bioq.1 qfb a

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA BENITO JUÁREZ DE OAXACA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

CARRERAPLAN DE ESTUDIOS

CLAVE DE LA ASIGNATURA

NOMBRE DE LA ASIGNATURA

QUIMICO FARMACEUTICOBIOLOGO A

2010-2010 BIOQUIMICA 1

PRÁCTICA NÚMERO

NOMBRE DE LA PRÁCTICAFECHA Y DURACIÓN

1EFECTO DE UN ÁCIDO Y UNA BASE SOBRE UN SISTEMA AMORTIGUADOR

6 MARZO13 MARZO4 HORAS

1 INTRODUCCIÓN

2 OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL: El alumno comprobará la capacidad amortiguadora de un Buffer.

3 FUNDAMENTO

4 PROCEDIMIENTOA EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS

NECESARIOSMATERIAL DE APOYO

2 pipetas graduadas de 10 ml 4 Vasos de precipitados de 250 ml 3 Probetas 100 ml 2 Pipetas 5 ml Propipeta Agua destilada Buffer HCl NaOH Buffer de Referencia pH 4 y pH 7. pHmetro

Etiquetas Plumón indeleble Pañuelos

desechables.

B DESARROLLO DE LA PRÁCTICA




Efecto de un ácido:

1. Colocar en un vaso de precipitado 50 ml de agua destilada y determinar el pH. Tomar la lectura de pH.

2. Añadir 5 ml de HCl (proporcionado por el instructor) y mide nuevamente el pH. (Anota)

3. Anotar la concentración del ácido utilizado.

Efecto de una base:

1. Siga el mismo procedimiento anterior solo que añade NaOH.2. anotar la concentración del NaOH utilizada.

Efecto de un amortiguador 1. Colocar en dos vasos de precipitado 30 ml de Buffer proporcionado por el

profesor a cargo, medir el pH.

Ácido2. A uno de los vasos de precipitado añadir 5 ml de HCl y medir nuevamente el

pH.3. En el mismo vaso de precipitados añade otros 30 ml de ácido y mide el pH.4. Anotar la concentración del ácido y buffer que se utilizó.

Base5. En el otro vaso de precipitados añadir 5 ml de NaOH, determinar el pH6. Añadir otros 30 ml de base en el vaso y mide el pH.7. Anotar la concentración de ácido y buffer utilizado.

C CÁLCULOS Y REPORTE DE RESULTADOS

Hacer cálculos teóricos con influencia de H+ y OH- según sea el caso, con el efecto amortiguador.

5 INTERPRETACIÓN Y CONCLUSIONESEl alumno dará sus conclusiones de acuerdo a la composición del buffer y características que confieren tanto los ácidos como las bases.

6 ANEXOSContesta las siguientes preguntas y resuelve los problemas1.- ¿Tiene efecto amortiguador el agua? Explique ampliamente.




2.- ¿Qué sucedió cuando añadió 30 ml de ácido y de base a sus amortiguadores respectivos?

3.- La fortaleza de un amortiguador se da de acuerdo a:

4.- Dibuje una grafica de titilación de pH vs. ml de base añadido utilizando las concentraciones utilizadas.

5.- Densidad y molaridad: a) Calcule la molaridad del ácido nítrico concentrado si su densidad es de 1.42 g / ml y su por ciento es de 72%. R= 16.2 b) Calcule los mililitros del HCl concentrado que deben tomarse para preparar un litro de solución 0.10 M, si la densidad del HCl concentrado es de 1.18 g/ml y su por ciento en peso es 36 %. R= 8.5 c) Calcule los mililitros de amoniaco concentrado que deben tomarse para preparar un litro de solución 0.10 M, si su densidad es de 0.90 g/ml y su por ciento en peso de 28.

6.- Dilución de soluciones: a) 150 ml de una solución 0.300 M se diluyen a 750 ml con agua, ¿cuál es la molaridad de la solución final? R= 0.0600b) ¿Qué volumen de agua debe añadirse a 10 ml de solución 0.500 M para obtener una molaridad de 0.200? suponga que los volúmenes son aditivos. R= 15.0

7.- Una alícuota de 25.0 ml de una solución 0.800 M se diluye a 500 ml en un matraz volumétrico (solución A ) una alícuota de la solución A de 10.0 ml se diluye en otro matraz volumétrico de 250 ml (solución B). Calcule la molaridad de la solución B. ¿cuántas veces se diluyó la solución original?

