama=kesme)bölgeleri adı verilir.Bu yerler DNA molekülü üzerinde



bulunan ve genellikle 4-8 baz çifti uzunlukta yerlerdir. Bu enzimlerin faaliyeti sonucu DNAbu yerlerden kopar.

BaĢlangıçta bu enzimlere „‟Restriksiyon enzim adı verilmesinin‟‟ ana sebebi Ģudur. Fajlar bazı bakterilerde yaĢayabilirlerken farklı restırıksıyon enzimlere sahip baĢka

bakterilerde de yaĢayabilememektedir. Bu yüzden bakteri soyları arasında faj infeksiyonu bakımından sınırlılık vardır. Üç tip Restrıksıyon enzimi bilinmektedir. Bu gruplama enzimi (DNA) daki kestiği bölgenin yapısına ve enzim yapısına göredir.

1.ve 3.tip Restriksiyon enzimleri gen klonlamada kullanılmaz. Çünkü bunlar DNA‟yı tanıma bölgeleri dıĢında keser ve kesim yeri tesadüf olup önceden tahmin edilmeyen bir yerde kesim yapar, oysa 2. Tip Restırıksıyon enzimi ise belli özel yerlerden keser.Ayrıca kesim yerleri belli bir simetri gösterir. Mesela (Bam I )isimli ikinci tip enzim [5‟-GGA/TTC-3‟] [3‟-CCT/AGG-5‟] bölgesinde kesim yapar.Eğer okuma düĢey yapılırsa merkezden alttaki zincirin AGG‟sı ile (soldan sağa okunur) ve üstteki zincirin GGA‟sı sağdan sola okununca (AGG) aynıdır.

Böyle bir tersinir eĢlenik yapıya POLINDROM ( polındrom yunanca polındrom =geriye kesmek demektir) denir. Her iki yönde okunuĢu aynı olan yapıları tanımlar.Mesala (1238321) her iki yönde de aynıdır. AĢağıdaki Ģekilde böyle iki tip Restırıksıyon Enzimi (RE) verilmiĢtir. Hemen hemen (100) u aĢkın 2. Tip R.E.bilinir. Konukçu hücreler kendi DNA larını bu enzim yerlerine sahip olmamaları yanısıra kendı (DNA) sını bu bölgelerde metilleĢtirme nedeniyle korurlar.

ġekil 2. DeğiĢik Restriksiyon Endonükleaz ile yapılan diziliĢ sıraları. Pu Purinleri, Py

purimidinleri göstersin. Okların yerleri Endonükleazların DNA kesim yerlerini gösterir. 1971 yılında K.Danna ve D.Nathan „Restriksiyon Endonükleazların DNA‟yı hemen hemen aynı

boyutlarda parçalara böldükleri,Enzim aksiyonunun tekrarlanabilirliği ve kesinliği bunları ilerde yapılacak araĢtırmalar için faydalı kılacagı gorusu ifade edilmiĢtir..Aslında Bütün resriksiyon endonükleazlar 3‟ ve 5‟ uçları üretmez, bazıları kör uçlar üretir.

(Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)



ġekil 3. Sitozine Metilaz enzimi yardımı ile Metil grubu katılması sonucunda 5-MetilsitozinedönüĢür. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)

ġekil 4. Konukçu DNA (Hpa II ) Restriksiyon yerinde metilleme ile kendi DNA sını R.E. den korur . Yıldızlar sitozindeki Metil grubunu gösterirler. (DNA) Replikasyonundan sonra DNAyarım metillenir. Yeni kol metile sahip değildir. Yarım metillenmiĢ DNA, daha sonra hücre enzimlerle metillenir. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGr aw-Hill),

isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)



13

Endonükleazların hücumuna maruz kalan aynı diziliĢ sırası metillemiĢ durumda ise metillenmemiĢe nazaran korunmuĢ haldedir. Yani enzim etki yapamaz. Konukçu (DNA) çoğalmasından sonra yeni çift sarmal hemimetil (yarım metilli) konumdadır.

Yani eski kol metilli yeni kol metilsizdir. Böyle bir durumda yeni kol kolayca

metillenebilir. Hangi kolda olursa olsun metil içermeyen yabancı DNA lar .RE lerce parcalanabılır, Restriksiyon enzimleri izole edildiği canlıya göre isimlendirilir. Mesela Bam HI isimli enzim Bacillius amlio Liqufeciens (H) soyundan elde edilmiĢtir. Eco R1 ise E.colı (RY-13) soyundan elde edilmiĢtir.

Hind II ise Haemophylus influence (Rd) soyundan Bgl 1 ise bacillus grobigi‟den elde edilir. Bunların genel adları Restırıksıyon enzimleridir. (R.E)‟ler DNA‟yı iki biçimde keser.Mesela Hınd II ve tanıma bölgeleri iki zincirde aynı hizada olup kesimden sonra (DNA)‟nın iki küt uç oluĢur. Bu durum Ģekildede gösterilmiĢtir.

Aynı Ģekilde mesela Bam HI‟ın kesikleri yapıĢkan uç olarak adlandırılır(5‟uç asılı

durur.)Bu durumda kendiliğinden komplementer bazlarla hidrojen bağları ile yeniden eklenebilir. Böyle yapıĢkan uçların böyle yeniden eklenme (Reanneaal) yeteneği S.Cohen,L.. Boyer ve ark.‟ca 1971‟de ortaya konmuĢtur.

VEKTÖRLER KLONLANACAK DNA PARÇALARI

TaĢıma Sürecinde Kullanılan TaĢıyıcılardır

Vektör moleküllerin kunukçudan kolay izole edilebilen kendi ve taĢıdığı DNA molekülünü bağımsız replike edebilen, sadece bir (RE) ile kırılma (kesilme) bölgesi oluĢturabilen bu surette taĢınacak (DNA) parçasında aynı enzimle kesilerek ekleme sağlanabilecek nitelikte olmalıdır. Vektör molekülleri üzerinde antibiyotik direnç gen gibi bir

iĢaretleyici taĢımalıdır. Bu surette vektör taĢıyan ve taĢımayan hücrelerin ayrımı mümkün olur. Mevcut teknolojilerde in vitro olarak çeĢitli kaynaklardan gelen DNA‟ların birbirine

eklenmesi mümkündür. ġekilde bu durum gösterilmiĢtir.

Halka DNA molekülü özel(R.E.)‟lerle kesilir. Böylece yeniden halkalar bağlanır. Eğer farklı moleküller aynı serbest uçlara sahipse bunlar kaynaĢarak hibrit molekül oluĢur.Burada DNA ligaz enzimi moleküllerin eklenmesinde kullanılır.Onemlı bır prokaryotık vektor plazmıddır.Bir konakçı hucreye bır plazmıd gırmesıne karsın kendını bır hucrede bınlerce kez

bulunacak sekılde çogaltır

PROKARYOTĠK VEKTÖRLER

Prokaryotlarda Plazmid vektor yanısıra LAMBDA ve M 13 BAKTERYOFAJ VEKTORLER, COZMIT ve MEKIK vektorler. Bakterı yapay kromozomları, bulunur . EUKARYOTLARDA ıse MAYA PLAZMITLERI ILE olusturulan vektorler, MAYA YAPAY KROMOZOMLARI kullanılabılır.

Prokaryotlarda konukcu hucre olarak E.Colı hucrelerı Eukaryotlarda ıse bitkiler için A.Tumofacıens ıle ınfekte olmus bıtkı hucrelerı, hayvanlar ıcın ıse Esey yada yumurta hucrelerı kullanılır. Sözü edilen vektörler aktarılacak materyalin büyüklüğüne göre seçilir.



14

ġekil 5. Halka plazmid DNA‟sı EcoRI aracılığı ile tanınır. DNA endonükleaz ile kesildiktensonra ayni iĢleme maruz kalmıĢ olan ve halkalanarak yada aynı restriksiyon enzimleri ile kesilen iki yada daha fazla,daha doğrusal molekülleri birleĢtirir. Bunun sonucunda elde edilen açıklıklar DNA ligaz ile kapatılır.S.Cohen, H.Boyer ve arkadaĢları bu teknik ile 1971‟de ilk kez plazmidleri eklemiĢlerdir. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth

Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)

ġekil 5.a. Rekombinant DNA çalıĢmalarının iĢlem basamakları(Robert H. Tamarin‟in Principles of

Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)



15

ġekil 6. Rekombinant plazmidin Ģekillenmesi. Aynı restriksiyon enzimleri kullanılarak bu örnek de olduğu gibi EcoRI kullanılarak hem konukçu hemde yerleĢik DNA kesılır. Aynı anda kesilen uclar biraraya getirilerek yabancı DNA araya sokulmuĢ plazmid oluĢturulur. Ligaz

DNA‟yı klonlayan ilk bilim adamıdır. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth




16

Ekleme iĢleminde yer alan bir DNA parçası plazmid olabilir. Plazmidler bakteri hücresinde yer alan bağımsız çoğalabilen DNA parçasıdır. Rekombinant plazmid molekülü oluĢturulup hücreye eklenebilir.

Rekombinant plazmid de Hibrit plazmid,hibrit taĢıyıcı (vektör) yada Kimerik

plazmid adıda verilebilir Rekombinant plazmidin konukçuya konulması için çeĢitli metodlar vardır. Mesela bakteri hücresi bu yapı için geçirgen (permeable) kılınır. Bu iĢlem Kalsiyum kloritin seyreltilmiĢ solüsyonu katılarak sağlanır. Bu iĢlem

sağlandığında hücre içi plazmid DNA çoğalırken aktarılan DNA‟dada çoğalma gerçekleĢir.

Konukçu hücre içine yabancı DNA katılma iĢleminde,kesme(ekleme) yerlerinde kovalent baglar oluĢmadığından bu iĢlem Ligaz enzımı ıle saglanır.Ayrıca plazmıdın aktarıldıgı hucredekı varlıgının saptanabılmesı ıcın antıbıyotık dırenc genlerı gıbı ozel tanıma unsurlarıda plazmıde eklenır. M 13 faj ları da tek kollu DNA içeren faj lar olup vektor ıslevi görebilirler

RESTRĠKSĠYON ENZĠMLERĠ ĠLE KLONLAMA

Prokaryotlarda vektor olarak aktarılacak molekulun buyuklugune gore plazmıd ,cozmıt,faj.bakterı yapay kromozomu mekık vektor gıbı tasiyici unsurlar kullanılabılır. Farklı kaynaklardan gelen DNA‟ların klonlanmasında çeĢitli koĢullar vardır.Önce plazmid aygıtı (R.E)‟lerle bir noktadan kesilir. Eğer birden fazla yerde kesim olursa deneme sırasında molekül parçalanır.

Lamda fajlarından türeyen Charon fajlarında genomlarının orta üçde birlik kısmı faj için cok gereklı bolge degıldır Eco R I yardımı ıle aktarılacak yabancı DNA bu üçde birlik kısma konulabılır. Bu yüzden Lamda önemli bir taĢıyıcı aygıttır.15000 baz çifti (15 kilo baz 15kb) büyüklüğünde faj görevleri için hayati olmayan kısmını yabancı DNA ile değiĢtirilmiĢ olan lamda fajı iyi bir hibrit taĢıyıcı aygıt olarak iĢlev görebilir.

Çünkü fajın bu kısmı E.Coli kromozomuna eklenmek için gereklidir. Bu kısım faj bakteriyi enfekte ettiğinde bakteri içinde çoğalır ve sonuçta ekleme bölgesi olmaksızın hücre lisise olur (patlar).

Genetik mühendisleri Lamda zorunlu olmayan bölgesi eksik ve Eco R1 kesme bölgesiiçeren DNA molekülü oluĢturmuĢlardır. Olusturulan recombınant molekuller ya yuksek

verımlı transfectıon meteodu ile konakçı bakteriye transfer edilir yada ınfektif faj bıcımınde infeksıiyon ile aktarım saglanır.

Normal E.Coli plazmiti ile klonlamada yabancı DNA (15kb) dan daha büyük bir Ģekilde çok büyük olduğunda durağan yapı kaybolmaktadır. Bu dezavantaj yanı buyuk molekullerle çalısma gerektıgınde olusan zorluk lamda fajları ile gıdereılır

Yani büyük kromozomal segmentler klonlandığında plazmid çoğaldıkça plazmid klonu bazı kısımlarını kaybetme eğilimde olmaktadır. BaĢlıca bu nedenle genetikçiler Lamda fajını taĢıyıcı olarak kullanmıĢlardır. Bu fajlar (24 kb)lık büyüklükleride baĢarıyla taĢırlar.Faj kromozomları yaklaĢık (50kb) DNA içerir. Faj baĢ kısmı içinde Lineer biçimde hücre içinde

halka formundadır. Faj baĢını dolduran DNA infeksiyon esnasında tanınır.



17

Çünkü her iki ucunda bir kollu küçük bir segment vardır. Bu uçlar Cos yeri olarak anılır. Cos terimi cohesive uç (Co hesive Ends) kavramını içerir. Cos yeri (12) bazlık uzunluktadır. Cos yerinin yeniden eklenmesi Lamda kromozomlarının konukçuya girdiğinde halka yapı almasına neden olur.

DNA‟yı (Cos) yerinden kesince halka açılır,Lineer molekül oluĢur.Genetikçiler (Cos)

yerinin bu avantajını kullanarak (24 kb) dan daha uzun segmentleri bile klonlayabilir.

Birçok Eukaryotik genler intronlar ve transkripsiyon kontrol segmentleri nedeniyledaha uzundur. Eğer (CoS) segmentleri her iki ucu plazmid orijinli (DNA)‟ya eklenmiĢ ise çoğalma iĢlemi seçiçi antibiyotik genlerle sağlanarak (50 kb) kadar DNA‟yla klonlaĢabilir.

Bu cos yeri içeren plazmidlere cosmid adı verilir. Bu nedenle bu moleküller lambda kromozomunun cos kısmı ıle bakteryel plazmıdın melezı hıbrıt molekullerdır. Bu cosmidler

büyük DNA‟ları klonlamak yanısıra DNA‟sı büyük segmentlerin seçiminde kullanılır. Kosmidler lambda fajının faj protein kılıfına paketlenmesi için gerekli (cos) yeri ile plazmid replikasyonu için gerekli dizileri ve antibiyotik direnç genleri içerir.

Çünkü küçük cosmidler faj baĢına birleĢemez. Böylece 2.5-50 kb uzunluğa kadar yabancı (DNA)‟lar plazmidleri choron fajları yada cosmidler kullanarak klonlanır. Bira mayasında milyon baz uzunluğa kadar yabancı DNA‟yı klonlamakta mümkün olmuĢtur.

ġekil 7. Bir kozmidin görünüĢü :Kosmıdler (cos) adı verilen bölgeler içeren plazmid olup lambda fajı baĢlarında bakteriye aktarılır.Ġnfeksiyon sürecinde etkili bir metoddur. (cos) yerleri tek kollu olup konukçu içinde kaynaĢarak halka formuna çevrilir.

(Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiyeedilerek alınmıĢtır.)



18

HĠBRĠT VEKTÖRLER ĠÇĠN SEÇĠM

Yukarıdaki açıklamalarda açıklanan metotda (R.E)‟lerin ayrı ayrı hem vektör hem yabancı (DNA)‟yı kesmesi söz konusudur. Daha sonra bu iki unsur ligazın mevcut olduğu ortamda karıĢtırılır.

Neticede birçok ürün meydana gelir. Bu ürünler üç guruba ayrılır. Yabancı DNA‟lı vektörler, yabancı DNA‟sız vektörler ve parçacıklar. Daha sonraki bölümlerde vektördeki özel yabancı (DNA) parçalarının bulunması incelenecektir.

Burada herhangi bir (DNA) parçası içeren vektörlerin seçilmesi açıklanacaktır. Choron fajları basit olarak E.coli hücrelerini infekte etme kabiliyetlerine göre seçilir.

Bilindiği gibi Lamda virüsü baĢ kısmında paketlenme için gerekli büyüklük ihtiyacı yüzünden sadece Lamda fajı DNA‟sı ve yabancı DNA birlikte paketlenebilir.

Bu yüzden yabancı DNA içeren plasmid antibiyotik dayanıklılık özelliğinin incelenmesi ile ayırt edilebilir. Mesela yaygın olarak kullanılan PBR 322 plasmid bu maksatlakullanılabilir.

Plasmitler ilk inceleyenlerin isimlerini baĢ harfleri ile incelenir. Buna göre bu plasmid (P) F.Bolivar (B) ve R.Rodriges (R ) tarafından incelenmiĢ ve (1977)‟de bu konu ile ilgili yayın yapılmıĢtır.Bu plasmidin Tetrasikline ve Ampisiline dayanıklılık genleri bulunur. Ayrıca bu plasmid de çeĢitli enzim kesme yerleri bulunur. Mesela Tetrasiklin dayanıklılık geni içinde (Bam H) enzimi kesim yeride bulunur.

Ligasyon iĢlemi sonucunda yabancı (DNA) bulunduran ve bulundurmayan plasmidleroluĢacaktır.

E.Coli hücrelerinin kalsiyum kloritli ortamda bu (DNA) karıĢımı ile birlikteliği sağlandığında antibiyotik içermeyen ortamda DNA yı içine almıĢ E.Coli hücreleri elde edilmiĢ olacaktır.

Daha sonra bu ortama iliĢkin plakalardan Replika yöntemi ile bir veya iki antibiyotiğin ikisini yada birini içeren ortamlara nakil kopya alınır. Her iki antibiyotiğe dayanıklı kolonilerdeki hücreler yabancı DNA içermeyen plazmidli hücrelerden oluĢmuĢ olmalıdır.

Sadece Ampiciline dayanıklı koloniler ise yabancı DNA içeren plazmidli hücrelere ait olacaktır. Her bir antibiyotiğe dayanıklı olmayanlar ise plazmid içermeyen hücreleri temsil eder.



19

ġekil 8. E.coli PBR 322 plazmidleri. Bu plazmidi (amp ) ve (tet ) sembolleri ile belırlenen amplisilin ve tetrasiline dayanıklılık, danda sorumlu iki gen yeri taĢır. (tet ) geni içinde (BamHI) kesici enzim yeri vardır.(tet ) geni içinde clonlanmıĢ parçalar tetrasiline dayanıklılığı ortadan kaldırır.

(Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)

KÖR UÇLU EKLENME

Kör ya da küt uçlu ekleme (Blunt end ligasyon) adı verilen yöntem (R:E) ile muamelenin klonlamada uygun olmadığı hallerde kullanılır.(R:E) ile kesme iĢlemi ıle

klonlamanın mumkun olamadıgı mesela kesim yerlerının istenen genin ortasında oldugu durumlarda gerek duyulan yontem ıse Kor uclu ekleme(blunt end lıgatıon) yontemıdır. Yabancı DNA nın fiziksel kırılma gibi metotlarda elde edildiği durumlarda da çeĢitli clonlama metotları bulunur. Bu metotlardan en populer olan kör uclu ekleme (blunt-end-ligasyon) denir.

Bu metotta da yabancı DNA nın taĢıyıcı aygıtla eklenmesinin sağlanması söz konusudur. Ancak birbirine bağlı olmak dolayısıyla gerçek uçlar (sticky ends) yada yapıĢkan uçları bulunmayan moleküllerin birbirine eklenmesi söz konusudur.Mesela faj enzimi olan T4 DNA ligaz isimli enzim kör uçlu DNA ları ekler. Kör uçlar DNA segmentleri klonlanacağı zaman fiziksel olarak DNA ların kırılması ile Hınd III gibi kör uç oluĢturan (R.E) ler ile sağlana bilir.

Ligaz hangi kör ucun ekleneceğine göre özel olmadığından bunun iĢlemi sonucunda birçok istenmeyen ürün neticeleri oluĢabilir.



20

(R.E) leri kullanarak klonlama yapmada yapıĢkan uçlar metodu tercih edilir. Kör uçlu ligasyonun değiĢik halinde bağlayıcılar, eklemler (linker) kullanılmaktadır.Bunlar kısa yapay sentezlenmiĢ DNA parçaları olup (R:E) tanıma yerleri içerirler. Bu bağlayıcılar DNA kör uçlarına eklenir uygun (RE) lerle muamele edilirse yapıĢkan uçlar oluĢur.

Bu durum Ģekil (9) da gösterilmiĢtir. ġekildeki bağlayıcılar ortasında Eco R1 yeri olan 12 Baz çifti (Base pair=bp) uzunluktadır.Bunlar klonlanacak DNA ya (T4 DNA) ligazla

beraber eklenir.Daha sonraki (EcoR 1) ile muamele (Eco 1) yapıĢkan uçları oluĢumuna yol açar.

ġekil 9. Bağlayıcılar. Küçük iç Restriksiyon kesim yerlerine sahip kısa DNA segmentleridir. Bunlar T4 DNA Ligaz enzimi aracılığı ile kör uçlu DNA‟lara katılabilir. Restriksiyon enzimleri ile muamele sonucu, aynı restriksiyon enzimi ile kesilmiĢ her hangi bir (DNA) ile rekabet edebilen (DNA)‟ ların oluĢmasına yol açar.

(Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye

edilerek alınmıĢtır.)

KLONLANACAK (DNA) LAR ĠKĠ ġEKĠLDE ELDE EDĠLĠR.

1. Arzu edilen gen ya da (DNA) sentezlenir veya direk yada (mRNA) dan tersinir kopyalamaile izole edilir.

2. Organizmanın genomu Ģansa bağlı küçük parçalara bölünür

Bu ikinci usule tüfek saçması benzeri anlamına (shot gun) rastgele atıĢ klonlama denir. Sonra istenen (DNA) segmenti oluĢturulan çeĢitli klonlar arasından yakalanır(seçilir).

ġimdi klonlamadan önce istenen genin izole edilmesi ya da sentezlenmesi sonradaklonlamadan sonra istenen genin yerleĢtirilmesini inceleyelim



21

1. BELĠRLĠ BĠR GENĠN KLONLANMASI

1.1.Klonlanacak DNA nın oluĢturulması.

Belli bir geni ya da DNA parçasının klonlanmasından önce ilgili geni içeren çift kollu (DNA) parçasının saflaĢmıĢ halde mevcut olması gerekir.(DNA) elde etmek için çeĢitli yollar vardır.

ÇeĢitli güçlük içermeyen oluĢumlar bir kollu (m RNA) elde edip onu çift kollu DNAya çevirmek böyle bir usuldür. Bu durumda sorun istenen m RNA yı elde etmektir.

