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Portada: Paisaje rural de la vereda Brasilia, municipio de Tello, sobre la Cordillera Oriental,dentro de la zona endemo-epidémica para leishmaniasis cutánea en eldepartamento del Huila, ubicada aproximadamente a 1600 m.s.n.m. La regiónes dominada por cafetales tecnificados al sol y pastizales; los bosques y cafetalestradicionales se presentan en fragmentos ocupando solo una pequeña parte delpaisaje. Las viviendas, dispersas, son construidas principalmente en baharequecon techos de zinc y presentan muchas aperturas que facilitan acceso de losflebótomos.

Raúl H. PardoGrupo de EntomologíaSubdirección de InvestigaciónInstituto Nacional de Salud

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Biomédica Instituto Nacional de SaludVolumen 26, Suplemento No. 1, Leishmaniasis - Bogotá, D.C., Colombia - Octubre, 2006

COMITÉ CIENTÍFICO

JUAN MANUEL ANAYA

Corporación para InvestigacionesBiológicasMedellín, Colombia

ARNOLDO BARBOSA RAMÍREZ

Hospital Clínic, Universidad deBarcelona, Barcelona, EspañaCentro de Investigação Em SaudeDa Manhiça, Manhiça, Mozambique

ANTONIO BERMÚDEZ

Instituto Nacional de SaludBogotá, D.C., Colombia

JORGE H. BOTERO

Universidad de AntioquiaMedellín, Colombia

VÍCTOR CÁRDENAS

University of TexasEl Paso, TX, Estados Unidos

ALBERTO CONCHA-EASTMAN

Organización Panamericanade la SaludWashington, D.C., Estados Unidos

ZOILO CUÉLLAR

Academia Nacional de MedicinaBogotá, D.C., Colombia

LUIS GABRIEL CUERVO

Organización Panamericana de laSaludWashington, D.C., Estados Unidos

PATRICIA DEL PORTILLO

CorpogénBogotá, D.C., Colombia

ANDRÉS DE FRANCISCO

Foro Global para la Investigaciónen SaludGinebra, Suiza

FERNANDO DE LA HOZ

Universidad Nacional de ColombiaBogotá, D.C., Colombia

JOSÉ LUIS DI FABIO

Organización Panamericana de laSaludWashington, D.C., Estados Unidos

JORGE HERNANDO DONADO

Universidad Pontificia BolivarianaMedellín, Colombia

JOSÉ FIGUEROA

World Health OrganizationGinebra, Suiza

LUIS FERNANDO GARCÍA

Universidad de AntioquiaMedelín, Colombia

ALBERTO GÓMEZ

Pontificia Universidad JaverianaBogotá, D.C., Colombia

ENRIQUE GONZÁLEZ

University of Texas Health ScienceCenter at San AntonioSan Antonio, TX, Estados Unidos

JOHN MARIO GONZÁLEZ

Universidad de los AndesBogotá, D.C., Colombia

FELIPE GUHL


ANTONIO IGLESIAS


JORGE JARA

BID/Secretaría de SaludTegucigalpa, Honduras

ERNESTO JARAMILLO

Organización Mundial de la SaludGinebra, Suiza

MARCELO LABRUNA

Universidade de São PauloSão Paulo, Brasil

SECRETARIA DEL COMITÉ LINDA GRACE MOLANO

COMITÉ EDITORIAL

EDITORES INVITADOS NANCY GORE SARAVIA RUBÉN SANTIAGO NICHOLLS

CIDEIM Instituto Nacional de SaludCali, Colombia Bogotá, D.C., Colombia

LEONARD MUNSTERMANN

Yale University School of MedicineNew Haven, CN, Estados Unidos

LUIS ALBERTO GÓMEZ


MARÍA CRISTINA FERRO

Bogotá, D.C., Colombia

ÁNGELA RESTREPO

Corporación para Investigaciones BiológicasMedellín, Colombia

RICARDO SÁNCHEZ


OMAR SEGURA


EDITORES ASOCIADOS

ELIZABETH CASTAÑEDA, editora jefeInstituto Nacional de SaludBogotá, D.C., Colombia

CARLOS ARTURO HERNÁNDEZ, editor ejecutivoBogotá, D.C., Colombia

EDITOR INVITADO MIGUEL A. GUZMÁN

Bogotá, D.C., Colombia

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Instituto Nacional de Salud

La revista Biomédica del Instituto Nacional de Salud es una publicación trimestral, eminentemente científica. Estáamparada por la resolución número 003768 de 1981, emanada del Ministerio de Gobierno, y con tarifa postal reducidasegún resolución número 1128 del 5 de mayo de 1982.

Ninguna publicación, nacional o extranjera, podrá reproducir ni traducir sus artículos ni sus resúmenes sin previaautorización escrita del editor. Ni la revista, ni el Instituto asumen responsabilidad alguna por los puntos de vistaexpresados por los autores. La revista no publicará ningún tipo de propaganda comercial. Los nombres de equipos,materiales y productos manufacturados que eventualmente puedan mencionarse, no implican recomendación nipropaganda para su uso y sólo se mencionan como identificación genérica.

La revista Biomédica aparece reseñada en Index Medicus/Medline de la National Library of Medicine, en el índice dela Literatura Latinoamericana en Ciencias de la Salud (LILACS), en el Sistema de Información Bibliográfica RegionalAndina (SIBRA), en CAB Abstracts, Review of Medical and Veterinary Entomology, y forma parte del Índice Nacionalde Publicaciones Seriadas Científicas y Tecnológicas Colombianas de Colciencias y del Índice Latinoamericano deRevistas Científicas y Tecnológicas (LATINDEX).

INSTITUTO NACIONAL DE SALUDAvenida Calle 26 No. 51-60Apartado aéreo 80334 y 80080Bogotá, D.C., Colombia, S.A.

URL: http://[email protected]

JAIRO LIZARAZO

Hospital Universitario Erasmo MeozCúcuta, Colombia

JUAN GUILLERMO MCEWEN

Corporación para InvestigacionesBiológicasMedellín, Colombia

ROBERTO MENDOZA

The Hospital for Sick ChildrenToronto, Ontario, Canada

ALVARO MONCAYO


RICARDO NEGRONI

Hospital de InfecciosasFrancisco Javier MuñizBuenos Aires, Argentina

MARÍA TERESA OCHOA

University of California Los ÁngelesLos Ángeles, CA, Estados Unidos

JUAN P. OLANO

University of Texas Medical BranchGalveston, TX, Estados Unidos

BLANCA RESTREPO

University of TexasSan Antonio, TX, Estados Unidos

VÍCTOR E. REYES

University of Texas MedicalBranchGalveston, TX, Estados Unidos

GERZAÍN RODRÍGUEZ

Universidad de la SabanaBogotá, D.C., Colombia

GUSTAVO ROMÁN

University of TexasHouston, TX, Estados Unidos

PEDRO ROMERO

Ludwig Institute for CancerResearch, Lausanne branchLausana, Suiza

ÁLVARO RUIZ


GIOCONDA SAN BLAS

Instituto Venezolano deInvestigaciones CientíficasCaracas, Venezuela

ÁLVARO SANABRIA


NANCY GORE SARAVIA

CIDEIMCali, Colombia

ROBERT TESH

University of TexasGalveston, TX, Estados Unidos

ORLANDO TORRES-FERNÁNDEZ


BRUNO TRAVI

University of TexasSan Antonio, TX, Estados Unidos

GUSTAVO VALBUENA

University of TexasGalveston, TX, Estados Unidos

JUAN MIGUEL VILLALOBOS

Universidade Federal de RondôniaPorto Velho, Brasil

JOHN WALKER

CideimCali, Colombia

MOISÉS WASSERMAN


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Editoria lLeishmaniasis: un reto para la salud pública queexige concertación de voluntades y esfuerzosNancy Gore Saravia, Rubén Santiago Nicholls ............. 5

Imágenes en biomedicinaHistoria natural de la leishmaniasis cutánea ymucocutáneaCarlos Arturo Hernández ............................................... 10

Presentación de casoTratamiento con miltefosina de la leishmaniosis cutáneadiseminadaLina María González, Iván Darío Vélez ........................ 13

Artículos originalesEstudio ultraestructural de la fagocitosis depromastigotes y amastigotes de Leishmania mexicanapor la línea de células dendríticas FSDCLadys Sarmiento, Martha Ayala, Sandra Peña,Gerzaín Rodríguez, Zelandia Fermín, Felix J Tapia ..... 17

Papel de la vacuola parasitófora demacrófagos de ratón infectados por Leishmaniaamazonensis en la adquisición de moléculasTania M. Cortázar, Joselín Hernández,María Clara Echeverry, Marcela Camacho ................... 26

Análisis inmunohistopatológico comparativo de lareacción a la prueba cutánea de Montenegroen infección asintomática y en leishmaniasis cutáneaaguda y crónicaNora Guarín, Gloria I. Palma, Claude Pirmez,Liliana Valderrama, Rafael Tovar, Nancy Saravia ......... 38

Actividad fotodinámica de ftalocianina de aluminio (iii) yzinc (ii) en promastigotes de LeishmaniaPatricia Escobar, Indira P. Hernández, Cesar M. Rueda,Fernando Martínez, Edgar Páez .................................... 49

Efecto del tipo de sangre en la supervivencia yfecundidad del flebotomino Lutzomyia ovallesi Ortiz(Diptera:Psychodidae) vector de LeishmaniaPedro Noguera, Maritza Rondón, Elsa Nieves .............. 57

Distribución de los vectores de Leishmania infantum(Kinetoplastida: Trypanosomatidae) en ColombiaCamila González, Olga L. Cabrera, Leonard E.Munstermann, Cristina Ferro ......................................... 64

Flebotomofauna al sureste del estado Lara,VenezuelaLuis Eduardo Traviezo ................................................... 73

Presencia en el peridomicilio de vectores infectadoscon Leishmania (Viannia) panamensis en dos focosendémicos en el occidente de Boyacá, piedemontedel valle del Magdalena medio, ColombiaErika Santamaría, Nubia Ponce, Yaneth Zipa,Cristina Ferro .................................................................. 82

Contenido

Lutzomyia longiflocosa, posible vector en un foco deleishmaniasis cutánea en la región subandina deldepartamento del Tolima, Colombia, y el conocimientoque tiene la población sobre este insectoRaúl H. Pardo, Olga Lucía Cabrera, Jorge Becerra,Patricia Fuya, Cristina Ferro .......................................... 95

Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae) enun foco suburbano de leishmaniosis visceral en el Cañóndel Chicamocha en Santander, ColombiaMónica Flórez, Junny Patricia Martínez,Reinaldo Gutiérrez, Katherine Paola Luna,Víctor Hugo Serrano, Cristina Ferro, Víctor ManuelAngulo, Claudia Magaly Sandoval ................................ 109

Seroprevalencia de leishmaniosis visceral canina enla comuna 8 de Neiva y en cuatro municipios deHuila, ColombiaJosé Fernández, Felio Bello, Myriam Consuelo López,Ligia Inés Moncada, Jimmy Jolman Vargas,Martha Stella Ayala, Rubén Santiago Nicholls,Carlos Alberto Lozano .................................................. 121

Transmisión de Leishmania panamensis en ambientesdomésticos: resultados de un estudio epidemiológicoprospectivo en Santander, ColombiaGerardo Muñoz, Clive R. Davies ................................ 131

Distribución geográfica de especies de Leishmaniaaisladas de pacientes consultantes al Instituto Nacionalde Dermatología Federico Lleras Acosta, E.S.E,1995-2005Clemencia Elena Ovalle, Luisa Porras, Maritza Rey,Melania Ríos, Yenny Carolina Camargo ..................... 145

Prevención de leishmaniasis cutánea americana enColombia mediante una intervención múltiple: resultadosde un ensayo de grupos aleatoriosCarlos A. Rojas, Kristen A. Weigle, Rafael Tovar,Alba L. Morales, Bruce Alexander ................................ 152

Efecto del conocimiento y nivel socioeconómico sobrelas actividades de control realizadas por la población enriesgo de adquirir leishmaniasis cutánea en la regiónsubandina del departamento del Huila, ColombiaRaúl H. Pardo, Alexander Carvajal, Cristina Ferro,Clive R. Davies ............................................................. 167

Eficacia de un ácido kaurénico extraído dela planta venezolana Wedelia trilobata (Asterácea)contra Leishmania (Viannia) braziliensisSolanny Brito, Oscar Crescente, Alexis Fernández,Aura Coronado, Noris Rodriguez ................................. 180

Eficacia y tolerancia de la pentamidina enel tratamiento de la leishmaniasis cutánea producidapor Leishmania (V.) panamensis en ColombiaSara María Robledo, Juan Alberto Puerta,Diana Lorena Muñoz, Mónica Guardo,Iván Darío Vélez ........................................................... 188

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Revisión de temaEstado actual y futuro de la terapia anti-leishmaniásicaen ColombiaJaime Soto, Paula Soto ................................................. 194

Miltefosina oral para el tratamiento de la leishmaniasisJaime Soto, Paula Soto ................................................ 207

Comunicación breveEspecies de género Lutzomyia (Psychodidae,Phlebotominae) en áreas de transmisión deleishmaniasis tegumentaria y visceral en eldepartamento de Santander, en la cordillera orientalde los Andes colombianosClaudia Magaly Sandoval, Reinaldo Gutiérrez,Rocío Cárdenas, Cristina Ferro ................................... 218

Primer hallazgo de Lutzomyia tihuiliensis(Diptera: Psychodidae) en el valle de Aburrá, ColombiaEduar Elías Bejarano, Diana Sierra, Alveiro Pérez-Doria,Iván Darío Vélez ........................................................... 228

Leishmania (Leishmania) mexicana en el corregimientode San Matías, municipio de Gómez Plata, Antioquia,ColombiaDiana Sierra, Marcela Ochoa, José Ignacio Calle,Gisela García, Diana Colorado, Iván Darío Vélez ..... 232

Foco de leishmaniasis en El Hobo,municipio de El Carmen de Bolívar, Bolívar, ColombiaLuis Alberto Cortés ....................................................... 236

Infectividad del perro (Canis familiaris) para Lutzomyiayoungi en Trujillo, VenezuelaDalila Hernández, Elina Rojas, José Vicente Scorza,Alicia Jorquera .............................................................. 242

Infección por Leishmania (Viannia) braziliensis en dosperros colombianos: una nota sobre infectividad paraflebótomos y respuesta al tratamientoBruno L. Travi, Carlos Javier Tabares,Horacio Cadena ............................................................ 249

Nota técnicaCuantificación de citocinas caninas mediante reacciónen cadena de la polimerasa de transcriptasa reversaen tiempo realOmar A. Saldarriaga, Bruno L. Travi, Peter C. Melby 254

Instrucciones para los autores

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EditorialLeishmaniasis: A public health challenge that demandsconcerted effort and willNancy Gore Saravia, Rubén Santiago Nicholls ............. 5

Images in biomedicineNatural history of cutaneous and mucocutaneousleishmaniasisCarlos Arturo Hernández ................................................ 10

Case presentationMiltefosine for disseminated cutaneous leishmaniasisLina María González, Iván Darío Vélez ......................... 13

Original articlesPhagocytosis of promastigotes and amastigotes ofLeishmania mexicana by the FSDC dendritic cell line:Ultrastructural studyLadys Sarmiento, Martha Ayala, Sandra Peña,Gerzaín Rodríguez, Zelandia Fermín, Felix J Tapia ...... 17

Role of the parasitophorous vacuole of murinemacrophages infected with Leishmania amazonensis inmolecule acquisitionTania M. Cortázar, Joselín Hernández,María Clara Echeverry, Marcela Camacho .................... 26

Comparative immunohistological analysis ofthe Montenegro skin test reaction in asymptomaticinfection and in acute and chronic cutaneousleishmaniasisNora Guarín, Gloria I. Palma, Claude Pirmez,Liliana Valderrama, Rafael Tovar, Nancy Saravia .......... 38

Photodynamic activity of aluminium (III) and zinc (II)phthalocyanines in Leishmania promastigotesPatricia Escobar, Indira P. Hernández, Cesar M. Rueda,Fernando Martínez, Edgar Páez ..................................... 49

Effect of blood source on the survival and fecundity ofthe sandfly Lutzomyia ovallesi Ortiz (Diptera:Psychodidae), vector of LeishmaniaPedro Noguera, Maritza Rondón, Elsa Nieves ............... 57

Distribution of Leishmania infantum vector species inColombia.Camila González, Olga L. Cabrera, Leonard E.Munstermann, Cristina Ferro .......................................... 64

Phlebotomine sandflies in the southeast of Lara state,VenezuelaLuis Eduardo Traviezo .................................................... 73

Presence of infected vectors of Leishmania (V.)panamensis within dwellings in two endemic foci in thefoothill of the middle Magdalena valley, western Boyacá,ColombiaErika Santamaría, Nubia Ponce, Yaneth Zipa,Cristina Ferro ................................................................... 82

Lutzomyia longiflocosa as suspected vector of cutaneousleishmaniasis in a focus of cutaneous leishmaniasis on the

Contents

sub-andean region of Tolima department, Colombia, andthe knowledge on sandflies by the inhabitantsRaúl H. Pardo, Olga Lucía Cabrera, Jorge Becerra,Patricia Fuya, Cristina Ferro ........................................... 95

Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae) at asuburban focus of visceral leishmaniasis in theChicamocha Canyon, Santander, Colombia.Mónica Flórez, Junny Patricia Martínez,Reinaldo Gutiérrez, Katherine Paola Luna,Víctor Hugo Serrano, Cristina Ferro, Víctor ManuelAngulo, Claudia Magaly Sandoval ................................. 109

Seroprevalence of canine visceral leishmaniasis in sector8 of Neiva and in four municipalities of Huila, ColombiaJosé Fernández, Felio Bello, Myriam Consuelo López,Ligia Inés Moncada, Jimmy Jolman Vargas,Martha Stella Ayala, Rubén Santiago Nicholls,Carlos Alberto Lozano ................................................... 121

Leishmania panamensis transmission in the domesticenvironment: the results of a prospectiveepidemiological survey in Santander, ColombiaGerardo Muñoz, Clive R. Davies ................................. 131

Geographic distribution of Leishmania species isolatedfrom patients at the National Institute of DermatologyFederico Lleras Acosta E.S.E. 1995-2005Clemencia Elena Ovalle, Luisa Porras, Maritza Rey,Melania Ríos, Yenny Carolina Camargo ...................... 145

A multifaceted intervention to preventAmerican cutaneous leishmaniasis in Colombia:results of a group-randomized trialCarlos A. Rojas, Kristen A. Weigle, Rafael Tovar,Alba L. Morales, Bruce Alexander ................................. 152

Effect of knowledge and economic status on sandflycontrol activities by householders at risk of cutaneousleishmaniasis in the subandean region of Huiladepartment, ColombiaRaúl H. Pardo, Alexander Carvajal, Cristina Ferro,Clive R. Davies .............................................................. 167

Efficacy of a kaurenic acid extracted from the Venezuelanplant Wedelia trilobata (asteracea) against Leishmania(Viannia) braziliensisSolanny Brito, Oscar Crescente, Alexis Fernández,Aura Coronado, Noris Rodriguez .................................. 180

Efficacy and tolerance of pentamidine for treatment ofcutaneous leishmaniasis caused by por L. (V)panamensis in ColombiaSara María Robledo, Juan Alberto Puerta,Diana Lorena Muñoz, Mónica Guardo,Iván Darío Vélez ............................................................ 188

Topic reviewCurrent situation and future of antileishmanial therapy inColombiaJaime Soto, Paula Soto .................................................. 194

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Oral miltefosine to treat leishmaniasisJaime Soto, Paula Soto ................................................. 207

Brief communicationSpecies of Lutzomyia (Psychodidae, Phlebotominae) inendemic cutaneous and visceral leishmaniasis foci of thedepartment of Santander, in the eastern range of theColombian AndesClaudia Magaly Sandoval, Reinaldo Gutiérrez,Rocío Cárdenas, Cristina Ferro .................................... 218

First finding of Lutzomyia tihuiliensis (Diptera:Psychodidae) in the Valle de Aburrá, ColombiaEduar Elías Bejarano, Diana Sierra, Alveiro Pérez-Doria,Iván Darío Vélez ............................................................ 228

Leishmania (Leishmania) mexicana in the village ofSan Matias, municipality of Gomez Plata, North Westof Antioquia, ColombiaDiana Sierra, Marcela Ochoa, José Ignacio Calle,Gisela García, Diana Colorado, Iván Darío Vélez ...... 232

Leishmaniasis transmission focus in El Hobo, Carmen deBolívar, Bolívar, Colombia)Luis Alberto Cortés ........................................................ 236

Dog (Canis familiaris) infectivity to Lutzomyia youngi inTrujillo, VenezuelaDalila Hernández, Elina Rojas, José Vicente Scorza,Alicia Jorquera ............................................................... 242

Leishmania (Viannia) braziliensis infection in twoColombian dogs: a note on infectivity for sand flies andresponse to treatmentBruno L. Travi, Carlos Javier Tabares,Horacio Cadena ............................................................. 249

Technical noteQuantification of canine cytokines using real timereverse transcriptase polymerase chain reactionOmar A. Saldarriaga, Bruno L. Travi, Peter C. Melby . 254

Instructions for authors

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Biomédica Instituto Nacional de SaludVolumen 26, Suplemento No. 1, Leishmaniasis - Bogotá, D. C., Colombia - Octubre, 2006

Editorial

Leishmaniasis: un reto para la salud pública que exige concertación de voluntades y esfuerzos

En su conjunto, las diversas formas clínicas de la leishmaniasis constituyen un serio problema desalud pública en el mundo. Según las estadísticas de la Organización Mundial de la Salud (OMS) (1),350 millones de personas están en riesgo de contraer la infección, existen actualmente cerca de 12millones de personas infectadas y cada año se presentan, aproximadamente, 2 millones de casosnuevos de las diferentes formas clínicas la leishmaniasis. En la matriz de énfasis estratégico delprograma de investigación en enfermedades tropicales (Tropical Disease Research) de la OMS (2), laleishmaniasis está clasificada en la categoría I como una enfermedad emergente e sin control.

Este suplemento especial de Biomédica se publica tres meses después de que el Consejo Ejecutivode la OMS hubiera aprobado una resolución que se presentará a la Asamblea Mundial de Salud en el2007, sobre el problema de la leishmaniasis a nivel mundial y las estrategias de control (1). La resoluciónpone de relieve la expansión y el impacto de la leishmaniasis en el mundo, y la necesidad de que losgobiernos de los países afectados fortalezcan sus programas nacionales de prevención, y de promociónde la investigación para encontrar métodos efectivos de control de los vectores, medicamentosalternativos menos tóxicos con reducidas dosis y duración del tratamiento, mejores métodos diagnósticosy para evaluar la efectividad y facilitar el acceso a las medidas de control.

En Latinoamérica, Colombia incluida, se presentan casos de las tres formas clínicas principales de laenfermedad, la mayoría en los países andinos y en los que comparten la cuenca amazónica.

En el 2005 se notificaron en Colombia 18.097 casos de leishmaniasis, cifra que incluye los casos delas fuerzas militares y que representa un incremento de 3.794 casos (21,9%) al compararla con elnúmero de casos notificados en el 2004 (3). De ellos, 17.983 casos correspondieron a la forma cutánea(99,4%), 60 (0,3%) a la mucosa y 54 a la visceral (0,3%). La distribución de los casos de leishmaniasiscutánea por grupos de edad muestra que 4,4% ocurrieron en menores de 4 años, 8,8% en el grupo de5 a 14 años, 81,3% en el de 15 a 44 años, y 5,5% en mayores de 45 años (3).

El notorio aumento de la notificación de casos de leishmaniasis en los dos últimos años refleja unincremento de la transmisión de esta parasitosis, atribuible a diversos factores, entre otros, al aumentode las actividades humanas en ambientes silvestres en donde existe transmisión enzoótica; y a loscambios en los entornos de transmisión, que ahora incluyen el peridomicilio y el domicilio, y zonasperiurbanas.

Es oportuno, entonces, que en medio de la creciente incidencia de leishmaniasis en el país se encuentredisponible una publicación especial con los hallazgos obtenidos por la comunidad científica nacional yregional, relacionados con la epidemiología, la distribución de vectores y especies de Leishmania, lasopciones terapéuticas, las medidas de control y sobre la relación huésped-parásito. En este suplementoconvergen los esfuerzos de instituciones de educación superior, grupos de investigación, secretaríasde salud y empresas prestadoras de servicios por encontrar respuestas al complejo problema de laleishmaniasis. Es notable la capacidad multidisciplinaria de la comunidad nacional y su persistenteinvestigación sobre la leishmaniasis. Sin duda, la experiencia y el compromiso de la comunidad científicay médica nacionales aquí representadas constituyen el elemento crucial para acoger y dar respuesta alas recomendaciones contenidas en la resolución antes mencionada que se presentará el año entrantea la Asamblea Mundial de Salud.

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A pesar de su importancia como problema de salud pública, son pocos los estudios que se publicansobre la epidemiología y la evaluación de intervenciones para el control de las leishmaniasis. En estesuplemento se presentan los resultados de tres estudios realizados por una nueva generación deinvestigadores colombianos. Sus resultados invitan a evaluar los efectos de medidas de intervenciónen focos con características eco-epidemiológicas conocidas de transmisión, resaltan la importancia dela educación a la comunidad sobre la transmisión de la leishmaniasis y la adopción de medidas paraevitar el contacto con el vector, aportan información sobre la dinámica de la transmisión de laleishmaniasis cutánea americana y ofrecen evidencia adicional de su transmisión intra o peridomiciliaria.

La vacunación podría constituirse en una medida preventiva pero el desarrollo de vacunas aún está enuna fase incipiente y nos falta entender los diversos matices de la interacción huésped-parásito eneste modelo exitoso de parasitismo de los macrófagos, fagocitos por excelencia. Varios artículos eneste suplemento aportan hallazgos que contribuyen a comprender esta interacción. Se registra por vezprimera una corriente iónica en la membrana de la vacuola parasitófora de los macrófagos infectadoscon Leishmania amazonensis; se describen las características ultraestructurales de la interacciónentre una línea de células dendríticas y Leishmania mexicana, y se caracteriza el patrón de respuestacelular inmune encontrada en la prueba de leishmanina, comparándolo con el de lesiones activas; losresultados sugieren que la intradermoreacción simula la respuesta temprana a la infección. El artículosobre la cuantificación de citocinas caninas mediante la reacción en cadena de la polimerasa detranscriptasa reversa en tiempo real brinda una herramienta para entender el comportamiento y eldesenlace de la infección por Leishmania chagasi en este reservorio doméstico.

El conocimiento de las especies de Lutzomyia spp. vectores de leishmaniasis y su comportamientoresulta fundamental para proponer medidas de control. Los resultados de los trabajos entomológicosadelantados, principalmente, en la región andina colombiana y venezolana presentan nuevos registrosde especies de flebótomos, y evidencias para incriminar a algunas especies de Lutzomyia, entre ellas,L. youngi, L. trapidoi, L. longiflocosa y L. gomezi, como posibles vectores de especies de Leishmaniacausantes de leishmaniasis cutánea; todos resaltan la presencia de estos insectos vectores en el intray peridomicilio. Otros dos trabajos confirman el papel de Lutzomyia longipalpis y Lutzomyia evansicomo especies vectores de leishmaniasis visceral en zonas de bosque seco tropical.

Si bien el papel del perro como reservorio doméstico de la leishmaniasis visceral es conocido, dosartículos presentan nuevas evidencias que implican a este animal como posible fuente de infecciónpara especies de Lutzomyia transmisoras de leishmaniasis cutánea en zonas ecológicamente diferentes:Trujillo, en los Andes venezolanos, y la Costa Pacífica colombiana.

El conocimiento de las especies de Leishmania y su distribución geográfica contribuye a la comprensiónde su eco-epidemiología. La biodiversidad de Colombia se ve reflejada no sólo en la diversidad deespecies de Lutzomyia sino, también, en la variedad de especies circulantes de Leishmania. AunqueLeishmania panamensis continúa siendo la especie más ampliamente distribuida, dos artículoscomplementan el conocimiento sobre las especies de Leishmania presentes en Colombia y llamanespecialmente la atención sobre el hallazgo de L. mexicana en departamentos en los que no se habíaregistrado anteriormente.

El desarrollo de nuevos medicamentos para el tratamiento de las diferentes formas clínicas de laleishmaniasis constituye una prioridad en el mundo. Varios artículos en este suplemento informansobre alternativas al tratamiento convencional con antimoniales pentavalentes. Dos de ellos presentanhallazgos promisorios de estudios in vitro o in vivo, con el uso de un ácido kaurénico extraído de unaplanta y con la terapia fotodinámica, respectivamente. Otro evalúa a la pentamidina como una alternativaeficaz y segura, mientras que dos artículos abordan el uso de la hexadecilfosfocolina, o miltefosina,para la quimioterapia de la leishmaniasis. Este último compuesto presenta varias ventajas frente a losantimoniales pentavalentes, la anfotericina B y la pentamidina, siendo la principal de ellas suadministración oral. Aunque los estudios de eficacia y seguridad de la miltefosina demuestran que estemedicamento es eficaz y seguro para el tratamiento de la leishmaniasis visceral causada por L. donovani

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y de la cutánea causada por L. panamensis, algunos resultados de estudios publicados muestran quesu eficacia puede variar según la especie infecciosa de Leishmania. Esto, aunado a que el medicamentoes teratogénico y a que presenta una vida media prolongada, permite recomendar que su introducciónse haga con las debidas provisiones para garantizar su uso adecuado y seguro y evitar así elacortamiento de su vida útil.

En el 2005, el Estado colombiano invirtió un poco más de Col$ 9.609 millones (cantidad equivalente amás de US$ 4,5 millones) en la adquisición de los medicamentos necesarios para el tratamiento de laleishmaniasis (4,5). Su alto costo y el riesgo de tratamiento incompleto o efectos adversos resaltan laimportancia de garantizar no sólo su uso adecuado sino, también, de evaluar permanentemente sueficacia y seguridad. Esto podría lograrse mediante una estrategia de farmacovigilancia en sitioscentinela, como se propone en la revisión sobre el “Estado actual y futuro de la terapia antileishmaniásicaen Colombia”.

Una respuesta efectiva e integral al problema de la leishmaniasis requiere la concertación de esfuerzospor parte de la comunidad científica y médica, el Ministerio de la Protección Social y las secretarías desalud, departamentales y municipales. Este compendio de trabajos hace evidente que en Colombiaexiste una comunidad “doliente” dispuesta a servir y a apoyar técnica y científicamente al Ministerio dela Protección Social para que, en conjunto con el Instituto Nacional de Salud, sea posible reducir elimpacto de las leishmaniasis en el país con base en la evidencia científica.

Nancy Gore Saravia, Directora Científica del Centro Internacional de Entrenamiento e InvestigacionesMédicas (CIDEIM) Cali, Colombia; Directora del Centro Colaborador de la OMS en Leishmaniasis yotras Enfermedades TransmisiblesCali, Colombia

Rubén Santiago Nicholls, Grupo de Parasitología, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia

Referencias

1. Organización Mundial de la Salud. Control de leishmaniasis. Resolución No. EB 118.R3 delConsejo Ejecutivo de la OMS en sesión del 30 de mayo de 2006. [Consultado: 8 de agosto de2006]. Disponible en: http://www.who.int/gb/ebwha/pdf_files/EB118/B118_R3-sp.pdf.

2. Remme JHF, Blas E, Chitsulo L, Desjeux PMP, Engers HD, Kanyok TP et al . Strategic emphasesfor tropical disease research: a TDR perspective. Trends Parasitol 2002;18:421-6. [Consultado: 8de agosto de 2006]. Disponible en: http://www.who.int/tdr/publications/publications/pdf/strategic_emphases.pdf.

3. Zambrano P. Informe de leishmaniasis, Colombia, semanas 1 a 52 de 2005. Inf Quinc EpidemiolNac 2006;11:40-3. [Consultado: 8 de agosto de 2006]. Disponible en: http://www.ins.gov.co/iquen/2006_iqen_03.pdf

4. Ministerio de la Protección Social. Resolución No. 2004 de 2005 del 30 de junio de 2005.[Consultado: 14 de agosto de 2006]. Disponible en: http://www.minproteccionsocial.gov.co/VBeContent/library/documents/DocNewsNo595002.pdf

5. Ministerio de la Protección Social. Resolución No. 3831 de 2005. 1 de noviembre de 2005.[Consultado: 14 de agosto de 2006]. Disponible en: http://www.minproteccionsocial.gov.co/VBeContent/library/documents/DocNewsNo632301.pdf

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Biomédica 2006;26(Supl.1):10-2HERNÁNDEZ C.A.

IMÁGENES EN BIOMEDICINA

Las manifestaciones clínicas de la leishmaniasis cutánea y mucocutánea siguen siendo elprimer paso para la sospecha de la infección y, por consiguiente, para su diagnóstico y obtenciónde muestras para su confirmación parasitológica. A pesar de ser una de las patologíasparasitarias de mayor incremento en los últimos años en Colombia, no es fácil encontrar en laliteratura imágenes de las lesiones clínicas y de su evolución. Por esta razón, y con el ánimode brindarle imágenes de referencia al personal de salud que se enfrenta al diagnóstico deesta parasitosis, se presenta una serie de fotos que resumen la evolución del cuadro clínicodesde los lesiones iniciales en el momento de la picadura de la hembra de Lutzomyia hastalas manifestaciones graves por destrucción de la mucosa nasal y oral.

Palabras clave: leishmaniasis cutánea, leishmaniasis mucocutánea, Colombia

Natural history of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis

The clinical picture of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis is still the first step ininfection suspicion and, consequently, for its accurate diagnosis and sample obtention forparasitological confirmation. Even though leishmaniasis is the parasitic infection with thegreatest increase in the last years in Colombia, it is difficult to find in the literature photographsof its clinical manifestations and evolution. For this reason, and hoping to offer a referencearticle for health personnel dealing frequently with this pathology, a series of pictures is presentedthat summarize the clinical picture and its evolution from the incipient lesion after the bite of aLutzomyia female until the severe nasal and oral cartilaginous destruction.

Key words: leishmaniasis, cutaneous; leishmaniasis, mucocutaneous; Colombia

Historia natural de la leishmaniasis cutánea y mucocutáneaCarlos Arturo Hernández

Grupo de Parasitología, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia.

Correspondencia:Carlos Arturo Hernández, Grupo de Parasitología, InstitutoNacional de Salud, Avenida calle 26 Nº 51-60, Bogotá,D.C., Colombia.Pensionado de la institución desde 01/01/2006Teléfono: (571) 220 7700, extensión [email protected]

Recibido: 01/07/06; aceptado: 01/08/06

Figura 1. Manchas eritematosas con ligero tinte violáceoque desaparecen a la vitropresión; aparecen poco tiempodespués de la picadura de la hembra de Lutzomyia, sinimportar si está infectada o si no lo está. Los pacientesrefieren una sensación de “quemadura” o “pringue” en elmomento de la picadura.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):10-2 HISTORIA NATURAL DE LA LEISHMANIASIS

Figura 2. Entre los 3 y 8 días, aproximadamente, despuésde la picadura aparece una pequeña pápula indurada en elsitio de la picadura si hubo transmisión de promastigotes deLeishmania sp. Nótese que no hay eritema ni descamaciónde la piel alrededor de la lesión; además, el paciente norefiere ninguna sintomatología; no hay dolor, ni prurito, nimolestia alguna.

Figura 3. A las dos semanas, aproximadamente, despuésde la picadura, la lesión continúa su proceso de ulceración yla costra central es más evidente, al igual que la induraciónalrededor de la lesión. Los demás signos permanecen sinvariación.

Figura 4. Hacia la tercera semana de evolución de la lesiónya aparece la imagen de la úlcera típica, la cual es simétrica,redondeada u ovalada, con bordes indurados y levantados,y fondo limpio de aspecto granulomatoso que sangrafácilmente; si no hay infección bacteriana ni micótica asociadael paciente no presenta eritema ni descamación de la piel.

Figura 5. Ocasionalmente, se puede observar la presenciade linfadenopatías en el sitio de drenaje de la lesión, comofue el caso de este paciente con una lesión en el hombroderecho; la frecuencia de este hallazgo clínico todavía nose ha logrado precisar.

Figura 6. Cicatriz “típica” en la que se observa ligerahiperpigmentación, con presencia de líneas radiadascentrípetas y, necesariamente, de menor grosor que la pielnormal dado el compromiso importante que hubo en laepidermis y en la dermis.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):10-2HERNÁNDEZ C.A.

Conflicto de intereses

El autor manifiesta que no tiene ningún tipo deconflicto de intereses.

Figura 11. Si el compromiso es de la mucosa de la cavidadoral –menos frecuente que el de cavidad nasal– el pacientepresenta pérdida de la úvula y compromiso de los velos delpaladar, y el paladar duro tiene aspecto de “empedrado”. Elcompromiso puede también extenderse a la mucosa de lalaringe y la faringe e, incluso, a la de la tráquea superior.

Figura 7. Una de las primeras manifestaciones delcompromiso de la mucosa nasal es el enrojecimiento de lamucosa del tercio distal del tabique nasal. Es posible que elpaciente consulte por epistaxis o rinorrea frecuentes, o porsensación de dificultad para respirar. El tiempo de apariciónde este signo es totalmente impredecible con las técnicasque se cuenta en la actualidad.

Figura 8. Posteriormente, se inicia un proceso de ulceraciónde la mucosa con ligera elevación e induración de los bordesde la lesión y, por consiguiente, epistaxis frecuente con elmás leve estímulo mecánico.

Figura 9. Algunos pacientes presentan, días o mesesdespués, destrucción del soporte cartilaginoso de la nariz;en este caso, hubo perforación del tercio distal del tabiquepor una lesión cutánea en el dorso de la nariz para la cual lapaciente no recibió tratamiento alguno.

Figura 10. Si la lesión mucosa es más agresiva, el pacientepuede presentar no sólo la deformación, el ensanchamientoy la perforación del tercio distal del tabique sino, también, lapérdida del soporte cartilaginoso de las aletas nasales y laconsecuente caída de la punta nasal a la que se le conocecomúnmente como “nariz de tapir” o “pico de loro”.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):13-6 MILTEFOSINA EN LEISHMANIOSIS CUTÁNEA DISEMINADA

PRESENTACIÓN DE CASOS

Tratamiento con miltefosinade la leishmaniosis cutánea diseminada

Lina María González, Iván Darío Vélez

Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales (PECET), Universidad de Antioquia,Medellín, Colombia.

La leishmaniosis cutánea diseminada es una forma escasa de leishmaniosis, que se caracterizapor la diseminación sanguínea del parasito que lleva a la aparición de múltiples nódulos yplacas en la piel de todo el cuerpo y aun de la mucosa nasal. Se diferencia de la leishmaniosiscutánea difusa en que la alteración de la inmunidad celular es menor y las lesiones puedentener una descamación epidérmica, en cambio en la leishmaniosis difusa las lesiones sonnodulares y hay una anergia celular específica contra el parásito. En este artículo se describeel caso de un paciente colombiano con Leishmaniosis cutánea diseminada causada por L(V)panamensis que inicialmente tuvo falla terapéutica al ser tratado con Glucantime y AnfotericinaB y quien curó de sus lesiones al recibir tratamiento con Miltefosine.

Palabras claves : Leishmaniosis cutánea diseminada, tratamiento, miltefosine

Miltefosine for disseminated cutaneous leishmaniasis

Disseminated cutaneous leishmaniasis is a rare presentation characterized by hematogenousdissemination of the parasite that causes the appearance of multiple nodules and plaques inthe skin of the whole body and even including the nasal mucous membrane. It differs fromdiffuse cutaneous leishmaniasis because the alteration in cellular immunity is lower and thelesions may have epidermal desquamation. On the other hand, diffuse cutaneous leishmaniasispresents nodular lesions and a specific anergy in the immune response directed against theparasite. This article describes the case of a Colombian patient with disseminated cutaneousleishmaniasis caused by L. (V) panamensis. The initial treatments with Glucantime® andAmphotericin B failed, but his lesions healed after treatment with miltefosine.

Key words: Disseminated Cutaneous Leishmaniasis, treatment, Miltefosine

Correspondencia:Iván Darío Vélez, Programa de Estudio y Control deEnfermedades Tropicales, PECET, Universidad de Antioquia,Sede de Investigaciones Universitaria, SIU, Lab. 632, Calle62 No. 52-59. Medellín, Colombia.Teléfono: (574) 210 6501, fax: (574) 210 [email protected]


de los parásitos, aparecen múltiples lesiones tiponódulo o placas redondeadas, indoloras, sinulceración, de diferente tamaño y velocidad decrecimiento, distribuidas por todo el cuerpo,incluidas la mucosa nasal. En Colombia se haninformado varios casos, con compromiso mucoso,producidos por L. (V) panamensis (2).

Para algunos autores, la leishmaniosis cutáneadiseminada es sinónimo de leishmaniosis cutáneadifusa pero otros autores diferencian ambasentidades y reservan esta última denominación ala presentación clínica caracterizada por laaparición de múltiples lesiones nodulares que, alconfluir en la cara, pueden dar el aspecto de faciesleonina semejante al de la lepra lepromatosa,acompañadas de anergia específica contra el

La leishmaniosis cutánea diseminada es unaforma poco frecuente de leishmaniosis que puedeser causada por Leishmania amazonensis (1), L.panamensis (2) y L. guyanensis (3). La enfermedadempieza con una lesión primaria tipo nódulo oplaca con descamación epidérmica en el sitio depicadura del vector flebotomíneo y, semanas omeses después, por la diseminación hematógena

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parásito, una pobre respuesta al tratamiento conantimoniales, frecuentes recaídas y la ausenciade infiltrado inflamatorio en la piel, a pesar de lagran cantidad de parásitos, como consecuenciade la falta de respuesta celular inmune, específicacontra la Leishmania (4). L. amazonensis es laespecie más frecuentemente implicada y seacepta que depende no sólo de la especie delparásito sino, también, de factores propios delhospedero que lo hacen susceptible a que seinhiba la inmunidad celular cuando está encontacto con el parásito (5).

En los últimos años se ha informado un incre-mento en el número de casos y para algunosinvestigadores brasileros la leishmaniosis cutáneadiseminada es una nueva forma emergente de laleishmaniosis cutánea (6). La respuestaterapéutica con antimoniales pentavalentes (Sb5)es variable. Algunos responden bien a la dosiscorriente de 20 mg de Sb5/kg IM por día por 20días (2) pero en otros, como el que se presentaen esta comunicación, la respuesta terapéutica alos antimoniales pentavalentes es mala. Paraalcanzar una mejor respuesta terapéutica se hasugerido la util ización de antimonialespentavalentes por periodos más prolongados (30días) y con seguimiento estricto (6).

El disponer de alternativas terapéuticas para todaslas formas de leishmaniosis es una necesidadsentida de los médicos, los investigadores y lasautoridades de salud de todos los países en dondese presentan casos de esta enfermedad.

Una alternativa terapéutica debe tener entre suscaracterísticas una alta eficacia -aun para lascepas resistentes a los antimoniales-, bajatoxicidad, bajo costo, disponibilidad en lasregiones apartadas en donde se presentan loscasos clínicos y vía de administración oral o tópica.

Desde hace varios años se ha investigado untratamiento oral efectivo para la leishmaniosiscutánea y la visceral. Luego de múltiples ensayosclínicos fallidos con mefloquina (7), alopurinol (8)y ketoconazol (9), la miltefosina (1 hexa-decil-fosfocolina), un fosfolípido alcalino desarrolladoinicialmente como agente antineoplásico,demostró buena actividad anti-Leishmania y fueavalado por la Organización Mundial de la Salud

como tratamiento de primera elección para laleishmaniosis visceral producida por L. (L)donovani en India y Sudán, donde la resistenciaa los antimoniales pentavalentes es del orden del60% (10,11).

Este mismo tratamiento fue evaluado en Colombiapara el establecimiento de una dosis óptima parael tratamiento de la leishmaniosis cutánea (12) y,posteriormente, en estudio multicéntrico realizadoen Colombia y Guatemala, se encontraroneficacias de 91% y 53%, respectivamente,diferencia terapéutica causada al parecer por ladiferencia en las especies de Leishmaniaprevalentes en ambos países, siendo tan sólo del33% para L. (V) braziliensis (13).

No conocemos ningún informe del uso demiltefosina para el tratamiento de la leishmaniosiscutánea diseminada, la cual se empleó en elpaciente que se presenta en este informe, ante lafalla terapéutica previa a dos ciclos deGlucantime® y uno de anfotericina B y, luego dehaber aceptado, mediante consentimientoinformado, recibir este tratamiento.

Presentación del caso

Se trata de un hombre de 26 años, provenientedel área rural del municipio de Urrao (Antioquia,Colombia). Consultó al hospital local por primeravez en noviembre de 2002, con manifestacionesclínicas de una lesión de un mes de evolucióntipo placa, localizada en el cuello. Se diagnosticóleishmaniosis cutánea y se inició tratamiento conGlucantime®, 20 mg Sb5/kg por día por un períodode 20 días. Al final del tratamiento el paciente nosólo no presentó mejoría de la lesión sino que,por el contrario, aparecieron múltiples lesiones portodo el cuerpo. Se consideró falla terapéutica yen enero de 2003 se le inició un segundo ciclo deGlucantime® a la misma dosis, sin lograrseninguna mejoría.

En marzo de 2003 el paciente fue remitido alPrograma de Estudio y Control de EnfermedadesTropicales (PECET) de Medellín. Al ingreso elpaciente presentaba aproximadamente 300lesiones en piel, tipo nódulo y placa con costrasepidérmicas, sin compromiso mucoso y sinsíntomas constitucionales. No presentaba

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antecedentes personales de importancia. Serealizaron de nuevo exámenes diagnósticos y seencontró un examen directo positivo, la pruebaintradérmica de Montenegro de 10 mm a las 48horas y cultivo positivo. La identificación de lacepa por la técnica de anticuerpos monoclonalesmostró que se trataba de L. (V) panamensis.

Al paciente se le inició tratamiento hospitalariocon anfotericina B, 1 mg/kg IM por día por nuevedías, con respuesta parcial, pero el tratamientodebió suspenderse por toxicidad renal con unincremento de la concentración de creatinina séricade 2,4 mg/dl y disminución significativa de lafunción renal.

En julio de 2003 se inició la administración deMiltefosine®, gentilmente suministrado por H.Sindermann de Zentaris, a la dosis de 150 mg/día por 28 días. Antes de iniciar el tratamiento, elpaciente ya presentaba normalidad de su funciónrenal y hepática y las cifras del hemograma estabanen los valores normales.

Se siguieron las instrucciones del fabricante delfármaco y se hizo seguimiento clínico y delaboratorio (hematológico, renal y hepático)semanalmente durante el tratamiento. Todos losexámenes resultaron normales; sólo presentó unincremento leve del valor de la creatinina séricaen la tercera semana (1,68 mg/dl), que senormalizó en la cuarta semana. El paciente nopresentó ninguna reacción adversa seria nicomplicaciones durante el tratamiento. Al final delos 28 días del tratamiento las lesiones eran máspequeñas o habían desaparecido y no sepresentaron nuevas lesiones.

Se realizó seguimiento clínico a los 45 días,cuatro meses y dos años luego de finalizado eltratamiento. El paciente no presentó recaídas y laslesiones se encontraban completamente curadas.

Discusión

Se trata de un paciente con leishmaniosis cutáneadiseminada, toda vez que tenía una diseminaciónde una lesión inicial, con la aparición de cerca de300 lesiones cutáneas tipo nódulo y placa en todoel cuerpo, con respuesta positiva a la pruebaintradérmica de Montenegro de 10 mm, que nopresentó respuesta terapéutica a los antimoniales

pentavalentes y no toleró la administración deanfotericina B.

Es un nuevo un caso de diseminación de laenfermedad a partir de una lesión inicial, causadapor L. (V) panamensis, especie que predominaen la región norte y occidental de Colombia y queproduce un gran polimorfismo clínico con compro-misos cutáneos, mucosos y diseminados (2,14).

La dosis seleccionada para el tratamiento conMiltefosina® fue de 150 mg por día por 4 semanas,equivalente a 2 mg/kg por día por 28 días, que fuela mejor respuesta terapéutica obtenida por Sotoet al. para el tratamiento de leishmaniosis cutáneaen Colombia (12).

A pesar que se trata de un solo caso clínico, estabuena respuesta terapéutica en un paciente queno respondió al tratamiento con antimonialespentavalentes señala la posibilidad de emplear laMiltefosina® para el tratamiento de la leishmania-sis cutánea que no respondan a los antimoniales;también, presenta una buena alternativaterapéutica para la leishmaniosis cutáneadiseminada que debería evaluarse, igualmente,para el tratamiento de la leishmaniasis cutáneadifusa.

Diferentes estudios han reportado algunasreacciones adversas como cefalea, mareos, dolorabdominal, náuseas, vómito y diarrea y aumentode la creatinina y de las transaminasas hepáticas.La Miltefosina® está contraindicada en elembarazo. En este reporte el paciente no presentóningún efecto secundario, excepto un aumentotransitorio de la creatinina. Los estudios conmayores series de casos permitirán concluir sobrela eficacia de la Miltefosina® en el tratamiento dela leishmaniosis cutánea resistente a losantimoniales y su utilidad en el tratamiento de laleishmaniosis cutánea diseminada y de la leish-maniosis cutánea difusa.


Los autores manifestamos que no existe conflictode intereses.

Agradecimientos

Al Dr. J. Soto por su gestión para la consecusiónde la Miltefosine.

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Financiación

Este estudio fue financiado por el Programa deEstudio y Control de Enfermedades TropicalesPECET, Universidad de Antioquia.

Referencias

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Biomédica 2006;26(Supl.1):17-25 FAGOCITOSIS DE LEISHMANIA POR CÉLULAS FSDC

ARTÍCULO ORIGINAL

Estudio ultraestructural de la fagocitosis depromastigotes y amastigotes de Leishmania mexicana por

la línea de células dendríticas FSDCLadys Sarmiento1, Martha Ayala 2, Sandra Peña 1, Gerzaín Rodríguez 3,4,

Zelandia Fermín 5, Felix J Tapia 6

1 Unidad de Microscopía y Análisis de Imágenes, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia2 Laboratorio de Parasitología, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia3 Laboratorio de Patología, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia4 Facultad de Medicina, Universidad de la Sabana, Bogotá, D.C., Colombia5 Laboratorio de Inmunología Celular, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.6 Laboratorio de Biología Molecular, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.

Introducción. Las células dendríticas están presentes en la mayoría de los tejidos, ellas capturany presentan antígenos para activar a los linfocitos T.Objetivo. Se describe ultraestructuralmente la fagocitosis de Leishmania mexicana por lalínea de células dendríticas FSDC, una línea de células de Langerhans obtenida de la epidermisfetal de ratón, e inmortalizada por la transducción retroviral del oncogen v-myc.Materiales y métodos. Se obtuvieron amastigotes de la lesión de ratones Balb/c y promastigotesa partir del cultivo (24°C) de la lesión. Las FSDC se cultivaron con los parásitos en unaproporción de 5 parásitos por célula, en medio IMDM, durante 24 horas. Los cultivos infectadosy los controles se procesaron para microscopía electrónica de transmisión. Se hicieron cortessemifinos contrastados con azul de toluidina para evaluar porcentaje de fagocitosis y finos,contrastados con acetato de uranilo y citrato de plomo.Resultados. El 13,42% de las FSDC fagocitaron promastigotes; de ellas el 8% contenían unparásito y el restante 5,2% fagocitó dos o más. El 20% de las FSDC fagocitaron amastigotes;10% contenían un parásito y 10% dos o más. Ultraestructuralmente se observaron promastigotesen contacto con las células por el flagelo o por el polo posterior. Los fagosomas que conteníanpromastigotes eran organelos estrechos con uno ó dos parásitos. Los que conteníanamastigotes eran de gran tamaño (8 µm) con uno o varios parásitos, libres o adosados a lamembrana del fagosoma por su polo posterior.Conclusión. La infección de las FSDC se caracterizó por una baja tasa de células infectadasal ser expuestas a promastigotes o amastigotes. La vacuola parasitofora presentó característicassimilares a las de los macrófagos. En su mayoría las FSDC presentaban 1 a 3 parásitos porcélula. Las observaciones plantean la necesidad de estudiar la relación entre capacidad defagocitosis y función.

Palabras clave: células de Langerhans, Leishmania, fagocitosis, microscopía electrónica.

Phagocytosis of promastigotes and amastigotes of Leishmania mexicana by the FSDCdendritic cell line: Ultrastructural study

Introduction . Dendritic cells, which capture and present antigen to activate unprimed T cell, arefound in most tissues.Objective. This work describes the ultrastructure of Leishmania mexicana phagocytosis by thefetal skin dendritic cell (FSDC) line, a Langerhans cell line isolated from mouse fetal epidermisimmortalized by retroviral transduction of the v-myc oncogene.Materials and methods. Leishmania amastigotes were obtained from mouse (BALB/c) lesionand promastigotes from culture (24°C) of the lesion. FSDC cells were cultured with parasites (5parasites per cell) using IMDM medium, during 24 hours. Control and infected cultures wereprocessed for transmission electron microscopy. Semi-thin sections counterstained with toluidine

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Biomédica 2006;26(Supl.1):17-25SARMIENTO L., AYALA M., PEÑA S. et al.

blue to evaluate phagocytosis and thin sections counterstained with uranyl acetate and leadcitrate were made.Results. 13.42% of the FSDC phagocytosed promastigotes; 8% contained a single parasiteand 5.2% phagocytosed 2 or more. 20% of the FSDC phagocytosed amastigotes; 10% containeda single parasite and 10% phagocytosed 2 or more. Ultrastructurally, promastigotes in contactwith FSDC by the flagellum or the posterior pole were observed. The parasitophorous vacuolesharbouring promastigotes were small organelles containing one or two parasites each.Parasitophorous vacuoles containing amastigotes were larger (8µm diameter) with one orseveral parasites free or attached to the vacuole at the posterior pole.Conclusion. The low rate of infected FSDC cells was characteristic and the parasitophorousvacuole showed similar characteristics to those observed in macrophages. The parasite densityin the infected cells was 1 to 3 parasites per cell. These observations highlight the need to studythe relationship between phagocytic capacity and function.

Key words: Langerhans cells, Leishmania, phagocytosis, electron microscopy.

Las células dendríticas son elementos clavedel sistema inmune, centinelas en la periferia quealertan a los linfocitos T de antígenos invasoresy dirigen el montaje de una respuesta eficiente(1). En la epidermis y otros epitelios estratificados,la célula de Langerhans es la representante porexcelencia del sistema de células dendríticas (2).La leishmaniasis cutánea es producida por lainoculación intradérmica del parásito por el vec-tor, lo que hace pensar que las células de Langer-hans tienen una participación crítica no sólo du-rante el proceso inflamatorio sino en el inicio deuna respuesta específica (3). La interacción delas células de Langerhans con parásitos de Leish-mania sp. se demostró en 1990 cuando Moll etal., empleando estas células recién aisladas dela epidermis de ratones Balb/c, encontraron que20% de ellas fagocitaban amastigotes de Leish-mania major en 24 horas; sin embargo, no seprodujo interacción con promastigotes, la formainoculada por el vector en la piel (4).

Más tarde, Udey et al., empleando célulasexpandidas de piel fetal de ratones C57BL6(FSDDC), obtuvieron 36% de fagocitosis deamastigotes mientras que solamente el 7%fagocitaron promastigotes (5). Estos resultadoscon células dendríticas derivadas de la piel,

contrastan con los más altos porcentajes defagocitosis que se logran cuando se empleancélulas dendríticas de otro origen, como lasdiferenciadas de médula ósea, en las que se hanencontrado porcentajes de fagocitosis deamastigotes y promastigotes de 40% y 54%,respectivamente, y de 76% y 80% (6,7).

Al emplear células dendríticas generadas a partirde monocitos de sangre periférica, se hanobtenido porcentajes de fagocitosis de amastigotesy promastigotes de 58% y 38%, respectivamente,y en el caso de células dendríticas derivadas debazo se encontró un porcentaje de fagocitosisde promastigotes del 33% (8,9). Las célulasdendríticas son una población celular muyheterogénea, por lo que las diferencias reportadasen la fagocitosis de las diferentes formas delparásito pueden ser producto de múltiples factores,entre ellos, su origen.

El objetivo de este trabajo fue estudiar lacapacidad de la línea de células dendríticas FSDCpara fagocitar parásitos de Leishmania mexicanay determinar las características ultraestructuralesde la interacción con cada una de las formas delparásito. Esta determinación ultraestructural nose había realizado previamente en el modeloestudiado, en el que la microscopía electrónicase ha empleado sólo como evidencia paradocumentar la infección.

Materiales y métodos

Parásitos

Se empleó la cepa de L. mexicana 000/00/WR-L11 CL802, donada al banco de criopreservación

Correspondencia:Ladys Sarmiento, Grupo de Microscopía y Análisis deImágenes, Instituto Nacional de Salud, Avenida Calle 26 Nº51-60, Oficina 233, Bogotá, D.C., ColombiaTeléfono: (571) 220 7700, extensión [email protected]


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del Laboratorio de Parasitología del InstitutoNacional de Salud (INS) por Robert Tesh de YaleUniversity. La identidad de la cepa se confirmópor isoenzimas y anticuerpos monoclonales.

Los amastigotes se extrajeron de la lesióndesarrollada en la almohadilla plantar de ratonesBALB/c inoculados 9 semanas antes con 1x106

promastigotes en 50 µl de solución salina estéril.El tejido obtenido se maceró en un filtro metálicocon el émbolo de una jeringa plástica, adicionandolentamente 10 ml de medio de Schneider. Con elfin de liberar los amastigotes de los macrófagos,la mezcla se pasó a través de agujas calibre 21 y26, se centrifugó a 246g por 5 minutos y elsobrenadante se colocó en hielo por 1 hora pararetirar los residuos adheridos a los amastigotes.Luego de centrifugar a 1.120g por 5 minutos, elsedimento de amastigotes se resuspendió enmedio de Schneider y se pasó por aguja número29 para facilitar el recuento de los parásitosindividuales (10). Antes de ponerlos en contactocon las células, los parásitos se lavaron ensolución salina al 0,85% y se transfirieron a medioIscove Modified Dubelcco Medium (IMDM).

Los promastigotes obtenidos del cultivo de tejidode la lesión de los ratones infectados, semantuvieron en medio Schneider a 24°C hastaincrementar la población y 10 días después delúltimo pasaje se lavaron en solución salina al0,85% y se transfirieron a medio IMDM para serpuestos inmediatamente en contacto con lascélulas, de la misma manera en que se procediócon los amastigotes.

Células

La línea FSDC fue amablemente suministrada porPaola Ricciardi-Castagnoli del Departamento deBiotecnología y Biociencias de la Universidad deMilán-Bicocca en Italia. La línea fue derivada decélulas dendríticas de piel fetal de ratón; si bienla suspensión de células se obtuvo de la epider-mis, el crecimiento de algunos fibroblastos en losprimeros pasajes no excluye contaminacióndérmica. La línea fue inmortalizada por latransducción retroviral del oncogen v-myc (11);tiene características de célula de Langerhanscomo son la expresión de ATPasa de membrana(11), la hidrólisis de ADP pero no de ATP (12),

además de un fenotipo de célula dendríticamieloide inmadura (13). El cultivo se realizó enmedio IMDM con 5% de suero fetal bovinoinactivado, 2mM de L-glutamina, 100 UI/ml depenicilina,100 µg/ml de estreptomicina y 0,05mMde mercaptoetanol, a 37ºC y 5% de CO

2.

Cultivos de FSDC con los parásitos

Las FSDC con una viabilidad mayor al 98% secolocaron en medio IMDM fresco (con 5% desuero fetal bovino inactivado, 2mM de L-glutamina,100 UI/ml de penicil ina, 100 µg/ml deestreptomicina y 0,05mM de mercaptoetanol) yse incubaron durante 30 minutos, tiempo requeridopara su adherencia, a 37°C y 5% de CO

2. Luego,

las monocapas de FSDC se pusieron en contactocon promastigotes o amastigotes, en unaproporción de 5 parásitos por célula. Los cultivosse incubaron durante 24 horas a 37°C, con 5%de CO

2. Como control se emplearon FSDC

cultivadas en medio IMDM en las mismascondiciones, pero sin la adición de parásitos.

Microscopía electrónica

Veinticuatro horas después de poner en contactolas células con los parásitos, los cultivos se fijaronen glutaraldehído al 3% en solución tampón defosfato 0,01M, pH 7,2, durante 1 hora, atemperatura ambiente. Luego se posfijaron entetraóxido de osmio al 1% durante 1 hora, a lamisma temperatura. Se deshidrataron en etanolde grados ascendentes, se infiltraron e incluyeronen resina epón-araldita. Se hicieron cortessemifinos de 1 µm de espesor y cortes finos de60 nm que se tiñeron con acetato de uranilo ycitrato de plomo (14). Las muestras se observaronen un microscopio electrónico de transmisiónZeiss EM 109.

Recuentos

Por medio de la observación con microscopía deluz de los cortes de 1 µm teñidos con azul detoluidina, se efectuó el recuento para calcular elporcentaje total de células con parásitosfagocitados y el porcentaje de células que habíanfagocitado 2 o más parásitos.

Se contaron 200 células en cada uno de los tresexperimentos independientes realizados porduplicado.

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Resultados

Veinticuatro horas después de poner en contactolas FSDC con promastigotes de L. mexicana, un13,42% de ellas habían fagocitado lospromastigotes. Los cultivos de FSDC puestos encontacto con amastigotes produjeron unporcentaje de fagocitosis de 20%. Por lo menos,el 50% de las FSDC fagocitaron un solo parásitoindependientemente de su forma (cuadro 1). Nofue posible inferir diferencias en los dos grupos,dada la dispersión de los datos.

Ultraestructuralmente, en los cultivos control seobservaron FSDC con abundantes dendritas,núcleo periférico y citoplasma con gran cantidadde retículo endoplásmico granuloso, algunasmitocondrias y pocas vacuolas (figura 1).

Los cultivos de FSDC puestos en contacto conpromastigotes mostraron la unión inicial delparásito a las células tanto por el flagelo comopor el polo posterior (figuras 2 y 3). Lospromastigotes se localizaban en vacuolas queadoptaban su forma y que presentaban un espaciomuy reducido entre el parásito y la vacuola,máximo de 100 a 200 nm (figura 4). El 8% de lascélulas presentaba vacuolas con un sólo parásitoy el 3% contenían dos por vacuola como semuestra en la figura 3. Ocasionalmente seobservaron parásitos en degradación dentro de lavacuola, como lo evidencia la pérdida deribosomas que deja una apariencia de espacios

vacíos en el citoplasma del parásito (figura 5).Algunas células, aunque no habían fagocitado,presentaron abundante número de vacuolascitoplasmáticas (figura 6).

Los cultivos puestos en contacto con amastigotespresentaron células con fagosomas más grandesque los observados cuando se emplearonpromastigotes, que llegaban a tener de 5 a 8 um,aun cuando dentro de ellos se encontrara un soloparásito (figura 7). Los amastigotes se encontraronadosados a la vacuola por su polo posterior y libre(figuras 7 y 8). Se pudo observar desde un soloamastigote hasta diez dentro de un mismofagosoma (figura 8).

Discusión

Las células dendríticas son una población muyheterogénea. Su susceptibilidad a infectarse conLeishmania sp. parece depender no sólo del tipoy procedencia de la célula dendrítica sino tambiénde la especie y estadio de Leishmania sp.empleada (15). Cuando se emplean célulasdendríticas derivadas de la epidermis como lascélulas de Langerhans, se obtienen menoresporcentajes de fagocitosis que cuando se empleacualquier otro tipo de célula dendrítica. La líneacelular FSDC mostró un comportamiento similaral reportado con las FSDDC en cuanto alporcentaje de células capaces de fagocitar elparásito (36% de amastigotes y 7% depromastigotes) (5), bajo, si se compara con los

Cuadro 1. Porcentaje de fagocitosis de promastigotes y amastigotes de L. mexicana por la línea de células FSDC. Losresultados se expresan como el porcentaje promedio obtenido del recuento de 200 células en tres experimentos independientesrealizados por duplicado.

Leishmania % total de FSDC % de FSDC % de FSDC % de FSDC % de FSDCmexicana con parásitos con un con dos con tres más de tres

fagosomas parásito parásitos parásitos parás itos

Amastigotes Media 20,17 10,08 4,83 2,17 3,08DE 14,77 6,92 5,26 1,78 2,04Coeficiente de variación 73,23 68,67 108,83 82,13 66,00

Promastigotes Media 13,42 8,17 3,33 0,83 1,08DE 2,91 2,38 1,33 0,52 0,74Coeficiente de variación 21,66 29,15 39,87 61,97 67,94

Total Media 16,79 9,13 4,08 1,50 2,08Des. estándar 10,74 5,04 3,74 1,43 1,79Coeficiente de variación 63,97 55,20 91,61 95,35 86,13

DE: desviación estándar

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Figura 1. Electromicrografia de una célula FSDC del cultivocontrol. N: núcleo con nucléolo prominente; V: vacuola; : mitocondria; :microvellosidad; barra: 3 µm.

Figura 2. Electromicrografia de un promastigote de L.mexicana que se une a la célula a través del flagelo. P:promastigote; :flagelo; barra: 1,5 µm.

Figura 3. Electromicrografia de un promastigote de L.mexicana cuyo polo posterior está en contacto con unaFSDC. Se observan dos parásitos (P) dentro de unfagosoma. Barra: 5 µm.

Figura 4. Electromicrografia de un promastigote dentro delfagosoma de la FSDC. Las flechas indican el pequeñoespacio entre la membrana del parásito y el fagosoma. N:núcleo; barra: 1 µm.

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reportados para tipos diferentes de célulasdendríticas. También presentan similitud con losobtenidos por Moll et al. en cuanto a amastigotesse refiere (4).

La aparente menor captación de parásitos porparte de una célula que se ha venido considerandola iniciadora de la respuesta inmunitaria altransportar el antígeno hasta el ganglio linfático,si bien es un hecho que no necesariamente tieneimplicaciones biológicas, sí llama la atenciónsobre el verdadero papel que esta célula podríaestar jugando en el inicio de la respuesta a laenfermedad.

Trabajos recientes demuestran que aunque sepudieron detectar parásitos en el ganglio unaspocas horas después de la infección, éstosestaban en macrófagos. Ninguna célula dendríticaemigrante de la piel tenía parásitos, lo cual indicaque no eran las transportadoras. Los parásitos se

Figura 5. Electromicrografia de una célula FSDC quecontiene un promastigote (p) en degradación, como lodemuestra la apariencia vacía del citoplasma por la pérdidade ribosomas. Barra: 5 µm.

Figura 6. Electromicrografía de una célula FSDC del cultivoinfectado. No contiene parásitos en su interior peroevidencia una gran cantidad de vacuolas (v) en sucitoplasma. r: retículo endoplasmatico; barra: 5 µm.

detectaron en células dendríticas en el gangliosólo tres semanas después de la infección (16).

Otra evidencia muestra que las células dendríticasque transportaban antígeno de Leishmania tresdías después de la infección eran de origendérmico y no epidérmico, concluyendo que lascélulas dendríticas dérmicas y no las células deLangerhans eran las principales presentadoras deantígeno en leishmaniasis (17).

Lemos et al. demostraron que no se requiere delas células de Langerhans para la presentaciónde antígenos ya que otras células dendríticaspueden desempeñar eficientemente el mismopapel (18). Prina et al. proponen que las célulasdendríticas en presencia de un bajo número depromastigotes no opsonizados podrían infectarseo no hacerlo por su baja actividad fagocítica, porla competencia con macrófagos residentes o, porel contrario, se infectarían permaneciendo

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inmaduras o en un estadio intermedio que nopermitiría la estimulación de los linfocitos T. Porlo tanto, se retardaría el inicio de la respuesta loque permitiría la amplificación del parásito para,luego, ya en presencia de opsoninas como losanticuerpos, fagocitar los amastigotes, madurary amplificar la respuesta (6).

Figura 7. Amastigote de L. mexicana adosado por su poloposterior a un gran fagosoma dentro de la célula FSDC.VP: vacuola parasitófora; A: amastigote; barra: 1,5 µm.

Figura 8. Fagosomas en el citoplasma de una FSDC congran número de amastigotes de Leishmania adosados ylibres. Barra: 5 µm

Los trabajos que varios grupos están adelantandoespecíficamente en células de Langerhans,permitirán en un futuro aclarar su verdadero papelen el inicio de la respuesta a la leishmaniasis.

Los estudios por videomicroscopía han mostradoque los promastigotes de Leishmania major yLeishmania aethiopica se unen a la célulahospedera de manera predominante por el flageloy, ocasionalmente, por el polo posterior, mientrasque Leishmania donovani lo hace por los dos sitiosen igual proporción (19); también se hadocumentado que Leishmania amazonensis seune al macrófago por los dos polos (20). Nosotrosobservamos la unión de L. mexicana por losdos polos pero no medimos la frecuencia con laque esto ocurría.

Una vez fagocitado, el promastigote se encuentraen una vacuola parasitófora característicamentemuy estrecha, ajustada al parásito a manera deguante, que deja un espacio muy reducido entreel parásito y la membrana de la vacuola.

En los macrófagos, las vacuolas parasitóforas quecontienen L. mexicana son grandes (20,21). Seha identificado un proteofosfoglicano secretadoa través del saco flagelar de amastigotes de L.mexicana que causa vacuolización de losmacrófagos in vitro (22,23). Aparentemente, losamastigotes de L. major no secretan estamolécula y el parásito no induce la formación degrandes vacuolas parasitóforas en macrófagos(23). También se ha encontrado que elagrandamiento de la vacuola parasitófora esmenos acentuado en células dendríticas que enmacrófagos, lo cual indica que la biogénesis dela vacuola parasitófora es diferente en estas doscélulas o que su formación es retrasada en célulasdendríticas (6).

Los amastigotes de L. mexicana se encontraronadheridos a la membrana de la vacuolaparasitófora en las FSDC por su polo posteriorpero también se encuentran libres dentro de ella,de la misma manera como se ha reportado paralas vacuolas parasitóforas formadas enmacrófagos (24).

Si bien la aparición de gran cantidad de vacuolasen las células que no fagocitaron puede tener

24


causas diversas, una posibilidad es que se debaa un estímulo por parte de las células infectadas,como se ha propuesto (6). Sin embargo, estotendría que demostrarse por métodos deinmunomicroscopía electrónica para este caso.

La estructura de la vacuola parasitófora y sucomposición bioquímica ya han sido estudiadasen macrófagos y, más recientemente, en célulasdendríticas generadas de médula ósea. Se debenhacer estudios encaminados a la caracterizaciónde la vacuola parasitófora formada específica-mente en células de Langerhans, en búsquedade las diferencias que puedan existir con lasvacuolas parasitóforas generadas en otros tiposde células dendríticas.

La alta resolución que se logra con la microscopíaelectrónica (100-200Å), permite aprovechar estaherramienta para el estudio detallado del suceso.

No fue posible inferir sobre la significanciaestadística de los resultados entre los dos gruposde células de trabajo, debido a la alta dispersiónque presentaron los datos, situación que se reflejaen los altos porcentajes de los coeficientes devariación estimados. Sin embargo, se pudoobservar que como célula dendrítica, ésta fagocitade manera preferencial un solo parásito. Lavariación observada podría estar relacionada conel tamaño reducido de las áreas de estudio paramicroscopía electrónica, de máximo 0,5 mm, y laforma como se distribuye la muestra; aunque lamezcla de células dendríticas y parásitos se hacehomogénea, se observan diferencias entre losfragmentos de muestra escogidos.

En conclusión, en cuanto a la estructura fina, sedescribieron las características de la interaccióncélula de Langerhans-Leishmania que se relacio-naron con cada una de las formas del parásitofagocitado, especialmente en lo que tiene quever con las diferencias morfológicas de la vacuolaparasitófora. Algunas de estas características sonsimilares a las descritas en macrófagos pero nohabían sido estudiadas en detalle en células deLangerhans infectadas con Leishmania. Hastaahora los pocos trabajos que muestran ultraestruc-turalmente la interacción célula de Langerhans-Leishmania, han empleado la microscopíaelectrónica sólo para documentar la infección.

Agradecimientos

A María Carlina Castillo por su asesoría en elanálisis estadístico.


Los autores manifiestan que no existe ningúnconflicto de intereses.

Financiación

Instituto Colombiano para el Desarrollo de laCiencia y la Tecnología - Colciencias (proyecto2104-04-10240), Banco Interamericano deDesarrollo, Instituto Nacional de Salud y FONACIT,Proyecto S1-2001000847.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):26-37CORTÁZAR T.M., HERNÁNDEZ J., ECHEVERRY M.C., CAMACHO M.

ARTÍCULO ORIGINAL

Papel de la vacuola parasitófora demacrófagos de ratón infectados por Leishmania amazonensis

en la adquisición de moléculasTania M. Cortázar 1,2, Joselín Hernández 1,2, María Clara Echeverry 1,3, Marcela Camacho 1,2

1 Laboratorio de Biofísica, Centro Internacional de Física, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C.,Colombia

2 Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C., Colombia.3 Laboratorio de Parasitología, Departamento de Salud Pública, Facultad de Medicina, Universidad Nacional

de Colombia, Bogotá, D.C., Colombia.

Introducción. Leishmania son parásitos intracelulares de macrófagos, confinados encompartimentos denominados vacuolas parasitóforas. La permeabilidad de este compartimentodepende de su interacción con el tráfico vesicular y transportadores presentes en su membrana.Objetivo. En este trabajo se estudió la permeabilidad de la membrana de la vacuola parasitóforaen la línea celular J774.A1 infectada con Leishmania amazonensis, in situ y en compartimentosaislados.Materiales y métodos. El aislamiento de vacuolas parasitóforas se hizo por gradiente dedensidad. La permeabilidad de la membrana de estas se valoró por distribución de sondasfluorescentes y electrofisiología. Para establecer indirectamente el transporte de protones seusó naranja de acridina. La presencia de transportadores ABC sensibles a probenecid seestableció con amarillo lucifer y calceína. Por primera vez con la técnica de patch-clamp seregistraron corrientes en la membrana de este compartimento aislado.Resultados. La vacuola parasitófora colorea de rojo con naranja de acridina indicando un pHácido. Concentra amarillo lucifer a través de un transportador sensible a probenecid, peroexcluye la sonda calceína. Vacuolas aisladas se marcan de rojo con naranja de acridina yconcentran amarillo lucifer a través de un transportador sensible a probenecid. Estas vacuolasexcluyeron calceína y presentaron en su membrana una corriente iónica que se activa adiferencias de potencial cercanas a 60 mV, con una conductancia de 46 ± 3 pS.Conclusiones. Se pueden aislar vacuolas parasitóforas con propiedades de permeabilidadque preservan mecanismos de transporte similares a los encontrados in situ. Se registra porprimera vez la presencia de una corriente iónica poco selectiva en la membrana de estecompartimiento.

Palabras clave: Leishmania, membranas intracelulares, permeabilidad, proteínas de transportede anión, transporte iónico, canales iónicos.

Role of the parasitophorous vacuole of murine macrophages infected with Leishmaniaamazonensis in molecule acquisition

Introduction. Leishmania are intracellular parasites of macrophages, confined into compartmentsknown as parasitophorous vacuoles. The permeability of this compartment depends on itsinteraction with the endocytic pathway and transport proteins present on its membrane.Objective. The membrane permeability of the parasitophorous vacuole was studied in J774.A1-macrophage like cells infected with Leishmania amazonensis, in situ and on isolatedcompartments.Materials and methods. The parasitophorous vacuoles were isolated by density gradients.Fluorescent probe distribution and electrophysiological recordings were used to determineparasitophorous vacuole membrane permeability. Proton transport was evaluated indirectly byacridine orange staining. Probenecid sensitive ABC transporters were detected using thefluorescent probes lucifer yellow and calcein. For the first time ion currents were recorded onthe membrane of isolated parasitophorous vacuoles using the patch clamp technique.