8.- Mezcla de soluciones: ¿Cuántos mililitros de una solución de HCl 0.50 M se deben de añadir a 50 ml de una solución de HCl 0.10 M para obtener una molaridad de 0.30? suponga que los volúmenes son aditivos. R= 50

7 REFERENCIAS

8 MECANISMO DE EVALUACIÓN




9 DISPOSICIÓN DE DESECHOS QUÍMICOS, FÍSICOS Y BIOLÓGICOS.Los desechos de las soluciones utilizadas se colocaran en el recipiente indicado para la recolección de ácido y bases de acuerdo a la especificación interna del laboratorio.

10 MEDIDAS DE SEGURIDAD Y SALUD OCUPACIONAL

Deberá evitarse el contacto directo de las soluciones ácidas y básicas, debido a que puede ocasionar lesiones dependiendo de la concentración en la que sea manejada.

Evitar contacto con mucosa. Utilizar pipeta para la medición de soluciones No aspirar la solución con la boca, utilizar siempre la propipeta. El alumno deberá trabajar únicamente en el desarrollo de la práctica, evitando

distracciones que nos puedan ocasionar accidentes.









PRÁCTICA NÚMERO


2 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD

20 MARZO10 ABRIL4 HORAS

1 INTRODUCCIÓN

2 OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL. 1. El alumno elaborara una curva patrón para determinar cuantitativamente la

cantidad de proteínas en una muestra problema.2. Determinar la cantidad de proteínas problemas

3 FUNDAMENTO



Espectrofotómetro Balanza analítica Picetas 2 Pipetas graduadas de 10 ml 1 vaso de precipitados Cubetas para espectrofotómetro. Reactivo de Bradford Albúmina bovina.

pañuelos desechables.


1. Preparación de la curva patrón.




CUBETAS µg DE PROTEINAS

µl DE PROTEINAS

AGUA BRADFORD

1 0 0 800 2002 5 5 795 2003 10 10 790 200

4 15 15 785 200

5 20 20 780 200

6 25 25 775 200 7 40 40 760 200 8 50 50 750 200

9 780 70 730 200

10 100 100 700 200

2. Agitar cada cubeta por inversión3. Una vez agitada leer la absorbancia utilizando una longitud de onda de 595 nm.


Graficar la absorbancia contra µg de proteínas Determinar la cantidad de proteína por interpolación

5 INTERPRETACIÓN Y CONCLUSIONES

6 ANEXOS

1.- Cite otro método cuantitativo para determinar la cantidad de proteína.

2.- ¿Qué haría usted si su muestra presentara una absorbancia muy alta?

3.- Por lo contrario si fuera muy baja.

4.- ¿Por qué se midió la absorbancia a 595 nm?

5.- Mencione algunas características de la albúmina de suero bovino.

6.- Cite 10 ejemplos en los cuales utilizaría determinación de proteínas, confiriendo un enfoque clínico.




7 REFERENCIAS



Deberá evitarse el contacto con las soluciones utilizadas, principalmente el contacto con la mucosa.

Evitar utilizar la boca para llenado de pipeta.

10 DISPOSICIÓN DE DESECHOS QUÍMICOS, FÍSICOS Y BIOLÓGICOS. Los desechos generados serán recopilados en un recipiente, etiquetado con

desechos.









PRÁCTICA NÚMERO


3 HIDRÓLISIS DE POLISACARIDOS17 ABRIL24 ABRIL4 HORAS

1 INTRODUCCIÓN

La hidrólisis de macromoléculas pueden llevarse a cabo usando diversos procedimientos: canalizando con ácidos o bases fuertes con catalizadores inorgánicos u orgánicos o mediante enzimas hidrolíticas adecuadas. En esta práctica se ilustran algunos de estos métodos, verificando la producción de la reacción mediante reacciones cualitativas. Podrá compararse no sólo la diferencia de tiempo requerido en cada método, si no también la gran diferencia en las condiciones requeridas para que se verifique la hidrólisis.

2 OBJETIVOS

El alumno demostrara la hidrólisis de los polisacáridos

3 FUNDAMENTO



Solución de almidón. 50 ml HCl concentrado 100 ml NaOH al 20% solución indicadora lugol. Reactivo de Lucas 20 ml Reactivo de Benedict

Saliva (amilasa salival)


PREPARACION DE REACTIVOS:1. solución de almidón soluble al 2%: preparar 100 ml pesando 2 gr de almidón,

mezclar con un poco de agua destilada, mientras hace hervir 90 ml de agua aproximadamente. Cuando haya formado una pasta con el almidón humedecido, agregue a dicha pasta agua hirviendo, agitando vigorosamente. Se deja enfriar un poco y llevar a aforo a 100 ml. (filtrar de ser necesario).