Belli bir özel gen için m RNA özel genin niteliğine göre elde edilebilir. Eğer belli bir özel hücrede çok miktarda RNA mevcut ise direk olarak izole edilir.

bolca bulunur. Ayrıca Ribozomal RNA ve birçok t RNA yı uygun bir klonlama için bolca ve kolayca elde etmek mümkündür.

RNA tümör viruslarından elde edilen tersinir kopyalanma (Reverse transcription)yardımı ile saflaĢmıĢ (RNA) dan klonlanacak çift kollu (DNA) elde edilebilir.

Burada (3 poly-A) kuyruğuna sahip Eukaryotlardan elde edilen m-RNA kullanılarak (RNA) nın (DNA) ya dönüĢümü açıklanacaktır.

ġekil 10. (a) mRNA enzimi iki kollu DNA‟ya çevrilerek revers transkriptisekullanılarak klonlamayapılır. (b)Eukaryotik RNA‟nın Poly-Aucuna komplementer (Poly-T)segmenti katılır. (c)RNA Ģablonundan bir primerin diziliĢ sırası kullanılarak DNA sentezlenmesi için ReversTranskriptize kullanılır. NaOH kullanılarak RNA uzaklaĢtırılır.

polimeraz 1 için primer yeri dedenir. Bundan çift kollu DNAoluĢur. (d-e) S1 Nükleaz enzimisaç tokasını uzaklaĢtırır. (f) Sonuçta komplementer DNA(cDNA) oluĢur. (Robert H. Tamarin‟inPrinciplesof Genetics(Sixth

Edition,WCB/McGraw-Hill),

isimlikitabındanmodifiye edilerek alınmıĢtır.)



22

ġekil (10)‟da görüldüğü gibi önce Poly-T, adı verilen primer kendine uygun Poly-A‟lı kuyruğa sahip m-RNA „ya katılır. Bu çeĢit çift kollu bölgeler serbest [3‟-OH] içerdiğinden polimeraz aktivitesi için primer olarak baĢlama unsuru olarak iĢlem görür.

Bilindiği gibi primer terimi (DNA) replikasyonunda (3‟-5‟)‟ci istikamete tek kollu

olarak devam eden çift kollu kısa (DNA) parçasını tanımlar. Daha sonra primer (RNA) tersinir kopyalama muamele edildiği zaman ,(RNA)‟yı kalıp olarak kullanarak (DNA) nükleotidleri polimerize eder(Bir araya getirir yani zincir haline getirir).Sonuçta (DNA-RNA)hibrid molekülleri oluĢur. Daha sonra m-RNA‟nın uzaklaĢtırılması için (NAOH) ile muamele sağlanır. Bu unsur DNA‟yı etkilemez.

RNA uzaklaĢtırıldıktan sonra DNA‟nın (3‟)ucu genellikle diğer uca katlanır ve saç tokası biçiminde lop oluĢturur. Meydana gelen çift kollu DNA‟ya komplementer DNA (c DNA)adı verilir. Burada tek kollu m-RNA‟dan baĢlanarak çift kollu DNA üretilmiĢtir . Bu(DNA) kör uçlu ekleme metodu ile klonlanabilir.

Eğer (RNA) çok miktarda ortamda mevcut değilse eğer belli bir gene iliĢkin proteinin aminoasit diziliĢ sırası biliniyorsa invitro olarak (DNA) sentezlenebilir. Bir genin protein unsuru yardımıyla aminoasit diziliĢ sırası buna iliĢkin muhtemel nükleotid diziliĢ sırası ise kod sözlüğünden elde edilir.

Bu metod genetik kodda çokluk (aynı aminoasidin birden çok kodla belirlenmesi) olduğundan orjinal DNA tam yeniden oluĢumu sağlanmayabilir. Diğer bir değiĢle bir

proteinde yer alan Leucin‟ne iliĢkin (6) farklı kodon vardır.

Bütün bunlara rağmen yeni tahmin her zaman gerçekleĢmemekle birlikte belli bir protein kodlayan (DNA) sentezlenebilir. Günümüzde Ģekil (11)‟deki gibi her zaman birimde bir (baz) (100) baz uzunlukta DNA sentezleyicisi makineler geliĢtirilmiĢtir.

Açıklanan bu metod ile genetik kod sözlüğünü kullanarak komplementer, bütünler (cDNA) yada sentetik DNA yapımı da genin promotor bölgesi ve (DNA) Protein çevrimine uğrayan kısmı (intron) Transkripsiyon Kontrol sıraları gibi kısımlar eksik kalacağı hususu akılda tutulmalıdır.

Eğer bir geni promotor ve intronları ile birlikte klonlamak istiyorsak klonlanan genomun tesadüfi seçilmiĢ parçalarını oluĢturduktan sonra yapılması gerekir. Ġlgi duyulan gen klonlamadan önce yada sonra bulunabilir.

mRNA aracılıgı ıle elde edılen cDNA çeĢitli Ģekillerde kullanılabılır.Soz gelimi uclarına çift zıncırlı kısa RE tanıma yerlerı ıceren DNA‟lar takılarak ardından RE ıle kesıp yapıskan uclar olusturarak bellı bazı teknıklerle faj yada plazmide aktarılarak klonlanır.Sadece bellı bır hucre tıpınde(embrıoda.yada dokuda) aktıf olan aktıf olan dızılerı(mRNA) iceren kolleksıyona cDNA kutuphanesı denır.

Bu terım GENOMIK KUTUPHANEDEN farklıdır. Çunku cDNA sadece o safada o hucrede mevcut mRNA ların karsılıgı olan DNA‟ları içerir. Dıger bır deyısle cDNA genomda yeralan DNA nın düzeneleyici bolgelerıni Transkrıpsıyona ugramayan bolgelerı ni içermez. Genomık DNA genomdakı tum dızılerden enaz bır kopya içeren klonlanmıĢ DNA

kolleksıyonudur.



23

Ġnsan genomunu klonlamak ıcın faj vektoru kullanılırsa 4-5 milyon faj vektoru gerekır. Genomun bır parcasından ornegın tek kromozomdan olusan kutuphaneler kromozom-ozgulkutuphane dıye adlandırılır. Bır genomık kutuphane yuzbınler varan klon içerebılir.

ġekil 11. Ġlk otomatize edilmiĢ döngü ile solid fazdaki DNA sentezi.Birinci nükleotid silica ön maddesine (substrat‟a)bağlanır.Ġkinci nükleotid (aDMT=Dimetoksitrily) türevi ilk nükleotidlefosfodiester bağı oluĢturur.DMT ikinci nükleotidin (5„) ucunu korur.DMT

uzaklaĢtırılmadığından nükleotid katılamaz.DMT uzaklaĢtırıldıktan sonra dinükleotid yeni döngüye hazır hale gelir.(R1) ve (R2) koruyucu grupları süreç tamamlandığında uzaklaĢtırılır.Ve oligonükleotidler silica ön maddesinden ayrılır. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill),isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)

Promotor terimi (RNA) polimerazın transkripsiyon baĢlatmak üzere (DNA)‟da bağlandığı yeri tanımlar. Ġntron terimi ise (DNA) içinde transcribe olan fakat translasyondan önce uzaklaĢtırılan kısımları tanımlar.



GENOM KÜTÜPHANESĠ OLUġTURMA

C-DNA veya sentetik DNA ile ilgili klonlama çalısmalarında genomun tumu buyukluk nedenıyle kullanılması mümkün olmadığında, organizmanın toplam DNA‟sı daha küçük

parçalara bölünür. Bu küçük parçalardan da arzu edilen gen yada DNA parçaları izole edilir.

Bir genomik kutuplarda genomdaki tüm dizilerden en az bir kopya içereçek Ģekilde hücrelerden DNA dürüstirileri (Rejler ile kesilir parça vektörlere takılır. Her vektör sadece birkaç bin baz DNA içierir.

Arzu edilen gen klonlamadan önce yada sonra elde edilebilir.Böyle (DNA) genomik DNAolarak adlandırılır ve c(DNA)‟dan farklıdır. Eğer (DNA) klonlamadan önce elde edilmiĢ ise o zaman sadece ihtiyaç duyulan DNA klonlanır.

Diğer bir yolda tüfek saçması benzeri (shotgun) adı verilen yaklaĢımı kullanmaktadır. Bu usulde genomunun bir örneği (küçük parça) kullanılarak klonlama yapılır.Böylece bir türün orjinal genomunun klonlanmıĢ parçalarının seti elde edilmiĢ olur. Bu sete genom

kütüphanesi denir(ġekil.12). cDNA kutuphanesı tum gernomu degıl sadece mRNA ları karsılıgı olan DNA ların kutuphanesidir. O yüzden (cDNA) kütüphaneside denir.

ġekil 12. Rastgele atıĢ(Tüfek saçması atısı) yaklaĢımını kullanarak oluĢturulmuĢ,araya sokulmuĢ unsurları kullanarak Genomik kütüphane oluĢturulur.Genom kısımlarına

parçalanır.Parçacıklar daha sonra vektörlerde Ģansa bağlı biçimde klonlanır.Bu vektörlerin toplamı genomik kütüphanesi adıyla bilinir. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)



25

Genom kütüphanesi olgusunda arzu edilen gen klonlandıktan sonra kutuphaneye yerleĢtirilmiĢ olur.

SOUTHERN BLOTTING

Genellikle Endonükleaz enzımı ıle Sindirim aracılığı ile tesadüf olarak üretilen DNA segmentleri söz konusu ise bunların ıcınden arzu edilen genin yerini belirlemeye gerek vardır. Daha önce belirtildiği gibi klonlamadan önce yada sonra gen aranabilir.

Önce (DNA)‟daki özel bir genin yerini (DNA) klonlamadan önce nasıl olduğunu inceleyelim DNA parçalarının ortasındaki özel bir genin yerini anlamak için önce özel sonda (probe) ihtiyaç duyulur.Klonlanan genın karakterızasyonu,pekçok DNA parcaları ıcınde ıstenılen parcanon varlıgını gosterme,ilgili genın farklı turlerde karsılıgını bulma, gıbı ıslemler ıcın SOUTHERN BLOTLAMA yapılır

Sondalar genellikle nükleik asid yapısında olup diziliĢ sırası hibridizasyon sonucu ile

varlıgı arastırılan hedef molekule(c-DNA)‟ya butunler olan ona uyan diziliĢ sırasını tanımlar.

Sondalar daha sonra otoradyografi ile yada cemilĠmunuskent teknikler ile (ultraviyole yada laser ıĢınları altında varlıklarını ortaya koyan iĢaretlerdir)iĢaretlerinden dolayı

belırlenebilmektedir.

radyoaktif olarak-DNA

yada DNA-DNA hibritleri özel gen ile radyoaktif sonda arasında oluĢacaktır.

Otoradyografi yada cemilımunuskent tekniği radyoaktif sondanın yerini gösterir. -globin geninin klonlamak istediğimizi varsayalım. Önce tavĢan (DNA)sında Restriksiyon enzimleri ile kesintiler oluĢturmak gerekir. Daha sonra bu kesintiler agaroz jeldeelekeroforeze tabi tutulur.

Ve böylece büyüklüklerine göre çeĢitli ebatlarda parçacıklara ayrılır. Agoroz çok çeĢitli büyüklükte (DNA) parçacıklarını ayırmak için iyi bir ortamdır.Bu çeĢit bir kesme iĢleminde çok sayıda fragment söz konusu olup sonuçta çok küçükden çok büyüğe olmak üzere oligonükleotid lekeleri (band yapıları)oluĢur.

Daha ileri iĢlem için elekroforez fragmentleri diğer ortama transfer edilerek sonda

iĢlemi yürütülür.Bunun icin dogru DNA parçalarının agoroz jelden dıĢa dogru nıtro seluloz fıltreye düfüze olması sağlanır. Nitroselüloz filtre yada naylon membranlar hibridizasyonda en iyi neticeyi verir.



26

ġekil 13. Southern blotting tekniğini kullanarak bir (DNA) Kitlesi içinde tavĢan -globingeninin varlıg belirlemiĢtir. TavĢa DNA‟sı restriksiyon enzimler ile kısımlara ayrılır Agaroz el ortamında elektroforez yapılır Southern Blotting yapılır (Bantları gorulur kılmak ıcın

-globin haberci RNA Ģeklindeki -globin geni içeren DNA fregmentinin yerini saptar.

(Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill),




27

Bu teknikte Agoraz jeldeki çift kollu DNA önce genellikle (NaOH) ile tek kollu(DNA)‟ya denatüre edilir. Daha sonra Agoraz jeli filtre parçası dikkatlice Nitroselüloz filtre altına gelecek Ģekilde yerleĢtirilir.

Neticede Sandviç gibi Agoroz tarafı aĢağıda ıslak sünger üstüne gelecek Ģekilde

yerleĢtirilir. Sonra nitroselüloz filtre tarafına kuru filtre kâğıdı konur. Böylece tıpkı fitil gibi agorozlardaki (DNA) segmentini taĢıyan kısım Nitroselüloz filtreye geçirilir.

ġekil 14. Southern blotting tekniğinde jel ve filtrelerin düzenlenmesi (NaOH) Buffersolüsyonu kuru filtre aracılığı ile yukarı çekilir ve DNA‟yı agarose jelden nitro seluloz filtreye transfer eder.(Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill),isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)

Burada (NaOH) tepside yer alarak nakledici solüsyon olarak iĢlem görür.(DNA) kesintili parçaları ise ısıtma iĢlemi ile Nitroselüloz filtreye kalıcı olarak bağlanır. Filtre üzerinde DNA-DNA) hibridizasyonu gerçekleĢmiĢ olur.

Eğer aynı teknik RNA üzerinde sağlanırsa Northern blotting olarak adlandırılır.Northern blotlama belırlı bır genın farklı hucrelerde,dokuda organızmada transkrıpsıyon aktıvıtesını(mRNA‟lar aracılıgı ıle) kullanılır .

Nükleotid komplementaritesini olgusu içermeyen immunolojik tekniklerde ise proteinler için sonda kullanılabilir. Bu tekniğe Western blotting denir. Yani antibody‟lerin sonda gibi kullanılarak belli bir proteinin aranması iĢlemine Western blotting denir.

ĠĢaretlenmiĢ sondalarda çeĢitli Ģekillerde elde edilebilir. Bu örnekte radyoaktif sonda

tersinir kopyalama kullanarak (cDNA) oluĢturmaktır.



28

Tersinir kopyalamadade kullanılan Dideoksinükleotidler sentezlenirken Radyoaktif Fosfor [32P] içerirler. Bu durum Ģekil (13)‟de gösterilmiĢtir.

içeren DNA segmentinin yerini gösterir.Doğal olarak (mRNA)‟dan türeyen cDNA gende mevcut intronu içermeyecektir. Ancak nükleotid kolunda komplementer kollar olduğu sürece

sondalama baĢarılı olacaktır.

kesintisi örneğini kullanarak ikinci bir Agoroz jel uygulanır.

(DNA-DNA) hibridasyonuna maruz bırakılmayan jel aynı yerde B globin segmentini içerir. Autoradyografi ile yeri bilinen bantı agoroz jelden kesilip çıkarılarak (DNA) izole edilir. Böylece bu DNA klonlama tekniği ile klonlanır.

DNA Sondaları

Bir Klon kütüphanesinden özgül klonların seciminde kullanılan mototlar DNA prok kullanımı içerir.

Bir genomik kütüphanede yüz binlerce klon vardır. Bir kütüphaneden çalıĢacak geni elde etmek için yalnızca ilğili geni içerir. Klona yada klonların belirlenmesi geliĢtirilmesi gerekir. Ayrıca klonları genini tutumunun bütününü belirlediği tesbiti gerekir.

DNA grupları tek zincirli yada cift zincirli moleküller olarak hazırlanabilir. Sondakigenellikle radyoaktif polinoleotidlerdir. Özgül polipeptidler belirlere de renk, kimyasalreaksiyonlar içeren sondalarda kullanılır.

Bu maksatla palazmit kütüphanesi taraması sa söz konusu olabilir. Bu iĢlem için klonları taĢıyan bakteriler besleyici plaklarda üretilip binlerce koloni oluĢturular. Koloni

bakterileri plakdan nitroselüler yapıda kagıt filitreye mühür replika yöntemi ile hafifce

bastırılarak filtre üzerine aktarılır. Filtredeki kullanılan tek zincirli sonda ile muamele edilerek(DNA-DNA) hibritleri oluĢturulamsı sağlanır. Sonra filitre yıkanır bağlanmamıĢ (hibrit oluĢumu) molekül hibridasyonu olup olmadığı anlanabilir. Fotorgraf filmi üzerine konup sonra sondanın radyoaktif olması yada olmamasına göre film üzerinde koyu lekeler yadakimyasal ısınma Ģle ayır edilir.

Bu maksatla Plaka hibridasyonu gibi baĢka yöntemler de kullanılabilir.

KLONLANMIġ GEN ĠÇĠN SONDA

DOT BLOTTING: Daha önce açıklanan metodlar mesela Genom kütüphanesi

oluĢturulduktan sonra zaten plasmid içinde klonlanan genlerin yerini belirlemek içindekullanılabilir.

Bu durumda elektroforez ve Southern blotting gerekmeyecektir. Çünkü belli birkesinti içindeki DNA segmentinin yerinden ziyade zaten klonlanmıĢ DNA‟nın belli özel diziliĢ sırası klonlanacaktır.

Dot blotting elektroforetik ayrım safhasını gerektirmeyen zaten klonlanmıĢ DNA‟nın Blotting (lekeler) ile Ģekillenen bantlar biçiminde görülürlügünü saglama tekniğidir. Mesela insan-fare hibrit hücre hattı DNA‟sı insan DNA‟sının yerini belirlemek için klonlanabilir.



29

Bu durumda hibrit hücre hatlı sadece 20 no‟lu kromozomu olan bir tane insan kromozomu içerir. Bu kromozomdan gelen DNA‟nın yerini belirlemek için insan kromozomundan izole edilmiĢ sonda (prob) kullanılır.

Sondalar radyoaktif olarak iĢaretlenir. Aynı anda her biri hibrit plasmid içeren (288) E.

coli kolonisi yerleĢtirilir ve direkt nitroselüloz filtreye dâhil edilir. Prob (sonda) iĢlemine hazırlık için hücreler lisise edilir ve DNA‟ların denatüre olmaları sağlanır.

Her klonun hücreleri içindeki plasmid DNA‟sı radyo aktif bir sonda ile hibridize edilir. Yani insana özel diziliĢ sırası içeren prob(sonda)‟un radyoaktivıtesı kullanılır. Aynı anda ayrı

bir iĢlem olarakta (288) adet insan-fare hibrit hücre hatt DNA klonları ile nitroselüloz filtre üzerinde (288) ayrı yerde lisise edilir.

Sonra prob (sonda) lisise edilen örneklere tadbik edilir. ĠĢte bu (288) klon örneklerinden insan 20 no‟lu kromozom DNA‟sı taĢıyanlar koyu renk alır. Bu Ģekilde elektroforez ayrımını gerektirmeyen klonların (DNA) hibritlenmesi tekniğine Dot Blotting

denir.

ġekil 15. Fare-insan hibrit hücre hattı içeren (DNA)ya iliĢkin (288) clonun Dot Blot otoradyagrafisi. Clonlar insana özgü diziliĢ sırası için sondalarla hibridize edilmiĢtir. Sonda iĢlemi her clonun nitro seluloz filtre dolu örneklerinin Lisizi ile yapılmıĢtır.Ġki koyu karanlık nokta,insan (DNA)sı taĢıyan clonların yerini gösterir.Bir çok diğer noktalardaki silik radyasyon araĢtırıcının yerleĢimin biçimini anlamasına yardımcı olmak için oluĢturulmuĢtur. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill),


WESTERN BLOTTING

Bu teknik belli bir klonlanmıĢ özel genin yerini belirlemek için farklı bir metod olarak bilinir. Plasmid içeren hücrelerdeki klonlanmıĢ genlerin gerçek açıklamasının yapılmasından yararlanılır. Eğer eukaryotik genler E. coli plasmidlerinde klonlan-dığında aktif bir

promotor uygun akım yönünde yer almıĢ ise bu durumda gen faaliyeti (Transcripsiyon>Translasyon>Protein) elde edilmiĢ olabilir.



30

Bilindiği gibi AĢagı yön(Down stream) (akım yönü) terimi (RNA) polimeraz enzimiile ılgılı olagan,yonu tanımlar. DNA transcipsiyonun yönü ve pozisyonuna dair olağan durum (5‟) ucundan (3‟) uc yönüne doğrudur.

Bu durumda ters akım yönü (up stream) (5‟) uca doğru normal akım yönünu (Down

stream) ise(3‟) uca doğru polimerazın geliĢimini tanımlar. Promotor ise (RNA) polimeraz bağlanma yerini tanımlar. ĠĢte yabancı DNA‟nın açıklanmasına olanak veren plasmide expresion vektör adı verilir.

Normal olarak bakteriler eukaryotik genleri açıklamayacağından bu teknikte birçok zorluk olduğu hatırlanmalıdır. Ancak genede klonlama yeri promotorun akım yönünde olan çeĢitli özel plasmidler geliĢtirilmiĢtir.

Bu durumda eukaryotik gen prokaryotik genin bir kısmı haline gelir ve bu Ģekilde genellikle prokaryotlar bir kaç aminoasit içeren fusyon protein oluĢturur. ġüphesiz eukaryotik genin uygun yerleĢimde yer alması ve uygun translasyon için tam doğru kodon çerçeve

okunmasına maruz kalması gerekir.

Doğal olarak böyle bir olasılık düĢüktür.Belli bir protein ürününün yeri Southern blottıng yada Dot Blottıng‟e benzer Ģekilde belirlenebilir. Bu tekniğe Western Blotting adı verilir. Yani burada antibiyotik kullanarak belli özel proteinin sonda tekniği ile anlaĢılması amaçlanır.

ġekil 16. Western Blot tekniğiyle birçok Klon arasından belli bir proteini açıklayan klonun yeri belirlenir. Açıklanan proteini taĢıyan Klonlar lisize adilir. Antibodi uygulanarak protein yeri saptanır.Ġkinci bir antibadi,birinci antibadinin yerini saptar.Bu iĢlem florosent

renklendirici ile yada otoradyografi ile yapılır. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)



31

Bu teknikte sondalama radyoaktif oligonükleotid sondadan ziyade belli özel proteineözgü antibodi ile yapılır. Birinci antibodiye özgü ikinci bir antibodide iĢaretleyici olarak genellikle floresans nitelikli olur ve birincinin yerini belirler.

