f:$.L BIOTECNOLOGIA DE LOS ENZIMAS

a la mitad de la actividad del enzima, estimndose que es necesario utiliM^ menos siete columnas para que la produccin vare solo en torno al lo o/ i

Recientemente Tate y Lyle han tenido xito en el desarrollo de una prepa#r cin de amiloglucosidasa utilizable comercialmente cuya principal ventaja es s alta actividad volmica, y por lo tanto la posibilidad de utilizarla con flujos elevados, siendo el tamao de la planta necesario considerablemente menor que cuando se utiliza el enzima en solucin (Fig. 3.4). La amiloglucosidasa se inmoviliza como un gel de protena activa enzimticamente por precipitacin con acetona y entrecruzado simultneo con glutaraldehido en presencia de hueso carbonizado que acta como soporte mecnico inerte para el gel de enzima (Daniels y Farmer, 1981). Este mtodo se ha llevado con xito hasta gran escala y est inicindose su uso comercial en Estados Unidos en las plntas procesado- ras de maz.

La amiloglucosidasa inmovilizada ha encontrado tambin aplicacin en la sacarificacin de la corriente de polisacridos de baja DP resultante de la separacin cromatogrfica de los jarabes de fructosa, para aumentar el contenido de esta ltima (Poulsen et al., 1980) y para hidrolizar las molculas de maltosa residuales despus de la isomerizacin alcalina de la maltosa (Walon, 1980).

3.14.4. Jarabes de maltosa

Se producen dos tipos fundamentales de jarabes de maltosa (Tabla 3.9). Uno de ellos tiene un contenido de 30-50 % de maltosa y el 6-19 7o de glucosa, un equivalente de dextrosa de 42-49-y se utiliza en mermeladas y pastelera por su resistencia a l aparicin de color, no seY higroscpico y no cristalizar tan fcilmente como los jarabes de glucosa. El otro contiene del 30 al 40 97o de maltosa, 30-50 H de glucosa y un equivalente de dextrosa de 63-70. El contenido de azcares fermentables es alto y se mantiene estable durante el almacenamiento; tambin se utilizan en cervecera y panadera (Maeda y Tsao, 1979) por lo que a veces de les denomina brewers adjunt.

Las a-amilasas fngicas derivadas del A. niger y oryzae son mucho menos estables al calor que las a-amilasas bacterianas, pero se emplean mucho ms porque producen grandes cantidades de maltosa y maltotriosa a partir de almidn licuado. El enzima acta hidrolizando el penltimo enlace glicosdico a-1-4 del extemo no reductor de las cadenas de amilosa o amilopectina, liberando unidades de maltosa en forma secuencial hasta que la accin del enzima se ve limitada por un enlace a-1-6. En tanques con agitacin se obtienen jarabes de 10-20 equivalentes de dextrosa, que contienen aproximadamente un 50 97o de maltosa, con la relacin usual entre la concentracin de enzima, substrato y el tiempo de incubacin. El proceso finaliza por desnaturalizacin trmica del enzima a 80-85 C, aunque para hidrolizar totalmente el almidn a maltosa se necesita un enzima adicional, como la pululanasa.

La /3-amilasa (EC 3.2.1.2) est ampliamente distribuida en las plantas superiores, especialmente en la cebada y en los granos de soja; es un exoenzima, que produce /3-maltosa, se inhibe por los reactivos de grupos sulfhidrilo y tiene un pH ptimo de 6,5-7,0. La /3-amilasa no hidroliza los enlaces a-1-6, por lo que no hidroliza totalmente las molculas de amilopectina del almidn. Produ-

/22 BIOTECNOLOGIA DE LOS ENZIMAS

a la mitad de la actividad del enzima, estimndose que es necesario utiliza menos siete columnas para que la produccin vare solo en torno al 10 f!