2. Solución indicadora de lugol: Mezclar 2 gr de KI y 1 gr de yodo: disuelva esta mezcla en agua destilada, calentando ligeramente si es necesario. lleve a aforo de 100 ml.

3. Reactivo de Lucas: disuelva 136 gr de ZnCl en 89 ml de HCl concentrado.

4. Reactivo de Benedict: se puede utilizar tabletas clinitest (para determinación de azucares) o pesar 1.73 gr de citrato de sodio, 9 gr de carbonato de sodio y 1.73 gr de CuSO4*5H2O. mezclar bien disolviendo agua y completar a 100 ml en un matraz aforado.

METODOLOGIA PRACTICA:

I. hidrólisis ácida del almidón.1. En un vaso de 100 ml coloque 20 ml de la solución de almidón.2. Adicionar 20 gotas de HCl concentrado y caliente de modo que hierva

suavemente agitando continuamente.3. Cada cinco minutos tome con una varilla de vidrio una gota y deposítela

en una placa de porcelana.4. Adicione una gota de lugol y anote el color que se produce.5. continúe calentando hasta que ya no se produzca el color azul con el

yodo, lo cual indica que la hidrólisis se ha completado.6. pase a un tubo de ensayo 1 ml de la disolución hidrolizada que queda en

el vaso y verifique la reacción de Benedict, la cual debe dar resultado positivo para comprobar que se realizó la hidrólisis.

II. hidrólisis ácida, catalizada de la celulosa.1. Coloque en un mortero un pequeño trozo de algodón bien desmenuzado o

varios pedacitos pequeños de papel filtro2. Agregue 3 ml de reactivo de Lucas y caliente durante 1 min, agitando

vigorosamente.3. Dejar enfriar y neutralice con NaOH al 20%. Distribuya la solución dos tubos

pequeños y verifique en uno de ellos la reacción con lugol y el otro con el reactivo de Benedict. Si la hidrólisis no fue completa, repita el procedimiento calentando dos minutos.

III. Hidrólisis enzimática del almidón.1. En un tubo de ensayo ponga 1 ml de saliva y 1 ml de agua destilada.

Introduzca el tubo en un baño de agua manteniendo a 40 °C y agregue 2 ml de disolución de almidón al 2% manteniéndola en el baño durante media hora, agitando cada 5 minutos

2. A los 15 minutos y a la media hora verifique en porciones de 0.5 ml las




reacciones de Benedict y la de lugol.

C CÁLCULOS Y REPORTE DE RESULTADOSLos colores que se obtienen con el lugol deben interpretarse de la siguiente manera;Color azul, lila, negro: Almidón-Hidrólisis (-) color rojizo: Acrodextrina- hidrólisis parcial.Color amarillo como el lugol: Reacción (-) Hidrólisis total. Después de al hidrólisis, la reacción de Benedict es positiva, debido a la presencia de glucosa o de disacáridos reductores.

Tiempo requerido para la hidrólisis ácida del almidón:Resultado de las pruebas de hidrólisis de celulosa:Hidrólisis enzimática a) color a los 15 minutos, b) color a los 30 minutos.


6 ANEXOS

1. ¿Cuáles son los productos de la hidrólisis parcial y total del almidón y de la celulosa?

2. ¿Qué son la amilasa y amilodextrina?3. ¿Cual es el mecanismo de acción catalítica del reactivo de Lucas?

7 REFERENCIAS1. Conn, Stump, Otlines of Chemistri. Cap 1 Edición en español. Editorial

limusa. Bioquímica fundamental.2. J. W suttie. Fundamentos de Bioquímica. Editorial Interamericana.3. Morrison & Boyd Quimica orgánica4. H.R. Mahler; E CORDES. Biological Chemistry. Haper International Edition.



Se deberá extremar precauciones en la utilización de derivados de yodo, además de evitar el contacto con los ácidos y las veces utilizadas para estos fines debido a que se podrán ocasionar lesiones de no tener las precauciones pertinentes.