Mesela Ģekil (15)‟deki clonda yer alan belli özel proteinin açıklanmasını arıyor olalım. Clonlar nitroselüloz membrana aktarılır ve orada genellikle kloroform buharı ile lisize edilir.

Sonra belli özel proteine özgü antibody tatbik edilir.Aynı Ģekilde birinciye özel ikinci antibodi florescens iĢaretleyici ile iĢaretlenir ve filtreye uygulanır. Ġkinci antibodi‟nin florescens ıĢıması birinci antibodi‟nin yerini gösterir. Bu da hangi klonun belli bir özel geni açıkladığını gösterir. ġekil 16‟da bu durumgösterilmiĢtir.

KROMOZOM YÜRÜYÜġÜ, KOMUġU GENLERĠN TANIMLANMASI

Bu terim bireysel olarak klonlanabilecekten daha uzun (DNA) segmentlerinin üst üsteçakıĢan sondalar kullanılarak incelenmesini açıklar. Bır genın yerı yaklasık bılınıyorsa once komsu dızılerı klonlayarak suretı ıle o genıde klonlamak mumkundur. Aktarılan yabancı (DNA) boyu sınırlı olmasına karĢın bazen daha uzun (DNA) segmentlerini üst üste çakıĢan

clonları incelemek suretiyle kromozom yürüyüĢü adlı teknikle inceleyebiliriz.Kromozom yürüyüĢü metodunda klonların ve DNA”nın uç kısmı tekrar klonlanır ve

Genomik kütüphaneden baz dizileri örtüĢen diğer klonların araĢtırılmasında sonda (prob) olarak kullanılır. Sonuç örtüĢme düzeyi için analiz edilir. Ġkinci kez klonlanan örtüĢen

bölgenin ucu alınır tekrar baĢka örtüĢen klonaların seçimi için sonda olarak kullanılır. Böylece kromozom boyunca yürümüĢ olunur.

ġekil 17. Kromozom yürüyüĢ tekniği ile bölgeyi kapsayan araya sokulmuĢ kısmın klonlarında üst üste çakıĢan kısmın yerini belirlemek Ģeklinde uzun kromozom yürüyüĢ yapılır.(A)Araya sokulmuĢ kısım olarak tanımladığımız belli özel (DNA) parçası ile baĢlanır. Daha sonra bu kısımlarına bölünerek diğer klonlar için,(A) bölgesiyle çakıĢan bölgeyi içeren genom kütüphanesi içindeki diğer klonlar için sonda elde edilir.(aĢağıda diğer bölge (B) ile

belirtlmiĢtir.) (A-B)klonunun kendisi kısımlara ayrılır ve iĢlemi tekrarlayarak sonde elde edilir. Böylece kromozom üzerinde sürekli ilerlenir.

(Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill),isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)



32

Mesela (A) bölgesi adı verdiğimiz belli bir gen (1) no‟ lu klonda yer alsın. Bu bölgenin bu klonda yer aldığı sonda aracılığı ile anlaĢılmıĢtır. KlonlanmıĢ kısım aynı (R.E)‟yi kullanarak baĢlangıç vektörü ile yapıldığı gibi alınıp uzaklaĢtırılır ve sonda (Prob) ların kendilerinin kullanımı gibi parçalara ayrılabilir.

Burada amaç birinci ile üst üste çakıĢan klonlanan kısmı içeren diğer bir klonun yerini belirlemektir. Ġkinci klonda aynı Ģekilde muamele görür. Böylece segmentleri kromozomda daha aĢağı kısımlardaki diğer üst üste çakıĢan kısımlarda sonda olarak kullanılır.

Bu Ģekilde nisbeten kromozomun uzun segmentleri çakıĢan klonlar yardımı ile incelenebilir. Kromozom yürüyüĢünün açık bir kullanım alanı eukaryotik kromozomlarda hangi genlerin birbiriyle yan yana olduğunu anlamayı sağlar. Kıstık fıbroz ve kas dıstrofısı genının yerı boyle belırlenmıstır.

Bu teknik çok bıktırıcı iĢlemleri gerektirir. Belli bazı alanlarla sınırlı uygulaması vardır. Mesela Eukaryot DNA larda tekrarlanan diziliĢ sıraları gibi konular özel güçlükler oluĢturur. ÇakıĢan sonda birçok ortak tekrarlanan diziliĢ sırası içerir bitiĢik segment

içermeyen birçok klonla hibritleĢir.

Bu Ģekilde çapraz iliĢki tekniğin değerini azaltır. Yakın zamanda kromozom sıçraması (kromozom jumping) teknikler geliĢtirilmiĢtir. Bu teknikler yürüyüĢ için uygun olmayan

bölgeleri atlayan onları (bypass) yapan tekniklerdir.

Bu teknikler segmentler iki ucunun ortasında yürüme iĢlemi yapılmadan iki uçların yerlerinin belirleme kabiliyetlerine bağımlıdır. Segmentlerin uçları eğer bölge invert edilmiĢ ise (ters çevrilmiĢ)yada büyük bir bölge klonlanıp orta kısım sonra uzaklaĢtırılarak sadece uçlar kalmıĢ ise segmentlerin uçlarının yeri belirlenebilir.

Ġki ucun sondası araĢtırıcının birinci ucu ve diğerlerini etkili olarak clonlamasına ve e aradaki bölgelerin üzerinden atlanılmasını mümkün kılar.

Kısaca kromozom jumping terimi genomik kromozom üzerindeki birbirini takip etmeyen fakat bilinen noktalar arasında o bölgeyi atlayan klonların izolasyonu sağlayan tekniktir. Bu iĢ genellikle ilgili olmadığı düĢünülen bölgeler üzerinde iĢlem yapmak yada (yürüyüĢ) uzun olduğunda bypass bölgelerinde yapılır.

HETERODUPLEX ANALĠZ

Genellikle eklenen parçanın boyutunu tahmin etmek için clonlama tecrübelerinin sonuçlarını görmek arzu edilir. Bu teknik heteroduplex analizi yada heteroduplex haritalama olarak anılır.

Duplex DNA farklı kaynaklardan gelen tek kolların (DNA) ları farklı olan yerlerdeLoop yada çıkıntı yapacak Ģekilde oluĢumu ile elde edilir. Bu heterojen DNA‟ya heteroduplex adı verilir.

Elektron mikroskobu gözlemi ile analizi ile bu çeĢit DNA analizlerinde rekombinans DNA aralarındaki önemli bilgiler sağlanır.



33

ġekil 18. Ġki lambda faj kromozomunun iki bölgede farklılaĢmıĢ hetero dubleks haritası. Her ikiside hem uzunluk, hemde bir bölgenin diziliĢ sırası bakımından farklılaĢır.(soldaki ok).Ayrıca biri diğerinde bulunmayan biraraya sokulmuĢ kısım içerir.(sağdaki ok).(a)-Elektron Mikrografik (b)-Açıklayıcı diyagram araya sokulmuĢ bölge içeren kromozom farklı çizimle gösterilmiĢtir. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill),isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)



34

Heteroduplex analizi kullanılarak çeĢitli yabancı DNA ilave yerler, delesyonlar yada (DNA) parçacıklarındaki heterojenite ile belirlenebilir. Bu yöntemte klonlanan ürünlerin clon genellikle kendi sondası yada clonsuz plasmidi olmak üzere diğer nükleik asit ile hibritleĢtiğinde heteoduplex DNA oluĢur.

Bu Ģekilde clonlanan ürün elektron mikroskobu ile görülebilir. Metot bu Ģekilde

elektron mikroskobik incelemeye dayanır. Mesela bir canlıda lamda fajlarının iki klonlama vektörü arasındaki farklılığı haritalamak için Heteroduplex analiz kullanılabilir.

Bu durum ġekil 18‟de gösterilmiĢtir. ġekilde iki farklı bölgede farklılaĢan iki faj kromozomunun hibridizasyonu gösterilmiĢtir. ġekilde okla iĢaretli yerde iki faj kromozomuebat ve diziliĢ sırası farklıdır. Bu durum heteroduplex kromozomdaki tek kollu lop halinde gözlenir. Oysa bunun her iki tarafında eĢit kollu molekül yer alır. Ġki bölge farklı diziliĢ sırası ile gözlenir. Çünkü bunlar hibrit hibridize olmaz.

Bunun nedeni bölgeler ebat bakımından farklıdır. Ġki tek kollu zincir ölçülerek aĢıkar olarak farklı olduğu gösterilebilir. Ġkinci farklı bölgede ise tek kolu (DNA)‟nın gözlendiği araya sokulmuĢ loop göze çarpar.

Bu durum bir kromozomun ilave içine alınmıĢ kazanılmıĢ bölge içerirken değerinin böyle olmadığını gösterir. Lamda kromozomu ebatını bilirsek iki vektörün ebat farklılığı yanı sıra farklılığın tam uç noktasını belirlemek mümkün olur. Bu ölçümler araĢtırıcıya iki vektörün nelere maruz kaldığını gösterir.

EUKARYOTĠK VEKTÖRLER

Yapılan çeĢitli çalıĢmalarda kimerik plazmidlerin baĢlıca E.Coli olmak üzere bakterilere sokulması söz konusudur. Ancak bu tekniklerin eukaryotlarda uygulanması için E.Coli gibi prokaryotlar, fajlar eukaryot genlerinin tümünü açıklamaya muktedir değildir.

Çünkü bunlar genetik bazı transcripsiyon sonrası yada translasyon sonrası, iĢlemler, intron uzaklaĢtırılması, bazı proteinlerin modifikasyonu gibi iĢlemler için gerekli enzimler

bakımından eksiktir.

canlı Eukaryotik genomun in vivo (canlı içi) organizasyon ve açıklanması konusunda da çeĢitli konular arastırma alanlarını olusturmaktadır. Bunları anlayabilmek için Eukaryotik plazmidler ve eukaryotik genomun invivo iĢlemesi konuları incelenmelidir.

MAYA VEKTÖRÜ

Bira mayası küçük bir eukoryatik olup, laboratuvarda tıpkı prokaryatik gibi genetık ıslemlere uygun çalıĢabilir nıtelıktedır.. Ekmek mayası (saccharomyces cerevisia ) da böyle doğal olarak mevcut 2 mikron ebadında plazmitler vardır. Bu tıp plazmıt vektor olarak kullanılabılır.

Ayrıca bakteriyel plazmitler maya hücresine konulabilir. Maalesef böyle plazmitler hücreden kaybedilebilme eğilimindedir.Bu güçlük maya sentromeri (cen) ve bakteriyal

plazmitler birlestırılerek içinde maya DNA replikasyon orijini bölgesinide (autonomously replication sequences ARS) içeren bakteriyel plasmitler oluĢturularak giderilmiĢtir. Daha sonra plasmitler bir generasyondan generasyona maya aracılığı ile aktarılır.



35

Plazmitler içlerine konan telomerik diziliĢ sırasına sahiptir. Ancak endonükleazlarla telomerik sıralarda kesilerek doğrusal hale getirebilir. Yada plazmitler önce doğrusal kılınıp uçlarına telomerik diziliĢ sırası eklenebilir. Bu plazmitler sonra maya suni kromozomu( yeast articifical chomoromozom = Y.A.C.) olarak adlandırılır.

YAC‟nin özel avantajı içlerine konan büyük (DNA) parçalarını taĢıma kapasiteleridir. Cosmitlerin 50 kb taĢıdıkları hatırlanırsa YAC‟ler 800 kb yada daha büyük taĢıyabilir. YAC‟lar Eukaryotlarda insan genom prosesinde olduğu gibi çok miktarda DNA‟nın klonlanması söz konusu olduğunda önem kazanmaktadır. MayadaRekombinantDNA çalıĢmaları, Eukaryotlarda gen regulasyonu, sentromer çalıĢma biçimi eukaryotik, Linear,kromozom replikasyonunun ayrıntıları anlaĢıldıkça artacaktır.

ġekil 19. E.Coli‟de PBR 232 plazmidi. Bira mayasında kullanımı için modifiye edilmiĢtir. Bu plazmid hem bira mayasında ve hemde E.Colide yaĢamakta ve replike olmaktadır. Çünkü heriki durum içinde replikasyon orjin içermenin yanı sıra, bira mayası sentromerik bölgesi(CEN)

bulundurur. Bunlar doğrusal hale getirildiğinde telomerler de katıldığında bira mayası, suni kromozomu(YAC) büyük (DNA) parçalarını klonlamak için uygun hale gelmiĢ olacaktır. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill),isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)

HAYVAN VEKTÖRLERĠ

Taksonomik bakımdan yüksek hayvanlarda yaygın kullanılan aygıt DNA tümor virüsü (SV40)‟dır.(S.V.sembolü sgımıan vacuolotıng virusu tanımlar. Ġlk olarak maymunlarda izole edilmiĢ olup normal fareye tavĢana hamster hücresinede transforme olabilir. Transformasyon kelimesinin bakterilerde kullanımının aksine eukaryotlarda normal hücrenin

hızlı büyüyen kanserli hale dönüĢümünü tanımlar.



36

SV40 bu bakımdan çok küçük nıtelıkte partükül olup kçok az (5224 baz çifti ) kromozom içerir. Kalıtsal içeriği çift kollu halka DNA molekülü halindedir. Lamb‟de vektörü gibi (SV40) virionları kendi DNA‟larının bir kısmını yabancı DNA ile değiĢebilir. Rekombinant DNA çalıĢmalarında kullanılan viruslar iki çeĢit yol izlerler.

Bunlar kendi hayat sikluslarını rekombinant olmayan viruslar yardımıyla tamamlar

replike olur yada konukçu hücrede mevcut stoplazmadaki halka plazmidler aracılığı ile aktif virus partikülleri yapmaksızın(Yanı hucreyı lısıze etmeden) yada konukçu kromozomuna eklenerek hayat sikluslarını tamamlar(lısogenı).

(SV40)memeli hayvanlar genetik çalıĢmalarında önemli bir araç olmaktadır. Mesela -Globun geni (SV40)‟de klonlanmıĢtır.SV40‟da enhancer( kuvvetlendırıcı

zenginleĢtirici) diziliĢ sırası keĢfedilmiĢtir. Onkogenler gibi transformasyon konusunda yeni bilgilerin çoğu DNA tümör viruslarını taĢıyıcı aygıt olarak kullanılan çalıĢmalardan sağlanmıĢtır.

Enhancer ise eukaryotik DNA diziliĢ sırasında transkribe edilen bölgeden belli bir

uzaklıkta bile olsa transkribe olan bölgenin transcipsiyonunu arttıran DNA diziliĢ sırasına verilen addır.

ġekil 20. SV40 bir klonlama aygıtı olarak kullanılabilir. Klonlama esnasında sokulan (DNA) ile virüsün bir kısmı yer değiĢtirir. Beraber normal helper (yardımcı) virüs yardımı ile hala replike olur.(Rekombinant olmayan SV40). Helper virüsü yardımı olmaksızın, ya plazmıt gibi çoğalır yada konukçu kromozomuna eklenir. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics

(Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)



37

BĠTKĠ VEKTÖRLERĠ

Yabancı genlerin bitki hücrelerine konulmasında en iyi çalıĢılan sistem doğal olarak mevcut Krown genleri tumor sistemidir. Toprak bakterisi Agrobacterium tumofaciens birçokdikotiledon bitkilerde Krown galerileri adı verilen tümöre neden olur.

Esas olarak Krown galerileri ise transforme olmuĢ bitki hücresidir. Bu hücreler bakteri içinde bulunan tümör özendirici adı verilen Tumor Inducıng (Ti) plasmidlerı aracılıgı transformeolmus bıtkı hucrelerıdır. Plazmidin belli bir bölgesine T-DNA (transfer edilenDNA) parçası adı verilir.

Eğer plasmidin T-DNA kısmı konukçu bitki hücre kromozomuna integre olursa transformasyon oluĢur. Krown galeri hücreleri opın adı verilen bir cins aminoasit türevi üretir. Bu unsur A. tumofacıen‟sin ihtiyaç duyduğu bir unsurdur.

Bu sistem kullanılarak genetikçiler transformasyon iĢleminin nasıl olduğunu anlamıĢlardır. Bu süreci bitkilerde gen aktarımı için kullanmıĢlardır. Genetikçilerin çalıĢması

büyük oranda E. coli maya ve meyva sinekleri gibi model bireyleri bitkilerde belirlediktensonra çalıĢmalar hız kazanmıĢtır.

Bu konuda en büyük ilgiyi çayır otlarından Arabıdopsıs thalıana almıĢtır. Bu küçük bitki bitki genetiği çalıĢmaları için idealdir. Çünkü genomu çok küçük olup (5) kromozomda 100 milyon baz çifti (2 nükleosu) bulunur.

Bu miktar mayaların (5) katı E. coli‟nin (20) katıdır. Dolayısıyla bu genom büyüklüğünde iĢlem yapmak genomu tamamen analiz etmek mümkün olacaktır.

Bitkiler çok sayıda yetiĢtirilerek her bitkinin binlerce tohumunu almak mümkün olduğu düĢünülürse bu organizma genellikle çalıĢmak için oldukça uygundur.

ġekil 21. Arabidopsis thaliana bitkisinin cüce formu. (Robert H. Tamarin‟in Principles of

Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)



38

YABANCI DNA’NIN EUKARYOTĠK HÜCREDE FAALĠYETĠNĠN SAĞLANMASI

Yabancı DNA eukaryotik hücrelere bakteriyel transformasyona benzer tarzda konulur. Ancak bu durumda TRANSFECTION adı verilir.

Çünkü daha önce açıklandığı gibi eukaryotlarda transformasyon kanserli büyümeyi ifade eder Eukaryotik organizmalar yabancı (DNA)‟yı aldığı zaman Transgenik adını alır.

Hayvan hücreleri yada hücre duvarı uzaklaĢtırılmıĢ bitki hücresi (protoplast) yabancı kromozomu yada (DNA)‟yı direkt çevreden Kalsiyuum bifosfat mevcudiyeti halinde düĢük etkinlikte kendi içine alır.

,Bu etkinlik DNA‟yı direkt olarak injekte etmek suretiyle arttırılabilir. Mesela Transgenik fare Ģimdilerde diĢi farelere uygun hormonal hazırlık uygulanarak sağlanan oosite yada bir yada iki hücreli emriyo halinde iken yabancı DNA injekte edilebilmektedir(ġekil23).

ġekil 22. Fare oositininn çekirdeğine DNA Ġnjeksiyonu. Oosit pipet içerisine çekilirve daha sonra injekte edilir. (Ro bert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)

KlonlanmıĢ DNA‟dan yaklaĢık 2 picoliter (2x10-12 litre) hücreler alıcı konukçu diĢi uterusuna reimplante edilir(yeniden yerleĢtirilir.)Bu injesiyonların yaklaĢık %15‟inde yabancı DNA embriyoya incorpore olur.

Transgenik hayvanlar yabancı eukaryotik genlerin kontrol ve açıklanması için faydalıdır.1988‟de transgenik fare patenti alınan ilk genetik olarak düzenlenmiĢ kansereeğilimli patenti alınmıĢ ilk organizmadır.

Transgenik fare kanser üzerinde çalıĢmalar için idealdir. Farelerde kemirgen büyüme hormonu geni ile transfecte edilmiĢ fare baĢarı ile elde edilmiĢtir. Ġnsan pıhtılaĢma faktörü üreten Transgenik koyun elde edilmiĢtir. En son Rekombinant DNA uygulaması bilimsel tartıĢma yaratan bir olgu olarak koyun klonlanması ile 1997‟de elde edilmiĢtir.



39

Transfeksiyon Retro virusler ile de yürütülebilir. Retroviruslar RNA içeren viruslarolup tersine kopyalama enzimini içerirler. Mesela insan akyuvar hücrelerinde“Adenosındeamınaz” enzimi eksiktir.

Bu eksiklik Retrovirus vektör infeksiyonu ile giderilir. Kemirgenlerde lösemi

Ģekillendirmekten sorumlu retrovirus olan “Moloreu murin losemi virusu” böyle bütün genler için düzenlenmiĢ virusun bütün genleri çıkarılmıĢ “neomisin” dayanıklılık antibiyotik iĢaretleyici ile yer değiĢtirilmiĢtir.

Virus hücre yüzeyine bağlanır ve hücre içine alınır. Bunun RNA‟sı tersinir kopyalama ile DNA‟ya çevrilir ve DNA hücre kromozomları ile birleĢip ona incorpore olur.

Bu oldukça yüksek modifiye edilmiĢ virusun bir yardımcı Helper virusu olmadıkça hücrelere hücum edip bozması mümkün değildir. ġekil 20‟deki (SV40) virusu modifiye edilmiĢ Moleney virusu önemli genler uzaklaĢtırıldığı için Helper virus olmaksızın baĢarılı infeksiyon baĢlatamaz.

Diğer üç çeĢit teknikte eukaryotik hücrelere Rekombinant DNA konmasında kullanılır. Bu teknikler elektroporasyon,Lıpozom aracılığı ile tranfer. biolistik transfer‟dir. Elektroporasyon dıĢ kaynaklı eksojen DNA‟nın yüksek voltajlı elektriğe maruz kalmıĢ hücreye alınmasıdır. Bu elektrik alanı mühtemelen hücre membranından geçici porlar oluĢturmakta ve eksojen DNA içeri girmektedir.

Lipozom aracılığı ile transfer yontemınde ise yabancı DNA suni membranlı bağlı lipozom adı verilen kesecikle kaplanır. Bu lipozomlar DNA‟yı hedef hücreye aktarmada

transf ekte olmuĢ neticede transfekte DNA ile kodlanan protein üretilmiĢtir.

Bir çok nedenlerin yanısıra çift membranlı hücre duvarı rekombinant DNA aktarımı için uygun olmaması yanısıra DNA‟nın mitokondriye yada kloroplastlara konması Ģimdilik genetik mühendisliği için zor hedeftir.

Yakın zamanlarda hem mitokondrial ve kloroplastlarla transfeksiyon için biolistik (Biyolojik Balistik) yöntemler geliĢtirilmiĢtir. Bu yöntemde rekombinant DNA Tungsten mikro projectle kaplanır. Sonra bu organizmalara gen tabancası adı verilen fırlatıcı ile fırlatılır.