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Biomédica 2006;26(Supl.1):26-37 PERMEABILIDAD DE LA VACUOLA PARASITÓFORA DE LEISHMANIA

Results. The parasitophorous vacuole stains red with acridine orange indicating an acidiccompartment. It concentrates lucifer yellow by means of a probenecid sensitive transporter butexcludes calcein. Isolated vacuoles stained red with acridine orange and concentrated luciferyellow by means of a probenecid sensitive transporter. These vacuoles excluded calcein andshowed an ion current in their membrane which is activated at potentials close to 60 mV with amean conductance of 46 ± 3 pS.Conclusions. Isolated parasitophorous vacuoles with permeability properties preservingtransport mechanisms similar to those found in situ can be purified. A poorly selective ioncurrent on the parasitophorous vacuole membrane is reported for the first time.

Key words: Leishmania, intracellular membranes, permeability, anion transporter proteins,ion transport, ion channels.

Correspondencia:Marcela Camacho, Laboratorio de Biofísica, CentroInternacional de Física, Edificio de Programas Especiales“Manuel Ancízar”, Ciudad Universitaria, apartado aéreo 4948,Bogotá, D.C., Colombia.Telefax: (571) 368 1517, 369 0487 y 571 4286; fax: (571)368 [email protected] y [email protected]


Leishmania spp. son parásitos intracelularesobligatorios. Después de entrar al hospederomamífero, el parásito es fagocitado pormacrófagos y, posteriormente, confinado a uncompartimiento denominado vacuola parasitóforaque se caracteriza por ser ácido y rico enhidrolasas (1). Asumimos que para su super-vivencia el parásito depende de la interacción delas tres membranas concéntricas presentes: lamembrana plasmática del macrófago, lamembrana de la vacuola parasitófora y su mem-brana plasmática.

La permeabilidad de la vacuola parasitófora deLeishmania está determinada por la capacidad deeste compartimiento de interactuar con la víaendocítica y la expresión de transportadores ensu membrana. La membrana de la vacuolaparasitófora se fusiona con vesículas provenientesde la ruta endocítica desde la membranaplasmática y moléculas que entran por endocitosisde fase líquida, como el dextrán, o por endocitosismediada por receptores, como la albúmina, sesitúan con Leishmania (2). Además, la membranade la vacuola parasitófora se fusiona por la rutamediada por receptores de manosa-6-fosfato (2)y la de la autofagia (3). La evidencia de la expresiónde los transportadores en la membrana de lavacuola parasitófora está dada por el pH ácido de

su luz en donde el transporte de protones está acargo de una ATPasa vacuolar (4) y por laexpresión de transportadores aniónicos de lasuperfamilia de transportadores ABC (3,5).

En este estudio se indaga el papel de la mem-brana de la vacuola parasitófora que contieneLeishmania amazonensis en el transporte demoléculas entre el citoplasma de la célulahospedera y la luz de la vacuola parasitófora. Seconfirma evidencia previa que indica acumulaciónde protones y expresión de transportadores ABC.Se reporta un protocolo para el aislamiento de lavacuola parasitófora que permite mantener laspropiedades de permeabilidad estudiadas encompartimientos in situ, y se presentan, porprimera vez, registros electrofisiológicos sobre lamembrana de este compartimiento que muestranuna corriente iónica poco selectiva.


Parásitos

Se cultivaron promastigotes de L. amazonensis(FLA/BR/67/PH8), gentilmente donados por NancyGore Saravia, CIDEIM, Cali, Colombia, a 24ºC enmedio Schneider (Sigma) con suplemento de suerofetal bovino al 10%. Los parásitos se cultivaronhasta alcanzar su fase estacionaria (107) y seconcentraron para la infección o se diluyeron paramantener el cultivo.

Célula huésped

La línea de macrófagos peritoneales de ratónJ774.A1 ( EECACC Nº 91051511) se mantuvo enmonocapa al 80% de confluencia en cajas decultivo de 25 cm2 en medio de cultivo RPMI 1640(Sigma) con suplemento de suero fetal bovino al10% (Hyclone) a 37ºC y 5% de CO

2.

28


Infección y fagocitosis

Se expusieron las células J774.A1 apromastigotes de L. amazonensis en faseestacionaria o a partículas de látex de 3 µm dediámetro, en una proporción de 1 a 10 y semantuvieron a 35°C y 5% de CO

2 por 4 horas (6).

El excedente de parásitos o partículas de látexse removió por lavado con RPMI. Posteriormente,los cultivos se mantuvieron a 35°C y 5% de CO

2

hasta por 5 días después de la infección.

Aislamiento de vacuolas parasitóforasde L. amazonensis

En este estudio se partió de 5x106 macrófagos,con porcentajes de infección a las 48 horas de75,5±0,8% para aislar vacuolas parasitóforas (7).Este tiempo de infección se eligió por el volumende la vacuola parasitófora y el comportamientodurante la purificación. Tiempos menores deinfección mostraban vacuolas parasitóforas demenor tamaño pero mayor variabilidad lo quedificultaba la separación en una fracción y, luegode las 72 horas después de la infección, loscompartimientos aislados eran muy frágiles.

Para el aislamiento se siguió un procedimientomodificado a partir del descrito por Chakrabortyet al. (8). En éste se combina un choque osmóticoen una solución hipotónica con ruptura mecánicade la membrana plasmática del macrófago. Unavez que se lisan las células, el homogenizado sesepara en gradientes de densidad (8).

A las 48 horas después de la infección, seremovieron mecánicamente las células infectadascon L. amazonensis de la caja de cultivo en 2,5ml de medio de lisis, compuesto por 20mMHEPES, 0,5mM EGTA, 0,25M sacarosa, 0,1%gelatina (Sigma G-9382), pH 7, más una mezclade inhibidores de proteasas, así: ácidoetilendiamino tetraacético, sal de sodio (EDTA)0,5mM; etilen glicol bis(2-aminoetiléter)-N,N,N´,N´-ácido tetracético (EGTA) 0,5mM, trans-epoxisuccinil-L-leucilamido-(4-guanidino)-butano(E-64) 2 µM, N-α-p-tosil-L-lisina clorometilcetonaHCl (TLCK) 0,2µM, leupeptina 0,1mM y pepstatin0,1µM.

Una vez en el medio de lisis, las células infectadasfueron sometidas a ruptura mecánica por medio

de una jeringa con aguja calibre 27G en un tuboFalcon de 15 ml y sobre hielo durante 10 minutos.El procedimiento se controló por microscopía deluz hasta lograr el 90% de lisis celular.

Para remover células intactas y núcleos delhomogenizado, la suspensión se diluyó a 10 mlen solución tamponada de lisis y se centrifugó a50g por 10 minutos a 4°C. El sobrenadante sellevó a un gradiente discontinuo de sacarosa (8).Con este tipo de gradiente no fue posible separarcompartimentos que preservaran las caracterís-ticas de las vacuolas parasitóforas. Por lo tanto,se modificó así: un colchón inferior de 60% desacarosa, más colchones de 1 ml de Percoll(partículas coloidales de sílica cubiertas conpolivinilpirrolidona) en concentraciones variablesen una solución (en mM) de 145 de NaCl, 5 deKCl y 10 de HEPES. Este gradiente se centrifugóa 3.500g por 25 minutos a 4°C (7).

Las fracciones recolectadas se visualizaron pormicroscopía de luz y aquéllas en las que seubicaron vacuolas que contenían parásitos, selavaron en una solución (en mM) 145 NaCl, 5 KCl,10 HEPES y 2 MgCl

2, pH 7,34 (KOH 1N)-310

mOsm y se concentraron por centrifugación a2.000g por 10 minutos. El sedimento con 0,5-1x103

compartimientos aislados se resuspendiósuavemente en diferentes soluciones dependiendodel experimento que se iba a realizar.

Microscopía de los compartimentos aislados

Para determinar la naturaleza del compartimientoaislado se realizaron inicialmente observacionesmorfológicas con microscopía de luz siguiendolos criterios descritos por Lang para vacuolasparasitóforas de Leishmania (9): espaciodelimitado por una membrana, con un diámetroentre 10 y 20 µm, con parásitos en su interior,generalmente, polarizados hacia la membrana delcompartimiento.

Una aproximación al pH de los compartimentos yla detección de ácidos nucleicos parasitarios ensu interior se hizo mediante la sondametacromática naranja de acridina enconcentraciones entre 4 y 8 µM incubando loscompartimentos aislados en los diferentesgradientes, durante 15 minutos en la oscuridad.

29


Simultáneamente, se incubaron células infectadasen las mismas condiciones. La marcación de loscompartimentos vesiculares purificados en cadauno de los gradientes se visualizó en microscopiode fluorescencia con un juego de filtros 480 nm/520 nm.

Actividad enzimática en los compartimentosaislados

La actividad de β-glucoronidasa, enzimalisosómica, se determinó mediante la incubaciónde los productos aislados de los diferentesgradientes, en 0,1M de acetato de sodio, pH 4,4y 0,25% Tritón X-100, y usando como sustrato1mM de 4-metillimbreliferil-2-acetamido-2-deoxi-β-D-glucopitanósido. La reacción se determinó porespectrofotometría a 448 nm.

Carga de sondas fluorescentes dentro delcitoplasma de células J774.1

Se expusieron células J744.A1 (control, expuestasa partículas de látex o infectadas) adheridas alaminillas de vidrio por 24 horas a dos sondasaniónicas fluorescentes de diferente tamaño comose describe a continuación. Antes de lasobservaciones, bajo microscopía de luz en unmicroscopio invertido Zeiss IM-35, las células selavaron tres veces con medio RPMI. La adquisiciónde imágenes se llevó a cabo con una videocámaraCCD modelo IC-100 acoplada al microscopio ycon el programa AIW 2.2. También se tomaronfotografías con cámara fotográfica Canon EOS3000 QD.

Amarillo lucifer (521 da). Las células se expusierona esta sonda, la cual absorbe a 427 nm y emite a535 nm (Sigma), a una concentración de 0,5 mg/ml, más ATP 5mM y ácido plurónico 5µM en RPMI,durante 5 minutos. La marcación fluorescente sedetectó usando un juego de filtros de 480 nm/520nm; se realizaron observaciones a los 5, 10, 30 y60 minutos después de la carga. También serealizó la carga de amarillo lucifer en las mismascondiciones y en presencia de 5mM deprobenecid, un inhibidor de transportadores ABC.

Calceína/AM (995 da). Las células se expusierona esta sonda, la cual absorbe a 494 nm y emite a517 nm (Molecular probes, Eugene, Oregon), auna concentración de 25-40µM en RPMI durante

5 minutos. La fluorescencia se evidenció usandoun juego de filtros de 480 nm/520 nm; se realizaronobservaciones a los 5, 10, 30 y 60 minutosdespués de la carga.

Carga de sondas fluorescentesen vacuolas parasitóforas aisladas

Las vacuolas parasitóforas aisladas en unasolución (en mM) de 140 K glutamato, 2 KCl, 5EGTA-K, 0,5 CaCl

2, 4 MgCl

2, 10 HEPES-K, 3 ATP-

Na2, 0,5 GTP-Na (pH 7,34, 300mOsm), para

mantener condiciones iónicas similares a las delcitoplasma, se cargaron con naranja de acridinapara verificar el pH, y con amarillo lucifer paraverificar su viabilidad (3). Así mismo, se cargaroncon calceína (25µM), se incubaron con la sondadurante 5 minutos a 35°C y 5% CO

2, y se lavaron

una vez.

Calceína sal de potasio (622,5 da). Las célulasse inyectaron con 25µM de esta sonda disueltaen una solución cuya composición era (en mM)de 145 NaCl, 5 KCL, 1 CaCl

2, 2 MgCl

2, 10 HEPES-

Na, 5 glucosa, pH 7,2, 300 mOsm, mediantemicropipetas hechas de capilares de hematocritono heparinizados (Fisher Scientific No. 02-668-6)cuyas resistencias variaron entre 3-5MΩ y usandola configuración de célula entera de la técnica deelectrofisiología patch clamp (10). En otraspalabras, antes de perforar la membrana de lavacuola parasitófora se obtuvo un sello de altaresistencia entre la membrana de la vacuolaparasitófora y la micropipeta de vidrio. Una vezalcanzada una resistencia superior a 1GΩ, seaplicó presión negativa sobre la membrana hastalograr la ruptura controlada de ésta, al tiempo quese obtenía registro visual en fluorescencia con lacámara digital y el programa Axon Imaging Work-bench 2.2.

Registros electrofisiológicos

Las técnicas de electrofisiología se usan para ladetección de las propiedades eléctricas de lamembrana tales como potenciales de membranay corrientes iónicas. El montaje para el registrode estas propiedades constó de un amplificadorAxopatch 1-C (Axon Instruments, Foster City, CA).Los pulsos de voltaje generados y las corrientesobtenidas, se digitalizaron con una interfase

30


análogo-digital, Digidata 1200 (Axon Instruments,Foster City, CA). Las señales se filtraron yalmacenaron en una computadora compatible conIBM.

Para la generación de los potenciales y laobtención de los registros, se utilizó el paquetede programa electrofisiológico Pclamp6. Utilizandola configuración de vacuola adherida similar a lade célula adherida de la técnica de patch clamp(10), se hicieron registros en vacuolasparasitóforas aisladas suspendidas en unasolución (en mM) de 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl

2, 10

HEPES. En esta configuración se acerca la puntade una micropipeta de vidrio a la membrana de lavacuola parasitófora y ejerciendo presión negativase genera un sello de alta resistencia (>1GΩ). Deesta manera, se pueden registrar los canalesiónicos presentes en la porción de membrana quequeda en la luz de la micropipeta.

Las micropipetas de registro se hicieron concapilares de borosilicato cuyas resistenciasvariaron entre 3 y 5 MΩ en una solución (en mM)de 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl

2, 10 HEPES, 15

EGTA, tratando de conseguir condiciones electro-químicamente simétricas y potenciales dereversión cercanos a 0 para los iones másimportantes. Los registros se analizaron con elprograma Pclamp6 (Axon Instruments) y segraficaron con el programa Origin 7SR (OriginLagCorporation, Northampton, MA, USA).

Resultados

Permeabilidad de la vacuola parasitófora alos protones

La estructura de la sonda naranja de acridina haceque esta pueda pasar fácilmente a través de lasmembranas. Por lo tanto, permea la membranadel macrófago y al entrar en el núcleo se intercala

Figura 1. Permeabilidad a protones medida por distribución de la sonda fluorescente naranja de acridina. Células J774.A1control, luego de fagocitosis de partículas de látex, infectadas por Leishmania amazonensis, o vacuolas parasitóforasaisladas, se cargaron con naranja de acridina a una concentración de 4-8 µg/ml y se observaron por microscopía defluorescencia. A. Macrófago control, microscopía de luz. B. Macrófago control, después de la carga de la sonda. C.Macrófagos luego de la fagocitosis de partículas de látex, microscopia de luz. D. Macrófagos luego de la fagocitosis departículas de látex, después de la carga de la sonda. E. Macrófagos infectados por L. amazonensis 48 horas después dela infección, microscopia de luz. F. Macrófagos infectados por L. amazonensis 48 horas después de la infección, despuésde la carga de la sonda. G. Vacuola parasitófora aislada, microscopía de luz. H. Vacuola parasitófora después de la cargade la sonda. Los datos son experimentos representativos de 10.Barra en A-F: 8 µm; en G-H: 5 µm; vp: vacuola parasitófora; flechas: parásitos. Nótese que la coloración verde es lamarcación de ácidos nucleicos y la roja indica compartimientos con pH ácido.

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entre los ácidos nucleicos emitiendo unafluorescencia verde. Sin embargo, al pasar acompartimientos ricos en H+ como la vacuolaparasitófora, adquiere carga neta positiva, sumovilidad disminuye y su espectro de emisióncambia emitiendo en el rango del rojo. Estamarcación, indirectamente, sugiere la presenciade mecanismos que median el transporte deprotones y generan un gradiente de este ion conrespecto al citoplasma del macrófago.

En la figura 1 se observa un macrófago control(figura 1A) en donde la coloración verdecorresponde al núcleo y el punteado rojo acompartimentos de la vía endocítica cuyo pH esácido (figura 1B). Los macrófagos que fagocitaron

látex o fueron infectados por Leishmania sepueden identificar por la presencia de partículas(figura 1C) o vacuolas de gran volumen conparásitos de tamaño similar a las partículas delátex en su interior. Las partículas de látex y Leish-mania se ubican en compartimentos, fagosomas(figura 1D) y vacuolas parasitóforas (figuras 1E-1H), respectivamente, cuyo pH es ácido lo quese evidencia por la coloración roja obtenida luegode la marcación con naranja de acridina.

Permeabilidad mediada por transportadores enla membrana de la vacuola parasitófora

Se cargaron células J744.A1 control, expuestasa partículas de látex o infectadas con L.amazonensis, con las sondas amarillo lucifer y

Figura 2. Permeabilidad de la vacuola parasitófora a través de trasportadores ABC determinada por distribución de la sondafluorescente amarillo lucifer. Células J774.A1 control (A-C), vacuolas parasitóforas aisladas (D-F), células infectadas por L.amazonensis (G-L) o luego de fagocitosis de partículas de látex (M-R), se cargaron con amarillo lucifer a una concentraciónde 0,5 mg/ml y se observaron por microscopía de fluorescencia. A. Macrófago control, microscopía de luz. B. Macrófagocontrol, 5 minutos y C. Macrófago control, 20 minutos después de la carga de la sonda. D. Vacuolas parasitóforas aisladas,microscopía de luz. E. Vacuolas parasitóforas, 15 minutos después de la carga y F. Vacuolas parasitóforas, 15 minutosdespués de la carga de la sonda en presencia de 5µM de probenecid. G. Macrófagos infectados por L. amazonensis, 48horas después de la infección, microscopía de luz. H. Macrófagos infectados por L. amazonensis, 48 horas después de lainfección, 10 minutos después de la carga de la sonda. I. Macrófagos infectados por L. amazonensis, 48 horas después dela infección, microscopía de luz. J. Macrófagos infectados por L. amazonensis, 48 horas después de la infección, 30minutos después de la carga. K. Macrófagos infectados por L. amazonensis, 48 horas después de la infección, microscopíade luz y L. 30 minutos después de la carga de la sonda en presencia de 5µM de probenecid. M. Macrófago luego de lafagocitosis de partículas de látex, microscopia de luz. N. Macrófagos luego de fagocitosis de partículas de látex, 10 minutosdespués de la carga. O. Macrófago luego de la fagocitosis de partículas de látex, microscopia de luz. P. Macrófago luegode la fagocitosis de partículas de látex, 30 minutos después de la carga. Q. Macrófago luego de la fagocitosis de partículasde látex, microscopía de luz. R. Macrófago luego de la fagocitosis de partículas de látex, 30 minutos después de la cargaen presencia de de 5µM de probenecid. Los datos son experimentos representativos de 10 experimentos.Barra: en D-F, 5 µm y 8 µm para las demás imágenes; vp: vacuola parasitófora; flechas: parásitos.

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calceína. Se tuvo en cuenta la distribución de lasonda en el citoplasma y, en el caso demacrófagos que fagocitaron látex o fueroninfectados, se observó la concentración oexclusión de las sondas en la luz del fagosoma ode la vacuola parasitófora, respectivamente.

La sonda amarillo lucifer no atraviesa la mem-brana celular; por ello fue necesario cargarlapermeabilizando la membrana plasmática delmacrófago con ATP (11). En los macrófagos con-trol (figura 2A), se observó el amarillo luciferdistribuido de manera uniforme por todo elcitoplasma a los 5 minutos después de la carga(figura 2B). Luego, entre los 10 y los 45 minutosdespués de la carga, la sonda se concentró encompartimientos citoplasmáticos o fue liberadaal medio extracelular (figura 2C).

La permeabilidad de la vacuola parasitófora deLeishmania (figuras 2D, 2E, 2F) no presentódiferencias con el patrón observado en losmacrófagos control, aunque fue un procesorelativamente más lento. En las células

infectadas, a los 10 minutos después de la carga,el amarillo lucifer se observó en el citoplasma yen el núcleo, pero fue excluida de la vacuolaparasitófora (figuras 2G, 2H). Después de 30minutos de la carga, la sonda se encontró en lasvacuolas parasitóforas y en pequeñas vesículascitoplasmáticas pero no en el citoplasma (figuras2I, 2J).

El inhibidor probenecid bloqueó la transferenciade amarillo lucifer a la luz de la vacuolaparasitófora (figuras 2F, 2K, 2L). La distribuciónde amarillo lucifer en fagosomas de partículas delátex fue similar a los controles (figuras 2M-2P).La concentración de la sonda en el fagosoma sepuede atribuir a un transportador ABC porque lapresencia de probenecid, un inhibidor de estegrupo de moléculas, evita esta distribución (figuras2Q, 2R).

Por encontrarse en su forma acetoximetil éster,la calceína/AM permea fácilmente las membranascelulares interactuando con los lípidos de lamembrana. En este estado, la sonda no es

Figura 3. Permeabilidad de la vacuola parasitófora a través de trasportadores ABC determinada por distribución de la sondafluorescente calceína. Células J774.A1 control, luego de fagocitosis de partículas de látex, infectadas por L. amazonensis,o vacuolas parasitóforas aisladas se cargaron con calceína a una concentración de 25µM y se observaron por microscopíade fluorescencia. A. Macrófago control, microscopía de luz. B. Macrófago control, después de la carga de la sonda. C.Macrófagos luego de la fagocitosis de partículas de látex, microscopia de luz. D. Macrófagos luego de fagocitosis departículas de látex después de la carga de la sonda. E. Macrófagos infectados por L. amazonensis 48 horas después de lainfección, microscopia de luz. F. Macrófagos infectados por L. amazonensis 48 horas postinfección, después de la cargade la sonda. G. e I. Vacuolas parasitóforas aisladas, microscopía de luz. H. Vacuolas parasitóforas aisladas, después dela carga de la sonda. J. Vacuolas parasitóforas aisladas, después de la inyección de la sonda con pipeta de vidrio. Los datosson experimentos representativos de 10 experimentos.Barra en A-F: 8 µm, en G-H, 5 µm y en I y J 6 µm; vp: vacuola parasitófora; flechas: parásitos

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fluorescente; una vez ingresa en el citoplasma,los grupos éster son cortados por esterasas y lasonda pasa a su forma fluorescente. Por estemecanismo la calceína puede ser usada paradeterminar la viabilidad celular.

En los macrófagos control (figura 3A), entre los 5y los 60 minutos después de la carga, la calceínase distribuye por todo el citoplasma de manerauniforme y no es liberada al medio exterior (figura3B). En las células que fagocitaron látex (figura3C), la sonda se observó por todo el citoplasma,pero fue excluida del fagosoma (figura 3D). De lamisma manera, en macrófagos infectados (figura3E), las vacuolas parasitóforas excluyeron porcompleto la sonda en todos los tiempos despuésde la infección (figuras 3F, 3G, 3H), lo cual sugiereque no existe ningún mecanismo de transportede calceína hacia el exterior del macrófago, laluz del fagosoma o de la vacuola parasitófora.

Permeabilidad de lavacuola parasitófora aislada

El aislamiento de vacuolas parasitóforas sellevó a cabo siguiendo el método recomendadopor Chakraborty et al. (8) y usado por Schaible etal. (3), para Leishmania mexicana. La separaciónse siguió por microscopía de luz y enriquecimientode la actividad de la enzima β-glucoronidasa,un marcador lisosómico. En las fracciones

Figura 4. Permeabilidad de la VP mediada por corrientes iónicas.VP aisladas fueron registradas con la técnica de patch-clamp en configuración de VP-adherida. A. Curva de corrientecontra tiempo de un registro obtenido luego de la aplicación de una rampa de voltaje desde 60 hasta -60 mV desde unpotencial de sostenimiento de 0 mV. B. Curva IV de donde se observa potencial de reversión de 1,6 mV. Los datos sonexperimentos representativos de 7 VP registradas. El potencial de reversión se relaciona con el potencial de equilibrio delos iones que pasan a través de la corriente detectada.

separadas, las vacuolas parasitóforas seidentificaron por su tamaño, apariencia de lamembrana y presencia de amastigotes. Se definiócomo vacuolas parasitóforas a toda estructura condiámetro alrededor de 10 µm y con parásitos ensu interior, adosados a la membrana delcompartimento.

Debido a que las vacuolas parasitóforas aisladascon esta metodología presentaban morfologíaanormal y alteraciones de las propiedades depermeabilidad de su membrana que atribuimos alefecto osmolar ejercido por la sacarosa, sesustituyó parte de la sacarosa por un gradientediscontinuo de Percoll, así: un colchón inferior de60% de sacarosa y colchones de 1 ml de Percollque variaron de la siguiente manera: 40-30-15. Lasvacuolas parasitóforas aisladas se encontraronen la interfase entre los colchones de 10% y 20%de Percoll, fracciones en las cuales se acumulóel 41% (22% y 19%, respectivamente) de laactividad de β-glucoronidasa. Los datosreportados a continuación se hicieron en vacuolasparasitóforas aisladas utilizando el gradiente dePercoll de 40-20-10%.

La vacuola parasitófora in situ, colorea de rojocon la sonda naranja de acridina lo cual indica lapresencia de un pH ácido. Este gradiente de pHse mantiene aún después del aislamiento de

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vacuolas parasitóforas (figura 1H) lo que sugiereque la membrana de la vacuola parasitófora nopresenta alteraciones importantes de permeabilidadque lo disipen. En la figura 1H la marcación verdeen el cuadrante inferior izquierdo de la vacuolaparasitófora indica la marcación de ácidosnucleicos y sugiere la presencia de Leishmania.Como se describió para las vacuola parasitóforain situ, el amarillo lucifer se concentró en la vacuolaparasitófora (figura 2E) y este proceso fue mediadopor un transportador ABC ya que la presencia delinhibidor probenecid evitó el transporte de la sondala luz de la vacuola parasitófora (figura 2F). Lapresencia del gradiente de protones y el transportede amarillo lucifer sugiere, además, que lasvacuolas parasitóforas aisladas son capaces demantener procesos dependientes de la hidrólisisde ATP.

El transporte de la sonda calceína también fuerestringido por vacuolas parasitóforas aisladas(figura 3H) y la exclusión no es debida aalteraciones en la capacidad de emisión de lasonda en un compartimento ácido, ya que esposible visualizarla luego de su inyección directa(figuras 3I, 3J).

Detección de corrientes iónicas envacuolas parasitóforas aisladas

Las técnicas electrofisiológicas se usan para lacaracterización de las propiedades eléctricas dela membrana. El uso de esta técnica enmembranas de compartimientos intracelulares esescaso. Los estudios aquí reportados se hicieronsobre grupos de vacuolas parasitóforasprovenientes de aislamientos en los que se habíahecho verificación de la presencia del parásito porobservación en microscopía y en los que lasmarcaciones con naranja de acridina y amarillolucifer eran satisfactorios.

Usando la técnica de patch clamp (10) en laconfiguración de vacuola parasitófora adherida yen soluciones con concentraciones iónicassimétricas se lograron sellos de alta resistencia(>1 GΩ). Estos sellos fueron de difícil obtenciónpor las dificultades para inmovilizar las vacuolasparasitóforas y la fragilidad de este comparti-mento. No se lograron registros en la configuraciónde vacuola parasitófora completa. Por lo tanto,

los datos presentados corresponden a vacuolasparasitóforas en configuración de vacuolaparasitófora adherida, en las que se registran lascorrientes a través de los canales iónicospresentes en la zona de la membrana en dondese ubica la pipeta de registro, y provenientes de 7vacuolas parasitóforas.

Las vacuolas parasitóforas se estimularon conrampas de potencial desde 60 hasta -60 mV quese usan para detectar todas las corrientes iónicaspresentes. Las corrientes observadas sefavorecen a diferencias de potencial de 55±1,5mV (figura 4A) en la que se observa una deflexiónque corresponde a la apertura y cierre de lacorriente registrada. El promedio de corrientecuando se observaron aperturas fue de 2,5±0,3pA (n=20) y la conductancia calculada fue de 46±3pS (n=20). La curva IV que relaciona la corrientecon el voltaje que la activa, muestra que elpotencial de reversión, potencial al cual la corrienteneta es igual a 0 y que al relacionarse con elpotencial de equilibrio para los iones presentesindica cuál es el ión que permea, es cercano a 0lo que sugiere poca selectividad (figura 4B).

Discusión

La vacuola parasitófora que contiene a Leishma-nia parece satisfacer los requerimientosnutricionales del parásito y soporta su crecimientoy replicación. Los datos obtenidos durante elpresente estudio sugieren que las vacuolasparasitóforas de Leishmania amazonensis puedentransportar iones desde el citosol de la célulahospedera.

El secuestro de la sonda amarillo lucifer (521 da)en la luz de la vacuola parasitófora de L. mexicanase ha atribuido a la presencia de transportadoresde aniones de la familia de glicoproteínastransportadoras ABC en la membrana de dichoorganelo (2,3) y confirmada en las vacuolasparasitóforas de L. amazonensis en el presenteestudio (figuras 2F, 2L). Representantes de la fa-milia de transportadores ABC o Pgp son capacesde transportar un rango de sustratos heterogéneo.Se ha descrito el transporte de carboxifluoresceína(376 da) hacia el interior de vacuolas citosólicas yhacia el medio extracelular en macrófagosperitoneales de ratón, y atribuido a la presencia

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de transportadores ABC sensibles a probenecid,incluidos en la membrana celular y vacuolar (12).

Este tipo de transportadores expresados en lamembrana de macrófagos de ratón puedensecretar antibióticos como penicilina G (546 da) ynorfloxacina (320 da) (13,14) y su inhibicióndisminuye la producción de IL-12, y la regulaciónde moléculas MHC II (15). Se encuentran,además, en células tumorales humanas (16) y enLeishmania (17), están implicados en el transportede aniones orgánicos como urato y p-aminohipurato(16) y en el transporte de tioles y metales (17).

Muchas moléculas sintetizadas por losmacrófagos son empacadas en vesículas yliberadas luego de la fusión de éstas con la mem-brana plasmática. Transportadores como los aquíreportados podrían estar mediando la transferenciade moléculas aniónicas, cuyos pesos molecularesoscilan entre 350 y 600 da, de cuya vía secretorano se conoce nada. Entre estas moléculasaniónicas se encuentran leucotrienos yprostaglandinas que juegan un papel importanteen las respuestas inmune e inflamatoria, glutatión,bilirrubina y lactato producido durante la glucólisis(18). Los transportadores de aniones podríanfuncionar como sistema de concentración depequeños productos orgánicos, péptidos y toxinas,para ser exportados de la célula vía exocitosis.

La exclusión de una molécula del tamaño de lacalceína de fagosomas de partículas de látex yde vacuolas parasitóforas de L. amazonensis seobservó por primera vez en el presente estudio.En el citoplasma, la calceína/AM se convierte enun derivado polianiónico de la fluoresceína, el cualemite fluorescencia al perder sus grupos éster porla acción de esterasas inespecíficas. La pérdidade los grupos éster hace que la molécula pierdamovilidad a través de membranas, quedandoatrapada en el citosol. Podría ser concentrada enla luz de los fagosomas y vacuolas parasitóforas,pero los trasportadores presentes (figuras 2J, 2P,3D, 3F) no permiten su paso, probablemente, porel tamaño.

Así mismo, las sondas fluorescentes fluo-3 (781da) y fura-2 (832 y 880 da) no se equilibran entreel citoplasma y la vacuola parasitófora demacrófagos infectados con L. amazonensis (19),

pero se ha observado que fura-2 marca otroscompartimentos endosómicos (6,19,20).

La vacuola parasitófora de Chlamydia trachomatisexcluye la calceína (21) y en fibroblastosinfectados con Toxoplasma gondii, los péptidosy las moléculas de más de 1.900 da no cruzan lamembrana de la vacuola parasitófora (22). Estonos permite especular que los fagosomas departículas de látex y las vacuolas parasitóforasde L. amazonensis no interactúan con algunoscompartimentos endosómicos excluyendo en esteproceso la expresión de trasportadores aniónicoscomo los que concentran fluo y fura-2.

Los estudios presentados en vacuolasparasitóforas aisladas confirman los hallazgos insitu y la evidencia previa (2,3). Sin embargo, estees el primer estudio en el que se presentaevidencia microscópica de luz de vacuolasparasitóforas aisladas demostrando algunas desus propiedades de permeabilidad, aunque Kimay Dunn (23) muestran la ultraestructura devacuolas parasitóforas purificadas usando elmarcador calnexín. Sugerimos que lasmodificaciones hechas en el proceso depurificación de este compartimento, es decir, elreemplazo por un gradiente de Percoll, mejoran elaislamiento de las vacuolas parasitóforas.

Este estudio, además, reporta por primera vezdatos electrofisiológicos obtenidos de vacuolasparasitóforas aisladas. Estudios previos con estatécnica en eritrocitos infectados con Plasmodiumfalciparum (24), registran una conductancia aaniones, aunque no queda claro si los registrosse obtuvieron de la membrana del eritrocito o dela vacuola parasitófora que contiene Plasmodium.A pesar de esto, existe evidencia que argumentaa favor de cambios en la permeabilidad deleritrocito por modificación de canales iónicosconstitutivos de su membrana (25,26) y porexpresión de transportadores de origen parasitario(26,27).

La conductancia calculada a partir de la corrienteregistrada en la membrana de la vacuolaparasitófora aislada (figura 4) podría ser elresultado de la expresión de un transportador ABC,canales iónicos del retículo endoplasmático delmacrófago o porinas. La presencia de trans-

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portadores ABC ha sido documentada encompartimentos de la vía endocítica demacrófagos control e infectados y en la membranade la vacuola parasitófora (2,3) (figuras 2F, 2L,2R). La evidencia reciente que sugiere que lamembrana del retículo endoplasmático (28) esincorporada para la formación de fagosomas, abrela posibilidad que los canales de calciodependientes de ligando y voltaje, presentes enla membrana de este compartimento (18), puedanestar asociados con la membrana de la vacuolaparasitófora.

En cuanto a la presencia de porinas se sabe quelos protozoarios Trypanosoma cruzi y Entamoebahistolytica (29,30), expresan proteínas concaracterísticas similares a estas moléculas. Másaún, los promastigotes de L. amazonensiscontienen una hemolisina capaz de causar lisiscoloidosmótica de eritrocitos, y extractos de esteparásito que contienen esta actividad reaccionancon anticuerpos contra perforina y C9 mostrandoque Leishmania también sintetiza porinas. Noronhaet al. sugieren que esta porina estaría mediandola salida de Leishmania del macrófago (31).

Nuestros hallazgos electrofisiológicos no nospermiten determinar el tipo de molécula que gen-era la corriente registrada y su significadofisiológico. Sin embargo, la expresión de porinaspuede ser un mecanismo de entrada de iones ynutrientes a través de la membrana de la vacuolaparasitófora como se ha sugerido para otrosparásitos (22,24), parte del proceso de salida delparásito (32) o servir en la exclusión de péptidosdel parásito limitando así presentación deantígeno.

Los estudios futuros incluyen la caracterizaciónelectrofisiológica de la corriente descrita en lamembrana de la vacuola parasitófora, ladeterminación de su origen y su función. Lostrabajos de los mecanismos de adquisición demoléculas por la vacuola parasitófora contribuiránal entendimiento de la nutrición, la supervivenciay el desarrollo del parásito en infecciones in vitroe in vivo. Más aún, la investigación del transportede fármacos a través de la vacuola parasitóforaque contiene a Leishmania podría ser de granvalor, por ser este compartimento un sitio blancopara la quimioterapia.

Agradecimientos

Agradecemos a las entidades que financiaron estetrabajo, al Departamento de Biología de laFacultad de Ciencias de la Universidad Nacionalde Colombia, sede Bogotá, y al CentroInternacional de Física de Bogotá, Colombia.


Los autores de este manuscrito garantizamos queno tenemos conflicto de intereses.

Financiación

Este trabajo fue financiado por: Colciencias,proyecto: 2228-04-12899, Programa Nacional deCiencia y Tecnología de la Salud; División deInvestigaciones, proyecto: 903835, UniversidadNacional de Colombia; Joselín Hernández recibióapoyo de la DINAIN (División Nacional deInvestigaciones, Universidad Nacional deColombia), programa apoyo a estudiantes:DI00C352.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):49-56 PHOTODYNAMIC ACTIVITY OF PHTHALOCYANINES IN LEISHMANIA

ARTÍCULO ORIGINAL

Photodynamic activity of aluminium (III) and zinc (II)phthalocyanines in Leishmania promastigotes

Patricia Escobar 1, Indira P. Hernández 1, Cesar M. Rueda 1, Fernando Martínez 2, Edgar Páez 2

1 Centro de Investigación de Enfermedades Tropicales (CINTROP), Facultad de Salud, Escuela de Medicina,Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga, Colombia.

2 Centro de Investigaciones en Catálisis (CICAT), Escuela de Química, Universidad Industrial de Santander,Bucaramanga, Colombia.

Introduction. Photodynamic therapy is a two-step procedure, involving the use ofphotosensitizing agents followed by selective illumination of the target lesion with visible light.It produces highly reactive oxygen species and subsequent cellular damage.Objective. This study was designed to determine whether Leishmania chagasi and L.panamensis promastigotes were sensitive to photodynamic therapy in vitro.Material and methods. Leishmania promastigotes were treated with aluminium phthalocyaninechloride and zinc phthalocyanine photosensitizers before illumination with visible light at 670nm. The parasite photoactivity was calculated by sigmoidal regression analysis.Results. Leishmania chagasi promastigotes were highly photosensitive to aluminiumphthalocyanine chloride treatment with effective inhibitory dose50 (ED50) concentration values of0.0033, 0.0083 and 0.0093 µM upon exposure to 10.0, 5.0, and 2.5 J/cm2 light intensitiesrespectively. By contrast, the activity of aluminium phthalocyanine chloride on L. panamensiswas significantly lower (P<0.01) with ED50 values of 0.17, 0.25, 0.34 µM at the same lightintensities. Zinc phthalocyanine activity was significantly (P<0.01) less active than aluminiumphthalocyanine chloride on both strains of these two species and no differences in zincphthalocyanine activity were found between them. A dose-response phototoxic effect with bothphthalocyanines was observed. Parasite inhibition was not observed after aluminiumphthalocyanine chloride or zinc phthalocyanine treatment in the dark. The reference drugshexadecylphosphocholine and amphotericin B were not photoactive.Conclusion. Treatment of Leishmania promastigotes with aluminium phthalocyanine chlorideand zinc phthalocyanine followed by illumination with visible light at 670 nm inhibited in vitrogrowth of promastigotes of L. chagasi and L. panamensis. Photodynamic therapy againstLeishmania could be a promising strategy for leishmaniasis treatment.

Key words : Leishmania, photochemotherapy, drug therapy, in vitro.

Actividad fotodinámica de ftalocianina de aluminio (iii) y zinc (ii) en promastigotes deLeishmania

Introducción. La terapia fotodinámica es un procedimiento en dos pasos que usa un agentefotosensibilizador y luz visible produciendo radicales de oxígeno altamente reactivos originandodaño celular.Objetivo. En este estudio se determinó la fotosusceptibilidad de promastigotes de dos cepasde las especies Leishmania chagasi y L. panamensis a la terapia fotodinámica in vitro.Materiales y métodos. Promastigotes de Leishmania fueron tratados con ftalocianina dealuminio clorada o ftalocianina de zinc antes de la irradiación con luz visible a 670 nm. Lafotoactividad fue calculada por regresión sigmoidea.Resultados. Los promastigotes de L. chagasi fueron altamente fotosensibles al tratamientocon ftalocianina de aluminio clorada con valores de concentraciones inhibitorias50 de 0,0033,0,0083 y 0,0093 µM utilizando una intensidad de luz de 10,0, 5,0 y 2,5 J/cm2 respectivamente.La actividad de la ftalocianina de aluminio clorada en promastigotes de la cepa de L.panamensis fue significativamente menor (P<0,01) que en la cepa L. chagasi con valores de

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ED50 de 0,17, 0,25, 0,34 µM respectivamente. El tratamiento con ftalocianina de zinc fuesignificativamente menos fotoactivo (P<0,01) en ambas especies sin diferencia significativaen la actividad entre ellas. El efecto fototóxico inducido por las ftalocianinas fue dependientede la dosis utilizada. No se presentó fototoxicidad en condiciones de oscuridad. Losmedicamentos de referencia hexadecilfosfocolina y anfotericina B no fueron fotoactivos.Conclusión. El tratamiento de promastigotes de Leishmania con ftalocianinas seguido de lairradiación con luz visible a 670 nm inhibió el crecimiento in vitro de promastigotes de L.chagasi y L. panamensis. La terapia fotodinámica contra la Leishmania podría ser una estrategiapromisoria en el tratamiento de leishmaniasis.

Palabras clave : Leishmania, fotoquimioterapia, quimioterapia, in vitro.

The leishmaniases are a group of diseases causedby trypanosomatid protozoa of the genusLeishmania transmitted to humans by the bite ofan infected sandfly. Leishmaniasis occurs inapproximately 88 countries in the New and OldWorld where 350 million individuals are exposed,12 million are infected and 1.5 to 2 million newcases of cutaneous leishmaniasis and half a millionof visceral leishmaniasis are reported annually (1).

Since the 1940s, pentavalent antimonial (SbV)drugs have been the treatment of choice for allforms of human leishmaniasis. Other drugs suchas amphotericin B, pentamidine isothionate andaminosidine (paromomycin) constitute the tradi-tional alternatives to SbV for leishmaniasis treat-ment (2). However, currently available drugs re-quire parenteral administration, many vary in effi-cacy and are toxic and expensive. Moreover, re-sistance to the most widely used antileishmanialdrugs has been reported (3). The process of drugdiscovery in leishmaniasis is difficult due to thebiological characteristics of the parasite and tothe lack of economical incentives for pharma-ceutical companies to invest in the developmentof new treatments. Fortunately, the currentsituation is more promising than it has been forseveral years. The duration of treatment has beenreduced, oral instead of parenteral administrationis now available, and new drugs, formulations ordosage regimens of old drugs with less toxicityare also on clinical trials (4-6).

Photodynamic therapy is a two-step procedure thatuses a combination of photosensitizer agents andvisible light in the presence of molecular oxygento obtain a therapeutic effect (7). It has been usedas an alternative procedure for detection and treat-ment of cancer and other skin illnesses like pso-riasis and vitiligo (8). Photodynamic therapy hasbeen used to eliminate in vitro microorganismssuch as bacteria, yeasts, viruses and parasitesand successfully in disinfection of blood products.In addition, it has become a potential low costtreatment for local skin infections (9-12).

Photosensitizer agents such as phenothiazinedyes, porphyrins and phthalocyanines containmacrocyclic structures with accessible sites fortriplet excited states under visible light radiation.They have the ability to accumulate in unhealthytissues and cells exhibiting little or no toxicity;however, after light illumination in the presence ofmolecular oxygen, they are excited and a lethaleffect on infected tissues is induced.Photooxidation reactions are produced by radicalintermediates subsequently scavenged by oxygenor by the generation of the highly cytotoxicmonovalent oxygen (O.-) after energy transfer fromthe photoexcited sensitizer (8,13,14).

Phthalocyanines (figure 1) are a new generationof photosensitizer agents for photodynamictherapy (15-17). These compounds are good can-didates for photodynamic therapy because theyare efficiently incorporated into target cells, arenon-toxic for healthy cells, exhibit high yield oftriplet states generation, and induce an optimallight tissue penetration by their high absorbancecoefficients at 650-680 nm (18,19). Thephotophysical properties of phthalocyanines arestrongly dependent on the central metal ion. For

Correspondence:Patricia Escobar, CINTROP, Escuela de Medicina,Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Industrialde Santander, Bucaramanga, Colombia.Phone/fax: (00576) 563 [email protected]


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application in photodynamic therapy, Zn (II) andAl (III) complexes exhibit the most favourable prop-erties. Unfortunately most phthalocyanines are in-soluble in water or in biologically compatiblesolvents. However, water-soluble phthalocyaninesderivatives can be readily synthesised throughsubstitution of the ring with moieties such assulphonic acid, carboxylic acid and amino groups(15).

While the use of the photodynamic therapy in can-cer treatment is well accepted, its use againstmicroorganisms is a relatively new area of researchand, at least in the case of Leishmania, it is inexploratory stages (20,21). Early in vitro investi-gations showed that some electron carriers andporphyrins in combination with menadione induceda selective destruction of intracellular amastigotes(22-24). Further experiments demonstrated thattransgenic Leishmania parasites, expressing thesecond and third enzymes involved in the synthe-sis of heme metabolic pathway such asaminolevulinate dehydratase and porphobilinogendeaminase respectively, become highly suscep-tible to ultraviolet l ight exposition afteraminolevulinic acid treatment (20). Recently, theefficacy of photodynamic therapy treatment wasdemonstrated on human skin lesions caused pos-sibly by Leishmania donovani parasites, usingaminolevulinic acid as photosensitizer (21).

Figure 1. General structure of phthalocyanines where M isthe central metal ion (Al, Zn, Co, etc.) and R represent thepossible ring substituents (15).

In order to investigate for new chemotherapeuticstrategies on leishmaniasis, the aim of this studywas to determine the in vitro photodynamic activ-ity of aluminium chloride and zinc phthalocyaninesin promastigotes of Leishmania panamensis andL. chagasi parasites.

Materials and methods

Phthalocyanines and reference drugs

Aluminium phthalocyanine chloride (AlPc) and zincphthalocyanine (ZnPc) were purchased fromSigma-Aldrich (St. Louis, USA). Stock solutionswere prepared in dimethylformamide (Fluka).Working solutions were made in culture mediumimmediately before the assays. Dimethyl-formamide was not toxic for the parasites at thedilution used. Hexadecylphosphocholine, kindlyprovided by Professor Simon Croft (London Schoolof Hygiene and Tropical Medicine, UK), and am-photericin B purchased from Sigma were used asreference drugs.

Parasites

L. panamensis (MHOM/PA/71/LS94) and L.chagasi parasites (MHOM/BR/74/PP75) werekindly donated by the Centro Internacional deEntrenamiento e Investigaciones Médicas(CIDEIM), Cali, Colombia. Parasite promastigoteswere cultured at 28°C in minimal essential medium(MEM, Gibco, USA) supplemented with 10% ofheat inactivated foetal calf serum (hiFCS, Gibco).

Phototoxic assays onLeishmania promastigotes

Parasites were harvested in the late exponentialgrowth phase, diluted to 1 x 106 parasites/ml andincubated with control drugs, AlPc or ZnPc usinga three-fold dilution series (from 0 µM to 15 µM),in 96 microwell plates (Becton Dickinson, NewJersey, USA) for 24 hours at 28°C. The parasiteswere illuminated using light intensities of 10.0 J/cm2, 5.0 J/cm2 and 2.5 J/cm2 at 670 nm with anon-ionic red laser light system (BFW, EdmundIndustrial Optics). Control cells were notilluminated. Twenty-four hours after illumination,inhibition of promastigotes growth wasmicroscopically determined by counting parasitenumbers in a haemocytometer. Inhibition of para-site growth was determined by comparison to un-

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treated controls. The phototoxic effect was dem-onstrated by comparing the activity of phthalo-cyanines with and without illumination. Each ex-periment was repeated by three times.

Analysis

ED50

and ED90

values were calculated by sigmoi-dal regression analysis (MSx/fitTM; ID BusinessSolution, Guildford, UK). Results were expressedas mean ± SEM and statistical significance wasdetermined by Student’s t-test.

Results

Photosensitivity of L. chagasi andL. panamensis to aluminium andzinc phthalocyanines

L. chagasi promastigotes were 30 to 50 times morephotosensitive than L. panamensis after AlPc treat-ment with ED

50 values of 0.0033, 0.0093 and

0.0083 µM versus 0.17, 0.25, 0.34 µM of AlPc atlight intensities of 10.0 J/cm2, 5.0 J/cm2 and 2.5J/cm2 respectively (table 1). A dose response wasobserved in the activity of AlPc on the strains ofboth parasites species. In contrast, both speciesof Leishmania showed the same range ofphotoactivity after ZnPc treatment (table 2). Nosignificant parasite inhibition was induced on non-phthalocyanine treated parasites after illumination.

This result indicates that the parasite inhibitionwas due to the photosensitization effect of thephthalocyanine compound under visible light.

Level of photoactivity induced by aluminiumand zinc phthalocyanine

In all assays, AlPc treatment induced morephototocixity than ZnPc. Aluminium phthalocyaninewas 30 to 40 times and 1,500-2,000 times morephotoactive than ZnPc on L. panamensis and L.chagasi promastigotes respectively (tables 1and 2).

No inhibition on both parasites species was in-duced by AlPc or ZnPc treatment on the dark(tables 1 and 2). At the maximal dose of any ofthe Pc used (15 µM), only up to 5% of parasiteinhibition was observed without illumination.

Photoactivity induced byhexadecylphosphocholine and amphotericin B

No photoactivity was induced by the referencedrugs after illumination at 5.0 J/cm2 and 2.5 J/cm2 (data not shown). Without illumination, HPCwas active against L. panamensis and L. chagasipromastigotes with ED

50 values of 4.15 µM (P

95

confidence limits 3.85-4.45 µM) and 1.80 µM (P95

confidence limits 1.56-2.04 µM) respectively after3 days of incubation. In addition, AmB was active

Table 1. Photoactivity of aluminium phthalocyanine chloride against Leishmania spp. promastigotes.

Experiment 1 Experiment 2

J/cm 2 ED50 ED90 ED50 ED90

(CL) (CL) (CL) (CL)

L. panamensis 10.0 0.17 6.61 0.15 3.11(0.12-0.21) (2.85-10.36) (0.14-0.16) (2.11-4.11)

5.0 0.25 15.64 0.27 6.15(0.22-0.28) (0.72-32.00) (0.17-0.36) (2.47-9.82)

2.5 0.34 8.63 0.26 7.69(0.27-0.41) (0.97-16.26) (0.23-0.29) (4.10-11.28)

0.0 >15.00 >15.00 >15.00 >15.00

L. chagasi 10.0 0.0033 0.1037 0.0020 0.0733(0.0024-0.0043) (0.0377-0.1697) (0.0020-0.0020) (0.0362-0.1105)

5.0 0.0093 0.1373 0.0087 0.1686(0.0069-0.0118) (0.1045-0.1702) (0.0031-0.0143) (0.1291-0.2082)

2.5 0.0083 0.1503 0.0077 0.0997(0.0074-0.0093) (0.1250-0.1757) (0.0058-0.0095) (0.0727-0.1266)

0.0 >15.00 >15.00 >15.00 >15.00

ED50 and ED90 values in µM with P95 confidence limits (CL); light intensity in J/cm2.

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Table 2. Photoactivity of zinc phthalocyanine against Leishmania spp. promastigotes.

Experiment 1 Experiment 2

ED50 ED90 ED50 ED90J/cm 2 (CL) (CL) (CL) (CL)

L. panamensis 10.0 6.05 >15.00 4.89 >15.00(5.00-7.11) (4.65-5.13)

5.0 7.78 >15.00 6.71 >15.00(7.53-8.03) (5.48-7.93)

2.5 12.38 >15.00 10.22 >15.00(958-15.18) (9.39-11.06)

0.0 >15.00 >15.00 >15.00 >15.00

L. chagasi 10.0 6.45 >15.00 3.31 >15.00(5.77-7.13) (2.07-4.55)

5.0 11.58 >15.00 6.68 >15.00(10.77-12.39) (5.46-7.87)

2.5 >15.00 >15.00 12.36 >15.00(12.00-12.71)

0.0 >15.00 >15.00 >15.00 >15.00

ED50 and ED90 values in µM with P95 confidence limits (CL); light intensity in J/cm2.

against L. panamensis and L. chagasi with ED50

values of 0.11 µg/mL (P95

confidence limits 0.10-0.12 µg/mL) and 0.025 µg/mL (P

95 confidence limits

0.021-0.028 µg/mL) respectively.

Discussion

The phototoxic effect of phthalocyanines againststrains of two Leishmania species was determinedfor the first time in this work. The antileishmanialactivity induced by the photodynamic treatmentin vitro was strongly dependent on both the Leish-mania species and the type and concentration ofphthalocyanine used.

Leishmania chagasi promastigotes were highlysusceptible to photodynamic therapy in vitro usingAlPc treatment and red light illumination at 670nm. The range of activities induced by AlPc (betweenED

50 of 0.0033 to 0.0093 µM) was lower than other

antileishmanial drug activities such as hexa-decylphosphocholine and amphotericin B (25-27).

The efficacy of photodynamic therapy ontrypanosomatids has been demonstrated in previ-ous studies. The ability to inactivate Trypanosomacruzi parasites from blood components was ob-served using photosensitizers such asamotosalen or psoralen and ultraviolet illumination(11,28) and cationic silicon phthalocyanines andred light illumination (28). In addition, a high

photosensitivity was showed by transgenicLeishmania promastigotes after ultravioletil lumination previously treatment withaminolevulinic acid (20).

There are two types of mechanism that could beinvolved in the parasites inhibition after photody-namic therapy. The type I mechanisms due to theproduction of hydroxyl radicals and other activeoxygen species that react with biomolecules insitu with subsequent cytotoxic results. The type IImechanism induced by the reactions between sin-glet oxygen with molecules involved in the main-tenance of cell-wall/membrane structures such asphospholipids, peptides and sterols. Because itis known that Leishmania promastigotes are verysusceptible to active oxygen species (29-31), it ispossible to suggest that the low concentration ofAlPc used in this study induces the release ofactivated oxygen species to inhibit the parasite.The mechanisms involved in Leishmaniaphotodamage are under study.

The difference in drug sensitivity between the twostrains pertaining to two species of Leishmaniasuch as L. chagasi and L. panamensis wasnotable. Over fifteen species of Leishmania areknown to cause disease in humans with a wideclinical spectrum from visceral to cutaneousmanifestations. Each species of Leishmania has

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specific biochemical and molecular characteristicsthat provide the basis for the taxonomy of thisgenus. These differences are reflected in thevariable sensitivity of Leishmania species todrugs, for example, pentavalent antimonials (32),the aminoglycoside antibiotic paromomycin(aminosidine) (33), several azoles (34), thepyrazolopyrimidines allopurinol and allopurinolriboside (35) and hexadecylphosphocholine (27).But why the strain of L. chagasi used was almost50 times more sensitive than L. panamensis tophotodynamic therapy it is not known. Almost allthe literature about the in vitro photodynamictherapy activities is coming from the cancermodels. In these models, the cell toxicity inducedby phthalocyanines in vitro has been shown to bedependent on factors such as type of tumour cell,metal phthalocyanine and its derivatives, celluptake, phthalocyanine incubation time, lightintensity and/or phthalocyanine localization anddistribution in the cells (16,36-40).

In this work two types of phthalocyanines werecompared. Aluminium phthalocyanine treatmentshowed a higher phototoxic effect than ZnPc. Thisresult could be attributed to the amphiphilicproperties of AlPc that could facilitate cell uptakeand intracellular localization, contrary to thehydrophobicity of ZnPc. The AlPc used in thisstudy was soluble in culture medium, whereasZnPc was less soluble. In general, phthalocyaninesare prone to self-aggregation and dimers arereported to be inactive or much more inefficientthan monomers as photosensitizers (17). In water,ZnPc displays a strong tendency to formaggregates as a result of the propensity of thelarge hydrophobic skeleton to avoid contact withthe aqueous medium. On the other hand, it isknown that the central metal ligand plays a crucialrole in the photobiological activity influencing theexcited triplet state yield and lifetime (16,17).Another important reason which could justify thedifference in AlPc versus ZnPc activity againstparasites was the type of illumination system usedin this study. It could be possible to obtain a higherZnPc activity using a wide range of wavelengthfor illumination.

In this paper, we have demonstrated that AlPcand ZnPc treatment after red light illumination at

670 nm effectively inhibits L. chagasi and L.panamensis promastigotes. In order to confirm theuseful of photodynamic therapy in leishmaniasis,it is imperative to continue this study testing thephothoactivity of these compounds in axenic orintracellular amastigotes and further in animalmodels. However the results shown in this paper,using only the promastigote free form of the para-site, give us an idea about the effects of photody-namic therapy on Leishmania and open a newperspective for an alternative treatment againstthis insidious parasite.

Acknowledgements

The authors would like to thank ProfessorRaymond Bonnett, Emeritus Professor of OrganicChemistry at Queen Mary, University of London,for his scientific support and advice during thedevelopment of the project.

Conflict of interest

The authors declare that there are no conflicts ofinterest on the results published in this paper.

Financial support

This work was supported by the InstitutoColombiano para el Desarrollo de la Ciencia y laTecnologia “Francisco Jose de Caldas”COLCIENCIAS (Grant 1102-04-14130; RC No 480-2003), by the Universidad Industrial de Santander,Bucaramanga, Colombia and by the Program“Apoyo a los doctorados nacionales”, fromCOLCIENCIAS.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):57-63 EFFECT OF BLOOD SOURCE ON THE SANDFLY

ARTÍCULO ORIGINAL

Effect of blood source on the survival and fecundity ofthe sandfly Lutzomyia ovallesi Ortiz (Diptera: Psychodidae),

vector of LeishmaniaPedro Noguera, Maritza Rondón, Elsa Nieves

Laboratorio de Parasitología Experimental (LAPEX), Departamento de Biología, Facultad de Ciencias,Universidad de Los Andes, Mérida, Estado Mérida, Venezuela.

Introduction. The reproductive potential of sandflies depends on various factors, one of whichis the type of host available as blood source, which is important in determining their capacity toserve as vectors.Objective. The present study evaluated the effect of the animal blood source on various biologicalparameters of Lutzomyia ovallesi (Ortiz) under laboratory conditions.Materials and methods. Two-day-old females from a L. ovallesi colony were artificially fed torepletion using a chicken skin membrane with blood from seven different species of vertebratehosts, horse, dog, cow, chicken, goat, pig and human. Life-span, time of oviposition, time forblood digestion, number of eggs laid, number of eggs retained and the total number of eggswere recorded.Results. The results show the influence of blood source on different biological parameters of L.ovallesi. The results showed that in L. ovallesi, chicken blood is the most quickly digested (3.34days) and gives the longest time of oviposition (5.88 days), the greatest number of eggs retained(10.20 eggs per female) and the greatest fecundity (30.80 eggs per female) compared with theother sources of blood studied. The most satisfactory animal blood source was chicken followed,in descending order, by goat, cow, pig, human, dog and horse.Conclusions. The data showed that, in bio-ecological terms, the best blood source for L. ovallesiwas chicken and the least satisfactory one was horse. These results contribute to theunderstanding of the factors that influence the rearing of the sand fly L. ovallesi under laboratoryconditions, and of how dietary factors for adult sand flies affect their biological potential andcould have important consequences on the transmission of Leishmania.

Key words: Blood, Psychodidae, biology, fertility, Leishmania.

Efecto del tipo de sangre en la supervivencia y fecundidad del flebotomino Lutzomyiaovallesi Ortiz (Diptera: Psychodidae) vector de Leishmania

Introducción. El potencial reproductivo de los flebotominos depende de varios factores, unode los cuales es el tipo de hospedador disponible como fuente sanguinea, este es importanteen determinar su capacidad de servir como vectores.Objetivo. Se estudia el efecto de la fuente de alimentación sanguínea sobre varios parámetrosbiológicos de L. ovallesi en condiciones de laboratorio.Materiales y métodos. Se utilizaron hembras de dos días de edad de L. ovallesi de colonia,alimentadas artificialmente a repleción usando membrana de pollo, con sangre de sietehospedadores vertebrados, caballo, perro, vaca, gallina, chivo, cochino y humano. Se determinóel tiempo de vida, tiempo de oviposición, tiempo de digestión sanguínea, número de huevospuestos, número de huevos retenidos y número de huevos totales.Resultados. Los resultados muestran la influencia de la fuente sanguínea sobre diferentesparámetros biológicos de L. ovallesi estudiados. Los resultados demuestran que con la sangrede gallina se obtienen mayor tiempo de oviposición (5,88 días), digestión más rápida (3,34días), mayor número de huevos retenidos (10,20 huevos por hembra) y mayor fecundidad(30,80 huevos por hembra) en comparación con los otros tipos de sangre. La sangre más

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Biomédica 2006;26(Supl.1):57-63NOGUERA P., RONDÓN M.,NIEVES E.

satisfactoria fue la de gallina seguida, en orden descendente, por las de chivo, vaca, cochino,humano, perro y caballo.Conclusión. Los datos muestran que la sangre de gallina es la mejor fuente sanguínea entérminos bio-ecológicos para L. ovallesi, y la sangre de caballo la menos adecuada. Losresultados contribuyen al entendimiento de los mecanismos que influyen en las condicionesde cría en el laboratorio del flebotomino L. ovallesi y también de cómo ciertos factores de ladieta en los adultos afectan el potencial biológico y que podrían tener importante consecuenciasen la transmisión de Leishmania.

Palabras clave: sangre, Psychodidae, biología, fertilidad, Leishmania.

Corresponding:Elsa Nieves, Laboratorio de Parasitologia Experimental(LAPEX), Departamento de Biología, Facultad de CienciasUniversidad de Los Andes, La Hechicera, Mérida, EstadoMérida, 5101. Venezuela.Teléfono: (02 74) 240 1244; fax: (02 74) 240 [email protected]


Sandflies (Diptera: Psychodidae) are hematophagicinsects that need bloodmeal to complete theirreproductive cycle. Only the females feed on bloodwhich provides proteins indispensable for eggproduction (1-3). The reproductive potential ofsandflies, as other hematophagic insects, dependmainly to find a host that will provide blood capableto mature a significant number of eggs besides asuitable site for laying them (4-7). The feedinghabits of the vectors constitute an importantaspect of their bionomics, affecting directly theLeishmania transmission (8-10). It also wasdemonstrated that the rate of blood meal digestionin Phlebotomus langeroni varied according to thesource of the vertebrate blood and Leishmaniaspecies involved (11).

Chaniotis 1967(12) noticed that Lutzomyia vexatorlaid more eggs after feeding on lizards than onsnakes. Ward 1977 (13) reported that L.flaviscutellata laid more eggs after feeding onrodents than on humans. Ready 1979 (14)observed that for L. longipalpis the number of eggsmatured with the blood of seven mammal hostsincreased in direct proportion to the weight of bloodingested and its source, some blood seems to bemore nutritive than others; similarly, Benito DeMartin et al. 1994 (15) and Hanafi et al. 1999 (16)showed for Phlebotomus that fecundity alsodependeds on the blood source. Nutritional qualityof blood varies between host species and mayinfluence egg productivity, reduce development

rates, longevity and fecundity of the insects (17).For understanding the role of blood meal sourceson sandfly biology, physiology and Leishmaniatransmission more field observations andlaboratory studies comparing egg productivity ofsandflies fed on differents hosts (17-19) arenecessary.

L. ovallesi (Ortiz) is one of the main vectors ofLeishmania braziliensis in Venezuela (20). It isfrequently found in the vicinity of human habita-tion and it is considered an anthropophilic spe-cies (21,22). However, L. ovallesi feeds upon avariety of vertebrate hosts, and could be consid-ered as an opportunistic species (23,24). Thus,the present work studies the effect of blood fromdifferent domestic animals on the fecundity of L.ovallesi in laboratory conditions.


Sandflies

Females of L. ovallesi were obtained from a closedlaboratory colony established with specimenscollected during 2001 at 1,360 m above sea levelin the locality of El Arenal, Ejido, Mérida state,Venezuela. The colony was maintained in theLaboratorio de Parasitología Experimental, at theUniversidad de Los Andes, Mérida, Venezuela,with techniques described by Killick-Kendrick etal. in 1977 (25), in an incubator at 25±1°C with arelative humidity of 80±10%.

Blood sources

Blood from healthy animals was collected in tubescontaing 0.2 ml of citrate per ml of blood. Theblood sources were: horse (Equus caballus),chicken (Gallus domesticus), pig (Sus scrofadomestica), cow (Bos taurus), goat (Capra hircus),dog (Canis familiaris) and human (Homo sapienssapiens).

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Artificial feeding

Two-day-old females were artificially fed to reple-tion using chicken membrane, with water circu-lating at a temperature of 39°C. Groups of ≈100sand flies were exposed to the feeder over eachcarton during 4 hours. In each fedeer blood wasmixed every 30-45 minutes using a pipette, to pre-vent cell sedimentation. Blood-fed sandflies wereseparated, counted and individually placed intoglass tubes, mantained in an incubator at 25±1°Cwith relative humidity of 80±10%, with 12 hoursof light and 12 hours of darkness. As a dietarysupplement they were given a 50% fresh sucrosesolution, renewed daily.

Fecundity, oviposition time and survival

Daily observations were made to determine thetime of blood digestion which was estimatedchecking each one of the females under the lightmicroscope to determine the presence of bloodin the midgut; the oviposition time, whichrepresents the time from blood feeding to egglaying; and survival represents the longevity ofthe females. After oviposition and death of thefemales, the eggs were counted, the femalesremoved and dissected in PBS solution using astereoscopic microscope and the number ofretained eggs counted for determination of thefecundity (the number of eggs laid and retained).All results represents the average per female of aminimum of 60 females and a maximum of 139females.

Statistical analysis

One way analysis of variance (ANOVA) was used,with a Tukey test for different N, and finally aprincipal component analysis, using MinitabStatistical Software (version 10), the statisticsprogram (version 6.0) and SPSS (version 8 inSpanish).

Results

Digestion time. The digestion time by L. ovallesifemales fed on the blood of seven vertebrate hostsis presented in figure 1. The digestion time for L.ovallesi in ascending order of duration is as fol-lows: chicken<pig<cow<goat<dog<human<horse(figure 1). Statistical analysis showed that therewas only a significant difference between the di-

gestion time for chicken blood and all the others,and between digestion time of horse blood andblood from chicken, pig, cow, and goat (p<0.0005).

Oviposition time. Figure 2 shows the ovipositiontime by L. ovallesi females fed on the blood ofseven vertebrate hosts. The longest ovipositiontime was obtained with chicken blood and theshortest, with goat and dog blood. In ascendingorder, the time of oviposition for L. ovallesi withthe different sources of blood was as follows:dog<goat<horse<human<pig<cow<chicken. Sta-tistically significant differences (p<0.05) were ob-served for oviposition time for L. ovallesi fed onchicken, goat, and dog blood.

Figure 1. Digestion time of L. ovallesi feeding on blood ofseven vertebrate hosts. The numbers in parentheses arethe range and the number below each blood source is the nvalue.

Figure 2. Oviposition time of L. ovallesi feeding on blood ofseven vertebrate hosts. The numbers in parentheses arethe range and the number below each blood source is the nvalue.

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Number of eggs laid. Figure 3 shows the averagenumber of eggs laid by L. ovallesi females fed onthe blood of seven vertebrate hosts. The lowestaverage occurred with horse blood and the highestwith goat. The number of eggs laid in decreasingorder was as follows: goat>chicken>pig>dog>human>cow>horse. No significant differenceswere found between the groups.

Number of eggs retained. Figure 4 shows theaverage number of eggs retained by L. ovallesifemales fed on blood of the seven vertebratehosts. The lowest number of eggs retainedoccurred with pig blood and the highest withchicken. The number of eggs retained inincreasing order was as follows: pig<cow<human<goat<horse<dog<chicken. Statistical analysisshowed only a significant difference in the aver-age number of eggs retained by L. ovallesi fed onblood of chicken and those fed on pig blood(p<0.01).

Fecundity. Figure 5 shows fecundity values (thenumber of eggs laid and retained) for L. ovallesifemales fed on the blood of different vertebratehosts. The fecundity values in decreasing orderwere as follows: chicken>dog>goat>pig>human>horse>cow. Statistical analysis shows significantdifferences in the fecundity of L. ovallesi fed onchicken blood compared with the values obtainedfrom cow, horse, human and pig blood. There werealso significant differences between the values

Figure 3. Number of eggs laid by L. ovallesi feeding on bloodof seven vertebrate hosts. The numbers in parentheses arethe range and the number below each blood source is the nvalue.

Figure 4. Number of eggs retained by L. ovallesi feeding onblood of seven vertebrate hosts. The numbers in parenthe-ses are the range and the number below each blood sourceis the n value.

Figure 5. Fecundity of L. ovallesi feeding on blood of sevenvertebrate hosts. The numbers in parentheses are the rangeand the number below each blood source is the n value.

obtained from cow and chicken blood, and betweendog and goat blood (p<0.05).

Life span . The average values for life span of L.ovallesi fed on blood of the seven vertebrate hostswere analyzed (figure 6). The longest life spanoccurred with cow blood and the lowest, with dog.The average life span of L. ovallesi fed on differenttypes of blood in decreasing order was as follows:cow>chicken>pig>human>goat>horse>dog. Sta-tistical analysis showed that there was a signifi-cant difference in the average values obtainedfrom dog blood and the other sources, and betweenthe average values obtained from horse andchicken blood and from cow and dog blood(p<0.05).

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Principal component analysis. Figure 7 showsthe principal component analysis of 6 variablesstudied in L. ovallesi fed on blood of the sevenvertebrate hosts. This analysis was made on thebasis of data obtained after the third day of feedingon blood. The figure is made up from two compo-nents which account for 63.35% of variation.

Discussion

Fecundity and longevity in sandflies are importantfactors in determining their capacity to serve asvectors. The results of the present work show thatin L. ovallesi, chicken blood is the most quicklydigested and gives the longest time of oviposition,the greatest number of eggs retained and thegreatest fecundity compared with the other

sources of blood studied. These results agree withthose of other researchers, who suggest that bloodsource modifies some biological parameters insandflies (14-16). Females of L. ovallesi fed ondog blood showed significant differences, with theshortest time of oviposition and the shortest lifespan. Those fed on cow blood showed significantdifferences in terms of lower fecundity with thosefed on chicken, dog and goat blood. L. ovallesifed on horse blood showed significant differencesbetween those fed on chicken and cow blood interms of a shorter life span, between those fed onpig and goat blood in terms of longer digestiontime, and with those fed on dog blood in terms ofa longer life span.

Ready (14) suggests that these differences in eggproduction by L. longipalpis fed on hamster andhuman blood could be due to differences in red-cell content and not to L-isoleucine deficiency inhuman red cells, since adding it did not increasethe number of mature eggs. The small specificdifferences among the seven vertebrate bloodsources would explain the results obtained for L.ovallesi. These agree with those of Ready (14),who showed that for L. longipalpis the amount andcomposition of blood were the principal factorsthat influenced egg-production in laboratory-bredfemales. He suggests that physiological factors,such as sugar feeding, size, autogeny and copu-lation, are less important.

The biological potential of Lutzomyia depends onvarious factors, one of which is the type of hostavailable as a blood source, where specificdifferences in blood values are related with thesynthesis and rupture of the peritrophic matrix,and the synthesis of digestive enzymes. Theenzymatic processes of sandfly guts were shownto function differently, when triggered by differenttypes of meals (8,19,26). The protease levels inthe gut of P. langeroni vary in accordance withthe blood of the vertebrate host (11). However,the blood meals from different species of vertebratehave no deleterious effect on the developmentof Leishmania braziliensis or Leishmaniaamazonensis in the gut of Lutzomyia migonei andparasite development was compatible withdigestion, independent of the bloodmeal source(10).

Figure 6. Life span of L. ovallesi feeding on blood of sevenvertebrate hosts. The numbers in parentheses are the rangeand the number below each blood source is the n value.

Figure 7. Principal component analysis of six variables as-sociated with L. ovallesi feeding with blood from sevenvertebrate hosts.

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Although, a high number of sandfly species havebeen successfully colonized during the lastdecade, the factors limiting their productivity andfecundity in the laboratory are unknown. Also, in-formation on basic aspects of the biology of thesandfly vectors is important to understand theefficiency of transmission of Leishmania and vec-tor competence (27-29). The results of the presentwork show the influence of blood source on differ-ent biological parameters of L. ovallesi, withchicken blood having the most significant effecton several of the parameters studied. However,no single blood source provided optimum resultsfor all the variables studied. On the basis of theprincipal component analysis, and taking into ac-count ideal or most adequate values for a specificblood source, they would be those that gave, inorder of importance: (1) longest life span, (2)shortest oviposition time, (3) shortest digestiontime, and (4) greatest number of eggs in total(fecundity). In this analysis, for L. ovallesi fed onseven types of blood, the best in bioecologicalterms would be chicken, and the least satisfactory,horse; the most satisfactory in descending orderbeing as follows: chicken, goat, cow, pig, human,dog, and horse.

Nutritional quality of blood varies between hostspecies, avian blood should be less nutritious thanthat of mammals (17). Chicken erythrocytes arenucleate and have a DNA content 31 times higherthan the contents found in humans (8,17). Theyalso have a lower hemoglobin content thanmammalian red cells and half hematocrit value incomparison to mammals, total plasma protein lev-els in chickens are considerably lower than in dogsand pigs. In addition, catabolism of nucleic acidsfrom chicken erythrocytes would presumably in-volve greater bioenergetic cost due to increasedproduction and active transport of uric acid, theend product of nitrogen metabolism (17). In acomparative study of the fecundity and survivalrates of P. papatasi fed on blood from eight spe-cies of mammals (human, horse, cow, pig, dog,rabbits, guinea-pigs and hamsters) appreciabledifferences were not detected (30). We found thatL. ovallesi can be fed on a variety of source blood,and the chicken blood appears to be morecompetent. Extrapolating these results, it could

be assumed that the effect would be similar innatural conditions, but these aspects need furtherstudy to determine the relative importance fromchicken and other hosts as bloodmeal sources.

Acknowledgments

We thank Carlos Araque for assistance in the pro-duction in laboratory colony, Luis Chávez for hishelp and cooperation, and to professors EfrainEntralgo, Guillermo Bianchi and Paolo Ramoni forguidance in statistical analyses; to professor LeidaQuintero for help in providing blood samples andIrlanda Márquez for proofreading this article.

Conflict of interests

The authors declare that they have no competinginterests

Financial support

This study was supported by grant of CDCHT-ULA (Cod: C-1406-06-03-B) and CONICIT (Cod.:S1-2000000818).

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Biomédica 2006;26(Supl.1):64-72GONZÁLEZ C., CABRERA O.L., MUNSTERMANN L.E., FERRO C.

ARTÍCULO ORIGINAL

Distribución de los vectores de Leishmania infantum(Kinetoplastida: Trypanosomatidae) en ColombiaCamila González 1, Olga L. Cabrera 1, Leonard E. Munstermann 2, Cristina Ferro 1

1 Laboratorio de Entomología, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D. C., Colombia.2 Epidemiology and Public Health Department, Yale University School of Medicine, New Haven, Connecticut,

USA.

Introducción. Debido a la importancia que tiene la vigilancia entomológica como principalmedida de control en el manejo de la leishmaniasis visceral, es necesario contar con informaciónactualizada acerca de la distribución y ecología de los insectos involucrados en la transmisiónpara optimizar las estrategias de prevención.Objetivo. Presentar la distribución actualizada geo-referenciada de L. longipalpis y L. evansi,vectores de los parásitos que causan leishmaniasis visceral en Colombia, teniendo en cuentala asociación de los insectos con su hábitat.Materiales y métodos. Los registros de distribución se obtuvieron a partir de los ejemplaresrecolectados en Colombia desde 1967. La información obtenida se organizó en una base dedatos a partir de la cual se tomaron las localidades que, posteriormente, fueron sometidas aanálisis geográficos por medio de Arc View que se utilizaron para realizar los mapas dedistribución.Resultados. Para L. longipalpis se obtuvieron 40 localidades todas distribuidas a lo largo delvalle del río Magdalena: Alto (24), Medio (11) y Bajo (5) Magdalena. L. evansi fue registradoen 19 localidades también ubicadas en el mismo valle: cinco en el Magdalena Medio y 14 elMagdalena Bajo.Conclusiones. Ambas especies demostraron una consistente asociación con regionesclasificadas principalmente como bosque seco tropical según las zonas de vida de Holdridgelo que confirma el riesgo epidemiológico de leishmaniasis visceral en estas áreas.Palabras clave: Psychodidae, leishmaniasis visceral, Colombia.