Recientemente Tate y Lyle han tenido xito en el desarrollo de una prepara cin de amiloglucosidasa utilizable comercialmente cuya principal ventaja es su alta actividad volmica, y por lo tanto la posibilidad de utilizarla con flujos elevados, siendo el tamao de la planta necesario considerablemente menor que cuando se utiliza el enzima en solucin (Fig. 3.4). La amiloglucosidasa se inmoviliza como un gel de protena activa enzimticamente por precipitacin con acetona y entrecruzado simultneo con glutara-ldehido en presencia de hueso carbonizado que acta como soporte mecnico inerte para el gel de enzima (Daniels y Farmer, 1981). Este mtodo se ha llevado con xito hasta gran escala y est inicindose su uso comercial en Estados Unidos en las plntas procesado- ras de maz.

La amiloglucosidasa inmovilizada ha encontrado tambin aplicacin en la sacarificacin de la corriente de polisacridos de baja DP resultante de la separacin cromatogrfica de los jarabes de fructosa, para aumentar el contenido de esta ltima (Poulsen et al., 1980) y para hidrolizar las molculas de maltosa residuales despus de la isomerizacin alcalina de la maltosa (Walon, 1980).

3.14.4. Jarabes de m altosa

Se producen dos tipos fundamentales de jarabes de maltosa (Tabla 3.9). Uno de ellos tiene un contenido de 30-50 % de maltosa y el 6-19 % de glucosa, un equivalente de dextrosa de 42-49-y se utiliza en mermeladas y pastelera por su resistencia a 1- aparicin de color, no sr higroscpico y no cristalizar tan fcilmente como los jarabes de glucosa. El otro contiene del 30 al 40 97o de maltosa, 30-50 % de glucosa y un equivalente de dextrosa de 63-70. El contenido de azcares fermentables es- alto y se mantiene estable durante el almacenamiento; tambin se utilizan en cervecera y panadera (Maeda y Tsao, 1979) por lo que a veces de les denomina brewers adjunt.

Las a-amilasas fngicas derivadas del A. niger y oryzae son mucho menos estables al calor que las a-amilasas bacterianas, pero se emplean mucho ms porque producen grandes cantidades de maltosa y maltotriosa a partir de almidn licuado. El enzima acta hidrolizando el penltimo enlace glicosdico a-1-4 del extemo no reductor de las cadenas de amilosa o amilopectina, liberando unidades de maltosa en forma secuencial hasta que la accin del enzima se ve limitada por un enlace a-1-6. En tanques con agitacin se obtienen jarabes de 10-20 equivalentes de dextrosa, que contienen aproximadamente un 50 97o de maltosa, con la relacin usual entre la concentracin de enzima, substrato y el tiempo de incubacin. El proceso finaliza por desnaturalizacin trmica del enzima a 80-85 C, aunque para hidrolizar totalmente el almidn a maltosa se necesita un enzima adicional, como la pululanasa.

La jS-amilasa (EC 3.2.1.2) est ampliamente distribuida en las plantas superiores, especialmente en la cebada y en los granos de soja; es un exoenzima, que produce /3-maltosa, se inhibe por los reactivos de grupos sulfhidrilo y tiene un pH ptimo de 6,5-7,0. La /3-amilasa no hidroliza los enlaces ct-1-6, por lo que no hidroliza totalmente las molculas de amilopectina del almidn. Produ

y324 BIOTECNOLOGIA DE LOS ENZIMAS

ce un 80 % de maltosa, y un 20 Io de jarabes de dextrina cuando se incuba con almidn licuado en medio cido a temperaturas elevadas o con a-amilasa bacteriana.

Los jarabes de maltosa pueden fabricarse a partir de a-amilasa fngica, microbiana o de plantas superiores, slo hasta un equivalente de dextrosa bajo, minimizando la formacin posterior de maltotriosa. La maltosa se produce mediante la a-amilasa o la |3-amilasa maltognica, el jarabe se calienta para desac- tTvaTl enzima, y se clarifica, decolora y concentra por evaporacin. Las | amilasas de cebada y soja se han utilizado extensamente, pero como son relativamente caras, el empleo de enzimas microbianos ha ido en aumento. Desgraciadamente, las /3-amilasas no hidrolizan los enlaces a-1-6 del almidn de modo que se forman dextrinas /3-limitadas y el contenido final de maltosa es del 60 %. Por esta razn se ha propuesto el combinar la /3-amilasa con enzimas desramificantes, como por ejemplo la pululanasa.