NAKAUT (KNOCKOUT) FARE

Belli bir lokustaki belli bir fonksiyonu olmayan allel için homozigot kılınmıĢ transgenik fareyi tanımlar. Normal olarak bir fareyi transfekte etmek için kullanılan gen fare genomunda ise tesadüfî bir yere inkorpore olur. (eklenir)Ancak bazen, eğer yabancı gen Krossingover olmadan homologunun aksi yönünde yer alırsa yabancı gen orijinal genle yer değiĢtirir. Bu avantajı dikkate alarak Knockout Fare (Nokaut Fare) tekniği oluĢturulmuĢtur.

Bu teknik de normal fare oositi kusurlu genle transfekte edilir ve bazı vakalarda bu normal kopyası ile yer değiĢtirir ve sonuçta fare bu gen için heterozigot olur. Böyle iki

transfekte edilen genin fonksiyonları gözlenmemiĢ olacaktır. Böylece bilim adamları bir genin fare yaĢamı için hayati olup olmadığını, değilse kusurlu fenotipin ne olduğunu anlamıĢ olacaklardır. Bu teknoloji geliĢme

ve imminoloji çalıĢmaları için çok uygundur.



40

KlonlanmıĢ normal genın arasına antıbıyotık dırenc genı gıbı marker katıp fonksıyonu bozulduktan sonra fare embrıonık koken hucrelerıne verılırse bazı hucrelerde bu gen normal genle yer degıstırır.Daha sonra bu hucreler blastomer safasında embrıolara ınjekte edılerek homozıgot mutant genı tasıyan fareler elde edılmıs olur.

Mesela “Mulleran” engelleyici unsuru için gen “knock out” edilirse erkekler kısır olur. Çünkü diĢi genital organlarına sahip olur. Bu deneyler cinsiyet belirlemesi genetik yönleredaha önem verilmesini sağlayacaktır. Halen her yıl 150-200 knock out deneyisergilenmektedir.Ayrıca nakavt genler ınsanlarda genetık hastalıkları calısılmasında model hayvan olarak kullanılır.

BĠLDĠRĠCĠ SĠSTEMLER

Bu sistemler bir genetik yapı olup araĢtırıcıya belli bir l iliĢkili lokusun fenotipik açıklaması suretiyle aktif olup olmadığını belirtir.

Mesela “Luciferaz” isimlı bildirici(reporter) genın yada urununun varlıgı Luciferin ile yıkandığında parıltılı kızarık görünüĢü vermesi ile belırlenır. Kısaca bu sistemler transfeksiyon (Yabancı DNA‟nın eukaryotik hücreye sokulması) deneyinin baĢarılı olup olmadığını belirleyen sistemlerdir. Bitkilerin Agro Bakterium Tumofaciens‟in (Ti) plazmidi ile transfekte edildiğini düĢünelim.

Eğer bir bitki (Ti) plazmidi içeren A.Tumofaciens ile infekte edilmiĢ ise konukçu bitkiye T-DNA bölgesini transfer ederek onu tranfekte eder. Bu Ģekilde T-DNA‟yı alan hücreler T-DNA ile transfekte edilmiĢ olan ve „opin‟ maddesi adı verilen bir çeĢit aminoasit türevinin üretimi özendirilir.

Bu madde bakterinin gıdasıdır. (Ti) plazmidi hakkında yapılan deneylerin çoğu konukçu bitkiye aktarılan diğer genleride içermektedir. Böylece aktarılan genler için transgenik bitkiler oluĢturulmuĢ olur.

Böyle bir denemede de Tütün bitkisi ateĢ böceğinden alınan Luciferaza genini içeren (Ti) plazmidi ile transfekte edilmiĢtir. Bu genin ürünü ATP bağımlı Luciferin oksidasyonunu katalize eder ve dıĢarıya ıĢık salar.

Transfekte bitki Luciferin ile sulanırsa ateĢ böceği gibi ıĢıldar. Böyle denemelerin önemi ıĢıldayan bitkilerden ziyade, bu ıĢıldamanın belli özel genin etkisini bildirmesini

sağladıgı hususudur. Daha ileri denemelerde belli özel genlerin promatör ve enhancer (zenginleĢtirilmiĢ) bölgeleri Luciferaze genine eklenebılır.

Sonuçta Luciferaze sadece promatörler aktive edilince iĢlev görmüĢtür, üretilmiĢtir. Bu durumda bitkinin ıĢıldayan bölgesi transfekte genin aktif olduğu yerleri gösterir.

Daha yakın zamanlarda incelene bildirici sistemler Jöle balığı (Jelly Fish)‟den gelen geni kullanır. Bu gen yeĢil floresans proteinidir. Bu sistemin önemi Luciferazda olduğu gibi

bir Ģey katmaya gerek olmaksızın ultraviole ıĢığında parlar.

YeĢil floresans protein geni incelenen gen ile kombine edilip transfeksiyon yapılır.

Eğer istenen gen baĢarı ile geçirildiyse ultraviole ile aktive edildiğinde bildirilmesi yani sonucun görülmesi gerekir.



41

RESTRĠKSĠYON HARĠTALAMA

Restriksiyon enzimlerinin bir çift kollu DNA‟da yaptıkları kesik sayısı bu DNA segmentinin uzunluğuna, diziliĢ sırasına, belli enzimin tanıma diziliĢ sırasında baz çifti sayısına bağlıdır. Prokaryot ve eukaryotlarda gen faaliyetlerinin unsurları aĢağıda kısaca

özetlenmiĢtir.

Prokaryotlar ve eukaryotlarda transkripsiyon sonrası (post transcription) ve translasyon sonrası (post translasyon) modifikasyonlarda farklılıklar olabilmektedir.

Gen açıklamasının kontrolünde en önemli “yer” trankripsiyonun baĢladığı, RNA polimerazın baglandığı yer olan promotordur. DNA zincirinde transkripsiyonun bitiĢ yeri terminatör (sona erdirici) diziliĢ sırası ile belirlenir.

Promotor yanı sıra eukaryotlarda DNA uçlarındaki enhancer bölgesi promotorun iĢlem yönüne ters yönde yer alır ve transkribe edilen yerden belli bir mesafede bile olsa ilgili

bölgenin transkripsiyonunu arttıran ayarlayıcı bölgedir.

Klon DNA‟sın tanımlamanın ılk adımı onun Rstrıksıyon harıtasını yapmaktır.Restrıksıyon harıtası klonlanmıs bır DNA parcası uzerınde RE kesme bolgelerının sayısının sıralanısının ve aralarındakı uzaklıgın jel elektroforezı ıle parca buyuklugu bılınen

bır molekul ıle karsılastırılarak belırlenmesıdır.

DiziliĢ sırası buyuklugunun Ģans etkisi oluĢma ihtimali ilgili sıra uzunluğunun

r.

Mesela Hınd II enzimi (SV40) tümör virüsü halka DNA‟sını iki parçaya böler. Bazı restriksiyon enzimleri E.Coli DNA‟sını yüzlerce parçaya böler Restriksiyon enzimlerinin DNA örneği üzerine etkisinin ürünlerine restriksiyon kesintileri (restriction digest) adı verilir.

Elektroforez kullanarak bu restriksiyon kesintilerinin büyüklük sırasına göre ayırabiliriz. Bu teknik aĢağıda anlatılacaktır. Bu teknik sayesinde orijinal gendeki yada DNA

parçasındaki restriksiyon yerlerinin yeri belirlenmiĢ olur.

Böylece restriksiyon tanıma yerlerine göre bir harita yapılabilir. Sonuçta bu tanıma yerleri arasındaki fiziksel mesafe hesaplanır.

Böyle restriksiyon haritaları çeĢitli nedenlerden oldukça önemlidir. Söz gelimi (SV40) unsurunda (DNA) replikasyon baĢlangıcında kısa sürede radyoaktif nükleotid trifosfatlı timidin katıldığında radyoaktiflik sadece bir restriksiyon parçasında gözlenir.

Bu durum (SV40) replikasyonunun bir özgün noktadan baĢladığını ve bu noktanın (SV40) belli yer kromozomunun, belli yerinde yer aldığını gösterir.

Ayrıca bu Ģekilde restriksiyon haritaları araĢtırıcılara genetik haritalar ile kromozom fiziksel haritalarını iliĢkilendirme olanağı verir. DNA‟daki Delasyon, inversiyon ve restriksiyon değiĢimleri gibi bazı fiziksel değiĢimler genetik haritalardaki yeri bakımından

belirlenebilir.



42

Restrıksıyon harıtaları klonlanan parcanın uzunlugu hakkında fıkır verdıgı gıbı RE kesım bolgelerınıde belırtır. Bu bilgiler DNA değiĢikliliklerini anlamamızı sağlar. Ayrıca türlerin farklılaĢmasının anlaĢılması bu çalıĢmalarla anlaĢılması daha iyi anlaĢılır.

Parçacık boyutundaki farklılıklar, restriksiyon parçacık ebat polimorfizmi (R.F.L.P-

Restriksiyon Fragment Length Polimorfizim) olarak adlandırılır ve genlerin tam yerlerinin belirlemesinde önemli bilgiler sağlar. Ayrıca bireylerin akrabalığı yada benzerliğini anlamaya yardımcı olur.

Restriksiyon kesintileri kısa DNA segmentlerinin izole edilmesi ve diziliĢ sırasının analiz edilmesi bakımından mümkün olur.

ġekil 23. Restriksiyon endonükleazlar ile sindirilmiĢ parçaların elektroforesi ıle restriksiyon haritaları. (a)- (A) ile gösterilen restriksiyon yerlerini gösteren orjinal DNA parçası. (b) kısmi ve toplam sindirilmiĢ kısımların bandlarını gösteren agaroz jel bandları. Yıldızlar ise uçları iĢaretlenmiĢ segmentler aracılığıyla üretilen radyoaktif bandları gösterir. Soldaki skala, baz çiftleri için molekül agırlığı değerlerini gösterir.(Örneğin: 800bp,700bp). Toplam sindirilmiĢ(kesılmıs) kısımlar 400.200.100 ve 50bp‟lik fregmentler üretir. Ayrıca 200 ve 100bp‟lik fregmentler iĢaretlenmiĢtir kısmi sindirilmiĢ unsurlar altı ilave bant verir.

NOT; Kısım kesim (RE) yerlerinin tümü değil bir kısmı kesilmis olmayı tanımlar. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill),isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)



43

(R.E.)‟ler ile kesmeden önce DNA‟nın (5 ) ucu polinükleotitkinaz enzimi kullanılarak radyoaktiflenerek (32P) ile iĢaretleyecektir. Bu enzim çift kollu DNA‟ya etki ederek iĢaretleneceklerdir.

DNA‟ların kesiminden sonra uygulanan elektroforezi sonucu 200 baz çifti ve 100 baz

çifti (bp) uzunlukta bantlar radyoaktif iĢaretlenmiĢ olacaktır. Bu durum bu segmentlerin(DNA) parçalarının termini (ucu) olduğunu gösterir.

Ancak ortalardaki parçaların diziliĢ sırası hakkında hiçbirĢey bilinmemektedir. Diğer segmentlerin diziliĢ sırası bu parçalanma sürecini yavaĢlatır.Kısmi kesim iĢlemi yapılarak bunlarda belirlenebilir.

(RE) ile kesim tamamlanmasına izin vermeden (RE) kesim yerleri henüz ayrılmamıĢ parçalardan oluĢuyorsa buna kısmi (partial) kesim (Digest) adı verilir.

Eğer reaksiyon soğutulur yada kısa süre sürdürülürse bütün restriksiyon yerlerinin kesilmemesi sağlanmıĢ olur. Bazı DNA parçaları bütün yerlerinden kesilmez iken bazıları bir,

bazıları iki, bazıları üç yerde olmak üzere restriksiyon yerlerinden kesilmiĢ olacaktır. Böyle

bir kısmi kesimin sonucu 24. ġeklin sağında gösterilmiĢtir.

RESTRĠKSĠYON HARĠTALARININ YAPIMI

Bu maksatla bircok usul bulunur .Ancak prensıp sozgelımı 2 RE enzım kullanılıyorsa bunların her ıkısını ayrı ayrı ve her ıkısını bırlıkte kullanarak elde edılen kesıklerin buyukluklerı yorumlanarak enzım kesme yerlerının sıralaması(harıtası)Ģeklindedır.

Yukarıdaki Ģekil 24‟de gösterildiği gibi Hipotetik bir DNA parçasını, (A) isimli restriksiyon enzimi ile keselim. Bu kesilme parçaların Agaroz jelde elektroforeze tabi tutalım.

Agaroz jel özellikle nispeten büyük DNA parçacıklarında hareket etmesini sağlayacak poroziteye sahiptir.(R.E) DNA‟yı üç yerden keser ve 200,50,400,100 baz çifti uzunlukta parçacıklar oluĢur.

ġeklin solunda görülen band değiĢimi modeli sözü edilen parçaların elektroforezi sonucu oluĢan görünümdür. Burada daha küçük parçacıkların daha büyük olanlardan daha hızlı hareket ettiğine dikkat edilmelidir.

Segmentlerin büyüklüğü, ebadı bilinen standartlarla karĢılaĢtırılarak tayin edilir. ġekilde solda bir skala kolu verilmiĢtir.

Ancak büyüklüğü bilinen standartların bantları Ģekilde gösterilmemiĢtir. Kromozom üzerinde bu segmentlerin diziliĢ sırası jelden açıkça belirlenerek, çeĢitli metodlar kullanılarak orjınal DNA parçası üzerindeki restriksiyon segmentlerinin sıraları saptanır.

Bu jelden segmentlerin diziliĢ sırası belirlenebilir. Bu jel (4) orjinal segment ile beraber (6) yeni segment içerir ve her biri en azından kesilmemiĢ restriksiyon yeri içerecektir.

Toplam kesinti jelinden dolayı biliyoruzki 200 ve 100bp‟lik segmentler dıĢarı taraflardadır. Bunlar radyoaktif iĢaretlidir. Ayrıca 50 ve 400 bp‟lik iç taraflardadır.



44

ġekil 24.ġekil 23„teki Ģekiller yeniden yapılanmaların basamaklarını gösteriyor. Bunlar toplam ve kısmi restriksiyon kesiklerinden oluĢur. Yıldızlar (32p )uç iĢaretlerini gösterir. Toplam kesiklerden 100 ve 200 bp‟lik ve uç segmentler oluĢur.(a)- 50 ve 400 bp‟lik segmentlerde olduğundan toplam kesiklerden elde edilen DNA içinde sadece bazı bandlar (fragmentler) kısmi kesiklerden oluĢur. Bunlarda 200 bp‟lik fregmentlere

bitiĢik,50(Birlıkte,200+50=250) ve 100 bp‟ye bitiĢik, 400 bp(bırlıkte,400+100= 500) fregmentleri oluĢturur. (b) ve (c) basamağı kısmi kesiklerde iĢaretlenmemiĢ 450 bp‟lik kısımların varlığı, 50 ve 400 bp‟lik(birlikte,50+400=450‟lık kısımları izole eder.(d) Nihai yapı oluĢur.(e)-Bütün fregmentler bu düzenlemeye uyar.(Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill),isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)



45

ġekil 25. Aynı DNA parçası üzerinde iki farklı restriksiyon endonükleaz ile (A ve B) ile oluĢturulan tanıma yerlerinin yayılımı. (a)-Gerçek düzenleme, (b)-Hipotetik alternatif düzenleme, (c )-Sadece (a) veya sadece (b) den oluĢan veya her ikisinden oluĢan toplam restriksiyon kesikleri (digest)‟nin elektro forezi. Yıldız iĢareti radyoaktivite iĢaretlenmesineiliĢkin bandları gösterir.(a)-Buradaki sıralar, bütün kesiklerde bulunan tüm bandlara uyumludur. (b)-Buradaki düzende uyum yoktur. Sözgelimi (b) nin sıralanma düzeninde ve iĢaretlemede 150bp parçacıkları anlaĢılır. Oysa bu kısım toplam kesikte yoktur. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill),isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)

ġekil 25 de bu durum gösterilmektedir. Kısmi kesimde 250 bp‟lik segment değil 150 bp‟lik segment bulunur. Bu durum bize 50 bp‟lik segmentin biraz içeride yer aldığını ve 200 bp‟lik uca bitiĢik olduğunu söyler.



46

Burada 500 bp‟lik segmentlerde vardır ancak 600 bp‟lik segment yoktur. Bu durum bize 400 bp‟lik segmentin 100 bp‟lik uca bitiĢik olduğunu söyler. ĠĢaretlenmemiĢ 450 bp‟lik segment ise 400 ve 50 bp‟lik segmenlere bitiĢik olduğunu , DNA‟nın içinde yer aldığını gösterir.

Bu durumda açık anlamı olan orijinal DNA‟nın sıralaması belirlemiĢ oluruz. Neticede belirli bilinen DNA uzunlukları ile ayrılmıĢ restriksiyon enzimlerin tanıma yerlerini gösteren bir harita yapılmıĢ olur. ġekil 24 ile 25‟i karĢılaĢtırdığımızda durum daha açık olarak belli olmaktadır.

ġekil 26: 7 kb büyüklüğündeki bir DNA parçasının restriksiyon haritasının elde edilmesi. Bir DNA örneği HindIII, diğer bir DNA örneği SalI ile ve bir diğeri de hem HindIII, hem de SalI ile beraber kesilir. Sonuçta oluĢan parçalar jel elektroforezi ile birbirinden ayrılır. Ayrılan parçaların büyüklükleri bitiĢik hatta yürütülen ve parça büyüklükleri bilinen bir DNA markeri ile karĢılaĢtırarak saptanır. HindIII, ve SalI ile oluĢabilecek kesim

parçalarının büyüklüklerinden yararlanarak iki tane restriksiyon kesim modeli önerilir. Önerilen parça büyüklükleri ile jelde gözlenen büyüklükler karĢılaĢtırıldığında, Model 1 „in doğru olduğu görülür. (William S. Klug, Prof Dr. Cihan Öner. Genetik Kavramlar, Palme Yayıncılık, 2003‟ten modifiye edilerek alınmıĢtır.)



47

ÇĠFT KESĠNTĠ

Pratikte restriksiyon haritaları birçok farklı restriksiyon enzimi ile yapılır. ġekil 26‟da Ģekil 24‟teki kullanarak baĢka bir çalıĢma sonuçlarını gösteriyor. Burada ikinci olarak endonükleaz (B) enzimi kullanılmıĢtır.

Biraz önce belirtilen metodu kullanarak, endonükleaz kullanılarak iki kesimden (B) segmentinin 350,250,150 baz çifti ebadında segmentler elde edilir.

Bu iki haritanın nasıl bir arada inceleneceğini anlamak için (B) segmentinin (A)‟ya göre solda yada sağda yer alıp almadığına bakılmalıdır. Eğer orijinal DNA‟yı her iki enzimle aynı anda muamele edersek, çift kesinti oluĢturursak diziliĢ sırası açıkça belirlenmiĢ olur.

Bu iki sıra Ģekil 30‟da gösterilmiĢtir. Burada çift kesimle farklı bir tahmin yapılmıĢtır. Ġlk diziliĢ sırasında (a) 200bp‟lik radyoaktif iĢaretlenmiĢ üç segment olduğu tahmin edilmiĢtir.

Ġkinci diziliĢ sırası (b) ise iĢaretlenmiĢ 200 bp‟lik segment. 150 baz çifti geriden kasılmıĢ olup 200 bp‟lik iĢaretlenmiĢ segment değildir. Çift kesim ise iĢaretlenmiĢ 200 bp‟lik segmentler (a)‟da belirtilen sırayı gösterdiği anlaĢılır.(a)‟daki bütün diğer hususlar çift kesim sonuçları ile ilgilidir.

Restriksiyon haritaları bize DNA parçalarının fiziksel haritalarını verir ve belli bazı bilinen DNA uzunlukları ile ayrılmıĢ (R.E.)‟lerin etkilediği yerleri gösterir.

Bu teknik bilinen bir pozisyondaki kısa DNA segmentlerinin diziliĢ sıralarının bilinmesini sağlar. Ayrıca DNA‟nın fiziksel haritalanmasının genetik harita ile karĢılaĢtırılmasını ve mutasyon gibi bazı diğer özel iĢaretleyicilerin yerlerinin anlaĢılmasını

sağlar.

RESTRĠKSĠYON PARÇACIK UZUNLUĞU POLĠMORFĠZMĠ

Kısaca R.F.L.P.( Restriksiyon Fragment Length Polimorfizim) olarak bilinen teknikrestriksiyonun enzimleri ile oluĢturulmuĢ kesintilerin elktroforezi ile elde edilmiĢ bant modelini tanımlar.



48

ġekil 27. Restriksiyon fregmentlerinin uzunlukları polimorfizmi (RFLP) denilen analiz. A1alleli(kromozomu) 750 bp‟lik kısma bağlanma ile anlaĢılan bir gen segmentidir. Allel (kromozom) ikide (A2) , allelin (A1) solundaki restriksiyon yeri değiĢmiĢtir. Bu sonda ile

hıbrıdıze olma dolayısıyla 750 bp yerine, 1400 bp uzunlukta parçalar tanınır. Southern Blotting (Southern isimli araĢtırmacının geliĢtirdiği bant aktarımı) sürecinde bu iki allelden iki farklı band görülür. Oklar restriksiyon yerlerini gösterir. Buna gore heterozıgot bır bırey soz konusu ıse her ıkı bandda gorulur(Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)

ġekil28.DNAparmakizinin (adli)kullanımı. Bir cinayet iĢleminde, bir mağdur(kurbanın) (v), savunmacının (D) Southern Blotting tekniği ile elktroforez DNA bantları oluĢturulmuĢ. Savunmacının

gömlek ve pantolon yapısından alınan(shırt ile gosterılen sutundakı bantlr) kan örneklerini gösterir. Bu model açıkça kurbanın kanına uyar. Savunmacının ise kendi kanına uymaz .Bütün diğer lekeli kanlar dağılımı Ģeritleri , kontrol ve ebat

büyüklüğütayinstandartlarını içerir.Pantoldaki Kan lekesının kurbandanolmama ihtimaliotuz üç milyondabirdir.Bu da yeryüzündeki bir insana

tekabül eder. Ancak bu olasılık ırklar içi ve etnik alt populasyonun değiĢkenliği hakkında, varsayımlara bağlı olarak zıt uyumludur. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth




49

Bu teknik özellikle insan gen haritaları ve Adli Tıpta önemli kolaylıklar sağlar. Ġnsanın tüm genomunu restriksiyon enzimi ile kesilmiĢ kesikleri oluĢturduğu bir restriksiyon enziminden binlerce parçacık oluĢur.