CARRERA

PLAN DE ESTUDIOS



QUIMICO 2010-2010 BIOQUIMICA 1




FARMACEUTICOBIOLOGO APRÁCTICA NÚMERO


4CARACTERIZACIÓN FISICOQUIMICA DE LIPIDOS

8 DE MAYO15 DE MAYO4 HORAS

1 INTRODUCCIÓN Para diferencia la gran cantidad de lípidos que se pueden encontrar en el análisis de alimentos y productos biológicos, es necesario efectuar diversos análisis físicos y químicos. En esta práctica se efectuarán algunos representativos como son:

1. Indice de acidez, que se define como la cantidad de mg de KOH necesarios para neutralizar la acidez libre de 1 gr de muestra. Si se conoce la fórmula del ácido graso se puede calcular fácilmente el índice de ácidez teorico correspondiente al ácido graso puro. Cuando se emplee NaOH en lugar de KOH para efectuar la titulación debe convertirse el resultado a su equivalente en KOH. Trabajando con NaOH de normalidad N, la fórmula para calcular el índice de acidez será.

I.A= 40*N*V*56= 56NVM*40 M

40= Es el peso molecular de NaOH.56= Es el peso molecular de KOH.56/40= es el factor que permite convertir el peso de NaOH a peso de KOH.V= es el volumen en ml de NaOH de N, requerido en la titulación (restando el volumen que se gaste en el blanco).M= es el peso de la muestra en gramos.

2. Índice de yodo sirve para determinar el grado de instauraciones de un ácido graso o aceite, debido a que el yodo es absorbido únicamente en los dobles o triples enlaces. En este caso, se determinará únicamente en forma cualitativa, para saber si el compuesto tiene dobles enlaces.

El índice de yodo se define como la cantidad de yodo expresada en gramos, que absorben 100 gr de muestra.

La formación de los complejos de ácidos grasos con urea, permite la obtención de compuestos cristalinos fácilmente aislables cuyo punto de fusión y forma de cristalización ayudan a la identificación del ácido graso.

Para la identificación del colesterol y otros esteroides, se han descrito varias reacciones sencillas como la de Salkowski y la de Liebermann-Burchard. El fundamento de estas reacciones es la formación de derivados coloreados de los esteroides, cuando se tratan con ácidos. El color y su intensidad varían según el




esteroide, el tipo de ácido y la concentración de éste.

2 OBJETIVOS Diferenciar el tipo de ácido graso por determinación de índice de yodo y el

índice de acidez.3 FUNDAMENTO



20 ml de Aceite de oliva y de maíz Ácidos oleico, esteárico y palmítico Colesterol Solución de lugol 10 Anhídrido acético 10 ml de ácido sulfúrico concentrado. Solución de almidón al 2% Disolución de urea en metanol: Etanol neutralizado NaOH 0.1N Fenolftaleína.

Microscopio Pañuelos

desechables

B DESARROLLO DE LA PRÁCTICAPREPARACION DE REACTIVOS.1. Etanol neutralizado: A una muestra de 5 ml de etanol, adicionar 5 gotas de

indicador fenolftaleína y neutralice con NaOH 0.1N. con el dato obtenido, calcule cuanto debe agregar a 100 ml de etanol. Mida 100 ml de etanol y agréguele el volumen de NaOH calculado.

2. Disolución de urea en metanol: pesar 3gr y disolverlos en 20ml de metanol, calentando suavemente si es necesario.

METODOLOGIA DE LA PRÁCTICA.INDICE DE ACIDEZ.

1. Pese exactamente una muestra entre 10 y 15 gr de aceite de maíz sobre un vaso de precipitados o un matraz previamente tarado.

2. Adicionar 50 ml de etanol neutralizado3. Introduzca el matraz en un baño de agua manteniendo a 60°C y titule sin dejar

de calentar adicionando 5 gotas de fenolftaleína.4. Se valorara con NaOH 0.1 N en cual se adiciona hasta encontrar un color rosa.5. Calcular.

FORMACIÓN DE COMPLEJOS DE ÁCIDOS GRASOS CON UREA.




1. Disuelva 1 gr de ácido graso en 5 ml de disolución de urea en metanol. (si el ácido graso es sólido, disuélvase en metanol, calentando suavemente).

2. Agitar y luego deje enfriar hasta cero grados en baño de hielo o en refrigerador.3. filtrar, seque los cristales y obsérvelos al microscopio.4. Dibuje los cristales.