La amiloglucosidasa y la a-amilasa fngica se han utilizado conjuntamente debido a que ambos enzimas tienen un pH ptimo similar para obtener jarabes de alta conversin que contienen de un 30 a un 35 7o de glucosa y de un 40 a un 45 Io de maltosa. Estos jarabes se emplean mucho y no cristalizan incluso a temperaturas bajas y concentraciones de slido altas.

Las jS-amilasas microbianas provienen de B. megaerium, circulans cereus y polymyxa, as como de Pseudomonas y Streptomyces spp. Estos enzimas microbianos tienen la ventaja de que son en principio ms baratos y abundantes que los derivados de plantas superiores.

Una observacin potencialmente importante es la de que la /3-amilasa y las a-l-6-glucosidasas pueden formarse simultneamente en ciertas especies de Ba- cillus , lo qu representa una ventaja pbrque, previamente, tenan que cultivarse dos organismos separadamente y debido a las diferencias existentes entre el pH y la temperatura que necesitan los dos enzimas era difcil que ambos actuaran simultnemente con el almidn. El resultado era la necesidad de un procedimiento en dos etapas para la manufactura de la maltosa. La formacin de a-l-6-glucosidasa se ve claramente estimulada por la presencia de iones Mnz + en el medio, que, sin embargo, tienden a suprimir la formacin de /-amilasa, por lo que debe controlarse cuidadosamente el momento y la cantidad de Mn2 + aadido. Los enzimas son extracelulares, precipitan con sales o solventes orgnicos y se aslan por adsorcin mediante almidn, carbn o tierra de diatomeas. A partir de B. subtilis se ha obtenido una /3-amilasa activa en medio alcalino y estable en presencia de agentes quejantes (Boyer e Ingle, 1977) y a partir de Streptomyces se ha obtenido una 3-amilasa cuyo pH ptimo es cido (Koaze et al., 1975).

Se ha propuesto la obtencin de jarabes de maltosa mediante un sistema de dos enzimas inmovilizados (Martensson, 1974), por ejemplo por coinmovilizacin de /3-amilasa y pululanasa, enzima desramificante, en un copolmero entrecruzado de acrilamida y cido acrlico. Como estos dos enzimas actan se- cuencialmente en el mismo substrato, mediante este sistema de coinmovilizacin Se pueden esperar claras ventajas debidas a los efectos microambientales. Tambin se ha observado un incremento en la estabilidad operacional con respect a los enzimas solubles.

f Tabla 3.9Composicin de los jarabes de glucosa

APLICACION DE LOS ENZIMAS EN LA INDUSTRIA 325

% Sacridos (sobre carbohidratos)

Equivalente i>p DP DP DP DP DP DP

Muestra de dextrosa 1 2 3 4 5 6 7

Jarabe de glucosa AC b 27 9 9 8 7 7 6 54Jarabe de glucosa AC 36 14 12 10 9 8 7 40Jarabe de glucosa AC 42 20 14 12 9 8 7 30Jarabe de glucosa AC 55 31 18 12 10 7 5 17Jarabe de glucosa HM, DC 43 8 40 15 7 2 2 26Jarabe de glucosa HM,, DC 49 9 52 15 1 2 2 19Jarabe de glucosa DC 65 39 31 7 5 4 3 11Jarabe de glucosa DC 70 47 27 5 5 4 3 9Jarabe de glucosa DC, E 95 92 4 1 1 suma de 2

\

5 , 6 , 7

a DP = grado de polimerizacin. b AC = conversin del cido, DC

E = conversin de enzima. De M aeda y 'Rao (1979).

conversin dual (cido-enzima), HM = maltosa rica,

De una form a similar, se ha inmovilizado /3-amiIasa jun to con a-l,6-glucoxidasa, ambos obtenidos a partir de Bacillus cereus mediante adsorcin con carbn activo. Este sistema de dos enzimas inmovilizados hidroliza el alm idn a 50 C a un producto formado por 90,5 97o de maltosa, 7,5 % de m altotriosa y 2 /o de otros oligosacridos (Ikkasaky y Takahara, 1976).