Bu kesintilerin Southern isimli araĢtırmacını geliĢtirği Blotting‟i ve ( DNA-RNA yada

DNA-DNA birleĢmesi için DNA‟yı agaroz jelden nitrüselüloze aktarıp bantlar halınde gormek) için çeĢitli özgün sonda (probe)‟lar geliĢtirilmiĢtir.

Genetik varyasyon genellikle ikinci bir allel formundan kaynaklanır. Herhangi bir mutasyon sonucu Restriksiyon yeri eksildiğinde DNA‟nın büyük bir parçası eksilmiĢ olur. Bazı prob‟lar birçok alleli olan Hyper Varyabl (değiĢken) lokusları ortaya koymuĢtur(herhangi bir kiĢi bu birçok mümkün allelden ikisini taĢır).Böylece populasyon içinde bu lokuslar bakımından varyasyon söz konusu olacaktır. Böyle Hyper değiĢken lokuslar birçok kısa, 10 ile 60 arasında değiĢen baz çift sayıda ikili tekrarlar içerir. Özellikle eĢit olmayan Krossing-over dolayısıyla bu lokuslardan biri aracılığıyla çok varyasyon gözlenir.

Bu lokuslara kısaca VNTR sembolu ıle gosterılerek (Variable Number Tandem Repeat) DeğiĢken sayıda ikili tekrarlı lokus adı verilir. Yani kısaca ikili tekrarlar nedeniyle Hyper değiĢken lokus. s öz konusudur.

Muhtemelen değiĢkenlik eĢit olmayan krosingoverden kaynaklanır. Bu çeĢit değiĢkenlik sonucu, bu VNTR lokuslarından birini sondalama birçok açıdan varlığını ortaya koyacaktır.

Böyle kesintilerin Southern Blotting iĢleme maruz bırakılması DNA parmak izi elde edilmesine yol açar. Bu olgu adli tıpta önemli kullanım alanı bulur.

Bir cinayet ardında bırakılan semen (ersuyu) yada kan örneğinin DNA modeli ile karĢılaĢtırılabilir. Bazı vakalarda aynı prob (sonda) ile çok sayıda farklı doku belirlenir. Bunların herbiri Southern Blott‟da birçok bant verirken insanların çoğu özgün bant modeli gösterir.

A.Jeffrey geliĢtirdiği bir sistemde bir probe her kiĢide 50 yada daha çok bandoluĢturur.

Eğer Jeffrey‟in sonraki bant modelini kesinleĢtirmek için kullanılırsa iki modelin tam tamına benzer olma olasılığı neredeyse son derecede küçüktür. Bu teknik kanda parmak

izinden elde edilen bilgiye göre daha büyük tanımlama gücüne sahiptir.

POLĠMERAZ ZĠNCĠR REAKSĠYONU

Müze örnekleri, kurumuĢ örnekler, cinayet yeri kalıntıları, fosil gibi birçok vakalar, mevcut DNA örnekleri çok küçük miktarlarda yani laboratuvar çalıĢmasının gerektirdiği minimum miktardan azdır .

Kary Mulin 1983‟ te Polimeraz Zincir Reaksiyon (P.C.R.= Polimeraz Chain Reaksion) adı verilen yöntemle bu çok küçük miktarları çoğaltma tekniğini bulmuĢtur.



50

Burada tek ihtiyaç duyulan, ilgi duyulan kısmın hangi yanında olursa olsun nükleotid diziliĢ sırasıdır. Bu bilgi bir primer oluĢturmak için gereklidir. Primer oluĢturulduktan sonra

primerler arasındaki diziliĢ sırası çoğaltılır.

Primer deyimi DNA replikasyonunda 3‟-5‟ yönünde tek kollu uçla devam eden çift

kollu DNA uzunluğunu tanımlar. Bu teknikte, örneğe bazı primerler ve çeĢitli maddeler katılır.

C ye düĢürülerek primerlerin kendi bütünler diziliĢ

sağlanır. Daha sonra replikasyon yeni bir döngüsü tekrar baĢlatılır. Bu durum Ģekil 29‟ta gösterilmiĢtir.

Bu döngünün çeĢitli safhaları sıcaklık ile kontrol edilir. Çünkü denatürasyonda primer eklemesi, DNA replikasyonu farklı sıcaklıklarda gerçekleĢir. YaklaĢık yirmi döngüde bir milyar kopya yapılır.

Bu teknik kaplıca bakterisi olarak bilinen Thermophylus Aguaticus‟den elde edilir. Sıcaklığa dayanıklı DNA polimeraz yardımı ile daha da etkin yürütülebilmektedir.

Bu yüzden her döngü sonunda reaksiyon ortamına yeni unsur katılmaz. Bunun yerinedöngü (PCR) aygıtına müdahale edilmeksizin baĢlıca su banyosunu programlayarak böylece isabetli bir Ģekilde reaksiyon karıĢımını saran su sıcaklığını hızla değiĢtirerek döngü devam ettirilir. Bazı özel PCR aygıtları aynı anda 96 örnekle çalıĢabilir.

(P.C.R) tekniği mikrosatellit DNA adı verilen yapıları çoğaltılarak, DNA fingerprint

(parmak izi) oluĢturmada kullanılabilir. DNA parmak izi çeĢitli değiĢken lokuslar için sondalanmıĢ DNA kesintilerine uygulanır.

(Jel) elektroforezi ile oluĢturulan band modeli tanımlanır. Mikrosatellit DNA ise genom boyunca dağılmıĢ kısa DNA diziliĢ sırası tekrarları demektir.

Mesela Sitozin-Adenin (CA) eukaryotlarıda onbinlerce kere tekrarlanır. VNTR lokuslarında insanlar arasında bu çeĢit tekrarların sayısı bakımından temel crossingover hatalarından ileri gelen sayısız ölçüde varyasyon vardır.

VNTR lokuslarından farklı olarak, bu lokuslardan birinin (PCR) ile çoğaltılması

Restriksiyon kesimi, Southern Blotting sondalama olmaksızın sağlanabilir.

P.C.R. direk elektroforez sonuçlarını verir. Gerekli olan tek Ģey, herhangi bir mikro satellit lokusunu saran primer diziliĢe sahip olmaktır. P.C.R. halen molekül genetiğinin önemli bir laboratuvar aracı olmuĢtur.Böylece araĢtırıcı yada adli tıp için ihtiyaçduyulan DNA bulgularının çoğaltılması mümkün olur.

RekombinantDNA tekniğinin en önemli sonucu DNA diziliĢ sırası belirlenmesidir.Rekombinant DNA teknolojisi,ıle küçük iyi tanımlanan, kromozom bölgelerinin izole edebilme yeteneği DNA diziliĢ sırası tekniklerinin geliĢmesine neden olmuĢtur.



51

ġekil 29. Polimeraz zincir reaksiyonu.(DNA)

denatüre edilir.Her ikikolon ucundaki diziliĢ sıra sıra bütünler,primer adı verilen oligonükleotitlerkatılarakreplikasyon sürdürülür.Bu basamaklar(DNA)denatürasyonuveya primer bağlama ya

da (DNA)replikasyonunauygunsıcaklıklar oluĢturularaksağlanır. Replikasyondansonrayeni bir döngü baĢlar. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics

(SixthEdition,WCB/McGraw-

Hill),isimlikitabından modifiyeedilerekalınmıĢtır.)



52

DNA DĠZĠLĠġ SIRASI BELĠRLENMESĠ

Harvard Üniversitesinden Walter Gilbert ve Stansford Üniversitesinden Paul Berg,Kambriç (Ġngiltere) Tıp AraĢtırma Konseyinden Frederik Senger, 1980 kimya ödülünü LamdaFajına (SV40) genomuna sokarak oluĢturdukları ilk klonlama (DNA) molekülü nedeniyle

paylaĢmıĢlardır.

Gilbert ve Senger DNA diziliĢ sırası belirtmek için, bağımsız bir metod geliĢtirdikleri için ödüllendirildiler. W. Gilbret ve A.Maxam Kimyasal Metod (chemiqual degiadation) adı verdikleri DNA diziliĢ sırası tayini metodunu ortaya koydular. Kimyasal metot halen neredeyse hiç kullanımamaktadır.

Bu metod DNA‟nın belirli bazlarda kimyasal olarak kırılmasını içerir. Ġnsülin protein unsur diziliĢ sırasından ötürü, 1950 Nobel ödülü sahibi Senger, daha sonra RNA diziliĢ sırası

belirlemesi üzerine çalıĢmıĢtır.

Bu Ģekilde Senger‟in isimli araĢtırmacı, Alan Coulson isimli araĢtırmacı ile geliĢtirdiği

DNA diziliĢ sırası metodu, DNA sentezini içerir ve artı-eksi (plus-minus) yeya zincirsonlandırma metodu olarak bilinir. Daha sonra Senger ve Coulsen sonlandırıcı nükleotid kullanarak plus-minus metodu modifiye etmiĢlerdir. Bu metod dideoksi metodu diye bilinir.AĢağıda bu metodnu açıklanmıĢtır.

DĠ DEOKSĠ METODU ĠLE DĠZĠLĠġ SIRASI BELĠRLEME

Enzimatık dizi analız metodu adıda verilen bu metodla diziliĢ sırası analizi DNA sentez iĢlemleri ile sağlanır. Hatırlanacağı üzere DNA sentezi primer adı verilen, çift kollu olup, tekkollu (3‟-OH) ile nihayetlenen yapıdan baĢlar. Diğer tek kol ise tek kollu DNA ile devam eder.

Dideoksi metodunda diziliĢ sırası bulunacak DNA‟nın bir primer yapısı oluĢturulur ve replikasyonun ilerlemesi sağlanır. Zincir sonlandırıcı bir nükleotid kullanarak yapılan bir yanıltma müdahalesi ile DNA sentezi bilinen pozisyonda durdurulur.

Bu zincir sonlandırıcı nükleotidler (2‟) ve (3‟) karbon atomlarının ikisinde de (OH) eksik olan Ģekerler ile oluĢturulur. Bu sebeple di deoksi adı verilir (Ġki kere deokside).

(3‟-OH) grubu olmayan dideoksi nükleotidler DNA polimerizasyonunda kullanılamaz. Yani oluĢan klon eklenir fakat kendisine yeni nükleotid eklenemediğinden zincir oluĢumu sonlanır. Zincir sonlandırıcı‟nın varlıgı nükleotid sentezinin istenen bazda durmasını sağlar. DiziliĢ sırası belirlenen örnek (4) ayrı reaksiyon karıĢımında ayrı ayrı yerleĢtirilir. Her bir karıĢım (4) nükleotidi ve bunun yanı sıra zincir sonlandırıcı dideoksi nükleotidi de belli bir oranda içerir.



53

ġekil 30. Dideoksi nükleotidler DNA replikasyonuna zarar verilmesine(durmasına) yol açar. Dideoksi primer konfigürasyonu 3‟-OH grubu eksiklikleri gösterir. Primerkonfigürasyonunda 3‟-OH vardır ve zincir uzatma için ihtiyaç duyulur.(Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill),isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)

Mesela Timin içeren Trifosfat nükleotid havuzunda bir kısım dideoksi Timidin Trifosfat var ise büyüyen tek koldaki sentez bir süre sonra, Jablonda Adenin belirdiğinde (Adenin Timinin bütünleridir) sentez sona erer.

Böylece sonu Timin olan değiĢik uzunlukta değiĢik uzunlukta birçok parçacığı meydana gelmiĢ olur. Benzer reaksiyonlar ayrı test tüplerinde her nükleotid için yapılır ve neticede ilgili bütünler nükleotidi içeren uca sahip parçacıklar oluĢur.

Ançak reaksiyon her zaman bu Timin sır olduğu pozisyonda kesilemez. Çünkü

ddATP‟den baksa ortamda d ATP‟debulunur. Bu edenle yeni zincir sentezi tüm Timinlerin bulunduğu pozisyonlarda sonlanarak kalıp üzerinde her Timin nükleotidi bulunduğu



54

pozisyonlar uzunluğunda DNA altornekler(tapier) de de oluĢur.

parçaları sentezlenir. Benzer reaksiyonlar diğer

Her karıĢımda sonuçta elde edilen parçacıklar elektroforeze tabi tutulursa meydana gelen band modeli yeni sentezlenen DNA‟ya göre (Jel) den okuyabilir. ġekil 31‟te bu durum

gösterilmiĢtir.

DiziliĢ sırası belirlenecek DNA„nın küçük bir bölmesi (9) baz çifti uzunluktadır. Bu diziliĢ sırasını belirlemek için bu çift kolun bir kolu Ģekilde gösterilen yapıya getirilmelidir. DiziliĢ sırası belirlenecek (DNA), yeni (DNA) sentezi için model olmalıdır. Bu yapıya Primer Konfigirasyonu oluĢturma denir.

ġekil 31. Dideoksi metodla DNA diziliĢ sırası analizinin baĢlangıç basamakları.Yıldızlar dideoksi nükleotidleri gösterir.Sırası saptanacak primer konfigürasyon içine yerleĢtirilir.(a,b) dört reaksiyon karıĢımı oluĢturulur.Her biri bütün (4) normal nükleotidin yanısıra dideoksi

dideoksi nükleotidlere bütünler yapılar oluĢma anında durdurulur.(c). (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill),




55

Bu iĢlem ayrıca açıklanacaktır. Gerekli primer yapı oluĢturulduktan sonra her biri (4) nükleosid Trifosfat ile birlikte DNA polimeraz I içeren (4) alt örnek alınır. Bu nükleosittrifosfatların biri radyoaktif iĢaretlidir.

Bu iĢlem genellikle (32P Radyoaktif fosfat) ile sağlanır. Bu iĢaret bize yeni sentezlenen

DNA‟nın otoradyoaktivite ile görülmesini sağlar. (4) alt örneğin her birine dideoksit nükleotidlerden (dd) sadece biri az miktarda katılır. Yani mesela her hangi bir örnekde söz gelimi 4 deoksi NTP de olmak üzere hangisi radyoaktif ise o nükleotiden dideok formukarıĢıma katılır.

Mesela 4 alt örneklerden biri ddTTP‟yi, aldıysa diğeri dd ATP‟alır, diğer üçüncüddCTP‟yi, diğer dördüncü ddGTP‟yi alır. Bu dideoksi nükleotidler, olağan deoksi nükleotidlerle birlikte katılarak zincir sona erdirme, iĢleminin her uygun pozisyonda oluĢturulma olasılığı dikkate alınmıĢ olur. Bu olgu da ddNTP‟leri çok az miktarda olduğundan zinci sentezi rasgele sonlandırarak değiĢik uzunlukta bir çok DNA parçası oluĢur.

Eğer zincir oluĢumunda Deoksi nükleotidların yerine dideoksi nükleotid katılınca, önce bu bazın bütünleri Ģablon kolda belirince zincir sona erdirilir. Dideoksi nükleotidin vedeoksi nükleosidleri karıĢtırarak sona erdirmenin her uygun pozisyonda oluĢması sağlanır.

ġekil 35‟te Jablonun iki Adenine sahip olduğu görülmektedir. Bu yüzden ddTTP reaksiyonu karıĢımı için Adeninin bütünlerine de iki misli ihtiyaç duyulur.

Böylece ddTTP için iki mühtemel nokta vardır. Aynı Ģekilde iki mümkün zincir sona erdirme ve dolayısıyla dideoksi Timidinle sona erecek iki mümkün fragment vardır.

Bunlarda iki ve yedinci bazlarda benzer Ģekilde ve adeninle sona eren üç mümkün parçacık vardır. Bunlar bir, üç ve sekizinci bazlardır. Aynı Ģekilde Sitozinle biten üç parçacık vardır.

Bunlar dördüncü, beĢinci ve dokuzuncu bazlardır. Guaninle sona eren bir parçacık vardır, o da altıncı bazdır. Bu durum Ģekil 32‟de gösterilmiĢtir.

ġekil 32. Dideoksit metodu ile DNA diziliĢ sırası tespiti ile üretilmiĢ segmentlerin elektroforezi.Böyle bir elektroforez sıra lamanın direk oluĢumunu mümkün kılar. Yıldız iĢareti

dideoksi nükleotidi gösterir.(Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (SixthEdition,WCB/McGraw-Hill), isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)



56

Yeni sentezlenen ürünler Ģekil 31 de gösterilen reaksiyon ürünleri olup primer ve ablon uzaklaĢtırılarak elde edilmiĢtir. Her reaksiyon karıĢımı (mesela ddTTP) dideoksitidine

trifosfat içeren karıĢım olup özel ve belirli uzunlukta, elektroforezde anlaĢılabilen özel unsurlar üretir. Yanı tuplerde uzunlukları bırbırıden bır nukleotıd farklı degısık uzunlukta DNA molekullerı bırıkır.

(ddTTP) reaksiyon karıĢımı diziliĢ sırası Timinle neticelenen iki çeĢit oluĢum içerir. Bunlardan biri iki bazlık uzunlukta ,diğeri yedi bazlık uzunluktadır.Böylece Timin ve Adeninin

bütünleri orijinal DNA parçasının 2. ve 7. pozisyonunda belirir.

Ancak hem orijinal kol , hemde bütünler kol (yeni sentez)orijinal diziliĢ sırasını verir.Çünkü (DNA) iki sıralı olup bir koldaki diziliĢ sırası bütünler koldaki diziliĢ sırası ile

belirlenir. Okuma islemı bandlar aĢagıdan yukarı dogru okuyarak mesela en alttakı band (A) dır cuku ust hızasındakı o bandın bulundugu tupler (A) tasıyor Ģeklınde yapılr.

DNA sentezi bittikten sonra eski primer daha sonra anlatılacak olan bir metoda göre

uzaklaĢtırılır ve sadece yeni sentezlenen DNA parçası kalır.

Yeni replike olacak segment her reaksiyon karıĢımı için değiĢik boyutlarda olup poliakrilamid Jel üzerinde elektroforeze tabi tutularak mevcut segmentin boyutu belirlenir.

Sadece yeni sentezlenen (DNA) segmenti radyoaktif iĢaretli olduğundan otoradyografiyeni sentezlenen DNA‟nın izini gösterecektir.

Jel‟in otoradyografisinde bu durum görüleceği gibi her alt örnek primer yapılanma (sentez baĢlama yeri) da baĢlayan, zincir bitirici dideoksi baz ise neticelenen uzunlukta

parçacıklar üretir.

Böylece aĢağıdan baĢlayarak yukarı ve geriye doğru Jel okunmak suretiyle (DNA) parçasının diziliĢ sırası olarak belirlenir. Çünkü bunlar, Ģekil 33‟de gösterildiği gibi her biri merdiveni andırdığından bu Jellere genellikle „Merdiven Basamağı Jeli‟ yada „Merdiven Jel‟ denir.



57

ġekil 33. Dideoksit metoduna göre DNA diziliĢ sırasının tespiti. (Dideoksi dizilim jelinin autoradyografisi). Altta yer alan G, A, T ve C harfleri sırasıyla ddGTP, ddATP, ddTTP ve ddCTP reaksiyon karıĢımlarımlarını göstermektedir. Aynı karıĢım birden fala yürütülerek (mesela solal ve suter6) bant tanımlama kolaylığı amaclar. doğrulama için bütünler kolur dizi aralıklarıda yapar. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill),isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)

Bu teknik orijinal Plus-analizinde kullanılmıĢtır. Bu yapı Faj kılıfı içinde bir kollu DNA‟ya sahiptir.

Bakteri içine girdikten sonra DNA çift kollu hale gelir. Bu Jel yapısında primer yapı (baĢlama yeri) oluĢturulması nisbeten daha kolaydır. Konukçuda çift kollu halka form restriksiyon endonükleazle muamele edilerek, çift kollu parçacıklar oluĢturulur.

Bu parçacıklar denatüre edilir. Bu karıĢımdan belki özel fragment elektroforezle izole edilir. Ġzole edilen kol Faj baĢından alınan, tek kollu DNA ile birleĢir ve yeni büyüme için

primer oluĢumu sağlanmıĢ olur.



58

(5387) Baz çifti uzunlukta ΦX174 Fajının dıdeoksi metodunu kullanarak dızılımının belırlenmesı nisbeten kolay olmuĢtur.

ġekil 34. Φx176 fajının genomu dideoksi diziliĢ sırası analizine maruz kalır. Çünkü faj hem bir, hem de iki kollu Ģekilde olabilir.Böylece diziliĢ sırası analizi için iĢlem görebilir. Çift kollu form endonükleazlar ile fregmentlere ayrılır. Bir fregment elektroforezle izole edilir ve hibrize edilerek yeni DNA sentezi için, primeroluĢturmak için bir kol ile hibridize edilir. Böylece dideoksi diziliĢ sırası yapılmıĢ olur. Yeni sentezlenen DNA aynı restriksiyon enzimi ile muamele edilerek izole edilebilir.Böylece orjinal ile aynı kesik uc oluĢmuĢ olur.Yeni izole edilen parçalar Ģekil 33‟deki gibi elektroforeze tabi tutulur. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill),isimlikitabından modifiye edilerek alınmıĢtır.)

DĠZĠLĠġ SIRASI ANALĠZĠNDE GEREKLĠ OLAN PRĠMER (BASLAMA YERĠ) KONFIGURASYONU OLUġUMUNUN MEYDANA GETĠRĠLMESĠ

Dideoksi metodunu etkili bir biçimde uygulamak için genel nitelikte bir primerinoluĢturulması gerekir. Bu amaç E. Coli vektörünün tek kollu Faj (M)-13 DNA‟sını kullanarak uygulanan rekombinant DNA iĢlemleri ile saglanır.

(M)- ına benzer. Her ikisi de bir kollu DNA biçiminde kalıtsal içeriğe sahip olup, her ikisi de konukçu içinde çift kollu sarmal biçiminde çoğalır.

Bu yüzden konukçu içinde çift kollu forma replike olma formu (R.F)denir. Bu formstandart metotlarda düzenlenebilir. Bir kollu form ise diziliĢ sırası analizinde kullanılır. Bu sistem aĢağıda belirtilen Ģekilde çalıĢır.