Distribution of Leishmania infantum vector species in Colombia.

Introduction. Since entomological surveillance is the main control strategy for visceralleishmaniasis, updated information on the distribution and ecology of involved vector species isnecessary for planning preventive measures.Objective. To present the updated and geo-referenced distribution of L. longipalpis and L.evansi, vectors of visceral leishmaniasis in Colombia, considering their relationship with theirhabitat.Materials and methods. Distribution was estimated from records of the sand fly specimenscollected since 1967.The information was organized in a database from which the localitieswere selected and geographically analyzed with Arc view in order to develop the distributionmaps. Results. 40 localities were established for L. longipalpis along the upper (24), middle (11) andlower (5) Magdalena river valley. L. evansi was recorded in 19 localities of the middle (5) andlower (14) Magdalena valley.Conclusions. Both species showed consistent association with dry tropical forest (sensuHoldridge 1967), confirming the epidemiological risk for visceral leishmaniasis in these areas.

Key words: Psychodidae, leishmaniasis, visceral, Colombia.


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Biomédica 2006;26(Supl.1):64-72 VECTORES DE L. INFANTUM EN COLOMBIA

La leishmaniasis visceral es una enfermedadendémica de 61 países que puede ser mortal enausencia de tratamiento. Su incidencia anual esde cerca de 500.000 casos de los cuales el 90%se presenta en Bangladesh, India, Nepal y Brasil(1). Las grandes epidemias ocurridas recientementeen África e India y la emergencia de casos enpacientes infectados con VIH han hecho de laleishmaniasis visceral una enfermedad prioritariapara la Organización Mundial de la Salud (2).

Mundialmente, dos especies de parásitos,Leishmania donovani y Leishmania infantum(generalmente considerado como Leishmaniachagasi en Latinoamérica (3,4)) son los agentesetiológicos responsables de la enfermedad. Unvariado número de reservorios (pequeñosmamíferos) y diferentes vectores (especies dedípteros de los géneros Phlebotomus y Lutzomyia)son los encargados de mantener los ciclosenzoóticos de la enfermedad en distintas regionesdel mundo (4-8). El perro es considerado el principalreservorio doméstico (9).

En el Nuevo Mundo, Lutzomyia longipalpis es elvector principal y se distribuye en áreas tropicalesdesde el sur de México hasta el norte de Argentina(10,11). En la década de los noventa, otras dosespecies fueron incriminadas como vectores deeste parásito, L. evansi en Colombia y en Brasil,Lutzomyia cruzi (12,13). L. evansi está presenteen Colombia, Venezuela, México, Guatemala, ElSalvador, Honduras, Nicaragua y Costa Rica(10,14,15) y L. cruzi en Brasil y Bolivia (13). Lapresencia de L. longipalpis y L. evansi puedecoincidir en una misma zona (14-18); en el estadode Aragua, Venezuela, la mayor abundancia paraL. evansi se registra al final de la estación lluviosa,mientras que para L. longipalpis el aumento seregistra durante la estación seca, lo que sugiereuna alternancia estacional (18).

Los estudios de competencia y capacidadvectorial han demostrado que L. evansi tiene un

menor potencial de transmisión con respecto a L.longipalpis debido a que registra bajas tasas deinfección (19-20). Las dos especies han sidoasociadas a la transmisión domiciliaria en áreasurbanas y suburbanas (18, 21). Además, enColombia, en años recientes, se encontró L. evansien una zona urbana de la Costa Atlántica (22).

La actualización de la distribución de estosvectores en Colombia permite optimizar lasestrategias de prevención definiendo zonas deriesgo y áreas prioritarias de control. Con estefin, en diferentes proyectos de salud pública seestán utilizando los sistemas de informacióngeográfica que permiten identificar, clasificar yorganizar las variables ambientales involucradasen la distribución y abundancia de lasenfermedades (23-26).

El presente trabajo introduce esta herramienta enel estudio de los vectores de leishmaniasisvisceral en Colombia y presenta, por primera vez,los mapas digitales de distribución de estasespecies y su asociación a las zonas de vida deHoldridge, se incluyen registros previamentedocumentados y algunos nuevos provenientes deestudios realizados en Colombia.


Se elaboró una base de datos a partir de registrosde ejemplares recolectados en Colombia desde1967, que fueron confirmados y complementadoscon datos bibliográficos. Toda esta informaciónse sistematizó por medio del programa EpiInfo2002 y, a partir de los registros obtenidos, sedeterminaron las localidades en las que cada unade las especies en estudio había sido registrada.Los registros que determinan la presencia de L.evansi en el departamento de Caquetá no seincluyeron porque al revisar la colección dereferencia del Instituto Nacional de Salud seencontró que corresponden a Lutzomyia nevesi yno a L. evansi como se registró inicialmente (14).Tampoco se incluyeron los de Nariño, Valle delCauca (10,15) y Meta (Molina JA, Jaramillo M,Villegas C, Guhl F. Actualización de la distribucióndel género Lutzomyia en Colombia. Biomédica1997;17:152). Estos últimos registros, posiblemente,se originaron por un error de identificación o unacontaminación en las herramientas de trabajo.

Correspondencia:Cristina Ferro, Instituto Nacional de Salud, Avenida Calle26 N° 51-60, Bogotá, D. C. Colombia.Teléfono: (057-1) 220 09 [email protected]; [email protected]


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A partir de los datos de distribución obtenidos sehallaron las coordenadas de las localidades y seelaboraron los mapas de distribución de losvectores en Colombia por medio del programaArcView (versión 3.2). Con el fin de realizar losanálisis, se utilizaron las siguientes coberturas:división política de Colombia por municipios(Departamento Administrativo Nacional deEstadística, DANE); zonas de vida de Holdridge(Instituto de Hidrología, Meteorología y EstudiosAmbientales, IDEAM) y mapa de ecosistemasgenerales de Colombia (Alexander von Humboldt).

Resultados

Se ingresaron 203 registros de las especiesvectores del parásito agente causal de laleishmaniasis visceral en Colombia. Para laespecie L. longipalpis se obtuvieron 167 registrosque confirman su presencia en 40 localidades, delas cuales, 37 (92,5%) se referenciarongeográficamente. En el caso de L. evansi, de los36 registros obtenidos de 19 localidades, 17(89,5%) se referenciaron geográficamente (figura 1).

Distribución geográfica deLutzomyia longipalpis en Colombia

L. longipalpis se distribuye en el territoriocolombiano a lo largo de la región conocida comovalle del río Magdalena, desde el departamentodel Huila hasta la región Caribe. Se conoce supresencia en el país desde 1967, a partir decapturas realizadas por Cornelius Marinkelle enel municipio de Honda, departamento del Tolima(27). En 1968 se encontraron ejemplares de estaespecie en el departamento de Caldas por Moralesy Osorno, en el municipio de Victoria, vereda ElLlano. Registros posteriores de Osorno en 1970,indicaron su presencia en los departamentos deHuila, 12 km antes de Neiva, y en Cundinamarca,municipio de Nilo. En 1975 y 1987 se amplió elconocimiento de su distribución al departamentode Norte de Santander, a los municipios deGramalote, Durania, Zulia y Arboledas (28). En1982 y 1983 a los departamentos de Santander,municipio de Girón, vereda Palogordo, y Sucre,municipio de Ovejas, veredas El Ojito y Alemania.En la misma década se registró en La Guajira, en

Figura 1. Distribución de Lutzomyia longipalpis y Lutzomyia evansi en Colombia.

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el municipio de Barrancas (29). En 1991, porprimera vez, se registra en Antioquia en elmunicipio de San Luis, veredas La Mulata y ElRefugio (30). En el 2002, se capturaron ejemplaresen el departamento de Córdoba en el municipiode San Andrés de Sotavento, vereda Villa Nueva(17) (figura 1).

Distribución geográfica deLutzomyia evansi en Colombia

De acuerdo con la revisión publicada por Youngen 1979 (15), el primer registro de L. evansi en elpaís se remonta a especímenes recolectados en1940 en el departamento de Bolívar en el municipiode Arjona. Posteriormente, en 1944, Gast yRengifo obtuvieron ejemplares de esta especieprocedentes del departamento de Santander enel municipio de San Vicente de Chucurí, veredaChaparral.

Actualmente, su distribución está confirmada paralos departamentos de Antioquia, Casanare,Córdoba, La Guajira, Bolívar, Magdalena, Sucre,Norte de Santander y Santander. En 1969 seregistró, por primera vez, en el departamento deLa Guajira, a partir de ejemplares recolectadosen la vereda Las Marías en el municipio deUrumita. El primer registro que existe para eldepartamento de Magdalena, está descrito porYoung 1979 (15) en 1973 en capturas realizadasen Santa Marta. En el departamento de Norte deSantander se registra en 1983, en el municipio ElZulia, vereda El Guayabo. Los ejemplaresrecolectados en Córdoba en el municipio de SanAndrés de Sotavento y en Sucre en el municipioColosó, fueron identificados en 1988 y 1997 (10,17,31) (figura 1). Además, en 2003 se informó de supresencia en el municipio de San Roque,departamento de Antioquia, y en los municipiosde Hato Corozal, Paz de Ariporo y Tauramena,en el departamento de Casanare (32); laslocalidades del departamento de Casanare no seincluyeron en las figuras por no disponer de lascoordenadas geográficas.

Distribución de L. longipalpis y L. evanside acuerdo con las zonas de vida de Holdridge

De acuerdo con el mapa de zonas de vida deHoldridge (33), L. longipalpis y L. evansi han sidoencontrados en Colombia, predominantemente, en

regiones con una cobertura vegetal de bosqueseco tropical (bs-T), 26 (70,3%) de las 37localidades para L. longipalpis y 12 (75%) de las17 para L. evansi. El bs-T se encuentra entre los0 y 1.000 m de altitud, tiene una temperatura mediasuperior a los 24°C y un rango de precipitaciónanual entre 1.000 y 2.000 mm (33); ha sidoaltamente intervenido debido a la ganadería y elestablecimiento de cultivos, quedando unporcentaje muy reducido de su cobertura original(34).

Aunque para L. longipalpis la gran mayoría de laslocalidades están dentro de los límites del bosqueseco tropical, algunas se encuentran en otro tipode cobertura vegetal, a una distancia tan pequeñadel bosque seco tropical, que no pudoestablecerse con absoluta certeza siefectivamente eran parte de la otra cobertura(figura 2). Por ejemplo, en el departamento de LaGuajira, Barrancas fue georreferenciado en la zonade bosque muy seco tropical (bms-T), a unadistancia de 2,3 km, aproximadamente, delmargen del bs-T. El bms-T tiene un rango deprecipitación entre 500 y 1.000 mm y unatemperatura media superior a 24°C; se encuentraen localidades de La Guajira y Norte de Santander.Este bosque está altamente intervenido debido aque la vegetación nativa ha sido destruida a causadel pastoreo excesivo y a la tala de árboles.

En el departamento de Tolima en los municipiosde Dolores y Melgar y en Norte de Santander enel municipio de Gramalote, L. longipalpis fuecapturada en áreas correspondientes a bosquehúmedo premontano (bh-PM) a una distanciaaproximada de 2,5 km del margen del bs-T. Estetipo de bosque, se encuentra entre los 1.000 y2.000 metros de altitud, y tiene una temperaturapromedio entre 18 y 24°C y un rango deprecipitación de 1.000 a 2.000 mm anuales. Lavegetación original ha sido explotada para elestablecimiento de cultivos y frutales llevando alaumento de la población rural en estas regiones.

En zona de bosque húmedo tropical (bh-T), en eldepartamento del Tolima, las localidades seubicaron entre 1,2 km en Purificación y 11,1 kmen Prado, del límite del bs-T. En Norte deSantander, la localidad de Durania dista 0,7 kmdel límite de bs-T. El bh-T se caracteriza por tener

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una temperatura superior a 24°C, promedio anualde lluvias entre 2.000 y 4.000 mm y se encuentraentre los 0 y 1.000 metros de altitud. Sus suelos,al igual que en el bs-T, son utilizados paraganadería y cultivos. Se conservan regiones conselvas nativas pero que son explotadas para laobtención de maderas. También las localidadesde La Mulata en Antioquia y El Llano en Caldasestán dentro de la cobertura bh-T.

En cuanto a L. evansi, además de las localidadesde bs-T, se encontró en zonas que pertenecen auna cobertura de monte espinoso subtropical (me-ST), caracterizado por tener un rango deprecipitación muy bajo (250 a 500 mm) y unatemperatura media de 24°C (35) en eldepartamento de La Guajira, y en bosque muyseco tropical en localidades de La Guajira y Nortede Santander (figura 3).

Distribución de L. longipalpis y L. evansi deacuerdo con el mapa de ecosistemasgenerales de Colombia (Etter, 1998)

De acuerdo con el mapa de ecosistemasgenerales de Colombia (36), la mayoría de las

localidades en las que se distribuyen L. longipalpisy L. evansi, son áreas altamente intervenidas delas cuales permanece menos del 20% de lacobertura original. Por ejemplo, en el caso de L.longipalpis en Sucre y Cundinamarca y L. evansien Sucre y Bolívar, los registros corresponden azonas altamente intervenidas, donde los colonosremplazaron el bosque por la agricultura mixta enlas que se encuentran principalmente cultivos y,además, se lleva a cabo el pastoreo (figura 4).Estas zonas intervenidas, en las que lasactividades humanas se llevan a cabo en cercaníade las viviendas y hay presencia de los vectores,constituyen áreas de importancia epidemiológicaya que, de introducirse el parásito, podríapresentarse transmisión domiciliaria o peri-domiciliaria dando origen a nuevos focos de laenfermedad (37). Sólo algunas de las localidadesen las que se capturaron insectos se encuentranen ecosistemas relativamente conservados. Estees el caso de L. longipalpis en los departamentosde La Guajira y en Norte de Santander (figura 4) yde L. evansi en los departamentos de La Guajira,Bolívar, Sucre y Norte de Santander (figura 5).

Figura 2. Distribución de Lutzomyia longipalpis de acuerdo con las zonas de vida de Holdridge.

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Figura 3. Distribución de Lutzomyia evansi de acuerdo con las zonas de vida de Holdridge.

Figura 4. Distribución de Lutzomyia longipalpis de acuerdo con el mapa de ecosistemas generalesde Colombia.

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Discusión

Por primera vez, el Laboratorio de Entomologíadel Instituto Nacional de Salud presenta ladistribución de los dos únicos vectores deleishmaniasis visceral en Colombia por medio demapas digitales.

El control vectorial es una de las estrategiasimportantes en el manejo de enfermedadestransmitidas por vectores; la elaboración de estosmapas se constituye en una herramienta de granutilidad ya que permiten establecer las zonas endonde se encuentran los vectores y, por lo tanto,predecir a largo plazo posibles focos de apariciónde la enfermedad.

L. longipalpis tiene una amplia distribución,principalmente, a lo largo del valle del ríoMagdalena mientras que L. evansi se localizapredominantemente en la Costa Atlántica. Las dosespecies pueden encontrarse en las mismaslocalidades mostrando una distribución simpátrica.La mayor importancia epidemiológica de cada unade estas especies aparentemente está asociadacon la abundancia de sus poblaciones, es decir,

L. longipalpis en el valle alto y medio del ríoMagdalena (38) y L. evansi en la Costa Atlántica.Sin embargo, es necesario profundizar en estudiosecológicos que permitan establecer los rangosclimáticos determinantes de la misma.

Por medio de los mapas se estableció unaasociación de la distribución de L. longipalpis y L.evansi a localidades pertenecientes, especialmente,a la cobertura vegetal de bosque seco tropical;sin embargo, su distribución no está restringida aeste tipo de bosque. Este hecho podría darsedebido a que las dos especies en estudio tienenun comportamiento oportunista, de hábitoseclécticos que puede favorecer la colonizaciónde nuevos ambientes y, por lo tanto, permitirlesalcanzar una mayor distribución (19,39). Por otrolado, también es importante tener en cuenta quela base de datos se elaboró a partir de registrosde ejemplares recolectados en Colombia desde1967; en algunos casos la asociación de lasespecies a las zonas de vida puede no ser tanprecisa, dependiendo del grado de conservaciónde cada localidad en el momento del muestreo.Además, el alto grado de deforestación ha

Figura 5. Distribución de Luitzomyia evansi de acuerdo con el mapa de ecosistemas generalesde Colombia.

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favorecido el aumento de algunas poblaciones deflebótomos en zonas cercanas a asentamientosrurales (21) y la domiciliación de los vectorespuede darse de forma muy rápida (18,21,23,40).

Agradecimientos

Proyecto: Biogeografía y genética de flebótomosvectores de enfermedades, Instituto Nacional deSalud-Yale University. Instituto Alexander vonHumboldt, unidad de SIG.


Los autores declaran que no hubo ningún conflictode intereses.

Financiación

Instituto Nacional de Salud y Yale University viaU.S. National Institutes of Health, grant RO1AI056254 para LEM.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):73-81 FLEBOTOMOFAUNA EN VENEZUELA

ARTÍCULO ORIGINAL

Flebotomofauna al sureste del estado Lara, VenezuelaLuis Eduardo Traviezo

Sección de Parasitología, Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado", Barquisimeto, Venezuela.

Introducción. El reporte de 522 casos de leishmaniasis cutánea americana entre los años1988 al 2002 en el estado Lara (específicamente al sureste donde hubo un repunte), motivó elestudio de los vectores implicados en la transmisión.Objetivos. Determinar la abundancia, diversidad y distribución de flebótomos durante un añoen 11 poblaciones situadas entre los 600 y 1600 metros sobre el nivel del mar, relacionandosu abundancia con elementos climáticos.Materiales y métodos. Para las capturas se utilizaron trampas CDC (18:00 a 06:00 horas)colocadas en zonas domésticas, peridomésticas y selváticas de casas donde hubo casos deleishmaniasis cutánea y se utilizó trampa Shannon en los alrededores de éstas, entre las19:30 y las 22:50 horas.Resultados. Se identificaron 10.326 ejemplares (8.867 hembras y 1.459 machos) con unadiversidad de 11 especies, siendo Lutzomyia youngi (Feliciangeli & Murillo 1987), la másabundante con un 96,54%, seguida de Lutzomyia ovallesi (Ortiz, 1952) con 2,9%,caracterizándose L. youngi por tener predilección por los ambientes peridomésticos y seapreció mayor actividad desde las 19:30 a las 20:30 horas (Shannon). La población de LasMaticas (1360 msnm) presentó la mayor abundancia, con un pico anual que coincidió con elfinal del verano, las primeras lluvias del invierno (régimen unimodal), la mayor temperaturamedia mensual del año (24°C) y la menor humedad mensual del año (70%).Conclusión. Esta información permite conocer la población, ambiente y época del año dondese incremente la probabilidad de transmisión de la enfermedad, por la abundancia de lasespecies vectoras.

Palabras claves: Psychodidae, leishmaniasis cutánea, temperatura ambiental, lluvias,humedad, Venezuela.

Phlebotomine sandflies in the southeast of Lara state, Venezuela

Introduction. The report of 522 cases of American cutaneous leishmaniasis between the years1988 to 2002 in Lara State (specifically in the southeast where there was an increase of cases)prompted the study of the vectors species involved in transmission.Objective. To determine the abundance, diversity and distribution of sandflies during one yearin 11 populations located between 600 and 1600 meters above sea level and the relationshipof their abundance to climatic elements.Materials and methods. CDC traps placed in domestic, peridomestic and woodland areasaround houses where cases of cutaneous leishmaniasis had been reported were used for thecaptures (18:00 to 06:00 hours) and Shannon traps were used in the environs of these housesbetween 19:30 to 22:50 hours.Results: 10.326 specimens were identified (8.867 females and 1.459 males) with a diversity of11 species, where Lutzomyia youngi (Feliciangeli & Murillo 1987), was the most abundantspecies (96.54%), followed by Lutzomyia ovallesi (Ortiz, 1952) with 2.9%. L. youngi showedpredilection for peridomestic areas and presented greater activity from 19:30 to 20:30 hours(Shannon). The population of Las Maticas (1360 meters above sea level) presented the highestabundance with an annual peak which coincided with the end of the dry period and the firstrains of the rainy period (unimodal regime), the highest monthly average temperature (24°C)and the lowest monthly humidity of the year (70%).

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Biomédica 2006;26(Supl.1):73-81TRAVIEZO L.E.

Conclusion. This information allows us to know the population, climatic variables and time ofthe year when the probability of transmission of the disease increases due to the abundance ofthe vector species.

Key words: Psychodidae, leishmaniasis cutaneous, temperature, rain, humidity, Venezuela.

Correspondencia:Luis Eduardo Traviezo, UCLA, Decanato de Medicina,Avenida Libertador con Avenida Andrés Bello, Apartado 400,Barquisimeto, Estado Lara, Venezuela.Telefax: (0058) (251) 259 [email protected]


Los estados Táchira, Mérida y Trujillo (Andesvenezolanos) junto con el estado Lara concentranla mayor cantidad de casos de leishmaniasiscutánea americana de Venezuela; Lara ha sidoen determinados años, el que ha aportado la mayorcasuística en el territorio nacional. Tal fue el casoen el 2000 cuando se informaron 685 enfermos,más que los acumulados anualmente reportadosen los 10 años anteriores; el municipio AndrésEloy Blanco, al sureste del estado, presentó unaumento en el número de enfermos (110 casos)con sólo el 2,6% de la población del estado(Biomedicina. Casos de leishmaniasis cutánea pordistritos sanitarios. Comunicación personal.Venezuela, 2002), convirtiéndose en un área deimportancia epidemiológica.

En Lara se han adelantado diversos estudiossobre la fauna de flebótomos asociada a leish-maniasis, comenzando con la descripción de Ortizde tres especies nuevas: Lutzomyia ovallesi(Ortiz, 1952), Lutzomyia nuñeztovari (Ortiz, 1954)y Brumptomyia beaupertuyi (Ortiz, 1954)(Arredondo C. Flebótomos del Estado Lara.Memorias, III Simposio Venezolano deLeishmaniasis. Barquisimeto, 1987). Existe unvacío de información hasta 1972 cuando secomienzan a definir las especies presentes (1,2)llegando a una diversidad que alcanza las 24especies (3,4); sin embargo, específicamente enel municipio Andrés Eloy Blanco, hasta elpresente no se habían realizado trabajos.

Por esta razón, se realizó un estudio longitudinalde un año en poblaciones ubicadas a diferentesaltitudes, con los objetivos de determinar laabundancia, diversidad y distribución deflebótomos en ambientes domésticos,

peridomésticos y selváticos, actividad en lasprimeras horas de la noche e infección natural deespecies que pudieran estar comprometidas conla transmisión de la leishmaniasis cutánea yrelacionar estos datos con variables climáticas.


Área de estudio: el municipio Andrés Eloy Blancose encuentra al sureste del estado Lara,comprendido entre los 9°31´33´´- 9°49´23´´ N y69°20´26´´-69°43´43´´ O, con una precipitaciónmedia anual de 826,81 mm, una temperaturamedia anual de 22°C y una clasificación climáticade subhúmedo seco frío; presenta relieves entrelos 600 y los 2.000 msnm; los cultivos predomi-nantes son el café y las papas.

Dentro del municipio se seleccionaron 11 puntosde captura sobre la base de la casuística de leish-maniasis cutánea americana, así: Las Virtudes(1.000 msnm), Sanare (1.200 msnm), Las Maticas(1.320 msnm), Monte Carmelo II (1.600 msnm) yYacambu I (600 msnm), Yacambu II (800 msnm),Yacambu III (1.000 msnm), La Represa (1.000msnm), Periquito (1.200 msnm), La Escalera(1.250 msnm) y Monte Carmelo I (1.400 msnm).En estas últimas ocho poblaciones se hicieroncapturas esporádicas (22 en total) ya que suubicación presentaba problemas logísticos y deseguridad, mientras que en las cuatro primerasse hicieron capturas mensualmente capturas du-rante 12 meses (48 capturas, una captura/mes).

Métodos de captura: se colocaron tres trampasde luz CDC en cada población, la primera dentrode la casa seleccionada con casos de leishma-niasis cutánea (zona doméstica), la segunda enlos alrededores de la casa, específicamente,donde estaban los gallineros (zona peridoméstica)y la tercera en zonas boscosas a unos 30 m delas casas seleccionadas (zona selvática). Estastrampas CDC se encendían a las 18:00 horas yse recogían a las 07:00 horas del siguiente día.

También se utilizaron trampas de luz Shannonpero sólo en Las Virtudes, Sanare, Las Maticas y

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Monte Carmelo II; la misma se colocaba a 30 mde viviendas donde se habían presentado casosde leishmaniasis cutánea americana. Estastrampas se encendían de las 19:30 a las 20:30,se apagaba y se agitaba, volviéndose a encenderdesde las 20:40 hasta las 21:40 horas; se apagabay se encendía nuevamente de las 21:50 a las22:50; estos intervalos de 10 minutos eran paragarantizar que los flebótomos atrapados nocorrespondían a los atraídos de la hora anterior.

Transporte, montaje e identificación: losflebótomos recolectados se colocaban en jaulascon cubiertas de organdí, dentro de cavas depoliuretano con alta humedad para el traslado allaboratorio donde eran adormecidos con éter y,luego, colocados por separado en cápsulas dePetri con solución de detergente al 0,5% para re-mover los pelos y disminuir la tensión superficial;posteriormente, los machos se colocaron ensolución clarificadora de Nesbitt, durante 24 horaspara montarlos, luego, en solución de Berlese yprecisar las características morfológicas de lagenitalia y ascoides para compararlas con losdescritos en las claves (3,4); en las hembras seexaminaron las espermatecas y la armadura delcibario según claves citadas.

Determinación de infección natural: paradeterminar la infección natural con flagelados, seretiró la cabeza del cuerpo y se separó el tractodigestivo entero para, luego, examinarlos almicroscopio (600X). Los posibles flagelados seidentificaron según el lugar de ubicación en elintestino para, posteriormente, en caso de hallar

ejemplares infectados, aspirar con jeringa detuberculina e inocular en cultivos y en hámster.

Características climáticas: se analizaron losdatos hidrometeorológicos de cuatro estacionesclimáticas ubicadas en el municipio Andrés EloyBlanco (5) con el fin de conseguir la relación entrela abundancia de flebótomos y la oscilación de latemperatura media mensual, la humedad y laprecipitación acumulada mensual de la zona decaptura.

Resultados

Se evidenció la presencia de ejemplares de dosgéneros de Lutzomyia (França, 1924) yBrumptomyia (França y Parrot, 1921); el géneroLutzomyia presentó mayor abundancia ydiversidad de especies, 11, de las cuales,Lutzomyia youngi (Feliciangeli & Murillo 1987), fuela más abundante con 9.749 ejemplares (95,4%)de los 10.217 recolectados, seguido de L. ovallesicon 3,72% (380), de menor abundancia (cuadro1).Las otras nueve especies fueron escasas, menosdel 1% del total.

Con respecto a la altitud, L. youngi fue la especiepredominante en los pisos altitudinalesinvestigados de los 600 a los 1.400 msnm,abundando, principalmente, a una altitud de 1.360msnm; no se evidenció su presencia en lalocalidad de Monte Carmelo II a 1.600 msnm, apesar de haberse realizado doce capturas a lolargo de un año de estudio. En lo que a L. ovallesise refiere su distribución coincide con L. youngi aexcepción de la localidad ubicada a 1.400 msnm,

Cuadro 1. Distribución de especies, diversidad y abundancia según la altitud de cada localidad estudiada del municipioAndrés Eloy Blanco.

L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L. L.Población/altitud youngi ovallesi lichyi scorzai gomezi venezuelensis sp. cayenensis trinidadensis dubitans walkeri B. sp Total

Represa/600 m 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0Yacambu/ 600 m 9 25 0 0 0 0 0 4 0 0 0 11 49Yacambu/ 800 m 15 12 0 0 8 0 0 0 0 0 0 11 46Yacambu/1.000 m 46 51 0 14 0 2 0 0 0 0 0 66 179Las Virtudes/1.000 m 2 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 3Sanare/1.180 m 43 3 5 0 1 0 0 0 2 0 0 0 54Periquito/1.200 m 3 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 5La Escalera/1.250 m 9 4 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 15Las Maticas/1.360 m 9486 285 34 0 0 0 5 0 0 2 1 18 9.831Monte Carmelo/1.400 m 136 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 3 144Monte Carmelo/1.600 m 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0Total 9749 380 45 16 10 3 5 4 2 2 1 109 10.326

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es decir, un rango de dispersión desde los 600msnm hasta los 1.360 msnm., con mayorabundancia que L. youngi por debajo de los 1.000msnm.

En lo que respecta al registro de las otras nueveespecies (<1%), se encontró que su presenciaestuvo asociada a ciertas altitudes es así comode los 45 ejemplares capturados de L. lichyi (Flochy Abonnenc, 1950) 34 de ellos fueron recolectadosa 1.360 msnm, en Las Maticas; L. scorzai (Ortiz,1965) de 16 ejemplares, 14 de ellos a 1.000 msnmy L. gomezi (Nitzulescu, 1931) de 10 ejemplarescapturados ocho fueron atrapados a 800 msnm.En la población de Las Maticas se recolectaron9.831 ejemplares, con una diversidad de sieteespecies a saber L. youngi, L. ovallesi, L. scorzai,L. walkeri (Newstead, 1914), L. dubitans (Sherlock,1962), Lutzomyia sp. y Brumptomyia sp.

Con respecto a la variación de la población, sedeterminó que la especie predominante fue L.youngi que presentó un pico de mayor abundanciaal final de la estación seca de un régimen

Figura 1. Frecuencia mensual de Lutzomyia youngi en la población de Las Maticas (trampas Shannon y CDC) y su relacióncon la precipitación, humedad relativa y temperatura.

unimodal, recolectándose 2.786 ejemplaressolamente en esta captura/mes. En la figura 1 seobserva que el pico de abundancia coincidió conla mayor temperatura media mensual, 24°C, y unahumedad relativa mensual de 70% la cual fue lamás baja registrada en el año.

Esta variación de la población de L. youngi enLas Maticas, además, fue seguida en función dela actividad durante las primeras tres horas de lanoche (figura 2), evidenciándose que su mayoractividad fue entre las 19:30 y las 20:30 horas,disminuyendo progresivamente en 50% de las20:40 a las 22:50 horas, principalmente, entre losmeses de diciembre a mayo. La actividad de L.youngi en Las Maticas fue mayor en el ambienteperidoméstico (principalmente, en febrero, marzoy abril) seguido del área selvática (con mayorabundancia entre mayo y septiembre, noviembrey diciembre) y, por último, en el ambienteintradomiciliario (figura 3).

Con relación a las 8.867 hembras disecadas,ninguna de ellas presentó flagelados.

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(5-7). De aquí que, en el estado Trujillo, señalen aL. youngi como especie que predomina sobre los800 msnm hasta los 1.700 msnm, mientras queL. ovallesi lo refieren entre los 200 y los 1.800msnm (8).

En el estado Mérida reportan a L. youngi como laespecie más abundante en todos los pisosaltitudinales estudiados (superior al 58%), seguidode L. trinidadensis (Newst, 1922) y de L. ovallesi(9,10). Al nordeste del estado Táchira en los límitescon el estado Mérida describen a L. youngi comola especie más abundante y extensa del occidentevenezolano (11). En América esta especie se hareportado en Costa Rica y en Colombia, donde seseñala en el Valle del Cauca como la másabundante con 73% de los ejemplares capturados,seguido de L. lichyi con 21% (12,13).

Esto sugiere la importancia de esta especie en lazona, seguido de L. ovallesi, aunque menor enabundancia (3,72%); su característica de seraltamente antropofílica (6) y de haber sidoencontrada naturalmente infectada (3,14), laconvierten en el segundo probable vector de leish-maniasis en la zona, específicamente, en pisosiguales o inferiores a los 1.000 msnm., donde L.ovallesi fue más numerosa en las capturas queL. youngi, situación presentada también en elestado Anzoátegui en áreas de leishmaniasiscutánea y con una diversidad de 18 especies; aquíreportan a L. ovallesi también con total predominiopor debajo de los 1.000 msnm, específicamente,entre los 790 y 886 msnm, sin que se presente L.youngi a pesar de la diversidad (15,16).

Por otro lado, en el estado Bolívar (Venezuela)con una diversidad de 18 especies, L. ovallesi esreportada con apenas 0,2% de las capturas,mientras que L. youngi tampoco se identificó (17),lo cual reafirma el carácter limitado de L. youngien los Andes venezolanos (Táchira, Mérida, Trujilloy sur de Lara) entre los 760 a 1.800 msnm (3).

Otras especies capturadas fueron: L. gomezi y L.lichyi de hábitos antropofílicos y L. cayennensis(Floch y Abonnenc, 1941), L. venezuelensis (Flochy Abonnenc, 1948), L. scorzai, L. trinidadensis yBrumptomyia sp. Otro elemento interesante fueel hallazgo de L. walkeri, especie que no habíasido descrita para el estado Lara.

Figura 3. Porcentajes mensuales de abundancia deLutzomyia youngi en la población de Las Maticas enambientes doméstico (negro), peridoméstico (gris) yselvático (blanco).

Figura 2. Actividad horaria mensual de Lutzomyia youngien la población de Las Maticas expresada en porcentajes, alas 19:30-20:30 horas (negro), 20:40-21:40 horas (gris) y21:50-22:50 horas (blanco).

Discusión

Con la trampa Shannon se lograron capturas másnumerosas que con las CDC; no se hicieroncapturas sobre cebo humano para disminuir elriesgo de infección. En ambas trampas la especieque más abundó en todos los puntos de capturafue L. youngi; también, fue la especie con mayordispersión ya que se consiguió en todos los pisosaltitudinales estudiados (desde los 600 hasta los1.400 msnm) tal como lo refieren otros autores

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Con respecto a la actividad de L. youngi, se tieneque desde las 18:30 hasta las 19:30 es -de lastres horas estudiadas en trampa Shannon- cuandose presenta mayor riesgo de picadura por esteflebótomo. Esta mayor actividad en las primerashoras de la noche ha sido descrita anteriormenteen una zona próxima a Cali a 1.375 msnm,señalando que L. youngi presentaba un aumentoproporcional desde las 19:00 horas hasta las 21:00horas (máxima abundancia) (13). En el estadoMiranda, utilizando trampa Shannon, se señalóun incremento de L. ovallesi entre las 18:00 y las20:00 horas y en Trujillo se describió a L. ovallesicon un pico de abundancia de las 24:00 a las 01:00(7,18). Todo esto para indicar que existen horasde mayor actividad para cada especie,particularmente coincidiendo esta actividad conlas horas crepusculares.

Con respecto al estudio de las zonas domésticas(10% del total de ejemplares), peridomésticas(62%) y selváticas (28%) con trampas CDC, setiene que las zonas peridomésticas (gallineros)fueron las que presentaron mayor abundancia deL. youngi en todas las poblaciones estudiadas,con 535 ejemplares, seguido de 238 y 86especímenes en las áreas selváticas ydomésticas, respectivamente. Esta abundanciade L. youngi en los ambientes peridomésticos enAndrés Eloy Blanco es influenciada por la atracciónque ejercen las aves de corral y otros animalesperidomésticos sobre los flebótomos, elementodescrito en Brasil donde se observa que las avesy sus plumas son un poderoso atrayente para losflebótomos, especialmente, L. migonei (França,1920) y L. pessoai (Coutinho y Barreto, 1940) (19).

Desde el punto de vista climático, otro elementoque se apreció fue el máximo pico de abundanciaque ocurría en febrero, marzo y abril,especialmente, en marzo, cuando tanto en lastrampas Shannon como CDC, hubo un máximode capturas para L. youngi. Este pico máximocoincidió, en primer lugar, con el comienzo de laslluvias después del período de verano; en segundolugar con el período de mayor temperatura mediamensual (24°C); en tercer lugar, con el mes demenor humedad (70%) y, en cuarto lugar, con elmes cuando hubo menos precipitaciones. Por elcontrario, cuando las precipitaciones sobre-

pasaron los 47 mm/mes, las poblaciones de L.youngi se mantuvieron muy bajas (excepto enagosto cuando hubo un pequeño pico).

Esta relación entre elementos climáticos yabundancia de flebótomos ha sido descritatambién para L. youngi en Colombia señalandoprimero un pico de abundancia en agosto quecoincide con el final del período seco y el comienzode las primeras lluvias para, luego, caer laabundancia cuando estas lluvias sobrepasabanlos 90 mm y, en segundo lugar, que los picosnocturnos coincidían con la disminución de latemperatura y el aumento de la humedad (13);posteriormente, en la población de Las Calderas(1.350 msnm) del estado Trujillo, en una zonapróxima a áreas endémicas de leishmaniasiscutánea americana, se señaló la existencia dealtas poblaciones de L. youngi las cualespresentaron dos picos de abundancia parecidosa los de Andrés Eloy Blanco, uno en abril (90 mm/mes) y otro en agosto (31 mm/mes), apreciándoseun mínimo en diciembre cuando las lluviassobrepasaron los 120 mm/mes (20), simultá-neamente relacionaron la abundancia con elcomienzo del período de las lluvias.

En el estado Táchira se señala que los casos deleishmaniasis cutánea americana aumentanconsiderablemente en los dos meses que siguena las primeras lluvias después del verano, tal vezporque el pico de flebótomos también coincidiócon las primeras lluvias luego del verano,presentándose los casos un mes después delcontacto hombre-vector infectado (11).

Es importante lo discutido por otros autores queproponen que el aumento súbito de la abundanciade flebótomos corresponde a un aumento de laeclosión de las pupas; igualmente, la disminuciónque ocurre cuando la precipitación es máxima esel resultado catastrófico de las lluvias sobre laslarvas de los flebótomos (21). Basado en esto,pareciera que en la población de Las Maticas, laslarvas después del intenso período seco con altastemperaturas y baja humedad, esperan lasprimeras lluvias del invierno para despertar el relojbiológico de la eclosión de las pupas.

Con respecto a la abundancia y distribución deespecies en los distintos pisos de captura, se tiene

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que la mayor abundancia se localizó en lapoblación de Las Maticas: 1.320 msnm, 18,7°C,pluviosidad media anual de 1.200 mm y bosqueseco premontano; esta población coincide con otraabundancia de L. youngi a 1.375 msnm, reportadaen la población de La Guaira, departamento delValle del Cauca, Colombia (13) y a la descripciónen la población de Las Calderas, Trujillo,prácticamente a la misma altura (1.350 msnm),la cual se caracteriza por presentar tambiénabundancia de L. youngi, lo cual sugiere que losmeses más secos como los mejores para hacerlas capturas (21). Esto coincide con los hallazgosde este trabajo, en el que se encuentra un pico enel mes más caliente y seco que coincide con lasprimeras lluvias.

La segunda población que tuvo mayor abundanciade L. youngi fue Monte Carmelo, a 1.400 msnm.,seguido de Sanare 1.180 msnm. y Yacambú 1.000msnm, pero ya en esta última altura L. ovallesipresentaba mayor abundancia que L. youngi, loque podría sugerir que esta zona, entre los 1.180m. y los 1.400 msnm, es la altitud donde haymayor abundancia de L. youngi, con una limitantea partir de los 1.600 msnm, altura a partir de lacual no se detectó presencia de ninguna especiede flebótomos y por debajo de los 1.000 msnm,donde L. ovallesi podría ser por predominio, elvector incriminado en la transmisión.

Otro elemento que resaltó fue las capturas en lapoblación de Monte Carmelo que es la segundaen aporte de casos en el municipio y secaracteriza por presentar un relieve conpronunciadas pendientes; aquí se hicieroncapturas a 1.400 msnm y a 1.600 msnm; ladistancia que separaba a ambos puntos por lacarretera era de aproximadamente 2.000 m. Sinembargo, a los 1.400 msnm, las capturas fueronexitosas, mientras que a 1.600 msnm, y a lo largode un año, no se capturó ningún flebótomo. Es deresaltar que en la zona alta (1.600 msnm) nuncase habían presentado casos, lo cual indica que alos 1.600 msnm de altitud se presenta unalimitante para todos los flebótomos, especial-mente, para L. youngi y, por ende, una barrerapara la enfermedad. Esta relación también la indi-can en Trujillo, refiriendo que a partir de 1.600 yhasta los 1.900 msnm disminuía la población de

L. youngi (8) y, posteriormente, en el estadoMérida se señala un límite de altura de 1.600msnm para la captura de L. youngi (9,10).

Otra característica importante es que en lamayoría de los poblados de este municipio dondese reportaban casos de leishmaniasis cutánea,señalaban temperaturas medias anuales igualeso inferiores a 19°C; estas temperatura sondescritas por algunos autores como una limitanteen la transmisión de la enfermedad (22). Sinembargo en febrero, marzo y abril lastemperaturas aumentan hasta 4°C por encima dela media anual, temperaturas en las cuales nohay limitantes por la isoterma de 19°C siendo enlos meses más calurosos cuando se determinómayor abundancia de L. youngi. Por lo tanto, enesta época se presenta el momento ideal para latransmisión de la enfermedad y, por consiguiente,el siguiente trimestre (mayo, junio, julio) seidentifica por los pobladores como los mesescuando hay mayor número de casos, habiendotranscurrido el tiempo de incubación de laenfermedad y coincidiendo esto con el períodode lluvias (figura 1), incrementándose laasociación lluvia-leishmaniasis que establecen loshabitantes del municipio.

La ausencia de hembras infectadas conpromastigotes impidió la identificación de lasposibles especies de Leishmania implicadas enla transmisión; sin embargo, en el estado Trujilloya se habían señalado 4 de 1.872 hembras de L.townsendi (Ortiz, 1959) infectadas con L.braziliensis (Vianna, 1911). Es necesario señalarque L. youngi era descrita en estas zonas comoL. townsendi antes de 1987 (3,23).

En conclusión, se tiene que L. youngi es laespecie más abundante de las 11 descritas, conun predominio a los 1.320 msnm y en febrero,marzo y abril, específicamente, cuando latemperatura media mensual es máxima y lahumedad y las precipitaciones mensuales sonmínimas, lo cual permite potenciar las medidaspreventivas (uso de insecticidas, mosquiteros,etc.) en las zonas y en los meses descritos,logrando un uso más racional de los recursos einfluyendo directamente en el control y ladisminución de la transmisión de la leishmaniasiscutánea americana.

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Agradecimientos

Al personal de la Sección de Parasitología Médicade la UCLA, al personal del Laboratorio de Biologíade Lutzomyia (Centro JWT) ULA, Trujillo; al per-sonal del Ministerio del Ambiente-Lara y a lasfamilias Escalona, Pérez, Mendoza, Jiménez yBetancourt en el municipio Andrés Eloy Blancopor su valiosa colaboración.


Se tuvo acceso irrestricto a todos los datos delpresente estudio y asumo plena responsabilidadpor la integridad de los datos y la exactitud delanálisis.

Fuentes de financiación

El financiamiento provino del Concejo deDesarrollo Científico y Humanístico de laUniversidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”,CDCHT-UCLA (suministro de equipos y reactivos)y de la Dirección de Formación de PersonalAcadémico del Vicerrectorado Académico de laUCLA.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):82-94 SANTAMARÍA E., PONCE N., ZIPA Y., FERRO C.

ARTÍCULO ORIGINAL

Presencia en el peridomicilio de vectores infectados conLeishmania (Viannia) panamensis

en dos focos endémicos en el occidente de Boyacá,piedemonte del valle del Magdalena medio, Colombia

Erika Santamaría 1, Nubia Ponce 1, Yaneth Zipa 2, Cristina Ferro 1

1 Laboratorio de Entomología, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia.2 Secretaría de Salud de Boyacá, Tunja, Colombia.

Introducción. En el departamento de Boyacá, los casos de leishmaniasis registrados de 1997a 2003 muestran un aumento en la incidencia a partir del año 2000 que puede correspondera una epidemia en el occidente del departamento. Además, la distribución de casos por sexoy edad sugiere transmisión domiciliar.Objetivo. Definir los vectores de leishmaniasis cutánea en los municipios de Otanche y Pauna,por su asociación con el domicilio y por su infección natural con la misma especie de Leishmaniaaislada de pacientes.Materiales y métodos. Se recolectaron ejemplares de Lutzomyia con trampas CDC en el intray peridomicilio. La identificación del parásito se hizo, mediante PCR, a partir de muestras depacientes y en grupos de hembras de las especies de Lutzomyia más abundantes. Además seconfirmó la especie de parásito en muestras de pacientes por anticuerpos monoclonales.Resultados. En los dos municipios, L. trapidoi fue la especie antropofílica mas abundante eny alrededor de las viviendas. L. hartmanni y L. yuilli fueron también abundantes en Otanche; y,L. gomezi y L. panamensis en Pauna. Leishmania (V.) panamensis se identificó tanto enpacientes como en los flebótomos: L. yuilli, L. gomezi y L. panamensis.Conclusión. Nuestros resultados confirman la presencia de vectores de Leishmania panamensisinfectados naturalmente, en las viviendas de los municipios de Otanche y Pauna del Occidentede Boyacá. L. trapidoi por ser la especie más abundante puede ser considerada como elvector principal. La evidencia de transmisión doméstica permite planear la aplicación demedidas de control vectorial a este nivel.

Palabras clave: Vectores de enfermedades, Psychodidae, Leishmania, leishmaniasis, PCR,Colombia.

Presence of infected vectors of Leishmania (V.) panamensis within dwellings in two endemicfoci in the foothill of the middle Magdalena valley, western Boyacá, Colombia

Introduction. Case records of leishmaniasis of the years 1997 to 2003 of the department ofBoyaca showed that since the year 2000 the department experienced an unusual rise in theincidence of cutaneous leishmaniasis that might correspond to an epidemic outbreak in thewestern region of the department. Age and gender distribution of cases supported a domestictransmission.Objective. This research was designed to identify the vectors of cutaneous leishmaniasis in themunicipalities of Otanche and Pauna through their presence in dwellings and their naturalinfection with the same species of Leishmania isolated from patients.Material and methods. Sampling of sand flies was done with CDC traps in and around dwellings.Samples from patients and pooled females of the most abundant species of Lutzomyia wereused to identify the parasite by PCR. Monoclonal antibody typing was also used to confirm theidentification of the parasite in samples from patients.Results. In both municipalities L. trapidoi was the most abundant anthropophilic species ofLutzomyia indoors and around dwellings. L. hartmanni and L. yuilli were also abundant in


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Biomédica 2006;26(Supl.1):82-94 VECTORES DOMÉSTICOS DE L. PANAMENSIS EN BOYACÁ

Otanche, and L. gomezi and L. panamensis in Pauna. Leishmania (V) panamensis was identifiedboth in patients and in the sand flies: L.yuilli, L. gomezi and L. panamensis..Conclusion. Our findings prove the presence of infected vectors of Leishmania panamensiswithin dwellings in the towns of Otanche and Pauna in Western Boyacá. Since L. trapidoi wasthe most abundant species, it may be considered as the principal vector of Leishmania (V.)panamensis. The evidence of transmission within human dwellings warrants vector control atleast in this environment.Key words: disease vectors, Psychodidae, Leishmania, leishmaniasis, PCR, Colombia

Correspondencia:Cristina Ferro, Laboratorio de Entomología, Instituto Nacionalde Salud, Bogotá. [email protected]


Generalmente, los ciclos de transmisión de losparásitos en las leishmaniasis están definidos porla distribución geográfica de los insectos delgénero Lutzomyia, considerados vectores y porlas preferencias de estas especies por un tipoespecífico de hábitat. Esta distribución y estaspreferencias han cambiado en el tiempo por lainfluencia de factores climáticos, demográficos yprocesos de deforestación que han llevado a ladestrucción de los hábitat naturales de los vectoresy de los animales de los cuales se alimentan (1,Vélez ID. La leishmaniosis en Colombia: de laselva a la ciudad. Memorias, XXVIII CongresoSociedad Colombiana de Entomología, Pereira,2001).

Esto ha ocasionado que la leishmaniasis enColombia y en otras latitudes, haya pasado deser una enfermedad exclusivamente selvática queafecta hombres adultos que trabajan en el bosque,para sufrir un proceso gradual de domiciliación alacentuarse las preferencias de los flebótomos porel domicilio humano, modificando el lugar y lapoblación de mayor riesgo de infección, sindiscriminación de sexo y con mayor tasa deincidencia en niños (2,3).

A partir de la década de los 80 se registró ennuestro país la presencia de vectores en áreasasociadas con las viviendas (4). La mismasituación se ha documentado desde entonces enestudios de foco realizados en regiones andinas(5-7), valles interandinos (8,9) y en las costasCaribe (10) y Pacífica (11).

En el occidente del departamento de Boyacá laleishmaniasis cutánea tiene un carácter epidémico

desde el 2000. Para el período de 1991 al 2003se registraron las mayores prevalencias (entre55,4 y 6,1 casos por 1.000 habitantes), en cuatromunicipios localizados en el piedemonte del Valledel Magdalena Medio: Otanche, San Pablo deBorbur, Puerto Boyacá y Pauna (12).

La enfermedad se presenta, especialmente, en elárea rural y la distribución de los casos por gruposde edad y sexo indica que la población másafectada está por debajo de los 20 años,resultando un alto registro de casos en niños de 0a 5 años y presentándose de manera similar enhombres y mujeres (Datos sin publicarse,Laboratorio de Entomología INS, Secretaría deSalud de Boyacá). Estos datos permiten inferirque, al menos, una parte de la transmisión de laenfermedad en estos municipios puede estarasociada al domicilio.

Dada la importancia de la identificación de lasespecies vectores y de sus preferencias porciertos tipos de hábitat en el diseño de estrategiasde control basadas en el conocimiento de labiología de estas especies, el objetivo de esteestudio fue identificar los vectores de Leishmaniasp. en el ciclo de transmisión doméstico en eloccidente de Boyacá, teniendo en cuenta suabundancia en los ambientes relacionados conlas viviendas y la infección natural con la mismaespecie de Leishmania aislada de pacientes.


Área de estudio

Se seleccionaron las veredas con mayor registrode casos. En Otanche, se eligió la vereda ElCarmen (05.7768°LN, 74.2450°LO; 900 msnm),clasificada, según las zonas de vida de Holdridge,como bosque pluvial tropical (13). En Pauna serealizó el muestreo en las veredas Topito-Quibuco(05.6531°LN, 74.0160° LO), Topo Grande

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(05.6436°LN y 74.0231° LO) con una altitudaproximada de 1.100 msnm y clasificadas comobosque húmedo tropical (13). Según el mapa deecosistemas generales de Colombia, las áreasrurales de estos municipios del departamento deBoyacá están altamente intervenidas y, hasta1998, sólo conservaban 20% de la coberturavegetal original (14).

Búsqueda activa de casosy obtención de muestras de pacientes

Con el fin de obtener muestras de las úlceras delos pacientes para la identificación de los parásitosde Leishmania, se realizó una búsqueda activade nuevos casos. Se tomaron aspirados de lasúlceras en las que el frotis detectó las formasamastigotas y se inocularon en la nariz dehámsteres dorados (Mesocricetus auratus), loscuales se trasladaron al bioterio del InstitutoNacional de Salud en Bogotá, en donde despuésde realizar un seguimiento a los cambios físicos,se sacrificaron entre 28 y 74 días después de lainoculación.

Se obtuvo una biopsia de la nariz de cada animal,la cual fue dividida en dos partes; una porción semaceró y se sembró en tubos con medio NNN(7), mantenidos a 27°C y examinados diariamentepor 5 semanas en el microscopio invertido paradetectar formas flageladas (15). Los cultivospositivos se llevaron a cultivo en masa paraidentificar los parásitos hasta el nivel de especiepor anticuerpos monoclonales (15). La otra porciónde biopsia se almacenó en alcohol al 70% paraidentificar la especie de parásito empleando PCRpara subgénero y especie, las cuales se describenmás adelante.

Búsqueda de vectores en el domicilio

Se seleccionaron viviendas que tuvieranhabitantes con úlceras activas o con cicatricescompatibles con leishmaniasis que expresaranhaber adquirido la enfermedad recientemente(últimos 2 años) y habitar la vivienda en la mismaépoca de la infección. Se incluyeron 38 viviendas,17 en la vereda El Carmen, 12 en la vereda Topito-Quibuco y 9 en la vereda Topo Grande. Para losmuestreos se emplearon trampas de luz CDCactivadas entre las 18:00 y las 06:00 horas del

día siguiente, por dos o tres noches consecutivas,en dos meses de la estación seca y dos mesesde la estación lluviosa. Las trampas se instalaronsimultáneamente en cada vivienda en dos tiposde ambientes: el intradomicilio, definido en esteestudio como los dormitorios ocupados de lasviviendas, y el peridomicilio, definido como elambiente que rodea la vivienda incluyendo corralesde animales domésticos a una distancia no mayorde 10 m.

Además, se hicieron muestreos con trampas CDCy Shannon en relictos de bosques y cultivosaledaños a las viviendas entre 10 y 100 m de lavivienda (extradomicilio). Los insectos del géneroLutzomyia capturados se almacenaron en alcoholal 70% y se mantuvieron a -4°C hasta suidentificación y procesamiento por PCR.

Identificación taxonómica de Lutzomyia ,separación y almacenamiento en grupospara búsqueda de infección naturalcon Leishmania

Las hembras y los machos recolectados en losprimeros muestreos fueron tratados siguiendo lasmodificaciones de la técnica de Young (16) yMaroli et al. (17) e identificados hasta especieempleando las claves taxonómicas de Young yDuncan (18).

Una vez obtenida la composición de especies deLutzomyia de las zonas muestreadas, seseleccionaron aquéllas que serían almacenadaspara la búsqueda de infección natural conLeishmania por PCR, de acuerdo con trescriterios: sus antecedentes como vector, suantropofilia y su abundancia en el intra yperidomicilio. Para separar estas especies deotras presentes en la zona y entre ellas mismassin emplear el proceso químico de aclaración, seestablecieron las características morfológicasexternas diagnósticas tales como la pigmentaciónde mesonoto, la longitud de las venas en las alasy del quinto palpómero, entre otras.

La confirmación de la identificación se realizó enel 5% de los ejemplares o, por lo menos, en unejemplar de cada especie en cada muestreo, conla observación de las espermatecas, para lo cualse disecaron los últimos segmentos del abdomen,

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se aclararon en fenol y se montaron en bálsamode Canadá.

En un estudio previo de estandarización (19), seconfirmó que para la detección de infección conLeishmania en flebotominos por PCR, coniniciadores para subgénero Leishmania (Viannia),la sensibilidad de la prueba era óptima cuando seprocesaban hasta tres hembras, por lo cual en elpresente estudio las hembras separadas porespecie, estado trófico y presencia o ausenciade huevos maduros se almacenaron en gruposde una a tres en microtubos con alcohol al 70% yse mantuvieron a 4°C hasta su procesamiento porPCR.

PCR para detección e identificación deLeishmania en pacientes y vectores

La extracción del ADN de las biopsias dehámsteres inoculados y de los grupos de insectosse hizo con Chelex 100®, según el protocolopresentado por Cabrera et al. (20). Se constituyóun banco de muestras con el ADN extraído decada grupo y se almacenaron a -20°C hasta serusados como plantil la para la PCR. Seseleccionaron los iniciadores B1 (5’-GGG GTTGGT GTA ATA TAG TGG-3’) y B2 (5’-CTA ATTGTG CAC GGG GAG G-3’), los cuales sonespecíficos para el subgénero Leishmania(Viannia) y producen una banda de 750 pb,aproximadamente (21). Se hizo esta selecciónteniendo en cuenta que las especies del subgéneroLeishmania (Viannia) son responsables de 90%,aproximadamente, de los casos de leishmaniasisen Colombia (22) y la distribución geográficaconocida de las especies de Leishmania en elpaís indica que en la región noroccidental deldepartamento de Boyacá circulan especies deeste subgénero (23).

Con base en estos iniciadores se realizó la PCRen el ADN extraído de las muestras de pacientesy de cada uno de los grupos de insectos. Lasensibilidad y la especificidad de esta pareja deiniciadores para detectar infección por Leishmania(Viannia), así como las condiciones deamplificación ya han sido valoradas en pacientesy en flebótomos (19).

Los grupos de insectos o muestras de biopsiascon amplificación positiva con los iniciadores B1

y B2, fueron sometidos a una nueva PCR con elfin de clasificar hasta especie el parásitodetectado, para lo cual se emplearon losiniciadores p1 y p2, específicos para Leishmania(V.) panamensis (5’-GGT CGG ATC TGC ATGCAT CAC -3´)(5´-CAA AAA GCG AGG GAC TGCGGG -3´) y los iniciadores b1 y b2, específicospara Leishmania (V.) braziliensis (5´-GTG GGCGTA TCT GCT GAT GAC -3´)(5´-CAA AAA GCGAGG GAC TGC GGA -3´). Estos iniciadoresdirigidos a una secuencia genómica fueronreportados por Matsumoto et al. (23) y Mimori etal. (24) y sus productos de amplificación son de79 pb para L. (V.) panamensis y 110 pb para L.(V.) braziliensis.

En las PCR para subgénero y especie, seemplearon como controles positivos de la reacciónADN de las cepas de referencia de L. (V.)panamensis (MHOM/CO/87/CL-412), L. (L.)chagasi (MHOM/CO/84CL-044B) y L. (V.)braziliensis (MHOM/CO/86/CL-250) del InstitutoNacional de Salud. Como control negativo de lareacción se utilizó solución salina para lasmuestras de pacientes y para los grupos deinsectos, ADN de una hembra de L. ovallesiproveniente de una colonia de laboratorio.

Los productos de amplificación se analizaronmediante electroforesis horizontal en geles deagarosa (NuSieve: SeaKem, 3:1) al 2%, utilizandoTBE 1X (89 mM Tris HCl, 90 mM de ácido bóricoy 20 mM de EDTA, pH 8,3) como tampón decorrido. Los geles se tiñeron con 0,1 µg/ml debromuro de etidio (Sigma) y los productos sevisualizaron en un transiluminador de luzultravioleta.

Vectores y otras especiesde Lutzomyia en las viviendas

Teniendo en cuenta los insectos de Lutzomyiarecolectados, incluyendo las hembras procesadaspara la búsqueda de infección natural, se comparóla abundancia relativa de cada especie, la riquezay la diversidad de especies en el intra yperidomicilio en cada municipio.

La abundancia relativa se calculó como el totalde individuos de una especie dada sobre el númerototal de ejemplares recolectados; la riqueza fue

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el número de especies identificadas en cada sitio,y como índice de diversidad se calculó el de Fisherα, de acuerdo con la ecuación S=αln(1+N/α),donde S es el número de especies, N es el númerode individuos y a es una constante que representadiversidad (25). Como medida de endofagia paralas especies con antecedentes de antropofilia, sehizo una relación de los ejemplares capturadosen el intra y peridomicilio, la cual indica laproporción de ejemplares del peridomicilio quepotencialmente entrarán a la vivienda. Además,para sustentar la endofagia se determinó elporcentaje de hembras con sangre por especieen las capturas del intradomicilio.

Aspectos éticos

Los pacientes con úlceras firmaron un consen-timiento antes de que se les tomara el frotis directoy el aspirado de la lesión. Los casos positivos se

remitieron al hospital del municipio , en donderecibieron tratamiento. Los habitantes de lasviviendas donde se instalaron las trampas CDCfueron informados del objeto del estudio y dieronsu consentimiento. Todos los procedimientos parapacientes y para animales de laboratorio fueronaprobados por el Comité de Ética del InstitutoNacional de Salud.

Resultados

Especies de Lutzomyia encontradasy su relación con el domicilio

En el cuadro 1 se presentan las especies deLutzomyia encontradas en Otanche y Pauna, consu respectiva abundancia relativa en cada sitiode muestreo, así como los índices de endofagiay el porcentaje de hembras con sangre en elintradomicilio para aquéllas antropofílicas.

Cuadro 1. Número de ejemplares recolectados, abundancia relativa e índice de endofagia de las especies de Lutzomyia enlos municipios de Otanche y Pauna.

Especie de Intradomicilio Peridomicilio Hembras con sangre Endofagia 3

Lutzomyia (n1=47) (n1=44) en el intradomicilio 2

% % %

Otanche Pauna Otanche Pauna Otanche Pauna Otanche PaunaTotal (185) Total (497) Total (664) Total (1.926)

L. trapidoi 43,2 30,4 53,6 18,2 27,5 35,1 0,22 0,42L. hartmanni 26,5 2,4 11,3 0,7 2,1 0 0,65L. yuilli yuilli 10,3 4,4 14,0 11,3 10,5 40,9 0,20 0,10L. gomezi 0 24,3 0 26,1 30,6 0,24L. panamensis 0 20,7 0 34,4 13,6 0,15L. triramula 11,3 0 13,5 0,1L. ovallesi 1,1 3,6 0,1 1,6L. barretoi majuscula 0,5 0 2,7 0L. dubitans 1,1 0 1,2 0L. walkeri 2,1 2,8 1,5 1,2L. trinidadensis 1,1 0 0,1 0L. camposi 0 4,8 0,3 3,9L. shannoni 0,5 0,2 0,1 0,1L. saulensis 1,6 2,2 0,9 0,7L. sordelli 0 0 0,4 0,4L. serrana 0,5 2,0 0 0,2L. ayrozai 0 0,2 0 0,2L. lichyi 0 1,4 0 0,6L. dysponeta 0 0,4 0 0,2α de Fisher 2,86 2,67 2,29 2,39

1 n: número total de muestreos2 Porcentaje de hembras con sangre en el intradomicilio para especies antropofílicas3 Endofagia para las especies antropofílicas = número de ejemplares capturados en el intradomicilio/número de ejemplares

capturados en el peridomicilio

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En el municipio de Otanche, en la vereda ElCarmen, se recolectaron 849 individuos del géneroLutzomyia, 185 en el intradomicilio y 664 en elperidomicilio. La riqueza de especies fue similary se encontraron 12 especies en las capturas delintradomicilio y 13 en el peridomicilio. En ambossitios, L. trapidoi fue predominante, 43,2 y 53,6%en intra y peridomicilio, respectivamente. En elintradomicilio le siguieron en abundancia L.hartmanni (26,5%), L. triramula (11,3%) y L. yuilli(10,3%) y en el peridomicilio, L. yuilli (14,0%), L.triramula (13,5%) y L. hartmanni (11,3%). Encuanto al índice de endofagia, L. hartmanni y L.trapidoi presentaron los mayores valores, mientrasque las especies con mayor porcentaje dehembras con sangre en el intradomicilio fueron L.trapidoi y L. yuilli.

L. triramula se encontró con frecuencia en el intray en el peridomicilio en Otanche. Esta especie noes antropofílica; sin embargo, es atraída por laluz (26,27), lo que explica su abundancia en lascapturas realizadas con trampas que utilizan laluz como estímulo de atracción.

En Pauna, en las veredas Topito-Quibuco y TopoGrande, se recolectaron 2.423 individuos, 497 (14especies) y 1.926 (16 especies) en el intra yperidomicilio, respectivamente. En el intradomiciliopredominaron L. trapidoi (30,4%), L. gomezi(24,3%) y L. panamensis (20,7%) y en elperidomicilio, las mismas especies con diferentesabundancias, L. panamensis (34,4%), L. gomezi(26,1%) y L. trapidoi (18,2%). Los mayoresíndices de endofagia fueron para L. trapidoi y L.gomezi y los porcentajes de hembras con sangreen el intradomicilio fueron altos en L. yuilli y L.trapidoi.

Las demás especies se presentaron conabundancias bajas, inferiores al 5%, en losambientes muestreados. La diversidad deespecies fue ligeramente mayor en el intradomicilioen ambos municipios, debido a que en un númeroreducido de ejemplares se identificó un númeroconsiderable de especies. De las demás especiesencontradas se resaltan algunas antropofílicas ycon antecedentes vectoriales como L. ovallesi yL. shannoni; sin embargo, por su baja abundancia(menor al 1%) se descarta que puedan estar

involucradas en la transmisión de la enfermedaden ambientes asociados al domicilio.

Detección e identificación de Leishmania enpacientes y en grupos de Lutzomyia spp.

De las úlceras cutáneas de siete pacientespositivos en Otanche y seis en Pauna, setomaron aspirados y se inocularon en hámsteres,de los cuales, permitieron el desarrollo del parásito3 y 2 hámsteres, respectivamente.

Se obtuvieron cultivos viables del parásito a partirde biopsias de dos hámsteres procedentes decada uno de los dos municipios, los cuales fueronidentificados por anticuerpos monoclonales comode la especie L. (V.) panamensis.

Todas las biopsias procesadas por PCR,produjeron la banda diagnóstica de 750 pb conlos iniciadores para el subgénero Leishmania(Viannia). Al realizar la PCR especie-específica,se obtuvo amplificación positiva con losiniciadores para la especie L. (V.) panamensisen cinco de las biopsias y con los iniciadorespara L. (V.) braziliensis en una biopsiacorrespondiente a un paciente de Pauna.

En cuanto a la infección natural con Leishmaniaen hembras de Lutzomyia, el cuadro 2 presentael número de hembras procesadas por PCR paracada especie y el número de grupos conamplificación positiva para Leishmania (Viannia),empleando los iniciadores B1 y B2. Aparecen,además, los porcentajes de infección para cadaespecie y el sitio de recolección de las hembrascon respecto a las viviendas. En la figura 1 seaprecia la visualización del producto deamplificación con los iniciadores B1 y B2 parauno de los grupos.

En el municipio de Otanche se obtuvieron 2grupos positivos, ambos de L. yuilli, sin ingestiónde sangre, ni huevos maduros, procedentes delperidomicilio de una vivienda.

En el municipio de Pauna se detectó el parásitoen cuatro grupos, tres de la especie L.panamensis y uno de L. gomezi.

Dos de los grupos positivos de L. panamensiscorrespondían a hembras sin sangre ni huevosmaduros, capturadas en el peridomicilio de una

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Cuadro 2. Infección natural por Leishmania panamensis detectada por PCR en grupos de Lutzomyia spp. en los municipiosde Otanche y Pauna.

N. total de hembras procesadas por PCR (No. positivas para Leishmania *) en cada municipio

Especie Otanche Pauna

Intra- Peri- Extra- Total por % de Intra- Peri- Extra- Total por % dedomicilio domicilio domicilio especie infección** domicilio domicilio domicilio especie infección**

L. hartmanni 5 (0) 47 (0) 20 (0) 72 (0) 0 7 (0) 6 (0) — 13 (0) 0L. gomezi — — — — — 45 (0) 111 (1) 54 (0) 210 (1) 0,5L. panamensis — — — — — 64 (0) 334 (3) 98 (0) 496 (3) 0,6L. trapidoi 15 (0) 302 (0) 91 (0) 408 (0) 0 74 (0) 75 (0) 28 (0) 177( 0) 0L. yuilli 6 (0) 71 (2) 44 (0) 121 (2) 1,6 13 (0) 61 (0) 6 (0) 80 (0) 0Total por sitio 26 (0) 420 (2) 155 (0) 601 (2) 203 (0) 587 (4) 186 (0) 976 (4)de muestreo

* Los números entre paréntesis indican el número de grupos positivos para Leishmania.** Porcentaje de hembras infectadas, asumiendo una hembra infectada por grupo positivo

Figura 1. Detección de ADN de Leishmania (Viannia) conlos iniciadores B1 y B2 en un grupo de hembras deLutzomyia yuilli procedentes del peridomicilio de una viviendade Otanche.

vivienda, en la que en la misma época de lacaptura (noviembre de 2002) se encontraron doshabitantes con úlceras activas y examen directopositivo.

El otro grupo positivo de L. panamensis,correspondió a hembras con huevos maduros,capturadas en un peridomicilio de la vereda TopoGrande.

El grupo positivo de L. gomezi correspondía ahembras con sangre, capturadas en elperidomicilio de una vivienda de la vereda Topitoy Quibuco.

Los seis grupos positivos para Leishmania(Viannia) con los iniciadores B1 y B2, fueronprocesados nuevamente con los iniciadoresespecie-específicos, y se obtuvo amplificaciónpara L. (V.) panamensis (figura 2) en todos los

grupos. No se observaron productos deamplificación al procesar los insectos con losiniciadores b1 y b2, específicos para L. (V.)braziliensis (no se muestra el gel).

Discusión

La infección natural es uno de los criterios másimportantes en la incriminación de una especiede Lutzomyia como vector de Leishmania (28) yes el que presenta mayor dificultad en sudemostración (29,30). Actualmente, la PCR esuna técnica de alta sensibilidad utilizada confrecuencia en los estudios epidemiológicos deleishmaniasis para la detección e identificacióndel parásito en pacientes, reservorios y vectores.Es así como se ha detectado infección naturalpor Leishmania en varias poblaciones deflebótomos en Perú, Venezuela y Bolivia (31-33).

Carril 1: marcador de peso molecularCarril 2-5 y 7-13: grupos de L. panamensisnegativos para Leishmania (Viannia)Carril 6: grupo de Lutzomyia yuilli positivo paraLeishmania (Viannia)Carril 14: control negativo: ADN de 1 hembra de L.ovallesi de la colonia de laboratorio (INS)Carril 15: control positivo: cultivo de L.(V.)panamensis, cepa de referencia (INS)

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En el presente estudio, la PCR con los iniciadoresB1 y B2 permitió detectar infección natural conLeishmania (Viannia) en tres de las cinco especiesde Lutzomyia procesadas con esta técnica.Posteriormente, se estableció con los iniciadoresespecie-específicos que los grupos positivoscontenían el parásito L. (V.) panamensis, el cualfue aislado e identificado de pacientesprovenientes de las mismas veredas en las quese realizaron los muestreos de los flebotomíneosen ambos municipios.

Aunque, en este estudio L. trapidoi no fue halladanaturalmente infectada con Leishmania, Molina(34) en el área rural del municipio de Otancheencontró formas flageladas en 64 hembras de estaespecie. Sin embargo, el intento de aislamiento ycultivo de los parásitos fue infructuoso. Por otrolado, en el foco de leishmaniasis cutánea ubicadoen Landázuri, Santander, Muñoz (35) disecó 558hembras de L. trapidoi y observó flagelados en11 hembras, 2 de las cuales resultaron positivaspara parásitos del subgénero Leishmania (Viannia).

L. trapidoi es un vector confirmado de L. (V.)panamensis en otros focos de leishmaniasiscutánea en Colombia (11,29,35,36,), Panamá (37)y Ecuador (38). Es antropofílica y su capacidad

Carril 1: marcador de peso molecularCarril 2: control positivo, cultivo de L. (V.)panamensis, cepa de referencia (INS)Carril 3: control negativo, solución salinaCarril 4: cultivo de L (V.) braziliensis, cepa dereferencia (INS)Carril 5: ADN extraído de biopsia de hámsterinoculado con aspirado de una lesión activa de unpaciente del municipio de PaunaCarril 6: grupo de hembras de Lutzomyia gomezi

Figura 2. Productos de amplificación de la PCR coniniciadores especie-específicos para Leishmania (Viannia)panamensis en una muestra de un paciente de Pauna y enun grupo de Lutzomyia gomezi de la misma localidad.

para soportar el desarrollo de L. (V.) panamensisse ha confirmado en el laboratorio (39). En elpresente estudio, L. trapidoi fue la especie másabundante en el intradomicilio en ambosmunicipios y en el peridomicilio, también, presentóuna abundancia importante. Además, fue en laque más se registró presencia de sangre en lascapturas del intradomicilio lo que indicaindirectamente su habilidad para alimentarse enel interior de las viviendas. Estas característicasindican que L. trapidoi puede ser el vector primariode la enfermedad en estos municipios y participaren la transmisión de la enfermedad a niveldomiciliario.

En el municipio de Otanche se detectó infecciónpor L. (V) panamenisis en dos grupos de L. yuilli.En hembras disecadas de esta especie ya sehabían encontrado flagelados en Colombia (4) yBrasil (40,41) pero no se habían logrado identificar.Éste se constituye en el primer reporte deinfección con parásitos identificados deLeishmania en L. yuilli. En cuanto a su asociacióncon el domicilio humano, en el área de estudio, L.yuilli se encontró en el intra y peridomicilio enambos municipios, lo que sugiere que podría estarparticipando en el ciclo de transmisión doméstico

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de la enfermedad, especialmente, en Otanchedonde este vector es más frecuente. Esta especiehabía sido considerada como exclusiva de áreasboscosas en diferentes países de Suramérica (16)pero en los últimos años se ha demostrado suadaptación a ambientes modificados por el hombreencontrándose en cultivos, en el peri eintradomicilio (42,43) y se ha demostrado sucarácter antropofílico (44,45).

En el municipio de Pauna, L. panamensis y L.gomezi presentaron infección natural con L. (V.)panamensis; la primera presenta una ampliadistribución en Colombia, es antropofílica y vectorcomprobado de L. (V.) panamensis en Panamá(37); también, ha sido incriminada en latransmisión de L. (V.) braziliensis en Venezuela(46) y encontrada con flagelados no identificadosen Ecuador (47). En Colombia es la primera vezque se reporta infección natural por L.(V.)panamensis en 3 hembras de esta especie. Unode los grupos en los que se diagnosticó lapresencia del parásito L. (V.) panamensiscorrespondía a una hembra que presentabahuevos maduros, lo que indica indirectamente quela especie puede soportar el desarrollo del parásito,permitiendo su multiplicación, aún después de ladigestión de la sangre, por lo que se considera unvector potencial en el domicilio (48).

Por su parte, L. gomezi, es una especie reconocidapor su comportamiento antropofílico y endofílico,es considerada como probable vector en variasregiones endémicas de leishmaniasis cutánea enColombia (2,11,35); además, ha sido encontradanaturalmente infectada con promastigotes noidentificados en Panamá (49), Ecuador (50) yColombia (29,36). Recientemente, en Venezuelafue encontrada naturalmente infectada conparásitos identificados como L. braziliensis(46,51). La presencia de alimento sanguíneo enla hembra de L. gomezi encontrada infectada eneste estudio llevaría a discutir dos posibilidades:la primera es que la hembra se haya alimentadohoras antes de la captura de un reservorioinfectado o que se haya infectado con Leishmaniaen una primera alimentación y que acabara detomar su segunda o tercera alimentación desangre, lo cual colocaría a esta especie como unvector eficiente de Leishmania (48). Se ha

demostrado en infecciones experimentales queL. gomezi permite el completo desarrollo de L.(V.) panamensis en su tracto digestivo (39,52).

Tanto L. panamensis como L. gomezi, en elmunicipio de Pauna, fueron abundantes en el intray peridomicilio, lo cual está acorde con otrosreportes en los que se demuestra su habilidadpara adaptarse a ambientes modificados (53).Además, se ha verificado su ingreso alintradomicilio en diferentes focos de la enfermedadtanto en áreas rurales como periurbanas y urbanas(54,55).

En el presente estudio, los porcentajes deinfección natural en las especies procesadasoscilaron entre 0,5 (para L. gomezi) y 1,6% (paraL. yuilli), lo cual está acorde con los porcentajesencontrados en otras especies de Lutzomyia enSuramérica empleando la PCR (23,25) y el métodoconvencional (29,56,57). L. yuilli presentó elmayor porcentaje de infección natural, el cualposiblemente está asociado con una altaabundancia estacional de esta especie en la épocaen que se realizó el muestreo. Por otro lado, elsitio en el que fueron recolectados los ejemplaresencontrados naturalmente infectados conLeishmania en este estudio fue el peridomicilio,lo cual sugiere el lugar donde estas especiesactúan como vectores.

L. yuilli, L. gomezi y L. panamensis cumplen convarios de los criterios propuestos por Killick-Kendrick (28) para ser incriminadas como vectoresde L. (V.) panamensis en la zona de estudio. Sonespecies antropofílicas, tienen antecedentesvectoriales reportados, se presentan conabundancia en el peridomicilio en donde se creeque ocurre la transmisión y fueron encontradasinfectadas con la misma especie de Leishmaniaaislada de pacientes. Se sugiere, entonces, queestas especies toman parte en el ciclo domésticode transmisión del parásito en la región.