3.14.5. Glucosa isomerasa (EC 5.3.1.5)

La glucosa tiene aproximadamente el 65 Io del poder edulcorante de la sacarosa en peso y la fructosa del 120 al 180 7o> en funcin de ls condiciones del anlisis. Por tanto, si se convierte la glucosa,, fcilmente disponible y muy barata cuando abunda el almidn de maz, en fructosa, el producto aumenta su dulzura y en consecuencia su valor. Una forma de. llevar a cabo esto es mediante la isomerizacin alcalina, aunque esta tcnica produce un color excesivo y demasiados subproductos. Las D-xilosas ceto isomerasas isomerizan la glucosa a concentraciones elevadas, dando lugar a jarabes de maz ricos en fructosa; este procedimiento, que produce todo el jarabe de maz rico en fructosa (HFCS) elaborado actualmente, es el que ms enzima inmovilizado consume mundialmente y su produccin alcanza varios millones de toneladas de producto por ao. La disponibilidad de jarabes de maz ricos en fructosa ha alterado radicalmente el mercado de los carbohidratos edulcorantes en USA, donde ha despla-

rr 326 b i o t e c n o l o g a d e l o s e n z i m a s

Tabla 3.10Mtodos de inmovilizacin utilizados para la explotacin comercial

de la glucosa isomerasa

Compaa Mtodos de inmovilizacint

Novo Industry, ~ 1 -

Clls lisadas de Bacillus coagulons, entrecruzadas con gluta-raldehdo y granulado

ICI Americas Inc. Clulas floculadas de Arthrobacter, calentadasy granuladas

G ist-Brocades Clulas de Actinoplanes missouriensis atrapadas en gelatina,entrecruzadas con glutaraldehido y granuladas

Clinton Corn Processing Co. Extracto de enzima adsorbido en resinas cam biadoras de ionesMiles Labs. Inc. Clulas entrecruzadas con glutaraldehido y granuladasMiles Kali-Chemie Clulas entrecruzadas y granuladasCPC Int. Inc. Extracto de enzima adsorbido a soportes cermicos granularesSanmatsu Enzima adsorbido en resinas cam biadoras de ionesSnam Progetti Clulas atrapadas en fibras de acetato de celulosa

t A menos que se manifieste lo contrario, se emplean Streptomyces.

zado a gran parte del mercado cubierto previamente por los jarabes de sacarosa. Sin embargo, las operaciones comerciales dentro de la CEE han experimentado considerables dificultades, debido a que desde 1977 han sido gravadas con una elevada tasa a fin de salvaguardar la produccin de sacarosa a partir de remolacha azucarera. \

La prim era glucosa isomerasa fue descrita por M arshall y Kooi en 1957. Este enzima es ap to para ser utilizado en forma inmovilizada puesto que es intra- celular, es estable a tem peraturas elevadas, suficientes para frenar la contam inacin m icrobiana, y porque todos los reactantes son molculas pequeas de forma que p lan tean pocos problemas de difusin. Para activar el enzim a es necesario aadir trazas de magnesio, en forma de sulfato de magnesio. Los iones magnesio sufren la com petencia de los iones calcio, por lo que su concentracin debe ser de aproxim adam ente 20 veces mayor que la necesaria. Para la isomeri- zacin de xilosa se necesitan iones M n2+ , eri tanto que p a ra la isomerizacin de xiloxa y glucosa se necesitan iones Co2+ . Sin em bargo, los iones Co2+ se unen fuertem ente al enzim a, por lo que no deben aadirse al substrato.

La form acin de subproductos durante la isom erizacin depende del pH , la tem peratura y el tiem po de reaccin. El empleo de colum nas de enzima inmovilizado hace que el tiem po de contacto sea m ucho m enor com parado con el necesario en las reacciones discontinas y por tan to la form acin de color se reduce mucho, particularm ente si se com para con los prim eros productos formados por el enzim a soluble en los procesos discontinuos, en los que debe m antenerse un m edio ligeram ente alcalino durante bastan te tiem po si se quiere lograr una isom erizacin com pleta.