59

J.Messir ve arkadaĢlarının çok dikkatli düzenlenmiĢ çalıĢmaları ile Lac(Z) isimli bakteriyel genlerde (R.E) için birçok kesım yeri oluĢturulmuĢtur.

Klonlanan unsur (M- -galaktsidoz enziminden sorumlu genlaktozu parçalar.

Bu enzim aynı zamanda enzimin suni substratı (etkilenen madde) olan X-gal‟i de parçalar. X- -gal mavirenkli olur.

Bu yüzden fonksiyonel (Lac Z) geni mevcut ise (M-13) plakaları mavidir. Eğer gen içine klonlanan yabancı içerik ile engellenmiĢ ise (X-gal) parçalanmaz ve plakalar renksizolur.

Çünkü (M-13) gerçek plakalar oluĢturmaz ve E.Coli hücrelerini lisize edemez. Böylece bakterinin azalmıĢ büyümesi nedeniyle bulanık, çamurlu yerler oluĢur.

Faj DNA‟sının klonlama yerinin ters akım yönündeki Faj DNA‟sı bölgesinde bütünler oligonükleotid primerler sentezlenebilir. KlonlanmıĢ yabancı kısmı içeren, bir kollu Faj DNA‟sı izole edilir. Sentetik oligonüklotidler ile hibridize edilebilir.

ġekil 35. (M13) Fajı ,hem bir kollu ve hemde iki kollu formları olduğundan Dideoksi Metodu ile klonlanmıĢ (DNA) parçalarının diziliĢ sırası analizi için yararlı bir vektör (taĢıyıcı) dır. Ayrıca (lacZ) geni içinde restrıksıyon enzimleri için tanıma yerleri içerir. Bu özellik yabancı (DNA) parçaları ile araya sokulmuĢ kısımları içeren klonların seçilmesini sağlar. Klonların yerine bitiĢiği ile hibritleĢecek oligonükleotitler yeni sentez için, ihtiyaç olan primerleri sağlar. (Robert H. Tamarin‟in Principles of Genetics (Sixth Edition,WCB/McGraw-Hill),




60

Bu iĢlem klonlanmıĢ DNA‟nın dideoksi sıra analizi için primer oluĢumunu (baĢlama yeri) oluĢturur. Hemen hemen klonlanabilen bütün DNA segmentleri bu genel metodu kullanarak diziliĢ sırası analizine tabi tutulabilir.

Merdiven basamağı jel iĢlemi sadece 400 baz çifti uzunluğuna kadar etkilidir. Bunlar

daha büyük bölgelere sıra analizleri üst üste çakıĢan segmentlere aminoasit diziliĢ sırası analizne benzer Ģekilde üst üste çakıĢan modellerin sıra analizi ve yeniden yapılması suretiyle belirlenir.

Üst üste çakıĢan DNA segmentlerinin diziliĢ sırası analizinde iki yada daha fazla R.E kullanılır. DNA sıra analizi konusundaki yakın zaman keĢifleri dört florosens boyayı içerir. Her boyanın dalga boyu farklıdır. (505, 512, 519, 526 nanometre).

Her bir 4 dideoksinükleotidler farklı boya bağlama yerine sahiptir. Yeni sentezlenen fregmentler izole edildikten sonra dört replikasyondan elde edilen ürünler birlikte aynı

poliakrilamid jel‟de elektroforeze tabi tutulur. Sonra jel argon lazerde taranarak boyamolekülünün yerleri kesilip çıkarılır.

Bir aygıt da renk zayıflama yerlerini belirler ve direk olarak, diziliĢ sırasını otomatik olarak okur. Bu metod büyük ölçüde diziliĢ analizini basitleĢtirir.

Bu yöntem radyoaktif iĢaretleyici ihtiyacını hafifletir ve azaltır. Ġster dideoksi metodu, ister kimyasal metodla diziliĢ sırası analizi yapılır. Her iki yöntem bir jelde yüzlerce nükleotidi okumamızı sağlar.

Tüm viral prokaryotik ve eukaryotik virus genomunun böylece analizi ve diziliĢ sırası belirtilebilir. Gilbert‟in Nobel ödülünde dediği gibi, DNA molekülü yapısı çözüldükçe bütün canlı hücrelerin tüm hücrelerinde esas olan unsurları anlamıĢ olacağız.

GEN KLONLAMANIN PRATĠK SONUÇLARI

TIP: Tıpta genetik mühendisliği ile önemli ilerlemeler sağlanmıĢtır. Öte yandan genlerin nasıl çalıĢtığına dair bilgiler, bu çalıĢmalarla artmıĢtır.

Öte yandan rekombinant DNA metodolojisi geliĢtirilmiĢ, daha önce eksikliği çekilen önemli unsurların bolca elde edilmesi sağlanmıĢtır.

Mesela insülin interforez büyüme hormonu, büyüme faktörleri, kan pıhtılaĢma

faktörleri, hepatit-B Herpes, kuduz gibi hastalıklara karĢı aĢılar geliĢtirilmiĢtir.

Genetik mühendisliği hastalıkların teĢhis ve tedavisi için Anti body üretimini mümkün kılmıĢtır. Ġnsan genomunun diziliĢ sırası analizi ile daha ileri düzeyde genlerin, çeĢitli hastalıklardan sorumlu genlerin yerlerinin belirlenmesi için daha ayrıntılı bilgileri sağlayacaktır.

Bugüne kadar önemli genlerin yeri klonlanmıĢ ve diziliĢ sırası analizi yapılmıĢtır. Ayrıca R.F.L.P. tekrarı ve P.C.R. ile çeĢitli bireylerin yapısının çalıĢmaları yapılmıĢtır. Öte yandan transgenik fare, klonlanmıĢ koyun olgusunun sonuçları taksonomik bakımdan yüksek canlılarında klonlanabileceğini göstermiĢtir.



61

Bu teknolojinin insan hastalıklarına uygulanma süreci henüz baĢlangıç halindedir.1990‟da Milli Sağlık Enstitüsü insanlarda gen terapisi fikrini onaylamıĢtır.

Agır combıne bagısıklık eksıklıgı(SCID) hastalıgı adenozın deamınaz(ADA) enzım eksıklıgındendır. Normal ADA genı klonlanmıs plazmıt tasıyan etkısıı retrovırus lar aracılıgı

ıle SCID hastasının T hucrelerıne verılerek bir çocuk infüzyona maruz bırakılmıĢtır. Daha sonraki tedavi baĢarılı olmuĢ ve ADA değer düzeyi arttırılmıĢtır. Tedavilerileeksikliğindeimmunsistemifonksiyonbozukluğu,

Adenosindeaminaz‟dan sorumlu hücreler AIDS, hemofili, Sistik Fibrosis, ġeker gibi diğer hastalıklar belkide yakın gelecekte gen terapisi ile tedavi edilebilecektir.

TARIM: Tarımda Pseudomonas syrıngae adlı bakteri modifiye edilerek bitkilerin dondan arı olması maksadı ile buz kristal formasyonunda çekirdek rolü gören proteinle ilgiligenetik bakımdan delasyon gösteren bitkiler üzerinde çalıĢılmıĢtır.

Bu düzenlenmiĢ bakteriler baĢarı ile normal olarak mevcut olanlar ile değiĢtirilirse, ısı

donma noktasına düĢtüğünde bitkide kolayca buz kristalleri Ģekillenmeyecektir.

Diğer bakteriyel projelerde “Rhizobium melliloti” de azot tespit yeteneğinin arttırılması bitki köklerini korumak için Pseudomores fluoreker böcek toksininin sokulması gibi uygulamalar biçimindedir. Bu çalıĢmalarda pamuk yuvarlak kurdu Dougles güvesi gibi değiĢik zararlı çeĢitleri öldürecek viral ve bakterial soylar geliĢtirmek amaçlanır.

Bitki ve hayvanlar direk olarak genetik mühendisliği ile düzenlenebilir. Bitkiler kuraklık ve virüse dayanıklılık için daha iyi kaliteli ürünler genetik olarak düzenlenebilir.

Mesela parçalanan hücre duvarının “Polygalaktorinaz” enzimi aktiviteleri azalmıĢ. Mesela domateste olgunlaĢma ile Polygalaktorinaz enzim aktivitesi azalır ve hücre duvarı kırılır. Dolayısıyla raf ömrü azalır. Böyle domateslerde 1994‟de satıĢa sunulmuĢ, genetik olarak düzenlenmiĢ domates olarak ilgi görmüĢtür.

Federal Gıda ve Ġlaç Dairesi 1994 sonbaharına kadar piyasaya sunulan yedi değiĢtirilmiĢ ürünü onaylamıĢtır. Aynı Ģekilde çeĢitli unsurlar bitki virüslerine dayanıklı (sarı

bal kabağı) olarak 1995‟de pazara girmiĢtir. Halen genetik mühendisliği ile düzenlenmiĢ soya fasülyesi ile mısır pazara intikal etmiĢtir. Evcil hayvanlarda hastalıklara dayanıklılık ve büyüme için genetik olarak düzenlenebilir.

ENDÜSTRĠ: Biyoteknolojinin endüstriyel uygulamaları. Bakterilerin genetik olarak düzenlenmesi, toksik artıkları parçalayan bakterilerin oluĢturulması.

Aynı Ģekilde “selüloz” enzimi ile mayaların glikoz ve alkol üretmesini, bu suretleyakıt üretimi, Alglerin mari kültürde (deniz organizmaları doğal çevrelerinde kültüre alınması) kullanımı ile önemli gıda ve diğer unsurlar elde edilmesi. Gıda endüstrisinin daha iyi ürün ve artık çevrimi için kullanımını kapsar.

Sonda dizilim ile eĢ bütünler yapıdaki parçalar eĢleĢir. Esleniği olmayanlar yıkama ile ayrılır. Lazer tarayıcı çipi okur ve yapı belirlenir.



62

2- ÜREME AMAÇLI KLONLAMA

Bireyin klonlanması tekniğinden farklı olarak reprodüktif (üreme amaçlı) klonlama tekniğinde amaçüreme hücresine sahip olmayan bir bireyin çocuk sahibi olmasına yardımcı olmaktır. Üreme hücresinesahip olmayan bir bireyden kasıt; ileri yaĢ veya cerrahi müdahaleler sebebiyle yumurtalık rezervitükenen, ilaç uyarısına karĢı yumurtalıklardan yumurta elde edilemeyen veya cerrahi yol ileyumurtalıkları alınmıĢ kadınlardır. Yardımcı üreme tekniklerinde gerçekleĢtirilen iĢlemler, çifte aitüreme hücrelerinin laboratuar ortamında bir araya getirilerek bir embriyo oluĢturulmasını hedefler. Eğer çiftten herhangi birisinden üreme hücresi yani yumurta veya sperm elde edilemez ise, çiftin yardımcıüreme teknikleri ile çocuk sahibi olmasına imkan kalmamaktadır. Üreme amaçlı klonlama tekniği de buaĢamada devreye gir mektedir.

Kadından yumurta elde edilemediğine göre bir baĢka hücrenin kullanılması gerekmektedir. Ancak yumurta hücresi, vücuttaki tüm diğer hücrelerden farklı olarak yarı kromozom yapısı (23) taĢımaktadır.Tüm diğer hücrelerde ise çift kromozom yapısı (23 çift yani 46 kromozom) bulunmaktadır. Bu durumda

böyle bir hücrenin yardımcı üreme teknikleri amacı ile kullanımı mümkün olmayacaktır. Bu problemiçözümü Ģu Ģekilde gerçekleĢtirilmektedir. Bir baĢka kadından elde edilen bir yumurtanın hücreçekirdeği çıkartılır ve bu yumurta artık vericinin genetik özelliklerini kaybeder. Bu hücrenin meta faz IIadı verilen bölünme aĢamasında olması gerekmektedir. Çünkü bu aĢamada hücre içerisineyerleĢtirilecek bir çekirdeğin bölünmesini sağlayacak potansiyeli taĢımaktadır.

Tedavide olan kadından elde edilecek herhangi bir hücrenin (cilt hücresi gibi) çekirdeği çıkartılarak,meta faz II aĢamasındaki boĢ yumurta hücresine nakledilir.

Meta faz II aĢamasındaki yumurta hücresi, çekirdeğin bölünmesini ve sahip olduğu çift kromozomyapısını yarıya indirmesini sağlar. Aynı yumurta hücresinin geliĢimindeki gibi fazla kromozom yapısı“polar cisim” adı verilen bir yapıya dönüĢtürülerek hücre dıĢına atılır. Sonuçta bir cilt hücresikullanılarak, istenilen Ģekildeki kromozom yapısına sahip bir yumurta hücresi elde edilir. YenioluĢturulan yumurta hücresi ve eĢinin spermleri kullanılarak mikroenjeksiyon iĢlemi ile embriyo eldeedilir. Bu embriyonun “yarı klonlanmıĢ” bir embriyo olduğu kabul edilebilir.

Yumurta hücresinin içerisine yerleĢtirilecek olan vücut hücresi erkekten de alınabilir. Böyle bir durumda, erkekten elde edilecek hücre çekirdeği kullanılarak bir baĢka çeĢit üreme hücresi oluĢturulur.Bu hücre kadına ait yumurta hücresine mikro enjekte edilerek ve bazı uyarılar gerçekleĢtirilerek

embriyo geliĢimi sağlanabilir.

Bu yöntem de henüz sadece deneysel amaçlarla gerçekleĢtirilmektedir. ÇeĢitli türde hayvan çalıĢmalarısürdürülmektedir.



63

3- ĠYĠLEġTĠRME AMAÇLI KLONLAMA

Klonlama üzerinde çalıĢan araĢtırmacıların bazılarının amacı da, kök hücre araĢtırmalarındakullanılmak üzere kök hücre kaynağı sağlamak. Klonlama yoluyla oluĢturulan embriyolardaki kök hücreler alındıktan sonra bu embriyoların yok edildiği bu çalıĢmalara “iyileĢtirme amaçlı klonlama” adıveriliyor. ĠyileĢtirme amaçlı klonlamada çekirdek transferi yöntemiyle klonlanmıĢ embriyolardaki kök hücreler yalıtılarak, doku ve organ nakillerinde kullanılmak üzere malzeme sağlanacak. Ancak kök hücrelerin aktarılacağı bölgelerdeki hücrelere nasıl dönüĢeceği konusunda daha pek çok çalıĢmayagereksinim var. Belli bölgelerdeki özelleĢmeleri oluĢturacak kök hücrelerin nasıl tetikleneceği ya da

belli iĢlevleri gerçekleĢtirmelerinin nasıl sağlanacağı heniz tam anlaĢılmıĢ değil. AraĢtırmacılara göreklonlama teknolojisinin iyileĢtirme amaçlı olarak kullanılmasının olumlu yönü, insanların kendihücrelerinden dokular yada organlar elde edilmesini sağlayacak olması. Böylece aktarılan dokularınyada organların reddedilmesi sorunu ortadan kalkıcak.

Tedavi amaçlı klonlamada uygulanan teknoloji aslında bireyin klonlanması için gerçekleĢtirilensistemin aynısıdır. Yine bir bireyden alınan hücre klonlanarak, birebir aynı genetik özelliklere sahip bir kopya yaratılmaktadır. Ancak burada önemli farkı teĢkil eden nokta Ģudur: elde edilen embriyo b irkadının rahmine transfer edilmez. Aksine blastosist aĢamasına ulaĢana kadar laboratuar ĢartlarındageliĢimi sağlanır. Bu aĢamada embriyonun içerisinde kök hücrelerinin barındıran, her türlü farklı hücreve dokuya dönüĢebilme potansiyeline sahip, multipotent hücreler oluĢmaktadır. ĠĢte terapötik klonlamada hedef bu hücrelerin elde edilmesi ve bu hücrelerden farklı dokular geliĢtirilerek, tedaviamacı ile kullanılmasıdır.

Kök hücreleri, blastokist aĢamasına ulaĢan bir embriyonun iç hücre kütlesi (Internal cell mass – ICM) bünyesinde yer alırlar. AĢağıdaki Ģekillerde blastokist aĢamasındaki bir embriyo ve ICM yapısıgörülmektedir.

Klonlama sonrasında blastokist aĢamasına ulaĢan embriyonun içerisinde yer alan multipotent hücreler,genetik olarak klonlanan bireyle aynı özellikler taĢımaktadır. Bu hücrelerden geliĢtirilecek olan dokular,klonlanan kiĢi için bir yedek doku veya organ teĢkil edecektir. Bu klonlanmıĢ dokunun en önemliözelliği, tamamen kiĢinin genetik yapısının aynısını taĢıdığı için herhangi bir doku reaksiyonu, dokununvücut tarafından reddedilmesi (rejeksiyon) riskinin bulunmamasıdır. Bu problem günümüzde organveya doku naklinde karĢımıza çıkan en önemli problemdir. Bu problemin çözülmesi, tıpta büyük bir aĢama kaydedilmesi anlamına gelir.

Örneğin bir Parkinson hastasına, kendisinden klonlanmıĢ bir sinir sistemi dokusu nakli yapılarak tedavisi sağlanabilir. Keza diyabet hastasına kendisinden klonlanmıĢ pankreas hücreleritransplantasyonu yapılabilir. Bu konudaki çalıĢmalar büyük bir hızla sürdürülmektedir. Klonlanan kökhücrelerinden sinir, kas, kalp kası, pankreas, kemik iliği dokuları üretilebilmiĢtir. Kök hücre teknolojisigelecekte pek çok hastalığın tedavisi için bir ümit ıĢığı oluĢturmaktadır.

Bu çalıĢmalar aynı zamanda bazı genetik hastalıkların tedavisi imkanını da tanıyabilir. Bilim adamlarıklonladıkları hücreleri istedikleri Ģekilde programladıkları taktirde bu hücrelerde, vücutta eksik olan veeksikliği sebebiyle hastalıkların ortaya çıkmasına neden olan bazı maddelerin yapımı sağlanabilir.



64

Örneğin bu Ģekilde talasemi (akdeniz anemisi) gibi kanda oksijenin taĢınmasında problem yaratan bir hastalık için sağlıklı hemoglobin üreten kemik iliği hücreleri oluĢturularak tedavi sağlanabilir.

Klonlama teknikleri uzun süredir botanik ve veterinerlik sahasında kullanılmaktadır. Klonlama tekniğisayesinde soyu tükenmekte olan hayvanların çoğaltılması veya biyo çeĢitliliğin korunması mümkün

olabilir. Benzer Ģekilde hayvanlarda görülen bazı hastalıkların (Deli dana veya scarpie gibi) tedavisindede klonlama tekniğinden yararlanılmasına çalıĢılmaktadır.

Terapötik klonlama konusundaki en önemli tartıĢma noktası, bir canlının hayatını kurtarmak veya tedavietmek için bir baĢka canlının (embriyonun) hayatına son vermenin ne kadar etik ve ahlaki olduğukonusudur. Bir diğer önemli nokta ise diğer bilim dallarında olduğu gibi terapötik klonlamanın da organnakli amacı ile suistimal edilmesi ve kötü amaçlı kullanımıdır. Bu ve bunun gib i konular, k lonlamanındaha üzerinde konuĢulacak, tartıĢılacak ve karara bağlanacak çok fazla soru ve çıkmazlar içerdiğinigöstermektedir. Bilim alanındaki her yeni geliĢme zaman içerisinde bu süzgeçlerden geçmiĢtir. Aynımekanizmanın klonlama içinde iĢlemesi ve bu tekniğin insan sağlığına faydalı Ģekilde kullanımı içindüzenlenmesi kaçınılmazdır.

KLONLAMANIN SÜPER STARI DOLLY’NĠN KOPYALANMAAġAMALARI VE SONRASI

1997 yılında Ġngiltere‟deki Roslin Enstütisinden lan Wilmut ve arkadaĢları klonlanmıĢ bir koyunun1996 yılında dünyaya gelmiĢ olduğunu açıkladılar. AraĢtırmacılar bunu açıklamak için, “Dolly” olarak



65

adlandırdıkları koyunun sağlıklı bir biçimde geliĢtiğinden emin olmak istemiĢlerdi. Dolly, yetiĢkin bir memeli canlının kalıtsal malzemesinin, yeni ve onunla eĢ bir canlı yaratmada kullanılmasının ilk örneğiydi. Bu geliĢmeden sonra bir daha hiçbir Ģey eskisi olmadı. Dolly‟den bu yana, klonlamadünyasında birçok ilerleme gerçekleĢti. Dünyanın farklı yerlerindeki laboratuarlarda araĢtırmacılar koyunun yanı sıra fare, inek, keçi, maymun, kesi gibi baĢka canlıları da klonlamayı baĢardılar. (biltek)

Son geliĢmelere imzasını atan ekip, genlerin laboratuar koĢullarında biçimlendirilmesinin ardından gentransferi yöntemi ile koyun bedeninde, istenilen özelliklerdeki genlerin (DNA molekülü)üretilebilmesini olağan bir hale getirdi. Söz konusu deneyde, ihtiyaç duyulan moleküllerin koyunun tümhücrelerinde değil, sadece süt bezlerinde sentezlenmesini hedef alıyordu. Bu nedenle koyunun ilaçfabrikası olarak değerlendirilmesini beraberinde getirdi. Dolly baĢarısının en önemli noktası bugerekçeye dayanmaktadır. Gen transfer yöntemi, ıslah çalıĢmaları sonucu elde edilen verimli ürününniteliği değiĢmeksizin seri olarak üretilmesi amacındadır.

Dr, Wilmut‟un gerçekleĢtirdiği deney; yetiĢkin bir diĢi koyunun bedeninden alınan hücrenin (somatik bir hücrenin) çekirdeğinin, mikron birimi inceliğindeki bir enjektör iğnesi yardımıyla vakumlanıp, baĢka bir erkek koyuna ait, çekirdeği alınmıĢ bir yumurtaya enjekte edilip oluĢturulan suni hücrenin,üçüncü bir diĢi koyunun rahmine yerleĢtirilmesidir. Üçüncü koyun, tüp bebek yönteminde olduğu gibidıĢ ortamda özel olarak üretilmiĢ hücrenin geliĢimini sağlayabileceği biyolojik ortamdır. Adını, ünlü Ģarkıcı Dolly Parton„dan alan kuzu Dolly, isim annesinin değilse de, DNA annesinin genetik ikizi. Dolly, sevimli görünüĢüyle kamuoyunun sempatisini kazanmıĢ ve tüm bu süreç ilginç bir bilimseloyun olarak sunulmuĢsa da, gerçekte deney oldukça iyi belirlenmiĢ bilimsel ve maddi hedefleri olansabırlı bir çalıĢmanın ürünüdür. Bu çalıĢmaların yankıları gerek günlük gazete ve magazin dergilerindeilk sayfadan bizlere ulaĢtırılmıĢ, basit Ģemalarla anlayıĢımıza sunulmuĢtu. Ġskoçyalı ekibin

gerçekleĢtirdiği klonlama deneyinin, dünyanın pek çok bölgesine dağılmıĢ sayısız standart biyoteknoloji laboratuarında kolayca gerçekleĢtirilebileceği söyleniyordu. Yine de uygulanan yönteminyeniden uygulanabilmesi pek de pratik ve kolay değildir.