Por su parte, L. hartmanni es el vector comprobadode Leishmania colombiensis en Colombia; es unaespecie antropofílica y se encontró con frecuenciaen el intradomicilio en el municipio de Otanche;sin embargo, su papel como vector de L. (V.)panamensis en la zona de estudio está pordeterminarse.

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La colonización humana en las áreas rurales delos municipios estudiados es relativamentereciente y se ha acompañado de una progresivadevastación de los bosques ya sea para laexplotación de la madera, implementar cultivos ola construcción de viviendas. Esto ha ocasionadouna disminución en la diversidad de las especiesde flebótomos y de los animales silvestres de loscuales se alimentan, por lo cual prevalecenaquellas especies de Lutzomyia que se adaptanmejor a los ambientes modificados y ocupadospor el hombre. En estos ambientes las especiesde flebótomos llegan a presentarse en altasdensidades ya que encuentran su supervivenciagarantizada gracias a la estrecha relación con elhombre y sus animales domésticos y estacircunstancia incrementa el riesgo para loshabitantes de las zonas rurales de adquirir laenfermedad en el interior de su domicilio o en elambiente circundante al mismo (58).

Las especies más abundantes en el intra yperidomicilio en ambos municipios, L. trapidoi, L.hartmanni y L. yuilli en Otanche y L. trapidoi, L.gomezi y L. panamensis en Pauna, demostraronadaptarse exitosamente a hábitats degradados,son antropofílicas y se confirmó la presencia delparásito en tres de ellas por lo que se concluyeque están involucradas en el ciclo doméstico detransmisión del parásito en la región.

En los últimos años la domiciliación de latransmisión de la leishmaniasis se ha reportadode manera frecuente en Latinoamérica (59), lo cualcomo es discutido por Campbell et al. (59),presenta posibilidades de control a niveldoméstico. Sin embargo, para que las medidasde control sean exitosas se recomienda que,además de la definición de los vectores, seestudien parámetros de comportamiento como laactividad horaria de picadura y la endofilia de cadavector.

Agradecimientos

A Ángela Sandoval de la Secretaría de Salud deBoyacá por su colaboración en la toma ydiagnóstico de los frotis directos; a las autoridadesde salud de los municipios de Otanche y Paunapor su colaboración en la organización de lassalidas de campo; a Tania Tibaduiza y Marco Fidel

Suárez por su ayuda en la recolección del materialentomológico; a la comunidad de las veredas endonde se realizaron los muestreos por sucolaboración.

Conflicto de interés

No hay conflicto de interés.

Financiación

Instituto Nacional de Salud, Colciencias (proyectocódigo 2104-04-12677) y Secretaría de Salud deBoyacá.

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121

Biomédica 2006;26(Supl.1):121-30 LEISHMANIOSIS VISCERAL CANINA EN HUILA

ARTÍCULO ORIGINAL

Seroprevalencia de leishmaniosis visceral canina enla comuna 8 de Neiva y en cuatro municipios de

Huila, ColombiaJosé Fernández 1, Felio Bello 2, Myriam Consuelo López 3, Ligia Inés Moncada 3, Jimmy

Jolman Vargas 4, Martha Stella Ayala 5, Rubén Santiago Nicholls 3,5, Carlos Alberto Lozano 6

1 Grupo de Epidemiología y Salud Pública, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de La Salle,Bogotá, D. C., Colombia.

2 Laboratorio de Entomología, Biología Celular y Genética, Departamento de Ciencias Básicas, Universidadde La Salle, Bogotá, D. C., Colombia.

3 Departamento de Salud Pública, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D. C.,Colombia.

4 Departamento de Ciencias para la Salud Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia,Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D. C., Colombia.

5 Laboratorio de Parasitología, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D. C., Colombia.6 Secretaría Departamental de Salud del Huila, Neiva, Colombia.

Introducción. La leishmaniosis visceral canina en áreas endémicas de Colombia se constituyeen un factor de riesgo para la salud pública, dado el carácter zoonótico de la enfermedad.Durante el año 2004 se registraron 96 casos de leishmaniosis visceral humana en el país, delos cuales cinco correspondieron al departamento del Huila, zona de influencia del vectorLutzomyia longipalpis.Objetivo. Determinar la prevalencia de anticuerpos IgG contra Leishmania chagasi en suerosde caninos recolectados en los municipios de Rivera, Palermo, Villavieja, Algeciras y la comuna8 de la ciudad de Neiva, Huila, Colombia.Materiales y métodos. Se realizó una encuesta epidemiológica a los propietarios de 610caninos y previo consentimiento se llevó a cabo examen clínico general y recolección demuestra de sangre de cada una de las mascotas. Los sueros fueron analizados mediante eltest de ELISA empleando como antígeno promastigotes de Leishmania chagasi, de la cepaMHOM/CO/84/CL044B. El análisis de datos empleó estadística descriptiva.Resultados. En la población canina 85% fueron mestizos, la edad promedio fue 2,5 años y67,3% de los animales fueron machos. Al examen clínico las manifestaciones más frecuentesfueron: onicogrifosis 24,3%, linfadenitis 10% y lesiones cutáneas 5%. La frecuencia deanticuerpos IgG contra Leishmania chagasi en la comuna 8 de la ciudad de Neiva fue 28,1%,en Villavieja 28%, en Rivera 14,9%, en Palermo 10% y en Algeciras 5,1%. Adicionalmente, seobservó un promedio de cinco personas convivientes por canino seropositivo.Conclusiones. Estos datos demuestran la exposición de los caninos que habitan los ambientesrurales y urbanos de las zonas en estudio a Leishmania chagasi y deben tenerse en cuentapara el fortalecimiento de los programas de control y prevención de esta zoonosis en elSistema General de Seguridad Social en Salud.

Palabras clave: enfermedades de los perros, Leishmania, test de ELISA, Colombia.

Seroprevalence of canine visceral leishmaniasis in sector 8 of Neiva and in fourmunicipalities of Huila, Colombia

Introduction. Canine visceral leishmaniasis in endemic areas of Colombia could be a publichealth risk factor given the zoonotic nature of the disease. Ninety-six human cases of visceralleishmaniasis were reported in Colombia in 2004, 5 of them in Huila, where Lutzomyialongipalpis has been incriminated as the main vector species.Objective. To determine the prevalence of IgG antibodies against Leishmania chagasi in dogsfrom the sector 8 of the city of Neiva and the from the towns of Villavieja, Algeciras, Palermo andRivera located in Huila, Colombia.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):121-30FERNÁNDEZ J., BELLO F., LÓPEZ M.C. et al.

Materials and methods. An epidemiological survey was carried out in 610 dogs, which includedclinical examination and venopuncture for obtaining blood samples. Authorization was obtainedfrom the dog owners. The sera were analyzed by the ELISA test with promastigotes of the L.chagasi strain MHOM/CO84/CL044B as antigen.Results. The canine population had an average age of 2.5 years; 67.3% of the dogs weremales and the cross–bred animals were the most prevalent constituting 85% of those samples.On clinical examination the main signs were onicogriphosis 24.3%, lymphadenitis 10% andskin lesions 5%. The presence of antibodies was observed in 28.1% of the dogs from sector 8of Neiva, 28% in Villavieja, 14.9% in Rivera, 10% in Palermo and 5.1% in Algeciras. An averageratio of five people cohabitating per seropositive dog was observed.Conclusions. The results reflect the exposure to Leishmania chagasi infection of dogs living inboth urban and rural environments in the studied zones, and should encourage health authoritiesto carry out control measures to prevent the spread of this zoonotic disease.

Key words: dog diseases, Leishmania, enzyme-linked immunosorbent assay, Colombia

Los protozoarios intracelulares del género Leish-mania afectan al hombre y a otros mamíferos,entre ellos, los cánidos, en los que puedenocasionar un amplio espectro de procesospatológicos que van desde cuadros cutáneosautorresolutivos hasta procesos viscerales conconsecuencias fatales (1,2).

La forma visceral en el hombre es causada porLeishmania chagasi en América y podríaasociarse con la presencia simultánea de brotesde leishmaniosis visceral canina en razón a queel perro, debido a su estrecho contacto con elhombre, se constituye en el reservorio domésticomás importante dentro del ciclo de transmisión,compartiendo en zonas endémicas, los nichosecológicos de reservorios silvestres e insectosvectores (3-8).

La leishmaniosis visceral en los caninos es unaparasitosis con repercusión en medicinaveterinaria, en la cual la dificultad en el diagnósticoy la baja eficacia de su tratamiento constituyenobstáculos para el control de la enfermedad enzonas endémicas, convirtiéndose en un riesgopara la salud pública, dado el carácter zoonóticodel proceso (4-7,9).

Los focos más importantes de leishmaniosis vis-ceral en Colombia se encuentran distribuidos a lolargo de la cuenca del río Magdalena y susafluentes en los departamentos de Huila, Tolima,Cundinamarca, Bolívar, Sucre, Córdoba ySantander que corresponden a la distribución delos vectores Lutzomyia longipalpis y Lutzomyiaevansi (8,10). En el 2004 se registraron 96 casoshumanos de leishmaniosis visceral en el país, delos cuales, cinco correspondieron al departamentodel Huila, cuatro de éstos registrados en Neiva (11).

En Colombia, los estudios realizados en perrosincluyen los desarrollados en la Costa Caribe, enel corregimiento de Cerro Vidales y en el municipiode Montería, Córdoba, donde se informaronmediante exámenes parasitológicos prevalenciasde 8,33% y 26,17%, respectivamente; de la mismaforma, mediante prueba de inmunofluorescenciaindirecta se identificaron en los municipios deOvejas (Sucre), San Andrés de Sotavento(Córdoba) y El Carmen de Bolívar (Bolívar), conprevalencias entre 3,84% y 9,6% (12). Vélez etal. en un estudio ecoepidemiológico de leish-maniosis visceral en la comunidad indígena zenúde San Andrés de Sotavento, Córdoba, reportaronel 16% de los caninos seropositivos mediante laprueba de inmunofluorescencia indirecta (13).Otros trabajos en el interior del país han registradoseroprevalencias de 12,5% en el municipio deRovira (Tolima) y de 17,2% en caninos de 17veredas del departamento del Huila (12).

Corredor et al. (1989) (10) encontraronseroconversión de caninos centinelas en un rangode 4,4 a 8 meses, después del ingreso a la zona

Correspondencia:José Fernández M., Universidad de La Salle, Facultad deMedicina Veterinaria, Grupo de Epidemiología y Salud Pública,Calle 68 No. 49-47 Bloque 19, apartamento 503, Bogotá D.C.,Colombia.Teléfono (571) 630 8978; fax: (571) 677 [email protected]


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de estudio como parte de un programa de vigilan-cia epidemiológica en el municipio de Ricaurte(Cundinamarca), así mismo se aislaron cepas decampo a partir de los perros seropositivos, quefueron identificadas como L. chagasi.

La necesidad de una técnica más eficiente en eldiagnóstico de leishmaniosis visceral permitiódesarrollar diferentes tipos de pruebasinmunoenzimáticas como la prueba de ELISA consus diferentes variaciones (14). Para eldiagnóstico de la leishmaniosis visceral en perros,esta prueba tiene una sensibilidad de 98% y unaespecificidad entre 85% y 96% (15). En Colombiase estandarizó una prueba de ELISA con unasensibilidad calculada de 84,5% y unaespecificidad de 86,4% (Vega JC, López MC,Vargas JJ, Ayala MS, Nicholls RS, Bello F et al.Estandarización de la prueba de ELISA para elinmunodiagnóstico de la leishmaniasis visceralcanina. En: Agudelo C, editor. I Encuentro deInvestigadores en Salud Pública de la UniversidadNacional de Colombia. Bogotá: Instituto de SaludPública; 2003. p.80-9), técnica que puede serempleada en estudios seroepidemiológicosnecesarios para el diseño de estrategias deprevención y control de leishmaniosis en perros yhumanos (15-16).

El propósito de este trabajo fue determinar laprevalencia de anticuerpos IgG contra L. chagasipor la prueba de ELISA en sueros de perros,recolectados en los municipios de Rivera,Palermo, Villavieja, Algeciras y en la comuna 8de Neiva, departamento del Huila, Colombia.


Área de estudio

Se tomaron sueros de perros en los municipiosde Rivera, Palermo, Villavieja, Algeciras y en lacomuna 8 de Neiva (figura 1). Las condicionesecológicas corresponden a zonas climáticas debosque seco tropical con temperatura promediode 25,8OC, altitud entre 400 y 1.500 msnm y concasos reportados de leishmaniosis visceral enhumanos (12).

Población muestreada

Se estudiaron 610 perros, muestra aleatoriacalculada teniendo en cuenta la población de 1.620

perros, establecida en los registros de vacunaciónantirrábica del 2003 de la SecretaríaDepartamental del Huila. Para el cálculo deltamaño de muestra se usó una prevalenciaestimada de 17,2% y un nivel de confianza de95%. Las muestras fueron tomadas casa a casa.

Encuesta epidemiológica y examen clínico

Se hizo una encuesta epidemiológica a lospropietarios de las mascotas objeto de estudio,con el ánimo de obtener los siguientes datos:nombre del propietario, vereda o barrio, nombredel perro, edad, sexo, raza, historia de vacunación,dieta, condición corporal (1=delgado, 2=bajo depeso, 3=ideal, 4 y 5=sobrepeso) (17) y númerode personas que conviven con la mascota. En elexamen clínico se evaluó la apariencia generaldel animal y la presencia de lesiones como úlcerascutáneas, onicogrifosis o hipertrofia de las uñas,áreas depiladas o alopécicas, lesioneseritematosas y linfadenitis.

Recolección de las muestras

Para la obtención de suero se recolectaron 10 mlde sangre completa por venopunción de la venacefálica; las muestras se fraccionaron enalícuotas y se almacenaron a –20OC.

Prueba de ELISA

Se siguieron las condiciones descritas en VegaJC, López MC, Vargas JJ, Ayala MS, NichollsRS, Bello F et al. Estandarización de la pruebade ELISA para el inmunodiagnóstico de laleishmaniasis visceral canina. En: Agudelo C,editor. I Encuentro de Investigadores en SaludPública de la Universidad Nacional de Colombia.Bogotá: Instituto de Salud Pública; 2003. p-80-9.

Como antígeno se emplearon promastigotes deL. chagasi cepa MHOM/CO/84/CL044B obtenidosde cultivos en masa que se mantuvieron en mediolíquido de Schneider. Se emplearon placas de 96pozos Dynatech Inmulon I de poliestireno. Encada pozo se agregaron 100 l de antígeno a unaconcentración de 7,5 µg/ml en solución reguladorade carbonato-bicarbonato de sodio 0,05 M, pH 9,6.Se incubaron las microplacas durante tres horasen cámara húmeda a temperatura ambiente, y selavaron tres veces por cinco minutos con soluciónreguladora de fosfatos 0,15 M, pH 7,4 con Tween

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20 al 0,05%. Se dispensaron 100 µl de suero decada perro muestreado, por triplicado en dilución1:800 en solución reguladora de fosfatos conTween 20; se incubaron en cámara húmeda atemperatura ambiente durante dos horas y selavaron tres veces como se describióanteriormente. Se agregaron 100 µl de anti-IgGcanina marcada con fosfatasa alcalina en dilución1:6.000 por pozo y se incubaron en cámarahúmeda a 4°C durante 18 horas. Se lavónuevamente tres veces y se agregaron a cadapozo 100 l de 5-para-nitro-fenil-fosfato enproporción 1:1 (v/v) en solución reguladora dedietanolamina al 10%, pH 9,8, en unaconcentración de 1 mg/ml y las microplacas seincubaron durante 30 minutos a temperaturaambiente. Se agregaron 25 µl de solución dehidróxido de sodio 3N para detener la reacción.Las absorbancias se leyeron a una longitud deonda de 405 nm en un colorímetro UNISKAN I.Se consideraron como sueros positivos aquéllosque mostraron valores de absorbancias iguales a0,420.

Análisis de resultados

Con la información obtenida se construyó una basede datos en el programa EpiInfo 6.04, y sedeterminaron las frecuencias, que se presentanen los cuadros. Las seroprevalencias se ajustaronmediante la formula PA=(p+E-1)/(S+E-1)(PA:

prevalencia ajustada, p=prevalencia observada,S=sensibilidad, E= especificidad) metodologíadescrita por Ahlbom y Norell (18).

Aspectos éticos

El muestreo se llevó a cabo con el consentimientoprevio de los propietarios, que incluyo el derechoa no participar, siguiendo las normas éticas parael manejo de animales establecidas en el EstatutoNacional de Protección para los Animales, Ley84 de 1989 y las normas éticas para investigaciónsin riesgos en comunidades descritas en laResolución No. 008430 de 1993 del Ministerio deSalud que establece las normas científicas,técnicas y administrativas para la investigaciónen salud (19,20). La investigación fue aprobadapor el Comité de Investigación con Animales delInstituto Nacional de Salud.

Resultados

En la población canina muestreada, 67,2% eranmachos y 32,8% hembras; 59,2% de los perrostenían menos de dos años, con una edad promediode 2,5 años; la raza más frecuente correspondióa la mestiza con 85,2%. Con respecto al manejosanitario y nutricional de los animales, 44% noregistró historia alguna de vacunación, sólo el34,9% había recibido tratamiento antiparasitariorecientemente y 84,9% consumía únicamentedietas caseras.

Figura 1. Localización de los municipios muestreados en el departamento del Huila, Colombia, 2004.

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La condición corporal de las mascotas fue ideal(condición 3) en 50,8%; bajo de peso (condición2), 46,2%, y delgado (condición 1), 3%; no seobservaron animales con sobrepeso (condiciones4 y 5). Teniendo en cuenta la sintomatología com-patible con leishmaniosis visceral canina, 24,3%de la población muestreada presentabaonicogrifosis, 10% linfadenitis, 5% lesionescutáneas y 2,7% disminución del apetito.

Se encontraron 2.619 personas conviviendo conlos perros muestreados, 77,5% mayores de 10

años y 22,5% menores de 10 años, lo cualrepresenta una proporción general de cuatro per-sonas convivientes por perro y, en el caso de lapoblación infantil, de un niño conviviente por perro.

Se observó la presencia de IgG contra L. chagasien 118 de los 610 sueros evaluados (cuadro 1).Las seroprevalencias ajustadas por municipiomuestreado se observan en el cuadro 2; la totalidadde las muestras positivas recolectadas en Neivay Rivera provenían de la zona urbana, mientras queen Algeciras la totalidad de sueros positivosprovenían de zonas rurales. En el municipio de

Cuadro 1. Descripción de la población canina seropositivaevaluada mediante prueba de ELISA en cinco municipios deHuila, Colombia, 2004.

Variable n %

Población canina 1.620Total de perros muestreados 610Positivos a ELISA 118 19,34Seroprevalencia ajustada 8,1IC 95% 5,9-10,2Raza Mestiza 95 80,5 French Poodle 5 4,2 Boxer 3 2,5 Pincher 2 1,7 Otras 13 10Sexo Machos 81 68,6 Hembra 37 31,4 Relación macho/hembra 2:1Edad Promedio (años) 3,1 (±2,5) Edad más frecuente 2Sintomatología Asintomáticos 88 75 Sintomáticos 30 25Vacunación Ninguna vacuna 39 33 Antirrábica 76 65 No responde 3 2Tratamiento antiparásito Sin tratamiento 65 55,6 Con tratamiento 52 44,4Alimentación Casera 94 80 Mixta 13 11

Concentrado 10 8,5Procedencia Del mismo lugar 84 71 Otro 34 29Personas convivientes Total 493 100 Adultos 277 56 10 a 18 años 95 19 Niños 124 25 Cuadro 3. Discriminación por grupos de edad de la población

humana que convive con perros seropositivos a leish-maniosis visceral en los municipios muestreados de Huila,Colombia, 2004.

Municipio Promedio de personas convivientescon un perro seropositivo

<10 años 10 a 18 años >18 años

Neiva 1,5 1,2 3,1Villavieja 0,8 0,7 19Rivera 0,7 0,4 1,6Palermo 0,6 0,4 2Algeciras 2,25 1 4Total 1,1 0,8 2,3

Cuadro 2. Seroprevalencia de leishmaniosis visceral caninaobtenida en municipios de Huila, Colombia, 2004.

Municipio Variable n %

NeivaTotal muestras 153Perros positivos 43 28,1Seroprevalencia ajustada 20,45IC 95% 14,05-26,08

VillaviejaTotal muestras 152Perros positivos 41 28Seroprevalencia ajustada 20,3IC 95% 13,9-26,7

RiveraTotal muestras 138Perros positivos 20 14,9Seroprevalencia ajustada 1,8IC 95% 0,4-4,0

PalermoTotal muestras 90Perros positivos 9 10

AlgecirasTotal muestras 78Perros positivos 4 5,1

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Villavieja, 21,9% de las muestras positivasprovenían de zona rural y 78,1% del casco urbano;en Palermo, 60% provenía de zona urbana y 40%de zona rural (cuadro 2).

Como se describe en el cuadro 1, en la poblacióncon anticuerpos contra L. chagasi, el promediode edad fue de 3,1 años y 80,5% correspondió aperros mestizos. En el examen clínico, 75% delos animales seropositivos fueron asintomáticosy las manifestaciones clínicas más frecuentes enla población sintomática fueron: onicogrifosis,24,8%; linfadenitis, 12,8%; alopecia, 5,2%, yemesis, 4,3%. Con respecto a la procedencia delos perros seropositivos, debe tenerse en cuentaque 29% fueron introducidos al área de estudio.

Los resultados obtenidos muestran que 493 per-sonas se encuentran en contacto con los perrosseropositivos (cuadro 1). En la población mayorde 18 años del municipio de Algeciras, cuatropersonas en promedio convivían con un perroseropositivo; similar situación se presentó enNeiva donde tres personas adultas en promedioconvivían con un perro seropositivo (cuadro 3).Los municipios de Palermo, Villavieja y Riveramostraron promedios similares de contacto de lapoblación adulta con perros con anticuerpos(cuadro 3).

En la población humana menor de 10 años, ladistribución fue similar a la observada en lapoblación adulta en cada municipio pero disminuyóel promedio de conviventes por perro seropositivo(cuadro 3). Por otro lado, el promedio de perso-nas entre 10 y 18 años de edad que convivíancon un perro seropositivo fue menor con respectoal promedio de convivientes en los demás gruposde edad.

Discusión

Las áreas objeto de estudio se encuentranubicadas por debajo de los 1.750 msnm y tienenlas condiciones geoecológicas para la transmisióny la proliferación de leishmaniosis visceral, hechoque se correlaciona con lo reportado por Vélez etal. (13) y Corredor et al. (21) quienes incluyeron aldepartamento del Huila como uno de los focos enColombia de leishmaniosis visceral (10,13).

En este estudio se observó la presencia de perrosinfectados tanto en zonas rurales como urbanas

del departamento del Huila, lo cual se podríaexplicar por el desplazamiento de la población ysus mascotas a las ciudades, a la presencia dereservorios y vectores a nivel urbano y a lacirculación de los perros entre los ambientessilvestres y domésticos, como lo describenParanhos-Silva et al. (22) y Silva et al. (23).

Las diferencias de seroprevalencia ajustadasobtenidas en Neiva (20,4%) y Villavieja (20,3%)con respecto a los demás municipios, podríanindicar variaciones en la densidad tanto devectores como de perros, similar a lo descrito porBusch et al. (24) y Ciaramella et al. (25); sin em-bargo, los porcentajes de positividad deanticuerpos obtenidos en los municipios deAlgeciras, Palermo y Rivera son similares a lasobtenidos en otros estudios realizados en zonasrurales de Colombia (12).

Teniendo en cuenta las variables asociadas conla leishmaniosis visceral en perros de zonasendémicas, el sexo no se constituyó en undeterminante negativo debido a que la proporciónde hembras y machos seropositivos fue similar;no obstante, el número de machos en la poblaciónes mayor al de hembras, probablemente por lapreferencia de los propietarios a la tenencia demachos. La edad es un indicador del grado detransmisión de la infección; Moreno y Alvar (26)reportaron que en los casos de leishmaniosis vis-ceral canina las prevalencias son mayores enanimales de hasta tres años de edad.

Los resultados obtenidos muestran un promediode edad para la población general de 2,5 años ypara la población seropositiva de 3,1 años, datosque permiten inferir que las prevalencias obtenidasse relacionan con una población joven. EnColombia se ha descrito que la supervivencia deperros infectados en focos endémicos no esmayor a dos años de edad (21). Teniendo encuenta que el promedio de edad en los animalesseropositivos fue mayor, podría pensarse queestos animales se han infectado de forma tardíao se mantienen en el estado de asintomáticosque correspondió al 75% de la poblaciónseropositiva muestreada.

Aunque la linfadenitis y la onicogrifosis son signosinespecíficos que se pueden presentar en

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diferentes patologías caninas, cuando estossignos se presentan con el antecedenteepidemiológico de vivir o haber vivido en zonaendémica, podría sugerir la presencia de leish-maniosis visceral canina, como lo describióCiaramela et al. (25).

En Colombia, según Vélez et al. (13), la mortalidadde perros en áreas endémicas puede alcanzar25%, cifra similar a la obtenida en los perrosseropositivos sintomáticos muestreados, loscuales tendrían una mayor probabilidad de morira causa de la infección. La talla, raza y peso delos animales no constituyeron variablesimportantes, como fue descrito por Moreno y Alvar(26).

Los casos de leishmaniosis visceral canina enáreas endémicas donde de forma concomitantese presenta la entidad en humanos han sido repor-tados desde los primeros aislamientos realizadosen 1908 por Nicolle y Compte en Túnez (24).

En Colombia, en el 2003 se registraron 121 casosen humanos que disminuyeron a 96 en el 2004;sin embargo, en la zona de estudio el número decasos pasó de dos en el 2003 a cinco en el 2004(11). Es posible que exista una asociación entreleishmaniosis visceral humana y canina, ya quelas mascotas se convierten en reservorios de laentidad en los ambientes domésticos en dondenormalmente habitan generando un factor deriesgo para las personas que conviven con ellassiempre y cuando exista la presencia del vectorL. longipalpis, el cual ha sido descrito en focosbien estudiados que incluyen la zona de estudio(11,21,22,27,28).

Aunque se considera que los perros de las áreasrurales son los más afectados, la infección se hareportado en regiones urbanas y suburbanas depaíses como Brasil en las ciudades de Boa Vista,Santarém, Terezina, São Luis, Natal, Aracajú,Montes Claros, Belo horizonte, Araçuaí, Sabará,Perdões, Rio de Janeiro y Cuiabá así como enVenezuela en el área úrbana de Valencia en elestado de Carabobo y en la isla de Margarita (14,29-31).

En Colombia son pocos los trabajos realizadoscon respecto a la situación de la leishmaniosis

visceral canina en zonas urbanas; sin embargo,en este estudio se encontró una seroprevalenciaajustada de 20,45% en Neiva, dato que contrastacon los resultados obtenidos a nivel rural dondese han observado seroprevalencias que varíanentre 3,8% y 17% en diferentes zonas deColombia (12). La sensibilidad del 84,5% y lasensibilidad del 86,4% de la prueba de ELISA nopermitió ajustar las seroprevalencias de losmunicipios de Algeciras y Palermo (cuadro 2).

Actualmente, se considera que el patrón detransmisión de las leishmaniosis está cambiandoen Colombia (28,32), hecho que se evidencia conla aparición de brotes de leishmaniosis cutáneaen personas que habitaban ciudades comoSincelejo (28), Bucaramanga (33), Remedios (34),Villeta y Quebradanegra (35) y de igual forma conla demostración de la presencia de vectoresincriminados en la transmisión en zonasperiurbanas de ciudades como Medellín (32).

En la actualidad, se discute cómo la leishmaniosisvisceral se encuentra en un nítido proceso detransición epidemiológica, identificado por unaincidencia creciente en áreas endémicas y suexpansión geográfica a zonas no endémicas,incluso a zonas urbanas (14). En Colombia, yase reportan casos de leishmaniosis visceral enniños sin nexos epidemiológicos con zonasendémicas rurales en Sincelejo (28) y de la mismaforma, en Neiva, donde se desarrolló parte de esteestudio, se reportaron dos casos en el 2003 ycuatro casos en el 2004, en la población infantil(11).

Todos estos factores hacen sospechar que losperros pueden tener un papel preponderante dentrode la nueva ecoepidemiología de la leishmaniosisvisceral en zonas urbanas y, específicamente,en el departamento del Huila, más aún, si se tieneen cuenta que se observaron parásitos del géneroLeishmania en cultivos preparados a partir de lostejidos de dos perros seropositivos procedentesde la comuna 8 de Neiva y que el perro esconsiderado el reservorio doméstico másimportante, con capacidad de establecer patronesenzoóticos silenciosos debido a su mayorprobabilidad de contacto con los vectores yreservorios silvestres en su hábitat natural (24).

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Sin embargo, hay que tener en cuenta que laimportancia del perro como reservorio no debeasumirse solamente en zonas endémicas; enzonas no endémicas como los Estados Unidos,se reconoce hoy la importancia y el impacto anivel de salud pública de esta enfermedademergente en los perros (27).

En este estudio, el mayor promedio de personasen contacto por perro seropositivo se observó enel municipio de Algeciras. Sin embargo, laseropositividad fue la menor del estudio,posiblemente a causa de que el área de muestreose encontraba a nivel periurbano y la densidad dela población por domicilio era alta.

En Neiva la seroprevalencia y el promedio deconvivientes por perro seropositivo fueron altos; sise tiene en cuenta la alta densidad de poblacióntanto humana como canina por unidad de área anivel urbano, el riesgo potencial de transmisióncuando existe la presencia de vectores adecuadospodría incrementarse (32). Lo anterior podríaexplicar el aumento de la incidencia de casoshumanos observados en Neiva.

Es necesario tener en cuenta que las poblacionesen riesgo de contraer la infección en áreas dondeconfluyen tanto reservorios como vectores, sonprincipalmente niños y adultos inmuno-comprometidos. En este estudio, aunque no secontempló el estado inmunológico de las perso-nas, se observa que el promedio de personasadultas convivientes mayor de 18 años es el másalto para todas las áreas muestreadas y estaseguido por la población infantil menor de 10 años,grupo de edad en la cual se reportan la mayoríade casos de leishmaniosis visceral (15,16,28).

De esta forma, el presente trabajo confirma laendemicidad de la infección en los caninos de losmunicipios muestreados y alerta sobre lapresencia de perros seropositivos en zonasurbanas. Esta situación sugiere el urgentefortalecimiento de los programas de prevención ycontrol de leishmaniosis visceral en el SistemaGeneral de Seguridad Social en Salud, en espe-cial, en Neiva y Villavieja donde un alto porcentajede perros que habitan las áreas urbanas muestranla presencia de anticuerpos frente a la infecciónpor L. chagasi.

En Latinoamérica la urbanización de las leishmani-osis es un fenómeno creciente y el riesgo decontraer la infección puede incrementarse si nose controla el contacto de los vectores y lapoblación humana con reservorios infectadoscomo los perros.

Agradecimientos

A los estudiantes de Medicina Veterinaria de laUniversidad de La Salle; a Martha Páez, ArnulfoAbril y John Penagos, por su colaboración en larecolección de material a nivel de campo. A losfuncionarios de salud ubicados en el Centro deZoonosis de Neiva y en los Centros de Salud delos municipios del área de estudio, por sucolaboración en sensibilización de la comunidady en la recolección del material de campo. A lacomunidad de los municipios estudiados porfacilitar las mascotas que permitieron llevar a caboeste estudio.


En la realización del presente trabajo no sepresentó ningún conflicto de interés financiero,político ni académico.

Financiación

El presente estudio se realizó con el apoyoeconómico de la Universidad de La Salle, laUniversidad Nacional de Colombia, el InstitutoNacional de Salud y la Secretaría Departamentalde Salud del Huila.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):131-44 LEISHMANIA PANAMENSIS EPIDEMIOLOGY

ARTÍCULO ORIGINAL

Leishmania panamensis transmission inthe domestic environment:

the results of a prospective epidemiological survey inSantander, ColombiaGerardo Muñoz 1, Clive R. Davies 2

1 Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Salud, Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga,Santander, Colombia.

2 Department of Infectious and Tropical Diseases, London School of Hygiene and Tropical Medicine, London,United Kingdom.

Introduction. Domestic transmission now appears to be the principal route of Leishmaniapanamensis infection in deforested regions characterized by the replacement of primary forestby permanent plantations, i,e coffee or cacao crops. This paper presents the results of thedisease patterns in a representative population of the Opón focus, in Santander, Colombia.Objective. The principal aims were: 1) to measure the incidence rate in a representativepopulation of the Opón focus; 2) to identify demographic risk factors for infection; 3) to estimatethe proportion of infections which cause disease; 4) to estimate the protection against diseasefrom acquired immunity; 5) to estimate the frequency of reactivations, and 6) to estimate the riskof mucosal leishmaniasis.Material and methods. A 19 month prospective survey of leishmaniasis caused by Leishmaniapanamensis was carried out amongst 1380 people in a cacao growing region of SantanderDepartment, Colombia. The population was diagnosed clinically and by the Montenegro skintest (at two time points).Results: The incidence rate was 0.19 infections/person-year, with 31% of infections apparentlysubclinical. The risk of acquiring cutaneous leishmaniasis decreased with age even in theabsence of apparent previous infections. Protective immunity followed both clinical andsubclinical infections, persisting for at least 10 years after a primary lesion. Mucocutaneousleishmaniasis was detected in 12% of the population with cutaneous lesions, of which 77% hadmild symptoms, and 23% perforated nasal septa. The risk of mucosal leishmaniasis was greatestfor males, and for people whose primary cutaneous lesion was on the head.Conclusion. The average age of infection in Opón, 7.7 years (1/λ), and the absence of genderas a risk factor is highly indicative of intradomiciliary or peridomiciliary transmission.

Key words: Leishmania, epidemiology, cutaneous leishmaniasis, mucocutaneousleishmaniasis.

Transmisión de Leishmania panamensis en ambientes domésticos: resultados de unestudio epidemiológico prospectivo en Santander, Colombia

Introducción. La transmisión doméstica de Leishmania panamensis parece ser la fuente deinfección mas frecuente en regiones deforestadas, caracterizadas por el reemplazo del bosqueprimario por plantaciones permanentes como cacao y café. Este papel presenta los resultadosde los patrones de enfermedad en una población representativa del foco del Opón, enSantander, Colombia.Objetivo. Los objetivos principales fueron: 1) cuantificar la tasa de incidencia en una poblaciónrepresentativa de la población del foco del Opón; 2) identificar los factores de riesgodemográficos para la infección; 3) estimar la proporción de infecciones que causan enfermedad;4) estimar la protección contra la enfermedad según la inmunidad adquirida; 5) estimar lafrecuencia de reactivaciones, y 6) estimar el riesgo de leishmaniasis mucosa.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):131-44MUÑOZ G., DAVIES C.R.

Materiales y métodos: Se llevó a cabo un estudio prospectivo de leishmaniasis causada porLeishmania panamensis durante 19 meses, entre 1.380 personas habitantes de una regióncacaotera del departamento de Santander, Colombia. La población fue diagnosticada porclínica y por la prueba de Montenegro (en dos tiempos).Resultados: La tasa de incidencia fue de 0,19 infecciones/persona-año, 31% de los cualestuvieron una infección aparentemente subclínica. El riesgo de adquirir leishmaniasis cutáneadecrece con la edad aún en ausencia de infecciones previas aparentes. Una inmunidadprotectiva subsiguió a las infecciones clínicas y subclínicas, persistiendo por lo menos durante10 años posterior a una infección primaria. La leishmaniasis mucocutánea se detectó en 12%de la población con lesiones cutáneas, de las cuales 77% tuvieron síntomas no severos, y23% perforación del tabique nasal. El riesgo de leishmaniasis mucosa fue más grande parahombres y para personas cuyas lesiones primarias se localizaron en la cabeza.Conclusión. El promedio de edad de infección en el Opón, 7,7 años (1/λ), y la ausencia defactores de riesgo relacionados con el género indican que la transmisión es intra o peridomiciliaria.

Palabras clave: Leishmania, epidemiología, leishmaniasis cutánea, leishmaniasismucocutánea.

Leishmania (Viannia) panamensis is responsiblefor zoonotic cutaneous leishmaniasis and occa-sionally mucocutaneous leishmaniasis in eightcountries in Central and South America (1,2). Thetotal number of human cases caused by L.panamensis annually is unknown, as i) most cu-taneous leishmaniasis cases are not reported (3),ii) L. panamensis is often sympatric with otherLeishmania species responsible for cutaneousleishmaniasis (e.g. Leishmania braziliensis), andiii) the Leishmania species responsible for the re-ported cases are rarely identified.

However, on the basis of those few human isolateswhich have been characterized, it appears thatabout half of all cutaneous leishmaniasis casesreported each year within the eight endemiccountries are due to L. panamensis (2). Thispercentage varies from less than 1% in Guatemalato over 90% in Panama and Costa Rica. InColombia, about 50% of all cutaneousleishmaniasis cases reported are due to L.panamensis; but this represents the greatestnumber of reported cases caused by L.panamensis in any country (an estimated 3,000/year) (2).

The geographic distribution of L. panamensis co-incides with the overlapping distribution of the two-toed sloth Choloepus hoffmanni thought to be theprincipal reservoir host, and the sandfly speciesLutzomyia trapidoi and Lutzomyia ylephiletor,thought to be the principal vectors (4). Hence, theclassical risk factors for human infection, as de-scribed in Panama (5) and on the Pacific coast ofColombia (6) involve occupational exposure to in-fectious sandfly bites when adult male humansenter the forest.

Indeed, the requirement of forest habitat for thesurvival of sloth populations led Herrer andChristensen to write optimistically in 1976 that the“increased deforestation activities by new immi-grants to provide more farm land may soon dis-rupt the transmission cycle of Leishmania whichwill lead to the disappearance of the disease.” Infact, the history of the last 25 years is that whilethe deforestation of endemic areas has continuedunabated, the incidence rate of L. panamensis hasincreased steadily. How has this been possible?

Part of the answer lies in the changing patterns ofL. panamensis transmission. Persistently endemiccommunities, characterised by a high prevalenceof active lesions in children and apparent domestictransmission, were occasionally detected inPanama in the 1970s, e.g. in El Aguacate (7).However, this epidemiological pattern has onlyrecently become widespread, with all householdmembers now apparently at risk of infection in

Corresponding:Gerardo Muñoz M., Departamento de Ciencias Básicas,Facultad de Salud, Universidad Industrial de Santander,Carrera 32 Nº 29 - 31, Bucaramanga, Santander, Colombia.Phone number and fax: (577) 645 [email protected]


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many endemic zones of L. panamensis. For ex-ample, domestic transmission now appears to bethe principal route of L. panamensis infection inthe provinces of Esmeraldas and Pichincha onthe Pacific coast of Ecuador (8), a deforestedregion characterized by the replacement of pri-mary forest by coffee plantations, and by relativelyhigh densities of Lutzomyia trapidoi and Lutzomyiagomezi in and around houses. Domestic trans-mission of L. panamensis is also suspected inAcosta, Costa Rica, where the presumed sandflyvectors, L. ylephiletor and L. gomezi, are abun-dant in the coffee plantations that have replacedthe primary forest (9,10).

Because the course of cutaneous leishmaniasisinfection depends on both the age and immunestatus of patients (11,12) the change in L.panamensis transmission from sylvatic to domes-tic could also affect the characteristic clinicalsymptoms of an exposed population.

This paper describes the results of the first pro-spective survey to investigate the course of in-fection in a population apparently exposed to L.panamensis in the domestic environment (Anguloand others, unpublished data): the inhabitants ofthe Opón focus in Colombia. The principal aimswere (1) to measure the incidence rate in a repre-sentative population of the Opón focus, (2) to iden-tify demographic risk factors for infection, (3) toestimate the proportion of infections which causedisease, (4) to estimate the protection against dis-ease from acquired immunity, (5) to estimate thefrequency of reactivations, and (6) to estimate therisk of mucosal leishmaniasis.


Study site

The study was carried out in 12 villages in theOpón area, Landázuri municipality (6° 20' N; 73°,43' W), Santander Department at altitudes rangingfrom 400 to 1,200 m above sea level. It is amountainous region where the principal economicactivities are silviculture of tropical hard woods(in the rain forest), cattle ranching, and the cacaocrops. The relative abundance (in percentage) ofthe vegetation around houses was estimated byeye within concentric circles with radiuses fromthe house of 50 m, 100 m, 200 m, 300 m, and 800

m, respectively. Most houses adjoin pasture land(ca. 80%) and/or cacao plantations (ca. 40%), andare some distance away from the survivingpatches of primary or secondary forest. About 35%and 85% of houses are within 800m from primaryand secondary forest, respectively.

Study design and population

During the first visit in January, 1995, a scaledmap for each village was completed and all 527occupied houses recorded. A unique identificationnumber was allocated to each person in everyhousehold and the Colombian national identity cardwas requested in order to verify the date of birth.If possible, the whole family attended theinterviews in order to minimise recall bias.Demographic data (age, sex, and date ofimmigration, when appropriate) and clinical status(including age when infected) were recorded, anda proportion of the population (those givingconsent) were given a Montenegro skin test (April-June, 1995).

All households were visited five times at aboutthree month intervals following the initial cross-sectional survey, checking for changes in thestudy population (due to immigration, emigration,birth or death) and looking for new cutaneous ormucocutaneous leishmaniasis cases.

During the final visit (February-March, 1997) thestudy population was given a second Montenegroskin test an average of 19 months after the firstone using the same batch of antigen as before. In1995 the Montenegro skin test was applied to51% of the Opón population (1,380/2,704), of which55.5% (766) received a second one.

There were no differences by gender between thegroup remaining in the project and the emigrants/refusal group; nevertheless, the former wereslightly older (mean=20.8 years old) than the latter(mean=18.2 years old) (Kruskal-Wallis H: 7.303,P=0.006).

The great majority of refusals were adults with apositive result in the first Montehnegro skin test.Thus, the main possibility of bias due to the re-fusal would apply to the measurement of recov-ery rate (r) rather than the measurement of trans-mission rate. During the prospective study, 163

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emigrants, 10 deaths, 126 immigrants and 37 birthswere recorded in the study population. Analysisincorporating age were carried out on a reduceddata set of 1,333 persons, because of missingdata from 47 people.

Clinical diagnosis

Past cases of cutaneous leishmaniasis were iden-tified by characteristic scars, which were detectedusing the following criteria: no history of trauma,duration for more than 2 weeks, central depressedsurface and contours with no sharp angles. Sus-pected leishmaniasis lesions were defined by theabsence of prior history of trauma and more thantwo weeks of evolution. Confirmation of the aeti-ology of suspected lesions was made by a positiveresult from one or more diagnostic tests (13), withthe informed written consent of the patients. Theseincluded: 1) microscopic examination of Giemsa-stained slides made from dermal scrapings; 2)PCR using the B1 and B2 primers as describedby de Bruijn (1992) (14), and 3) the in vitro cultureof parasites from aspirates or biopsies in NNNbiphasic medium. The sensitivity of microscopydiagnosis was 40% for all suspected patients and60% for the 55 patients with a positive culture,while the equivalent values for PCR were 43%and 87%.

All confirmed patients were provided with free treat-ment (Glucantime®) and followed-up on a monthlybasis. Characterisation of Leishmania isolates wascarried out by IEA in thin-layer starch-gel electro-phoresis, using 8 isoenzymes (PEPD, NH, MPI,ME, GPI, PGM, 6PGD, and ES) as described byGodfrey and Kilgour (1976) (15). All 25 parasitesisolated during the survey were characterised asL. panamensis; 23 were indistinguishable from thereference strain MHOM/PA/71/LS94, and twoisolates demonstrated the same variant of PEPD.

After clinical inspection and following the resultsof the diagnostic tests, the study population wasclassified into two groups: people with scar orlesions (L+) and people with no history ofleishmaniasis (L-). The upper respiratory tract wasvisualised with the help of a nasal speculum,lantern and a tongue depressor by a trained clini-cian (16) on the L+ population. Lesions compat-ible with mucosal leishmaniasis were defined as

septal erosion or perforation; erythema or ulcersin the septum, turbinate, oral or nasal mucosa. Inorder to exclude acute lesions the clinician visitedthe same population three times in three consecu-tive months. Persistent lesions were included assuspected a mucocutaneous leishmaniasis patientbut biopsy was not taken because there was nothospital aid in such remote areas.

Montenegro skin tests

The Montenegro skin test was applied (with theirinformed written consent) to some or all of theresidents of 331 households following thetechnique recommended by the World HealthOrganization (17), i.e. using a mixture of L.panamensis and L. braziliensis at a concentrationof 5x106 ml-1 heat-killed promastigotes for eachspecies. A pressurised intradermal injector(Dermo-jet model G, Robbins Instruments, USA)was used to inject 0.1 ml of leishmaninintradermally on the external surface of one arm,and the diameter of induration was measured 48hours later. The choice of cut-off point, 3 mm,was made empirically, and the study populationwith a Montenegro skin test was classified intotwo groups according to their skin test response:Montenegro negative (M-) and Montenegro posi-tive (M+).

Ethical aspects

Written informed consent was obtained from everyperson or family included in the present study,following the indications of the Ministerio de Saludde Colombia (Resolution 008430, 1993). Inaddition, approval was requested and obtainedfrom the ethical committee of the IndustrialUniversity of Santander

Analysis

The transmission rate was measured using theresults of both the cross-sectional and prospectivestudies. The analysis of the cross-sectional datafocused on the comparison of prevalence rates(active or cumulative; Montenegro skin test re-sponsiveness or clinical) according to sex andage. In addition, a simple infection-recovery model(11) was fitted to the age prevalence curves (i.e.the proportion that were infected at age “a”) bymaximum likelihood (18). The model assumes that

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susceptibles became infected at a constant rate“l“ (the force of infection), and infected recoveredand returned to the susceptible class at a con-stant rate “r“ (the recovery rate). It follows thatthe proportion infected at age “a” can be predictedfrom the equation:

The assumptions of these models were then testedby analysing the results of the prospective survey,which permitted direct estimates of incidence (inrelation to age or gender) and recovery rate duringthe 19 month follow-up period.

Explanatory variables for variation in infection rateor in the clinical consequences of infection weremostly sought using general linearised models inGLIM (v. 4.07) (19). When the outcome data werecounts (e.g. the number of scars), Poisson errorswere specified; and when the outcome data wereproportions (e.g. prevalence) or binary (e.g. healthyversus with disease) these were treated asbinomial variables in logistic regression. When nosuitable error structure could be identified, a non-parametric method was adopted.

For multivariate analyses model simplification tothe minimal adequate model was achieved bybackward stepwise elimination. The absolute orrelative change in residual deviance caused bythe removal of each explanatory term wasexamined for significance (P<0.05). Interactionterms were assessed and removed in order ofdiminishing complexity, i.e. before the main effectterms. This procedure was repeated until the minimaladequate model retained only significant explana-tory variables. For minimal adequate models withbinomial or Poisson error structures, changes inresidual deviance were compared to χ2 distribu-tion. The F-ratio statistic was employed to testmodels with a normal error distribution. Finally,the fit of each model was checked by inspectinga plot of the residuals against the fitted values.

Results

Population infection rate

The distribution of induration sizes suggest a bi-modal-like shape (figure 1,2) indicating a differen-

tial response between uninfected and infectedpeople. In order to define a cut-off point for M+,the distribution of Montenegro skin test indurationsizes was compared between L+ and L- people. Itis clear from these data that there is no empiricalreason for choosing the textbook cut-off point of5 mm, as the majority of the 10 people with indu-ration sizes between 1-4 mm also had scars. Incontrast, clinical cases were a small minority

Figure 1. Frequency distribution of Montenegro skin test(MST) induration sizes amongst healthy population.

Figure 2. Frequency distribution of Montenegro skin test(MST) induration sizes amongst patients with cutaneouslesions (black bars) and scarred population (white bars).

136


amongst those with a zero skin test response.Given the few data, the choice of cut-off pointbetween 1-4 mm must be somewhat arbitrary. Inthe analysis described here, we used a relativelyconservative cut-off point of 3 mm, i.e., indurationsizes of 3 mm or greater are treated as a positiveskin test response or “M+”.

The cumulative Montenegro skin test prevalenceof infection amongst the whole study populationin 1995 was 0.75 (1,044/1,380) (table 1). The in-duration sizes of the skin test response accord-ing to clinical status was as follows: 1) peoplewith active cutaneous lesions (no mucosal), n=80;geometric mean (gm)=8.0 mm (95% ConfidenceIntervals [CI] 7.8-8.2 mm); 2) cutaneous scarredpopulation (no mucosal), n=782; gm=12.2 mm(95%CI 12.1-12.2 mm); 3) people with mucocuta-neous lesions, n=108 (concurrent active cutane-ous lesions, 8; concurrent cutaneous scars, 100);gm=15.6 mm (95%CI 14.2-17 mm), and 4)“healthy” people, n=410; gm=1.0 mm (95%CI 0.9-1.1 mm).

In order to determine the average incidence ratein recent years, the force of infection (λ) was cal-culated by fitting a simple infection-recovery modelto the cross-sectional age prevalence data for M+(18), making the assumption of constant trans-mission and recovery rate with time and age. Themodel estimates a mean recovery rate of 0.01/year, and l to be 0.14 (95%CI 0.12-0.15) cases/person-years (figure 3), which is significantly

Figure 3. Montenegro skin test (MST) prevalence by agefor (a) females and (b) males. Age prevalence curves forthe population with MST positive response (M+) detectedduring the cross-sectional study (1995). Each point repre-sents the proportion M+ within a particular age group. Lineswere fitted by maximum likelihood to the infection-recoverymodel (see text for details).

Table 1. Distribution of the study population by clinical and Montenegro skin test (MST) status in the 1995 and 1997 cross-sectional surveys.

Status 1995 Status 1997

Clinical MST 2 nd New lesions No new lesions

status status n MST M+ M- NT* M+ M- NT

Cutaneous lesionsM+ 75 50 1 0 2 49 0 23M- 13 6 0 0 0 4 2 7

Scarred populationM+ 852 439 16 0 4 414 9 409M- 30 15 1 1 0 5 8 15

Healthy populationM+ 117 51 5 0 3 39 7 63M- 293 205 36 8 5 16 145 83

Total 1380 766 59 9 14 527 171 600

*M+: positive MST response; M-: negative MST response; NT: not tested

137


smaller than the Montenegro skin test conversionrate detected during the prospective survey. Themean number of person-months at risk betweenthe first and second skin test date was 19 months.

Amongst the 226 M- people who were re-tested,62 converted to M+, resulting in an incidence of0.21 (95%CI 0.17-0.24) conversions/person-year(Only 5 people in the second skin test presentedsize of 3 or 4mm). Evidence of past infectionswere detected in 10 people (6 scars, 4 lesions)who converted from M-

1995 to M+

1997 (table 1), sug-

gesting that these conversions reflect infectionsalready prevalent in 1995 but with an extendedincubation period prior to skin test conversion,rather than incident infections during the prospec-tive study. Thus, our most reliable assessmentof incidence rate is 0.19 (95%CI 0.15-0.23) con-versions/person-year which is calculated from the52/205 M-L-

1995 who converted during the 19 month

prospective study.

During the prospective survey, loss of positiveskin test responsiveness was detected in 16people at a rate, r, of 0.02 (95%CI 0.01-0.03)/person-year. Recovery rate was significantlygreater in people without clinical symptoms, 0.13(7/51), than amongst L+ people, 0.02 (9/439)(χ2=16.2, degrees of freedom [df]=1, P<0.0001).

The assumption of constant transmission rate withtime was validated by a cross-sectional surveycarried out on the same population in 2004(n=1,127) , i.e. seven years after the first survey(1997). The force of infection (λ) calculated byfitting a simple infection-recovery model to thecross-sectional age prevalence data in 2004 was0.12 (95%CI 0.11-0.14), i.e. remarkably close tothe previous estimate.

Risk factors for infection

The cumulative prevalence of infection for males,0.77 (535/692)/person was not significantly greaterthan that for females, 0.73 (509/688)/person:χ2=2.08, df=1, P=0.15. In the follow-up study, in-cidence of infection in males, 0.24 (26/109 M-

1995

re-tested)/person-year, was also not significantlydifferent from the incidence of infection in females,0.30 (36/117)/person-year (χ2=1.35, df=1, P=0.24).Similarly, l estimated from the age MST preva-lence curves for males, 0.14 (95%CI 0.11-0.16)/

person-year was not significantly different from lcalculated for females, 0.12 (95%CI 0.10-0.13)/person-year (figure 3). Thus, there is no evidenceof any difference in the risk of infection betweenmales and females.

Because of the relatively high transmission ratein the Opón focus, the majority of M-

1995 (224/

336) are concentrated amongst children less than10 years old. This explains the relatively low meanage of 8.6 (95%CI 6.7-10.5) years amongst the62 people who converted during the study. How-ever, there was no significant difference betweenthe mean age of the people who remained M- in1997, 10.2 (95%CI 8.4-11.9) years, compared tothe mean age of “converters” (t test on log trans-formed data t=1.55, df=1, P>0.05). The absenceof any relationship between age and risk ofinfection is illustrated in figure 4, which demon-strates that there is no trend between the inci-dence rates calculated for eight age groups (withequal denominators) (F=0.05, df=1, P>0.05). Thus,new infections occurred irrespective of age,validating the key assumption made in the infec-tion-recovery model to calculate l from age preva-lence data.

Risk factors for clinical symptoms withinfection

The most reliable estimate of the proportion ofinfections leading to clinical disease comes fromthe prospective data. The proportion of skin testconversions which lead to disease (a) was 0.69

Figure 4. Montenegro skin test conversion rate by age.Squares are the proportions converting in each age classover the 19 month period, and lines are the standard errors.The horizontal line is the average conversion rate.

138


(95%CI 0.56-0.82) [36/52]. The possibility thatsome of the “subclinical” skin test conversionswere cross-reactions cannot be discounted. How-ever, no significant difference was detected in theinduration sizes of the skin test response follow-ing “subclinical” infections (6.7 mm; 95%CI 5.3-8.6 mm) compared to the response following clini-cal incident infections (6.5 mm; 95%CI 5.8-7.2mm) (t-test on log transformed data: t=0.29; df=51;P=0.76).

The significance of age and gender was tested bycomparing the two subpopulations of people withincident subclinical (SC) or clinical (C) infections.The geometric mean age for C, 3.8 years (95%CI2.8-5.1 years), was significantly smaller than forSC 8.7 years (95%CI 6.6-11.3 years) (t-test onlog transformed data: t=3.3; df=51; p=0.0021). Thesex ratio amongst SC cases, 43.7% male (7/16),was not significantly different from that amongstC cases, 47.2% male (17/36) (χ2=0.05, df=1,P>0.05).

Acquired immunity against disease

During the follow up, 82 cutaneous leishmaniasispatients were clinically and laboratory diagnosed(table 1). In order to determine the role of acquiredimmunity for protecting against new episodes ofclinical leishmaniasis, risk factors for cutaneousleishmaniasis were sought by testing for signifi-cant associations with the presence of cutaneousleishmaniasis (as a binary response) amongst thepopulation of 1,333. The explanatory variablestested in the multivariate model were village, age,gender, Montenegro skin test induration size, andprevious lesion (intercept estimate -1.439). Sig-nificant risk factors were age (χ2=14.5, P<0.001;estimate -0.05635), skin test size (χ2=4.2, P<0.05;estimate -0.246), and previous lesions (χ2=10.7,P<0.01; estimate -2.019), and there was a signifi-cant interaction effect between MST size and clini-cal status (χ2=4.2, P<0.05).

The main conclusions are as follows: 1) irrespec-tive of Montenegro skin test and clinical status,the odds of a new lesion decreased significantlywith age by 5.4% per year; 2) amongst both thehealthy and scarred population, the odds of a newlesion decreased with skin test size; this effectwas significantly greater amongst the healthy

population, for which the odds of a new lesion de-creased by 22% per 1 mm increase in skin testsize; this compares to an equivalent reduction of9% for the scarred population; 3) irrespective ofage and Montenegro skin test status, the odds ofa new lesion was significantly less for the scarredthan for the healthy population; but this effect wasless marked for people with a greater skin testsize. For example, for a person with no skin testresponse (0 mm), the odds of a new lesion de-creased by 88%, whereas for people with skin testresponses of 10 mm the odds decreased by only43% .

Recurrent leishmaniasis

Full clinical histories were recorded for 125 of the170 cutaneous leishmaniasis patients in the study(i.e. the 88 patients detected in the first cross-sectional survey, plus the 82 new cases detectedduring the prospective survey) . Previous leish-maniasis scars were detected in 80 (64%) of thesepatients. Incidence decreased from 0.12 to 0.016cases/person-years in the first 10 years after theprimary lesion (figure 5), indicating that these earlysecondary infections were relapses rather than re-infections. However, 15 years after the primaryinfection, incidence rates increase to a peak of0.091 cases/person-years, which is not signifi-cantly different from the incidence in L-

1995 (0.1

cases/person-years) (figure 5). The preciselocalisation of lesions and the time since primarylesions occurred were recorded on the clinical his-tory forms. For 36% (29/80) of the patients, thesecondary lesions appeared in the same site in

Figure 5. The incidence rate of secondary lesions (+standard errors) in relation to time since the primary lesion.

139


the body as the previous scars. For this popula-tion, the geometric mean time between the pri-mary and secondary lesions was 2.2 years (95%CI0.71-3.74 years). In contrast, the mean timebetween episodes when secondary lesions wereon a distant site was 9.3 years (median 3 years)which was significantly higher than for the former:H (Kruskal-Wallis)=4.83, df=1, P=0.027.

Mucocutaneous leishmaniasis

Clinical inspections for mucocutaneous leishma-niasis were carried out on 881 persons with cur-rent or past cutaneous leishmaniasis symptoms,of which 12% (108) presented lesions clinicallycompatible with mucocutaneous leishmaniasis.The majority (77%) of the mucocutaneous leish-maniasis symptoms were mild, i.e. with erythema,ulcers or erosion detected on single mucosa, usu-ally the nasal septum but, also, the nasal mu-cosa (n=18), oral mucosa (n=2) and turbinate(n=2). The remaining 23% (n=25) had moderatesymptoms (perforated nasal septa) (table 2).

There was some evidence that severity increasedwith time since cutaneous leishmaniasis episode,as the geometric mean time for mild mucocuta-neous leishmaniasis was 7.5 years (95%CI: 5.3-9.8 years) compared to 21.4 years (95%CI: 19-23.7 years) for moderate cases (t=4.11, df=1,P<0.001). Risk factors for mucocutaneousleishmaniasis were sought by testing for significantassociations with the presence of mucocutaneous

leishmaniasis (as a binary response) amongst the881 cutaneous leishmaniasiscases observed.

The explanatory variables tested in the multivari-ate model were: 1) whether the cutaneous leish-maniasis lesions were active or healed, and thetime since the cutaneous leishmaniasis episode;2) the area, number and localisation of the cuta-neous leishmaniasis lesions; 3) the Montenegroskin test induration size; 4) whether the cutane-ous leishmaniasis lesion was treated with anti-monials; and 5) age and gender. The significantrisk factors for mucocutaneous leishmaniasis weregender (P<0.0001; odds ratio [OR] for males=2.2[95%CI 1.4-3.4]), location of cutaneous leishma-niasis lesion on the head (P=0.002; OR=2.0[95%CI 1.3-3.0]), Montenegro skin test size(P=0.001; OR for unit increase in log transformedMontenegro skin test induration in mm=2.4 [95%CI1.4-3.9]) and previous treatment (P<0.001;OR=2.3 [95%CI 1.5-3.7]).

Discussion

Personal risk factors for infection are mostaccurately estimated from prospective studieswith two assessments of Montenegro skin teststatus in the population. Correlates with infectionrate can then be identified either by cohort studies(as in this study) or by nested case-control studies(Llanos-Cuentas, unpublished data). In contrast,retrospective studies of infection, whether by case-control studies (20) or cohort studies, are plagued

Table 2. Relationship between mucocutaneous (MCL) clinical features and time since cutaneous (CL) lesions.

Number of MCL patients by type of lesions

Time since CL* erythema Nasal lesions erosion Septumulcers perforation

0-3 15 3 1 14-6 13 1 17-9 8 3 1 1

10-12 6 1 213-17 4 318-20 3

more than 23 6 3 9total patients 55 9 4 17

Geometric mean† 7,1 8,7 10 21,4

*: time since cutaneous lesions by groups (in years)†: geometric mean time since cutaneous lesions (in years)

140


by potential bias and other inaccuraciesassociated with faulty recall or changes incircumstance. Thus, here we focus on thecomparison of our results with those from the onlytwo previously published large scale prospectiveMontenegro skin test surveys of New Worldcutaneous leishmaniasis: in Tumaco, Colombia(6) and in the Peruvian Andes (11).

New infections occurred irrespective of age andgender in Opón and in Perú, whereas in Tumacoincidence of infection increased with age, and in-fection was three times greater in males than infemales. These differences are presumably theresult of differences in exposure rather than dif-ferences in susceptibility. The average age of in-fection in Opón, 7.7 years (1/λ), and the absenceof gender as a risk factor is highly indicative ofintradomiciliary or peridomiciliary transmission, asin the Peruvian Andes. In Tumaco, infection mainlyoccurs during farming activity, an occupation inColombia carried out principally by males. Theepidemiological contrast with Tumaco is striking,given the similarities between Opón and Tumacoboth in the agent of disease (L. panamensis) andin the presumed principal vectors (Lu. trapidoi, andLu. gomezi).

Clinical infection is determined by the host-para-site interaction which includes host genetic fac-tors, acquired resistance to infections, and para-site pathogenicity. Our estimates of pathogenic-ity from the cross-sectional and prospective sur-veys are surprisingly different. The explanationappears to lie in the significant difference betweenthe recovery rate of Montenegro skin test respon-siveness following subclinical or clinical infections.Subclinically infected people apparently revert toM- relatively quickly, so that despite a relativelyhigh transmission rate, only a small proportion ofpeople sampled in the cross-sectional survey re-tain their M+L- status. Hence, our best estimatefor the proportion of subclinical infections in theOpon focus was 31%. This is higher than the ratereported for L. peruviana in Peru (17%) but lowerthan that reported in Tumaco (88%) (6,11).

This result is consistent with the hypothesis thatL. panamensis in Opón is more pathogenic thanin Tumaco, and that L. peruviana is more patho-genic than both L. panamensis populations stud-

ied in Colombia. Alternatively, the differences mayrepresent methodological inconsistencies betweenthe three research groups, i.e. different sensitivi-ties of the clinical or Montenegro skin test diag-nosis (due to different field workers or differentleishmanin batches), including the hypotheticalpossibility of a booster effect from serial skin test-ing. In addition, geographical differences could beexplained by different levels of cross-reactingparasitic infections in the three regions such aslizard Leishmania (21).

The proportion of subclinical infections may alsobe influenced by factors related to human sus-ceptibility. In Tumaco the majority of the commu-nity are negros who are infected when adults,whilst in Opón the people are whites and “mulatos”(i.e. a mixture of indigenous, Spaniards andnegros) infected in childhood. Evidence thatpeople who developed chronic disease in Tumacowere innately more susceptible than those whowere subclinically infected came from an experi-mental study, where the in vitro infection rate ofmacrophages differentiated from peripheral bloodmonocytes with L. panamensis was higher incutaneous leishmaniasis patients (from Tumaco)than in asymptomatically infected persons (22).Further evidence for genetic variation insusceptibility comes from a comparison of leish-maniasis symptoms in Amerindians and mixedrace people in Bolivia (23).

In the Opón focus, the geometric mean age forclinical infections (3.8 years) was significantlysmaller than that for subclinical infections (8.7years); but there was no significant genderassociation with clinical symptoms. A positiverelationship between age and the proportion ofsubclinical infections was also observed in Perúwhere the geometric mean age for clinical infectionwas significantly lower than those with subclinicalinfections (7.7 and 15.0 years, respectively) andin Tumaco too the odds that a skin test conver-sion was associated with a lesion decreased sig-nificantly with age: gender adjusted OR=0.2 foradults (>30 year old) as compared with children(<10 years old). This consistent pattern of a de-creasing incidence of clinical infection with agecould be related to undetected acquired immunityfollowing infection (12). Alternatively, adults may

141


be innately less susceptible to cutaneous leish-maniasis (23) as they are to visceral leishmania-sis (24), even in the absence of prior exposure toleishmaniasis.

A novel hypothesis to explain the reducedsusceptibility to cutaneous leishmaniasis with agecomes from the recent findings that pre-exposureto sandfly saliva reduces the clinical outcome ofL. major infection in experimental mice (25).Antibodies to salivary gland antigens are thoughtto cancel the enhancing immunomodulatory effectsfrom subsequent co-inoculation of saliva with theLeishmania parasites (26). As adults living inendemic areas have had a longer exposure tosandfly bites than children, their presumed higherlevels of antibodies to sandfly antigen couldfeasibly reduce their risk of clinical symptoms.This speculative hypothesis is consistent with thefinding of a three-fold higher risk of clinical diseasefor migrants compared to native inhabitants in AltoBeni, Bolivia (23).

In Opón, people with previous clinical episodes(i.e. scars) on average had 80% protection againstsubsequent clinical infections, although this effectwas more marked amongst people who had a nega-tive skin test response. Skin test responsivenesswas also a significant indicator of acquired pro-tection, even amongst those with no clinical symp-toms. Within the healthy population, the odds of asubsequent clinical infection decreased by 22%for each 1 mm increase in skin test size in Opón.This corresponds with an equivalent measurementof 18% in a Peruvian study of acquired immunityfollowing subclinical infections. Hence, the Opónresults confirm the conclusions from the Peruvianstudy that protective immunity can be acquiredfollowing a Leishmania infection even in the ab-sence of clinical symptoms. This result provideshope for the future development of vaccines. Inaddition, it provides a rationale for using theMontenegro skin test response as an indirect in-dicator of the protection which may follow a puta-tive vaccine within the context of an interventiontrial.

The recurrence rate of leishmaniasis in Opón (3%/year) in the prospective study, was similar torecurrence rates previously detected in Colombia(L. panamensis), Perú (L. peruviana) and Brazil

(L. braziliensis): 2.0%/year (6), 2.9%/year (11),and 2.7%/year (16) respectively. The consistencyof these data is remarkable given the differencesin the treatment regimes, parasite species, andeven in the definition of recurrence used by thedifferent research teams. On the Pacific coast ofColombia, where L. panamensis was the mostcommon parasite isolated (27), the group of re-current patients (80/498) required higher doses ofGlucantime® and showed a lower skin test re-sponse compared with non-recurrent patients, sug-gesting that the risk of reactivation is associatedwith a low-cell mediated immune response.

In Opón, as in the Peruvian Andes, the incidencerate of recurrence decreased dramatically duringthe first 10 years following the primary lesion,indicating that the majority of recurrentleishmaniasis in this period is due mainly torelapses rather than reinfections. On theColombian Pacific coast the cumulative frequencyof recurrences in a group of 498 patients alsoincreased rapidly in the first year after the firstlesion, with few recurrences detected during thefollowing 42 months of the follow up (12,27). Fromthis group of recurrent cases, 50% were suggestedto be caused by relapses based on the apparentgenetic identity of parasites isolated from the samepatient in both leishmaniasis episodes (primaryand secondary infections) (27). In all patients withidentical parasites in consecutive episodes, thesecondary lesions were located on the same partof the body on the primary lesions. In the Opónfocus, 36% of recurrent lesions were located onthe same part of the body as the previous scars,and this percentage decreased significantly withtime since primary lesion, indicating that the earlyrecurrences are more likely to be relapses andthe later recurrences are more likely to bereinfections (presumably due to the loss of ac-quired immunity).

Prior to the Opón study there were remarkablyfew descriptions of the frequency and severity ofmucosal leishmaniasis following L. panamensisinfection. Most reports come from hospital/healthpost admissions, which are notoriously biased, orfail to take out account of the potentialconfounding effect of time since the primarycutaneous leishmaniasis episode. Nevertheless,

142


the inclusion of suspected mucocutaneousleishmaniasis patients based only on clinicaldiagnosis may have selection bias and the resultshave to be taken with precaution. Active searchof rural populations are likely to encounter mildermucocutaneous leishmaniasis symptoms than aregenerally seen in mucocutaneous leishmaniasisadmissions, but may include more severemucocutaneous leishmaniasis symptoms than aredetected amongst cutaneous leishmaniasisadmissions (as the ratio of moderate: mildmucocutaneous leishmaniasis symptomsincreases significantly with time since thecutaneous leishmaniasis episode). With thesecaveats, it seems that mucocutaneousleishmaniasis due to L. panamensis in Colombialesions may be more severe than in Panamá: 23%(25/108) of mucocutaneous leishmaniasis casesin Opón and 17% (4/23) on the Colombian PacificCoast (28) had perforated nasal septa, comparedto 9% (3/33) in Panama (29). The cumulativeprevalence of mucocutaneous leishmaniasisamongst cutaneous leishmaniasis patients wasalso greater in Opón, 12%, than on the ColombianPacific Coast, 9% (10/114) (30).

Geographic variability in symptoms could be dueto genetic variability in parasite pathogenicity (31),human susceptibility (32), or sand fly salivaimmunomodulatory activity (33). Alternativeexplanations could involve variability in availabilityof treatment. Prior to 1995 there were no medicalfacilities available in Opón. While this could explainthe high frequency of chronic mucocutaneousleishmaniasis lesions, we found no evidence thattreatment of cutaneous leishmaniasis lesionsreduced the risk of mucocutaneous leishmaniasis.Our data indicated the reverse association,presumably because the odds of treatment wasconfounded by the severity of the cutaneousleishmaniasis episode (a known correlate ofmucocutaneous leishmaniasis risk following L.braziliensis infection) (30). Previous studies ofmucocutaneous leishmaniasis due to L.braziliensis suggest that risk of mucocutaneousleishmaniasis may decrease with age of primarycutaneous leishmaniasis episode (31). Hence,variability in the age distribution of cutaneousleishmaniasis cases could also impact on the

frequency of mucocutaneous leishmaniasissymptoms. In Opón cutaneous leishmaniasispatients tend to be younger than on the ColombianPacific coast or in Panama, but we were unableto detect any association between age andmucocutaneous leishmaniasis risk.

The remaining three risk factors formucocutaneous leishmaniasis which we detectedin Opón were consistent with previous analysesof mucocutaneous leishmaniasis risk associatedwith L. braziliensis, but had not been previouslyshown for L. panamensis. In particular, we foundthat, as in Bahia, Brazil (34), people with cutaneousleishmaniasis lesions on the head had significantlygreater risk of mucocutaneous leishmaniasis.Secondly, we found that, as in Bolivia (35,36),mucocutaneous leishmaniasis is a greater risk formale than female cutaneous leishmaniasispatients. While we cannot discount possibleconfounders, it seems likely that this reflectsinnate gender differences in susceptibility,mediated by sex-associated hormones (37), asdemonstrated in laboratory mice infected withvarious Leishmania species (38). Finally, we foundthat, as in Belo Horizonte, Brazil (39),mucocutaneous leishmaniasis patients had agreater Montenegro skin test response thancutaneous leishmaniasis patients. This ispresumably because mucocutaneous leish-maniasis, whether caused by L. braziliensis or L.panamensis, is a hyperergic form of cutaneousleishmaniasis with an exaggerated antigen-specific, cell-mediated immune response (40).

Acknowledgements

We want to thank Elsa Morales and ReynaldoGutiérrez for their technical assistance, SantiagoNicholls from the Instituto Nacional de Salud deColombia for providing leishmanin; and to DouglasBarker, Sharon McCann, Debbie Nolder and VíctorAngulo for their support.

Conflict of interest

The authors declare that they have no conflict ofinterest.

Financial support

This study was sponsored by COLCIENCIAS-Colombia (code 11020412926).

143


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Biomédica 2006;26(Supl.1):145-51 DISTRIBUCIÓN DE ESPECIES DE LEISHMANIA

ARTÍCULO ORIGINAL

Distribución geográfica deespecies de Leishmania aisladas de pacientes consultantesal Instituto Nacional de Dermatología Federico Lleras Acosta,

E.S.E., 1995-2005Clemencia Elena Ovalle, Luisa Porras, Maritza Rey, Melania Ríos, Yenny Carolina Camargo

Centro Dermatológico Federico Lleras Acosta, E.S.E., Bogotá, D. C., Colombia.

Introducción. El mapa de la distribución de especies de Leishmania en Colombia no se haactualizado desde hace siete años.Objetivo. Describir la distribución de las especies de Leishmania a partir de los aislamientosde pacientes consultantes al Instituto Nacional de Dermatología durante el período 1995 a2005Materiales y métodos. Se realizó un estudio descriptivo de distribución geográfica de lasespecies de Leishmania, a partir de los aislamientos obtenidos de 137 pacientes consultantesal Instituto Nacional de Dermatología Federico Lleras Acosta E. S. E, con diagnóstico confirmadode leishmaniasis. Se revisó la historia clínica obteniendo la información de forma clínica, sitioprobable de infección, edad y género. Se tomaron y cultivaron muestras de las lesiones y losaislamientos se tipificaron por anticuerpos monoclonales, comparando el 10% de los resultadoscon los obtenidos por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y patrones isoenzimáticos.Resultados. La frecuencia encontrada de los 137 aislamientos fue: Leishmania panamensis74,45%; Leishmania braziliensis 15,33%; Leishmania guyanensis 0,73%; Complejo Leishmaniamexicana 3,65%, Leishmania mexicana 5,11% y el 0,73% restante correspondió a unaislamiento que no se pudo caracterizar por anticuerpos monoclonales. La distribución de L.braziliensis, L. panamensis y L. guyanensis fue concordante con lo reportado en estudiosanteriores pero para las especies del complejo L. mexicana se encontraron procedencias noreportadas previamente: Caldas, Santander, Cundinamarca, Caquetá, Casanare, Cauca yValle del Cauca.Conclusión. El complejo L. mexicana presenta una distribución más amplia de la reportadapreviamente. La utilidad de los monoclonales especie-específicos, los patrones isoenzimáticosy la PCR para L. mexicana y L. amazonensis fue limitada.

Palabras clave: leishmaniasis cutánea, epidemiología, clasificación, anticuerposmonoclonales, Leishmania

Geographic distribution of Leishmania species isolated from patients at the National Instituteof Dermatology Federico Lleras Acosta E.S.E., 1995-2005

Introduction. The Colombian distribution map of Leishmania species has not been updatedsince seven years ago.Objective. To describe the distribution of Leishmania species isolated from patients attendedat the National Institute of Dermatology during the period 1995 to 2005.Materials and methods. A descriptive study of the geographic distribution of Leishmania specieswas made from 137 isolates obtained from patients consulting the National Institute ofDermatology “Federico Lleras Acosta E.S.E”, with confirmed diagnosis of leishmaniasis. Theclinical history was reviewed to obtain information on the clinical presentation, most probableplace of infection, age and gender. Samples were taken and cultured and the isolates weretyped by monoclonal antibodies, comparing 10% of the results with those obtained by PCR andisoenzymatic patterns.Results. L. panamensis accounted for 74.45% of the 137 isolates studied, L. braziliensis for15.33%, L. guyanensis for 0.73%; L. mexicana complex for 3.65%, L. mexicana 5.11% and the

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Biomédica 2006;26(Supl.1):145-51OVALLE C.E., PORRAS L., REY M. et al.

remaining 0.73% corresponded to an isolate which could not be characterized by monoclonalantibodies. The distribution of L. braziliensis, L. panamensis and L. guyanensis was similar tothat reported in previous studies but species of the L. mexicana complex, were found in patientsfrom the departments of Caldas, Santander, Cundinamarca, Caquetá, Casanare, Cauca andValle del Cauca, where they had not been previously reported.Conclusion. Species of the L. mexicana complex display a wider distribution than previouslyreported. The usefulness of species-specific monoclonal antibodies, isoenzymatic patterns,and PCR for identification of L. mexicana and L. amazonensis was limited.