Para inm ovilizar glucosa isom erasa se pueden utilizar m uchos sistemas, incluyendo clulas enteras y preparaciones libres de clulas (Tabla 3.10). Los primeros intentos de inm ovilizar glucosa isom erasa partan del enzim a proveniente de Streptom yces parcialm ente purificado y adsorb ido en D E A E celulosa. El

APLICACION DE LOS ENZIMAS EN LA INDUSTRIA 327

Tabla 3.11Produccin de glucosa y jarabes ricos en fructosa a partir dei almidn

Pasta de almidn (34-40 % de slidos)

__ a-am ilasa bacteriana

A lm idn hinchado y gelatinizado

am iloglucosidasa

Jarabe sacarificado con DE 96

_ filtracin/clarificacin/ desionizacin

Jarabe de glucosa 40-50 97o en peso evaporacin jarabe de glucosa

Mg S04

glucosa isomerasa

corriente enriquecida en glucosa Jarabe rico en fructosa

cristalizacin

Dextrosa m onohidratada producto

desionizacinevaporacin

Jarabe rico en fructosafructosa 42 7ot slidos 72 7o

'v

separacin cromatogrfica

Jarabe de fructosa 90-95 97o

mezclado

jarabe de fructosa 55 %fructosa90-95 7o

fructosa 42 7o

prim er proceso comercial, introducido en 1974, trabajaba en discontinuo, aunque desde entonces, las propiedades mecnicas de las preparaciones de glucosa isom erasa inm ovilizada se han m ejorado de form a que. ahora pueden emplearse para em paquetar reactores de relleno (Tkbla 3.11); En general, se necesitan un m nim o de ocho reactores de relleno en paralelo para m antener una productibi- lidad global constante. En los procesos discontinuos las condiciones de reaccin no son ptim as porque para perodos de reaccin demasiado largos, se forman m uchos subproductos y el color es intenso. En los reactores de relleno, el tiem po de reaccin es relativamente corto, por lo que se pueden emplear unas condiciones de isom erizacin ptim as a fin de obtener un producto ms puro. Las clulas inm ovilizadas agotadas se pueden emplear para alimentar el ganado vacuno. Ms recientemente, las plantas utilizadas consisten en preparciones

BIOTECNOLOGIA DE LOS ENZIMAS

de clulas enteras de Bacillus, Streptomyces, Actinoplanes o Arthroh binadas en partculas estables con buenas propiedades hidrulicas r n e d ^ ^ n a gran variedad de mtodos, entre los que se incluye la floculacin el^alenta- miento y el entrecruzamiento con glutaraldehido o compuestos similares Buc- ke y Wiseman, 1981). La mayora de los jarabes de glucosa ricos en fructosa manufacturados en la actualidad se fabrican utilizando preparaciones de Novo de clulas enteras de Bacillus coagulans, em pleado en varias plantas en USA y tambin en Europa, Japn y Corea del Sur, con capacidades de hasta 1.200 toneladas de extracto seco. La capacidad total de fabricacin de estas plantas puede estimarse en varios millones de toneladas por ao.

La glucosa isom erasa asociada con las clulas de Bacillus coagulans se separa por centrifugacin del medio de cultivo, se entrecruza con glutaraldehido, se rompe en pequeas partculas y se seca para m ejorar la resistencia mecnica de los grnulos. Otros procedimientos alternativos incluyen la congelacin del precipitado entrecruzado previo al secado, someter las clulas a autolisis antes de entrecruzarlas y despus flocularlas y secarlas, o la disrupcin de las .clulas y despus floculacin y entrecruzamiento del hom ogenado. El enzima inmovilizado se emplea en reactores en colum na a una tem peratura de aproximadamente 60 C para producir jarabes que contienen aproxim adam ente un 42-43 % en peso de fructosa y una intensidad de color y contenido de psicosa bajos (Amotz et. al., 1976).-(Fig. 3.2). ||9 H N M