ABSORCION DE YODO POR ACIDOS GRASOS INSATURADOS.1. ponga en un tubo de ensayo 2 ml de aceite de oliva o de ácido oleico. Agregue

5 gotas de lugol y agite.2. Esta mezcla debe ser rojiza como la solución de yodo. Caliente a la flama y

observe que el color va cambiando.3. Cuando el color inicial ha desaparecido totalmente. Deje enfriar y agregue 10

gotas de disolución de almidón.4. Se observará que no hay formación de color azul, lo cual indica que no hay

yodo libre en la mezcla.5. si le agregó lugol en exceso, aparecerá el color azul, por haber sido incompleta

la absorción.

IDENTIFICACIÓN DE COLESTEROLI. Reacción de Salkowski.

I. En un tubo de ensayo perfectamente seco. Ponga 100 mg de colesterol. Agregue 3 ml de cloroformo para disolverlo

II. reparta esta disolución. En 2 tubos para efectuar, con la mitad la reacción siguiente: a uno de los tubos agregue 1 ml de H2SO4 concentrado, deslizándolo por las paredes, sin agitar. La capa superior y la inferior tomarán colores distintos.

III. observe el tubo de lado contra fondo semi-oscuro. Para apreciar la fluorescencia. Anote lo observado.

II. Reacción de Lieberman:

1. Agregue 5 gotas de anhídrido acético con 2 gotas de H2SO4 concentrado, a la otra porcion de dicoluciín de colesterol en cloroformo.

2. Mezcle suavemente y anote el color que adquiere inicialmente y los cambios que se van observando en el mismo.

C CÁLCULOS Y REPORTE DE RESULTADOSHacer cálculos correspondientes y anotar las observaciones en cada una de las pruebas.





6 ANEXOS1. Escriba la formula estructural del colesterol y su nombre químico completo.2. Describa cada uno de las pruebas de manera extensa.

7 REFERENCIAS Pierre Crabbé. Actividad optica, dispersión rotatoria óptica y dicronismo

circular en quimica organica. Mazur, B Harrow. Bioquímica básica Editorial interamericana.



Recomendaciones limitadas al correcto uso de los reactivos evitando contacto con la piel, además de evitar llenado de pipetas con la boca.

10 DISPOSICIÓN DE DESECHOS QUÍMICOS, FÍSICOS Y BIOLÓGICOS.






PRÁCTICA NOMBRE DE LA PRÁCTICA FECHA Y




NÚMERO DURACIÓN

5 EXTRACCION Y SEPARACIÓN DE LIPIDOS.22 MAYO29 MAYO4 HORAS

1 INTRODUCCIÓN

En esta práctica se inicia al alumno en las técnicas de aislamiento de lípidos a partir de materiales biológico, lo cual es de especial interés en numerosos estudios bioquímicos. Además de la extracción de lípidos totales, se extraen y separan dos grupos de lípidos muy importantes, ambos conocidos como fosfolípidos, por contener fosforo: lectinas y cefalinas. Se efectuará también la extracción de colesterol, por ser uno de los esteroides de mayor importancia en nutrición y bioquímica de esteroides. Por tratarse de procedimientos relativamente largos y cuidadosos, el alumno podrá escoger dos de los tres que se describen para realizarlos.

2 OBJETIVOSEl alumno extraerá y separa lípidos de yema de huevo, hígado de rata, pollo o conejo, además de cerebro de animales.3 FUNDAMENTO



Acetona Cloroformo Etanol Éter de petróleo Éter etílico Sulfato de sodio anhidro Yema de huevo Hígado de rata, pollo o conejo. Cerebro de conejo o cerdo. Vaso de precipitados de 100 ml Varilla de vidrio Baño maría Papel filtro Embudo de vidrio

B DESARROLLO DE LA PRÁCTICAEXTRACCION Y SEPARACIÓN DE LECITINAS Y CEFALINA DE HUEVO.

1. Separe la yema de un huevo en un vaso de precipitados de 100 ml o en un matraz Erlenmeyer.

2. agregar éter hasta cubrir totalmente la yema agite con una varilla de vidrio para




homogenizar bien. Agregue lentamente y sin dejar de agitar, un volumen de acetona igual al de éter. Se observará que la acetona provoca la precipitación de fosfolípidos, en tanto que las grasas y el colesterol permanecen disueltos.

3. filtrar, después dejar en reposo unos minutos.4. El precipitado que contiene lecitina y cefalina se lava con alcohol frío recibiendo

el filtrado en un tubo seco.5. la lecitina es mas soluble en el alcohol frío por lo tanto queda en el filtro

únicamente la cefalina.6. par obtener la lecitina evapore el alcohol lentamente en baño de vapor.7. dejar secar los precipitados. Y pesar.