Key words: cutaneous leishmaniasis, epidemiology, classification, monoclonal antibodies,Leishmania

La epidemiología de la leishmaniasis se puedealterar por cambios en algún punto de la triadaepidemiológica (humanos, reservorios yflebótomos). Los factores ambientales, eldesarrollo económico, el aumento en laurbanización, la deforestación, la migración deáreas rurales a urbanas con creación de nuevaszonas de asentamiento humano y el conflictoarmado pueden ser responsables de la dispersióndel vector, lo cual hace que la epidemiología dela enfermedad cambie y, por consiguiente, ladistribución de las cepas de Leishmania (1,2).

La historia taxonómica de Leishmania inicia conla descripción del parásito y la definición delgénero hecha por Ross en 1903, seguido de lareagrupación del genero Leishmania en lossubgéneros Viannia y Leishmania por Lainson yShaw en 1987, basados en el desarrollo delparásito en el intestino de los vectores; por ello,inicialmente los criterios de identificación yclasificación del parásito se basaban en lascaracterísticas extrínsecas como la biología, lasmanifestaciones clínicas, los aspectosgeográficos y epidemiológicos que ofrecían unacercamiento a la especie infecciosa (3). En 1998,Cupolillo et al. agrupó cinco complejos fenotípicos:Leishmania braziliensis, Leishmania naiffi,Leishmania guyanensis/Leishmania panamensis/Leishmania shawi, Leishmania mexicana,Leishmania major para las poblaciones aisladasdel Nuevo Mundo (4).

En Colombia, la leishmaniasis es una enfermedadendémica en casi todo el territorio con excepciónde San Andrés, Atlántico y Bogotá, D.C. (5),constituyéndose en un problema de salud pública.En el año 2004 se notificaron 10.794 casos, delos cuales, 98,4% (10.624) correspondió a leish-maniasis cutánea, 1% (96) a leishmaniasis vis-ceral y el 0,6% (74) restante a leishmaniasis mu-cosa. En este periodo los departamentos quereportaron mayor incidencia de leishmaniasiscutánea fueron, en su orden: Tolima, Antioquia,Santander, Norte de Santander, Caquetá, Nariño,Cundinamarca, Boyacá, Guaviare, Caldas yRisaralda (6).

Desde hace 20 años se han realizado esfuerzospara determinar la distribución geográfica de lasespecies de Leishmania en el país; es así comoen 1986 se publicó el primer informe dedistribución geográfica de 225 aislamientos (7) yen 1990 se reportaron los resultados de un estudiode 340 aislamientos de humanos, animales yvectores de varias regiones de Colombia, dondepredominó la L. panamensis (53,8%), L.braziliensis (30,3%), L. chagasi (9,4%), L.guyanenesis (2,6%), L. amazonensis (1,8%), L.mexicana (0,9%) y Leishmania sp. (1,2%) (5).

En 1998 se identificaron 511 aislamientos depacientes consultantes al Centro Internacional deInvestigaciones Médicas (CIDEIM), dondeencontraron que L. braziliensis estaba distribuidaen varias zonas del país, L. panamensis eraprevalente en el occidente colombiano, y L.guyanensis en la riberas de los ríos Orinoco yAmazonas (8).

El Instituto Nacional de Dermatología atiendepacientes provenientes de todo el país, condiferentes formas clínicas de leishmaniasis, a

Correspondencia:Clemencia Elena Ovalle, Av. 1 # 13A-61 Bogotá, ColombiaTeléfono: (571) 2428160, ext. 115,145,137; fax: (571)[email protected]


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quienes se les aísla y caracteriza el agenteetiológico. Este estudio pretende describir ladistribución de las especies de Leishmania enColombia aisladas a partir de los pacientesconsultantes al Instituto Nacional de Dermatologíadurante el período de 1995 a 2005.


Tipo de estudio. Se realizó un estudio descriptivode la distribución geográfica de las especies deLeishmania.

Población de estudio. Se incluyeron losaislamientos obtenidos de 137 pacientesatendidos por dermatólogos en la consulta espe-cial de leishmaniasis, los cuales presentabandiagnóstico confirmado de leishmaniasis cutánea,difusa, cutánea y mucosa simultánea; se revisóla historia clínica y se obtuvo informaciónrelacionada con forma clínica, sitio probable deinfección, edad y sexo.

Obtención de la muestra. La muestra se obtuvopor punción aspirativa del borde de las lesionescutáneas que se caracterizaban por múltiplesplacas ulceradas con bordes violáceos infiltradosde diferentes tamaños, localizadas en varios sitiosanatómicos.

Aislamiento y cultivo. El aspirado se colocó enen medio de Seneckjie, se incubó a 26°C y seobservó durante cinco semanas (9). Los parásitosaislados se cultivaron en medio de SchneiderDrosophila (Sigma Chemical Co.) con suplementode suero fetal bovino al 10%, inactivado, paraobtener cultivo en masa. Una vez que el cultivode parásitos se encontraba en fase logarítmica

de crecimiento se ajustó la población a 3x106

parásitos por ml con el fin de preparar el antígenode acuerdo con el protocolo de la OrganizaciónPanamericana de la Salud (OPS) (10).

Tipificación de los aislamientos. La tipificaciónde las especies se hizo mediante anticuerposmonoclonales (10). Se emplearon 11 anticuerposmonoclonales (cuadro 1), los cuales fueronproducidos por McMahon Pratt y John R. David1981 (11) y donados por el CIDEIM.

Los patrones obtenidos para la identificación deespecies se determinaron por la posibilidad de losanticuerpos monoclonales, así: L. braziliensis conB-18, B-16, B-2 y B-21; L. panamensis con B-4,B-11, B-2 y B-21; L. guyanensis con B-19 y B-2;complejo L. mexicana con M-2 y M-7; L. mexicanacon M-2 , M-7 y M-8.

Se utilizaron como controles las cepas dereferencia: L. braziliensis MHOM/BR/75/M2903,L. panamensis MHOM/PA/71/LS-94, L. guyanensisMHOM/BR/75/M4147, L. mexicana MHOM/BZ/82/BEL21, L. amazonensis IFLA/BR/67/PH80,donadas por el CIDEIM.

Determinación de serodemas. Se analizaron lospatrones de reactividad que presentaron losaislamientos con los anticuerpos monoclonalesutilizados.

Comparación de la tipificación de especies porotros métodos. Se tomó el 10% de losaislamientos en forma ciega y se enviaron allaboratorio de referencia para ser caracterizadosmediante patrones de isoenzimas y poderestablecer la concordancia entre especies y

Cuadro 1. Descripción de anticuerpos monoclonales

Especificidad Clon del hibridoma Código del anticuerpo

L. braziliensis/L. panamensis VI-6H9 B-21L. braziliensis (todas las especies) VI-4B9-D10 B-2L. braziliensis XIII-3E6-B11 B-16L. braziliensis XIV-2A5-A10 B-18L. panamensis VI-2A5-A4 B-4L. panamensis VII-5G3-F3 B-11L. guyanensis XLIV-5A2-B9-B6 B-19L. mexicana/L. amazonensis LXVIII-1D7-D8 M-7L. mexicana/L. amazonensis - M-2L. amazonensis IX-5H9-C10 M-3L. mexicana IXVIII-4D8-E3 M-8

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complejos con los resultados obtenidos conanticuerpos monoclonales.

Así mismo, se tipificaron por PCR, utilizando dospares de iniciadores, B1/B2 (12) y M1/M2 (13)específicos para el complejo L. braziliensis ycomplejo L. mexicana, respectivamente.

Consideraciones éticas. A todos los pacientesatendidos en la consulta especial de leishmania-sis del Centro Dermatológico Federico LlerasAcosta se les informa e indaga sobre la inclusiónde los aislamientos (en el caso de que fuereposible) en el banco biológico institucional paraposteriores investigaciones. El protocolo delpresente estudio fue sometido al Comité de Éticainstitucional que lo categorizó como investigaciónsin riesgo, según la declaración de Helsinki.

Resultados

La frecuencia de las especies encontradas en los137 aislamientos estudiados fueron: L. panamensis,74,45%; L. braziliensis, 15,33%; L. guyanensis,0,73%; L. mexicana, 5,11%, complejo mexicana,3,65%, y Leishmania sp. 0,73%. La distribuciónpor departamento de probables sitio de infecciónse muestra en el cuadro 2 y en la figura 1.

La reactividad de los anticuerpos monoclonalesM-2 y M-7 para la tipificación del complejo L.mexicana permitió hacer la identificación confiablede los aislamientos a diferencia de lo reportadopor otros autores que presentan resultadoscontradictorios (14,15). Los anticuerposmonoclonales M-3 y M-8, utilizados para laidentificación de especies L. amazonensis y L.mexicana, respectivamente, no presentaronresultados consistentes, lo cual no permitió latipificación de 12 aislamientos (8,76%); ocho deéstos (5,10%) se identificaron como L. mexicanapor el método de perfil isoenzimático.

La forma clínica según la especie causante seobserva en el cuadro 3; se encontró que la formamás frecuente era la leishmaniasis cutánea(97,08%), seguida de la leishmaniasis cutánea ymucosa simultáneamente (2,19%) y, finalmente,la leishmaniasis difusa (0,73%).

La leishmaniasis cutánea fue causada por L.panamensis en 74,44%, L. braziliensis en 15,79%,L. guyanensis en 0,75%, el complejo L. mexicanaen 3,76%, L. mexicana 4,51% y Leishmania sp.en 0,75%. La leishmaniasis mucosa y cutánea

Cuadro 2. Distribución geográfica de Leishmania aisladas de pacientes consultantes al Instituto Nacional de DermatologíaFederico Lleras Acosta, E. S. E, 1995-2005

Especies de Leishmania

Departamentos L. L. L. L. Complejo Leishmaniabraziliensis panamensis guyanensis mexicana L. mexicana sp. Total

Antioquia 0 3 0 0 0 0 3Bolívar 0 2 0 0 0 0 2Boyacá 0 14 0 0 0 0 14Caldas 0 7 0 1 0 0 8Caquetá 0 1 0 1 0 0 2Casanare 0 0 0 2 1 0 3Cauca 0 0 0 1 0 0 1Chocó 0 3 0 0 0 0 3Córdoba 0 1 0 0 0 0 1Cundinamarca 15 15 0 1 2 0 33Guaviare 1 2 1 0 1 0 5Huila 0 1 0 0 0 0 1Meta 2 3 0 0 0 1 6Risaralda 0 1 0 0 0 0 1Santander 0 40 0 0 1 0 41Tolima 0 9 0 0 0 0 9Valle del Cauca 0 0 0 1 0 0 1Vichada 3 0 0 0 0 0 3Total 21 102 1 7 5 1 137

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Cuadro 3. Presentación de la forma clínica de los casosde leishmaniasis

Especies Forma clínica*

LC LC-LM LD Total

L. brazilienzis 21 0 0 21L. panamensis 99 2 1 102L. guyanensis 1 0 0 1L. mexicana 6 1 0 7Complejo L. mexicana 5 0 0 5Leishmania sp. 1 0 0 1Total 133 3 1 137

* LC: leishmaniasis cutánea; LC-LM: leishmaniasis cutáneay leishmaniasis mucosa simultánea; LD: leishmaniasisdifusa.

simultánea fue causada por L. panamensis en66,67% y por L. mexicana 33,33%. El caso deleishmaniasis difusa fue de L. panamensis, de unpaciente inmunocomprometido con sida.

En cuanto al perfil de isoenzimas realizado en ellaboratorio de referencia se pudo caracterizar el93% de los complejos (13 aislamientos); losresultados presentaron 100% de concordanciacon los obtenidos por anticuerpos monoclonalesy PCR; estas dos últimas técnicas permitieronidentificar el 100% de los complejos.

En lo relacionado con la identificación deespecies, el perfil de isoenzimas permitió carac-terizar el 93% (13 aislamientos) y los anticuerposmonoclonales el 42,8% (6 aislamientos); por estaúltima técnica no fue posible identificar ningunaespecie perteneciente al complejo L. mexicana.Una caracterización de aislamiento no coincidióentre las dos técnicas; fue caracterizado como L.panamensis por anticuerpos monoclonales y comoL. braziliensis por perfil de isoenzimas (cuadro 4).

Figura 1. Distribución geográfica de especies de Leishmania aisladas de consultantes del Instituto Nacional de Dermatología,1995-2005.

Discusión

A pesar de que el presente estudio corresponde ala casuística del Instituto Nacional deDermatología Federico Lleras Acosta, lo cualintroduce un sesgo de selección, los resultadosobtenidos en cuanto a distribución de las especiesde L. braziliensis, L.panamensis y L. guyanensis

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Cuadro 4. Resultados de la comparación de métodos para la identificación de aislamientos de Leishmania sp.

Métodos de tipificación

Código de aislamiento Anticuerpos monoclonales (1) Isoenzimas (2) PCR(1)

MHOM/CO/99/LL0002 Complejo L. mexicana L. mexicana Complejo L. mexicanaMHOM/CO/99/LL0003 Complejo L. mexicana L. mexicana Complejo L. mexicanaMHOM/CO/99/LL0004 Complejo L. mexicana L. mexicana Complejo L. mexicanaMHOM/CO/99/LL0005 Complejo L. mexicana L. mexicana Complejo L. mexicanaMHOM/CO/99/LL0006 Complejo L. mexicana L. mexicana Complejo L. mexicanaMHOM/CO/00/LL0007 Complejo L. mexicana L. mexicana Complejo L. mexicanaMHOM/CO/00/LL0008 Complejo L. mexicana ND Complejo L. mexicanaMHOM/CO/00/LL0009 Complejo L. mexicana L. mexicana Complejo L. mexicanaMHOM/CO/00/LL0010 L. brazilienzis L. braziliensis Complejo L. braziliensisMHOM/CO/00/LL0014 L. brazilienzis L. braziliensis Complejo L. braziliensisMHOM/CO/01/LL0019 L. panamensis L. panamensis Complejo L. braziliensisMHOM/CO/01/LL0023 L. panamensis L. panamensis Complejo L. braziliensisMHOM/CO/01/LL0024 L. panamensis L. braziliensis Complejo L. braziliensisMHOM/CO/01/LL0029 L. panamensis L. panamensis Complejo L. braziliensis

(1) Instituto Nacional de Dermatología Federico Lleras Acosta, E.S.E., Laboratorio de Parasitología y Biología Molecular(2) CIDEIM, Unidad de Bioquimica y Biología MolecularND: No determinado

concuerdan con los obtenidos en estudios decoberturas más amplias como son los realizadospor Corredor et al., Saravia et al. y Grimaldi et al.De igual forma, la especie más frecuentementeaislada es L. panamensis seguida por L.braziliensis (5,7,16,17).

Por el contrario, la distribución de las especiesdel complejo L. mexicana mostró procedenciasno reportadas previamente: La Victoria (Caldas),Barrancabermeja (Santander), La Mesa, Nimaimay Villeta (Cundinamarca), La Unilla (Guaviare), SanJosé de Fragua (Caquetá), Tauramena, Ipigua yMonterrey (Casanare), municipio de Bolívar(Cauca) y Buenaventura (Valle). En estudiosanteriores las especies de L. mexicana habíansido identificadas en los departamentos del Cauca,Meta, Nariño, Risaralda y Norte de Santander(5,7,17); y la especie L. amazonensis se habíaaislado en el Meta y Norte de Santander (5,17).

Los aislamientos identificados como L. panamensispresentaron un único patrón de serodema, lo cualcoincide con el trabajo realizado por el CIDEIMen el 2002 (18). Igualmente, L. braziliensistambién presentó un patrón único de serodema yen los trabajos de otros autores esta especie hapresentado hasta nueve patrones (18,19). Estoshallazgos nos hacen suponer que el patrón deserodema no se encuentra relacionado con ladistribución geográfica de las especies.

En cuanto a la tipificación del complejo L.mexicana consideramos que fue limitada la utilidadde los anticuerpos monoclonales M3 y M8 para laidentificación de las especies L. amazonenesis yL. mexicana, respectivamente.

Dados los hallazgos de este estudio en el que seencontraron aislamientos de L. mexicana en laszonas geográficas en donde no se había reportadosu presencia hasta ahora, apoya la hipótesis delorigen antroponótico de la infección por losdesplazamientos y la movilidad de laspoblaciones. Así mismo, este hecho sugiereadelantar estudios de vectores con el fin dedilucidar este evento.

Con los resultados obtenidos en la caracterizaciónse confirma que los patrones isoenzimáticoscontinúan siendo de gran util idad en laidentificación de especies; la especie que no sepudo identificar por isoenzimas se debió a lapresencia de patrones que no coincidían con lospresentados en las cepas de referencia y la bajareactividad del aislamiento; esto podría ser por lapresencia de una variación dentro de la especieque se necesita comprobar con estudiosadicionales.

Agradecimientos

Al CIDEIM por la donación de los anticuerposmonoclonales y cepas de referencia. A Rafael

151


Góngora por la identificación de especies por elperfil de isoenzimas. Al Instituto Nacional de Saludpor la donación de un anticuerpo monoclonal. ASandra Moreno por su dedicación en elmantenimiento de cepas y preparación deantígeno.


Los autores manifiestan que no existe conflictode intereses.

Financiación

El presente trabajo se realizó con la financiacióndel Instituto Nacional de Dermatología FedericoLleras Acosta, E.S.E.; recursos propios, código20 del presupuesto de inversión.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):152-66ROJAS C.A.,WEIGLE K.A., TOVAR R. et al.

ARTÍCULO ORIGINAL

A multifaceted intervention to preventAmerican cutaneous leishmaniasis in Colombia:

results of a group-randomized trial †

Carlos A. Rojas 1, 2, Kristen A. Weigle 3, Rafael Tovar 4,2,Alba L. Morales 5, 6, Bruce Alexander 7, 2

† This paper is dedicated to the memory of Jaime Becerra Calle

1 Grupo de Epidemiología, Facultad Nacional de Salud Pública, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.2 Centro Internacional de Entrenamiento e Investigaciones Médicas, Cali, Colombia.3 Department of Epidemiology, School of Public Health, University of North Carolina, Chapel Hill, United

States of America4 Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas, Facultad de Ingeniería, Pontificia Universidad

Javeriana, Cali, Colombia5 Programa para la Eliminación de la Oncocercosis en América, Ciudad de Guatemala, Guatemala.6 Centro de Investigaciones Multidisciplinarias en Desarrollo, Cali, Colombia.7 Molecular and Biochemical Parasitology Group, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, UK

Research institution: This investigation was conducted when the principal author was working at theCentro Internacional de Entrenamiento e Investigaciones Médicas

Introduction. American cutaneous leishmaniasis is endemic in Colombia, where approximately6.000 new cases are reported every year. Current prevention and control measures are restrictedto the diagnosis and treatment of cases.Objective. To evaluate the efficacy of a multifaceted intervention to prevent the transmission ofLeishmania in the endemic focus of Tumaco, on the Pacific Coast of Colombia.Materials and methods. A group-randomized trial was conducted. Twenty villages were matchedaccording to prevalence of Leishmania infection, number of inhabitants and level of communityparticipation, and then randomly assigned to intervention or control. The intervention includeddeltamethrin-impregnated bednets, repellent (20% diethyltoluamide and 0.5% permethrin),modification of sand fly resting sites, and health education. Villages were under surveillance forone year and the use of the intervention measures monitored. The incidence of Americancutaneous leishmaniasis and Leishmania infection in the two groups were compared, adherenceto the intervention and adverse events were monitored, and the results were adjusted forvillage intraclass correlation.Results. Ten cases of American cutaneous leishmaniasis were confirmed in the interventionand 23 in the control group, OR = 0.42, 95% CI 0.14-1.26. The intervention had a greater effectin children < 10 years old, in people living on the periphery of the village and in villages with aprevalence of infection in small children > 1%. Adverse events associated with the use of thebednets and the repellent were reported in 2% of the participants and were always mild.Conclusion. Incident cases of American cutaneous leishmaniasis were reduced by 58% in theintervention group. However, the small number of cases renders the effect estimate impreciseand precludes us to claim a protective effect for the intervention. Specific populations could bethe targets of simpler and more cost-effective interventions in the future.

Key words: Leishmaniasis, cutaneous, /prevention & control, vector control, randomizedcontrolled trials, effect modifiers (Epidemiology), Colombia

Prevención de leishmaniasis cutánea americana en Colombia mediante una intervenciónmúltiple: resultados de un ensayo de grupos aleatorios

Introducción. La leishmaniasis cutánea americana es endémica en Colombia, donde cadaaño son notificados aproximadamente 6000 casos nuevos. En la actualidad las medidas deprevención y control están limitadas al diagnóstico y tratamiento de los casos.


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Biomédica 2006;26(Supl.1):152-66 PREVENTION OF LEISHMANIASIS IN COLOMBIA

Objetivo. Evaluar la eficacia de una intervención múltiple para prevenir la transmisión deLeishmania en el foco endémico de Tumaco, costa Pacífica de Colombia.Materiales y métodos. Se realizó un ensayo de grupos aleatorizados. Veinte veredas fueronpareadas según prevalencia de Leishmania, habitantes y participación comunitaria y luegoasignadas aleatoriamente a intervención o control. La intervención incluyó toldillos impregnadoscon deltametrina, repelente (N, N-dietil-m-toluamida 20% y Permetrina 0,5%), modificación delugares de reposo para los vectores y educación. Al cabo de un año se comparó la incidenciade infección y enfermedad producida por Leishmania en los dos grupos, se monitorearon laadherencia a la intervención y la aparición de efectos adversos. Los resultados finales fueronajustados por el efecto de correlación intra-grupo.Resultados. Se presentaron 10 casos de leishmaniasis cutánea americana en el grupo querecibió la intervención y 23 en el grupo control, OR=0,42, IC95% 0,14-1,26. La intervencióntuvo un mayor efecto en los niños menores de 10 años, en aquellos que residían en la periferiade la vereda y en veredas con una prevalencia de infección en niños pequeños mayor del 1%.Se reportaron eventos adversos leves asociados con el uso de los toldillos impregnados y elrepelente en 2% de los participantes.Conclusión. Los casos nuevos de Leishmaniasis cutánea americana se redujeron en un 58%en el grupo que recibió la intervención. Sin embargo, el número pequeño de casos hace quela estimación de la medida de efecto sea imprecisa y no nos permite afirmar que la intervencióntiene un efecto protector. Poblaciones específicas podrían ser el blanco de futuras intervencionesmás simples y costo-efectivas.

Palabras claves: Leishmaniasis cutánea, /prevención & control, control vectorial, ensayoscontrolados aleatorios, modificadores del efecto (Epidemiología), Colombia

American cutaneous leishmaniasis is an infectiousdisease caused by parasites of the genus Leish-mania that affects the skin and the upper respira-tory mucosa (1). It is transmitted by the bite ofinfected phlebotomine sand flies (Diptera: Psy-chodidae) and sylvatic and domestic mammalsserve as reservoirs for the parasite (2). The dis-ease is widespread in the Americas, ranging fromsouthern Texas to northern Argentina (3), and theannual number of cases and people who live inareas where American cutaneous leishmaniasisis transmitted has been estimated at 59,300 and59 million, respectively (4).

Control of American cutaneous leishmaniasis hasbeen restricted principally to case management(3,5). However, both diagnosis and treatment arechallenging. Accurate diagnosis, based on labo-ratory techniques, requires trained personnel andadequate equipment (6). On the other hand, treat-

ment with antimonial derivates such as Glucantime® is expensive, requires a parenteral route of ad-ministration and has frequent adverse effects (7).

Although sand flies can be eliminated by sprayingwith residual insecticides in many areas of theworld where leishmaniasis occurs (8-9), mostspecies involved in American cutaneous leishma-niasis transmission are associated with forestedhabitats where such interventions are not feasible.However in these areas many species of sandflies can be found resting on the bases of treetrunks during the day and attempts have beenmade to control the insects in these microhabi-tats (10). The application of DDT on the walls ofhouses, used since the 1950s to control mosquitovectors of malaria, produced a temporary reductionin the number of American cutaneousleishmaniasis cases in places where sand fliesentered houses to bite (11). A clinical trial recentlyshowed positive results in the control of cutane-ous leishmaniasis in Peru using a similar strat-egy (12).

Control measures targeted against the wildreservoirs of American cutaneous leishmaniasisis also impractical (2), and whether or not domesticanimals participate in the transmission of

Correspondencia:Carlos A. Rojas, Grupo de Epidemiología, Facultad Nacionalde Salud Pública, Universidad de Antioquia, Calle 62 No. 52-68, Medellín, Colombia.Phone (574) 210 6433, fax (574) 511 [email protected]


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American cutaneous leishmaniasis remainsdebatable (13-14).

Personal protection measures against insect bitessuch as insect repellents have been used for manyyears and have been recommended for the pre-vention of American cutaneous leishmaniasis (8).However, such measures are only suitable for in-dividuals such as military personnel and touristswho are exposed to sand fly bites for only shortperiods of time. Insecticide-impregnated bednetsare effective in the prevention of malaria and wellaccepted by communities in Latin America (15).However, the efficacy of this strategy in the pre-vention of American cutaneous leishmaniasis hasnot been evaluated. Deltamethrin-impregnatedbednets and a repellent containing 20% diethyl-toluamide (DEET) and 0.5% permethrin reducedbiting by sand flies in Colombia (16-17) althoughboth studies were too small to assess the effectof these interventions on Leishmania transmission.

To understand whether sustainable measuressuch as the above could reduce Americancutaneous leishmaniasis transmission when usedby inhabitants of Leishmania-endemic areas, weevaluated the efficacy of an intervention packagethat incorporated several methods: deltamethrin-impregnated bednets, repellent, painting sand flyresting sites with whitewash and health education.Exposure to infected sand flies in endemic areasmay occur in intra-, peri-or extra-domiciliarysituations or various combinations of the three andan intervention package of the type evaluated herewas felt to be preferable to any single control mea-sure.


Study area and population

The study was conducted between October, 1994,and June, 1997, in 20 villages located on the banksof four rivers in Tumaco, Nariño department,Colombia. This is an area of active American cu-taneous leishmaniasis transmission that has beenthe site of multidisciplinary research conductedsince 1982 by the Centro Internacional deInvestigaciones Médicas (CIDEIM) (18-24). All pre-vious Leishmania isolates have been identified asLeishmania (Viannia) panamensis (89%) andLeishmania (Viannia) braziliensis (11%) (19-20).

The predominant insect vectors are Lutzomyiatrapidoi (Fairchild & Hertig) and Lutzomyia gomezi(Nitzulescu) (21), and no cases of visceral leish-maniasis due to Leishmania (Leishmania)infantum have ever been diagnosed in the area.

The Tumaco area is classified ecologically as hu-mid tropical rain forest. Most human residencesare constructed on wooden platforms with woodenwalls and zinc or thatch roofs. Although the num-ber of residences per village varies from 19-122,all communities have two clearly distinguishablezones: a center with houses located around theschool and connected by sidewalks and a periph-ery, consisting of dwellings spread along theriverbank on either side of the center. Inhabitantsof the study area are the descendants of Africanslaves, with 46% less than 15 years old and a slightpreponderance of males (55%). The principaloccupation is subsistence farming, supplementedin some of the villages with fishing or lumbering.

The intervention

To protect participants in all possible transmis-sion settings, a multifaceted intervention was de-signed to include protective measures for the resi-dence (impregnated bednets), residence-surround-ings (painting of tree trunks with whitewash), andthe forest (use of a repellent). All measures wereintroduced and accompanied by an educationalintervention, and actively involved communitymembers and local health Institutions.

New polyester bednets (11.6 m2 and 35 holes percm2 ) were provided to all the participants afterbeing impregnated with K-Othrine E-25®(deltamethrin). The impregnation was done withthe participation of community members followingstandard procedures (15). Two bars of the repel-lent Nopikex® (20% DEET and 0.5% permethrin)were delivered to each residence. Participantswere instructed by demonstration on how to usethe bednets and the repellent (16-17). They wereespecially encouraged not to wash the nets. Treetrunks that could serve as resting sites for sandflies and were located <50 m from an inhabitedresidence were painted with whitewash to a heightof 1.5 m from the ground. Every three months thebednets were impregnated, additional repellentsupplied, and the tree trunks repainted.

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An educational program designed and imple-mented by the Centro de InvestigacionesMultidisciplinarias en Desarrollo (CIMDER) thatincluded information about American cutaneousleishmaniasis, its mode of transmission and howto use the different preventive measures accom-panied the preventive measures.

Study design and data collection

The study protocol and the consent forms werereviewed and approved by CIDEIM’s InstitutionalReview Board. Inhabitants of the 20 villages wereinvited to participate in a group-randomized trialand written consent was obtained from all theadults and from parents or guardians of minors.Initially a baseline census and exams wereconducted. Participants were examined for scarsor active skin lesions suspected to be Americancutaneous leishmaniasis, using clinical criteriadefined in a previous study (22). The leishmaninskin test was applied to detect prior Leishmaniainfection (23). The status of community participa-tion in each village was assessed and quantifiedusing a community participation score (MoralesAL, unpublished data).

Before randomization, villages were paired accord-ing to prevalence of leishmanin skin test positivein children <5 years old, number of inhabitants,and community participation score. One village ineach pair was randomly assigned to receive theintervention; the other remained as a control. Con-trol villages did not receive any of the studied in-terventions, but like the intervention villages, theywere subject to active surveillance and case man-agement of American cutaneous leishmaniasiscases. Randomization was performed using a lot-tery system and was carried out with the partici-pation of delegates from the 20 villages.

After randomization, all the participants were ex-amined and those with a previous negativeleishmanin skin test tested again. New residents,willing to participate, were enrolled even if they didnot participate in the baseline assessment. Theintervention measures were begun shortly afterthis pre-intervention exam and the intervention andcontrol villages were followed during approximately12 months (July, 1996-June, 1997). The use ofbednets and repellent was monitored in a repre-

sentative sample of residences (17%) in eachstudy village. At the end of the study, the numberof impregnations per bednet was recorded, as wellas the number of times they were washed betweentwo consecutive impregnations. Community healthvolunteers trained to detect suspected Americancutaneous leishmaniasis cases searched their vil-lages for new cases and reported to the project’sstaff during their monitoring visits to the villages.At the end of the follow-up period all the partici-pants were examined (post-intervention exam), andthose with a negative leishmanian skin test dur-ing pre-intervention were tested again.

Study outcomes

An incident case of American cutaneous leish-maniasis was defined as a person without activeskin lesions during the pre-intervention exam whowas later found to have lesions that were parasi-tologically confirmed as American cutaneous leish-maniasis (6). Since re-infection with American cu-taneous leishmaniasis has been documented (19),the appearance of new lesions in participants withhistory of American cutaneous leishmaniasis,were also considered as incident cases.

As in previous studies, we used skin test conver-sion as a marker for newly acquired infections (22-23). An incident Leishmania infection was definedas leishmanin skin test conversion from non-re-active in the pre-intervention exam to reactive inthe post-intervention. We used the leishmanin skintest produced by the Instituto Nacional de Saludde Colombia. Throughout the study we used thesame lot of leishmanin skin test (No. 001, March,1994).

Covariates

Information about risk factors for American cuta-neous leishmaniasis (24) and potential effect modi-fiers was collected during the baseline assess-ment (1994-1995). Variables were screened bycontingency tables, and those that were associ-ated with either of the study outcomes in the con-trol group were selected for the analysis. Variableswith >30% missing values were excluded. A priori-defined effect modifiers were included in the analy-sis independently of their association with thestudy outcomes.

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The following variables were included in the analy-sis:Individual level: age, gender, farming occupation,history of American cutaneous leishmaniasis,presence of typical American cutaneous leishma-niasis scars, farming activities, daily forest hours,and entering the forest;Household level: residence located on the periph-ery of the village, residence borders the forest,residence borders the river, roof made of thatch,external walls made of bamboo, incompletenumber of external walls (living area not com-pletely enclosed by walls), latrine located outsidethe residence, distance from residence to the for-est, distance from the next residence and totalnumber of animals per residence;Village level: community participation score,prevalence of Leishmania-infection in children <5years old during the baseline exam, and numberof inhabitants.

Data analysis

Cumulative incidences of American cutaneousleishmaniasis and Leishmania-infection were cal-culated for the intervention and control group. ForAmerican cutaneous leishmaniasis only those whodid not have active skin lesions at the pre-inter-vention exam and who were examined during post-intervention were included in the analysis. For in-fection we included only those with a non-reac-tive leishmanin skin test in the pre-interventionexam who were tested during post-intervention.The effect of the intervention was calculated usingrisk ratios (RR) (intervention/control) and risk dif-ferences (RD) (intervention-control), and 95% con-fidence intervals (CI) were computed for descrip-tive purposes using standard methods (25).

The distribution of the risk factors between thetwo study groups was compared and the strengthof the association measured with the odds ratio(OR). Those risk factors that were associated withstudy group were considered potentialconfounders of the intervention-outcomeassociation. Logistic regression was used toadjust for the effect of multiple confounders (26).Separate models were constructed for each of thestudy outcomes. Nested models were constructedto identify the least biased estimate of the inter-vention effect (25). A variable that produced a

change in the intervention’s OR>10% after beenremoved from the model, was considered a con-founder and retained in the final model. Once thefinal model was defined, the generalized estimat-ing equations method (GEE) (27) was used toestimate the parameters while taking into accountthe correlation of observations within villages (non-independence). The type of correlation used wasexchangeable.

A priori-defined effect modifiers included age, gen-der, farming occupation, history of American cu-taneous leishmaniasis, residence proximity to theforest, residence located on the periphery of thevillage, roof made of thatch, incomplete numberof exterior walls, prevalence of infection in children<5 years old, community participation score, andvillage size. For each effect modifier we calcu-lated stratum-specific RR of the effect of the in-tervention. We then used logistic regression andevaluated effect modification using interactionterms in models that included all the confoundersalready identified. All the analyses were doneusing SAS version 6.12 (SAS Institute, Cary, NC).

Results

Study populations

During the pre-intervention assessment, 5,009persons resided in the study area. A total of 4,630(92%) participated in the exam. Most of the non-participants were absent during the days of theexam. Twenty-seven participants were found withskin lesions suggestive of American cutaneousleishmaniasis and were excluded from the studypopulation. The rest (4,603) constitute the popu-lation considered susceptible to American cuta-neous leishmaniasis. A total of 2,738 participantshad a negative skin test and constituted the popu-lation susceptible to Leishmania infection. Refusalto be tested was small (3.6%).

Seventy-nine percent of those susceptible toAmerican cutaneous leishmaniasis had a secondphysical examination during the post-interventionexam and 77% of those susceptible to infectionwere skin tested again. These rates were the samefor the intervention and control groups. Loss tofollow-up due to emigration was somewhat greaterin the control group, while absence from the vil-lage on the days of the post-intervention exam

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was somewhat more common in the interventiongroup. Refusal rates were less than 2% in the twostudy groups. Those who were not examined ortested during the post-intervention survey includeda larger proportion of teenagers and farmerscompared to the studied groups; however, theydid not differ by gender or history of Americancutaneous leishmaniasis. Characteristics of non-participants were the same in the intervention andcontrol group (data not presented).

Thirteen persons from the control group were ex-cluded because they moved to an intervention vil-lage during the follow-up period. No movementsin the opposite direction were documented. Thestudy groups to evaluate the intervention’s effecton the incidence of American cutaneousleishmaniasis included 1,791 in the interventiongroup and 1,840 in the control group. The studygroups to evaluate the intervention’s effect on theincidence of infection included 1,066 and 1,034persons, respectively.

The mean follow up time for the intervention vil-lages (12.6 months) was slightly longer than forthe control villages (12.2 months). The number ofperson-years observed for those susceptible toAmerican cutaneous leishmaniasis was 1,891 and1,873 person-years in the intervention and controlgroup, respectively. The number of person yearsobserved for those susceptible to infection was1,130 and 1,051 person-years, respectively.

Identification of potential confounders

Characteristics of the residence (distance to theforest <50 m, RR=12.5, 95% CI 1.7-93.5 and roofmade of thatch, RR=3.5, 95% CI 1.4-8.6) and thevillage (prevalence of infection in children <5 yearsold, RR=13.4, 95% CI 3.9-45.9 and communityparticipation score <50, RR=5.1, 95%CI 2.0-2.9)were strongly associated with American cutane-ous leishmaniasis in this setting. However, noassociation was observed between behavioral andoccupational activities and American cutaneousleishmaniasis. On the other hand, several behav-ioral and occupational activities were moderatelyassociated with infection, as were characteristicsof the residence (roof made of thatch, RR=1.9,95% CI 1.1-3.3 and walls made of bamboo,RR=1.9, 95% CI 1.2-3.2) and the village (preva-

lence of infection in children <5 years old, RR=3.1,95% CI 2.0-4.9 and community participation score<50, RR=2.0, 95% CI 1.3-3.1).

The distribution of these risk factors between thetwo study groups are compared in table 1. Wepresent the information for those susceptible toAmerican cutaneous leishmaniasis. In general, thestudy groups were comparable in the distributionof behavioral and occupational risk factors, butdiffered in the distribution of those factors relatedwith the residence and the village. Residences inthe control group were more likely to be located atthe periphery, close to the forest, have roof madeof thatch, have incomplete external walls and havemore animals. Also, control villages had lowercommunity participation scores. On the other hand,villages in the intervention group had a greater preva-lence of infection in children <5 years old, had alarger number of inhabitants and had slightly moremales.

Based on associations with the outcome and studygroup assignment, potential confounders of theeffect of the intervention on American cutaneousleishmaniasis were: residence located on the pe-riphery of the village, roof made of thatch, distanceto the forest <50 m, number of animals in the resi-dence, community participation score and preva-lence of infection in children <5 years old. Poten-tial confounders of the effect of the intervention oninfection were; sex, roof made of thatch, commu-nity participation score and prevalence of infec-tion in children <5 years old.

Incidence of American cutaneousleishmaniasis and infection

Thirty-three new cases of American cutaneousleishmaniasis were detected during the study, 23in the control group and 10 in the interventiongroup. Cases in the control group appearedthroughout the follow-up period, compared tocases in the intervention group that were absentat the beginning and concentrated at the middleand end of the follow up period (figure 1). Casesin the control group were somewhat younger, onaverage, than those in the intervention group,though the difference was well within the range ofchance expectation (p=0.47). Cases in the twostudy groups were comparable in the rest of the

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Figure 1. Detection of American cutaneous leishmaniasiscases during the follow up period by study group. Tumaco,Colombia (1996-1997).

Table 1. Comparison of sociodemographic characteristics, behaviors, occupational activities, and environmental conditionsbetween the intervention and the control groups. Tumaco, Colombia (1996-1997).

Factor Intervention Control Odds ratio †(N=1,791) (N=1,840) 95% CI

Age (years) 0-4 314 (17.5) 354 (19.3) 0.86 (0.72-1.03) 5-9 320 (17.9) 355 (19.3) 0.87 (0.73-1.05) 10-19 364 (20.3) 363 (19.7) 0.97 (0.81-1.16) >20 793 (44.3) 768 (41.7) 1.0

Male sex 995 (55.6) 955 (51.9) 1.16 (1.02-1.32)

Typical scar present initially 162 (9.1) 160 (8.7) 1.04 (0.83-1.31)

Farming occupation 386 (26.9) 361 (24.2) 1.15 (0.98-1.36)

Entered the forest in last year 898 (68.1) 1,000 (66.8) 1.06 (0.91-1.24)

Days entered the forest in last week 4-7 346 (30.9) 381 (30.8) 1.08 (0.89-1.31) 1-3 332 (29.6) 329 (26.6) 1.20 (0.99-1.47) 0 442 (39.5) 527 (42.6) 1.0

Daily forest hours >5 508 (38.5) 540 (36.0) 1.11 (0.95-1.30)

Residence located on the periphery 470 (36.3) 575 (43.5) 0.74 (0.63-0.87)

Distance to the forest <50 m 495 (38.5) 775 (58.8) 0.44 (0.37-0.51)

Roof made of thatch 187 (14.4) 223 (16.9) 0.83 (0.67-1.02)

Incomplete number of exterior walls 114 (8.8) 155 (11.8) 0.72 (0.56-0.93)

Exterior walls made of bamboo 312 (24.1) 308 (23.3) 1.04 (0.87-1.25)

Number of animals in the residence >5 858 (66.1) 982 (74.3) 0.67 (0.57-0.80)

Village size (inhabitants) >200 1,540 (86.0) 1,179 (64.1) 3.44 (2.92-4.05)

Village community participation score <50 567 (31.7) 652 (35.4) 0.84 (0.73-0.97)

Village prevalence of infection in <5 years old >10% 467 (26.1) 397 (21.6) 1.38 (1.17-1.61) 1-9% 403 (22.5) 366 (19.9) 1.29 (1.09-1.52) 0% 921 (51.4) 1,077 (58.5) 1.0

† Odds ratio for a factor is odds in intervention/odds in control

characteristics. Most lesions were of short dura-tion, located on the extremities and had the typi-cal appearance of a rounded ulcer with raised bor-ders (table 2).

The cumulative incidence of American cutaneousleishmaniasis was 0.56% in the intervention and1.25% in the control group, RR=0.44, 95% CI 0.21-0.94 (table 3). The risk ratio did not changesignificantly after adjusting for confounding andvillage intraclass correlation. The cumulativeincidence of infection (skin test conversion) wassimilar in the two study groups, 7.69% in theintervention and 7.74% in the control, RR=0.99(table 3). The risk ratio changed slightly afteradjusting for confounding and intraclasscorrelation, but did not suggest any interventioneffect, OR=1.06, 95% CI 0.54-2.08.

Effect modification

Table 4 presents stratum-specific ORs for the as-sociation between the intervention and American

159


cutaneous leishmaniasis, adjusted for villageintraclass correlation. Compared to the overall ef-fect, a stronger effect of the intervention was ob-served in children under 10, non farmers, personsliving on the periphery of the village, persons livingin houses that facilitate the entrance of sand flies(roof made of thatch, incomplete external walls),persons living in villages with low community par-ticipation score. After adjusting for residence lo-cated on the periphery of the village, which weconsidered the most important confounder for thisassociation in this study, a stronger effect wasobserved in those who live in villages with a preva-lence of infection in small children >1% (OR=0.31,95%CI 0.10 – 0.96) and in women (OR=0.24, 95%CI 0.03–1.60). Because of the small number ofcases, not all the stratum-specific effect estimatescould be adjusted for confounding.

Table 2. Characteristics of incident cases of Americancutaneous leishmaniasis. Tumaco, Colombia (1996-1997).

Intervention Control(N=10) (N=23)

n % n %

Age (years) 0-4 2 20.0 5 21.7 5-9 1 10.0 8 34.8 10-19 4 40.0 6 26.1 >20 3 30.0 4 17.4

Male sex 6 60.0 14 60.9

Positive skin test in 0 0.0 1 4.3pre-intervention

Typical scar in 0 0.0 2 8.7pre-intervention

Duration of lesion (months) <1 6 60.0 12 52.2 2 1 10.0 8 34.8 >3 3 30.0 3 13.0

Lesion location Head and neck 2 20.0 6 28.6 Trunk 1 10.0 1 4.8 Upper extremity 4 40.0 7 33.3 Lower extremity 5 50.0 11 52.4

Lesion characteristics Ulcer with raised borders 9 90.0 15 71.4 Ulcer with flat borders 2 20.0 6 28.6 Oval or rounded lesions 9 90.0 18 85.7 Presence of satellite lesions 1 10.0 4 19.0 Multiple lesions 3 30.0 7 33.3 Grouped lesions 0 0.0 1 4.8 Painful 2 20.0 6 28.6 Local lymphadenities 0 0.0 4 19.0

Stratum-specific ORs for the association betweenthe intervention and Leishmania infection arepresented in table 5. A stronger effect of the inter-vention was observed among those who lived inresidences with roof made of thatch (OR=0.36,95% CI 0.07-1.78). After adjusting for age andprevalence of infection in children <5 years old, amoderate effect was observed for males (OR=0.58)and children (OR=0.54); however, the 95% CI in-cluded the null value for both of these subgroups.Similar to what we observed with American cuta-neous leishmaniasis, the intervention seemed tobe more effective in larger villages (OR=0.67, 95%CI 0.38-1.17).

Adherence of participants tothe intervention measures

Frequency of bednet use was high and consistentduring the study. Among the participants who wereinterviewed during the first and second monitoringvisits, 93% and 96% respectively reported sleep-ing under the bednet every night. This was con-firmed during the two unannounced visits to theresidences, where approximately 85% of thebednets were in use by the participants. Becausethere was not enough variation we could not evalu-ate dose effect for bednet use.

Four of the intervention villages only had threeimpregnation sessions due to logisticalconstraints. Complete adherence to theimpregnation schedule, defined as the percent-age of bednets that received all the impregnations(4 or 3 depending on the village), varied amongvillages (17%-100%) (data not presented). Veryfew participants abstained from washing theirbednets between two impregnations. Seventy-three percent of the participants reported theywashed the bednets three or more times duringthat period (approximately 3 months). Thefrequency of adverse effects with the impregnatedbednets reported during the monitoring visits was2%. The most common adverse effect washeadache. Among the villages that were offeredthe four impregnations, no significant differenceswere observed in the incidence of American cuta-neous leishmaniasis and the incidence of Leish-mania infection between those who had four andthose that had less than four impregnations.

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Table 3. Crude and adjusted effect measures for incidence of American cutaneous leishmaniasis and incidence ofLeishmania infection. Tumaco, Colombia (1996-1997).

Outcome Intervention Control Effect 95% CImeasure

ACL (skin lesions) No. of cases 10 23 Total examined 1,791 1,840 Cumulative incidence (%) 0.56 1.25 Risk difference (RD) 0.68 (0.08-1.31) Risk ratio (RR) 0.44 (0.21-0.94) Odds ratio (OR) 0.44 (0.21-0.93) OR adjusted for intraclass Correlation 0.43 (0.13-1.46) Adjusted OR (full model)† 0.45 (0.18-1.14) Adjusted OR (final model)‡ 0.43 (0.18-1.04) Adjusted OR for intraclass Correlation (final model) ‡ 0.42 (0.14-1.26)

Infection (LST conversion) No. LST positive 82 80 Total tested 1,066 1,034 Cumulative incidence (%) 7.69 7.74 RD 0.05 (-1.95-2.05) RR 0.99 (0.74-1.34) OR 0.99 (0.72-1.37) OR adjusted for intraclass Correlation 1.01 (0.55-1.84) Adjusted OR (full model) # 0.86 (0.58-1.28) Adjusted OR (final model) ¶ 0.85 (0.57-1.26) Adjusted OR for intraclass Correlation (final model) ¶ 1.06 (0.54-2.08)

ACL: American cutaneous leishmaniasis, LST: leishmanin skin test† OR adjusted for age, residence located on the periphery, roof of thatch, distance to the forest <50m, community

participation score and prevalence of infection in children <5 years old‡ OR adjusted for residence located on the periphery# OR adjusted for age, sex, roof of thatch, community participation score and prevalence of infection in children < 5

years old¶ OR adjusted for age and prevalence of infection in children <5 years old.

Participants with less than four impregnationswashed more often their bednets, OR=2.0, 95%CI1.4-2.9, adjusted by residence located on the pe-riphery of the villages and by communityparticipation score.

Use of the repellent decreased over time. At thebeginning of the intervention, 42% of theinterviewed sample reported using the repellenteveryday. During the last exam, only 5% (40/781)used it every day; however, 55% were using itbetween 4 and 6 days per week. The repellentwas used principally during the day in the forest(61%) and during the night at home (23%).Differences were reported by gender. More women(11%) reported they never used the repellent, and

more men (63%) reported they used it between 4and 6 days per week. Women used the repellentmost frequently at home during the night (39%),whereas men used it in the forest during the day(84%). Almost 100% of the interviewed participantsliked the repellent (acceptance). No significantdifferences were observed in the incidence ofLeishmania infection in those who used therepellent >4 days per week compared to thosewho used it less frequently, 18% (23/131) and 11%(13/113), respectively, (p>0.1). The frequency ofadverse effects with the repellent was also 2%and the most common was itching.

Since the modification of the tree trunks with white-wash was not a personal intervention, adherence

161


to this component of the intervention was evalu-ated in terms of the participation of communitymembers in its implementation and sustainability.Community members participated in large num-bers in painting the tree trunks the first time. How-ever, participation decreased gradually during thefollow-up period in most villages. Because of this,

not all the trees that were part of this interventioncould be repainted every 3 months as planned.

Discussion

We found a moderate, not statistically significant,reduction in the overall cumulative incidence ofamerican cutaneous leishmaniasis in the

Table 4. Stratum-specific odds ratios for the association between the intervention and American cutaneous leishmaniasis.Tumaco, Colombia (1996-1997).

Factor Intervention Control Odds ratio (OR) * Adjusted OR †¶(N=1,791) (N=1,840) 95% CI 95% CI

N Cases N Cases

Overall effect 1,791 10 1,840 23 0.43 (0.13-1.46) 0.42 (0.14-1.26)Age (years) 0-9 634 3 709 13 0.22 (0.05-1.09) >10 1,157 7 1,131 10 0.71 (0.19-2.71) 0.59 (0.16-2.20)

Sex Male 995 6 955 14 0.41 (0.13-1.32) 0.52 (0.17-1.58) Female 796 4 885 9 0.50 (0.06-4.06) 0.24 (0.03-1.60)

Farming occupation Yes 386 3 361 3 0.97 (0.16-5.79) 0.68 (0.11-4.45) No 1,050 5 1,132 17 0.29 (0.07-1.18) 0.34 (0.09-1.24)

Residence located on theperiphery of the village Yes 470 5 575 19 0.34 (0.09-1.19) No 824 2 746 0

Roof made of thatch Yes 187 1 223 8 0.17 (0.02-1.46) No 1,110 6 1,098 11 0.52 (0.16-1.67) 0.59 (0.21-1.64)

Incomplete number ofexterior walls Yes 114 1 155 4 0.32 (0.03-2.91) 0.58 (0.06-5.16) No 1,182 6 1,159 15 0.39 (0.09-1.63) 0.40 (0.11-1.48)

Distance to the forest <50 m Yes 495 5 775 18 0.39 (0.11-1.36) No 790 2 542 1 1.01 (0.07-13.76) 1.16 (0.12-10.70)

Village size (inhabitants) <200 251 1 661 8 0.37 (0.07-1.71) 0.97 (0.36-2.96) >200 1,540 9 1,179 15 0.43 (0.08-2.20) 0.33 (0.08-1.23)

Village communityparticipation score <50 567 2 652 17 0.14 (0.05-0.43) >50 1,224 8 1,188 6 1.00 (0.21-4.78) 1.46 (0.26-8.29

Village prevalence of infection in < 5 years old >1% 870 8 763 20 0.36 (0.11-1.15) 0.31 (0.10-0.96) 0% 921 2 1,077 3 0.53 (0.04-6.24)

Number of cases in specific strata do not always sum to the total number of cases due to missing data.* Risk ratios and odds ratios (OR) estimates were approximately the same, therefore OR results are reported.Odds ratios were calculated using logistic regression and are adjusted for village intraclass correlation† Odds ratio adjusted by residence located on the periphery¶ Not adjusted if confounding was not present in either strata or if too few cases available to fit adjusted model.

162


intervention group (OR=0.42, 95% CI 0.14-1.26).Although the small number of cases in our studyrenders the estimates imprecise, the interventioneffect was stronger in subgroups such as chil-dren, women, those who lived in large villages(>200 inhabitants) and those who lived in villageswith low community participation score.

Table 5. Stratum-specific odds ratios for the association between the intervention and Leishmania infection. Tumaco,Colombia (1996-1997).

Factor Intervention Control Odds ratio (OR) * Adjusted OR †¶(N=1,066) (N=1,034) 95% CI 95% CI

N Cases N Cases

Overall effect 1,066 82 1,034 80 1.01 (0.55-1.84) 1.06 (0.54-2.08)

Age (years)

0-9 529 14 580 26 0.61 (0.20-1.90) 0.54 (0.20-1.49) >10 537 68 454 54 1.10 (0.56-2.14) 1.02 (0.55-1.87)

Sex Male 546 37 507 49 0.66 (0.32-1.35) 0.58 (0.29-1.15) Female 520 45 527 31 1.50 (0.74-3.02) 1.31 (0.73-2.37)

Farming occupation Yes 99 16 94 19 0.76 (0.27-2.16) 0.71 (0.26-1.91) No 760 50 753 46 1.10 (0.47-2.60) 1.11 (0.53-1.84)

Residence located on theperiphery of the village Yes 219 23 253 27 0.86 (0.38-1.94) 0.85 (0.39-1.84) No 526 35 478 29 0.86 (0.25-2.98) 1.10 (0.42-2.86)

Roof made of thatch Yes 98 4 103 12 0.36 (0.07-1.78) 0.33 (0.08-1.36) No 649 54 628 44 1.27 (0.70-2.31) 1.21 (0.72-2.03)

Incomplete number ofexterior walls Yes 62 8 97 4 1.16 (0.19-6.92) 1.54 (0.32-7.39) No 685 50 630 52 1.05 (0.46-2.39) 1.16 (0.56-2.42)

Distance to the forest <50 m Yes 261 20 414 37 0.95 (0.39-2.36) 0.80 (0.36-1.80) No 481 37 315 19 1.31 (0.48-3.54) 1.42 (0.54-3.72)

Village size (inhabitants) <200 158 18 359 22 1.89 (0.61-5.86) 1.50 (0.49-4.56) >200 908 64 675 58 0.70 (0.35-1.37) 0.67 (0.38-1.17)

Village communityparticipation score <50 283 26 263 32 0.80 (0.37-1.71) 0.88 (0.47-1.64) >50 783 56 771 48 1.21 (0.60-2.45) 1.00 (0.57-1.78)

Village prevalence of infection in <5 years old >1% 449 41 328 40 0.79 (0.35-1.81) 0.79 (0.34-1.84) 0% 617 41 706 40 1.26 (0.97-1.64) 1.19 (0.84-1.67)

Number of cases in specific strata do not always sum to the total number of cases due to missing data.* Risk ratios and odds ratios (OR) estimates were approximately the same, therefore OR results are reported.Odds ratios were calculated using logistic regression and are adjusted for village intraclass correlation† Odds ratio adjusted by age, prevalence of infection in children <5 years old.¶ Not adjusted if confounding was not present in either strata or if too few cases available to fit adjusted model.

The community participation score findings con-tradict our original hypothesis that the interven-tion would have a greater effect in better orga-nized and in villages with a higher degree ofcommunity participation (score>50). To determinewhether the score was a surrogate for somethingelse, we measured its association with other

163


factors. The community participation score wasstrongly associated with residence located on theperiphery (OR=11.3, 95% CI 9.3-13.6), villageswith a greater proportion of residents who lived onthe periphery had lower scores; and prevalenceof infection in children <5 years old (OR=8.2, 95%CI 7.0-9.7), villages with a higher prevalence ofinfection in young children have lower score.Community score seems to be a correlate of lesscentralized dense village, with a greater risk forAmerican cutaneous leishmaniasis because moreresidences are located near the forest. On theother hand a high score does not seem to be arequirement for a successful intervention.

We examined other possibilities beside the inter-vention that could explain the reduction in the in-cidence of American cutaneous leishmaniasis.There was an unbalanced distribution of potentialrisk factors between the study groups; however,after controlling for these differences in the analy-sis our estimation of the intervention effect didnot change significantly.

To see if American cutaneous leishmaniasis wasmore endemic in the control villages we comparedthe prevalence of American cutaneous leishma-niasis in the two study groups before the inter-vention. During the baseline exam (1994-1995),no significant differences were observed betweenthe two groups in terms of suspected lesions,history of American cutaneous leishmaniasis andpresence of scars. During the pre-interventionexam (1996) the prevalence of participants withsuspected lesions was 0.48% (11/2,283) in theintervention villages and 0.68% (16/2,347) in thecontrol villages (p = 0.37) (Rojas CA, unpublisheddata).

The observed difference in the incidence of Ameri-can cutaneous leishmaniasis could have resultedfrom other type of intervention that decreased thecontact with sand flies in the intervention villages.Sand flies are susceptible to the residual insecti-cides used to control malaria (8) and Americancutaneous leishmaniasis transmission could alsobe affected by the permethrin-impregnated bednetsused for malaria prevention. Malaria vector-controlactivities were interrupted in the 20 study villagesduring the year of follow-up. Instead, detection and

treatment of malaria cases was increased, pay-ing special attention to the control group. No out-breaks of malaria were reported during the study.It is also unlikely that participants in the interven-tion group used additional protective measures.According to information collected before the in-tervention, inhabitants of the study villages do notuse insecticides or repellents at home. These aretoo expensive for most of the participants (RojasCA, unpublished data).

Case detection was conducted in the same wayin both study groups. Surveillance activities basedon community volunteers were implemented in thestudy villages before randomization, and all thevolunteers were selected, trained, and followed inthe same way. Personnel who were not aware ofthe patient’s study group did the laboratoryconfirmation of the suspected lesions. It is unlikelythat bias in the detection of cases accounted forthe observed difference. Neither our surveillancesystem, nor our physical examination protocolduring the post-intervention exam was exhaustive,and it is possible that we missed some cases.This was likely to have affected the two studygroups in the same way, and hence would haveproduced non-differential misclassification, biasingthe effect measure estimate towards the null valueand underestimating the effect of the intervention.

It was interesting that the intervention did notreduce the incidence of Leishmania infection. Apossible explanation for the discrepancy in theresults between disease and infection is that theintervention had an effect on the pathogenicity ofAmerican cutaneous leishmaniasis. In the naturalhistory of the infectious diseases, infection pre-cedes the appearance of clinical disease andpathogenicity is the transition from infection to dis-ease (1). The pathogenicity of American cutane-ous leishmaniasis is affected among other factorsby the number of Leishmania parasites (28) andby the host’s immune response.

The intervention measures could have decreasedthe number of sand fly bites, and therefore thenumber of parasites introduced in the human host,to a degree that was insufficient to promote thedevelopment of clinical disease, but still enoughto generate an immune response in the host

164


(leishmanian ski test conversion). This could ex-plain why the same proportion of participants inthe two study groups showed skin test conver-sion, but a larger proportion in the control groupdeveloped American cutaneous leishmaniasis.

Similar results were observed in Sudan (1995-1996), where a trial was conducted to assess theefficacy of pyrethroid-impregnated bednets on thetransmission of visceral leishmaniasis, and asignificant reduction in the number of clinical casesin the intervention village observed. Also, the highdisease/infection ratio in the control village wasreversed into a high infection/disease ratio in theintervention village (29). According to the WHOthese changes in the pathogenesis of the diseasemay be due to a reduced number of infective bitesor to reduced parasite doses received by peopleusing the bednets. Similarly, in our study thedisease/infection ratio was higher in the control(0.16) than in the intervention group (0.07).

Previous studies using pyrethroid-impregnatedbednets have been effective in reducingcutaneous leishmaniasis due to L. tropica in Syria(30), and visceral leishmaniasis in Sudan (29). Wereport for the first time the use of a multifacetedintervention, which includes impregnated bednets,for the prevention of cutaneous leishmaniasis inthe New World. Current control strategies arelimited to detection and treatment of cases;however, since humans have not been proven tobe reservoirs for American cutaneous leishmania-sis, this strategy does not have any effect on thetransmission and appearance of new cases.

Although pyrethroid-impregnated bednets havebeen shown to reduce malaria transmissionsignificantly (31) and would be expected to havea similar effect on leishmaniasis, there are sev-eral drawbacks attached to their widespread use.These include (a) problems with ensuring adequatecoverage of the mesh during impregnation, (b) riskof intoxication if users miscalculate the correctconcentration of insecticide or substitutepyrethroids for other, more toxic chemicals and(c) environmental contamination associated withwashing nets or disposal of surplus insecticides.Fish, an important economic resource in the studyarea, are particularly susceptible to pyrethroid

intoxication. These problems could be reduced(although not eliminated) by supplying people withpre-impregnated bednets.

A drawback of the repellent used was that it wasformulated as a soap whose protective effect wasnot retained after rinsing. This might have discour-aged some participants from using it when nec-essary.

Although not evaluated adequately during thepresent study, regular whitewashing of the lowertrunks of trees used by sand flies as diurnal restingsites is a low-cost, sustainable measure that canbe carried out by untrained individuals withoutsafety equipment. This measure would not killsand flies but might have the effect of distancingthem from the communities further into the forestwhere other blood meal sources are available.Sand flies have relatively short flight ranges (32)so the width of such barrier zones (and thereforethe number of trees that would have to be treated)is not large. Many of the large trees favored bysand flies as diurnal resting sites were also usedby the communities as latrines, particularly exam-ples of breadfruit (Artocarpus artilis) with largebuttress roots. This would be a further incentiveto maintain these trees free from sand flies.

The policy implications for the control of Americancutaneous leishmaniasis with a multifacetedintervention need to be considered carefully. Acost effectiveness analysis conducted during thefirst year of the intervention yielded a bigincremental cost effectiveness ratio (ICER) (33).This represents the additional cost that societywould have to pay for the intervention in order toprevent an additional case of American cutaneousleishmaniasis, compared to the cost effectivenessof current case management activities (34).Sensitivity analysis showed that the ICERdecreases significantly with an increment in theincidence of American cutaneous leishmaniasis(33). Also, a multifaceted intervention could bemore cost effective if the beneficial effect on thetransmission of other vector-borne diseasesendemic in the study area, such as malaria anddengue, is taken into account. Sustainability ofthis intervention also has constraints, which havebeen discussed in detail elsewhere (35).

165


One limitation of our study is that we could notevaluate the effect of the different interventionmeasures separately, although the effectmodification pattern observed implies that thebednets were more effective than the repellent inthe present study. The lack of an intervention effectin farmers may indicate that the repellent had littleeffect. To target interventions to high-riskpopulations such as children and villages with ahigh prevalence of infection could be a more costeffective alternative. Our data shows how theeffect was higher in these groups.

Acknowledgements

The authors thank the 20 communities that werepart of the study, especially the volunteers whoparticipated in project activities. We are gratefulto Wilson Cortés Montaño, Aura García, EdgarMuñoz, Nancy Gore Saravia and the clinical stafffrom CIDEIM; Ricardo Rodríguez, Adalberto Ruizand Esmeralda Burbano from CIMDER. We ap-preciate the collaboration of the Hospital SanAndrés and the Malaria Control Program ofTumaco, especially Dr. Jesús Quiñones, WilsonCasierra, Rigoberto Erazo, Andrés Dajome, GuidoPantoja, Beatriz Caicedo, Margarita Cortés, AlbertoReynel, Rosa Aída Ramirez, and Alirio Castillo.

Financial support

A first draft of this paper was written while theprincipal author was in receipt of a WHO ResearchTraining Grant. The study was supported by theInternational Development Research Center ofCanada, IDRC file 92-0223-01.

Conflicts of interest

The authors have no conflicts of interest concern-ing the work reported in this paper.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):167-79 EFFECT OF KNOWLEDGE AND ECONOMIC STATUS ON SANDFLY CONTROL

ARTÍCULO ORIGINAL

Effect of knowledge and economic status on sandfly controlactivities by householders at risk of cutaneous leishmaniasis in

the subandean region of Huila department, ColombiaRaúl H. Pardo 1, Alexander Carvajal 2, Cristina Ferro 1, Clive R. Davies 3

1 Laboratorio de Entomología, Subdirección de Investigación, Instituto Nacional de Salud, Bogotá D.C.,Colombia.

2 Unidad de Entomología, Secretaría de salud Departamental del Huila, Neiva, Colombia.3 Department of Infectious and Tropical Diseases, London School of Hygiene and Tropical Medicine, London,

United Kingdom.

Introduction. Householder vector control measures can be encouraged by health promotioncampaigns which take into account peoples’ attitudes and focus on key gaps in knowledge.Objectives. To describe household sandfly control practices in an endemic area of cutaneousleishmaniasis in the department of Huila, Colombia, and determine how these are influencedby attitudes, knowledge and socioeconomic status.Materials and methods. A household questionnaire was applied to collect information on:demography, socioeconomic status, knowledge of cutaneous leishmaniasis and of sandfliesand their role in transmission, and the control activities practiced. Indoor sandfly abundancewas estimated by light trap collections.Results. Amongst 249 interviewees, 86% knew about cutaneous leishmaniasis and 98% sandflies. 35% of interviewees who knew about cutaneous leishmaniasis practiced measures withthe purpose of its control. This practice was higher amongst the 32% who knew that sand fliestransmit cutaneous leishmaniasis. However, 82% of interviewees practiced sand fly controlmeasures, and these were significantly associated with high sand fly abundance. Measuresincluded smoke, bednets, and house spraying with insecticide or non-insecticidal substances.Householders using the high cost measures (bednets and insecticide) had the highest economicstatus.Conclusions. Health education programmes should note that sand fly nuisance can initiatecontrol measures, but that knowledge of the role of sand flies in transmission could enhanceactivities. The socioeconomic findings indicate that targeted bednet subsidies could reduceinequities in health status amongst cutaneous leishmaniasis endemic communities.

Key words: Psychodidae; Lutzomyia; health knowledge, attitudes, practice; prevention & control,leishmaniasis, Colombia.

Efecto del conocimiento y nivel socioeconómico sobre las actividades de control realizadaspor la población en riesgo de adquirir leishmaniasis cutánea en la región subandina deldepartamento del Huila, Colombia

Introducción. Las medidas de control vectorial en el ámbito familiar pueden ser estimuladaspor campañas de promoción en salud que tengan en cuenta los conocimientos y actitudes dela población con énfasis en vacíos claves en el conocimiento.Objetivos. Describir las prácticas de control para flebótomos realizadas por las familias en unárea endémica de leishmaniasis cutánea en el departamento del Huila, Colombia, y determinarcómo estas prácticas son influenciadas por las actitudes, conocimientos y el estatussocioeconómico.Materiales y métodos. Se aplicó un cuestionario a nivel familiar para recolectar informaciónsobre: demografía, estatus socioeconómico, conocimientos sobre leishmaniasis cutánea ysobre los flebótomos y su papel en la transmisión, y la práctica de actividades de control. Laabundancia intradomiciliar de flebótomos fue estimada con trampas de luz.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):167-79PARDO R.H., CARVAJAL A., FERRO C., DAVIES R. C.

Resultados. De 249 entrevistados, 86% conocían la leishmaniasis cutánea y 98% losflebótomos. 35% de los entrevistados que conocían la leishmaniasis cutánea practicaronmedidas para su control. Estas prácticas fueron mayores, 32%, en las familias que conocíanque los flebótomos transmiten la LC. Sin embargo, 82% de los entrevistados practicaronmedidas de control para los flebótomos, y estas prácticas estuvieron significativamenteasociadas con altas abundancias de flebótomos. Las medidas de control practicadas incluyeronhumazo, toldillos, fumigación intradomiciliar con insecticidas o con sustancias no insecticidas.Las familias que usaron medidas de costo alto (toldillos e insecticidas) tenían el estatuseconómico más alto.Conclusiones. Los programas de educación en salud deben considerar que la molestiasanitaria causada por los flebótomos puede iniciar la práctica de medidas de control y que elconocimiento del papel de los flebótomos en la transmisión puede aumentar estas actividades.Los resultados con relación al estatus socioeconómico indican que subsidios para adquirirtoldillos pueden reducir desigualdades en salud en comunidades en donde la leishmaniasiscutánea es endémica.

Palabras clave: Psychodidae; Lutzomyia; conocimientos, actitudes y práctica en salud;prevención y control, leishmaniasis, Colombia.

Correspondencia:Raul H. Pardo, Laboratorio de Entomología, Instituto Nacionalde Salud, Bogotá, D.C., ColombiaTeléfono: (571) 220 [email protected]


Throughout the cutaneous leishmaniasis endemicregions of the Andean countries there are few ver-tically organized vector control programmes.House spraying activities by health ministry per-sonnel tend to be sporadic, with limited coverage,and little formal evaluation (1). Hence, householdsin endemic zones can currently most effectivelyreduce their risk of cutaneous leishmaniasis bycarrying out their own vector control measures.Whether such measures are taken could dependon a combination of factors –including the inci-dence of disease, the attitudes of the local peopleto the disease, knowledge of the possible controlmeasures, and the ability to pay for the measures.

Knowledge of vector control measures for cuta-neous leishmaniasis implies an understanding ofthe role of insects in its transmission. However,control activities could also be carried out simplyto target the nuisance caused by sandfly bites,without any appreciation of their role in diseasetransmission. Hence, any investigation of sandflycontrol activities in endemic communities shoulddetermine the principal reasons for householderpractices.

Previously reported surveys of knowledge, atti-tudes and practice amongst cutaneous leishma-niasis endemic communities throughout the worldhave focused mainly on factors related to the dis-ease. Despite differences in questionnaire designand definitions, most reported studies have de-tected a relatively high (>75%) knowledge of thedisease but relatively poor (<30%, in the majorityof cases) knowledge of its control (2-10, Chappuis,F, Cavailler, P. Perception of Kala Azar amongPokot communities in Amudat, Eastern Uganda.Report: Epicentre, centre collaborateur de l’OMSpour la recherche en epidemiologie et la reponseaux maladies emergentes. December 6th., 2002).Knowledge of sandflies has been less frequentlyinvestigated and the few data reported are highlyvariable (<25% to 98%) (5,6,8); and, crucially, paststudies have tended to detect very variable (<10%to 60%), but generally poor, knowledge ofsandflies’ role in transmission (2,3,5,6,8,9,11,Chappuis et al., 2002).

While no previous study appears to have ad-dressed the extent to which sandfly controlactivities are affected by knowledge of their rolein cutaneous leishmaniasis transmission, therehas been at least one study addressing the impactof household income on control practices (12).This study found that in a cutaneous leishmaniasisendemic area of Brazil, control measures whichdemanded an expenditure were more frequentlypracticed by households with higher incomes. In

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addition, in cutaneous leishmaniasis endemiccommunities in Afghanistan, 78% of householdsinterviewed apparently did not use bednetsbecause bednets were too expensive (2). Bothstudies therefore provide evidence that withoutgovernment support, protection against cutaneousleishmaniasis by vector control activities is likelyto be inequitably distributed.

The present study describes the sandfly controlactivities by households in a cutaneous leishma-niasis endemic region of Colombia where sandflyindoor biting is important, and addresses the ex-tent to which household practices are influencedby (1) knowledge of the disease and its transmis-sion, and (2) socioeconomic status. The ques-tionnaire survey was carried out in Huiladepartment, location of a major cutaneousleishmaniasis epidemic from 1993-1996 (casesreported=1,232), with a peak departmentalincidence of 275 per 100,000 in 1994. Incidencein this region has risen again in recent years, 57per 100,000 in 2004 (cases reported=178).


Study area

The study was carried out between January toMarch 2001 in three rural localities on the sub-andean region of the north-western side of theCordillera Oriental (mean altitude of 1,660 masl),La Troja (Baraya municipality), Brasilia (Tellomunicipality), and El Cedral (Neiva municipality),within the cutaneous leishmaniasis epidemic areaof Huila department (figure 1). Mean rainfall is1,311 mm, with an increasing gradient from northto south, and mean temperature is 18.5o C. Rainfallfollows a bimodal pattern with two dry, or low rainy,seasons (January-February and July-September)and two rainy seasons (March-May and October-November). The economy of the area is based onagricultural products, mainly coffee crops andpasture. The natural vegetation has been highlydisturbed and only a few remnants of the sub-andean forest have survived. Most of the humanpopulation is formed by mestizos peasants.

Figure 1. Sampled localities in the cutaneous leishmaniasis focus of Huila department included in the study. Shadow areaindicates altitudes >1,000 masl.

170


Questionnaire design and application

Evaluation of the knowledge and practice of hu-man populations in relation to cutaneous leish-maniasis and vector control of sandflies was car-ried out in a section of a questionnaire answeredby the heads of households in 237 houses, duringa house risk factor study. Only households whohad lived for at least one year in the surveyedhouses were included in the study. The vocabu-lary used in the questionnaire was chosen basedon the experience gained in a previous study(Nicholls S, Castaño L, Palau T, Álvarez C, AyalaM, Corredor S et al., 1998. Conocimientos,actitudes y prácticas sobre la leishmaniasistegumentaria en tres zonas endémicas deColombia. Informe: Convenio COLCIENCIAS eInstituto Nacional de Salud R.C. 020-93) and by apilot test of the questionnaire. The topics includedin the questionnaire were: demography (numberof persons per house by age and gender);knowledge of cutaneous leishmaniasis andsandflies, role of sandflies in transmission, typeof control measures (for both disease andsandflies); and building features and the owner-ship of domestic animal which were used as anindirect measure of economic status. The studywas approved by the ethics committee of theInstituto Nacional de Salud.

Control measures

Information on the different control measures(mainly bednets, house spraying with insecticides,house spraying with non-insecticides, and smoke)included: date of start and frequency of use (i.e.all the time, only during the sandfly season [asspecified by the interviewee] or other, asspecified). Information on product name (for housespraying with insecticides or with non-insecticides),type of material used as fuel (for smoke), andmesh size (for bednets) was also recorded.Additional information about cost of the controlmeasures was obtained from the main market inNeiva city (for bednets) and small shops in Tellomunicipality (for insecticides).To distinguishcontrol measures for disease and controlmeasures against sandflies (i.e. amongsthouseholders who did not recognize the role ofthe sandflies in disease transmission) the same

questions concerning control practices for cuta-neous leishmaniasis were repeated later duringthe questionnaire, this time referring to sandflycontrol (i.e. household measures to protect them-selves from sandfly nuisance). Only control mea-sures applied by the inhabitants in the currenthouse were recorded.

“Integral understanding” ofcutaneous leishmaniasis

The level of “integral understanding” of cutaneousleishmaniasis and its control by householders wasevaluated qualitatively based on the presence/ab-sence of knowledge on cutaneous leishmaniasis,sandflies, sandfly role in disease transmission,and the practice of control for cutaneous leishma-niasis. Practices of control for sandflies were notincluded in this analysis to allow comparison withprevious studies, as the majority of these studieshad only addressed disease control. Household-ers were classified in six categories of “integralunderstanding”: (a) very good: householders knewthe disease, the sandfly, the role of the sandfliesin the transmission, and practised some measureof control for cutaneous leishmaniasis; (b) good:householders knew the disease and some mea-sure of control for cutaneous leishmaniasis; butmay or may not recognize sandflies; (c) accept-able: householders knew the disease, the sandfly,and the role of the sandflies in the transmissionof the disease; (d) bad: householders knew thedisease and sandflies, but were unaware of anyassociation between them; (e) poor: household-ers knew about the sandflies only; although, somealso recognized the role of sandflies in transmis-sion of the disease; (f) none: no knowledge ofcutaneous leishmaniasis or sandflies. Results arepresented as percentages with each category ofintegral understanding.

Economic status and control measures

The association between economic status and theuse of control measures was based on thecomparison of frequencies of practice of the fourmain control measures (i.e. bednets, house spray-ing with insecticides, house spraying with non-insecticides, and smoke) with an “index of eco-nomic status”. The index was generated on thebasis of building features and the ownership of

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domestic animals, both of which should reflectthe economic status of the householders. Buildingfeatures chosen as indicators of a “better”economic status were: walls made of bricks, fewor no cracks in walls (0-30%), presence of a ceil-ing, few or no openings in the house (0-5.8 m2),and availability of electricity service; while the in-dicators of “low” economic status were: walls madeof bahareque or other material, many cracks inwalls (>30%), absence of a ceiling, many open-ings in the house (>5.8 m2), and no electricityservice. Ownership of pigs, cows, and equineswas considered as an indicator of “better”economic status. The index was obtained bysumming the values for all eight featuresconsidered as indicators of “better” economicstatus (where 1=presence, 0=absence). Hence,the index could range between 0, the lowest status,and 8, the highest.

Sandfly sampling

In addition to the questionnaire survey, each housewas sampled once with a CDC light trap set up inan inhabited bedroom (13), during the night (18:00to =7:00 h) in order to provide a crude estimate ofrelative indoor sandfly abundance, for comparisonwith the reported household practice of sandflycontrol. Inhabitants were requested not to applyany control measures during the sampling night.Collected sandflies were identified using the keysof Young (14) and Young and Duncan (15).