Ekibin baĢarısı ve önceki sayısız benzeri deneylerin baĢarısızlığı, Wilmut‟un verici koyundan alınanhücre çekirdeğiyle, kullanılan embriyonik hücrenin frekanslarını çok hassas biçimde çakıĢtırabilmesinedayanıyor. Bu yöntemle araĢtırmacılar, yetiĢkin çekirdeğin genetik saatini sıfırlamayı, tüm geliĢimsürecini baĢa almayı becerebilmiĢlerdir.

Milyarlarca sayıda hücreden oluĢmuĢ bir bedenimiz var. Bu hücrelerin milyonlarcası her saniye

bölünmeyi sürdürerek beden geliĢimini devam ettiriyor. Bunun yanında yıpranmıĢ hücreleri deyeniliyor. Somatik hücre adını verdiğimiz yapısal hücrelerde meydana gelen fizyolojik ve morfolojik değiĢimler genetik intikal ile bir sonraki nesile aktarılamamaktadır. Dolayısıyla, biyolojik bedenimizdemeydana gelebilecek mutasyonların etkileri populasyon havuzunda bir değiĢime neden olmaz. Ancak

bu durum üreme hücrelerinde farklı bir seyirde ilerler. GerçekleĢebilecek mutasyonlar, daha sonrakifrekanslarda etkisini gösterecektir.

Koyun ve insan hücrelerinin de dâhil olduğu geliĢmiĢ hücreler (çekirdeği olan hücreler = ökaryotik hücreler), farklı geliĢim evreleri ihtiva eden döngüyü takip etmektedirler. Bu döngüyü, interfaz evresi(bölünmenin olmadığı hazırlık evresi) ve belirgin biçimde bölünmenin gerçekleĢtiği mitoz evrelerine

ayırmak mümkün. Hücre, yaĢam döngüsünün % 90 kadarını interfaz evresinde geçiriyor. Aslında, buduraklama evresi göründüğü kadar sakin değil. Hücre, tüm bileĢenlerini bölünmeye hazırlar. Hücrenin



66

yaĢam döngüsü üç ana evreye ayırabilir iz :G1 evresi, hücrenin DNA dıĢındaki tüm komponentlerinin (organel) çoğaldığı bir dinlenme dönemi,

S hücredeki birim DNA‟nın miktarının ikiye katlandığı (replikasyon) evre,

G2 ise, hücre içi geliĢmenin tamamlanıp, hücrenin bir zar yardımıyla bölünüp, iki eĢit miktardakihücreleri oluĢturduğu evredir. Bu evre mitoz olarak da isimlendirilebilir.

Hücrelerin hangi evreyi ne kadar sürede tamamlayacakları genetik program dâhilindedir. Bu süre bir canlıdaki tüm hücreler için aynıdır. Ani çevresel koĢul değiĢiklikleri (besleyici maddelerin miktarı

birden bire minimum düzeye düĢürüldüğünde) hücreleri G1 evresinde belli bir kritik noktaya kadar indirgenebiliyor. Söz konusu kritik nokta aĢılırsa, çevresel koĢullar ne yönde geliĢse de artık DNAreplikasyonunun önü alınamıyor. Bu noktanın kontrol altına alınabilmesi, Wilmut ve ekibinin baĢarılı

bir klonlama gerçekleĢtirebilmelerinin altın anahtarı olmuĢtur.

Burada bir parantez açarak G1, S, G2 ve M evrelerinin denetim altına alınması, hücrenin yaĢamdöngüsünü olduğu kadar, özelleĢmesini de dizginlemiĢtir. FarklılaĢma evresine giren hücreler geliĢimevrelerinde, genetik programı gereğince beyin, kas gibi hücrelere dönüĢürler. Wilmut ve ekibi Dollyiklonlayıncaya kadar bu sürecin irreversible (geriye dönüĢümsüz) olduğunu, bir baĢka deyiĢle, bir defakas hücresi olmaya karar vermiĢ bir hücrenin yeniden programlanamayacağını düĢünüyorlardı. ĠĢte budeneyi baĢarılı kılan unsur, genetik saati sıfırlamak, yani farklılaĢmanın önüne geçebilmektir.

Diğer araĢtırıcıların bunu baĢaramamalarının nedeni, kullandıkları somatik hücrelerin çekirdeklerini, Sveya G2 evrelerindeki konakçı hücrelerle füzyona uğratmalarıydı. Eski teorik bilgilere göre, buyöntemin iĢe yaraması gerekiyordu, çünkü çekirdeğin mitoza yaklaĢmıĢ olması avantaj olarak

görülüyordu. Ancak bu denemelerde, iĢler bir türlü yolunda gitmedi. KaynaĢtırmadan sonra, hücrefazladan bir parça daha mitoz geçiriyor ve yararsız, kopuk kromozom parçaları meydana geliyordu. Bukorsan genler, geliĢimin normal seyrini sürdürmesi için ciddi bir engel oluĢturuyordu. WilmutgerçekleĢtirdiği deneyde; anneden ve babadan gelen gen setlerinin karıĢım evresi olan G0 ( zigot oluĢmaevresi) evresini askıya alıp, bu aĢamadaki çekirdeği, füzyona uğrattı. Füzyon sonucu oluĢan yeni hücre,normal besin koĢulları ve hafif bir elektrik Ģoku etkisiyle olağan çoğalma sürecine girmiĢti. Zigot, annekoyunun rahmine yerleĢtirilip, gerekli hormonlarla normal hamilelik süreci baĢlattı. Bu deney hakkında

bilinenler, yukarıda kaba hatlarıyla anlatılanlarla sınırlı. Sürecin duyurulmayan kritik bir evresi varsa, bu ticari bir sır olarak kalacağa benziyor.

Embriyolog Jonathan Slack, çok daha temel Ģüpheleri öne sürüyor araĢtırmacılar, yumurta hücresindekiDNA‟ları tümüyle temizleyememiĢ olabiliriler. Dolayısıyla Dolly, sıradan bir koyun olabilir.

Slack, alınan meme hücresinin henüz tamamen özelleĢmemiĢ olabileceğini, böyle vakalara memehücrelerinde, bedenin diğer kısımlarına göre daha sık rastlanılabildiğini de ekliyor. Zaten Wilmut da,

bedenin diğer kısımlarından alınan hücrelerin aynı sonucu verebileceğinden bizzat Ģüpheli. Örneğin, büyük olasılıkla kas veya beyin hücrelerinin asla bu amaçla kullanılamayacaklarını belirtiyor. Üstüneüstlük, koyun bu deneylerde kullanılabilecek canlılar arasında ayrıcalıklı bir örnek. Koyunembriyolarında hücresel farklılaĢma süreci zigot ancak 8- 16 hücreye bölündükten sonra baĢlıyor.Geleneksel laboratuar canlısı farelerde aynı süreç ilk bölünmeden itibaren gözlenebiliyor. Ġnsanlarda iseikinci bölünmeden itibaren baĢlıyor. Bu durum, aynı deneyin fare ve insanlarda baĢarılı olamaması

olasılığını beraberinde getiriyor.



67

Dile getirilen açık noktalardan bir de, hücrelerde DNA içeren tek organelin çekirdek olmayıĢı. KendiDNA‟ sına sahip organellerden mitokondrinin özellikle önem taĢıdığı düĢünülüyor. Memelihayvanlarda mitokondriyal DNA, embriyo geliĢimi, sırasında sadece anneden alınıyor. Her yumurtahücresi, farklı tipte DNA‟lara sahip yüzlerce mitokondriyle donatılmıĢ durumda. Bu mitokondriler zigotun bölünmesinin ileri evrelerinde, embriyo hücrelerine dengeli bir biçimde dağılıyor. Ancak,

canlığın daha ileri geliĢim evrelerinde, bu denge belli tipteki DNA‟lara doğru kayabiliyor. Dolayısıyla birim hücredeki mitokondri DNA‟sı / çekirdek DNA‟sı oranındaki sapmalar Parkinson, Alzheimer gibihastalıklara zemin hazırlar. Bazı araĢtırıcılarda, Dolly‟nin ilerleyen yaĢlarda sağlık problemleriyaĢayabileceği düĢüncesini yarattı.

KLONLAMANIN YARALARI

1. NESLĠ TÜKENMEKTE OLAN TÜRLERĠN KLONLANMASI

Nesli tükenmekte olan türlerin klonlanması herkese çok çekici gelmiĢtir. Avustralya‟dan bir proje 153 yıldır alkol ĢiĢesinde kalan bir örnekten Tazmanya Kaplanını klonlamayı amaçlanmaktır.Bir baĢka araĢtırma grubu Sibirya buzullarında bulunan 20 000 sene yaĢlı bir dokudan mamutklonlamayı amaçlıyor. Fakat bu örneklerde DNA parçalar halindedir ve tam genomu tekrar bir arayagetirmek imkansızdır. Üstelik çekirdek transferi tekniği ta bir çekirdeği ve fonksiyonel kromozomlarıgerektirmektedir. Bundan dolayı da sadece DNA yeterli olamamaktadır.

Klonlama için bariz gerekli diğer nesnelerden uygun oositler ve implante edilecek ana rahmidir. Neslitükenmekte olan türlerin klonlanması akraba olan ve daha sık rastlanan hayvanların yumurta hücrelerive rahimleri kullanılarak yapılabilir. Fakat bu durumlarda da yumurta hücrelerinin ve rahimlerin dahayakın akraba olan türlerden alınması hamileliğin sonuna kadar baĢarılı olması için gereklidir. Mesela

pandayı klonlamakla kurtarmak bu açıdan çok zor olacaktır, çünkü uygun yumurta hücreleri ve uygunrahim bulunabilmesi için yakın akrabası yok.

2. ÇĠFTLĠK HAVYALARI ÜRETĠMĠNDE KLONLAMA

Çekirdek transferi prensip olarak en iyi çiftlik hayvanlarının sonsuz miktarda kopyasını yapmak içinkullanılabilir. Pratikte sadece sığır ve domuzların klonlanması yapılacaktır çünkü sadece bu hayvanlarınklonlanması karlı olacaktır. KlonlanmıĢ elit inekler ABD‟de her biri 40 000den fazla fiyata alıcı

bulmaktadırlar. Fakat bu onların gerçek fiyatından ziyade yenilik oldukları için çıkan fiyattır. Etkiliolabilmesi için klonlamanın üretim programına entegre olması gerekir ve genetik çeĢitliliği korumaya

gerekli dikkatin gösterilmesi de zorunludur. Klonların sağlıklı olduğunu ve hakikaten beklenen faydayıve baĢarıyı gösterdiklerini ispatlamaları gerekir. Buna ilave olarak tekniğin havyaların refahının

bozmadığı gösterilmelidir.

3. ĠNSAN TEDAVĠ EDĠCĠ PROTEĠNLERĠNĠN ÜRETĠMĠ

Ġnsan proteinlerine bir çok hastalığın tedavisi için çok büyük gerek duyulmaktadır. Bazıları kandan izoleedilebilirken bu iĢlem hem çok pahalı hem de AIDS veya Hepatit C bulaĢma riski de söz konusudur.Proteinler hücre kültür ortamında üretilebilir, fakat bu yöntem de çok pahalı ve verimi çok düĢüktür.Çok büyük verimle proteinler bakteri veya mayada üretilebilir. Fakat bunlarda da proteinlerin

saflaĢtırılması çok zor, proteinlerin gerekli post-translasyon değiĢimleri de yoktur ve dolayısıyla gerekliolan in vivo etkileri olmayabilir.



68

Bunlara karĢın düzgün post-translasyon değiĢimleri olan insan proteinleri transgenik koyun, keçi veineklerin sütünden 40gr/L miktarında ve nispeten daha ucuz bir Ģekilde üretilebilir. PPL Therapeuticsfirması, alfa-1-antitripsini, sistik fibrosis ve amfisemanın tedavi edilmesi için 3 klinik denemegerçekleĢtirmiĢ ve sonunda üretebilmiĢlerdir. Alfa-1-antitripsin geni koyunun zigot hücresine

aktarılarak transgenik koyun üretilmiĢtir. Daha sonra bu koyun ve diğer transgenik süt hayvanlarıkopyalanarak genin yeni kopyalarda devam etmesi sonucu istenilen proteinin üreten tek tip canlılar yaratılabilmiĢtir. Çekirdek transferi tekniği insan genlerinin genom anlam kazanmasını arttıran spesifik

bir noktaya sokulmasına izin verir. Çekirdek transferiyle transgenik hayvan oluĢturulmasının pronükleer enjeksiyonun üzerinde diğer büyük avantajı, denek havyalarını yarısından azınınkullanılmasıdır. Ayrıca, dölün cinsiyetini de belirleyebilmek, üretim stokunun oluĢturulması için gereklizamanı önemli derecede azaltmaktadır.

KLON CANLILARIN SAĞLIĞI

Doğumdan Önce…

Bedensel hücre çekirdeği aktarımı, Dolly den sonra baĢka memeliler üzerinde de denendi; klonlamanıntekrarlanabilir olduğu gösterildi. Koyunlardan sonra domuzların, keçilerin, fare, inek ve kedilerindeklonlanabildiğini gördük. Ancak bilim adamları hala bedensel hücre çekirdek aktarımı sürecini tamanlamıĢ değiller. Klonlama uygulamalarında araĢtırmacıların baĢarısız olma Ģansı %97. Klonlanan her canlı, yüzlerce hatalı denemeden sonra ortaya çıkıyor. Klonlama çalıĢmalarında embriyolar genellikle,taĢıyıcı anneye aktarıldıkları blastosit aĢamasına gelene kadar laboratuarda olgunlaĢtırılıyor. ĠĢte busüreçte klonlanmıĢ embriyonun içinde bulunduğu “kimyasal çorba” nın karıĢımı iyi

tutturulamayabiliyor. Olasılıklardan bir baĢkasıysa laboratuardaki çalıĢmalar sırasında embriyonunsarsıntı geçirmesi. Klon canlılarda sık rastlanan “büyük bebek sendromu” nun nedeninin bu olabileceğidüĢünülüyor.

Doğumdan Sonra…

Laboratuarda her Ģey yolunda gitse de klonlama uygulamasının yolunda gitmemesine neden olanetkenler var. Normal bir eĢeyli üreme sırasında, yumurta ve sperm hücreleri yepyeni bir canlıoluĢturabilecek kalıtsal donanıma sahiptir. KlonlanmıĢ embriyolardaysa bu donanımın bazı yerlerinineksik olduğu anlaĢıldı. Sağlıklı görünen klon canlıların bile genlerinin etkinliklerinde ciddianormallikler olduğu anlaĢılmıĢ. Klon canlıların bazı genlerinin etkinleĢmesi gereken zamanlarda

etkinleĢmediğini ve etkin olmaması gerektiği zamanlarda etkinleĢtiğini gösteren araĢtırmalarda var.Örneğin Dolly‟nin küçük yaĢta eklem iltihaplanmasına yakalanması bununla açıklanıyor. Klon



69

canlıların erken yaĢlanması da baĢka bir sorun. 1999 yılında Dolly nin biyolojik yaĢının kronolojik yaĢından daha fazla olduğu ortaya çıkmıĢtı. Bunun telomerlerinin uzunluğundan kaynaklandığısanılıyor. AraĢtırmacılara göre Dolly nin telomerleri kendisi gibi üç yaĢındaki bir koyununtelomerlerinin olması gerektiği boydan çok daha kısa; hatta tam olarak, Dolly nin klonlanmıĢ olduğu 6yaĢındaki koyununkiler kadar.

BEDEN HÜCRELERĠNĠNKROMOZOMLARI NASIL OLUYOR DA AKTARILDIĞI YUMURTA HÜCRESĠNĠNKROMOZOMLARI GĠBĠ DAVRANMAYA BAġLIYOR?

Bir hücrenin çekirdeğini programlanmasını, hücre sitoplazmasıyla çekirdekteki genlerin arasındaki

etkileĢimli bir süreçtir. Sitoplazma çekirdeğe, hangi genlerin etkinleĢip hangilerinin etkinliğinin biteceğini, yani hücrenin hangi proteinleri üretileceğini belirleyen sinyaller gönderir. Hücre özelleĢiptotipotent olma özelliğini yitirince, birçok proteini üretemez duruma gelir. Bedendeki herhangi bir

proteini üretecek genetik donanıma sahip olduğu halde, yalnızca hücrenin gereksinim duyduğu proteinleri üretir. ĠĢte bedensel hücre çekirdeği aktarımında hücrenin geliĢimsel sürecinin embriyonunilk aĢamasına alınabilmesinin nedeni, çekirdeğin aktarıldığı hücrenin bir yumurta hücresi olması.

KLONLANMIġ CANLILAR VERĠCĠ HÜCRENĠN ALDIĞICANLININ TAM BĠR KOPYASI MI?

Bedensel hücre çekirdeği aktarımı yönetiminde, ortaya çıkan canlının kromozomları yalnızca vericihücreden geliyor. Hücredeki genetik malzemenin büyük çoğunluğu hücre çekirdeğinde bulunuyor;küçük bir bölümüyse, hücrede çekirdekten ayrı bir yapı olan mitokondride. Yani mitokondrinin kendiDNA sı var. 1999 yılında klonlanmıĢ 10 canlı (Dolly le birlikte 10 koyun) üzerinde yapılan bir araĢtırma

bu canlıların mitokondrilerinin %99,5‟inin alıcı hücreden geldiği sonucuna varmıĢlar. ÖrneğinDolly‟nin mitokondrisindeki 37 gen, çekirden DNA sının alındığı verici hücreden değil, DNA nın

aktarılmıĢ olduğu yumurta hücresinden geliyordu. Mitokondri, bedendeki tüm hücrelerde önemli bir role sahip olduğu için, bu durum klonlarla, klonlanmıĢ oldukları canlılar arasında önemli fizikselfarklılıklara yol açabilir. AraĢtırmacılara göre ortaya çıkacak fiziksel farklılık insanlarda sözgelimiyetenekli bir atletle, spora hiç yatkınlığı olmayan baĢka bir insan arasındaki farklılıklar kadar bileolabilir.

Hayvanlarda denenen klonlama insanda da uygulanmaya çalıĢılmaktadır. Ama bir çok ülkede insanklonlaması yasaklanmıĢtır. Yine de, klonlamadan elde edilen yeni bilgiler ile hücre çekirdeğinintransferi gibi teknikler üreme tıbbında bu gün karĢılaĢtığımız önemli problemlere bir çözüm olarakgörülmektedir. Klonlamada esas olan, genetik materyalin yani kromozomların izolasyonu ve bunundanukleusu (çekirdeği) çıkarılmıĢ bir kadın yumurta hücresi (oositi) içerisine nakledilmesidir. DiĢiyumurta hücresinin çekirdeği, bir cam mikropipet kullanılarak mikromanipülasyon ile ya da kimyasal



70

tedavi ile çıkarılabilir. Çekirdeği çıkarılmıĢ bu hücre içerisine daha sonra, kopyalanması yapılacak kiĢinin bir hücresinin genetik materyali enjekte edilir ve elektrik stimülasyonu verilerek veya viralajanlar kullanılarak, çekirdeği çıkarılmıĢ alıcı yumurtası ile bu genetik materyalin birleĢmesi,kaynamaları sağlanılabilir. Arkasından, embriyo geliĢecek ve geliĢen embriyo da kadının rahmiiçerisine nakledilerek gebelik sağlanabilecektir. Bütün bu iĢlemler teorik olup, henüz hayvan deneyleri

yapılmaktadır ve insanlarda pratik olarak uygulanmamaktadır.

ĠNSAN KLONLAMA

Klonlama bilim tarihinde en çok tartıĢılan çalıĢmalardan biri olmayı baĢardı. Bazı bilim adamları

klonlamanın insanlık için büyük bir geliĢme olduğunu ileri sürerken, bazıları da bu çalıĢmaları insanlık ayıbı olarak görüp, kesinlikle engellenmesi gerektiğini düĢünüyor. Bu düĢüncelere sahip klonlamakarĢıtlarının yaptığı çalıĢmalar ile baĢta Avrupa ülkeleri olmak üzere bir çok ülke sınırları içerisindeklonlama ile ilgili çalıĢmaların yapılmasını yasakladı. Klonlama yanlıları ise, klonlamanın kaçınılmaz

bir bilimsel gerçek olduğunu ve yapılan yasakların bilimi yavaĢlatmaktan baĢka bir Ģey olmadığınısavunarak, her ne pahasına olursa olsun çalıĢmalarına devam edeceklerini açıkladılar. Bu tartıĢmalar tüm bilim dünyasını sardı ve bir çok bilimsel kuruluĢ klonlama özellikle de insan klonlamaçalıĢmalarının ahlaki ve bilimsel bir yanlıĢ olduğu konusunda karara vardı. Fakat insan oğlunun bitmeztükenmez merak duygusunu engellemek kolay değil. Bazı firma ve bilim adamları izinli yada izinsiz buçalıĢmaları sürdürüyor.