EXTRACCION DE LIPIDOS TOTALES DEL HIGADO.1. Pese el hígado del animal y anote este peso. Corte el tejido en fragmentos

pequeños y póngalo en un mortero, con dos veces su peso de sulfato de sodio anhidro.

2. Muela la mezcla en un mortero hasta obtener una pasta homogénea.3. adicione 5 ml de alcohol y continúe homogenizando.4. transfiera la pasta a un matraz Erlenmeyer ayudándose de 32 porciones más

de alcohol.5. de cada 5 ml cada una de modo que quede limpio el mortero.6. coloque el matraz en baño de agua a 70°C y se filtra de la misma forma7. dejar enfriar y adicionar 10 ml de éter etílico para completar la extracción; agite

bien y deje reposar hasta que se asiente bien.8. filtre el sobrenadante por decantación y agregue el residuo otra porción de 10 ml

de mezcla de alcohol- Éter proporción 3:1.9. Se calienta a 70°C y se filtra de la misma forma.10. repita por tercera vez la extracción con otros 10 ml de alcohol-éter..11.Evapore el éter sin flama hasta que ya no desprenda olor a disolventes.12.Enfríe el matraz y agregue 10 ml de éter de petróleo, agitando para volver a

disolver los lípidos. Filtre recibiendo el filtrado en una probeta seca y lavando el residuo con éter de petróleo hasta completar un volumen final de 25 ml.

EXTRACCIÓN DE COLESTEROL, DEL CEREBRO.1. El cerebro se pone sobre un vidrio de reloj previamente tarado.2. Formar una pasta uniforme.3. Agregar al homogenizado 10 ml de acetona, agitando con una varilla de vidrio,

durante 10 minutos. Centrifugar a 2000 rpm, durante 1 minuto. Trasferir el sobrenadante a un matraz de 25 ml. con tapón esmerilado.

4. El residuo vuelve a extraerse dos veces en porciones de 5 ml de acetona, en volumen 1/5 del original, evaporando lentamente en baño de vapor, sin flama.

5. El resido se deja enfriar en el refrigerador durante toda la noche para que precipite el colesterol.

6. El precipitado se vuelve a disolver en 2 ml de acetona, se filtra y se recristaliza.




7. El producto seco se pesa para determinar el rendimiento a partir del peso del cerebro.


Se darán en base a rendimientos, en peso.Realizar cálculos necesarios para preparación de cada una de las soluciones.5 INTERPRETACIÓN Y CONCLUSIONES

En base a alas características de cada uno de los lípidos extraídos.6 ANEXOS

1. Escriba las formulas estructurales de todos los productos de hidrólisis de la 1 alfa lecitina (dioleil fosfatidil colina).

2. Escriba la fórmula general de una cefalina.3. ¿en qué la condición patológica conocida como“higado grueso” y cuales son las

causas mas frecuentes?

7 REFERENCIAS1. G. Rendina. Tecnicas de Bioquimica Aplicada. Editorial Reverté.



10 DISPOSICIÓN DE DESECHOS QUÍMICOS, FÍSICOS Y BIOLÓGICOS.









PRÁCTICA NÚMERO


6MEDICION DE LA ACTIVIDAD DE LA CATALASA DE ERITROCITOS HUMANOS

5 JUNIO12 JUNIO4 HORAS

1 INTRODUCCIÓN

La actividad de una enzima puede expresarse, a sugerencia de la comisión de enzimas de la unión Internacional de bioquímica, como actividad molecular (número de recambio), y como actividad específica.La actividad molecular es el número de moléculas de sustrato transformadas por minuto por una sola molécula de enzima(o por un solo centro activo), cuando la enzima es el factor limitante de la velocidad, se basa en la V máx. y tiene unidades de recíproco de tiempo (min.−1).

La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (una unidad enzimática se define como la cantidad de enzima que origina la transformación de un micromol de sustrato por minuto a 250c en condiciones óptimas de medida). La actividad específica constituye una medida de la pureza de la enzima, aumenta durante el proceso de su purificación y llega a ser máxima y constante cuando ésta se halla en estado puro. La forma más usada de expresión de la actividad específica es la de micromoles de producto formado por minuto por miligramo de proteína.