Gist Brocades emplea una glucosa isomerasa obtenida a partir de una cepa de Actinoplanes missouriensis. Las clulas se cultivan en jarabe de maz como medio, m ejorando el rendimiento en enzima mediante la adicin de melazas como fuente de carbono. El enzima fijado al micelio se atrapa en gelatina y se entrecruza cof glutaraldehido. La eleccin de este sistema de inmovilizacin se basa en que tan to el material de soporte como los reactivos de acoplamiento estn perm itidos en los productos comestibles o com o auxiliares tecnolgicos. El procedimiento global de inmovilizacin es continuo y se puede aplicar a otros enzimas utilizados en el procesado de alimentos. La preparacin enzimtica est formada por partculas esfricas uniformes de 1 mm de dimetro. El tiempo de reduccin a la m itad de la actividad de dichas preparaciones es de aproximadamente 430 horas en los procesos discontinuos en presencia de cobalto, y de 500 horas en las operaciones en colum na en ausencia de cobalto.

R.J. Reynolds Tobacco Co. utiliza una cepa de Arthrobacter para la produccin de glucosa isomerasa. Las clulas se agregan y posteriorm ente se procesan antes de ser usadas en un reactor de lecho fijo (Patente de USA 3645848,1972). Los Laboratorios Baxter tienen un proceso basado en un enzima obtenido de Streptomycesphaeochromogenes', inmovilizado en un soporte de celulosa cambiadora de aniones (Patente inglesa 1274158, 1972). C linton Corn Productos, uno de los pioneros en este campo, introdujo en 1972 un proceso industrial basado en la glucosa isomerasa (aislada de Streptomyces) inmovilizada (Thompson et al., 1974). El enzima se adsorbe en DEAE-celulosa y se utiliza en un proceso continuo controlado por un microprocesador. El reactor consiste en varios lechos planos colocados en serie de form a que cada uno contenga un material de distinta edad, y la isomerizacin se lleva a cabo a 60 C a un pH entre 7,0 y 7,5 utilizando como substrato una solucin de glucosa al 73 % con el 30-35 7o de slidos. El producto resultante contiene un 42 7o de fructosa.

APLICACION DE LOS ENZIMAS EN LA INDUSTRIA 329

La glucosa isomerasa tambin se puede obtener a partir de Corynebacte- rium, Curtobacterium, Bacillus stearothermophilus y Flavobacterium arbores- cens, donde es excepcional en el sentido de que puede obtenerse una actividad enzimtica mxima cuando las clulas crecen en lactosa.

La lista de preparaciones de glucosa isomerasa inmovilizada puede extenderse considerablemente. Por- ejemplo, la glucosa isomerasa purificada ha sido inmovilizada en vidrio poroso, DEAE celulosa y resinas de fenol-formaldehdo, y tambin ha sido atrapada en fibras de celulosa y en fibras huecas. Las clulas enteras con actividad isomerasa han sido inmovilizadas por atrapamiento en fibras de acetato de celulosa as como en membranas de poliacrilamida y colgeno. Sin embargo, el uso potencial como catalizadores industriales de la mayor parte de estas preparaciones parece ser limitado, especialmente cuando existen ya en el mercado un cierto nmero de procesos, como los descritos anteriormente (Brodelius, 1978).

No obstante, existen signos que demuestran una tendencia a volver a las preparaciones inmovilizadas en las que los enzimas solubles, parcialmente purificados, se inmovilicen en soportes inorgnicos que son estables y con excelentes caractersticas de flujo, puesto que su mayor costo se ve compensado por el aumento en diez veces de las actividades volumtricas, lo que permite emplear una planta ms compacta, disminuyendo as el capital inicial del proceso.