Statistical analysis

Information collected by the questionnaire wasdigitalized in Epi-Info 6.04d (Centers for DiseasesControl and Prevention, Atlanta, Georgia, USA)and validated by dual entry. Analysis of the rela-tionship between knowledge and the practice ofcontrol was carried out in relation to both cutaneousleishmaniasis control and sandfly control. Thedescription of control measures, as well as theirrelation with economic status, was carried out onlyin relation to the practice of sandfly control. Thiswas because the practice of sandfly control wasdominant, 82%, as compared with the practice ofcutaneous leishmaniasis control, 35%, and be-cause the measures reported to control cutaneousleishmaniasis were, in general, also reported forcontrol of sandflies. Frequencies (e.g. knowledge

of the disease, sandflies, and the practice of con-trol measures) were compared using the χ2 testwith Yates’ correction, and Fisher’s exact test,as appropriate.

Comparison of control measures in relation to theindex of economic status was carried out by di-viding households into two groups: “low” economicstatus (those with an index 0–3) and “high” eco-nomic status (those with an index: 4–8). Wherehouseholds practised more than one control mea-sure, they were only included in the analyses ofassociations with the more costly measure. Theorder of cost was bednets, house spraying, smokeand/or spraying with non-insecticidal substances.The analyses of the least two costly control mea-sures was carried out twice, by varying their per-ceived order with respect to cost. Univariateanalysis of variance was carried out with Stata7.0 (Stata Corporation. Texas, USA) to testwhether indoor sandfly abundance of the mostprobable vector, Lutzomyia longiflocosa (log trans-formed data of females/CDC light trap/night) wasassociated with the practise of any kind ofcontrol measure.

Results

Characteristics of the study population

A total of 85% (249/293) of interviewed house-holders (from 271 houses) were included in thestudy, as they had lived in their house for at least1 year. Four additional householders wereexcluded because the families were absent duringthe survey. In a few houses (12/235) included inthe study more than one (two or three) householderswere interviewed. The overall village populationwas 1,244 inhabitants. Although male: female ratiowas 1.25, interviewees were typically female(58.2%) and between 18-60 years old (84.7%).

Knowledge of cutaneous leishmaniasis,sandflies and their role as vectors

85.9% (214/249), of the interviewees knew cuta-neous leishmaniasis, known locally as leishma-niasis, with no significant association with genderor age (χ2< 0.01, p=0.97 and χ2=0.01, p=0.94,respectively); and 98.0% (244/249) knew sandflies,known locally as “mantablanca” or “capotillo”. Whenasked which disease is caused by “mantablanca”,

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Figure 2. Summary of the knowledge and control of cutaneous leishmaniasis (CL) and sandflies by householders, who livedat least 1 year in the sampled house (n=249). All possible combinations are obtained by the intercepts between columns androws.a two missing data in any of the two possible answers

173


Table 2. Frequency of use of control measures for sandflies practised by the householders. Original question: “How oftendo you use the control measure?”

Frequency of use

Season of high Once orabundance of Rainy Dry twice a

All time sandflies season season week Occasionally O ther

Type of control No. % No. % No. % No. % No. % No. % No. %

Smoke (n=124) 2 1.6 113 91.1 0 1 0.8 2 1.6 4 3.2 2 1.6

House spraying withinsecticides(n=65a) 2 3.1 56 86.2 1 1.5 0 1 1.5 4 6.2 1 1.5

House spraying withnon-insecticides(n=43b) 2 4.7 39 90.7 0 0 0 1 2.3 1 2.3

Bednets (n=72a) 16 22.2 55 76.4 0 0 0 0 1 1.4

Others (n=16a) 4 25.0 10 62.5 1 6.3 0 0 0 1 6.3

a One missing data was not included, b two missing data were not included.

Table 1. Integral understanding on cutaneous leishmaniasis (CL) by the householders, according to their knowledge ofdisease, sandflies, and the practice of any control for the disease.

Knowledge on Practice Level of understandingcontrol for CL

CL Sandflies Role of sandflies Category n %b

x x x x Very good 37 15.0x (x) - x Good 38a 15.4x x x - Acceptable 30 12.1x x - - Bad 107a 43.3

- x (x) - Poor 32 13.0- - - - None 3 1.2

a One missing data point in practice of control for CL was not included; b Denominator was 247; x: indicates that theknowledge or practice was present; ( ): indicates that the knowledge was or was not present.

the answers by the 244 who responded were: “donot know”: 45.5% (111); cutaneous leishmaniasis:29.5% (72), including those who respondedcutaneous leishmaniasis plus another disease; nodisease: 15.6% (38); biting signs: 6.6% (16), i.e.weal, ampulla, itch, fever, and allergies; other dis-eases: 2.8% (7). Amongst interviewees who knewboth sandflies and disease, only 31.6% (67/212)knew that sandflies transmit cutaneousleishmaniasis (figure 2), and this included a groupof householders, 16.4% (11/67), who said theyknew that sandflies transmitted cutaneousleishmaniasis but did not believe it. Thisscepticism was based on their own experience,e.g. saying: “Mantablanca do not transmit cuta-

neous leishmaniasis because we have been bit-ten by a lot of them and we have not got cutane-ous leishmaniasis”.

Practice of control of cutaneous leishmaniasisand sandflies: impact of knowledge

Only 35.4% (75/212) of interviewees who knewcutaneous leishmaniasis practised any measureswith the purpose of controlling the disease. Thispractice was significantly associated withknowledge of the role of sandflies in transmission(χ2 = 16.9, p<0.001), with 50.7% (37/73) of “diseasecontrol practitioners” having this knowledge,compared to only 21.9% (30/137) amongst non-practitioners. In general, using our defined

174


Table 3. Index of economic status for each of the control measures for sandflies practised by householders. For comparativepurposes indoor abundance of Lutzomyia longiflocosa females is shown in the bottom of the table.

Control measure (n=196) a

House Housespraying spraying with No

with non-insecticidal controlVariable Bednets insecticides Smoke substances measure

(n=73) (n=46) (n=64) (n=13) (n=44)

Wall made of bricks 0.29 0.09 0.17 0 0.18

Wall without or withfew cracks (0-30%) 0.83 0.77 0.78 1.00 0.80

Presence of ceiling 0.74 0.70 0.59 0.46 0.70

None or few openings(0-5.8 m2) 0.74 0.60 0.73 0.42 0.68

Presence of electricity 0.94 0.88 0.90 1.00 0.89

Presence of pigs 0.29 0.37 0.15 0.08 0.19

Presence of cows 0.09 0.18 0.08 0.08 0.28

Presence of equines 0.27 0.22 0.19 0.08 0.34

Index of economic statusb 4.18 3.81 3.59 3.11 4.06

Indoor abundance ofL. longiflocosa femalesc 5.5 4.6 8.2 20 2.4

(95% CI) (3.7 - 7.9) (2.5 - 8.0) (5.4 - 12) (7.6 - 49) (1.3 - 3.9)

a Four householders who reported other control measures were excluded; b Index is the sum of the proportion of each of thelisted variables, and range from “0” lower, to “8” better); c Based on 232 houses (from 237 included in this study) where datafor sandflies were available.

categories (table 1), only 15% of householders hada “very good” understanding of cutaneousleishmaniasis, compared to 56.3% with a “bad” or“poor” understanding of cutaneous leishmaniasis.Nevertheless, an understanding of cutaneousleishmaniasis was clearly not required to carry outsandfly control, as 77.1% of householders with a“bad” understanding of cutaneous leishmaniasispractised some measures to control sandflies.Indeed, 82% (200/244) of interviewees who knewsandflies practiced some control measures againstthem. There was some suggestion (though notsignificant: χ2=2.68, p=0.102) that this practice wasassociated with knowledge of the role of sandfliesin cutaneous leishmaniasis transmission, with 32%(64/200) of “sandfly control practitioners” having thisknowledge, compared to only 18.2% (8/44) amongstnon-practitioners. However, sandfly control was

certainly associated with the extent of sandflybiting nuisance, as sandfly abundance wassignificantly higher (F

(6, 235) =2.75, p=0.013) in

houses where sandfly control was practiced,Geometric Mean (GM) = 6.7 f/LT/n (females/CDC light trap/night), than in houses where nocontrol was practiced (2.4 f/LT/n).

Choice of sandfly control measure: impactof socioeconomic status

Amongst those who practiced sandfly control,four measures predominated: (1) smoke, 62%(124/200); (2) bednets, 36.5% (73/200); (3) housespraying with insecticide, 33.0% (66/200); and(4) house spraying with non-insecticidal sub-stances, 23.0% (46/200). Other control mea-sures, such as use of repellents, mosquito coils,vaporizing mats, closing of windows and doors

175


in the evening, vapours of aromatic plants, andburning rubbish outside houses, accounted for8.9% (17/200).

Smoke was produced from a small fire, made fromdifferent materials (e.g. Citrus spp., Pinus spp.,Eucalyptus spp., manure from cow or horse, andcoffee pods or ground), placed in the bedroomsfor approximately five minutes. Householders re-ported that this method of control repels sandfliesfor approximately two hours. This measure hadthe longest history of use, with a median of 18.2years. A total of 129 bednets were recorded, ofwhich 57% (74/129) had a small mesh size(<1 mm) appropriate as a physical barrier forsandflies. There was a mean number of 0.41 (95%CI: 0.33 - 0.50) bednets/person/house, and anestimated 63% (258/409) of people who lived inhouses with bednets slept under a net (assumingthat bednets are used by an average of 2 per-sons). The median time of use was 3.7 years.The most common insecticides used for housespraying were domestic insecticides, 93.9% (62/66), with only 10.6% (7/66) of householdersreporting the use of agricultural insecticides. Thismeasure had been used for a median time of 6.2years. The main non-insecticidal substances usedfor spraying houses were petroleum derivates (e.g.gasoline, kerosene, and other fuels): 95% (42/46).This measure has been practised for a mediantime of 7.2 years. Householders reported thatthese substances are used as repellents forsandflies because of their strong smell.

An overwhelming majority of householders saidthey used the control measures only during the“season of sandfly abundance”: smoke, 91.1%(113/124); house spraying with insecticide, 86.2%(56/65); house spraying with non-insecticidal sub-stances, 90.7% (39/43); and bednets, 76.4% (55/72) (table 2). This season was identified as eitheror both of the two dry seasons by 84.3% (145/172) of interviewees.

Bednets and house spraying with insecticideswere considered high cost measures, whereashouse spraying with non-insecticidal substancesand smoke were low cost. The cost in the mainmarket in Neiva city, where many people from thestudy area shop, of a small mesh size bednet is

US$ 4.3. The cost of house spraying with domes-tic insecticides, based on information collectedfrom Tello municipality, ranges from $1.0 to $1.3per bottle (230 cm3); and householders who useinsecticides could spend up to $18/year specifi-cally for sandfly control. The cost of non-insecti-cidal substances was considered low becausethese were bought mainly for other uses (fuels forcooking and engines) rather than sandfly control.Smoke was considered as a measure of minimalcost because the fuels were obtained for freearound the houses.

Householders using the relatively high cost mea-sures tended to have the highest economic sta-tus index (table 3): the use of bednets (mean in-dex=4.2) and house spraying with insecticides(3.8), as compared with households using lowercost measures: smoke (3.6) and house sprayingwith non-insecticidal substances (3.1). Theassociation between socioeconomic status andthe practice of using bednets was confirmed by acomparison of bednet usage amongst the twobroad categories of economic status, withhouseholders of “high” economic statussignificantly more likely to use bednets, 44.8%(43/96), than householders of “low” economicstatus, 23.9% (16/67) (χ2=6.59, p=0.01). In con-trast, no significant association was detected be-tween economic status and the use of either housespraying with insecticides (p=0.089), smoke(p=0.83) or house spraying with non-insecticidalsubstances (p=0.57).

Finally, it is notable that the highest sandfly abun-dance was detected in the houses of the poorerhouseholders who practised low cost control mea-sures (table 3): house spraying with non-insecti-cidal substances, 20 (7.6–49) f/LT/n, and smoke,8.2 (5.4–12) f/LT/n. In contrast, the lowest sandflyabundance, 2.4 (1.3-3.9) f/LT/n, occurred in thehouses of those householders who did not usecontrol measures and who had a relatively higheconomic status (4.1).

Discussion

A remarkable 82% of all householders claimed tohave used some sandfly control measure. Thepositive association detected between sandflyabundance and the practice of control measures

176


does not imply that these control measures arenecessarily ineffective. Instead it indicates thatcontrol activities are largely practiced in responseto sandfly nuisance. This also explains why themajority of householders claim to only practicecontrol measures during the seasons of highsandfly abundance, i.e. the dry seasons. It isnotable that in the only other survey of sandfly(rather than disease) control measures used bycutaneous leishmaniasis endemic populations inLatin America (in southern Bahia state, Brazil),this practice was apparently much less common(43%) (12).This could be due to many factors, notleast differences in indoor sandfly biting rates. In-door sandfly biting rates in Huila do appear to berelatively high, with a reported indoor geometricmean during the dry season of 2.8 sandflies/LT/nin Neiva municipality and 6.6 sandflies/LT/n inBaraya municipality (Pardo R, Ferro C, LozanoG, Lozano CA, Cabrera O, Davies C. Flebótomos(Diptera: Psychodidae) vectores de leishmania-sis cutánea y sus determinantes ecológicos en lazona cafetera del departamento del Huila.Memorias, XXVI Congreso de la SociedadColombiana de Entomología, Bogotá; 1999.p.147-63).

Almost all sandflies collected indoors are L.longiflocosa, and nearly all bloodfeds collectedindoors were shown to have fed on human blood.This would also explain why all but 5 intervieweesin this survey knew sandflies, consistent with theresults of the previous survey in the region (>80%:Nicholls et al., 1998). In areas where human ex-posure to sandflies is low, one would expect apoorer sandfly knowledge. For example, amongsta cutaneous leishmaniasis endemic population liv-ing in the coffee plantations of Minas Gerais state,Brazil, where the sandfly abundance was appar-ently low, only 23.1% of the interviewees knewsandflies (16).

In contrast, while 86% of householders in the Huilasurvey recognized cutaneous leishmaniasis, rela-tively few (35%) householders in the Huila surveyreported that they practiced control measuresagainst cutaneous leishmaniasis. Relatively lowlevels of cutaneous leishmaniasis control activitywas also detected by Nicholls and co-workers(1998) in cutaneous leishmaniasis endemic

populations in two other subandean endemic lo-calities: Norte de Santander (17.9%) andCundinamarca (18.9%). The practice of cutaneousleishmaniasis control in Huila was significantlymore frequent amongst householders who knewthe role of sandflies in transmission (51%), imply-ing that knowledge of this role could provide house-holders with a rationale for practicing disease con-trol by targeting sandflies.

Further evidence for this association is providedby the previous surveys in three sub-Andean de-partments by Nicholls et al. in which the most fre-quent practise of cutaneous leishmaniasis con-trol was detected in Huila (48%), whereinterviewees also had the highest knowledge ofthe role of sandflies in cutaneous leishmaniasistransmission (70%), as compared with populationsin Norte de Santander and Cundinamarca, where<20% of householders had knowledge of the role,and a similar small percentage practised cutane-ous leishmaniasis control.

However, high levels of knowledge of the role donot guarantee high levels of control activity as isevident in previous studies for leishmaniasiswhere high percentages (60%->75%) of knowledgeof the role corresponded with poor knowledge ofcutaneous leishmaniasis control (0–22%) (5, 7,Chappuis and Cavailler, 2002). Indeed, high knowl-edge of vector biology and control often fails tocorrespond to the practice of effective vector con-trol for a range of vector borne diseases, such asdengue (17). For leishmaniasis, this discrepancycould depend on the extent to which sandflies areendophagic. Measures of control by household-ers are applied mainly indoors; for exophagicsandflies, the knowledge of the sandfly role intransmission is not expected to have a signifi-cant effect on the practice of cutaneousleishmaniasis control.

In addition to knowledge, the survey found evi-dence that household economic status also limitsthe practice of some control measures. Thepoorest households were more likely to practicethe less costly control measures, smoke and housespraying with non-insecticidal substances, as com-pared with the more costly measures, bednets andhouse spraying; and bednets, in particular, were

177


significantly more utilised by households in the“high” (45%) rather than “low” (24%) economicstatus group. A similar finding was indicated in acutaneous leishmaniasis endemic population inBahia state, Brazil (12), where families with lowerincomes were apparently less likely to practisecontrol measures which demand a high expendi-ture (2.1%), as compared with households withhigher incomes (15.4%).

Note that those households in the Huila study whopracticed no control measures were not limitedby their economic status (which was relativelyhigh). Instead, it would appear that they had lessreason to practice control, as they experiencedrelatively low sandfly nuisance. Hence, it appearsthat low cost control measures (smoke or housespraying with non-insecticidal substances) areaccessible to all householders in the region, whowish to reduce sandfly nuisance. Smoke was cer-tainly the most commonly used control measure(62%), and had the longest history of use by thehouseholders. Use of smoke as the main controlmeasure (88%) by householders against sandflyvectors of cutaneous leishmaniasis has also beenreported in Bahia state, Brazil (12). In Peru too, insome cutaneous leishmaniasis endemic areashouseholds commonly generate smoke indoorsduring the periods of high density of sandflies asa measure of protection (18). The question remainswhether this low cost control activity (or the spray-ing of non-insecticidal substances) is effective.

In spite of the wide use of repellent and insecti-cide components extracted (or synthesized) frommany plants for commercial purposes, there arelimited reports of the effectiveness of traditionalformulations (i.e. smoke) on sandflies. In China,indoor smoking with tobacco, pyrethrum orartemisia reportedly kept sandflies away for 1–2days (19). In Ethiopia, the absence of Phlebotomuslongipes in some buildings was attributed, in part,to the smoke indoors (mainly from cooking fires),and their abundance in bedrooms to the absenceof smoke (20). A 2-fold reduction in indoor P.martini abundance was also associated with theburning of an indoor fire during the night in a recentrisk factor study in Pokot, Uganda (C. Davies &J. Stephenson, unpublished). If such findings canbe confirmed by intervention trials, the attractions

of this control measure are considerable, i.e. it iseasily available, inexpensive and is already widelyused. However, it remains unclear whether anyhealth advantages that may ensue from reducedindoor biting insects using smoke outweigh thehealth disadvantages due to the respiratory ef-fects of indoor pollution.

The potential health advantages of using bednetsare less controversial. For example, the use ofuntreated bednets was identified as a protectivefactor against visceral leishmaniasis transmittedby P. argentipes in both Nepal and Bangladesh(21, 22). In the present study, the relatively highownership of untreated bednets by householdswho practiced any form of control (36.5%,reflecting 0.41 bednets/person/house) indicatesthat a bednet intervention could have highacceptance by the community. However, 43% ofthese bednets were wide mesh (>1 mm), whichwould not provide a complete physical barrier, andso should be treated with insecticide for optimalperformance. In a recent lambdacyhalothrintreated bednet (LTN) field trial in this region, LTNswere found to reduce landing rates of L.longiflocosa both inside and outside the bednets,as well as the percentage of bloodfeds, the sizeof blood meals and the human blood index (HBI)amongst sandflies collected in light traps in housesusing LTNs as compared with control houses(Pardo R, Ferro C, Davies C. Efficacy andeffectiveness of insecticide treated bednets inColombia. 5th International Symposium onPhlebotominae sandflies, ISOPS 5, Tunisia, 2005).In the same trial, the impact of insecticide housespraying was less clear.

In conclusion, despite the relatively low “integralunderstanding” of cutaneous leishmaniasis and itstransmission amongst the surveyed population,householders had a good knowledge of some ofthe different components of the disease and itscontrol. The significant association between theknowledge of sandflies’ role in transmission andthe practice of cutaneous leishmaniasis controlprovides evidence that there is scope for impact-ing control activities by health educational cam-paigns. However, the remarkably high level ofsandfly control as compared to cutaneous leish-maniasis control practiced by the community

178


shows how vector control promotion programmesneed to account for community attitudes to bothsandfly nuisance as well as the diseases theytransmit.

Finally, based on the acceptability and its ento-mological effectiveness, it is possible that theintroduction of LTNs could be used to control cu-taneous leishmaniasis within the study area. Giventhe indications that economic status limits thechoice of control measure, it may be worth con-sidering bednet subsidies for the lowest economicstatus households within the context of socialmarketing campaigns. This could help widenbednet usage and reduce inequities in health sta-tus amongst cutaneous leishmaniasis endemiccommunities.

Acknowledgements

We thank Alcaldías Municipales de Baraya, Telloy Neiva, Secretaría de Salud Municipal de Neiva,hospital local de Baraya, and Centro de Salud deTello, for logistic support. We thank Gladys Lozanofor her support during all stages of the project.She and Álvaro Ruiz and César González pro-vided valuable epidemiological background andthey took part in planning field work activities. Wethank Stella Pedraza who participated in the fieldsurvey and the generation of the data bases. Wegratefully acknowledge the field support of thehealth workers from Tello, Baraya and Neivamunicipalities. Finally, we would like to thank theinhabitants of the study localities, particularly LaTroja, Brasilia, and El Cedral for their hospitalityand kindness with the research team.

Conflicts of interest

The authors declare that they have no competinginterests.

Financing

This study received financial support from InstitutoNacional de Salud and Organización Panamericanade la Salud (Contract OPS-ASC-00/00094-0); andfrom Secretaría de Salud Departamental del Huila(SSDH). Raúl Pardo was supported by a scholar-ship from Instituto Colombiano para el Desarrollode la Ciencia y la Tecnología Francisco José deCaldas, COLCIENCIAS.

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180

Biomédica 2006;26(Supl.1):180-7BRITO S., CRESCENTE O., FERNÁNDEZ A. et al

ARTÍCULO ORIGINAL

Eficacia de un ácido kaurénico extraído dela planta venezolana Wedelia trilobata (Asterácea)

contra Leishmania (Viannia) braziliensisSolanny Brito 1, Oscar Crescente 1, Alexis Fernández 2, Aura Coronado 1, Noris Rodriguez 2

1 Universidad de Oriente, Cumaná, Estado Sucre, Venezuela.2 Instituto de Biomedicina, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.

Introducción. La leishmaniasis es un grave problema de salud pública y aun no existe untratamiento eficaz para la enfermedad. Por esta razón, es necesario investigar nuevasalternativas terapéuticas.Objetivo. En este trabajo nos propusimos evaluar el efecto parasiticida de un ácido kaurénico(ent-kaur-16-in-19-oico) aislado de la planta superior venezolana denominada Wedelia trilobata(Asteracea) sobre Leishmania (V.) braziliensis in vivo e in vitro.Materiales y métodos. Los estudios in vitro fueron realizados en amastigotes axénicos,promastigotes así como en macrófagos infectados y no infectados, los cuales fueron tratadoscon dosis entre 25-100 µg/ml del ácido kaurénico. El efecto del compuesto sobre la viabilidadcelular fue evaluado utilizando el método de conteo directo en una cámara de Neubauer ohemocitómetro y por el método indirecto utilizando el método de MTT (Metil Tiazol Tetrazolium).Para el ensayo in vivo, se utilizaron ratones Balb/c infectados subcutáneamente en la almohadillaplantar con 1x106 promastigotes de Leishmania (V.) braziliensis; posteriormente los ratonesfueron tratados intraperitonealmente durante una semana con 30 mg del ácido kaurénico porkg de peso, en un volumen de 100 µl de etanol al 10%.Resultados. Este compuesto mostró un potente efecto parasiticida tanto sobre los amastigotesaxénicos como sobre promastigotes con dosis letales 50 (DL50) de 0,25 y 0,78 µg/mlrespectivamente, en 24 horas. Se observó una baja toxicidad del compuesto sobre macrófagosde la línea J774G8, con una DL50 de 25µg/ml, manteniéndose una alta viabilidad (70-92%) delos mismos, y una moderada viabilidad para los macrófagos infectados (37-81%) conconcentraciones menores de 25µg/ml. Adicionalmente, se observó una clara reducción (70%)en el tamaño de las lesiones de los ratones tratados sin efectos tóxicos aparentes.Conclusión. Los resultados obtenidos indican que este compuesto posee un potente efectoleishmanicida sobre Leishmania (Viannia) braziliensis.

Palabras clave: Leishmania, leishmaniasis, quimioterapia.

Efficacy of a kaurenic acid extracted from the Venezuelan plant Wedelia trilobata (Asteracea)against Leishmania (Viannia) braziliensis

Introduction. Leishmaniasis is a global public health problem without adequate treatmentoptions, hence requiring research on new drug development.Objective. Our main objective was the evaluation of a kaurenic acid (ent-kaur-16-in-19-oico),isolated from the Venezuelan plant Wedelia trilobata (Asteracea), on Leishmania (V) braziliensisboth in vivo and in vitro.Materials and methods. The in vitro assay was performed using axenic amastigotes andpromastigotes as well as infected and uninfected macrophages. Parasites and macrophageswere treated with concentrations of the compound varying between 10 and 250 µg/ml. Theeffect of the compound on cellular viability was evaluated by counting dead and living cells ina hemocytometer and by the colorimetric method using MTT (Methylthiazoletetrazolium). Forthe in vivo assay, Balb/c mice were infected subcutaneously with 1x106 promastigotes of L.(V.)braziliensis and afterwards treated with a daily dose of 30 mg/kg in 100 µl of kaurenic acidadministered by intraperitoneal injection for one week.


181

Biomédica 2006;26(Supl.1):180-7 EFICACIA DE UN ÁCIDO KAURÉNICO CONTRA LEISHMANIA (VIANNIA) BRAZILIENSIS

Results. The compound had a lethal effect on axenic amastigotes and promastigotes with DL50

of 0.25 and 0.78 µg/ml, respectively, in 24 hours. Low toxicity was observed for J774-G8macrophages with a DL50 of 25 µg/ml and high viability (70-92%), while a moderate viabilitywas observed for infected macrophages (37-81%), with concentrations of 25 µg/ml or less.Additionally, a 70% reduction was observed in the size of the skin lesions in Balb/c mice with noevident toxic effect.Conclusion. The results indicate that this compound has a potent leishmanicidal effect on L.(V.)braziliensis.

Key words: Leishmania, leishmaniasis, drug therapy.

Correspondencia:Noris Rodríguez, apartado postal 4043, Caracas 1010A,VenezuelaTelefax: (0058) (212) 864 [email protected]


La leishmaniasis se distribuye en las zonastropicales y subtropicales de 88 países de Europa,África, Asia y América, de los cuales 22, paísespertenecen a América Latina (1). Esta enfermedadconstituye un serio problema de salud públicaocupando el sexto lugar en importancia dentro delas enfermedades tropicales, debido a que producemutilaciones, deformaciones e incapacidades.

Por más de 70 años, el tratamiento de eleccióncontra la leishmaniasis se ha basado en laquimioterapia convencional con antimonialespentavalentes como el estibogluconato de sodio(Pentostan®) y el antimoniato de meglumina(Glucantime®). El uso de estas drogas contra laleishmaniasis se ha asociado con la aparición dereacciones adversas de tipo cardiovascular, renal,hepática y gastrointestinal; a esto se le adicionanlas dificultades para su administración por largosperiodos de tratamiento, el desconocimiento desu mecanismo de acción, los elevados costos yla resistencia que han desarrollado los parásitosa estos medicamentos, lo cual limita su uso en eltratamiento contra la leishmaniasis (2-5).

En la búsqueda de tratamientos alternativos paralos enfermos de leishmaniasis, se han utilizadoalgunas otras drogas comerciales tales comopentamidina, anfotericina B, alopurinol, azoles,ketoconazol, sulfonas, metronidazol y otras, lascuales han resultado tóxicas y poco efectivas,sobre todo, en casos de leishmaniasis difusa yvisceral (6-8). Recientemente, una nueva drogadenominada miltefosina ha sido utilizada con éxito

en el tratamiento de la leishmaniasis visceral enIndia; sin embargo, se ha reportado resistenciapor parte de parásitos de la especie Leishmaniadonovani a este compuesto (9,10).

Los modelos experimentales, así como los cultivosin vitro de promastigotes, se están utilizando paraevaluar algunos compuestos de valor potencialpara el tratamiento contra la leishmaniasis. Eneste sentido, el efecto de un derivado de bifosfonato(pamidronato), compuesto utilizado en eltratamiento de la osteoporosis, ha sido evaluadocontra la leishmaniasis experimental, y hamostrado un total efecto parasiticida con laconsecuente desaparición de las lesiones (11).

Más recientemente, en Venezuela se hacomenzado a aislar productos naturales de plantassuperiores entre las que se encuentra Wedeliatrilobata (Asterácea), la cual biosintetiza un grannúmero de metabolitos secundarios llamadoskaurenos (12), los cuales son diterpenos quecontienen un rígido esqueleto tetracíclico (13). Loskaurenos son intermediarios en la biosíntesis denumerosos metabolitos de plantas y hongos,como la giberelina, que poseen propiedadesesterodoigénicas, anticonceptivas, hipotensivas,antiinflamatorias, antibióticas, antiparasiticas ycitotóxicas (14).

Analizando extractos crudos de W. trilobata, sehan logrado caracterizar diversos tipos dediterpenos, entre los cuales se encuentra el ácidokaurénico (ent-kaur-16-en-19-oico) el cualpresenta la fórmula molecular C

20H

30O

2 (13), y se

ha demostrado que este compuesto poseediversas actividades biológicas, entre las cualesse encuentran, la actividad contra Staphylococusaureus y Bacillus cereus, lo cual también fuedemostrado con el mismo ácido aislado deCopifera paupera y plantas del género Espeletia,

182


y, además, una potente actividad sobre Myco-bacterium smegmatis y células tumorales (15,16).

En este trabajo nos propusimos evaluar el efectodel ácido kaurénico (ent-kaur-16-en-19-oico)extraído de W. trilobata sobre Leishmania (Viannia)braziliensis, el agente causal del 80% de los casosde la leishmaniasis cutánea localizada enVenezuela, en la búsqueda de una quimioterapiamás racional contra la leishmaniasis.


Preparación del material de origen vegetal

El ácido kaurénico utilizado en este trabajo fueobtenido en el Laboratorio de Productos Naturales,Departamento de Química, Núcleo Sucre,Universidad de Oriente, Cumaná, Venezuela.

El procedimiento utilizado para la obtención deeste compuesto es el siguiente: se utilizan lostallos de la planta W. trilobata, se secan y sepulverizan; el material pulverizado se macera ensolventes orgánicos de diferentes polaridades,primero, hexano y, luego, etanol en una proporción2:1; después de 24 horas de incubación, elmacerado se filtra al vacío y se evapora el solventepara concentrar la muestra. El extracto seco sedisuelve en hexano y se preabsorbe en sílica-gel;luego, se coloca en una columna del mismo ma-terial; la elución de los productos se inicia con100% de hexano, el cual se va variando de acuerdocon la polaridad. Los productos eluidos se analizanpor cromatografía en capa fina sobre sílica-gel60, bajo luz UV. La determinación de loscomponentes activos se realiza mediante técnicasespectros-cópicas de resonancia magnética deprotones y de carbono 13 (1H y 13C), además deespectro infrarrojo y espectrofotometría de masas(13). Se disuelven 50 mg de ácido kaurénico enmetanol al 10% para los ensayos in vitro; paralos ensayos in vivo se usó etanol al 10% comosolvente, por encontrarse que este alcohol esmenos irritante para los ratones.

Cultivo y mantenimiento deparásitos y macrófagos

Se mantuvieron promastigotes de L.(V.)braziliensis (MHOM/BR/84/LTB300) y macrófagosde la línea tumoral J774-G8 en medio SDM-79

(17) y RPMI-1640 (JRH-Bioscience y Gibco-BRL),respectivamente, con suplemento de 10% desuero fetal bovino (SFB); para el cultivo deparásitos, el SFB se inactivó a 56oC durante 30minutos.

Se recolectaron los promastigotes en la faselogarítmica tardía de crecimiento porcentrifugación a 3.000 rpm, se lavaron tres vecesen solución salina amortiguada con fosfatos (PBS,pH 8,0) y, finalmente, se resuspendieron en mediofresco y se ajustaron a una concentración de1x106/ml. Los macrófagos se mantuvieron enmedio RPMI 1640 con 10% de suero fetal bovinoen estufa a 37oC con 5% de CO

2. Luego, se

recolectaron utilizando un policía de goma,centrifugado a 3.000 rpm y ajustado a unaconcentración de 1x106/ml.

Ensayos anti-Leishmania in vitro

Se disolvieron 50 mg de ácido kaurénico enmetanol al 10% y se utilizó en concentracionesentre 10 y 500 µg por 106 células, incluyendopromastigotes de L. (V.) braziliensis, macrófagosde la línea J774-G8 infectados y no infectados yamastigotes axénicos. Estos últimos seobtuvieron mediante la transformación depromastigotes en medio RPMI-1640 (pH 5,0) ytemperatura de 37oC durante 48 horas (18).

Para la obtención de macrófagos infectados, seutilizaron monocapas de macrófagos los cualesfueron infectados con promastigotes de Leishma-nia en una relación 10:1 e incubados a 35oC (19);después de 24 horas se descartaban lospromastigotes no enlazados. A las 72 horas secontaban los promastigotes dentro de la célula;una vez establecida la infección (5 días), seutilizaron las células infectadas. De la mismaforma, los macrófagos no infectados se incubarondurante 5 días; a ambos tipos de células se lescambiaba el medio de cultivo cada 48 horas.

Para cada ensayo, las células se resuspendieronen 100 µl de medio SDM-79 +10% de SFB(GIBCO), y se colocaron en placas de ELISA de96 pozos. Para el cálculo de la dosis letal (DL

50)

se utilizó el método de conteo directo almicroscopio después de colorear con azul detripano (vol/vol) para medir la viabilidad, y por el

183


método colorimétrico (20), para lo cual losparásitos con las distintas concentraciones de ladroga, se incubaron durante 18-24 horas; luego,se adicionaron 10 µl (10 mg/ml) de metil-tiazoltetrazolium (MTT, Sigma), se incubaron por 4horas y se detuvo la reacción con soluciónamortiguada de lisis (50% isopropanol, 10% SDS),se sometió a agitación durante 10 minutos y,luego, se midió la densidad óptica (DO) a 570 nm.La viabilidad celular es directamente proporcionala la DO puesto que a mayor número de célulasvivas, mayor intensidad de color, ya que lascélulas vivas tienen mayor capacidad parametabolizar el MTT, trasformándolo en cristalesde formazán que son los que generan el color.

Para cada experimento se realizaron losrespectivos controles, incluyendo células tratadascon metanol solo, un control sin droga y un con-trol con antimoniato de meglumina.

Ensayos anti-Leishmania in vivo

Para los ensayos in vivo, se utilizaron 10 ratonesBalb/c, hembras, de 8 semanas de edad con unpeso promedio de 26 g, suministrados por elBioterio del Instituto de Biomedicina.

Los ratones fueron previamente inoculados en laalmohadilla plantar con 1x106 promastigotes enfase estacionaria de crecimiento; 4 semanasdespués de la inoculación, cada ratón fue tratadocon una inyección diaria (30 mg/kg) del ácidokaurénico, por vía intraperitoneal. El tratamientose aplicó durante 7 días, utilizando como control10 ratones infectados y tratados con etanol al10%. El seguimiento de la evolución deltratamiento en los ratones se hizo diariamente pormedición de las lesiones en la almohadilla plantar,utilizando para ello un calibrador de papel digital(Marathon Instruments).

Aspectos éticos

Los animales experimentales fueron tratados bajolas normas y principios de la guía internacionalde principios para la investigación biomédica conanimales de experimentación (21-22).

Así mismo, se obtuvo la correspondienteautorización del Comité de Bioética de nuestrainstitución.

Cuadro 1. Dosis letal 50 calculada para promastigotes,amastigotes axénicos y macrófagos J774-G-8.

Células x 10 6 DO1 DO2 DL50a 10 ug a 500 ug (µg/ml)

Promastigotes 1,542 0,048 0,80±0,2

Amastigotes 0,772 0,029 0,25±0,08axénicos

Macrófagos 0,828 0,0912 25±6,02J774-G8

DL50: dosis letal 50

Resultados

Obtención de la dosis letal 50 y efecto in vitro

Los resultados indican que el ácido kaurénico tieneun potente efecto leishmanicida sobrepromastigotes, amastigotes axénicos ymacrófagos (cuadro 1), en el que podemosobservar que, a pesar de que se usa el mismonúmero de células, la dosis letal 50 (DL

50) es

diferente para cada tipo celular, y que la menorfue la obtenida para los amastigotes axénicos.Los valores de densidad óptica permiten calcularla DL

50, aplicando el algoritmo matemático

previamente descrito (20), obteniéndose un valorde 0,25 µg/ml para amastigotes axénicos y 0,80µg/ml para promastigotes a las 24 horas deincubación y de 25 µg/ml para macrófagos.

En la figura 1 se muestra el efecto de distintasconcentraciones del ácido kaurénico sobrepromastigotes de L.(V) braziliensis, observándoseque las concentraciones mayores de 25 µg/mlproducen la muerte celular. Se observa crecimientonormal de los promastigotes en presencia delmetanol utilizado como solvente del ácidokaurénico; el mismo comportamiento se observóen presencia de Glucantime® a concentracioneshasta de 500 µg/ml (no se muestra el resultado).

La figura 2 muestra el efecto del ácido kaurénicosobre macrófagos previamente infectados conpromastigotes de L.(V.) braziliensis. Losresultados muestran entre 81,03% y 37,02% deviabilidad a una concentración de 12,5 y 25 ug/ml respectivamente, con respecto al 100% deviabilidad de los macrófagos sin droga. Estosporcentajes son similares tanto por el método deconteo directo con azul de tripano como por el

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Figura 2. Efecto del ácido kaurénico sobre la línea celularde macrófagos J774-G8 previamente infectados conpromastigotes de Leishmania (V) braziliensis. Losmacrófagos se infectaron en una relación parásito/macrófagos 10:1 y, posteriormente, fueron tratados condistintas concentraciones del compuesto.

Figura 3. Efecto del ácido kaurénico in vivo. Diez ratonesBalb/c por grupo fueron infectados con 1x106 promastigotes.Se realizaron medidas diarias del tamaño de la lesión a partirde la aplicación de la primera dosis de ácido kaurénico (30mg/kg de peso). Ratones tratados; ••••• Ratones controles.

método indirecto con MTT, lo cual concuerda conla sensibilidad mostrada por los amastigotesaxénicos.

Efecto sobre la leishmaniasis experimental

Se evaluó el efecto del ácido kaurénico extraídode W. trilobata sobre la leishmaniasis experimental

producida por L. (V.) braziliensis, inducida enratones Balb/c. La figura 3 muestra los resultadosobtenidos después de las mediciones realizadasen la almohadilla plantar de los ratones; lasmedidas graficadas son el promedio de 10 ratonespor grupo, evaluados hasta el día 14 después dela aplicación de 7 dosis (una dosis diaria) de 30mg de ácido kaurénico por kilogramo de peso; elgrupo control fue tratado con etanol (10 µl de etanolen 90 µl de agua).

Se observa una reducción en el tamaño de lalesión, la cual se inicia a partir del primer día detratamiento, obteniéndose una reducción total de1,2 mm lo que representa el 70% a los 7 díasdespués del tratamiento; esta reducción tambiénse manifiesta en el número de parásitosintracelulares observados en los frotis de laslesiones, teñidos con Giemsa, en los cuales seobservaron 5±3 parásitos en 10 campos, encomparación con 35±5 parásitos en 10 camposen los ratones controles.

Discusión

El efecto leishmanicida del ácido kaurénico, (ent-kaur-16-en-19-oico) fue evaluado in vivo e in vitro.Los resultados obtenidos en promastigotes,amastigotes axénicos y macrófagos infectados ysin infectar, utilizando el método colorimétrico paradeterminar la viabilidad celular y, por ende, la DL

50

Figura 1. Efecto del ácido kaurénico sobre promastigotesde Leishmania (Viannia) braziliensis, cultivados en medioSDM-79 +10% de suero fetal bovino y tratados con diversasconcentraciones del compuesto.

185


(20), indican que este compuesto tiene un altopoder leishmanicida. Se evaluaron diferentesconcentraciones de ácido kaurénico, y se encontróuna DL

50 para promastigotes de 0,80 µg/ml a las

24 horas de incubación con concentraciones en-tre 10 y 200 µg/ml; dosis mayores de 25 µg/mlproducen el 100% de muerte de los promastigotesde L. (V.) braziliensis, dosis menor que lareportada para promastigotes de Leishmania(Leishmania) mexicana (13).

En amastigotes axénicos, la dosis necesaria paraeliminar el 50% de los parásitos fue de 0,25 µg/mlen 24 horas, observándose que para la formaamastigote la DL

50 es, aproximadamente, una

tercera parte de la dosis necesaria para lospromastigotes, lo que indica una mayorsusceptibilidad de la forma amastigote, tal comoha sido reportado para el Glucantime® (23), en laque los amastigotes axénicos de L. (L.) donovanison susceptibles a una DL

50 de 80 µg/ml, mientras

los promastigotes son susceptibles a una DL50

de5.830 µg/ml de Glucantime®.

Los resultados aquí reportados, también, sugierenque el ácido kaurénico podría ser estado-específico, ya que la DL

50 para los amastigotes

axénicos es 3,2 veces menor que para lospromastigotes, aunque en comparación conGlucantime® tiene un potente efecto leishmanicidasobre ambas formas del parásito.

Se han sintetizado otros compuestos conactividad leishmanicida y se han evaluado in vivoe in vitro; entre ellos se encuentran algunosderivados de la pirimidina y una serie dediarilheptanoides, los cuales han mostrado serefectivos en promastigotes de L. (L.) donovani,L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis y L. (L.)chagasi (24, 25).

Actualmente, en la búsqueda de mejoresmedicamentos con menos efectos colateralespara el tratamiento de la leishmaniasis se hanexplorado los productos naturales derivados deplantas superiores, entre los cuales se encuentranel extracto alcaloide aislado de la planta Aspi-dosperma ramiflorum (Apocinácea) la cual inhibeel crecimiento de promastigotes de L. (L.)amazonensis y L. (V.) braziliensis (26). Así mismo,se ha aislado una serie de compuestos con poder

leishmanicida, entre los cuales se encuentranquinonas, lactosas, acetógenos, lignanos,flavonoides y terpenos.

En cuanto a los terpenos, los cuales muestranuna gran actividad leishmanicida, son losmetabolitos secundarios más abundantes en lanaturaleza, ya que juegan un papel muy importanteen la biosíntesis de las vitaminas A, D y E, dealgunas hormonas como la cortisona, el estrógenoy la testosterona; además, intervienen en lasíntesis de algunos esteroides, como el colesterol,y forman parte de aceites esenciales ycarotenoides. Los diterpenos 7-hidroxi-12-metoxi-nor-abieta-1,5 (10), 7, 9,12-penta-en-6,14-dione yel abieta-8,12-dien–11,14-dione (12-deoxi-roileanone), así como un triterpeno aislado de laraíz de Salvia silicica, mostraron actividadleishmanicida contra amastigotes de L. (L)donovani y L. (L) major a dosis letales de 170 y290 nM, respectivamente (27-29).

Todos estos resultados apoyan la búsqueda decompuestos leishmanicidas derivados de plantas.Nuestro trabajo aporta resultados en cuanto alefecto de estos productos sobre el promastigote,la célula hospedadora y la forma intracelular deLeishmania spp. Los resultados obtenidosutilizando la línea celular J774-G8 indican que auna concentración de 25 µg/ml, la viabilidad delos macrófagos es de 70,08%. Esta concentraciónes similar a la encontrada para otros derivadosde plantas tales como las saponinas enfibroblastos humanos (30); sin embargo, estosvalores resultan altos comparados con el efectodel ácido kaurénico en líneas cancerígenas dondese encontró la DL

50 entre 0,59 y 0,012 µg/ml (16).

En cuanto al tratamiento experimental de la leish-maniasis cutánea, se pudo observar una reducciónde 70% en el tamaño de la lesión, utilizando unadosis diaria de 30 µg/kg de peso durante 7 días.Sin embargo, no hubo eliminación total de losparásitos en las lesiones, ya que se observaronalgunas formas amastigotes (5 en 100 células).Además, el error estándar calculado para losratones tratados, utilizando el programa PRISMA,no detectó errores significativos en los valoresobtenidos, en contraste con los controles cuyoserrores estándar fueron variables durante el tiempode la medición. Este resultado sugiere un

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importante efecto parasiticida in vivo. Es prob-able que al incrementar la concentración delcompuesto o el tiempo de tratamiento, ocurra laeliminación total de los parásitos, tal como ocurrecon otros compuestos como el pamidronato, elcual induce una total cura parasitológica enratones Balb/c (11).

Los resultados sugieren que el ácido kaurénico(ent-kaur-16-en-19-oico-9) aquí reportado sería unposible candidato a ser evaluado en futurasinvestigaciones utilizando adicionalmente otrasvías de inoculación, para valorar su utilidad en eltratamiento de la leishmaniasis cutánea producidapor L. (V.) braziliensis.

Agradecimientos

Al personal del Laboratorio de Ingeniería Genética,por el apoyo prestado durante la realización deltrabajo, especialmente a Miguel A. Barrios, por laayuda prestada en la estandarización del métodoindirecto para el cálculo de la DL

50.


Los autores declaran no tener conflicto deintereses en el manuscrito.

Financiación

Este estudio fue realizado con el apoyo económicodel CDCH de la Universidad Central de Venezuelay el FONACIT proyecto S1-2001-000761

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Biomédica 2006;26(Supl.1):188-93ROBLEDO S.M., PUERTA J.A., MUÑOZ D.L., et al

ARTÍCULO ORIGINAL

Eficacia y tolerancia de la pentamidina enel tratamiento de la leishmaniasis cutánea producida por

Leishmania (V.) panamensis en ColombiaSara María Robledo, Juan Alberto Puerta, Diana Lorena Muñoz,

Mónica Guardo, Iván Darío Vélez

Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales PECET, Universidad de Antioquia

Introducción. El tratamiento de elección de la leishmaniasis cutánea es el antimoniopentavalente con una eficacia cercana al 85%; sin embargo, debido a los serios efectosadversos y a la aparición cada vez más frecuente de resistencia al tratamiento, se hace necesariala búsqueda de alternativas terapéuticas.Objetivo. Evaluar la eficacia terapéutica y la tolerancia del isotianato de pentamidina con unensayo clínico piloto con pacientes con leishmaniasis cutánea producida por L. (V) panamensisen Colombia.Materiales y métodos. Se incluyeron en el estudio 63 pacientes los cuales fueron tratados porvía intramuscular con 4 mg de isotianato de pentamidina/kg de peso/ interdiario por cuatrodosis, con seguimiento clínico por seis meses.Resultados. De los 63 paciente incluidos, 43 fueron evaluados durante los seis meses delestudio y de estos 37 (86%) presentaron curación de todas sus lesiones mes y medio despuésde terminar el tratamiento. Cinco pacientes (11,6%) fallaron al tratamiento por no cicatrizaciónde las lesiones y uno presentó recaída. En general el tratamiento fue bien tolerado; los efectosadversos principales fueron dolor y edema en el sitio de aplicación, mareo y fiebre, de intensidadleve a moderada. No se presentaron hipoglucemia, hipotensión ni diabetes.Discusión. Los resultados del presente estudio validan los hallazgos de eficacia de lapentamidina para el tratamiento de la leishmaniasis cutánea en Colombia y en Brasil. Sedestaca una baja frecuencia e intensidad de los efectos colaterales en la población civil dondeno se encontró ningún paciente con efectos secundarios serios.

Palabra clave: leishmaniasis cutánea, tratamiento, pentamidina, eficacia, tolerancia, Colombia.

Efficacy and tolerance of pentamidine for treatment of cutaneous leishmaniasis causedby por L. (V) panamensis in Colombia

Introduction. Current treatment for human cutaneous leishmaniasis (CL) relies on pentavalentantimonials. Although efficacy of these drugs is high (around 85%), their widely documentedtoxicity and increasing resistance makes the search for therapeutic alternatives a priority forendemic countries.Objective. To evaluate the efficacy and tolerability of the pentamidine isethionate for the treatmentof cutaneous leishmaniasis caused by L. (V) panamensis in a pilot clinical trial.Materials and methods. Sixty three individuals suffering CL were enrolled. Patients receivedfour intramuscular injections of pentamidine (4 mg/Kg/injection) administered every other day,and both clinical efficacy and side effects were documented during the following 6 months.Results. Of the 63 patients enrolled, 43 could be followed for 6 months. 86% (37/43) of treatedpatients healed all their lesions by 1.5 months after therapy. Treatment failure was observed inonly five patients (11.6%; 5/43). One patient showed relapse. Overall tolerance of treatmentwas good, with adverse events such as local pain and swelling at the site of injection, dizzinessand fever, varying from mild to moderate. Hypoglycemia, hypotension or diabetes were notobserved.


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Biomédica 2006;26(Supl.1):188-93 TRATAMIENTO DE LA LEISHMANIASIS CUTÁNEA EN COLOMBIA

Discussion. These results confirm the previously reported efficacy of pentamidine for thetreatment of CL in Colombia and Brazil, and, additionally, highlight the low intensity andfrequency of side effects in a civilian population. No serious adverse events were recorded.

Key words: cutaneous leishmaniasis, therapy, pentamidine, efficacy, tolerance, Colombia.

Correspondencia:Iván Darío Vélez, Programa de Estudio y Control deEnfermedades Tropicales, PECET, Universidad de Antioquia,Sede de Investigación Universitaria, SIU, Laboratorio 632;Calle 62 Nº 52-59, Medellín, Colombia.Teléfono: (574) 210 6502; fax: (574) 210 [email protected]


La leishmaniasis cutánea es una enfermedadendémica en Colombia. Para los años 2003 y 2004se diagnosticaron anualmente cerca de 10.000casos y en el 2005 la cifra aumentó a cerca de18.000, 98% de leishmaniasis cutánea, 0,7% deleishmaniasis mucosa y 0,9% de leishmaniasisvisceral.

Leishmania (V.) panamensis es la especie másampliamente extendida en el país, responsablede la mayoría de casos cutáneos y mucosos (1).El tratamiento de elección es el antimoniopentavalente (SbV) a dosis de 20 mg/kg por día,por 20 días con una eficacia cercana al 85% (2).Sin embargo, debido a la necesidad de aplicardiariamente inyecciones intramusculares (IM), laduración del tratamiento y los efectos colateralesde los antimoniales: mialgias, artralgias, anorexia,náuseas y dolor de cabeza (3), muchos pacientesno concluyen el tratamiento, lo que favorece lareactivación de la lesión, el compromiso en mu-cosas y la aparición de resistencia al medicamento.Por esta razón, la Organización Mundial de laSalud plantea como prioritaria la búsqueda dealternativas terapéuticas.

El isotianato de pentamidina es un medicamentoantiparasitario de uso general utilizado durantemuchos años en el tratamiento de infeccionesproducidas por Trypanosoma, Babesia yPneumocystis y se ha utilizado como tratamientoalternativo para casos de leishmaniasis visceralresistentes al SbV (4,5). En Colombia y en otrospaíses, el uso de pentamidina a diferentes dosiscomo tratamiento alternativo para casos deleishmaniasis cutánea producida por L. (V.)panamensis y Leishmania (V.) braziliensis, ha

brindado altas tasas de curación, hasta del 96%(13), con tasas de recaída muy bajas pero conefectos colaterales leves o moderados enesquemas terapéuticos de bajas dosis queincluyen dolor en el sitio de aplicación de lainyección, náuseas, vómito y, en algunos casos,hipoglucemia. Se han observado efectos adversosserios como diabetes mellitus y nefrotoxicidad enesquemas prolongados con altas dosis como losque se emplean en neumonías por Pneumocystisjiroveci o en pacientes con coinfección VIH-Leish-mania (6-10).

Teniendo en cuenta que los estudios previosrealizados en Colombia se llevaron a cabo enpoblación militar y ante la necesidad de validarestos estudios en población general, por iniciativadel Ministerio de Protección Social se diseñó elpresente estudio con el fin de evaluar la eficaciay la tolerancia a la pentamidina en población civilcon leishmaniasis cutánea, utilizando un esquematerapéutico de 4 mg/kg, interdiario, por cuatrodosis.


Diseño del estudio

Estudio clínico abierto en el que se evaluó laeficacia y la tolerancia de 63 pacientes condiagnóstico parasitológico de leishmaniasiscutánea tratados con isotianato de pentamidina(Pentacarinat®), suministrado por el Ministerio deSalud, los cuales fueron atendidos por el Programade Estudio y Control de Enfermedades Tropicales,PECET.

Los criterios de selección para la inclusión de lospacientes fueron: edad, entre 18 y 40 años;diagnóstico parasitológico de leishmaniasiscutánea, sin tratamiento previo para leishmaniasisdurante los seis meses anteriores; ausencia delesiones en mucosas o en regiones cercanas amucosas; disponibilidad para el seguimiento clínicodel tratamiento, y haber aceptado por escrito serincluido en el estudio. Entre los criterios de

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exclusión se tuvieron en cuenta: embarazo y elpadecimiento de alguna enfermedad aguda ocrónica asociada o la imposibilidad de asegurarel seguimiento.

Para la realización de este estudio se contó conla aprobación del Comité de Bioética Humana dela Universidad de Antioquia.

Todas las cepas aisladas de los pacientes seidentificaron por medio de inmunofluorescenciautil izando los anticuerpos monoclonalesgentilmente suministrados por Diane McMahonPratt.

Los pacientes tratados con pentamidina recibieronuna dosis IM de 4 mg/kg cada dos días por cuatrodosis. Para determinar la respuesta al tratamientose calculó el área de ulceración e induración decada una de las lesiones. La evaluación clínica yla medición del área de las lesiones se hizo antesde comenzar el tratamiento, al final del mismo, alas tres y seis semanas y a los seis mesesdespués de terminado el tratamiento.

Para hacer la evaluación de la respuesta altratamiento se tuvieron en cuenta los siguientesparámetros clínicos, siempre con respecto a laevaluación anterior:

- cicatrización completa: cicatrización del 100%del área y desaparición completa de lainduración;

- mejoría clínica: cicatrización o disminución dela induración mayor al 50% del área;

- sin mejoría clínica: cicatrización o disminuciónde la induración menor del 50% o aumentomenor del 50% del área;

- falla clínica: aumento mayor del 50% del área;

- recaída: reactivación de alguna lesión despuésde una cicatrización completa.

Criterio de falla:

1. A las tres semanas: cuando hay, por lo menos,una lesión con induración o ulceración,calificada como falla.

2. A las seis semanas: cuando hay, por lo menos,una lesión con induración o ulceración,calificada como sin mejoría clínica o falla.

3. A los seis meses: cuando todavía hay unalesión con induración o ulceración activa.

4. Durante todo el estudio: cualquier lesión conrecaída o cuando hay inicio de una lesiónmucosa.

Además, se registraron la aparición y el grado deseriedad de los efectos adversos, clasificadoscomo leves, moderados o graves. Todos lospacientes que presentaron fallas, recibierontratamiento con antimoniato de meglumina (20 mg/kg por día, IM, durante 20 días).

Análisis estadístico

Se realizó un análisis descriptivo de las diferentesvariables evaluadas. Para las variables como edad,número de lesiones por paciente y tiempo deevolución de las lesiones, se calcularon elpromedio y la desviación estándar y los intervalosde confianza para el promedio de estas variables,utilizando un nivel de confianza del 95%,asumiendo una distribución normal toda vez queel n es mayor de 30.

Resultados

Todos los pacientes incluidos en el estudio eranprocedentes del noroccidente colombiano y suscaracterísticas más relevantes se encuentrancitadas en el cuadro 1.

De los 63 pacientes incluidos, 43 (68%) terminaronel seguimiento clínico de los seis mesespostratamiento, con los cuales se realizaron loscálculos de eficacia por protocolo. Veintepacientes se perdieron en el seguimiento y, por lo

Cuadro 1. Características de los pacientes evaluados enel estudio.

Característica Valor

Pacientes evaluados 43

Edad en años (±DE)a 25,3±12,5

Hombres 74,4%

Lesiones por paciente (±DE) b 3,5±6,3

Tiempo evolución, meses (±DE) c 3,6±5,7

Pacientes con cultivo positivo 39 (90,7%)

Leishmania panamensis 39 (100%)

Intervalos de confianza del 95%: a 21,57-29,03; b 1,62-5,38;c1,9-5,3

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tanto, no se obtuvieron datos de su evolución fi-nal después del tratamiento y se analizan en elcuadro 2 como intención por tratar (cuadro 2).

Treinta y nueve de los 43 pacientes analizadospor protocolo (91%) tuvieron cultivo positivo. El100% de las cepas identificadas con anticuerposmonoclonales correspondieron a L. (V.)panamensis.

Se observó completa cicatrización de todas laslesiones en 37 (86%) de los pacientes evaluadospor protocolo, de los cuales 18 (41,9%) cicatrizarona las tres semanas postratamiento y 19 (44,2%)a las seis semanas. Cinco (11,6%) pacientespresentaron falla durante el tiempo de seguimiento.Un paciente que había cicatrizado presentórecaída en la evaluación de los seis mesespostratamiento. En ningún paciente se observóaparición de compromiso mucoso. La tasa deeficacia acumulada para el tratamiento fue de 86%,eficacia que disminuye a 58,7% en el análisis porintención por tratar, si se asume que todos los

pacientes perdidos en el seguimiento a los seismeses hubieran fallado al tratamiento.

El 55,8% de los pacientes tratados con isotianatode pentamidina presentaron efectos secundariosleves o moderados, a saber: dolor en el sitio deaplicación (34,8%), edema en el sitio de aplicación(11,6%), mareos (11,6%), fiebre (9,3%), cefalea(4,6%), adinamia (4,6%), náuseas (2,3%) y dolorarticular (2,3%), que fueron evaluados como leveso moderados (figura 1). No se presentaron casosde efectos adversos serios, hipotensión, diabetesmellitus o hipoglucemia.

Discusión

El isotianato de pentamidina a una dosis de 4 mg/kg, cada dos días, por cuatro dosis, demostróser efectivo en el 86% efectivo para el tratamientoen población general colombiana de la leishma-niasis cutánea producida por L. (V.) panamensis,proporcionando curación clínica con una baja tasade recaída (2,3%), cuando el seguimiento se hacedurante seis meses.

Estos resultados son comparables con losencontrados por Soto et al. (6) quienes evaluaronla aplicación de 2 mg de isotianato de pentamidina/kg, cada dos días por siete dosis y encontraronuna tasa de curación del 96%. Sin embargo, 17,4%de los pacientes interrumpieron el tratamientoluego de cuatro a seis inyecciones por problemasde hipotensión (8,7%), hipoglucemia (8,7%),intenso dolor de cabeza (4,3%) y mialgias (4,3%).Cuando el número de dosis fue de 4, la eficaciadisminuyó al 74%.

Cuadro 2. Eficacia del tratamiento con pentamidina.

Variable Intención Protocolo por tratar n

Pacientes incluidos 63 43

Cicatrización completa a 28,6% 41,9%la semana 3

Cicatrización completa a 60,3% 88,3%la semana 6

Recaída a los 6 meses 1,6% 2,3%

Eficacia a los 6 meses 58,7% 86%

Figura 1. Tolerancia al tratamiento (porcentaje de aparición de los efectos adversos)

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El mismo autor en un estudio posterior en 38militares colombianos (7), utilizó como esquemade tratamiento 2 mg/kg cada dos días por cuatroinyecciones y la tasa de curación fue de 84% perocon una alta frecuencia de efectos adversos(55%). Si la dosis diaria se aumentaba a 3 mg/kg, la tasa de curación era de 96% pero el 64%de los pacientes presentaron manifestacionessecundarias que fueron clasificadas en 10,9%como moderadas o serias. Con resultadossimilares, de Paula et al. (11) en Brasil evaluaronla pentamidina en pacientes con lesihmaniosiscutánea producida por Leishmania braziliensis ala dosis de 4 mg/kg por dosis, interdiarios, portres dosis y encontraron una eficacia de 71%.Todos estos resultados difieren de los encontradospor Andersen et al. (12) en Perú quienes trataroncon isotianato de pentamidina a la dosis de 2 mg/kg, interdiario, por siete inyecciones a 40 pacientesperuanos con leishmaniasis cutánea debida a L.braziliensis, con una tasa de curación de sólo el35%.

En el presente estudio se encontró una toleranciaaceptable al medicamento, la intensidad de losefectos adversos fue menor que la encontradapor Soto en población militar y ningún pacientepresentó efectos adversos serios.

Luego de terminado el presente estudio, seinformaron algunos casos de rabdomiólisisasintomática y transitoria en pacientes con leish-maniasis cutánea producida por Leishmaniaguyanensis y que fueron tratados con isotianatode pentamidina en dosis única de 7 mg/kg. Estospacientes presentaron aumento de la creatín-cinasa, sin cambios en los niveles de urea ocreatinina, o aumento de creatinín-fosfocinasa yde mioglobina. Es recomendable, por lo tanto,controlar los niveles séricos de proteina cinasaC, aldolasas, mioglobina y transaminasas (ASATy ALAT) a fin de evitar la aparición de rabdomiólisiso de posibles efectos nefrotóxicos de estemedicamento (13-17).

En un ensayo clínico realizado en el PECET con66 pacientes con diagnóstico parasitológico deleishmaniosis cutánea procedentes de la mismaregión geográfica de los incluidos en el presenteestudio, se evaluó el antimoniato de meglumina a

la dosis de 20 mg SbV/kg por día durante 20 díasy se encontró una eficacia del 93% (3).

Se concluye que el isotianato de pentamidina y elantimoniato de meglumina son medicamentoscomparables en cuanto a su efectividad y a suvía de aplicación. La ventaja del isotianato depentamidina radica en un menor tiempo deadministración y de dosis requerida. La desventajaradica en su costo superior al de los antimoniales,por lo que se debe mantener como un medicamentoalternativo para el tratamiento de la leishmaniosiscutánea en Colombia, con el esquema de 4 mg/kg por dosis, interdiario, por cuatro dosis.

Agradecimientos

Los autores agradecen a los pacientes por suparticipación voluntaria en el estudio y al Ministeriode Protección Social de Colombia por la invitacióna realizar el presente estudio clínico.


Los autores manifiestan no tener ningún conflictode interés con la realización de este trabajo.

Financiación

Este estudio fue financiado por el Programa deEstudio y Control de Enfermedades Tropicales,PECET, Universidad de Antioquia, y por elMinisterio de la Protección Social de Colombiaque suministró los medicamentos.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):194-206SOTO J., SOTO P.

REVISIÓN DE TEMA

Correspondencia:Jaime Soto, CIBIC, Centro de Investigaciones Bioclínicasde la Fundación FADER, Calle 60 A No. 5-54, oficina 201,Bogotá.Teléfono 348 2171; fax: 347 [email protected] y [email protected]


Estado actual y futuro dela terapia anti-leishmaniásica en Colombia

Jaime Soto, Paula Soto

CIBIC, Centro de Investigaciones Bioclínicas de la Fundación FADER, Bogotá, Colombia.

Los antimoniales pentavalentes son la primera elección para el tratamiento de la leishmaniasisen Colombia pero la dosis ha tenido que incrementarse en mas de 600% para mantener sueficacia que en distintos reportes varía entre 93 y 25%, lo cual puede reflejar diferencias en lasensibilidad de los parásitos pero más probablemente incumplimiento de los esquemasrecomendados. Los resultados de su empleo, así como la situación actual de pentamidina,anfotericina B y miltefosina son revisados y se hace una proyección sobre el desarrollo de laterapia en los próximos años. Para definir el real estado de la respuesta a los medicamentosanti-leishmaniásicos y prolongarles su vida útil, es indispensable establecer mecanismos devigilancia de los factores implicados en el manejo de la enfermedad por lo que se plantea unaestrategia de sitios centinela que permitan observaciones puntuales en el tiempo, en áreasespecíficas y sobre situaciones particulares.

Palabras clave: leishmaniasis/terapia, vigilancia epidemiológica, resistencia a las drogas,resultado del tratamiento, efectividad.

Current situation and future of antileihmanial therapy in Colombia

Pentavalent antimonials are the first choice to treat leishmaniasis in Colombia. However, a600% increase in the total dose has been necessary in order to maintain their efficacy. Curerates varying between 93 and 25% can reflect differences in parasite susceptibility, but aremore likely secondary to deficiencies in compliance with treatment guidelines. We review thecurrent situation of efficacy and use of pentavalent antimony compounds, amphotericin B,pentamidine and miltefosine and attempt a projection for the next following years. To determinethe real situation of response to antileishmanial drugs and to extend their useful life, theestablishment of surveillance mechanisms to cover all factors involved is necessary. A sentinelsite surveillance strategy to allow punctual observations in time, in specific geographical areasand in particular local situations, is proposed.

Key words: Leishmaniasis/therapy, epidemiologic surveillance, drug resistance, treatmentoutcome, effectiveness.

El 99% de los casos nuevos de leishmaniasis enColombia son cutáneos, causados por variasespecies de parásitos hemoflagelados de lossubgéneros Viannia y Leishmania con ampliopredominio de Leishmania (V) panamensis. En el2004 se registraron en nuestro país cerca de

13.000 casos nuevos de leishmaniasis (1) lo querepresenta un incremento de más del 37% sobrelo reportado en 2003. Se prevé que elcomportamiento epidémico mostrado por laenfermedad se mantenga durante los próximosaños dada la persistencia de factores sociales yde orden público que exponen a un número mayorde personas al riesgo de la infección, así como laaparición de nuevos focos de transmisiónresultado de la colonización vectorial de nuevasáreas geográficas, incluidas las zonas urbanas.

Desde su introducción en 1945, los antimonialespentavalentes se han mantenido en primera línea

Biomédica 2006;26(Supl.1):194-206

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Biomédica 2006;26(Supl.1):194-206 TRATAMIENTO DE LA LEISHMANIASIS EN COLOMBIA

como medicamentos anti-leishmaniásicos; deellos, el antimoniato de meglumina (Glucantime®,Aventis) es el empleado en el Nuevo Mundomientras que el estibogluconato de sodio(Pentostam®, GSK) es mas comúnmente usadoen el Viejo Mundo. En el curso de los últimostreinta años se han venido haciendo ajustes en ladosificación como mecanismo para mantener sueficacia. En 1975, la dosis total para un adulto de65 kg era de 4,25 g de antimonio (1 ampolla pordía durante 10 días); en 1984, la OrganizaciónMundial de la Salud (OMS) recomendó la dosisde 20 mg/kg por día durante 20 días con dosistope de 850 mg diarios (2) y, luego, en 1990,eliminó el tope (3), criterio que acogió Colombia(4) y que hoy sigue vigente, por lo que una personade 65 kg recibe un total de 26 g. Esto significaque la dosis se ha incrementado el 612%. Si bienlos antimoniales pentavalentes tienen una ventanaterapéutica amplia, lo que permitió este aumentode la dosis, sus efectos secundarios son ahoramás frecuentes y severos tanto en pacientesafectados por leishmaniasis cutánea como enlos enfermos de leishmaniasis visceral que,generalmente, tienen un mayor compromiso desu estado general (5-11).

Los reportes de eficacia del antimoniato demeglumina en diversos estudios clínicosadelantados en la última década con pacientescolombianos afectados por leishmaniasis cutáneavarían entre 25% y 93% (12-18); tal amplitud enla variación es también reportada en estudiosregionales (19-22) y se puede explicar por factoresdirectamente relacionados con la enfermedad(dependientes del parásito o del hospedero), conel esquema terapéutico empleado o con factoresinherentes al estudio (diseño, número de sujetosincluidos, criterios de curación y falla, tiempo deseguimiento, etc.) (23).

A la variabilidad en la eficacia de los antimonialespentavalentes se suman otros factores (alto costo,vía de administración parenteral, disponibilidad,etc.) que limitan su empleo, por lo que regional-mente se han hecho múltiples estudios paraencontrar alternativas terapéuticas. Se hanprobado otros medicamentos inyectables comola anfotericina B (24), la pentamidina (12,25) y la

paromomicina (13); drogas orales como elalopurinol (14), la mefloquina (26), la dapsona (27),la rifampicina (28), el metronidazol (29), elitraconazol (12), el ketoconazol (30), el fluconazol(31), la azitromicina (32) y la terbinafina (33), ypreparados tópicos (15,34,35) así como otrasmodalidades terapéuticas físicas como lacrioterapia (36) y la termoterapia (37). Algunosmuestran resultados iniciales alentadores perotales resultados no siempre se reproducen enotras regiones y en pacientes infectados por otrasespecies. Existe, pues, una amplia variación enla respuesta a los diversos intentos terapéuticos.Desde 1998 (38), la miltefosina por vía oral hamostrado ser un medicamento efectivo en laleishmaniasis visceral por L. donovani y en laleishmaniasis cutánea por L. panamensis (en estenúmero de Biomédica se publica una revisiónsobre miltefosina).

Dada la amplia variabilidad de las tasas de eficaciareportadas en los distintos estudios clínicos y lapersistente preocupación de los médicos quetrabajan en las zonas endémicas por la aparentedisminución de la efectividad de los antimonialespentavalentes, así como la introducción de nuevosmedicamentos, la presente revisión esboza al finaluna propuesta para establecer un programa devigilancia centinela para analizar los resultadosde las intervenciones terapéuticas.

Esquemas terapéuticos vigentes en América

La OMS recomendó en 1990 el empleo deantimoniales pentavalentes a la dosis de 20 mg/kg por día durante 20 días continuos, sin dosistope, para la forma cutánea y durante 28 días parala forma mucosa (3). El Ministerio de Salud deColombia acogió tal recomendación en su guía y,en la actualidad, se emplea el antimoniato demeglumina en una dosis diaria por vía intramuscular(IM). Ante un paciente que no responde o querecae, se recomienda un nuevo curso completodel antimonial bajo supervisión directa, y ante laposibilidad de una segunda recaída, se recomiendaemplear cuatro inyecciones IM de isotianato depentamidina a la dosis de 3 mg/kg por día endías alternos (4).

Al revisar la situación de los países vecinos, seencuentra que la recomendación oficial en Perú

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(año 2000) indica la misma dosis diaria por 20días en la forma cutánea y 28 en la mucosa,admite la administración endovenosa (EV) o IM yse mantiene una dosis tope de tres ampollas(1.275 mg) por día (39, 40). En Argentina (año2004) la dosis es la misma, el tiempo deadministración es igual pero la dosis tope está endos ampollas (850 mg) diarios y sólo serecomienda la vía IM (41). En México (año 2003)se recomienda la misma dosis por un mínimo de20 días para la forma cutánea localizada y conuna dosis tope de dos ampollas (850 mg) por díacomplementada por 4 a 6 inyecciones intra-lesionales semanales de antimoniales y calor local(42). En Brasil (año 2000) la recomendación esde 10 a 20 mg/kg por día durante 20 a 30 días(43,44). En Ecuador (año 2001) la recomendaciónes la inyección IM de 10 a 20 mg/kg por día por10 a 15 días para la forma cutánea y 28 para lamucosa (45). En Venezuela (año 2003) seemplean 20 mg/kg por día durante 20 días paralos casos cutáneos y 28 para los mucosos porvía EV o IM (46). El ejército de los Estados Unidos(año 2004) recomienda 20 mg/kg por día durante20 días por vía EV, sin dosis tope (47). Ensíntesis, aunque existe una recomendación de laOMS hay una amplia variedad de esquemas quepueden ser consecuentes con situaciones yfactores locales de cada país.

Mecanismo de acción deantimoniales pentavalentes

El blanco de los agentes quimioterápicos enleishmaniasis es el amastigote intracelular queescapa de los mecanismos naturales dedestrucción y que sobrevive y se multiplica dentrode la vacuola parasitófora del macrófago tisularcuyo pH ácido facilita la nutrición y la homeostasisdel parásito (48,49).

Las diversas especies de leishmanias aparente-mente ocupan macrófagos distintos y ejercenactividades de adaptación variadas, lo que podríaexplicar, al menos en parte, la diversidad en larespuesta a los medicamentos (50). Losmecanismos de acción de los antimonialespentavalentes no están aún totalmente dilucidadospero sabemos que la forma pentavalente delantimonio se transforma dentro del amastigote en

antimonio trivalente que es más tóxico y mata alparásito por acción sobre la enzima reductasa quedepende de tiol (TDR1) y por inhibición de latripanotión reductasa, afectando de esta manerala vía del metabolismo tiol que participa en lasíntesis de deoxirribonucleótidos, en laconjugación, secuestro y transporte de metales ymedicamentos y en la depuración de radicalestóxicos del oxígeno (51). Al inhibirse las enzimasinvolucradas en el metabolismo tiol, el parásitoqueda expuesto intracelularmente a la acción delos metabolitos reactivos del oxígeno que lo matan(51).

Mecanismos de resistencia aantimoniales pentavalentes

El estudio de los mecanismos de resistencia seve influenciado por el tipo de modelo in vitrousado, las especies estudiadas, los medios y elmedicamento empleado. Así, por ejemplo, L.braziliensis y L. donovani son tres a cinco vecesmás sensibles al estibogluconato de sodio que L.mexicana en un modelo macrófago/amastigote(51,52). Empleando promastigotes en cultivo,Grögl (53,54) demostró una amplia variación enla sensibilidad de leishmanias aisladas de lesionescutáneas a los antimoniales y sugirió unacorrelación entre dosis subterapéuticas y la menorsensibilidad a la droga encontrada in vitro. Unreflejo de estas variaciones en la clínica es queNavin encontró en Guatemala (55) diferencias enlas tasas de curación de pacientes infectados conL. braziliensis o L. panamensis tratados conestibogluconato de sodio.

En los parásitos resistentes a SbV hay nivelesaumentados de las enzimas del metabolismo tiolantes mencionadas, que depuran los radicalestóxicos del oxígeno eliminando este mecanismode ataque al parásito y permitir la preservación ymultiplicación de los amastigotes dentro de losmacrófagos. Hay, además, una modificación enel transporte del medicamento que frena suingreso y acelera su salida del parásitodisminuyendo, de esta manera, las concentra-ciones citoplasmáticas que podrían ser fatalespara el microorganismo. Para una mayorilustración al respecto se recomienda la revisiónpublicada por Osorio et al. (56).

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Situación actual de la eficacia de losantimoniales

Resistencia a los antimoniales pentavalentes

El que se genere resistencia a los medicamentoses especialmente crítico en casos deleishmaniasis visceral del Viejo Mundo producidospor L. donovani dada su característicadiseminación antroponótica, por lo que el principalproblema para el tratamiento de las leishmaniasisestá en la provincia de Bihar en India en donde sepresenta la mayor cantidad de casos deresistencia. Allí, en menos de 20 años, elantimoniato de meglumina perdió el 60% de sueficacia, razón por la cual ya no se emplea comotratamiento de primera línea (57). Esta situaciónes consecuencia de un proceso generado por elempleo de dosis subterapéuticas, cursosacortados de tratamiento y uso de medicamentono originales de baja calidad en una enfermedadde transmisión antroponótica. Las prácticas deiniciar con dosis bajas e ir aumentando hasta ladosis plena (“para inducir tolerancia”), de hacerpausas durante el tratamiento (“para disminuir losefectos secundarios”) o de dividir la dosis diariaen dos o tres aplicaciones (“para reducir el volumenque se va a inyectar”) resultan en nivelessanguíneos subterapéuticos y en una toleranciade los parásitos al antimonio (58).

La resistencia a los antimoniales pentavalentes,hecho evidente en leishmaniasis visceral en India(59), puede convertirse en un problema de igualmagnitud en la leishmaniasis cutánea del NuevoMundo; un incremento de más del 600% en ladosis en los últimos 30 años pone de manifiestoque los parásitos se han vuelto menos sensiblesy que, de alguna manera, esta característica seestá esparciendo. Estrictamente hablando, laleishmaniasis cutánea en América se consideraaún una zoonosis, pero los cambios en suecoepidemiología y su acercamiento a losasentamientos humanos están permitiendo queel hombre pase de simple huésped accidental ajugar un papel más protagónico en el ciclo detransmisión (60).