Aunque estas definiciones son sugeridas por la Comisión de Enzimas, no siempre seguidas, como en el caso de preparaciones crudas. Cada investigador aplica su propia definición de unidad de enzima y es necesaria una interconversión cuidadosa para comparar diferentes preparaciones de la misma enzima. En esta práctica la actividad de la catalasa se expresará como el número de micromoles de peróxido de hidrógeno transformado por minuto a 0 C, por ml de sangre.

La actividad de los preparados de catalasa se mide de diversas formas, casi siempre sujetas a errores. Un método conveniente consiste en medir el peróxido de Hidrógeno no atacado por la enzima, mediante titulación con Permanganato de Potasio, después de incubar la enzima (por cinco minutos) sobre una solución diluida de peróxido de Hidrógeno, (la reacción se detiene añadiendo ácido sulfúrico que destruye a la enzima).

2 OBJETIVOSDeterminar catalasa en sangre humana (eritrocitos)

3 FUNDAMENTO






5 Matraces Erlenmeyer de 50 ml 1 Matraz aforado de 100 ml. Pipetas Serológicas de 0.1 ml, 1 ml, 5ml y 10 ml. 1 Bureta 1 Soporte y pinzas para bureta. Tubos de 13 x 100 mm con tapón Baño de temperatura constante (100 C) 1Baño con hielo. Acido sulfúrico, 6 N Amortiguador de fosfatos, 0.02 M (pH= 7.0) Permanganato de potasio, 0.005M Peróxido de Hidrógeno, 0.05M; en amortiguador

de fosfato 0.02M, (pH=7.0) Sal di sódica de EDTA, al 1%


A.−OBTENCION Y MANEJO DE LA MUESTRA DE SANGRE.Extraer 2 ml de sangre venosa y mezclarla con EDTA al 1 % (en tubo de 13x100) y colocarla inmediatamente sobre hielo. La muestra debe ser utilizada lo más rápidamente posible.

B.− MEDICION DE LA ACTIVIDAD DE LA CATALASA1. Colocar sobre hielo picado (antes de extraer la muestra), un matraz de aforación

de 100 ml conteniendo 25 ml de agua destilada fría.2. Pipetear exactamente 0.1 ml de la sangre recién extraída. Limpiar con algodón

al exterior de la pipeta y dejar caer la sangre en el agua fría contenida en el matraz de 100 ml.

3. Enjuagar la pipeta varias veces (con el agua del matraz), hasta asegurarse de que toda la sangre paso al agua. Agitar el matraz durante un minuto para homogenizarla y aforar a 100 ml con agua destilada fría.

4. Mantener esta solución a 0ºC durante todo el experimento para evitar inactivación de la enzima por calor.

5. Preparar cinco matraces de 50 ml según indica la tabla I. Todos los matraces deben estar a 0ºC pues la reacción se lleva a cabo a esa temperatura. Después de añadir cada reactivo mezclar con movimientos de rotación.

Matraz 1 2 3 4 5




numeroReactivo mlAmortiguador fosfatos 0.02

10 10 10 10 10

H2O2 0.05M 2 2 2 2 2Catalasa a O°C

0.5 0.5 - 0.5 0.5

Catalasa inactivada por calor

- - 0.5 - -

H2SO4 6N 2 min antes de añadir enzima

2 2 2 2Cinco minutos antes de añadir la catalasa

titular el H2O2 restante en cada uno de los matraces con KMNO4 0.005 M

C CÁLCULOS Y REPORTE DE RESULTADOS Mol de H2O2 = ml de kmno4 x 2.5 x 1000

Para calcular los _mol de H2O2 iniciales sustituir en la formula uno los ml de Kmno4 utilizados para titular el H2O2 del matraz uno.

Para calcular los _mol de H2O2 restantes sustituir en la formula uno los ml de Kmno4 utilizados para titular el H2O2 de los matraces el 2 al 5.

Mol de H2O2 descompuesto = _mol de H2O2 iniciales − _mol de H2O2 restantes. (En 5 minutos por 5x10−4 ml de sangre).Actividad enzimático = _mol de H2O2 descompuesto/4x102(_mol de H2O2 descompuesto en un min./ml de sangre) (En 5 minutos por 5x10−4 ml de sangre)


6 ANEXOS

1. Investigar en bibliografía las características químicas, el nombre sistemático y el número asignado por la comisión de enzimas para la catalasa.

2. Escribir dos reacciones donde haya formación de peroxido de hidrógeno.3. Escriba la reacción catalizada por la catalasa.