KlonlanmıĢ insan aslında çok yabancı olduğumuz bir terim değil. Tek yumurta ikizi olarak adlandırılanikiz çeĢitleri (duruma göre üçüz ve dördüz de olabilir) aslında birbirlerinin doğal yoldan klonlanmıĢhalleridir. Anne rahminde bir zigot bölünmesinin ilk aĢamalarında her hangi bir nedenle iki ayrı hücreoluĢturursa, aynı DNA'ya sahip iki aynı canlı dünyaya gelir ve dünyaya gelen bu iki canlı birbiriningenetik kopyasıdır yani klonlanmıĢ halidir. Normal doğumların yaklaĢık %1.3ünde bu olaya rastlanır.Yapay klonlama ise dünyaya gelecek canlının genetik özelliklerinin (DNA'sının) dıĢarıdan müdahale ilekendi türünden baĢka bir canlının DNA'sı ile aynı olmasının sağlanmasıdır. Daha detaylı anlatacak olursak; normalde insanlar eĢeyli üreme sonucunda dünyaya gelir. EĢeyli üremede anne ve babanınüreme hücrelerindeki DNA' lar birleĢerek yeni ve kendisine has özellikler taĢıyan bir DNA oluĢtururlar.Yani oluĢan yeni birey bazı ufak benzerlikler dıĢında anne ve babanınkinden bağımsız bir genetik yapıya sahip olur. Klonlama sonucunda ise eĢeyli üreyen canlı bir nevi eĢeysiz üreme gerçekleĢtirmiĢolur. Yani oluĢacak birey sadece annenin yada sadece babanın DNA'sını taĢır. Bu nedenle oluĢan birey,DNA'sı kullanılan bireyle aynı genetik özelliklere sahip olur, yani yeni birey anne yada babanınkendisinden küçük bir tek yumurta ikizi olarak dünyaya gelir ve normal tek yumurta ikizlerinde olduğugibi dıĢ görünüĢleri birebir aynıdır.

Klonlama için en çok kullanılan yönteme "çekirdek transferi yöntemi" dir. Teoride basit gibi görünen buyöntem pratikte çok büyük zorluklar çıkartmaktadır. BaĢarı yüzdesi çok düĢük olan bu yöntemsonucunda doğan bireyde bir çok sağlık sorunu ile karĢılaĢılmaktadır. Klonlama için kullanılan"partenogenez" gibi diğer yöntemlerin hiçbiri ile canlı bir bireyin dünyaya gelmesi sağlanamamıĢtır.

Diğer yöntemlerle canlı bir birey oluĢması teorik olarak da mümkün değildir.



71

Dolly‟nin klonlanmasında çekirdek transferi yönteminden yararlanılmıĢtır. Deneyde kullanılan 277yumurta hücresinden yalnızca 29 tanesi bölünme aĢamasını tamamlayabildi ve bu yumurtalar farklıkoyunların rahimlerine yerleĢtirildi. Koyunlardan 13 tanesi gebe kaldı. Sonuçta ise bir tek baĢarılıdoğum gerçekleĢti. Dünyaya gelen bu koyuna Dolly adı verildi. ĠĢte klonlama tartıĢmaları da bu noktadaalevlendi. Dolly'nin doğumunu klonlamada bir milat olarak gören bazı bilim adamlarının insan

klonlama çalıĢmalarına baĢladıklarını açıklamaları üzerine klonlama karĢıtları da karĢı çalıĢmalara baĢlayarak klonlama çalıĢmaları aleyhinde ciddi yaptırımlar getirilmesini sağladılar. Tüm buengellemelere rağmen 26 Kasım 2001'de Advanced Cell Technology (ACT) adlı firmadan ilk klonlanmıĢ insan embriyosu haberi geldi. ACT‟nin yaptığı açıklamaya göre, yapılan deneyde toplam 19yumurta hücresi kullanıldı ve hücrelerden sadece 3 tanesi bölünme aĢamasına gelebildi. Bu üç hücreden2' si 4, 1‟i de 6 hücre oluĢturduktan sonra öldü. Ġnsan klonlama konusunda yapılan bu ilk resmi açıklamabüyük ses getirdi. Fakat bir insan embriyosundaki genler ancak 4-8 hücre oluĢturduktan sonra kendisinigöstermeye baĢlıyor. BaĢta ACT olmak üzere klonlama yaptığını duyuran hiç bir firmanın henüz 8hücreden büyük bir embriyo elde edememiĢ olması, bazı bilim adamlarına göre insan klonlamaçalıĢmalarının henüz baĢarıya ulaĢılamadığını gösteriyor

.

Klonlama çalıĢmaları yapan ve yapmaya devam eden bilim adamlarının çoğu bu çalıĢmaları yeni bir birey dünyaya getirmek için değil de sadece tedavi amaçlı kullanılacak kök hücreleri üretmek içinsürdürdüklerini belirtiyorlar. Tedavi amaçlı klonlama çalıĢmalarda amaç klonlama sonucunda kök hücre elde etmek. Ġlk hücre bölünmesinden yaklaĢık 5 gün sonra yani embriyonun yaklaĢık 100 hücreoluĢturacak kadar bölünmesi ile oluĢan ve baĢkalaĢarak 200 değiĢik vücut hücresine dönüĢebilen buhücrelere kök hücre adı verilir. Bu hücrelerin bir kısmı organları bir kısmı ise kan, saç, tırnak ve deri gibivücut bölümlerini oluĢtururlar. Klonlama ile kök hücre elde etmeyi amaçlayan bilim adamları bu kök hücreler yardımı ile birçok hastalığa çözüm bulunacağını ve daha ileriki dönemlerde yine bu hücreler

yardımı ile organ üretimi ve nakli yapılabileceğini iddia ediyorlar. Fakat burada göz ardı edilmemesigereken Ģey, kök hücre elde etmek için embriyonun öldürülmesi gerektiği gerçeğidir, bir canlınınhayatını kurtarmak ya da sağlık sorununu gidermek için baĢka bir canlının hayatına son vermenin nekadar ahlaki olduğu tartıĢma konusudur.

Klonlama konusunda içine düĢülen en büyük yanlıĢ doğacak canlının klonlanan canlı ile aynı kiĢiolacağının sanılmasıdır. Bu cahilce ve çok büyük bir yanılgıdır. Klonlama yöntemi sonucunda dünyayagelen canlı sadece fiziksel görünüĢ olarak genleri kullanılan canlıya benzer ve bu benzerlik yukarıda daanlattığımız gibi doğal bir klonlama Ģekli olan tek yumurta ikizliğinde görülen benzerliktir. Yani doğan

yeni birey ile genleri kullanılan birey tek yumurta ikizlerinde olduğu gibi düĢünce ve ruh olarak tamamen farklı kiĢilerdir. Bu nedenle klonlamanın yaradılıĢ gerçeği ve kader ile ters düĢen bazı genetik faktörler aynı Ģekilde doğacak yeni bireye aktarılmıĢ olur. Bu da klonlama karĢıtlarının tepki gösterdiğinoktalardan biridir.

Klonlama tedavi amaçlı olarak düĢünüldüğünde insanda iyi izlenimler bıraksa da iĢe insan ve insanıniçinde taĢıdığı hırslar girdiğinde çok tehlikeli boyutlara ulaĢabilir. Örneğin bir canlının bazı organları(kalp,ciğer gibi) hasar gördüğünde baĢka bir canlının organı o canlıya takılamaz, DNA‟lar uyuĢmadığıiçin organı hasar görmüĢ canlının antikor sistemi bu organı kabul etmez ve dolayısıyla bu tür vakalarda

sonuç ölümdür. Fakat organı hasar gören canlının herhangi bir hücresi kullanılarak yapılan klonlamasonucunda dünyaya gelecek bebeğin DNA‟sı organı zarar görmüĢ olan canlı ile uyum gösterir ve organ



72

nakli gerçekleĢebilir. ĠĢte bu noktada insanın içindeki para hırsı göz önüne alındığında, ödenen parakarĢılığında birçok hasta insanın klonlarının sadece organları alınmak için dünyaya getirebileceğigerçeği ortaya çıkar. Klonlama sonucunda doğan ve organı alınan canlı doğal olarak ölürken, organıhasarlı olan birey parası sayesinde bir süre daha yaĢayabilir. Bu tür bir olay tam bir ahlak çöküntüsüdür ve ne kadar yasa çıkarsa çıksın ya da ne kadar önlem alınırsa alınsın bu olayın önüne tam olarak

geçebilmek mümkün değildir. Günümüzde de birçok böbrek kaçak yollardan satılmaktadır. Fakat hiçbir kanun ya da yasa bu olayı tam olarak ortadan kaldıramamıĢtır. ĠĢte klonlamanın düĢünülmesi gereken veasla göz ardı edilemeyecek bir yüzü de budur. Bu ve benzeri düĢüncelerle yola çıkan bir çok bilim adamıve bilim kuruluĢu klonlama çalıĢmalarının kesinlikle durdurulması gerektiğini savunmaktadır. Ve yineaynı duyarlılık ile yaklaĢan birçok geliĢmiĢ ülke sınırları içerisinde her türlü klonlama çalıĢmasınıyasaklamıĢtır. Bu tartıĢma daha çok uzayacağa benzer, ahlaki değerleri savunan bilim adamları mıyoksa klonlama kaçınılmaz bir bilimsel gerçektir diyen bilim adamları mı galip gelecek, bunu zamangösterecek.

KENDĠ ORGANINI KENDĠN YAP

Bir hastanın kendi dokularını kullanarak yeni organlar üretmesi, kimsenin düĢleyemeyeceği kadar kolayolabilir. Bilim adamlarına bu güveni veren, yetiĢkin beyin hücrelerini kolaylıkla kan halinedönüĢtürebilmeleri. ġimdiye kadar hücrenin kimliğinde böylesine kökten bir değiĢikliğin, ancak hücreçekirdeği nakliyle gerçekleĢtirebileceği sanılıyordu. Medyatik koyun Dolly, bu yolla kopyalanmıĢtı. Buyöntem, bir yumurta hücresinden kendi genetik malzemenin çıkarılarak, yerine yetiĢkin bir hücreninçekirdeğinin yerleĢtirilmesini içeriyordu. Oysa Ģimdi, bilim adamları, bu iĢ için fare beyninden alınan

sinir kök hücrelerinin hayvanın kemik iliğine naklinin yeterli olacağını söylüyorlar. Eğer aynı Ģeyinsanlarda da gerçekleĢirse, hiçbir doku uyumu sorunu olmaksızın sınırsız bir yedek organ deposunakavuĢmuĢ olacağız. Ġki yıl öncesine kadar, embryonik kök hücrelerinin biçim değiĢtirerek canlıdokularından birine (örneğin göz, beyin ya da tırnak) dönüĢtüğü uzmanlaĢma sürecini geriyedöndürmenin olanaklı olamadığı sanılıyordu. Ancak Ġskoçya‟nın Edinburgh kenti yakınlarındaki RoslinEnstitüsünde Dolly‟i kopyalayan ekip, yetiĢkin hücrelerdeki geliĢme potansiyelinin istenildiği biçimdekullanılabileceğini kanıtladı. Bilim adamları yumurtadaki birtakım unsurların hücre genlerini yeniden

programlayarak embryonik (uzmanlaĢma öncesi) duruma getirdiklerini ve böylelikle hücrenin herhangi bir dokuya dönüĢmesine olanak sağladığını görürler. Ama Ġtalya‟nın Milano kentindeki Ulusal NörolojiEnstitüsü araĢtırmacılarından Angelo Vescovi ve ekibi bu yeniden programlamanın cerrahi bir

müdahale (hücre nakli vs.) olmadan da gerçekleĢebileceğini düĢündüler. Ġtalyan araĢtırmacılar, farelerin beyinlerinden aldıkları sinir kök hücrelerini (neural stem cells NSC) hayvanların kemik iliklerineaĢıladılar. Ancak daha önce, yeniden programlanma sürecini tetikleyeceği umuduyla kemik iliğinin kanüreten kendi hücrelerini ıĢınıma tabi tutarak etkisizleĢtirdiler. Gerçekten de nakilden beĢ ay sonra denek fareler yeni kan hücreleri üretmeye baĢladı. Yapılan genetik tahliller, bu hücrelerin NSC‟lerdenkaynaklandığını kanıtladı. ĠĢin daha ilginç yanı, denek farelerde kan hücrelerinin, kendi kemik ilikleriıĢınlandıktan sonra ilik nakli yapılan ikinci bir grup fareden bir ay daha geç oluĢması. Vescovi, bugecikmenin hücrelerin yeniden programlanma sürecinden kaynaklandığını söylüyor. Bu da varsayımındoğruluğunu kanıtlıyor: Hücreler yeni bir doku oluĢturmadan önce geliĢme süreçlerini geri vitesetakarak uzmanlaĢma öncesi durumlarına kadar geri dönüyorlar ve yeni görevleri için yeniden

programlanıyorlar.



73

GeliĢtirilen tekniğin ufkunda insanlara sıfır kilometrede yeni organlar sağlanması var. ABD‟ninMaryland eyaleti Baltimore kentindeki John Hopkins Üniversitesinden bir ekip insan embryonik kökhücreleri elde etmeyi baĢarmıĢ bulunuyor. Ama Ġtalyan ekibinin lideri Vescovi, yeni dokunun kaynağıolarak baĢka dokulardan, örneğin beyin yerine deriden alınan kök hücreler kullanılabileceğine inanıyor.Bu hücrelerin elde edilmesi çok daha kolay. Vescovi, böylelikle hastalar, kendilerini iyileĢtirecek

hücreleri yabancı embriyolardan almak yerine kendi kendilerine üretebilecekler diyor. (New Scientist,30 Ocak 1999)

ĠNSAN KLONLANMASINDA BĠR ADIM DAHA

KlonlanmıĢ (kopyalanmıĢ) kuzu Dolly‟nin babası Ian Wilmut Amerikan firması Geron ile birlikte, insanklon hücrelerini doku kültürlerinde tıbbi amaçlarla çoğaltmaya baĢladı. Diğer yandan Amerikan Ulusal

Sağlık Enstitüsü de insan klonlamayı özel sektör tekelinde bırakmamak için, bu araĢtırmalara baĢlamıĢbulunuyor.

KlonlanmıĢ bir embriyonun farklılaĢmıĢ hücreleri vücut dıĢında özel bir besleyici sıvıda çoğaltılır; bunadoku kültürü denir. Bu hücreler kültürde sinir, kan, pankreas, kas vb. hücrelerine dönüĢür; bu hücreler

bunama (Alzheimer hastalığı), lösemi, Ģeker hastalığı, kalıtsal kas erimesi (Duchenne hastalığı) ve hattaAIDS tedavisinde kullanılabilecek . (Science et Vie, Nisan 1999)

KLONLAMANIN TEHLĠKELERĠ

Metal, elektrot, implant gibi inorganik araçların yerine, biyolojik araçların uygulamalı biyonik kullanımı, insanlık için geniĢ ufuklar açıyor. Belki bizim yarattığımız makineler bizi geçecek, amayavaĢ da olsa milyarlarca yıllık evrimin canlılara kazandırdığı yaĢama, soyunu devam ettirme dürtüsünüde yabana atmamak gerek.

Ġnsan-makine kavgasında hemcinslerimiz, sınırsız sayıda bir yedekler ordusuna sahip olabilir. Yine bukök hücrelerin manipülasyonu yoluna dayanan bir yöntemle istediğimiz sayıda genetik kopyalarımızıçıkartabiliriz. Bu alandaki ilk örnek tabii ki kuzu (Ģimdi torun sahibi koyun) Dolly. Annesinin genetikkopyası.

ġimdiye kadar pek çok hayvan klonlandı. Getirilen tüm etik ve yasal sınırlamalara karĢın, ilk insanklonlarının da 21. yüzyılın ilk beĢ yılı içinde ortaya çıkması bekleniyor. Ancak bu yöntemin sorunları daufukları kadar geniĢ. Bir kere, aĢılanan embriyonların ancak çok küçük bir bölümü yaĢayabiliyor.

KopyalanmıĢ canlıların kromozomları uçlarında bulunan ve yaĢlandıkça kısalan telomer adlı uzantıların boyu da model canlıdaki kadar oluyor. Bir baĢka deyiĢle kuzu Dolly'nin hücreleri, doğduğundaannesindekiler kadar yaĢlıydı. Bu da kopyaların erken ölümü demek.

BaĢka bir sorun da bizim kopyalarımızın yalnızca fiziksel özelliklerimizi taĢımaları. Boy, deri, saç, göz,deri rengi gibi. Oysa baĢka özelliklerimiz, örneğin zekâmız yönelimlerimiz; yetiĢtirilme biçimimiz,

aldığımız gıda, eğitim, çevre gibi dıĢ etmenlerin bir türevi. Dolayısıyla makinelerle savaĢ kaçınılmaz



74

olursa kopyalarımız, en azından bazıları, cesur savaĢçılar yerine pekala iĢbirliğine yatkın korkaklar daolabilirler.

Kaldı ki insan kaynaklarımızı sınırsız yapmaya çalıĢırken kendi bindiğimiz dalı da kesebiliriz. Çünküçoğalmanın doğal yolu olan seks sayesinde ana ve babamızdan eĢit ölçüde gen alıyoruz. Bu da bizi

ileride ortaya çıkabilecek sağlık tehditlerine karĢı dirençli kılacak yeni yeni gen bileĢimleri sağlıyor.Klonlama uygulamasının yaygınlaĢması, insan gen havuzundaki zengin çeĢitliliği tehlikeli biçimdedaraltır.

KLONLAMA ĠLE ĠLGĠLĠ YAPILMIġ ÖNEMLĠ ÇALIġMALAR

DONMUġ FAREDEN KOPYA

Japon bilim adamları, 16 yıldır donmuĢ halde bulunan fareyi kopyalamayı baĢardı. Kopyalamada klasik hücre çekirdeği transfer yöntemi kullanıldı. Japonya‟nın Yokohama kentindeki RIKEN araĢtırmaenstitüsüne bağlı GeliĢimsel Biyoloji Merkezi‟nden fare kopyalama uzmanı Teruhiko Wakayama vemeslektaĢları, farenin hücre zarları, donmadan ötürü çatlamıĢ olduğu halde hayvanıkopyaladı.Wakayama‟nın ekibi, kopya farelerin oluĢturulması için klasik hücre çekirdeği transfer yöntemini kullandı. Yumurta hücresinden hücre çekirdeği çıkarıldı ve yumurtaya bunun yerine, kopyasıyetiĢtirilecek olan donmuĢ hayvanın normal bir hücresinden hücre çekirdeği alınarak yerleĢtirildi.Ardından doğru biçimde kimyasal ve elektriksel tetikleme yapılarak, yumurta hücresinin, tıpkı bir sperm hücresiyle döllenmiĢ gibi bölünerek çoğalmaya baĢlaması sağlandı. ÇalıĢmalarını, “Proceedings of the National Academy of Sciences” adlı bilimsel dergide kaleme alanaraĢtırmacılar, hücre çekirdeği transfer tekniklerinin, hayvanların yeniden canlandırılmasındakullanılabileceğini belirttiler. Makalede, bu tekniğin ayrıca, genetik stoklar oluĢturularak korunmasıgereken türlere ait genetik bilgilerin sonraki kuĢaklara aktarılmasını sağlayacağı belirtildi. AraĢtırmacılar tekniğin, organizma parçalarının dondurularak uzun süreler saklanması yoluyla, değerligenetik stokların oluĢturulabilmesine ve ileride gerekli olduğunda kullanılabilmesine imkansağladığının altını çizdi. AraĢtırmacılar makalelerinde, “Hücre çekirdeği transferi yöntemi bizlere, türü tükenme tehlikesi altındaolan memelileri koruma imkanı sağlıyor” Ģeklinde yazdı.

MAMUT YENĠDEN ORTAYA ÇIKARILABĠLECEK MĠ?

Ancak araĢtırmacılar, soyu tükenmiĢ hayvanların yeniden yaratılmasının, bunlara ait canlı ve genetiğideforme olmamıĢ hücrelere ulaĢılmadığı sürece mümkün olmadığını da belirttiler.

AraĢtırmacılar Ģu ifadeyi kullandı: “DonmuĢ durumda elde edilebilen, mamut gibi türü tükenmiĢ hayvanların canlı hücreleri eldeedilemeyeceği için ve geriye kalan genetik maddeler deforme olmuĢ olacağı için, kopyalanarak yenidencanlandırılmaları, uygulanabilir değildir.” Rus bilim adamları Sibirya‟da, 40.000 yıl önce donarak ölmüĢ bir mamut kalıntısı bulmuĢlardı.Wakayama‟nın ekibi, bu tür kalıntılardan klonlama yapmanın kullanılabilir hücre çekirdeği

bulunmasına bağlı olduğunu vurguladılar.



75

KLONLANMIġ 3 BEBEK YAġIYOR

Kopya insan yöntemiyle uğraĢan ilk doktor olarak tanınan Ġtalyan Severino Antinori, bu bebeklerin 9yaĢında olduğunu ve Doğu Avrupa'da yaĢadıklarını söyledi. Dünyada kopya insan yöntemiyle uğraĢanilk doktor olarak tanınan Ġtalyan Severino Antinori, Ġtalya'da yayımlanan Oggi dergisinine verdiğidemecinde, ''Ġnsan klonlama tekniğiyle 3 çocuğun doğmasına yardımcı oldum. Ġkisi erkek, biri kız ve

bugün 9 yaĢındalar. Sağlıklı doğdular ve Ģu anki sağlık durumları da çok iyi'' ifadesini kullandı.

Severino Antinori, Doğu Avrupa ülkelerinde yaĢayan çocukların ailelerinin özel yaĢamlarına saygıgöstermek zorunda olduğu için ayrıntı veremeyeceğini, ancak Ġskoç Profesör Ian Wilmut'un ilk kopyahayvan Dolly'yi üretirken kullandığı tekniğin geliĢtirilmiĢ halini kullandıklarını belirtti.

64 yaĢındaki Antinori, 5 yıl önce dünyada klonlama yöntemiyle 3 çocuğun dünyaya geldiğini söylemiĢ,ancak ayrıntı vermemiĢti.Severino Antinori, 1994'te 63 yaĢındaki bir Ġtalyan kadının doğum yapmasınısağlayarak üne kavuĢmuĢtu.



KAYNAKLAR:

Ensari Y. Moleküler biyoloji

Bahçeci Z. Moleküler Biyoloji

Kayhan Y. Klonlama Uygulamaları

Artur, c. ve Laurance, J. 1998. Clonning (http.www.independent.co.ok)

http://www.medical-ethics.net/Files/Klon.html

Okumus, 1997. Genetik Kopyalama ve Uygulaması. Prognoz. Cilt1,sayı2, S81-82

http://www.tubitak.gov.tr

www.genbilim.com

www.bilimteknik.com

Fikriye Özkan



http://www.tubitak.gov.tr/


http://www.genbilim.com/


http://www.bilimteknik.com/






biyoteknoloji ve genetik kopyalama

Documents