Desde 1989 (53) sabemos que es posible generarin vitro cepas resistentes a SbV medianteexposición a dosis subóptimas y que esa

característica se mantiene luego de múltiplespasos por cultivos e, incluso, después de haberpasado por huéspedes mamíferos y ser cultivadanuevamente, lo que significa que se inducenmodificaciones genéticas que producen cambiosestructurales y funcionales permanentes que sonheredados por su descendencia, es decir que dosisbajas de SbV favorecen la persistencia de parásitosgenéticamente más resistentes (54). El que 13de 14 aislamientos procedentes de pacientes quehabían sido tratados con antimoniales y no habíancurado mostraran menor sensibilidad que lademostrada por esas mismas cepas antes deltratamiento (61) es una confirmación in vivo deesta importante observación.

Los parásitos aislados de pacientes conleishmaniasis visceral por L. donovani que norespondieron a SbV eran en promedio cinco vecesmás resistentes in vitro que los aislamientos delos pacientes que sí curaron (62). La mitad de lospacientes catalogados como “refractarios” a losantimoniales en India en 1994 realmente nohicieron el tratamiento siguiendo lasrecomendaciones oficiales de OMS (59), dato queconcuerda con lo hallado en nuestro paísrecientemente: de 226 enfermos tratados conantimonio pentavalente, 43 (19%) fallaron y alrevisar la forma como se llevó a cabo eltratamiento se evidenció que quienes fallaronrecibieron entre 3% y 13% menos de la dosisrecomendada lo que significa que aun lasvariaciones pequeñas en la cantidad diaria demedicamento pueden ser responsables derespuestas anormales (18).

La leishmaniasis cutánea americana se haconsiderado siempre una zoonosis que afectaincidentalmente al ser humano cuando penetra enel área de transmisión, por lo que la resistencia alos medicamentos no es aún crítica desde el puntode vista epidemiológico. Sin embargo, los patronesde exposición y transmisión de la enfermedad hancambiado: antes los hombres viajaban solos asus áreas de trabajo mientras que ahora sedesplazan las familias completas y, así, todoslos miembros están en riesgo.

Además, la deforestación y los cambiosambientales han acercado los vectores a laperiferia de las poblaciones en donde se han

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asentado las familias desplazadas de los camposy ciudades; de la misma manera, algunos vectoreshan cambiado sus hábitos y se han hecho peri ointradomiciliarios (63-66). La distribución por sexoy por grupos de edad se ha modificado y hoysabemos que en Colombia una tercera parte delos pacientes diagnosticados con leishmaniasiscutánea son menores de 14 años y que unatercera parte del total son mujeres (67,68),situación común a la de otros países de la región(69). Puede, entonces, decirse que laleishmaniasis cutánea está en un proceso deurbanización y “domiciliación” lo que permite laeventual participación del ser humano en elproceso de transmisión, caso en el cual laposibilidad de diseminación de resistencia sevuelve crítica.

En 1989 se comunicó el primer caso de respuestaanormal a SbV en un paciente colombianoinfectado con L. panamensis, que había sidotratado inicialmente con tres “cursos” de diez días;en el lapso de 14 meses este paciente recibiómás de 92 g de SbV en muy variados esquemassin que llegara a curarse de la leishmaniasis (SotoJ, Chalela J, Flórez M. Respuesta anormal aGlucantime en Colombia, VIII Congreso Mundialde Dermatología, Rio de Janeiro, Brasil, 1989).En este caso hubo una evidente subdosificacióndel medicamento durante el primer tratamiento loque pudo influir en la falta de respuesta a losantimoniales, situación similar a la planteada enIndia como explicación a la generación deresistencias (58,59).

Otros factores que afectan la eficacia de losantimoniales pentavalentes

Intentar reducir el tratamiento de las leishmaniasisa una fórmula única es prácticamente imposiblepues a las variaciones intrínsecas de las especies(54), al estado inmunológico del paciente (23) y ala localización geográfica del foco (70), se sumanlas diferencias en la farmacocinética que imponenla localización cutánea o visceral de la enfermedad(50), la edad del paciente (16) e, incluso, lasdiferencias en el contenido de SbV de los distintoslotes de los antimoniales pentavalentes (71-73).

En condiciones reales de empleo, hay factoresno directamente dependientes del medicamento,

el parásito o el enfermo, que pueden modificar elcurso y el resultado de una intervenciónterapéutica, tales como:

A. forma como es prescrito y como se suministrael medicamento;

B. interacciones del personal de salud con elpaciente (empatía, grado y calidad de lainformación proporcionada, acompañamientoy seguimiento);

C. creencias sobre los medicamentos y susefectos, tanto de los pacientes como delpersonal de salud;

D. forma de presentación de los medicamentos;

E. falsas percepciones de los resultados deltratamiento, tanto de los pacientes como delpersonal de salud, y

F. efectos colaterales.

Todos estos factores deben ser evaluados y susresultados deben ser confrontados periódicamentepara buscar las estrategias necesarias que ayudena mejorar el cumplimiento de los tratamientos porparte de la población y la adecuada prescripciónpor parte de los trabajadores de la salud; de estamanera, es posible determinar la efectividad delos medicamentos antileishmaniásicos. Pero esnecesario que estas observaciones seanadelantadas por grupos independientes de losservicios de salud, pues por ser cualitativos, lasubjetividad de los implicados directamente conla prescripción y el seguimiento del cumplimientodel tratamiento, podría generar sesgos. En nuestropaís hay numerosas zonas endémicas deleishmaniasis por lo cual es imposible adelantaruna vigilancia sistemática en todo el territorio; serequieren estudios de tiempo limitado y lugarespecífico cuyos resultados tengan utilidadinmediata y directa en el sitio donde se realizan.Al consolidarse centralmente los datos de cadasitio centinela, se pueden determinar tendenciasy características comunes que sean útiles paralos responsables de las políticas nacionales.

Situación actual de la atención a los enfermos

Además de la eficacia reportada en los estudiosclínicos, es necesario saber cómo es elcomportamiento de los antimoniales en

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condiciones reales y qué circunstancias afectansu efectividad. En el 2004 (68) se revisaron lascondiciones de atención de los pacientes consospecha clínica de leishmaniasis cutánea encuatro centros localizados en distintas áreasendémicas del país a los que acudieron 406pacientes que fueron atendidos por el personallocal siguiendo las normas de cada centro. Uninvestigador revisó las fichas de registro, lashistorias (cuando se diligenciaron), los reportesde laboratorio y las fórmulas médicas y entrevistóalgunos pacientes. Los principales hallazgos deeste trabajo se presentan a continuación.

Diagnóstico. La descripción de las lesiones sehizo en el 41% pero los datos fueron escuetos(“úlcera” o “placa” sin más especificaciones); losantecedentes médicos y el examen físico generalfueron escritos en 43% de las fichas, pero sóloen 58 pacientes (14%) hubo anotaciones máscompletas que “normal” o “negativo”. En 67% seanotó el peso del paciente y en 12% hubo solicitudde exámenes de laboratorio (hemograma, pruebasde función renal y hepática y parcial de orina) perosin que se pudiera esclarecer la razón parasolicitarlos en cada caso. 256 (63%) casos fueronconfirmados parasitológicamente por examendirecto; en 52 (15%) no se practicó el frotis. En8% se tomó biopsia de piel y sólo en una terceraparte se aplicó la prueba de intradermorreacción.

Se hallaron anotaciones por controles médicos alfinal del tratamiento en 190 (40%). En losdocumentos de la mitad de las mujeres en edadfértil que recibieron tratamiento no se encontrarondatos sobre la fecha de la última menstruación,medidas anticonceptivas o prueba de embarazoprevia al inicio de las inyecciones. Los registrosepidemiológicos son más completos lo que reflejala clara tendencia de la ficha de registro depacientes actualmente en uso en Colombia haciaeste aspecto.

Tratamiento. 238 pacientes fueron tratados conantimoniato de meglumina (Glucantime®,Aventis). En 163 (68%) se cumplieron lasrecomendaciones de 20 mg/kg por día durante 20días continuos y 150 (92%) de ellos seconsideraron curados. En comparación, 35 de 75(47%) que recibieron esquemas incompletos

fallaron (cuadro 1). Once de quienes fallaronrecibieron un segundo tratamiento supervisado ysólo 5 (45%) se curaron.

Hubo dos razones principales para los esquemasincompletos: 1) ajuste de dosis, para no“desperdiciar”, con aproximación por lo bajo alnúmero de ampollas exacto, lo que sucedió en el60% de los que fallaron, y 2) reducción de efectossecundarios, lo que sucedió en el 40% restanteen quienes el intenso dolor en el sitio de lasinyecciones fue la queja principal.

Control de los programas de atención. Lainformación sobre la atención de los pacientescon leishmaniasis hace parte de los reportesperiódicos que deben rendir las unidades de saludde los diferentes niveles hasta que se consolidaen el nivel central. La centralización en elprocesamiento y análisis de la información esindispensable para definir las políticas nacionalesde salud pero, dada la enorme cantidad de datosque se manejan, la introducción de modificacionestoma mucho tiempo. Cuando se necesita mejorarla salud en aspectos puntuales, en áreasespecíficas y a corto plazo, la adopción de unsistema más sencillo y ágil que recoja sólo lo queel personal local de salud puede analizar y utilizar,permite un mayor dinamismo y una solución máseficiente del problema individual del paciente (74).Esta es la razón por la cual el modelo de sitioscentinela se ha impuesto en enfermedades comomalaria y tuberculosis y por la cual esta estrategia

Cuadro 1. Respuesta de pacientes con leishmaniasiscutánea al tratamiento con antimoniato de meglumina(Glucantime®, Aventis), n=238, Colombia 2005 (68).

n %

Pacientes tratados siguiendo las 163recomendaciones (400 mg/kg)

Curaron 150 92Fallaron 13 8

Pacientes tratados con dosis diaria 40reducida ( : 343,5 mg/kg)


Pacientes tratados con esquema 35acortado : 16, 3 días)


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podría ser útil en áreas de leishmaniasis enColombia.

Propuesta de vigilancia terapéutica mediantela estrategia de sitios centinela

Las intervenciones terapéuticas buscan la curacióndel paciente y las intervenciones epidemiológicasy sanitarias pretenden la eliminación de laenfermedad en una determinada comunidad. Lacombinación de todas las estrategias debería darpor resultado el control o la eliminación del riesgode padecer leishmaniasis. La complejainterrelación de múltiples factores hace que laeliminación de la leishmaniasis sea prácticamenteimposible por lo que el control para reducir laenfermedad es una meta más factible, al menos,en el mediano plazo. En relación con el manejoindividual de los enfermos el objetivo es curarlosmediante la intervención más simple, costo-efectiva y segura.

La sección de terapéutica de las guías oficialesde manejo de la leishmaniasis fija unas pautasque buscan resolver el problema de la mayoríade los enfermos, propósito que logran en buenamedida. El manejo actual de la información y laenorme cantidad de datos sobre distintasenfermedades que se deben enviar periódicamentepara su procesamiento centralizado hacen que losanálisis, los resultados, las conclusiones y lasrecomendaciones se demoren. Fruto de esteproceso son, lógicamente, guías que buscancubrir la mayoría de las situaciones pero que,obviamente, no pueden detenerse en circunstanciasparticulares. Cuando hay variaciones individualesy casos que se salen de las presentacioneshabituales quedan, por supuesto, fuera del alcancede dichas guías. ¿Qué debe, entonces, hacer unmédico y qué puede esperar un paciente ante unasituación no contemplada en las guías?

La creación de una red operativa de vigilancia delos resultados de la terapéutica antileishmaniásicapuede servir para resolver esas situacionespuntuales, para brindar apoyo a médicos ypacientes en forma inmediata ante una situaciónque no da espera, al tiempo que recogeinformación sobre el tratamiento y lascircunstancias que lo rodean, de forma tal que seconvierta en un soporte para el análisis y la toma

de decisiones en el momento de revisar las guíasgenerales de manejo.

La metodología de sitios centinela ha sidoexitosamente empleada en otras enfermedadesinfecciosas como la malaria y la tuberculosis(75,76). Los sitios centinela son localidadesrepresentativas a nivel regional de las distintascondiciones de salud, de los diferentes nivelesde acceso a los servicios de salud, de la diversidadétnico-cultural y de la densidad de la población.Son comunidades en las que se realiza larecolección cíclica de información detallada,confiable y utilizable en la planificación, quecomplementa el sistema rutinario de información(77). No es un área de pruebas sino un lugarcorriente que es fiel reflejo de las comunidadesque representa y del que se obtienen resultadosque pueden ser reproducibles (78) y, sobre todo,aplicables para la resolución de situacionesespecíficas de un paciente o de un grupo pequeñode pacientes. Mientras que sistemas como elSIVIGILA reciben y procesan información pertinen-te para la definición de las políticas generales desalud de aplicación en el ámbito nacional, unared de sitios centinela provee herramientas paradecidir situaciones locales individuales, puntualesy específicas de manera inmediata.

Haciendo uso de los sitios centinela se puedeobtener información que responda a la inquietudexistente entre investigadores, clínicos,administradores y comunidad en relación con losresultados del programa de control deleishmaniasis cutánea en nuestro país,especialmente en lo que hace referencia a lautilidad y seguridad de los medicamentos. Unprograma de esta naturaleza debe resolver lasinquietudes sobre:

• eficacia, tolerancia y seguridad de losmedicamentos;

• efectividad de los servicios de salud en laadministración del programa antileishmaniásico.

• vigencia y aplicabilidad de las recomenda-ciones del nivel central, y

• conocimientos, actitudes y prácticas tanto delusuario como del prescriptor del tratamientoantileishmaniásico.

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Organizar una red de vigilancia centinela tieneefectos prácticos en diversas áreas. Algunos delos más importantes son:

En educación:

• Recolectar, procesar y evaluar informaciónsobre conocimientos, creencias, actitudes yprácticas de la población en relación con laenfermedad, sus medidas de prevención y sumanejo.

• Establecer el grado de conocimiento ypreparación del personal local de saludencargado del manejo de la enfermedad, asícomo su actitud y compromiso.

• Determinar las necesidades reales deinformación de los enfermos, de la comunidad,del personal de salud y de las autoridadeslocales.

• Analizar y ofrecer alternativas de solución alas situaciones específicas locales de unaforma más ágil y puntual.

• Alimentar a los entes de salud de nivelessuperiores con información que les provea deelementos para revisar el programa e introducirajustes que lo hagan más operativo para queresponda a necesidades reales de la población.

• Hacer aportes al conocimiento de laleishmaniasis toda vez que, como en cualquierproceso dinámico, se dan cambios que puedenser detectados más fácil y rápidamente a estenivel. Estas observaciones locales pueden serposteriormente evaluadas por los entessuperiores para determinar su validez e impactoglobal.

En asistencia:

• Unificar criterios clínicos y de laboratorio parael diagnóstico de la enfermedad.

• Fomentar el desarrollo y acceso a técnicas delaboratorio confirmatorias.

• Seguir la prescripción, administración y controlal manejo farmacológico de los pacientes.

• Establecer criterios para seguimiento ydeterminación de curación o falla.

En administración:

• Evaluar los procesos actuales y proponer eimplementar los que sean más eficientes parala atención de los enfermos.

• Racionalizar tiempos y costos.

• Ejercer un mayor control sobre los recursos,especialmente en lo relacionado con exámenesparaclínicos y con el medicamento.

• Constatar la aplicabilidad de las recomenda-ciones actuales para diagnóstico de laboratorio,esquemas supervisados de administración delos antimoniales pentavalentes, tiempo deseguimiento, etc.

En investigación y epidemiología:

• Conocer la frecuencia de presentación deleishmaniasis en los sitios seleccionados.

• Conocer el comportamiento epidemiológico dela leishmaniasis.

• Fomentar el desarrollo de otras investigacionesrelacionadas.

• Aportar información útil para la implementaciónde medidas de control.

• Detectar y comunicar circunstancias que sealejen de la norma.

Perspectivas en el tratamiento

¿Qué piensan los autores que sucederá con laterapia antileishmaniásica en los próximos cincoaños en Colombia?

Antimoniales pentavalentes. La eficacia,actualmente entre 80% y 90% puede disminuirpero sin llegar aún a niveles críticos; habrá unmayor cuidado en su administración y tantomédicos como pacientes estarán más pendientesde los eventuales efectos secundarios lo cual,seguramente, hará que los reportes seincrementen pero que se detecten a tiempo losproblemas y se puedan manejar rápidamente lospotenciales eventos adversos graves. La apariciónen el mercado nacional del estibogluconato desodio original (Pentostam®, GSK), así como devarios genéricos (uno de meglumina deLaboratorios BCN y tres de estibogluconato: GR

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Intercomerce, Lakor Farmacéutica y Albert DavidLtd.) abrirá la oferta, lo que puede contribuir adisminuir costos de tratamiento. Sin embargo, eneste punto habrá que ser especialmentecuidadosos para asegurarse de que existanestudios clínicos locales que demuestren laeficacia de tales productos contra las especiescirculantes en Colombia, así como un perfil deseguridad óptimo. La implementación de la víaendovenosa en aquellos lugares donde sealogísticamente posible, podrá ayudar a disminuirel efecto adverso más frecuente –el dolor local–causante de las pausas y de las interrupcionesprematuras relacionadas con, al menos, el 40%de las fallas terapéuticas.

Pentamidina. Incluida en las guías oficiales comola segunda alternativa pero sin que se dispongade ella en la actualidad. De conseguirse, será unabuena opción para aquellos pacientes que nopuedan recibir antimoniales por contraindicacionesmédicas. También será útil para tratar los casosde fracaso terapéutico. El hecho de que elvolumen total que se inyecta sea entre 10 y 20veces menor y que el tiempo de tratamiento seaun tercio o la mitad que el de los antimonialesson ventajas importantes, máxime cuando superfil de seguridad es comparativamente mejor.

Miltefosina. La alta eficacia demostrada contraL. panamensis, especie identificada en más del80% de los aislamientos locales, hará que estemedicamento se considere de primera línea enColombia, pero es necesario establecer sucomportamiento frente a L. braziliensis, L.guyanensis y L. mexicana. Su administración porvía oral y su excelente perfil de seguridad sonventajas muy importantes; sin embargo, debenextremarse los cuidados para su empleo enmujeres en edad fértil así como para realizar eltratamiento bajo supervisión que garantice laadministración completa para evitar los fracasosterapéuticos y la eventual generación deresistencia.

Anfotericina B. Seguirá siendo una alternativaen casos de leishmaniasis visceral y mucosa queno respondan a los antimoniales. Su costo, lanecesidad de hospitalización y los frecuentes eimportantes efectos secundarios seguirán siendo

limitantes para su empleo. Las formas liposómicasse emplearán poco debido a sus altos costos.

Terapias combinadas. La tendencia es hacia labúsqueda de combinaciones medicamentosas quepotencien sus efectos y disminuyan eventossecundarios y costos, siguiendo la experienciade otras enfermedades como la malaria, la lepray la tuberculosis. El que no presente resistenciacruzada contra antimoniales, anfotericina niparomomicina, hacen de la miltefosina unmedicamento ideal para buscar lascombinaciones.

Otras alternativas. La crioterapia, la termoterapia,las inyecciones intralesionales y los esquemasacortados con antimoniales y otros medicamentosdeben demostrar su real utilidad en estudiosclínicos controlados. La posibilidad de desarrollode lesiones mucosas es una de las principalesrazones para tratar la leishmaniasis cutánea enColombia; por tal motivo, y hasta tanto no existauna forma rápida y confiable de determinar laespecie infectante o la posibilidad de extensiónmucosa, el tratamiento debe hacerse con losmedicamentos, a las dosis y por las víasrecomendadas.

Profilaxis. La posibilidad de una vacuna seguray efectiva contra las diversas especies circulantesen el país está aún muy lejana. Considerando quela búsqueda de una vacuna antileishmaniásicalleva más de cien años, los autores no creen queen el próximo lustro se disponga de ella. Lasmedidas preventivas individuales (ropa protectora,repelentes, etc.) tendrán una utilidad limitadamientras que las colectivas seguirán siendodifíciles de aplicar y poco útiles, por lo que es enel correcto tratamiento de los enfermos en dondese debe concentrar el mayor esfuerzo.

Conclusiones

Los antimoniales pentavalentes han perdidoeficacia antileishmaniásica en otros países comoresultado del empleo de dosis insuficientes, cursosacortados de tratamiento, transmisión antro-ponótica y uso de medicamentos de baja calidad.Errores frecuentes como iniciar con dosis bajas eir aumentando hasta la dosis plena, hacer eltratamiento en ciclos, hacer pausas durante el

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tratamiento o dividir la dosis diaria en dos o tresaplicaciones resultan en niveles sanguíneossubterapéuticos y en una tolerancia de losparásitos al antimonio.

Aunque en Colombia los antimoniales siguensiendo primera elección para el tratamiento de lasleishmaniasis, es reconfortante observar losesfuerzos por encontrar nuevos medicamentos quelos complementen o los remplacen pero esnecesario evaluarlos en nuestra propia situaciónantes de aceptar resultados obtenidos en otraslatitudes y con otras especies. Bajo las actualescircunstancias, los medicamentos paraleishmaniasis deben ser escogidos de acuerdocon la especie circulante en el área de infección.En las regiones en donde hay resistenciacomprobada a SbV, se han considerado diversasposibilidades de esquemas con múltiplesfármacos, vectorización de la droga mediante suinclusión en liposomas y potenciación de larespuesta inmune del paciente, con miras aconseguir la curación del enfermo y a disminuir laposibilidad de generar o transmitir resistencia. EnColombia debemos tener en mente la posibilidadde resistencia a los antimoniales y tomar lasprecauciones necesarias para evitar que elproblema nos desborde.

La supervisión del manejo general, y muy especial-mente, del tratamiento, debe implementarse endistintas áreas del país. Debe hacerse un granesfuerzo en la capacitación y el entrenamientode los profesionales a cargo del cuidado médicode los pacientes como medida para garantizar elmanejo ideal del programa, mejorar lascapacidades diagnósticas clínicas y paraclínicas,racionalizar tiempos y costos y ofrecer al pacienteel mejor cuidado posible.

Aprovechando la experiencia con actividadessimilares en malaria es necesario tomar medidaspara evitar que la avalancha de informaciónrecolectada localmente sature el programa eimpida su análisis y empleo para generar cambiose introducir los ajustes necesarios en forma rápida.De igual manera, hay que desarrollar unaestrategia que elimine las incompatibilidades conescalones superiores, para evitar que se manejencifras retrasadas que subestimen o sobreestimen

ciertas realidades que pueden no ser el reflejo delmomento actual para esa zona específica.

Por último, es indispensable que la informaciónhaga su ciclo completo y regrese a la comunidad.De esta manera se puede hacer un manejo másracional de la enfermedad y se pueden protegerlos medicamentos para prolongarles su vida útil.


Jaime Soto ha obtenido fondos para adelantarestudios clínicos con medicamentos antileish-maniásicos de las siguientes entidades: AlbertDavid Ltd, Asta Médica, Aventis, BCN Medical,Carlos Erba, Teva, WRAIR y Zentaris.

Financiación

Este trabajo fue parcialmente financiado por laAB Foundation for Medical Research de NorthBethesda, MD, USA y por la Fundación FADER,Bogotá, Colombia.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):207-17 MILTEFOSINA ORAL PARA LA LEISHMANIASIS

REVISIÓN DE TEMA

Miltefosina oral para el tratamiento de la leishmaniasisJaime Soto, Paula Soto

CIBIC, Centro de Investigaciones Bioclínicas de la Fundación FADER, Bogotá, Colombia.

La pérdida de la eficacia, las dificultades para su administración y el incremento en la frecuenciay la severidad de los efectos secundarios de las sales de antimonio pentavalente han forzadola búsqueda de un medicamento que pueda remplazarlas en el tratamiento de la leishmaniasis.Los estudios adelantados con medicamentos inyectables, orales y tópicos han arrojadoresultados inconsistentes y de poca util idad en el Nuevo Mundo. Desde 1998 lahexadecilfosfocolina (miltefosina) viene siendo utilizada con éxito en India en enfermos conleishmaniasis visceral y en 1999 se iniciaron los estudios clínicos en Colombia en pacientescon leishmaniasis cutánea. A la fecha se han tratado mas de 2.500 pacientes en India(leishmaniasis visceral por L. donovani ) y Colombia (leishmaniasis cutánea por L. panamensis)y se han logrado tasas de curación superiores a 91% a la dosis recomendada de 2,5 mg / kgpeso / día durante 28 días continuos, sin que haya diferencia en la respuesta entre pacientesnuevos y los que presentan fallas o recaídas después de recibir antimoniales. En Guatemalala respuesta fue de 53% ( 33% para L. braziliensis, 60% para L. mexicana) mientras que la deL. tropica en Afganistán fue de 63%. Pacientes con leishmaniasis cutánea difusa, leishmaniasismucosa y con co-infección por HIV+, han tenido una buena respuesta inicial pero deberecordarse la tendencia a recaer que tienen estos pacientes. Entre el 35% al 60% de lospacientes presentan reacciones adversas gastrointestinales leves y 10% al 20% hacenelevación leve de transaminasas y creatinina. Miltefosina, medicamento originalmenteantineoplásico que posee una potente actividad leishmanicida al interferir con vías metabólicase inducir apoptosis, ha demostrado su eficacia en casos de leishmaniasis cutánea por L.panamensis y de leishmaniasis visceral por L. donovani; miltefosina debe ahora demostrar sueficacia contra otras especies asociadas con las diversas formas clínicas de leishmaniasis.

Palabras clave: Leishmania, leishmaniasis, leishmaniasis cutánea, leishmaniasis visceral,terapia.

Oral miltefosine to treat leishmaniasis

Reduced efficacy, difficulties of administration and increasing frequency and severity of adverseevents of pentavalent antimony have stimulated the quest for new anti-leishmanial drugs.Several clinical studies in Latin America testing injectable, oral and topical anti-leishmanialdrugs have yielded inconsistent results. Since 1998 Indian researchers have conducted clinicaltrials evaluating hexadecylphosphocoline (miltefosine) in patients with visceral leishmaniasisand in 1999 clinical studies were initiated in Colombia in patients with cutaneous leishmaniasis.Up to date, more than 2.500 patients have been treated with miltefosine in India (visceral by L.donovani) and Colombia (cutaneous caused by L. panamensis) obtaining cure rates over 91%when a dose of 2.5 mg / kg / day during 28 days was used, with no difference between naïveand relapsing patients. In Guatemala the overall cure rate for patients with cutaneousleishmaniasis was 53% (33% for L. braziliensis; 60% for L. mexicana) while in Afghanistan thecure rate of patients with L. tropica was 63%. Patients with diffuse cutaneous leishmaniasis,mucosal disease and co-infected with HIV have been treated with initial success; howeverthese diseases have frequent relapses. Mild gastrointestinal events (i.e. nausea, vomiting anddiarrhoea) were present in 35 to 60% of patients included in clinical trials and 10 to 20% had amild increase in transaminases and creatinine levels. Miltefosine, originally an antineoplasticdrug, has a potent leishmanicidal activity as consequence of its interference in parasite metabolicpathways and the induction of apoptosis, has demonstrated efficacy against L. donovani visceral

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disease and L. panamensis cutaneous disease. Now, miltefosine must demonstrate its efficacyagainst other species associated with diverse clinical presentations.

Keywords: Leishmania, leishmaniasis, leishmaniasis cutaneous, leishmaniasis visceral, terapy.

En la década de 1940 se inició el empleo de losantimoniales pentavalentes para el tratamiento delas diversas formas clínicas de leishmaniasis.Desde hace quince años se vienen reportandofallas terapéuticas en algunas regiones de India,Sudán y Etiopía (1,2), razón por la cual se hanhecho ajustes en las dosis diarias y en el tiempode administración con lo que se ha logradomantener su eficacia pero con el inconvenientedel incremento en la frecuencia y seriedad de losefectos secundarios (3,4). En Colombia se reportórecientemente (5) que los antimonialespentavalentes continúan siendo efectivos en másdel 90% de los casos cuando se emplean en ladosis y por el tiempo recomendado pero que suactividad declina hasta 50% cuando se hacenpausas, se acorta el tiempo de administración ose emplean dosis menores, circunstancias éstasfrecuentemente secundarias a la presencia deeventos adversos.

Se han publicado numerosos reportes buscandoalternativas a los antimoniales pentavalentes tantoinyectables (6-9), como orales (10-14) y tópicas(15-17). De ellos, sólo la pentamidina ha resultadoeficaz y segura para recomendarla comomedicamento de segunda línea (18), útil enpacientes que por alguna circunstancia médicano puedan recibir antimoniales pentavalentes oque no se hayan curado con ellos.

Croft (19) encontró a principios de los 80 que lamiltefosina (hexadecilfosfocolina), un análogo dela fosfatidil-colina que fue originalmentedesarrollada como un agente antineoplásico,eliminaba rápida y eficazmente de los cultivos alos promastigotes de leishmania. Su eficacia enratas (20) así como un perfil de seguridad muybien conocido por su empleo previo en pacientes

Correspondencia:Jaime Soto, CIBIC, Centro de Investigaciones Bioclínicas dela Fundación FADER, Calle 60 A No. 5-54, oficina 201, BogotáTeléfono: 348 2171; fax: 347 [email protected]


con cáncer (21,22) llevaron al rápido desarrollode un programa de investigación clínica que hoyincluye más de 2.500 pacientes con leishmania-sis visceral y más de 500 con las formastegumentarias. Con esta revisión queremos ofrecerun panorama actualizado sobre este medicamentocon énfasis en su empleo en la forma cutánea,toda vez que existen publicaciones recientes,extensas y bien documentadas sobre su uso enleishmaniasis visceral (8, 23-26).

La enfermedad y su tratamiento actual

Cada año se reportan más de 1,2 millones decasos nuevos (27) en el mundo, de los cualesmás de la mitad son de leishmaniasis visceral enIndia. En América Latina, la leishmaniasis vis-ceral está restringida a ciertas áreas y Brasilaporta más del 80% de los casos nuevos cadaaño. La forma cutánea está distribuida másampliamente y en algunas regiones en donde lainfección por especies del subgénero Viannia espredominante, la posibilidad de invasión a mucosaoro-nasal está presente (28). En Colombia sereportaron para el 2004 cerca de 13.000 casosnuevos (99% de ellos cutáneos) (29) lo querepresenta un incremento de más del 30% enrelación con el año anterior y que mantiene latendencia incremental que se ha visto en la últimadécada.

El tratamiento vigente para todas las formas deleishmaniasis son los antimoniales pentavalentesen forma de antimoniato de meglumina(Glucantime®, Laboratorios Aventis) o estiboglu-conato sódico (Pentostam®, Laboratorios GSK)que deben ser administrados parenteralmente,tanto intravenosos como intramusculares paraposibilitar su absorción. La dosis estándar es de20 mg/kg por día, sin dosis tope, en una únicadosis diaria; para la enfermedad cutánea se usapor 20 días continuos mientras que para laextensión mucosa y para la enfermedad visceralpor 28 a 40 días (30). Otros agentes son elisotianato de pentamidina (Pentacarinat®,Laboratorios Aventis) (6,7,31) y la anfotericina B(Fungizone®, Laboratorios Squibb) (24), el primero

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como alternativa en casos de enfermedad cutáneaque no respondieron a los antimonialespentavalentes o en los que, por alguna razónmédica, no se pueden emplear éstos y la segundapara el manejo de la forma visceral y comoalternativa en pacientes con compromiso mucoso.Las guías oficiales de manejo en paíseslatinoamericanos (32-35) difieren en cuanto a dosisdiaria de antimonio, dosis máxima que se debeaplicar y vía de administración, añadiendofactores de confusión a un ya de por sí complejopanorama, resultado de las diferencias en larespuesta terapéutica entre especies y a factoreslocales e individuales.

Desarrollo de la miltefosina comoantileishmaniásico

La identificación del potencial antileishmaniásicode la miltefosina y otros derivados de fosfolípidoscomenzó a finales de los 80 como resultado detres líneas independientes de investigación. Laprimera buscaba demostrar la actividad antitumoralde la edelfosina; la segunda se orientó hacia elefecto de estas sustancias sobre el metabolismode los fosfolípidos en los promastigotes de Leish-mania y la última en la que se identificó a lamiltefosina como agente antileishmaniásico (19).A la miltefosina se llegó luego de cambiar la parteprincipal de la cadena glicerol de la edelfosina yla ilmofosina por un grupo alquil, de manera quese reforzara la actividad débil de las dos primeras.

En 1984 se encontró que los ésteres de liso-fosfolípidos tales como 1-O-alquilglicero-fosfocolina, 1-O-alquilglicerofosfoetanolamina y 1-O-hexadecil-sn-glicerol eran más activos yeliminaban la totalidad de los promastigotes deLeishmania donovani en menos de cinco horasde exposición con una dosis de 25 µM (36).Posteriormente, se empleó la miltefosina por víaoral en ratones BALBc infectados con L. donovanio con Leishmania infantum y se logró laeliminación de más del 95% de los parásitos conuna dosis de 20 mg/kg (37). Estos resultadosestimularon la creación de un programa clínicopara leishmaniasis visceral en India que terminócon el primer estudio fase II en 1997 (38). En 2000y 2001 (39) se demostró que la miltefosina eraefectiva en animales inmunodeficientes encontraste con la ausencia de actividad del

estibogluconato sódico en los mismos animales.Además, se probó la miltefosina tópica al 6% enratones infectados con Leishmania mexicana yLeishmania major y se consiguió la curación enun lapso de 2 a 5 semanas (40). Sin embargo, esde anotar que un estudio clínico para probarmiltefosina tópica contra leishmaniasis por Leish-mania panamensis se suspendió prematuramenteen razón a los pobres resultados y a la presenciade irritación (Soto J, datos en archivo).

Existen diferencias en la respuesta a miltefosinaentre promastigotes y amastigotes de la mismaespecie, cuando se comparan L.donovani, L.major, L. tropica, L. aethiopica, L. mexicana y L.panamensis in vitro. En todos los ensayos, L.donovani fue la especie más sensible con ED50de 0,12 a 1,32 µM contra promastigotes y de 1,2a 4,6 µM contra amastigotes, mientras que L.major fue la especie menos sensible con un rangode 4,8 a 13,1 µM contra promastigotes y 7,5 a37,1 µM contra amastigotes. Recientemente (41),se demostró in vitro una diferencia en lasensibilidad a miltefosina entre amastigotes deL. donovani y L. braziliensis del orden de 3 a 20veces, lo que evidencia una notable diferencia enla sensibilidad intrínseca de las especies deLeishmania y podría tener importantesrepercusiones en su uso clínico.

Farmacocinética

La farmacocinética es independiente del sexo enratas y perros. Después de su administración oral,la absorción fue lenta pero completa en el tractogastrointestinal, con una biodisponibilidad absolutaentre 82% y 94% en ratas y perros, respectiva-mente, y con una concentración máxima entre 4y 48 horas después de su aplicación. Ladepuración plasmática del compuesto fue muybaja y su eliminación media tomó 84 y 159 horasen ratas y perros, respectivamente (42).

Distribución. Se alcanzan altas concentracionesde miltefosina en riñón, mucosa intestinal, hígadoy bazo. No se han realizado estudios relacionadoscon la transferencia placentaria, pero segúnresultados de estudios de reprotoxicidad, se puedeasumir que esta transferencia está presente (21).

Metabolismo y excreción. La fosfocolina Dmetaboliza la miltefosina y libera colina que es

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luego empleada para la biosíntesis de acetilcolinao lecitina. El hexadecanol, la cadena más largade grasas que surge del desdoblamiento de lamiltefosina, puede oxidarse a ácido palmítico yentrar a la biosíntesis de lípidos o a la beta-oxidación. No hay relación de la miltefosina conlos sistemas enzimáticos CYP y CYP3A, por loque no se espera que haya competenciametabólica o inducción del metabolismo de otrasdrogas que sean metabolizadas por estossistemas (43).

Seguridad farmacológica

Seguridad farmacológica general. Tanto enpacientes con cáncer, críticamente enfermos,como en pacientes con leishmaniasis visceral ycutánea, el tracto gastrointestinal es el principalórgano blanco para eventos adversos; sonfrecuentes pero leves las náuseas, el vómito y ladiarrea. No se mencionan efectos nocivos en riñón,sistema nervioso, aparato respiratorio o sistemahematológico (42).

Hallazgos toxicológicos preclínicos y surelevancia en la clínica

Hígado. No hay evidencia de hepatotoxicidad enratas y perros. En los pacientes con cáncer hayuna discreta elevación de las transaminsas quevuelven a valores normales con la reducción dela dosis. En los pacientes con leishmaniasis vis-ceral hay un aumento de las transaminasas luegode la primera semana de tratamiento, lo quesugiere la necrosis de las células gravementedañadas, que vuelven a valores normales auncuando se continúe el tratamiento. Estos datosindican que el hígado no es un órgano blanco parala toxicidad de la miltefosina (44).

Riñón. Los estudios de toxicidad subaguda ocrónica en ratas mostraron cambios en losparámetros bioquímicos y morfológicos pero condosis superiores a las recomendadas en humanos.Usando las mismas dosis, los perros no tuvieronesos cambios. En 30% de los pacientes concáncer se eleva la creatinina, elevación quedisminuye al reducir la dosis diaria. Aparte de losefectos directos de la miltefosina en la funciónrenal, el desequilibrio de líquidos relacionado conlos efectos gastrointestinales adversos puedecontribuir al aumento de los niveles de creatinina.

En el estudio piloto en pacientes con leishmania-sis visceral, un paciente que recibió una dosis de250 mg por día desarrolló falla renal irreversible(38). Con la dosis terapéutica recomendada, elriesgo de desarrollar nefrotoxicidad es limitado,particularmente si se tiene buen cuidado en larehidratación en los casos de reaccionesgastrointestinales muy intensas (23).

Sangre y médula ósea. Una dosis de 10 mg/kgde miltefosina puede aumentar los neutrófilos enratas y perros. No se encontraron cambiostoxicológicos en la médula ósea ni en las líneascelulares a dosis máximas.

Los pacientes con cáncer mostraron un aumentonotable del recuento de leucocitos y plaquetasdurante el tratamiento con miltefosina. Esto esuna posible ventaja para los pacientes con leish-maniasis visceral que cursan con pancitopenia.Los estudios clínicos en pacientes con leishma-niasis visceral muestran un ligero y rápido efectoen el recuento de células blancas y plaquetas alfinalizar el tratamiento (22).

Ojo. En ratas se observa degeneración retinianareversible luego de un año continuo de uso demiltefosina, lo que no se observó en perros. Enpacientes con cáncer se encontraron levesalteraciones reversibles en el electrooculogramasin repercusiones clínicas (45). En pacientes conleishmaniasis cutánea no se encontraronalteraciones en el examen oftalmológico (46), esdecir que a las dosis recomendadas no sepresentan en seres humanos las alteracionesobservadas en las ratas.

Toxicidad sobre el aparato reproductor. Lamiltefosina induce cambios en las células deSertolli de ratas. En ratas, la atrofia testicular yel deterioro de la fertilidad causados pormiltefosina a dosis de 8,25 mg/kg fueroncompletamente reversibles. Aunque la dosisterapéutica en humanos, 2,5 mg/kg, es más bajaque la utilizada en las ratas, no se puede excluirel riesgo de los que los hombres sufran undeterioro transitorio de la fertilidad, que debe serreversible una vez terminado el tratamiento. Paradilucidar este aspecto se realizó un estudiocontrolado con placebo (46), en 15 varonescolombianos con leishmaniasis cutánea a quienes

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se les realizó un espermograma antes y despuésdel tratamiento con miltefosina; ningún pacientepresentó diferencias clínicas relevantes oanormalidades en el conteo de espermatozoideso en su función que indicaran un evento adversode la miltefosina en la viabilidad del esperma o enla espermatogenesis. Además, a 341 hombresadultos indios se les evaluó su funciónreproductiva en el periodo postratamiento. 220participantes fueron identificados como “poblaciónrelevante” debido a que tenían compañera sexualy, por lo menos, algunas veces no utilizaronmedidas anticonceptivas. El seguimiento fue de11 a 57 meses después de iniciado el tratamientocon miltefosina (media de 34 meses) y se encontróque el 69% había tenido un hijo o su compañeraestaba embarazada. No hubo diferencia entreestos pacientes y los que recibieron tratamientocon anfotericina B ni hubo reportes de defectoscongénitos (Sindermann H, Engel J. Developmentof Miltefosine as an oral treatment forleishmaniasis, manuscrito en preparación). Enresumen, no hay evidencia de que las dosisterapéuticas tengan efectos nocivos sobre lafertilidad de los pacientes hombres.

Teratogenicidad. La miltefosina a dosis de 1-2mg/kg en ratas durante el desarrollo embriológicotemprano y durante la fase de organogénesis tieneriesgo de embriotoxicidad, fetotoxicidad yteratogenicidad. Aunque no hay estudioscontrolados con miltefosina en mujeresembarazadas, su uso durante el embarazo estáestrictamente contraindicado (23). Como la vidamedia en humanos de la miltefosina es de unasemana, se recomienda que el uso de una medidacontraceptiva efectiva debe mantenerse durante 2a 3 meses después del periodo de tratamiento (47).

Mecanismo de acción

Los análogos de los lisofosfolípidos (LPA) tienenuna potente y selectiva actividad antiparasitaria,particularmente contra tripanosomatídeos, tantoin vitro como in vivo (48). Su actividad clínicaresulta de los efectos directos en sus célulasblanco y no es dependiente de la función delsistema inmune del hospedero (49).

Inhibición del metabolismo de la membranalipídica. Existe una relación causal entre el

bloqueo por parte de los LPA de la biosíntesis defosfatidilcolina (PC) y su acción anti-proliferativa.Adicionalmente, los altos niveles intracelulares deácido fosfatídico, resultante de la hidrólisis defosfatidilcolina por la fosfolipasa D, frenan elcrecimiento celular (50). En L. mexicana los LPAinhiben la acyl-CoA-acyltransferasa-alquilespecífica, enzima clave en la remodelación eter-lipídica, lo que podría ejercer un efecto sobre elcrecimiento celular de los parásitos (51). Los LPAtambién inducen la modificación del esterol librede los epimastigotes de Trypanosoma cruzi através de la inhibición de la esterol desaturasa;este hallazgo plantea la posibilidad del sinergismoantiproliferativo de los LPA y de los inhibidoresespecíficos de la biosíntesis de ergosterol comoel ketoconazol (52).

Apoptosis. En las células de los mamíferos, losLPA aumentan el nivel de ceramidas secundarioa la depresión de la síntesis de esfingomielina,con lo que se inhibe el crecimiento y se induce laapoptosis (muerte celular programada) (53). Lamiltefosina induce apoptosis por aumento de losniveles intracelulares de ceramida como resultadode la reducción de la biosíntesis de la esfingo-mielina relacionado con los bajos niveles defosafatidilcolina (54). En los tripanosomatídeos lainhibición de la biosíntesis de fosfatidilcolina porlos LPA se hace a nivel de la fosfotidil-etanolaminaN-metil-transferasa, lo que lleva a apoptosis deuna manera eficiente y selectiva (55).

Miltefosina en leishmaniasis visceral

En India ocurren más de 200.000 casos nuevosde leishmaniasis visceral cada año y en variasregiones la resistencia a los antimonialespentavalentes supera el 40%; los antimonialesgenéricos tienen menor costo pero comparten losproblemas de resistencia y efectos adversos conlos productos de marca; la anfotericina B escostosa, tóxica y requiere de hospitalizacionesprolongadas. Su forma liposomal es muy efectivapero el alto costo impide su uso generalizado (44).Tras varios intentos infructuosos por encontrarmedicamentos parenterales u orales eficaces, en1998 se inició el primer estudio con miltefosina(38) que usó dosis entre 50 y 250 mg diariosdurante 28 días, logrando desaparición de los

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parásitos en todos los pacientes pero con recaídaen 7 de 10 pacientes que recibieron las dosis bajasen comparación con 1 de 15 de los que recibieron150 o más mg al día. Los efectos colateralesfueron gastrointestinales y hubo una correlacióncon la dosis diaria recibida.

Un estudio posterior confirmó la pobre toleranciaa dosis superiores a 200 mg (26); en el mismo sedemostró que la miltefosina era igualmente útilen pacientes nuevos que en pacientes conrecaídas luego del tratamiento con antimoniales.En quienes recibieron 200 o más mg/día huboelevación de creatinina e, incluso un pacientedesarrolló falla renal irreversible. La normalizaciónde la temperatura se logró en una semana, ladesaparición de los parásitos en dos semanas enpromedio y la curación alcanzada se mantuvo entodos los pacientes durante los seis meses deseguimiento, demostrando que miltefosina era unprometedor prospecto para el tratamiento de laleishmaniasis visceral. En 2000 Sundar (56)encontró que cursos de 2 o 3 semanas tambiénpermitían alcanzar la curación de los pacientes;sin embargo fueron pocos pacientes y es necesariocorroborar estos hallazgos. Un estudio multi-céntrico (57) incluyó varios grupos de pacientescon el propósito de encontrar la dosis con mejoresresultados de eficacia y seguridad. Sus resultadospermitieron establecer que la dosis óptima es de2,5 mg/kg de peso/ día durante 28 días. Dosissuperiores a 4 mg/kg peso/día no son toleradas ydeben evitarse pues los síntomas gastro-intestinales y el compromiso renal pueden serseveros.

En 2002 (58) se publicaron los resultados de lacomparación de miltefosina (299 pacientes) yanfotericina B (99 pacientes); la eficacia fue similaren los dos grupos (94 y 97% respectivamente).Hubo vómito en 38% y diarrea en 20% de quienesrecibieron miltefosina; sólo un paciente tuvo diarreagrado 4 de acuerdo con la escala CTC (CommonToxicity Criteria) (59). Se encontraron aumentosocasionales de transaminasas, creatinina ybilirrubina, leves a moderados, los cualesretornaron a sus valores normales aún cuando secontinuó el tratamiento. Un estudio de fase IV enIndia con 1.167 pacientes mostró una tasa decuración a seis meses de 94% además de que

comprobó la buena tolerancia (Battacharya S,Sinha P, Sundar S, Jha T, Takur C, Pandey K, etal. Phase IV studies of Miltefosine in Bihar, India.Third World Congress on Leishmaniasis, 2005.Book of Abstracts, page 342).

Miltefosina en leishmaniasis cutáneadel Nuevo Mundo

La respuesta de las distintas especies deLeishmania existentes en Latinoamérica a losantimoniales pentavalentes es variable, con rangode 94 a 25% (5, 6, 12, 28, 60-62). En los últimos30 años las dosis se han incrementado en masdel 600% (5) para tratar de mantener sus nivelesde eficacia pero esto ha llevado a un aumento enla frecuencia y severidad de los efectossecundarios. Se han adelantado múltiplesensayos clínicos con otros medicamentos perolos resultados no han sido consistentes salvo conla pentamidina inyectable que, lamentablemente,no se encuentra disponible en la actualidad. En1999 se iniciaron los estudios clínicos conmiltefosina en Colombia. El primero (63) fueconducido para buscar la dosis ideal e incluyó 72pacientes en cuatro grupos; el resultado final fueque 2,5 mg/kg de peso/día por 28 días era la másapropiada, tal y como sucedió en India. Con estadosis se alcanzó una tasa de curación de 91% aseis meses. Adicionalmente a los efectossecundarios reportados por los pacientes indios,en los colombianos hubo mareo de movimientoleve en 60%.

Los resultados de un estudio binacional, dobleciego, aleatorizado, comparativo con placebo sepublicaron en 2004 (46). Se incluyeron 133pacientes (89 con miltefosina y 44 con placebo).Los pacientes colombianos procedían de áreasendémicas de L. panamensis; 40 de 44 (91%) delgrupo con miltefosina curaron en comparación con9 de 24 (37%) del grupo placebo. En Guatemalase incluyeron pacientes infectados con L.braziliensis y L.mexicana y la tasa de curaciónfue de 33 y 60% respectivamente en comparacióncon 21% en el grupo placebo. Esta eficacia tandistinta puede ser atribuible a factores intrínsecosde especie (42) pero necesita exploracionesadicionales, especialmente ahora que los reportespreliminares de un estudio en 100 pacientesbolivianos con leishmaniasis mucosa por L.

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braziliensis muestran tasas de curación ó mejoríasuperiores al 80%, con seguimientos entre 9 y 12meses (Soto J, Toledo J, Parra R, Balderrama M,Rea J, Gómez A, et al. Efficacy of Miltefosine(Impavido®) for mucocutaneous leishmaniasis inBolivia. Third World Congress on Leishmaniasis,2005. Book of Abstracts, page 343).

172 pacientes han sido tratados en Colombia conla dosis de 2,5 mg/ kg de peso/día durante 28días; 47 (27%) de ellos presentaban recaídas luegode tratamiento con AP. La tasa de curación enpacientes nuevos fue de 97% en comparación con93% de los ya tratados. Al término del tratamiento65% de las lesiones estaban cicatrizadas. Alcontrol dos semanas post tratamiento 89%estaban cicatrizadas y 11% tenía aún algunaactividad; a los dos meses post tratamiento dospacientes fueron declarados fallas terapéuticas,mientras que otros dos pacientes que habíanmejorado inicialmente recayeron, uno al día 55 yotro al día 84. Tres de estos pacientes teníanlesiones en el pabellón auricular y dos habíanfallado ya a los AP.

De los pacientes colombianos sólo dos han debidointerrumpir el tratamiento por efectos secundarios(vómito CTC 3); elevación de transaminasas y decreatinina (CTC 1) se ha presentado en 25% y17% respectivamente, mientras que dos pacienteshan hecho erupciones cutáneas transitorias leves.La buena tolerancia hace innecesaria la prácticarutinaria de exámenes paraclínicos y su solicituddependerá de los hallazgos clínicos en loscontroles periódicos.

Miltefosina en leishmaniasis cutánea difusa

Esta enfermedad se caracteriza por su cursocrónico, la pobre respuesta a los medicamentosy las frecuentes reactivaciones. Doce pacientescon 2 a 30 años de evolución y múltiplestratamientos previos recibieron 2,5 mg/kg de peso/día de miltefosina. A los 30 días de tratamientotodos los 12 pacientes mostraban mejoría clínicade al menos el 65% y al día 75 siete pacienteshabían mejorado un 100% y los otros cinco entre90 y 95%. Diez de los 12 pacientes eranparasitológicamente negativos a los dos mesesde tratamiento. Si bien estos resultados son muysatisfactorios, los pacientes deben seguir en

control permanente por la posibilidad de recaídas.(Zerpa O, Blanco B, Diaz N, Tapia F, Convit J.Miltefosine in the treatment of diffuse cutaneousleishmaniasis. Thrird World Congress onLeishmaniasis, 2005. Book of Abstracts, page344).

Miltefosina en leishmaniasis cutáneadel Viejo Mundo

Se usó miltefosina contra L. tropica en Afganistány se compararon sus resultados contra lainyección intralesional y la inyección IM deestibogluconato de sodio. 35 pacientes recibieron2,5 mg/kg de peso/día por 28 días y de ellos el63% se curó, resultado similar al obtenido conlas infiltraciones intralesionales. La tolerancia ala inyección IM de estibogluconato fue pobre ydebió ser suspendida prematuramente. (ReithingerR, Leslie T, Mohsen M, Bismullah M. Wahid R,Quinnell R, et al. A randomized controlled trial totest the efficacy of miltefosine against Leishmaniatropica in Kabul, Afghanistan. Third WorldCongress on Leishmaniasis, 2005. Book ofAbstracts, page 49).

Miltefosina en co-infección con VIH

Bajo condiciones de uso compasivo, la miltefosinase ha empleado para el tratamiento de pacienteseuropeos VIH positivos con leishmaniasis (64).Los 39 pacientes pesaban en promedio 60 kg yrecibieron inicialmente 100 mg/día durante 55días; de los 25 que mejoraron inicialmente 22recibieron un segundo curso por 48 días; de losquince que respondieron, todos recibieron un tercercurso y 4 hasta un cuarto curso. Como con losdemás medicamentos, la recaída es unaconstante en estos pacientes, aún recibiendomiltefosina. La dosis administrada fue baja(promedio de 1,6 mg/kg de peso/día) por lo quelas autoridades alemanas han autorizado la dosisde 150 mg para pacientes de 67 o más kg.

Miltefosina en niños

Hay experiencia con miltefosina en niños puestoque la leishmaniasis visceral es frecuente enmenores de edad y en los estudios iniciales deIndia se incluyeron pacientes de 12 años enadelante. En 2003 (65) se publicó un estudioincluyendo 39 niños de 2 a 11 años quienes

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recibieron 1,5 a 2,5 mg/kg de peso/día por 28 díasy, esencialmente, mostraron los mismosresultados que los adultos. Un nuevo estudio (66)multicéntrico con 80 niños confirmó que elcomportamiento de la miltefosina es similar queen los adultos tanto en eficacia como enseguridad.

Miltefosina en mujeres

Debido a su potencial teratogénico, la miltefosinadebe ser administrado en mujeres en edad fértilsólo si se emplea un método anticonceptivo dereconocida eficacia. Aunque no hay estudioscontrolados con miltefosina en mujeres emba-razadas, su uso durante el embarazo estaestrictamente contraindicado. Como la vida mediaen humanos de la miltefosina es de una semana,se recomienda que el uso de una medida contra-ceptiva efectiva debe mantenerse durante 2 a 3meses después del periodo de tratamiento (42).

Conclusiones

Las similitudes en el metabolismo eter-fosfolípidode las leishmanias con las células cancerosashizo que se iniciaran los estudios in vitro e in vivopara demostrar la actividad de miltefosina contraestos parásitos. Puesto que en los 80 se habíanadelantado los estudios de toxicología animal yla fase I clínica para soportar la indicación comoanti-neoplásico, el programa clínico de miltefosinapara leishmaniasis avanzó muy rápidamente.Luego de más de 2.500 pacientes con leish-maniasis visceral o cutánea tratados en seis añosse sabe que la dosis ideal es 2,5 mg/kg de peso/día durante 28 días. Hoy miltefosina está aprobadaen India para el tratamiento de leishmaniasisvisceral en pacientes inmunocompetentes de dosaños de edad en adelante, en Alemania parapacientes inmunocomprometidos afectados porleishmaniasis visceral y en Colombia para leish-maniasis cutánea y visceral.

La administración oral de la miltefosina obvia lanecesidad de hospitalización en casos deleishmaniasis visceral, reduce las incomodidadesde las inyecciones lo que puede mejorar laadherencia de los pacientes al tratamiento,disminuye costos así como la demanda deservicios en las instalaciones sanitarias de por sísobrecargadas de trabajo. Adicionalmente

favorece al paciente al no tener que interrumpirsus actividades laborales para asistir diariamentea la aplicación del producto inyectable y aleliminarse uno de los efectos secundarios másfrecuentes e incapacitantes: el dolor y lainflamación en el sitio de la inyección cuando seadministra por vía IM.

Sin embargo, hay algunas circunstancias quedeben considerarse:

A. miltefosina es teratogénica e induce abortosen animales;

B. por lo anterior, debe manejarse de una maneracontrolada asegurando que las mujeres que lareciben acepten y sigan las medidasapropiadas necesarias para evitar el embarazodurante el tratamiento y hasta 2 a 3 mesesdespués de recibir la última cápsula;

C. miltefosina tiene una vida media larga, deaproximadamente siete días, lo que lapredispone al desarrollo de resistencia por partedel parásito;

D. para evitar abusos y tratamientos incompletosdebe administrarse bajo supervisión directa delpersonal de salud especialmente en nuestrospaíses, en donde los pacientes apenas sientenmejoría suspenden el tratamiento o compartenel tratamiento con familiares o conocidos osimplemente venden parte del medicamentoentregado;

E. la variabilidad de respuesta de las distintasespecies de Leishmania a los antimoniales ylas distintas sensibilidades a miltefosinaencontradas en el laboratorio entre diversasespecies de Leishmania, obligan a adelantarestudios adicionales con otras especies paraconfirmar la eficacia hasta ahora demostradapor la miltefosina.

Se han propuesto tratamientos combinados condos o más medicamentos (67, 68), al estilo delos manejos para malaria, tuberculosis o lepra,con el propósito de potenciar sus efectos, reducirla dosis de los medicamentos más tóxicos, limitarla posibilidad de generación de resistencia y,probablemente, disminuir costos. Se ha demostradoin vitro e in vivo que la miltefosina no seantagoniza y, por el contrario, incrementa la

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actividad de anfotericina B, paromomicina yestibogluconato de sodio (69) así como la deantimoniato de meglumina (Sampaio R, Lucas I,Takami H. Use of oral miltefosine associated withmeglumine antimoniate in the treatment ofexperimental cutaneous leishmaniasis caused byL amazonensis. Third World Congress onLeishmaniasis, 2005. Book of Abstracts, page 54),lo que podría ser una estrategia útil en el caso delos pacientes resistentes, aunque el real significadoclínico de estos hallazgos está aún por dilucidarse.


Jaime Soto ha recibido financiación para adelantarestudios clínicos con miltefosina de parte deLaboratorios Zentaris de Alemania.

Financiación

Este trabajo fue parcialmente financiado por laAB Foundation for Medical Research de NorthBethesda, MD, USA y por la Fundación FADER,Bogotá, Colombia.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):218-27SANDOVAL C.M., GUTIÉRREZ R., CÁRDENAS R., FERRO C.

COMUNICACIÓN BREVE

Especies de género Lutzomyia (Psychodidae, Phlebotominae)en áreas de transmisión de leishmaniasis tegumentaria yvisceral en el departamento de Santander, en la cordillera

oriental de los Andes colombianosClaudia Magaly Sandoval 1, Reinaldo Gutiérrez 2, Rocío Cárdenas 3, Cristina Ferro 3

1 Laboratorio de Entomología, Secretaría de Salud de Santander, Bucaramanga, Colombia.2 Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales, CINTROP, Universidad Industrial de Santander,

Colombia.3 Laboratorio de Entomología, Subdirección de Investigación, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C.,

Colombia.

Introducción. Los flebótomos desde el punto de vista de salud pública son especialmenteconocidos como los únicos insectos vectores de las leishmaniasis y demuestran una interesantebiodiversidad en algunas zonas como la cordillera de los Andes en Suramérica. Este estudiopresenta las especies de flebótomos organizadas por municipios y zonas endémicas quepueden encontrarse en el departamento de Santander, ubicado sobre la cordillera orientalandina en Colombia.Objetivo. Presentar una actualización del inventario de las especies del género Lutzomyia enel departamento de Santander, señalar la distribución y discutir algunos aspectos de la ecologíade las especies de mayor importancia en salud pública.Materiales y métodos. Durante 1998 a 2001 en 12 municipios se realizaron capturas deflebótomos utilizando trampas de luz tipo CDC miniatura, entre las 19:00-6:00 horas, tambiéncapturas con cebo humano protegido utilizando aspiradores manuales entre las 18:00-20:00horas, ocasionalmente aspiración directa sobre troncos de árboles entre las 8:00-11:00 horasy capturas de flebótomos en reposo sobre las paredes en horario diurno.Resultados. Se capturaron un total de 3.972 flebótomos distribuidos en 41 especies; de éstas,16 especies son nuevos registros para esta región del país. En las zonas consideradasendémicas para leishmaniasis tegumentaria americana se destacaron por su abundancia,presencia en el intradomicilio e importancia epidemiológica L. gomezi, L. trapidoi, L.panamensis, L. ovallesi y L. yuilli yuilli. En las zonas de leishmaniasis visceral americanapredominó L. longipalpis. Conclusión. La presencia significativa de vectores en el intradomicilioy la prevalencia de infección humana continúan demostrando la importancia de la leishmaniasiscomo un problema de salud pública en este departamento.

Palabras clave: Psychodidae, Phlebotominae, leishmaniasis, Colombia.

Species of Lutzomyia (Psychodidae, Phlebotominae) in endemic cutaneous and visceralleishmaniasis foci of the department of Santander, in the eastern range of the ColombianAndes

Introduction. Phlebotomine sand flies are the only known vectors of leishmaniasis and showan interesting biodiversity in the Andean mountain range of South America. We update theregistry of species prevalent in the municipalities and endemic areas of the department ofSantander, in the eastern range of the Colombian Andes.Objective. To present an updated inventory and distribution of the Lutzomyia species in thedepartment of Santander and to discuss some ecological aspects of the principal species ofmedical importance.Materials and methods. Phlebotomines were collected in 12 municipalities in the years 1998to 2001 between 19:00-6:00 using CDC miniature light traps, manual aspirators on protectedhuman baits between 18:00 and 20:00, and occasionally by direct aspiration on tree trunks


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Biomédica 2006;26(Supl.1):218-27 ESPECIES DEL GÉNERO LUTZOMYIA EN SANTANDER

between 8:00-11:00 and resting on walls at different times of the day.Results. 3.972 phlebotomines of 41 species were captured, of which 16 species were newrecords for this area of the country. In zones of endemic American cutaneous leishmaniasis, L.gomezi, L. trapidoi, L. panamensis, L. ovallesi and L.yuilli were remarkable for their abundance,their presence within dwellings and their epidemiological relevance. In areas of visceralleishmaniasis, the most relevant species was L. longipalpis.Conclusion. The significant presence of vectors within human dwellings and the prevalence ofhuman infection are continuing evidence of household transmission of Leishmania as animportant public health problem in this department of Colombia.

Key words: Psychodidae, Phlebotominae, leishmaniasis, Colombia.

En Colombia, la leishmaniasis se manifiesta comoleishmaniasis tegumentaria americana y visceralamericana. En el 2004 se reportaron 14.938 casos(Ministerio de la Protección Social. Consolidadode la casuística de leishmaniasis en Colombia2004. Informe anual, Bogotá, 2005), distribuidosampliamente en todo el territorio; las zonas demayor endemicidad son la Costa Atlántica yPacífica, el valle del Río Cauca y el valle del ríoMagdalena.

En esta última se ubica el departamento deSantander, haciendo parte de la región nororientalconsiderada como la segunda zona de mayortransmisión después de Norte de Santander, conuna incidencia media anual de 593±161 casos,para el periodo comprendido entre 1993-2002(Secretaría de Salud de Santander. Datos de laOficina del Programa de EnfermedadesTransmitidas por Vectores, casuística de la leish-maniasis en el departamento de Santander).

Los parásitos aislados e identificados de casoscutáneos en diferentes municipios de este departa-mento pertenecen a las especies Leishmania(Viannia) braziliensis, Leishmania (V.) panamensispara leishmaniasis tegumentaria americana y enlos casos de leishmaniasis visceral a Leishmania(Leishmania) infantum (1). Santander es conocidocomo una de las áreas endémicas más antiguasde Colombia para la transmisión de leishmania-sis. Municipios como Vélez, cuentan con reportes

de casos de leishmaniasis tegumentariaamericana en la literatura desde 1893, en esetiempo conocido bajo el nombre de “bubón deVélez” (2) y en el municipio de Lebrija se registróen 1944 el primer caso de leishmaniasis visceralamericana para el país (3,4). Por lo tanto, estedepartamento precisa actualizar el conocimientosobre la fauna de flebótomos existente en la región.

En este estudio se presenta el inventario de laespecies del género Lutzomyia para Santander,Colombia, señalando su distribución pormunicipios y zonas endémicas; además, sediscuten algunos aspectos de la ecología de lasespecies de mayor importancia en salud pública.


Área de estudio

El departamento de Santander está ubicado en laregión nororiental de Colombia, entre los 5° 42’ y8° 08’ de latitud N y los 72° 26’ y 74° 32’ delongitud O. Posee una superficie de 30.537 km2

y una población de 1’964.361 habitantes.

Este departamento presenta dos grandes regionesfisiográficas, la del valle del Magdalena con unatopografía plana, suavemente ondulada y lacorrespondiente a la Cordillera Oriental con unatopografía quebrada y abrupta que puede presentaralturas superiores a los 3.000 m.

Sus principales renglones económicos son laagricultura de productos como el cacao, la piña,el café, el tabaco y la caña de azúcar, laexplotación minera del petróleo y el comercio.

Captura de flebótomos

Durante 1998-2001 se realizaron muestreos nosistemáticos de flebótomos en 12 municipios contransmisión activa de leishmaniasis en este

Correspondencia:Claudia Magaly Sandoval, Laboratorio de Entomología,Instituto de Investigación en Ciencias Biomédicas,Universidad de Pamplona, km1 vía a Bucaramanga,Pamplona, Colombia.Telefax: [email protected]


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departamento. Estos municipios corresponden aocho zonas endémicas para leishmaniasistegumentaria americana: El Playón, El Carmen,San Vicente de Chucurí, Landázuri, Sabana deTorres, Matanza, Betulia, Florián y en el municipiode Cimitarra en el área urbana y la localidad deCobaplata. En esta última localidad no se registrótransmisión activa de la enfermedad en elmomento de las capturas. También se realizaroncapturas en Girón y Lebrija, dos municipios conzonas de transmisión de leishmaniasis tantotegumentaria como visceral y en el municipio deCepitá tradicionalmente conocido como zona de

transmisión de leishmaniasis visceral americana.Las áreas muestreadas se ubicaron en un rangoaltitudinal de 300 y 1.500 msnm (figura 1).

Para las capturas de flebótomos se utilizarontrampas de luz tipo CDC miniatura, entre las 19:00y las 06:00 horas ubicadas en el interior de lasviviendas y en el extradomicilio (peridomicilio ybosque); también, se hicieron capturas con cebohumano protegido utilizando aspiradores manualescon un horario de las 18:00 a las 20:00 horas enel intradomicilio y extradomicilio; ocasionalmente,se hizo aspiración directa sobre troncos de árboles

Figura 1. Mapa de Santander. Se señalan los municipios estudiados y su denominación corresponde a la siguientenumeración: 1. El Playón, 2. Matanza, 3. Cepitá, 4. Lebrija, 5. Sabana de Torres, 6. Girón, 7. Betulia, 8. San Vicente deChucuri, 9. El Carmen, 10. Landázuri, 11. Cimitarra, 12. Florián

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entre las 08:00 y las 11:00 horas y capturas deflebótomos en reposo sobre las paredes deldomicilio en horas de la mañana.

Todos los flebótomos capturados se almacenaron,debidamente rotulados, en alcohol al 70%.Posteriormente, se aclararon con KOH 10% y fenolsaturado. Para los montajes permanentes se usóuna mezcla de fenol y bálsamo de Canadá y,finalmente, en la identificación taxonómica sesiguió la clave de Young y Duncan (5). Lacomposición específica de la fauna de flebótomosse presenta distribuida por municipios,indicándose el número total de especímenescapturados (hembras y machos) por método yambiente de captura (intradomicilio yextradomicilio) (cuadro 1).

Aspectos éticos

Las capturas de los flebótomos fueron realizadaspor funcionarios de Enfermedades Transmitidaspor Vectores del Instituto Departamental de Saludde Santander, con participación del InstitutoNacional de Salud, personal que está debidamentecapacitado para la aplicación de las metodologíasy que, voluntariamente, participó en las capturascon cebo humano protegido una vez se solicitósu consentimiento verbal. No se obtuvo unconsentimiento firmado.

Resultados

En los 12 municipios muestreados se recolectaron3.972 flebótomos, distribuidos en 41 especies deLutzomyia (cuadro 1). En las áreas contransmisión de leishmaniasis tegumentariaamericana se capturaron 3.208 flebótomosdistribuidos en 37 especies, las más abundantesen las capturas fueron L. gomezi (Nitzulescu,1931), 31,48%, seguida de L. trapidoi (Fairchild &Hertig, 1952), 16,27%, L. panamensis (Shannon,1926), 9,56%, L. ovallesi (Ortiz, 1952), 6,51% yL. yuilli (Young & Porter, 1972), 4,57%. Las otrasespecies conformaron el 31,48% restante y, enestas últimas, 2,27 % fueron L. longipalpis (Lutz& Neiva, 1912). Para las áreas de transmisión deleishmaniasis visceral americana se capturaron699 flebótomos, distribuidos en tres especies, L.longipalpis representó 93,13% de los flebótomoscapturados seguido de L. yuilli, 4,14%, y L.gomezi, 2,71%.

De otro lado, en el municipio de Cimitarra, lalocalidad Cobaplata y el casco urbano deCimitarra, sin transmisión activa de leishmaniasis,se capturaron seis especies de Lutzomyia; la másabundantes fueron L. antunesi (Coutinho, 1939)con 29,23%, L. yuilli, 27,69%, L. chagasi (CostaLima, 1941), 15,38%, L. ayrozai (Barretto &Coutinho, 1940), 15,38%, L. gomezi,10,76% y L.davisi (Root, 1934), 1,53%.

En el extradomicilio de las zonas endémicas deleishmaniasis tegumentaria americana, teniendoen cuenta todos los métodos de captura, seregistraron 31 especies; al considerar las capturascon trampas de luz CDC y cebo humano, lasespecies más abundantes en este ambiente fueronL. gomezi, seguida de L. trapidoi, L. panamensis,L. camposi (Rodríguez, 1952), L. yuilli, L. ovallesi(cuadro 2).

En el intradomicilio se capturaron 25 especies contrampas de luz CDC y 13 con cebo humano; alconsiderar ambos métodos de captura, L. gomezifue la de mayor abundancia seguida de L. trapidoi,L. ovallesi, L. panamensis, L. yuilli y L. bifoliata(Osorno, Morales de Osorno & Muñoz, 1970)(cuadro 2).

El 76% (32/42) de las especies que componen lafauna flebotomínea del estudio se recolectaroncon trampas de luz tipo CDC, 45% (19/42) enreposo sobre árbol, 35% (15/42) con cebo humanoy 11% (5/42) en reposo dentro del domicilio.

Discusión

La posición geográfica del departamento deSantander con una gran parte de su territorioatravesado por la Cordillera Oriental andina, gen-era un mosaico ecológico de regiones de sabanay áreas de bosque que albergan una grandiversidad de flebótomos y reservorios de lasLeishmania dermotropas y viscerotropas. En elcontexto nacional, Santander registra 31 especiesdel género Lutzomyia de 135 reportadas para elpaís (6-10, Sandoval CM, Martínez J, Flórez M,SerranoVH, Angulo V. Composición y abundanciaestacional de flebótomos en un foco de leishmani-osis visceral en la vereda de GuatiguaráPiedecuesta, Santander, Colombia. Biomédica2002;22(Suppl.1):111-2). Con este estudio seamplía el reporte de especies del género

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Cuadro 1. Composición específica de la fauna de flebótomos capturados en los 12 municipios del departamento deSantander, Colombia, 1998-2001.

Intradomicilio Extradomicilio

Especie CDC CH RI CDC CH RA CA Total Distribución por municipio

L. gomezi 184 140 19 208 483 2 1036 El Carmen, Girón, Betulia, San vicente,Lebrija, Landázuri, Cimitarra, Sabanade Torres, Matanza, El Playón, Florián

L. longipalpis 75 81 87 1 480 724 Girón, Lebrija, CepitáL. trapidoi 197 38 279 8 522 El Carmen, Betulia, San Vicente,

Landázuri, El PlayónL. panamensis 106 12 174 15 307 El Carmen, Girón, Betulia, Lebrija,

Landázuri, Sabana de Torres, El PlayónL. ovallesi 80 45 22 34 28 209 El Carmen, Betulia, Lebrija, Landázuri,

MatanzaL. yuilli yuilli 26 74 14 78 5 197 El Carmen, Betulia, San Vicente,

Lebrija, Landázuri, Cimitarra, Sabana deTorres, El Playón

L. trinidadensis 3 6 119 128 El Carmen, Lebrija, LandázuriL. camposi 6 4 105 2 1 118 El Carmen, Betulia, Lebrija, LandázuriL. shannoni (Dyar, 1929) 2 2 2 110 116 El Carmen, Betulia, LandázuriL.quasitownsendi 61 1 32 7 7 108 Landázuri, MatanzaL. bifoliata 2 68 3 14 8 95 El Carmen, Betulia, Lebrija, Landázuri,

El PlayónL. vespertillonis (Fairchild 1 0 57 58 Landázuri& Herting, 1947)L. hartmanni 24 1 27 2 54 El Carmen, LandázuriL. saulensis (Floch & Abonnenc, 1944) 35 1 9 1 46 El Carmen, LandázuriL. olmeca bicolor* (Fairchild 1 30 31 El Carmen, Girón, Lebrija, Landázuri& Theodor, 1971)L. yencanensis* (Ortiz, 1965) 9 1 19 29 LandázuriL. triramula (Fairchild & 2 25 27 Girón, LandázuriHerting, 1952)L. serrana (Damasceno & Arouck, 1949) 2 12 10 24 LandázuriL. antunesi* 19 19 CimitarraL. christenseni* (Young & Duncan, 5 0 14 19 Landázuri1974)L. sordelli (Shannon & Del Ponte, 10 9 19 El Carmen, Betulia, Landázuri1972)L. walkeri (Newstead, 1914) 4 8 12 Girón, LandázuriL. dubitans 6 5 11 LandázuriL. ayrozai* 1 9 10 CimitarraL. chagasi* 10 10 CimitarraL. abonnenci (Floch & Chassingnet,1947) 1 0 7 8 LandázuriL. caprina (Osorno, Morales & de 1 7 8 LandázuriOsorno, 1972)L. barretoi majuscula*(Young, 1979) 1 2 2 5 Girón, Landázuri, Sabana de TorresL. nuneztovari* 2 1 3 MatanzaL. pilosa (Damasceno & Causey, 1944) 1 0 2 3 BetuliaL. carpenteri* (Fairchild & Herting, 2 0 2 Betulia, El Playón1953)L. cerqueirai* (Causey & Damasceno, 0 2 2 Landázuri1945)L. lichyi 2 0 2 BetuliaL. micropyga (Mangabeira, 1942) 0 2 2 LandázuriL. undulata* (Fairchild & Herting 1950) 2 0 2 BetuliaL. dasymera* (Fairchild & Herting, 1 1 El Carmen1961)L. davisi* 1 1 CimitarraL. erwindonaldoi* (Ortiz, 1980) 1 0 1 LandázuriL. nocticola* (Young, 1973) 1 0 1 El CarmenL. sp de pichinde* (Young, 1979) 0 1 1 BetuliaL. tuberculata (Mangabeira, 1941) 0 1 1 Landázuri

Total 846 390 120 1177 568 391 480 3972

CDC: trampa de luz tipo CDC; CH: cebo humano; RI: reposo en intradomicilio; RA: reposo en árbol; CA: cebo animal* Nuevo registro

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Lutzomyia a 47 para el departamento de Santandery 16 son nuevos registros para esta área (cuadro1). Las especies que no fueron recolectadas du-rante este estudio y que previamente fueronreportadas son L. infraespinosa (Mangabeira,1941), L. atroclavata (Knab, 1913), L. furcata(Mangabeira, 1941), L. pia (Fairchild & Hertig,1961), L. venezuelensis (Floch & Abonnenc,1948)y L. evansi (Nuñez-Tovar, 1924) (6).

En Santander, la leishmaniasis visceral americana,al igual que en otras áreas de transmisión del valledel río Magdalena en Colombia, ocurre en las zo-nas de bosque seco tropical de los municipios deGirón, Lebrija, Piedecuesta y Cepitá donde laespecie predominante es L. longipalpis (11). Enel estudio no se reportó la presencia de L. evansi,considerado vector de leishmaniasis visceral enla Costa Caribe colombiana (12) y en Venezueladonde se comporta como principal vector enausencia de L. longipalpis (13) o vector alternodurante la estación húmeda, cuando disminuyenlas poblaciones de L. longipalpis (14). Otrasespecies como L. gomezi, L. ovallesi, L. dubitans(Sherlock, 1962), L. camposi y L. yuilli yuillicomponen la fauna de flebótomos en losmunicipios santandereanos endémicos para leish-maniasis visceral, acompañando a L. longipalpis,aunque siempre en muy baja proporción.

Para las zonas de leishmaniasis tegumentariaamericana, las especies de Lutzomyia másimportantes por su abundancia, presenciaintradomiciliaria y peridomiciliaria, antropofilia y

antecedentes vectoriales fueron L. gomezi, L.trapidoi, L. panamensis, L. ovallesi y L. yuilli yuillique representaron, aproximadamente, el 70% dela fauna flebotomínea recolectada en los diferentesambientes.