A pesar del espectacular xito comercial de la glucosa isomerasa an caben mejoras. Un enzima que no fuera inhibido por el calcio podra encontrar fcilmente mercado, puesto que el refinado poda llevarse a cabo despus del tratamiento enzimtico, eliminando as al menos una etapa de refinado. Las glucosas isomerasas empleadas comnmente operan satisfactoriamente a 55-60 C, por lo que tambin sera bienvenido un enzima estable a una temperatura algo ms alta, as como un enzima capaz de operar a pH inferiores a 7, para que la formacin de color resultante de la destruccin de la glucosa fuese baja. No es probable que se pueda mejorar el contenido de fructosa en los jarabes ricos en fructosa. En el equilibrio, el producto contiene aproximadamente un 55 7o de fructosa, pero en la prctica es antieconmico que la reaccin supere el 42 7o de fructosa, concentracin a la que el jarabe es tan dulce en comparacin en peso como la sacarosa, excepto cuando se utiliza en la elaboracin de bebidas cidas como la cola. En tales bebidas la fructusa parece ser menos dulce y se necesitan jarabes con un 55 % de fructosa para reemplazar la sacarosa; estos jarabes se elaboran actualmente utilizando separadores cromatogrficos que producen una corriente rica en fructosa (aproximadamente el 95 7o de fructosa) y otra rica en glucosa. La primera se puede mezclar con el material inicial para enriquecer su contenido de fructosa y la ltima puede ser reciclada. De una forma similar, tambin se pueden obtener jarabes con un 95 7o de fructosa (Bucke y Wiseman, 1981). Obsrvese que se produce en el separador un material rico en glucosa y oligosacridos, que puede ser posteriormente sacarificado con ami- loglucosidasa antes de su posterior isomerizacin (Tabla 3.11).

Se han desarrollado muchas formas nuevas mejoradas de glucosa isomerasa. Por ejemplo, Miles Labs. Inc. (Elkhart, In., USA) produce una nueva forma de glucosa isomerasa inmovilizada mediante calentamiento de clulas de Flavobacterium arborescens y entrecruzamiento con polifenilamina, quitosano y glu- taraldehido, y posterior moldeado y secado. El enzima inmovilizado resultante

330 BIOTECNOLOGIA DE LOS ENZIMAS

tiene un amplio rango de pH til de 6,0 a 8,5, es relativamente insensible a la inhibicin por los metales pesados, tiene un tiempo de reduccin a la mitad de 58 das y produce el 42 7o de fructosa a partir de jarabes con un 40 % de glucosa a 60 C. La actividad inicial es de 2,0-2,5 veces el volumen de la columna por hora para un 42 7o de fructosa, aproximadamente el doble de la actividad que presentan las glucosas isomerasas inmovilizadas comerciales existentes.

Se han llevado a cabo dos ensayos que pretenden conseguir jarabes ricos en fructosa m ediante sistemas distintos a la glucosa isomerasa. Heady (1980) ide un mtodo que im plicaba la polimerizacin de la fructosa derivada de la saca rosa en un polmero levano mediante la fructotransferasa llevan-sacarosa. El polmero se degradaba entonces a jarabe de fructosa que contena del 66 % al 75 % de fructosa m ediante tratam iento con cido diluido o resinas cambiadoras amnicas cidas. La glucosa residual se isomerizaba a fructosa por la glucosa isomerasa, increm entando el rendimiento de fructosa o se fermentaba a etanol.

El segundo proceso utilizaba una glucosa-2-oxidasa (EC 1.1.3.10) derivada de Basidiomycetes que oxidaba la glucosa a glucosona, que mediante hidroge- nacin cataltica produca fructosa:

Glucosa 4- 0 2 ------- H20 2 + glucosona

Glucosona + H2 --------- * fructosa

U na elegante caracterstica de este mtodo es el empleo del perxido de hidrgeno obtenido com o subproducto para oxidar olefinas a epxidos y glico-les. Esto es: . .,

m CloroperoxidasaEtileno'' + HC1 4- H20 2 ------------------- * 2-cloroetanol

NaOH2-cloroetanol ------------- : y epxido etileno

Epoxidasa | ^ , : epxido e tilen o ------------------- etilehglicol

La estabilidad trm ica de la 2-oxidasa se incrementa substancialmente modificando los residuos de lisina con acetimidato de etilo.