7 REFERENCIAS

1. Bohinski, Robert C. bioquímica Fondo educativo Interamericano S.A. México (1978)




pp.722. Rendina, George Dr. Técnicas de Bioquímica Aplicada Editorial Interamericana; S.A.,

México (1974) pp.84−86.





QUIMICO 2010-2010 BIOQUIMICA 1




FARMACEUTICOBIOLOGO APRÁCTICA NÚMERO


7ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA

19 JUNIO

2 HORAS 1 INTRODUCCIÓN

2 OBJETIVOS

El alumno aprenderá el fundamento de electroforesis. Hacer una electroforesis con geles de poliacrilamida desnaturalizante SDS-

PAGE, para identificar la albúmina de suero bovino

3 FUNDAMENTO



5 Tubos de ensaye 2 Pipetas de 5 ml 2 Pipetas de 10 ml Micropìpetas 200 uL Pipetas pasteur Vaso de ppt de 500 ml Parrilla Extracto vegetal Centrifuga Tubos ependorff Cámara electroforetica con accesorios Mortero con pistilo Embudo Gasa

Solución I: TEMEDSolución II y III: Persulfato de Sodio al 20%.Solución teñidora: Buffer de extracción.Solución desteñidora: Tris- HCl 0.2 M

Guantes. Cubrebocas.





METODOLOGIA

1.- Todo el material debe estar perfectamente limpio 2.- Las placas se arman sellando los extremos con grasa de silicón 3.- Una vez que se ha armado las placas, adicionar un poco de agua para verificar si hay fugas, se seca el agua con tiras de papel filtro. En caso de haber fugas desmontarlo nuevamente.4.- Colocar el peine para marcar hasta donde tiene el gel separador 5.- Preparación de geles: a) Gel separador 5 ml de solución I (acrilamida 30% y brisacrilamida 0.8 %) fueron mezclados con 6 ml de solución II (Tris-HCl) 0.75 M a pH 8.8 SDS 0.2% se desgasifica por 2 min. se agrega 5µl de TEMED (N, N, N, N-tetrametilletilenodiamina) y 50 µl de persulfato de sodio al 02 %. La mezcla se coloca en la placa y en caso de que se presenten burbujas, eliminarlas por completo. (Su concentración fue de 14), dejar reposar unos 10 min.

b) Gel condensador 1.3 ml de la solución I fueron mezclados con 2.7 ml de la solución III (Tris-HCl 0.25 M a pH 6.8 SDS 0.2 %) 1.5 ml de agua. La mezcla se desgasifico por 2 min. Y se toman 5 µl de TEMED y 50 µl de persulfato de sodio al 20% (su concentración es 7 % de acrilamida).

c) una vez colocada la mezcla en la placa se coloca el peine. Dejar reposar hasta que gelifique.

6.- sacar con cuidado el peine

7.- lo mas recomendable es que cada muestra de proteína sean 100 µg aproximadamente por lo cual es pertinente hacer esta determinación por el MÉTODO DE BRADFORD y así saber cuántos microlitos tomar para tener la cantidad de proteína indicado.

8.- colocar las muestras en los depósitos. La muestra a correr será la albúmina de suero bovino obtenido de la práctica anterior.

9.,- llenar con buffer de corrida (Tris-HCl 0.0025 M pH 8.3, glicina 0.192 M y SDS 0.1%) la cámara electroforética.

10.- ensamblar la parte que contiene la placa con el resto de la cámara

11.- colocar la tapa y conectar con la fuente de poder por tres horas a voltaje constante, pregunte a su profesor.

12.- Tinción y secado de los geles




Al finalizar el tiempo de corrida se sacan de la cámara. Se tiñen con azul de coomassie al 2 % en ácido acético al 7 % y metanol al 50% durante el tiempo que el profesor le indique.

Con una solución de ácido acético al 7% y metanol al 50 % durante ½ o 1 hora.C CÁLCULOS Y REPORTE DE RESULTADOSLos cálculos se harán previamente a la entrada al laboratorio para la preparación de soluciones requeridas, algunas de ellas se han elaborado previamente a lo largo del semestre.

5 INTERPRETACIÓN Y CONCLUSIONESLos resultados serán dados de acuerdo a la distancia recorrida en comparación con referencia.

6 ANEXOS

1. ¿Cual es el fundamento de la electroforesis?2. ¿Estas de acuerdo que la migración es inversamente proporcional al tamaño

de las partículas? Fundamente su respuesta. 3. Mencione 5 ejemplos en los cuales aplicaría la electroforesis y ¿por que? lo

haría.

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