3.14.6. Inversin de la sacarosa

La sacarosa, se puede hid.rolizar a azcar invertido mediante cidos o enzimas (Invertasa, E C 3.2.1.26). El producto consiste en una mezcla 1:1 de glucosa y fructosa algo ms dulce que l sacarosa y_se utiliza principalmente en alimentacin y pastelera com o hum ectante para mantener la humedad y evitar el secado. Tambin se pueden utilizar inulinasas e invertasas, derivadas de Aspergillus o Saccharpmyces sp, que estn sobre todo asociadas a las paredes de la clula. Entre las aplicaciones del azcar invertido se incluyen la fabricacin de sucedneos de miel, la industria de la cerveza y las mermeladas ya que cristaliza menos fcilmente que la glucosa, en el recubrimiento de ciertos productos de confitera y en la form acin de centros lquidos en confitera, donde un centro

APLICACION DE LOS ENZIMAS EN LA INDUSTRIA 331

de sacarosa dura que contiene invertasa se recubre con una capa su pe rf ic ia l de chocolate.

La invertasa (0-fructofuranosidasa) permite obtener un jarabe de mayor pureza que la hidrlisis cida de la sacarosa. Aunque la produccin de azcar invertido con enzimas solubles es relativamente barata, se ha intentado inmovilizar el enzima para producir continuamente jarabes invertidos. La invertasa es un enzima relativamente estable, especialmente cuando se emplea en presencia de elevadas concentraciones de sacarosa y su inmovilizacin da lugar a preparaciones cuya vida til es muy larga. Por ejemplo la invertasa de levadura atrapada en fibras de triacetato de celulosa tiene una actividad y estabilidad operacio- nal satisfactorias, especialmente a altas concentraciones de sacarosa en las que el enzima libre demuestra una gran inhibicin por el substrato, que puede correlacionarse con la reducida actividad de agua. Se ha demostrado finalmente que las diferencias observadas entre la invertasa libre y atrapada se deben a los efectos de difusin (Marconi et al., 1974).

3.14.7. Refinado del azcar

3.14.7.1. RajinasaLa rafinosa, un a-galactsido, se acumula en la remolacha azucarera, espe

cialmente cuando su temperatura de cultivo ha sido baja, e interfiere en la cristalizacin de la sacarosa a partir de las molasas de l remolacha azucarera. El rendimiento en sacarosa puede incrementarse hidrolizando la rafinosa con a- galactosidasa (EC 3.2.1.22), debido en parte a la formacin de sacarosa a partir- de la hidrlisis de rafinosa y en parte a la eliminacin de un agente molasogni- co. Los mohos Mortierella vinacea raffinosutilizer son la mejor fuente de~este enzima, que adems, y esto es importante, no producen invertasa. Cuando crecen en condiciones controladas se obtienen grnulos micelianos de tamao uniforme (20-30 luz de malla) que contienen a-galactosidasa. Estos grnulos se emplean cmodamente como fuente de a-galactosidasa inmovilizada en un proceso continuo.

En 1968 Hokkaido Sugar Co. Ltd, Japn (Obara et al., 1976/7) introdujo un proceso industrial basado en los grnulos de a-galactosidasa. Great Western Sugar Co., USA dise un proceso similar, que comenz a funcionar en 1974. El reactor enzimtico consista en un cierto nmero de recipientes abiertos en forma de U equipados con agitadores y una pantalla de separacin en la parte superior para retirar el catalizador de la corriente de producto. Las melazas que se alimentan al reactor se ajustan continamente a aproximadamente el 30 % en peso, a una temperatura entre 48 y 52 C y a un pH de 5,0 a 5,2 utilizando cido sulfrico. El pH ptimo para la reaccin de a-galactosidasa es de 4,0, aunque se mantiene a 5,2 para evitar la inversin catalizada por cidos de la sacarosa. El tiempo de reaccin es.de 1,5 a 5 horas, aunque se puede incrementar sin problemas cuando haya que tratar melazas con mayor contenido de rafinosa. Los grnulos de enzima se emplean unos 25 das y despus se sacan del reactor. La introduccin de enzima en el proceso eleva la capacidad del procesado de la remolacha aproximadamente en un 10 % y la cantidad de sacarosa