L. gomezi fue registrada en todos los municipiosmuestreados como San Vicente, Betulia,Landázuri, El Carmen, El Playón y Lebrija y puedeestar implicada en la transmisión pues se encontrócon frecuencia en el intradomicilio y fue abundanteen el extradomicilio. En Santander este flebótomopuede ser capturado tanto en áreas de bosqueseco tropical (Girón, Cepitá) y húmedo tropical(Landázuri, Betulia, El Carmen, San Vicente),como ha sido reportado previamente en diversasregiones del país en zonas rurales de bosquehúmedo tropical (7,15) y de bosque seco tropical(16), así como en áreas urbanas donde seconsidera que cumple un papel importante en latransmisión (10,17). Por estas características seconsidera una especie muy versátil pues seadapta a ambientes altamente intervenidos (15,18)coincidiendo esto con su amplia distribucióngeográfica. Cabe resaltar que, además, es unflebótomo altamente antropofílico y se encuentranaturalmente infectado con L. panamensis enPanamá y L. braziliensis en Venezuela (19-21).

L. trapidoi fue capturada en los municipios de ElCarmen, San Vicente y Landázuri en zonasboscosas de relativa intervención antrópica y conun comportamiento altamente antropofílico. Estostres municipios tienen en común que son losprincipales productores de cacao (Theobromacacao) del departamento y los domicilios seencuentran muy cercanos al bosque o a loscultivos tradicionales de este producto. En zonascafeteras de Colombia, esta especie fue exclusivade plantaciones tradicionales, y estaba ausenteen las plantaciones intensificadas (22). EnBuenaventura fue predominante en ambientes debosque (23) y en la región del Chocó fue frecuenteen el bosque, pero también en áreas intervenidaslo cual indica tolerancia a la deforestación (15).

Señalamos para Santander que L. trapidoi estamás asociada a ambientes de relativa intervenciónantrópica en los cuales aún se mantienen relictosde bosque secundario y donde probablementedesempeña un papel importante en la

Cuadro 2. Número y porcentaje de Lutzomyia capturadascon trampas de luz CDC y cebo humano en el extradomicilioe intradomicilio en las áreas muestreadas del departamentode Santander con transmisión de leishmaniasis tegumentariaamericana.

Especie Extradomicilio Intradomicilion % n %

L. gomezi 678 40,75 316 27,94L. trapidoi 287 17,25 235 20,78L. panamensis 189 11,36 118 10,43L. camposi 107 6,43 10 0,88L. yuilli yuilli 69 4,15 79 6,98L. ovallesi 56 3,37 125 11,05L. bifoliata 22 1,32 70 6,19 1.408 84,62 953 84,26Otras spp. 256 15,38 178 15,74

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epidemiología de la leishmaniasis tegumentaria.L. trapidoi es un reconocido vector L. panamensisen Ecuador (24) y Colombia en los departamentosde Nariño, Tolima y en el municipio de San Roque(25-27). Se encuentra reportado en 12 de 32departamentos del país. En un estudio previo enel municipio de Landázuri, Santander, L. trapidoipresentó 0,35% de infección natural por parásitosde Leishmania sp. del complejo braziliensis pormedio de la reacción en cadena de la polimerasa,probablemente, L. panamensis (Muñoz G.Incriminación de vectores de Leishmaniapanamensis por métodos estadísticos. Memorias,XXVI Congreso Sociedad Colombiana deEntomología. Santa Fe de Bogotá: SociedadColombiana de Entomología; 1999. p.164-71).

L. ovallesi se presentó de manera discreta enalgunas zonas de leishmaniasis tegumentariaamericana con excepción de los municipios deLandázuri y Betulia donde fue frecuentementehallada en el intradomicilio. Es un flebótomo,incriminado en la transmisión de L. braziliensisen Guatemala (28), L. braziliensis y L. mexicanaen Venezuela (20). En Colombia es consideradouno de los principales vectores de leishmaniasistegumentaria americana y ha sido reportado enocho departamentos del país (6); se demostró quepuede ser un vector competente debido a quesoporta altas tasas de infección con L. braziliensisen ensayos experimentales con poblacionessilvestres (29). L. ovallesi, ha sido definida comode bosque secundario en buen estado deconservación, sin aproximarse a las viviendas enalta densidad (18). No obstante, en Venezuelaexhibió una fuerte actividad intradomiciliariaasociada a la incidencia de casos en la localidadEl Ingenio, estado de Miranda (20,30) y en laciudad de Trujillo, de este mismo país, es elsegundo vector en importancia, después de L.youngi Feliciangeli & Murillo, 1987 (31). EnBucaramanga, capital de Santander, L. ovallesijunto con L. gomezi fueron las especiespredominantes en las áreas de mayordeforestación de la ciudad y localizadas a 900msnm (Cárdenas R, Gutiérrez M, Angulo VM,Munsterman L, Sandoval M, Ferro C.Phlebotomine sand flies (Diptera: Psychodidae)habitat associations to urban cutaneous leishma-

niasis in the city of Bucaramanga, northwesternColombia. XVth International Congress for Tropi-cal Medicine and Malaria. Cartagena de Indias,Colombia, 2000. p.39), asociadas probablementecon la presencia de casos urbanos (10).

L. panamensis incriminado como vector de L.panamensis en Panamá (19) y encontradanaturalmente infectada con L. braziliensis enVenezuela (21), presenta en este último país unagran distribución geográfica en 19 de 24 estados,y un papel vectorial reconocido desde los trabajosde Pifano (32,33). En el estado de Guarico, L.panamensis fue abundante en el extradomicilio,lo que sugiere que la transmisión de leishmaniasistegumentaria americana por esta especie ocurreen este ambiente (34) y en el estado deAnzoátegui, esta especie podría tener un papelimportante en la transmisión de la leishmaniasistegumentaria americana en las localidades demenor altitud, donde fue capturada con frecuenciasobre cebo humano (35). En Colombia sedistribuye en 18 de 32 departamentos y,recientemente, fue señalada junto con L. gomezi,como posibles especies responsables de latransmisión urbana de la leishmaniasistegumentaria americana en Sincelejo (17). Esprobable que esta especie esté implicada en latransmisión tanto domiciliaria como extra-domiciliaria en los municipios de Sabana deTorres, El Playón, El Carmen y Landázuri en eldepartamento de Santander.

L. yuilli yuilli fue capturada con frecuencia en elintradomicilio y estuvo presente en 8 de 11municipios muestreados; es una especiepredominantemente antropofílica, halladanaturalmente infectada con flagelados noidentificados tanto en Brasil como en Leticia,Colombia (36,37). Recientemente, se encontrónaturalmente infectada con L. panamensis en elmunicipio de Otanche junto con L. gomezi y L.panamensis en Pauna, Boyacá (Santamaría E,Zipa Y, Ponce N, Sandoval A, Ferro C.Determinación de las especies de Lutzomyia(Diptera: Psychodidae) involucradas en latransmisión de leishmaniasis cutánea en losmunicipios de Otanche y Pauna, Boyacá.Resúmenes, XXXI Congreso SociedadColombiana de Entomología, 2004. p.52). El papel

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vectorial de esta especie requiere estudios yatención en los focos de leishmaniasistegumentaria americana en las zonas andinascolombianas.

De manera general, podemos concluir queSantander es un área de gran importanciaepidemiológica para la transmisión deleishmaniasis tanto visceral como tegumentariaen Colombia. En su territorio se registra,aproximadamente, 34% de las especies presentesen el país, y el extradomicilio es el ambiente endonde se captura la mayor diversidad y númerode flebótomos. Sin embargo, en el intradomiciliose registraron 32 especies con la frecuenteincursión en este ambiente, por lo menos, de 11especies de Lutzomyia: L. gomezi, L. longipalpis,L. trapidoi, L. ovallesi, L. panamensis, L. yuilli, L.hartmani (Fairchild & Hertig, 1957), L. trinidadensis(Floch & Abonnenc, 1944), L. quasitownsendi(Osorno, de Osorno & Morales, 1972), L. lichyi(Floch & Abonnenc, 1950) y L. nuneztovari (Ortiz,1954), vectores comprobados o sospechosos detransmitir la enfermedad, lo cual permite suponerque en algunas áreas del departamento deSantander, además del extradomicilo, en elintradomicilio la transmisión también ocurre comoha sido previamente sugerido por Muñoz (MuñozG. Incriminación de vectores de Leishmaniapanamensis por métodos estadísticos. Memorias,XXVI Congreso Sociedad Colombiana deEntomología. Santa Fe de Bogotá: SociedadColombiana de Entomología; 1999. p.164-71) parael municipio de Landázuri, siendo necesariosfuturos estudios sistemáticos encaminados aaclarar el papel vectorial de cada una de lasespecies en los diversos escenarios de las áreasendémicas en el departamento de Santander, queincluyan el estudio de reservorios y la transmisiónal humano, que permitan comprender la dinámicade transmisión y diseñar estrategias de controladecuadas y ajustadas a la realidad de cada foco.

Agradecimientos

A todo el personal del Programa de EnfermedadesTransmitidas por Vectores de la Secretaría deSalud de Santander, en especial, a losfuncionarios y técnicos de EnfermedadesTransmitidas por Vectores por su asistenciatécnica en el campo.


Los autores declaramos que no existe conflictode interés.

Financiación

Secretaría de Salud de Santander e InstitutoNacional de Salud.

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228

Biomédica 2006;26(Supl.1):228-31BEJARANO E.E. , SIERRA D., PÉREZ-DORIA A., VÉLEZ I.D.

COMUNICACIÓN BREVE

Primer hallazgo de Lutzomyia tihuiliensis(Diptera: Psychodidae) en

el valle de Aburrá, ColombiaEduar Elías Bejarano 1, Diana Sierra 2, Alveiro Pérez-Doria 1, Iván Darío Vélez 2

1 Grupo de Investigaciones Biomédicas, Universidad de Sucre, Sincelejo, Colombia.2 Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales, PECET, Universidad de Antioquia, Medellín,

Colombia.

Introducción. La serie pia del grupo verrucarum está integrada por siete especies de Lutzomyia,incluyendo a L. pia, L. limafalcaoae y L. emberai que están presentes en Colombia.Objetivo. Este artículo tiene como objetivo registrar el hallazgo de una morfoespecieantropofílica de la serie pia en el país.Materiales y métodos. Los flebotomíneos fueron recolectados con un aspirador bucal sobrecebo humano protegido dentro de un bosque secundario del municipio de Envigado,departamento de Antioquia. El muestreo entomológico se desarrolló entre las 18:00 y 22:00horas, en junio y diciembre de 2004.Resultados. Los especímenes recolectados fueron identificados como L. tihuiliensis, que sedistingue por la pigmentación basal de la pleura toráxica, la longitud del labro-epifaringe ³350µm y la longitud del segundo palpómero ³170 µm. Adicionalmente, el taxón muestra un ductocomún claramente más largo que los ductos individuales, con una relación de la longitud delducto común/ducto individual ³2.Conclusión. Con el hallazgo de L. tihuiliensis se eleva a 21 el número de especies del grupoverrucarum registradas en Colombia. La presencia de cuatro especies de la serie pia en elpaís es de interés para el estudio de la génesis del taxón, considerando además que dos deéstas son endémicas del territorio nacional.

Palabras clave: Psychodidae, Lutzomyia, leishmaniasis, Colombia.

First finding of Lutzomyia tihuiliensis (Diptera: Psychodidae) in the Valle de Aburrá,Colombia

Introduction. Three of the seven species that comprise the pia series of the Lutzomyia verrucarumgroup have been recorded in Colombia, including L. pia, L. limafalcaoae and L. emberai.Objective. The aim of this paper is to report the occurrence of an anthropophilic morphospeciesof the pia series in the country.Materials and Methods. Sand flies were collected with a mouth aspirator on protected humanbait in a secondary forest in the municipality of Envigado, department of Antioquia. Theentomological survey was performed from 18:00 to 22:00 hours in June and December, 2004.Results. Captured specimens were identified as L. tihuiliensis, which can be distinguishedeasily from other species of the pia series by its basally pigmented pleura, the length of thelabro-epipharynx, ³350 µm, and the length of the second palpomere, ³170 µm. In addition to theprevious characters, the sand flies collected exhibit a longer common sperm duct than theindividual ducts with the ratio of the lengths of the common/individual ducts ³2.Conclusion. The finding of L. tihuiliensis raises to 21 the number of species of the Lutzomyiaverrucarum group recorded to date in Colombia, including two endemic species of the piaseries. From a biogeographical point of view, the presence of four species of the pia series inColombia is of great interest for the study of the origin of the taxon.

Key words: Psychodidae, Lutzomyia, leishmaniasis, Colombia.


229

Biomédica 2006;26(Supl.1):228-31 LUTZOMYIA TIHUILIENSIS EN COLOMBIA

Las enfermedades transmitidas por artrópodos,entre las que se encuentra la leishmaniosis,representan un problema de salud pública enAmérica Latina. Esta enfermedad es producto dela infección con parásitos de Leishmania Ross,1903 (Kinetoplastida: Trypanosomatidae),transmitidos al humano a través de la picadurade insectos hematófagos de la subfamiliaPhlebotominae Rondani, 1840.

Las especies de Lutzomyia França, 1924, delgrupo verrucarum Theodor, 1965, desempeñan undestacado papel en el ciclo epidemiológico de laleishmaniosis en la región andina (1). Éstastambién participan en la transmisión de Bartonellabacilliformis (Strong et al., 1913), el agenteetiológico de la bartonelosis humana (2,3).Taxonómicamente, el grupo verrucarum ha sidodividido en cuatro series de especies según elnúmero y la distribución de las espinas sobre elestilo de la genitalia masculina: verrucarum,serrana, townsendi y pia (4). Galati (5) consideró,además, la existencia de una quinta serie deespecies, evansi, con base en la ausencia depapila sobre el flagelómero III. Los machos de laserie pia poseen cinco espinas dispuestas entrela región media y distal del estilo, en tanto quelas hembras exhiben espermatecas estriadas conforma de saco, donde sobresale un anillo apicalliso de bordes casi rectos (6).

Hasta la fecha se ha registrado la presencia detres especies de la serie pia en Colombia,Lutzomyia pia (Fairchild & Hertig, 1961), Lutzomyialimafalcaoae (Wolff & Galati, 2002) y Lutzomyiaemberai Bejarano, Duque & Vélez, 2004. L. piase extiende por los departamentos de Antioquia,Boyacá, Caldas, Cundinamarca, Huila, Meta,Nariño, Norte de Santander, Risaralda, Tolima yValle del Cauca (7,8). L. limafalcaoae y L. emberaison endémicas del territorio nacional, apareciendoen los departamentos de Antioquia y Chocó,respectivamente (6,9).

El presente artículo tiene como objetivo registrarel hallazgo de otra morfoespecie de la serie piaen el país.


La recolección de los especímenes se desarrollódel 3 al 6 de junio y 7 al 10 de diciembre de 2004en la vereda El Vallano del municipio de Envigado,departamento de Antioquia. Ésta se localiza alsureste del valle de Aburrá, en la estribaciónoccidental de la Cordillera Central, a una altura de1.909 msnm. Sus coordenadas geográficascomprenden los 06° 08’ 49’’ de latitud norte y 75°34’ 53’’ de longitud oeste. La temperatura promedioanual de la región alcanza los 16,8°C y la humedadrelativa es del 85,8%. Ecológicamente, el áreacorresponde a una zona de vida de bosquehúmedo tropical (10).

El muestreo entomológico se realizó entre las18:00 y las 22:00 horas durante cuatro nochesconsecutivas por mes empleando dos reco-lectores. Los flebotomíneos se recolectaron conun aspirador bucal sobre cebo humanoprotegido dentro de un bosque secundario.Posteriormente, se aclararon en lactofenol y semontaron sobre láminas portaobjeto usando elmedio de Hoyer. La determinación de especie serealizó con las claves taxonómicas de Wolff yGalati (9), Galati (11) y Bejarano y colaboradores(6).

Este estudio fue aprobado por el Comité deBioética de la Corporación Académica para elEstudio de las Patologías Tropicales de laUniversidad de Antioquia.

Resultados

Se recolectaron siete hembras de Lutzomyiapertenecientes a la serie pia, las cuales fueronidentificadas como L. tihuiliensis Le Pont, Torrez-Espejo & Dujardin, 1997. Éstas se distinguen porla pigmentación basal de las pleuras toráxicas, lalongitud del labro-epifaringe mayor o igual a 350µm y la longitud del segundo palpómero mayor oigual a 170 µm. Además, los especímenesrecolectados muestran un ducto comúnclaramente más largo que los ductos individuales,con una relación de la longitud del ducto común/ducto individual mayor o igual a 2.

Correspondencia:Eduar E. Bejarano, Centro de Diagnóstico Médico,Universidad de Sucre, Carrera 14 No. 16 B-32, ApartadoAéreo 406, Sincelejo, Colombia.Teléfono: (575) 282 0830; Fax: (575) 282 [email protected]


230

Biomédica 2006;26(Supl.1):228-31BEJARANO E.E. , SIERRA D., PÉREZ-DORIA A., VÉLEZ I.D.

Discusión

El presente hallazgo constituye el primer registrode L. tihuiliensis en Colombia. Esta especie fuedescrita a partir de hembras recolectadas en lalocalidad de Suapi, Nor Yungas, departamento deLa Paz, Bolivia (12). Posteriormente, Cáceres etal. (13) la encontraron en Perú. En zonasendémicas de leishmaniosis de ambos países seha observado que L. tihuiliensis ostenta uncomportamiento antropofílico (12,13), lo que co-incide en Colombia con la captura de todos losespecímenes mientras intentaban picar alhumano. Aunque hasta la fecha no se hanregistrado casos de leishmaniosis en el municipiode Envigado, la presencia de una especieantropofílica del grupo verrucarum tienetrascendencia epidemiológica, teniendo en cuentael papel del vector como un focalizador de laenfermedad.

Es necesario resaltar que, entre los flebotomíneosrecolectados durante el estudio, no se encontró aL. pia. Más aún, una revisión morfológicaexhaustiva de especímenes de la serie piapreviamente recolectados en los alrededores deMedellín y depositados en la Colección de vectoresy hospedadores intermediarios de enfermedadestropicales del Programa de Estudio y Control deEnfermedades Tropicales de la Universidad deAntioquia, reveló que éstos corresponden a L.tihuiliensis y no a L. pia como se había informadoinicialmente (14). Esto pone de manifiesto lanecesidad de confirmar la identidad de losespecímenes identificados como L. pia en el país.

Desde el punto de vista biogeográfico, la presenciade cuatro especies de la serie pia en Colombia esde interés para el estudio de la génesis del taxón,considerando, además, que dos de éstas sonendémicas del territorio nacional. Las únicasespecies de la serie no encontradas hasta ahoraen el país son Lutzomyia suapiensis y Lutzomyiatocaniensis que están presentes en Bolivia y Perú,y Lutzomyia reclusa que aparece restringida aPerú. En este sentido, se espera que la adiciónde nuevos registros contribuya de manerasignificativa a su conocimiento.

Con el hallazgo de L. tihuiliensis se aumenta a150 el número de especies flebotomíneas

registradas en Colombia, incluyendo 140 especiesde Lutzomyia, 8 especies de Brumptomyia França& Parrot, 1921, y 2 especies de Warileya Hertig,1948 (Bejarano EE. Lista actualizada de lospsicódidos (Diptera: Psychodidae) de Colombia.Enviado para publicación).

Conflicto de Interés

Los autores declaran que no existe conflicto deinterés alguno sobre el trabajo publicado.

Financiación

Este estudio fue financiado por la Fundación parala Promoción de la Investigación y la Tecnologíadel Banco de la República, bajo el código No. 1606(contrato 200314)

Referencias

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Biomédica 2006;26(Supl.1):228-31 LUTZOMYIA TIHUILIENSIS EN COLOMBIA

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232

Biomédica 2006;26(Supl.1):232-5SIERRA D., OCHOA M., CALLE J.I. et al.

COMUNICACIÓN BREVE

Correspondencia:Diana María Sierra, Programa de Estudio y Control deEnfermedades Tropicales, PECET, Universidad de Antioquia.Sede de Investigaciones Universitaria, SIU, Laboratorio 632;Calle 62 Nº 52-59. Medellín, Colombia.Teléfono: (574) 210 6502; fax: (574) 210 [email protected]


Leishmania (Leishmania) mexicana enel corregimiento de San Matías,

municipio de Gómez Plata, Antioquia, ColombiaDiana Sierra, Marcela Ochoa, José Ignacio Calle, Gisela García,

Diana Colorado, Iván Darío Vélez

Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales, PECET,Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.

Introducción. La leishmaniaisis es una enfermedad encontrada en focos naturales de infeccióndonde están presentes insectos vectores y mamíferos reservorios de Leishmania.Objetivo. Registrar por primera vez la presencia de Leishmania (Leishmania) mexicana Biagi,1953, en el corregimiento de San Matías, municipio de Gómez Plata, departamento de Antioquia.Materiales y métodos. La especie fue aislada de un paciente con leishmaniasis cutánealocalizada e identificada por la técnica de Inmunofluorescencia utilizando anticuerposmonoclonales específicos de especie y electroforesis de enzimas .Resultados y conclusión. Su perfil isoenzimático similar al de las cepas de referencia L. (L.)mexicana (MNCY/BZ/62/M379) y L. (L.) mexicana (MHOM/BE/82/BEL21), permitió concluírque la especie aislada del paciente es L. (L.) mexicana.

Palabras clave: leishmaniasis, Leishmania, Colombia.

Leishmania (Leishmania) mexicana in the village of San Matias, municipality of GomezPlata, North West of Antioquia, Colombia

Introduction. Leishmaniasis is found in natural foci of infection where both sand fly vectors andmammalian reservoirs of Leishmania are present.Objective. To report for the first time the presence of Leishmania (Leishmania) mexicana Biagi,1953, in the village of San Matías, municipality of Gomez Plata, Department of Antioquia.Materials and methods. The parasite was isolated from a patient with localized cutaneousleishmaniasis and was identified by the immunofluorescence technique using specificmonoclonal antibodies against L. mexicana species and isoenzyme electrophoresis.Results and conclusion. The isoenzymatic profiles of the reference strains L. (L.) mexicana(MNCY/BZ/62/M379) and L. (L.) mexicana (MHOM/BE/82/BEL21) were similar to that of theisolate recovered from the patient, allowing us to classify it as L. (L.) mexicana.

Key words: leishmaniasis, Leishmania, Colombia.

La leishmaniasis es un conjunto de enfermedades,causadas, al menos, por 20 especies de parásitosdel género Leishmania, transmitidos a losmamíferos a través de la picadura de insectoshembras hematófagas pertenecientes a los

géneros Lutzomyia en el Nuevo Mundo y Phle-botomus en el Viejo Mundo; los reservorios sonanimales domésticos y silvestres que albergan elparásito, lo cual permite que los vectores se infectende ellos y persista el ciclo de transmisión (1).

Los parásitos de Leishmania están agrupados endos subgéneros, Viannia y Leishmania. El primeroincluye las especies propias del continenteamericano como L. (V.) peruviana, Vélez 1913,L. (V.) guyanensis, Floch 1954, L. (V.) panamensis,Lainson y Shaw 1972 y L. (V.) braziliensis queson las especies más ampliamente distribuidas


233

Biomédica 2006;26(Supl.1):232-5 LEISHMANIA MEXICANA EN GÓMEZ PLATA, ANTIOQUIA

en Colombia y responsables del mayor númerode casos de leishmaniasis cutánea y mucosa (2).En el subgénero Leishmania se encuentranespecies distribuidas tanto en el Viejo Mundo(Europa, Asia y África) como en América (3). Eneste último subgénero se encuentra L. (L.)mexicana especie que se distribuye desde el surde los Estados Unidos hasta Colombia, la cualproduce generalmente úlceras cutáneas pequeñas,principalmente en cara y pabellón auricular. EnColombia esta especie ha presentado unadistribución limitada, encontrándose en losdepartamentos de Caldas, Putumayo, Nariño ySantander (4-6).

Según la especie de Leishmania, se desarrollanlas diferentes formas clínicas de la enfermedadcomo leishmaniasis cutánea, causada porespecies de Leishmania de los subgéneros Vianniay Leishmania. Se distribuye desde el sur de losEstados Unidos hasta el norte de Argentina (7).

En el presente trabajo se registra por primera vezel hallazgo de L. (L.) mexicana en el corregimientode San Matías, municipio de Gómez Plata,departamento de Antioquia.


Área de estudio

El corregimiento de San Matías esta localizado a6° 40' 43'’ N - 75° 13' 01'’ O. Su altura sobre elnivel del mar es de 1.800 metros sobre el niveldel mar (m.s.n.m), con temperatura promedio de20°C; está ubicado entre los ríos Guadalupe yPorce.; es de área montañosa con zonas planasy valles y elevaciones pertenecientes a laCordillera Central; su economía dependebásicamente de cultivos (caña panelera, yuca,café, maíz y plátano), ganadería y minería.

El paciente con leishmaniasis cutánea localizadaresidente de esta localidad fue examinado duranteun estudio de prevalencia de leishmaniasisrealizado en el corregimiento de San Matías.

Búsqueda activa de casos, aislamiento eidentificación de la cepa de Leishmania sp .

En la finca El Loro del corregimiento de SanMatías, se presentaron en los últimos seis meses-por primera vez en la historia del municipio- tres

casos autóctonos de leishmaniasis cutánea entrabajadores de la finca, los cuales fuerondiagnosticados mediante examen directo en elLaboratorio Clínico del Hospital de Santa Isabel.

En el momento de nuestro estudio, a uno de estospacientes con lesiones se le tomó muestra poraspirado del borde activo de la lesión y el materialobtenido se sembró en el medio de cultivo Novy-McNeal- Nicolle (NNN). Posteriormente, se realizóun subcultivo en masa en el medio NNNmodificado para proceder a la identificación delos parásitos por inmunofluorescencia indirecta(IFI), utilizando anticuerpos monoclonalesespecíficos de especie (8) y su posteriorconfirmación por isoenzimas (9).

Para esta técnica se usaron las enzimas glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, fosfogluconatodeshidrogenasa, superóxido dismutasa,fosfoglucosa mutasa, nucleósido hidrolasa,manosa-fosfato isomerasa, glucosa-fosfatoisomerasa de las cepas de referencia de laOrganización Mundial de la Salud, HOM/BR/75/M2903 (L. (V.) braziliensis), HOM/Br/75/M4147 (L.(V.) guyanensis, HOM/PA/71/LS94 (L. (V.)panamensis), IFLA/BR/67/PH8 (L. (L) amazonensis,MNCY/BZ/62/M379 (L. (L.) mexicana), MHOM/BE/82/BEL21 (L. (L.) mexicana) y MHOM/VE/74/PMH3 (L. (L.) venezuelensis).

Consideraciones éticas

Los procedimientos realizados fueron aprobadospor el Comité de Bioética de la CorporaciónAcadémica para el Estudio de PatologíasTropicales de la Universidad de Antioquia, ya quecumple con los requisitos establecidos en laResolución N° 008430 de 1993, sobre normascientíficas, técnicas y administrativas para lainvestigación en salud.

Resultados

El paciente analizado en el corregimiento de SanMatías presentó lesiones cutáneas activas, lo quepermitió la toma de muestra para el cultivo y elposterior aislamiento del parásito para suidentificación.

La técnica de IFI util izando anticuerposmonoclonales específicos de especie, permitióestablecer, en primera instancia, que el parásito

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Biomédica 2006;26(Supl.1):232-5SIERRA D., OCHOA M., CALLE J.I. et al.

pertenecía al complejo mexicana y, posterior-mente, su perfil isoenzimático similar al de lascepas de referencia L. (L.) mexicana (MNCY/BZ/62/M379) y L. (L.) mexicana (MHOM/BE/82/BEL21), permitió concluir que la especie aisladadel paciente es L. (L). mexicana.

Discusión

En Colombia se han informado brotes epidémicosde leishmaniasis desde 1986 (10) y desdeentonces el Programa de Estudio y Control deEnfermedades Tropicales, PECET, ha venidorealizando estudios de campo en varias regionesdel país como Montebello, Antioquia (1984), SanRoque, Antioquia (1987), Saiza, Córdoba (1990),Arboletes, Antioquia (1997), Yalí, Maceo yCisneros, Antioquia en 2002 (informes internosPECET); con excepción de Montebello la especieresponsable fue una variante enzimática de L. (V.)braziliensis, muy emparentada por isoenzimascon L. (V.) peruviana, (Vélez 1913); para los otrosfocos la especie responsable fue L. (V.)panamensis la cual presenta una ampliadistribución en Colombia (4).

El género Leishmania comprende 30 especies,las cuales presentan distribución ecológica ygeográfica diferente y pueden infectar granvariedad de reservorios y vectores (11,12). Parael diseño de medidas de prevención y control dela enfermedad es importante hacer una correctaidentificación de la especie de parásito que estácausando la enfermedad en un área dada.

Nuestro estudio confirma la transmisión activa deLeishmania causante de manifestaciones clínicascutáneas en el corregimiento de San Matias. Estaafirmación se respalda por los casos humanosdetectados en la zona y, también, por elaislamiento, aunque sólo en un paciente de L. (L.)mexicana que ocasiona formas clínicas cutáneasy de la cual en Colombia se ha informado supresencia en los departamentos de Caldas,Putumayo, Nariño y Santander (4-6).

Igualmente, es importante la presencia deLutzomyia columbiana del grupo Verrucarum(Ristorcelly & Van Ty, 1941) (no se presentan losresultados), especie de importancia médica y quefue incriminada como vector de bartonelosis en

el sur de Colombia entre los años 1930 y 1940(13) y, más recientemente, asociada a latransmisión de L. (L.) mexicana en Samaniego,Nariño (5).

Es importante que las autoridades de saludpresten una vigilancia constante por la posibilidadde la aparición de nuevos casos de leishmaniasisen esta localidad. Además, es necesario realizarestudios epidemiológicos que incluyan labúsqueda de la infección tanto en humanos comoen reservorios y flebótomos, elementos queconstituyen la triada epidemiológica deleishmaniasis.

Agradecimientos

Agradecemos al personal del Hospital de SantaIsabel por su participación y colaboración; a loshabitantes de la localidad de San Matías y a ImerioCorrea de la finca El Loro por toda su cooperaciónpara la ejecución de este estudio.

Financiación

Este estudio fue realizado dentro del conveniointeradministrativo realizado entre la DirecciónSeccional de Salud de Antioquia y el Programade Estudio y Control de Enfermedades Tropicales,PECET, de la Universidad de Antioquia; contratocódigo Nº CI 217-2002.


Los autores manifiestan que no existe conflictopersonal ni financiero de interés con otras personasu organizaciones que pudieran influenciarinadecuadamente los datos presentados en estarevisión.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):236-41CORTÉS L.A.

COMUNICACIÓN BREVE

Foco de leishmaniasis en El Hobo,municipio de El Carmen de Bolívar, Bolívar, Colombia

Luis Alberto Cortés

Unidad de Entomología, Laboratorio de Salud Pública Departamental, Secretaría de Salud de Bolívar,Cartagena, Colombia.

Introducción. Se describen las características epidemiológica e importancia de la especies deLutzomyia presentes en un foco de leishmaniasis en la vereda El Hobo Carmen de Bolívar,departamento de Bolívar.Objetivos. Obtener un conocimiento preliminar de la transmisión de leishmaniasis en lavereda El Hobo Carmen de Bolívar.Materiales y métodos. Se analizaron datos epidemiológicos y se realizaron capturas deflebótomos con trampas CDC y cebo humano en la vereda El Hobo. Para establecer la seroprevalencia de leishmaniasis visceral canina se hizo un estudio en perros mediante la técnicade inmunofluorescencia indirecta.Resultados. Se capturaron nueve especies de Lutzomyia: L. trinidadensis, L. evansi, L .cayennensis,L. venezuelensis, L. gomezi, L. dubitans, L. ylephiletor, L. yuilli, y L. walkeri. Las especie demayor importancia por sus implicaciones en la transmisión de leishmaniasis cutánea y visceralfueron L. gomezi, y L. evansi respectivamente. Se reporta por primera vez para Bolívarespecimenes de L. venezuelensis, L. dubitans, L. ylephiletor, L. yuilli, y L. walkeri. Se determinóuna prevalencia de leishmaniasis visceral del 36% en los caninos estudiados. Según losreportes epidemiológicos, en el 2002 en el municipio de Carmen de Bolívar la leishmaniasiscutánea mostró un aumento del 40% y la leishmaniasis visceral canina del 80% de los casoscon respecto al 2001, debido al brote presentado en la vereda El HoboConclusiones. Los resultados determinan a la vereda El Hobo como una zona de riesgopotencial de transmisión de leishmaniasis cutánea y visceral.

Palabras clave: Leishmania, Lutzomyia, leishmaniasis visceral, leishmaniasis cutánea,reservorios, epidemiología.

Leishmaniasis transmission focus in El Hobo, Carmen de Bolívar, Bolívar, Colombia)

Introduction. The epidemiological characteristics and the importance of the Lutzomyia speciespresent in a leishmaniasis focus in the village El Hobo, Carmen de Bolívar, Department ofBolívar, Colombia, are described..Objective. To obtain a preliminary assessment of leishmaniasis transmission in the village ofEl Hobo, Carmen de Bolívar.Materials and methods. Epidemiological data were analyzed and sandflies were collectedwith CDC traps and on protected human volunteers in the village of El Hobo. Sero prevalenceof canine visceral leishmaniasis in dogs was evaluated using indirect inmunofluorescence(IFAT).Results. Nine Lutzomyia species were collected: L. trinidadensis, L. evansi, L. cayennensis, L.venezuelensis, L. gomezi, L. dubitans, L. ylephiletor, L. yuilli, and L. walkeri. The species ofgreater importance based on their implication in the transmission of cutaneous and visceralleishmaniasis were L. gomezi, and L. evansi respectively. Specimens of L. venezuelensis, L.dubitans, L. ylephiletor, L. yuilli, and L. walkeri are reported for the first time for the Departmentof Bolivar. The sero prevalence of visceral leishmaniasis in dogs was 36%. According to theepidemiological records, in 2002 the municipality of Carmen de Bolivar presented a 40%increase in cases of cutaneous leishmaniasis and an 80% increase in canine visceralleishmaniasis as compared to 2001, due to the outbreak in the village of El Hobo.


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Biomédica 2006;26(Supl.1):236-41 LEISHMANIASIS EN CARMEN DE BOLÍVAR, BOLÍVAR

Conclusions. The results indicate that the village of El Hobo is an area of potential risk fortransmission of both cutaneous and visceral leishmaniasis.

Key words: Leishmania, Lutzomyia, visceral leishmaniasis, cutaneous leishmaniasis, reservoirs,epidemiology.

Correspondencia:Luis Alberto Cortés, coordinador, Unidad de Entomología,Laboratorio de Salud Pública Departamental, Secretaría deSalud de Bolívar, Centro calle 36 Nº7-55, Casa de la Moneda,Cartagena, Colombia.Teléfono fax (095) 664 3600luisgonatodes@ yahoo.com. [email protected].


Todas las leishmaniasis son trasmitidas al hombreúnicamente por la picadura de especies deflebótomos que, en el Nuevo Mundo pertenecenal genero Lutzomyia y en el Viejo Mundo al géneroPhlebotomus (1).Cada especie de Leishmaniatiene un único perfil epidemiológico con diferentesvectores, huéspedes, reservorios y distribucióngeográfica. La mayoría de casos humanos ocurreen personas que residen o entran a áreas ruraleso selváticas ya que la enfermedad es básicamenteuna zoonosis (2). La epidemiología de estasenfermedades es extremadamente compleja ypuede ser alterada por cambios en algún puntodel triángulo epidemiológico que está formado porhumanos, reservorios y flebótomos transmisores.La mayoría de los factores ambientales queafectan la epidemiología de varias leishmaniasisson aún pobremente entendidos o no se conocenmuy bien (3). En el 2002, Carmen de Bolívar aportó187 casos de leishmaniasis cutánea y 19 casosde leishmaniasis visceral, el 63% y el 99% de loscasos en el departamento de Bolívar, respecti-vamente. La vereda El Hobo en el 2002 presentó76 casos de leishmaniasis cutánea y 17 de los19 casos reportados de leishmaniasis visceral enel municipio Carmen de Bolívar (datos sin publicar,Secretaría de Salud de Bolívar. Informes deentomología, ETV y epidemiología, 2003). Deacuerdo con estos antecedentes epidemiológicos,la Unidad de Entomología de la Secretaría deSalud Departamental decidió realizar un estudioque tenía como objetivo determinar las caracterís-ticas ecoepidemiológicas del foco y las especiesde Lutzomyia presentes que permitieran dilucidarel ciclo de transmisión de la enfermedad y poder

elaborar métodos de control y prevención eficacesen la vereda El Hobo.


Área de estudio y población. El estudio se llevóa cabo en la vereda El Hobo, municipio de Carmende Bolívar, departamento de Bolívar.

Investigación epidemiológica. Se analizaron losdatos de las fichas epidemiológicas de leishma-niasis de los pacientes procedentes de la veredaEl Hobo del 2002 y se compararon con los del2001. Estas fichas se hallaban en la Secretaríade Salud Municipal de Carmen de Bolívar y laSecretaría de Salud Departamental. Se tomaroncomo variables relevantes la edad y el sexo delpaciente.

Investigación entomológica. El muestreo deflebótomos se realizó del 15 al 18 de enero del2003. Se seleccionó una casa en la vereda ElHobo en donde se habían presentado dos casosde leishmaniasis visceral y uno de cutánea. Semuestreó con trampa de luz CDC por dos nochesen el intradomicilio, y una noche en el peridomicilioy extradomicilio por espacio de 12 horas de las17:00 a las 05:00 horas y se muestreó en cebohumano protegido en el intradomicilio durante tresnoches de las 17:00 a las 24:00 horas. Para talefecto, dos personas con protección adecuada,camisa de manga larga y pantalón largo, y conrepelente en las partes expuestas, se sentaron aesperar la llegada de los insectos.

Se hizo búsqueda activa en el intradomicilio, enlas paredes de la vivienda de las 17:00 a las 20:00horas. Las capturas las hicieron cuatrorecolectores, con la ayuda de una linterna y unaspirador bucal. Se registró el número deindividuos por hora; los insectos capturados seasfixiaron con humo y se preservaron en alcoholal 70%, debidamente rotulados para ser enviadosal Laboratorio de Entomología del InstitutoNacional de Salud y a la Unidad de Entomologíade Bolívar para su determinación taxonómica

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según las claves taxonómicas de Young yDuncan (4).

Encuesta serológica. Para determinar laprevalencia de leishmaniasis canina mediante latécnica inmunofluorescencia indirecta (IFI) secapturaron perros en la vereda El Hobo, a loscuales se les extrajeron 5 ml de sangre en tubos(vacutainer) por venopunción. Luego, se separóel suero por centrifugación a 5000 rpm durante 5minutos y se conservó en frío hasta suprocesamiento.

La captura de los caninos y la recolección de lasmuestras, al igual que las capturas en cebohumano, fueron aprobadas por el Comité de Zoono-sis conformado por el ICA y la Secretaría de Saludde Bolívar.

En la vereda El Hobo se estimaba un total de 48perros, pero sólo se les pudo tomar muestra desangre a 36, encontrados en las casas visitadasen la vereda. Los exámenes realizados a las per-sonas y a los caninos mediante la técnica IFI parael diagnóstico de leishmaniasis visceral fueronbajo los parámetros del Laboratorio deParasitología del Instituto Nacional de Salud. Seutilizó el antígeno cepa Leishmania chagasi,suministrado por el Instituto Nacional de Salud, yse consideraron positivos los resultados mayoreso iguales a 1/32 (comunicación personal concolaboradores del INS).

Análisis estadístico. Se realizó un análisisdescriptivo de la población con las variables edady sexo; se utilizó una prueba no paramétrica G,para determinar diferencias significativas entre lapresencia de leishmaniasis por sexo y edades.

Se determinó la prevalencia de leishmaniasis vis-ceral canina en perros de la vereda El Hobo. Losdatos se analizaron con el programa SPSS paraWindows.

Resultados

Según los reportes epidemiológicos, en el 2002en el municipio de Carmen de Bolívar laleishmaniasis cutánea mostró un aumento del 40%y la leishmaniasis visceral canina del 80% de loscasos con respecto al 2001, debido al brotepresentado en la vereda El Hobo. Mediante laprueba no paramétrica G no se encontraron

diferencias significativas entre hombres y mujeresque presentaron leishmaniasis cutánea (G

0,05, 1= 4,9,

p>0,95) como tampoco en el rango de edades tomado

(0-10, 11-20, 21-35, <36), (G0,05, 1= 1,3, P>0,08

). Para

leishmaniasis visceral se encontró el mayornúmero de casos entre cero y dos años de edad.A través del 2002 los casos de leishmaniasiscutánea y visceral se presentaron en todos losmeses del año, con un leve aumento en los mesesde noviembre y diciembre.

En cuanto al muestreo de Lutzomyia, secapturaron 190 individuos de Lutzomyia, 73 portrampas CDC, 107 en cebo humano y 10 enbúsqueda activa. Del total de ejemplarescapturados, 68%(130) eran hembras y 30,52% (60)machos; de éstos, 55 fueron capturados por trampasCDC, 2 por búsqueda activa y 3 en cebo humano.Del total de hembras, 94 fueron por cebo humano,28 en trampa CDC y 8 por búsqueda activa.

Según los sitios -intradomicilio, peridomicilio yextradomicilio- se observó que la mayor capturaocurrió en el extradomicilio con una densidad de39 Lutzomyia por trampa por 1 noche, seguidapor el intradomicilio con una densidad de 9Lutzomyia por trampa por noche y el peridomicilioque tuvo una densidad muy baja, 1 Lutzomyiapor trampa por noche. La tasa de picadura en elintradomicilio mostró actividad desde las 17:00 alas 21:00 horas, con un pico máximo entre las21:00 y las 22:00 horas con una densidad de 6Lutzomyia/hora/hombre (figura 1).

Las especies de Lutzomyia capturadas fueron: L.trinidadensis, L. evansi, L. cayennensis, L.venezuelensis, L. gomezi, L. dubitans, L.ylephiletor, L. yuilli y L. walkeri.

De los 36 perros muestreados, 13 resultaronpositivos para leishmaniasis visceral canina conuna prevalencía del 36%.

Figura 1. Horas de actividad de Lutzomyia spp. en elintradomicilio, vereda El Hobo.

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Discusión

La vereda El Hobo queda en la zona rural delmunicipio El Carmen de Bolívar; se ubica entreun bosque secundario con algunos parches debosques secos tropicales, comparte fronteras converedas del departamento de Sucre en dondeexiste un foco histórico de leishmaniasis visceral(5). Para el caso de las leishmaniasis, el desarrollourbano en áreas endémicas crea condiciones detraslape en donde la vivienda humana se aproximaa los focos naturales con la consecuente apariciónde individuos infectados (6). La presencia deindividuos de diferentes edades entre un mes y78 años al igual que de ambos sexos, sugiereuna transmisión intradomicilio y peridomicilio deleishmaniasis cutánea en la vereda El Hobo. Losresultados de prevalencia de caninos positivospor IFI comparados con otros reportes realizadosen la región, mostraron una seroprevalenciaconforme a lo registrado en San Andrés deSotavento, Córdoba, 16% por IFI (7) y más altosque los reportados por Ovejas, Sucre, y El Carmende Bolívar, 9,6% (5), La seroprevalencia encontradaes alta comparada con recientes estudiosrealizados en el mundo: en España, 4,5% (8);Brasil, 6,2% (9), e Irán, 18% (10).

Los estudios de la dinámica de la población deespecies de Lutzomyia involucradas en latransmisión de la leishmaniasis en áreas ruralesy suburbanas, son importantes para elconocimiento de los factores bióticos y abióticosque mantienen estas parasitosis como unaenfermedad endémica en zonas rurales y seconstituyen en estudios de gran valor para laplanificación de las estrategias de control vectorial(11).

A pesar del corto tiempo del estudio, el presentetrabajo permite tener una buena aproximación ala composición de especies de Lutzomyiaimplicadas en un foco de leishmaniasis en lavereda El Hobo. Se observaron nueve especiesdel género Lutzomyia, lo cual aumenta de 13 a18 el número de especies reportadas para Bolívarsegún Ferro y Morales en 1998 (12).

Se han reportado para Colombia 129 especies deLutzomyia (13), sólo siete de ellas se hanincriminado como vectores: L. longipalpis, L.

evansi, L. spinicrassa, L. hartmanni, L. trapidoi,L. flaviscutellata y L. gomezi (14). De las especiesencontradas en este estudio las de mayorimportancia por sus antecedentes como vectoreseran L. gomezi, vector reconocido de leishmania-sis cutánea (12,13,15) y L. evansi, vector princi-pal de la leishmaniasis visceral en la costa delCaribe colombiano (4,16-18).

Epidemiológicamente es importante reconocer elcomportamiento y los hábitos de picadura de lasLutzomyia, para establecer las horas y los sitiosdonde se encuentran expuestos los habitantes deuna región determinada (6,15). De acuerdo conlas capturas hechas en cebo humano en elintradomicilio, las especies de Lutzomyiamuestran una actividad entre las cinco de la tardey las once de la noche (figura 1), sobreponiéndosecon las actividades humanas como descansar,ver televisión, oir radio, o dormir; esto puedeexplicar, hasta cierto punto, la gran incidencia dela enfermedad, además del mal manejo del medioy la poca protección contra los vectores, motivodel desconocimiento de las comunidadesafectadas acerca de la enfermedad y el vector(datos epidemiológicos sin publicar, Unidad deEntomología de Bolívar).

Después de analizar los datos de este estudio laSecretaría de Salud decidió tomar como medidasde control y prevención la utilización de toldillosimpregnados en las viviendas dispersas,fumigación de acción residual en las viviendasconglomeradas y educación a la comunidad sobrelos métodos de prevención y control de laenfermedad. Aunque es muy difícil el seguimientode estas actividades por el delicado acceso a lavereda, se puede decir que los métodos utilizadosfueron eficaces, dado que la vereda El Hobo no hareportado casos de leishmaniasis cutánea ni vis-ceral desde el segundo semestre del 2003 (datossin publicar, Secretaría de Salud de Bolívar, datosde entomología, ETV y Epidemiología, 2004).

En conclusión, en el presente trabajo se reportancinco nuevos registros de Lutzomyia para eldepartamento de Bolívar: L. venezuelensis, L.dubitans, L. ylephiletor, L. yuilli, y L. walkeri.

Teniendo en cuenta la presencia de L. evansi, yL. gomezi, vectores principales de leishmaniasis

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cutánea y visceral en la costa Caribe colombiana,la vereda El Hobo constituye una zona de riesgopotencial de transmisión de leishmaniasis cutáneay visceral.

Si se tiene en cuenta que el reservorio de la leish-maniasis visceral es el perro, y que se da unintercambio importante de diferentes tipos, comotransporte de mascotas por las personasdesplazadas por la violencia, visita de familiaresy actividades de comercio entre las veredas delos departamentos de Sucre y Bolívar en dondelos focos de leishmaniasis visceral están activos,es muy difícil controlar la endemia si no se ponetodo el empeño de las autoridades municipales ydepartamentales de salud.

De acuerdo con los datos arrojados por esteestudio preliminar se hacen necesarios estudiosindividuales de los diferentes focos presentes enla región, así como un estudio más profundo ydetallado de las especies L. gomezi y L. evansipara poder determinar efectivamente las medidascontrol y prevención de la leishmaniasis visceraly cutánea de acuerdo con las característicasepidemiológicas y ecológicas de cada vereda enel municipio de El Carmen de Bolívar.

Agradecimientos

A Margarita Martínez y a Martha Hernández porsu apoyo a la logística del estudio. A Alcira Castropor los datos epidemiológicos, a Yonia Cabarcaspor su apoyo en la toma de muestras. A RamiroPereira y Guillermo Laguna por su invaluableapoyo en campo. A Adán Márquez y a todos lostécnicos del municipio de El Carmen de Bolívarque participaron en la realización de esteproyecto. A Víctor Olano, Cristina Ferro y ErikaSantamaría por su colaboración en la deter-minación taxonómica de los individuosrecolectados en el Laboratorio de Entomología delInstituto Nacional de Salud. A Martha Ayala porsu apoyo y la realización de los IFI en elLaboratorio de Parasitología del Instituto Nacionalde Salud.


Se manifiesta que los resultados obtenidos enesta investigación no están relacionados conningún tipo de intereses.

Financiación

Este estudio pertenece a los Programas dePrevención y Control de ETV de la Secretaría deSalud de Bolívar, y fue financiado por laGobernación de Bolívar, Secretaría de Salud.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):242-8HERNÁNDEZ D., ROJAS E., SCORZA J.V., JORQUERA A.

COMUNICACIÓN BREVE

Infectividad del perro ( Canis familiaris ) para Lutzomyia youngien Trujillo, Venezuela

Dalila Hernández 1, Elina Rojas 1, José Vicente Scorza 1, Alicia Jorquera 2

1 Instituto Experimental “José Witremundo Torrealba”, Núcleo Universitario Rafael Rangel, Universidad deLos Andes, Trujillo, Venezuela.

2 Centro de Investigaciones en Ciencias de la Salud, Universidad de Oriente, Núcleo Anzoátegui, Barcelona,Venezuela.

Introducción. En Trujillo, Venezuela, la prevalencia de leishmaniasis tegumentaria americana(LTA) es de 38 por 100.000 habitantes.Objetivo. En una localidad periurbana, rural, de la ciudad capital, estudiamos a los perroscaseros (Canis familiaris) para investigar mediante la técnica de xenodiagnóstico la eventualcapacidad para infectar a Lutzomyia youngi, especie flebotomina con actividad vectorialintradomiciliaria comprobada y abundante en el área de estudio.Materiales y métodos. Los perros con lesiones sugestivas de LTA, parasitológicamentediagnosticados, fueron seleccionados para el xenodiagnóstico permitiendo a flebótomossilvestres de una zona libre de LTA alimentarse ad libitum sobre toda la superficie corporal decada animal, y evidenciar, en disecciones efectuadas a los 5 días post-ingesta, la posiblepresencia de flagelados en sus tractos digestivos, en cuyo caso, fueron evaluados por latécnica PCR-Multiplex para determinar la identidad del parásito.Resultados. Un total de 455 flebótomos se ingurgitaron sobre dos perros en tres evaluacionesdistintas; en una única ocasión, se observaron promastigotes en 4 (0,88%) insectos, cuyaidentificación molecular reveló pertenecían al subgénero Viannia.Conclusión. El perro casero constituye un potencial factor de riesgo intradomiciliario en elciclo de la LTA.

Palabras claves: leishmaniasis, perros, xenodiagnóstico, PCR, factores de riesgo.

Dog (Canis familiaris ) infectivity to Lutzomyia youngi in Trujillo, Venezuela

Introduction. In Trujillo, Venezuela the prevalence for American tegumentary leishmaniasis(ATL) is 38 per 100.000 inhabitants.Objective. In a periurban, rural settlement of the capital city Trujillo, we studied the potentialcapability of the domestic dog (Canis familiaris) as a source of infection for Lutzomyia youngi,a phlebotomine sand fly species abundant in the study area and whose domestic vectorialactivity has been proven.Materials and methods. Dogs with dermal lesions suggestive of ATL and parasitologicalconfirmation of infection, were selected for xenodiagnosis by allowing sylvatic phlebotominesfrom a ATL free area, to feed ad libitum over each animal´s entire body surface. The insects´intestinal tracts were dissected 5 days after the blood meal in order to look for flagellate forms.When these were found, parasitological identification was performed by the multiplex-PCRtechnique.Results. Four hundred and fifty five sand flies engorged over two dogs in three different assays;promastigotes were found in 4 (0.88%) of the specimens on only one occasion. PCR identifiedDNA of the Leishmania Viannia subgenus.Conclusion. The household dog has the potential of being a domestic risk factor in the ATLtransmission cycle.

Key words: leishmaniasis, dogs, xenodiagnosis, PCR, risk factors.


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Biomédica 2006;26(Supl.1):242-8 XENODIAGNÓSTICO EN LEISHMANIASIS TEGUMENTARIA CANINA

En Venezuela, la leishmaniasis tegumentariaamericana es un importante problema de saludpública que ocurre en casi todo el territorio,especialmente en la región de los Andes, dondeel estado Trujillo reporta oficialmente unaprevalencia de 38 en 100.000 habitantes (1), aunquese reconoce un notable subregistro de casos (2).

En la epidemiología de la leishmaniasistegumentaria americana, se han descritomodificaciones asociadas con la evolución de larelación parásito-hopedador; la inicial concepciónenzoótica de la infección (3) ha adoptado uncarácter zoonótico definido por el desarrollo yprogreso de actividades humanas que hanacompañado un incremento de la incidencia de laenfermedad y enmarcado un ciclo urbano ysuburbano de transmisión (4,5), caracterizado enla región andina venezolana por el reemplazo dela vegetación primaria por plantaciones de café,medio importante de subsistencia en comuni-dades periurbanas y un paisaje ideal para laprocreación de vectores de leishmaniasistegumentaria americana (6).

En el ambiente doméstico, diversos estudios hanreportado la coincidencia de personas y perros(Canis familiaris) con leishmaniasis tegumentariaamericana conviviendo en las mismas casas (7-11), hecho que ha contribuido a la suposición deque el perro doméstico podría tener algún papelcomo reservorio de leishmanias dermótropas,similarmente a como está establecido en laepidemiología de la leishmaniasis visceral (12).Para ello, se han empleado diversas técnicasdiagnósticas en el estudio de la prevalencia deleishmaniasis tegumentaria americana canina (13-18); no obstante, son escasas las investigacionessobre la capacidad del perro para infectar apotenciales vectores de Leishmania causantesde leishmaniasis tegumentaria americana.

La técnica de xenodiagnóstico con Lutzomyia sp.fue introducida por Christensen y Hearer (19). Parala leishmaniasis tegumentaria americana, losreportes disponibles sobre el xenodiagnóstico enperros refieren animales con lesiones; Vexenatet al. (20), al alimentar Lutzomyia whitmani sobrelesiones de leishmaniasis en tres perros, obtuvoun índice de infección de 2,68% (5/186). En otrainvestigación en la que se utilizó Lutzomyiamigonei, Bezerra et al. planteaban que lacapacidad infectiva del perro dependía de laevolución de sus lesiones, y disminuían deacuerdo con su antigüedad (21).

Entre tanto, Lutzomyia youngi ha sido señaladacomo la especie más común del grupo verrucarumen la región de los Andes venezolanos (22), conuna abundancia de población de 80% en el estadoTrujillo, Venezuela, donde se le ha halladonaturalmente infectada en 1,8% (4/221) en unalocalidad periurbana de la ciudad capital del estado(23,24), y ha sido empleada en la técnica delxenodiagnóstico en casos humanos (25).

El objetivo del presente trabajo fue evaluar lacapacidad infecciosa de perros con lesiones deleishmaniasis, presumiblemente, causadas porLeishmania (Viannia) braziliensis. Por ser el perrode asentamientos rurales un animal domésticoestrechamente en contacto con el ambienteselvático, consideramos probable que encondiciones naturales fuera activamente picadopor L. youngi, especie de flebótomo decomprobada actividad picadora intradomiciliaria yabundante en el área de estudio (26,27).


Área de estudio

La localidad del estudio fue Loma de PiedrasNegras, una comunidad periurbana, rural, detradición agrícola cafetalera, ubicada a 15 km endirección noroeste de la capital del estado, Trujillo,(9°18´40´´ LN, y 70°27´28´´LO), considerada comoun área de riesgo epidemiológico alto para leish-maniasis tegumentaria americana (26-28), y dondese ha descrito por métodos moleculares que laespecie de parásito circulante causante de leish-maniasis cutánea en la población humana y en lapoblación canina pertenece a la especie L. (V.)braziliensis (11,29).

Correspondencia:Dalila Hernández, Instituto Experimental “José WitremundoTorrealba”, Núcleo Universitario Rafael Rangel, Universidadde Los Andes, Trujillo, Venezuela; Avenida Medina Angarita,sector Los Ilustres; apartado postal Nº 100, Trujillo 3102-A,Venezuela.Telefax: (0058) (272) 236 [email protected]


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Animales del estudio

Mediante una encuesta domiciliaria se hizo uncenso de todos los perros caseros de la localidad.En una posterior visita, previo consentimiento delos dueños de los animales, se examinaron losperros incluidos en el estudio mediante unaevaluación clínica general, inspeccionandorigurosamente la integridad de su pelaje y de supiel. Se consideraron alteraciones dérmicassospechosas de leishmaniasis tegumentariaamericana, las úlceras, los nódulos, las excoria-ciones, las cicatrices y las despigmentaciones.

Examen parasitológico

De los animales con lesiones sugestivas deleishmaniasis tegumentaria americana se hicierondos improntas in situ y dos frotis de biopsias delborde de la lesión sobre láminas portaobjetos.Luego de fijadas y coloreadas con Giemsa, seevaluaron microscópicamente con el objetivo deinmersión en busca de formas amastigotas deLeishmania sp., considerando la relación parásitosvisualizados por cada 100 células blancascontadas por impronta.

En los animales que resultaron positivos a laevaluación parasitológica directa, se intentó elaislamiento in vitro e in vivo de los parásitosmediante la siembra e inoculación de trituradosde tejido del borde de sus lesiones en tubos deensayo con medio agar sangre y en los metatarsosde un par de hámsteres (Mesocricetus auratus)machos de 3 meses de edad.

Para el xenodiagnóstico se seleccionaron losperros con lesiones cuyo diagnóstico clínico seconfirmó mediante el examen parasitológico.

Flebótomos

Los flebótomos utilizados para el xenodiagnósticose capturaron directamente en su hábitat silvestre.El procedimiento fue el siguiente: a 12 km de laciudad capital, en la localidad de Las Calderas,donde la fauna de flebótomos está compuestapredominantemente por L. youngi y cuyatemperatura media es un factor limitante para eldesarrollo de Leishmania sp. (30,31), se expuso,en tres distintas ocasiones, cada perro en unajaula de 1,0 x 0,5 m colocada dentro de una trampa

de Shannon confeccionada para tal fin, con unpeso en el borde inferior de la tela, de modo quereposó directa y uniformemente sobre el suelo paraevitar el escape de los flebótomos.

Los insectos se recolectaron de forma manualmediante un aspirador de boca (tubo de Castro),seleccionando las hembras que se posaron sobrela trampa iluminada que, en grupos de cinco,fueron liberadas hasta introducir unas 200ejemplares en el interior de la trampa dondereposaba el perro dentro de la jaula, tras lo cual,se desconectó la lámpara para que se alimentaranad libitum sobre cualquier parte anatómica delanimal evaluado. Transcurrida media hora, serecapturaron los insectos en reposo dentro de latrampa y se confinaron en grupos de 10 hembrasingurgitadas, en envases cilíndricos de vidrio de5 cm de diámetro por 6 cm de alto, revestidosinternamente con una lámina delgada de corchoy sellados con tela de organdí en la boca delfrasco.

Estudio parasitológico directode los flebótomos

Aplicando técnicas previamente probadas(25,30,32), se mantuvieron los flebótomos en uninsectario acondicionado con una temperatura de24°C y humedad relativa de 70%, constantes hastael momento de su disección, a las 120 horasdespués de la ingestión de sangre. Se revisarondiariamente para determinar la mortalidad, a la vezque se mantuvieron hidratados con soluciónsaturada de sacarosa.

Las disecciones se hicieron bajo microscopioestereoscópico siguiendo el protocolo siguiente:previa exposición de los insectos a vapores deéter, se les hicieron lavados y enjuaguessucesivos en solución jabonosa con un detergenteno iónico NP40 y solución salina simple, con elobjetivo de retirar residuos y remover los peloscorporales de los insectos. Luego, se colocaronen láminas portaobjetos y, con agujas entomo-lógicas, se seccionaron sus alas y extremidadespara facilitar el desprendimiento de la cabezaque, al ser delicadamente halada, extraía el tubodigestivo del cuerpo. Una vez separado, secubrió con una lámina cubreobjetos de 25x20 mmpara ser estudiado con objetivo de 40X, a la vez

245


que se emplearon los criterios taxonómicos deYoung y Duncan (33) para verificar que fuera L.youngi la especie de flebótomo empleada en elestudio.

Estudio molecular delos flebótomos parasitológicamentepositivos

Para la identificación molecular de la especie deparásito presente en los flebótomos positivos, sepreparó un extracto crudo de ADN a partir de cadahembra positiva; para ello, se colocaronseparadamente los tractos digestivos de cada unade éstas en tubos Eppendorf que contenían 100ml de una solución Chelex-100 al 5%. Allí semantuvieron a temperatura ambiente hasta elmomento de su procesamiento siguiendo elprotocolo de Harris et al. (34), cuyo ensayoconsiste en un paso único PCR-multiplex para ladetección simultánea de genomas de parásitosde los subgéneros Leishmania (L.) y Viannia (V.)del Nuevo Mundo utilizando secuencias queempalman en el gen ARN (miniexón) según eltamaño del gen y la secuencia del espaciointergénico.

Los iniciadores están construidos de la siguientemanera: LU-5A, 5´-TTTATTGGTATGCGAA ACTTC-3´ que corresponde a una secuencia altamenteconservada y repetitiva en todas las especies deLeishmania, y LM-3A, 5´-GCACCGCACCGG(A/G)CCAC-3´; LB-3C, 5´- CGT(C/G)CCGAACCCCGTGTC-3´; y LC-3L,GCCCGCG(C/)GTCACCACCAT-3´, los cuales generan productos de 218-240 pbpara L. (Leishmania); 146-149 pb para L. (Viannia)y 351-397 pb para L. chagasi. Los controlespositivo y negativo incluidos fueron ejemplaresde colonia de las especies Lutzomyia longipalpisy L. youngi y hembras experimentalmenteinfectadas con Leishmania amazonenzis (MHOM/BR/67/PH8) (35).

Resultados

La localidad estudiada está compuesta por 46viviendas; se censaron 58 perros caseros, de loscuales, 17, pertenecientes a 10 viviendasdistintas, presentaron lesiones sugestivas deleishmaniasis tegumentaria americana. Laconfirmación de la infección, mediante el examen

parasitológico, se logró en dos ejemplares alobservar cada lámina fijada y coloreada duranteunos 30 minutos, registrándose 1 parásito porcada 100 células blancas.

Clínicamente, un ejemplar (Nº1) presentó treslesiones dérmicas (oreja, prepucio y escroto),mientras que el otro (Nº2), presentó una únicalesión en el hocico.

Se tuvo éxito en el aislamiento de parásitosmediante el cultivo in vivo en el perro Nº2, decuyos hámsteres inoculados se observó laformación de discretos granulomas a los tres ymedio meses, de los que se espera laidentificación molecular. Las siembras procuradasen medio agar-sangre resultaron negativas al serrevisadas periódicamente hasta las tres semanasdespués de la inoculación.

En el xenodiagnóstico, el total de flebótomosingurgitados fue de 455. La mortalidad fue totalen las dos primeras evaluaciones y alcanzó parala tercera y última, 49% entre ambos grupos. Apesar de los infructuosos resultados de los dosprimeros ensayos, en la tercera ocasión se registróuna tasa de infección de 6,45% (4/62) para el perroNº1; para el perro Nº2 la mortalidad fue muy alta,y se lograron disecar sólo 13 flebótomos, de loscuales, todos fueron negativos. Considerandoambos grupos de insectos como un total general,se registró 5,33% (4/75) de positividad para esteúltimo ensayo en el que, además, se confirmó,preliminarmente mediante la técnica PCR-multi-plex, la identidad de los parásitos observadoscomo pertenecientes al subgénero Leishmania(Viannia), quedando por determinarse la secuenciadel producto obtenido.

Discusión

Como han reportado Mengistu et al. y Padilla etal. (10,36), el aislamiento de Leishmania sp.mediante cultivo in vitro resultó poco sensible,aspecto que podría estar relacionado con laevolución de la enfermedad (37), ya que en estosanimales sus dueños refirieron no recordar elmomento de aparición de las lesiones dérmicasni la posible causa de su origen.

Mayor sensibilidad mostró el cultivo en el animalexperimental, en los que el crecimiento lento y

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discreto de los histiocitomas concordó concaracterísticas macroscópicas del desarrollo deLeishmania dermótropas (7).

El método empleado para xenodiagnóstico fue unensayo en el que se procuró reproducir lo máscercanamente posible el contacto de los insectoscon el mamífero en condiciones naturales. En tresintentos anteriores, haciendo uso de la meto-dología empleada por Rojas y Scorza (25), losflebótomos capturados se confinaron y, luego,expusieron sobre las lesiones y otras partesanatómicas de los perros evaluados, con unéxito de alimentación muy bajo (menor al 10%),sumado a una alta mortalidad (observaciones sinpublicar).

Nuestros hallazgos de infección en los flebótomosdisecados confirman que L. youngi, especieabundante en la localidad estudiada, es suscep-tible a infectarse con Leishmania del subgéneroViannia al alimentarse sobre el perro casero. Eninvestigaciones previas se logró con estatécnica la infección experimental de esta especiede flebótomo en 5,56% (4/72) al ser alimentadossobre Didelphis marsupialis inoculados con L.braziliensis (32) y, en otro ensayo, al seralimentados sobre lesiones de 8 personas, seobtuvieron tasas de infección entre 4 y 20% (25).

En los perros de nuestro estudio, los flebótomostuvieron oportunidad de picar sobre las lesiones uotra parte anatómica del animal; aun teniendo encuenta que el perro sobre el cual se infectaron losflebótomos presentaba lesiones múltiples,inferimos que muchas hembras se alimentaronsobre piel intacta, pues en ensayos previospracticados sobre este mismo animal, aplicandouna metodología distinta para el xenodiagnóstico(25), en la que se controló la cantidad de insectosexpuestos sobre distintas áreas corporales,observamos un mayor porcentaje de ejemplaresingurgitados sobre piel intacta.

Este hecho sugiere la posibilidad de que los perrosinfectados, aparentemente sanos, pudieran serfuente de infección para flebótomos vectores,como se ha demostrado para la leishmaniasis vis-ceral (38), en la que el perro es el reservorio de laenfermedad y se ha estudiado la asociaciónentre su signología clínica y su capacidad

infecciosa, determinándose que el estado clínicodel perro no tiene influencia sobre su estadoinfecciosa (39).

Se ha demostrado mediante modelos estadísticosla asociación entre las prevalencias de laenfermedad en la población humana y de lainfección en caninos de áreas endémicas (18,40).Sin embargo, queda por investigar la influenciaque tiene la presencia de lesiones dérmicas encaninos como factor de riesgo para la presenciade la enfermedad en humanos.

La PCR para detectar ADN parasitario en el vec-tor ha demostrado una alta sensibilidad enensayos de capturas de insectos silvestres (35),lo cual sugiere que su uso podría aumentarsignificativamente la sensibilidad del xeno-diagnóstico.

Los hallazgos de este trabajo reafirman lacapacidad de L. youngi para infectarse con L. (V.)braziliensis e incentivan el uso de la técnica dexenodiagnóstico en perros. Por ser los perros unapoblación susceptible de contraer y actuar comoreservorios de leishmaniasis tegumentariaamericana, la búsqueda activa y el examen deanimales con lesiones dérmicas podría ser unamedida adicional útil en la vigilanciaepidemiológica.


Este trabajo se llevó a cabo en el Instituto Ex-perimental “José Witremundo Torrealba”en elLaboratorio de Control de EnfermedadesMetáxenicas y Transmisibles con supervisión yaprobación del Comité de Bioética.

El procesamiento molecular se llevó a cabo en elCentro de Investigaciones en Ciencias de la Salud,Universidad de Oriente, Núcleo Anzoátegui,Barcelona, Venezuela.

Los autores declaramos que no existe conflictode intereses que puedan afectar los resultadosde esta investigación.

Financiación

Consejo de Desarrollo Científico Humanístico yTecnológico de la Universidad de Los Andes:NURR-C-335-03EM; NURR-H-226-03-09B y ADG-CVI-NURR-03-95.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):249-53 CUTANEOUS LEISHMANIASIS IN COLOMBIAN DOGS

COMUNICACIÓN BREVE

Leishmania (Viannia ) braziliensis infectionin two Colombian dogs:

a note on infectivity for sand flies and response to treatmentBruno L. Travi, Carlos Javier Tabares, Horacio Cadena

Centro Internacional de Entrenamiento e Investigaciones Médicas, Cali, Colombia.

Introduction. Although canine cutaneous leishmaniasis has been reported in several foci ofSouth America, no published information from Colombia is available.Objective. We report on two cases found in the Pacific coast region of this country, whichpresented as a single scrotal ulcer in one dog, and two ulcers on the external surface of the earin a second dog.Materials and methods. Parasites were isolated by culture in Senekjie’s culture medium andidentified using monoclonal antibodies. The capacity of these dogs to transmit the parasites tosand fly vectors (Lutzomyia trapidoi, Lutzomyia gomezi, Lutzomyia longipalpis, Lutzomyiayoungi) was tested by allowing the flies to feed on the lesion borders.Results. Both isolates were identified as Leishmania (Viannia) braziliensis. No infections weredetected upon dissection of engorged flies. A single peri-and sub-lesional injection of 1-2 ml ofpentavalent antimony in the dog with ear lesions resulted in clinical cure 6 weeks post-treatment.Conclusions. These observations suggest that although dogs are susceptible to L. braziliensis,their reservoir competence could be low. However, if further studies indicate that canines arecapable reservoir hosts of L. Viannia spp., the local treatment of lesions could become afeasible approach to diminish the risk of human infection in the peridomestic setting, withoutsacrificing infected dogs.

Keywords: Leishmania braziliensis, dog diseases, cutaneous leishmaniasis, Leishmaniareservoir, therapy

Infección por Leishmania (Viannia ) braziliensis en dos perros colombianos: una nota sobreinfectividad para flebótomos y respuesta al tratamiento.

Introducción. A pesar de que la leishmaniasis cutánea canina ha sido reportada en variosfocos de Sudamérica, no existe información publicada de Colombia.Objetivo. Se reportan dos casos hallados en la región de la costa Pacífica de este país, que sepresentaron como una úlcera escrotal única en un perro y como dos úlceras en la cara externade la oreja en un segundo individuo.Materiales y métodos. Los parásitos fueron aislados por cultivo en medio de Senekjie eidentificados empleando anticuerpos monoclonales. La capacidad de los perros para transmitirparásitos a los flebótomos vectores (Lutzomyia trapidoi, Lutzomyia gomezi, Lutzomyialongipalpis, Lutzomyia youngi) se ensayó permitiendo que los insectos se alimentaran sobreel borde de las lesiones.Resultados. Ambos aislamientos se identificaron como Leishmania (Viannia) braziliensis. Nose detectaron infecciones durante la disección de los flebótomos alimentados. Una solainyección peri- y sub-lesional de 1-2 ml de antimonio pentavalente en el perro con las lesionesauriculares resultó en la curación clínica a las 6 semanas post-tratamiento.Conclusiones. Estas observaciones sugieren que aunque los perros son susceptibles a L.braziliensis, su competencia como reservorio podría ser baja. Sin embargo, si estudiosposteriores demuestran que los caninos tienen capacidad de reservorio para especies de L.Viannia, el tratamiento local de las lesiones podría ser una estrategia factible para disminuir elriesgo de infección humana en el peridomicilio, sin necesidad de sacrificar a los perrosinfectados.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):249-53TRAVI B.L., TABARES C.J., CADENA H.

Palabras clave: Leishmania braziliensis, leishmaniasis cutánea, enfermedades de los perros,terapia

Corresponding:Bruno L. Travi, CIDEIM, Apartado Aéreo 5390, Cali, Colombia.Telephone: (572) 668 2164; fax: (572) 667 [email protected]


The natural infection of dogs with Leishmania(Viannia) spp. in rural and periurban areas of SouthAmerican countries such as Argentina, Brazil, Perúand Venezuela has been reported by severalauthors (1-8). However in Colombia, where threespecies of Leishmania (Viannia) are endemic (9),no published information on canine cutaneousleishmaniasis is available.

There is no doubt that dogs play an essential rolein the peridomestic transmission of visceralleishmaniasis (10), yet only risk factor analysesand isolation of Leishmania from lesions havesuggested that they could play a role in Americancutaneous leishmaniasis (1,7,11), and conse-quently confirmatory studies are still pending. Wereport on two cases of canine leishmaniasis inadult male, mongrel dogs residing in different en-demic areas of cutaneous leishmaniasis in theColombian Pacific coast.


The first individual suspicious of having cutaneousleishmaniasis, an adult male, was found during adog screening for American cutaneous leishma-niasis (n=52 dogs) in the municipality of Tumaco,Nariño (1°48’N, 78°46W), an area endemic forcutaneous leishmaniasis. The animal, which wasthe only individual with lesions, had a chronic scro-tal ulcer of unknown evolution time. The seconddog, also an adult male, resided in Bajo Calima,municipality of Buenaventura (4°2' N, 77°4’W), asmall rural town distant 30 km from the Pacificcoast in the department of Valle del Cauca. It wasbrought to CIDEIM for diagnosis, presenting alarge ulcer and a satellite lesion on the externalface of the ear, of less than 6 months of evolution(figure 1a). Dermal scrapings stained with 2%Giemsa and aspirate-cultures (n=4) seeded inSenekjie’s culture medium of samples obtainedfrom the lesion borders were used as diagnostic

methods (12). To test the capacity of these dogsto transmit Leishmania to sand flies, the animalswere subjected to xenodiagnosis. For thispurpose, Lutzomyia trapidoi and Lutzomyiagomezi, which are the prevalent sand fly speciesin this region (13), were collected in the field, andgroups of 50 -100 female flies were caged in 500ml plastic containers furnished with fine mesh.The dogs were anesthetized with xylacine (2 mg/kg; Rompun®, Bayer) and the lesion bordersexposed for 30' to the bites of sand flies. Between30 and 40 flies took a blood meal on each dog.

The individual with the ear lesions also was ex-posed to colonized Lutzomyia longipalpis (n=20engorged), the common Leishmania infantum (=L. chagasi) vector in the Americas, which is widelyused as experimental vector for several Leishma-nia species including Leishmania (Viannia) spp.(14). Also, wild-caught Lutzomyia youngi (n=10engorged), a natural vector of cutaneous leish-maniasis in South America, was used in the latterindividual (15,16). Engorged flies were maintainedon a sugar water diet, and dissected 6-7 days post-feeding, when parasites regularly multiply andmigrate to the anterior midgut and stomodeal valve(17).

Results

Although no amastigotes were detected in eitherdog by microscopic examination of dermalscrapings, promastigotes readily grew inSenekjie’s culture medium after one week ofincubation at 25°C. Both isolates were identifiedas Leishmania braziliensis using a panel ofmonoclonal antibodies that discriminates betweendifferent species of the subgenus Viannia (18).No gut infections with Leishmania promastigoteswere detected in any of the sand flies fed on eitherdog upon individual dissection of the flies.

Only the dog with ear lesions was available fortreatment, and based on previous reports ofsuccessful local therapy we decided to apply asimilar approach. Between 1 and 2 mL ofmeglumine antimoniate (Glucantime®) were in-jected subcutaneously at different sites aroundand under the lesions. Although only one injection

251


was applied, the ulcers began to heal 15 daysafter treatment and clinical resolution was achievedin approximately 6 weeks, with hair regrowth andonly a small, flat scar (figure 1b). Aspirates fromthe scar obtained at this time point were negativeby culture; no clinical follow-up of this individualwas possible beyond this period.

Discussion

The results suggest that despite the fact that ca-nines are susceptible to L. braziliensis, develop-ing cutaneous lesions, their reservoir status inAmerican cutaneous leishmaniasis should beevaluated in greater detail if control measures tar-geted at this species are to be applied. Vexenatet al. (19) were capable of infecting a low propor-tion of Lutzomyia whitmani (1.8-8.3%) by feedingthem on the lesions of 3/9 dogs naturally infectedwith L. braziliensis.

It is conceivable that our negative results weredue to the low number of amastigotes present inthe lesions, as suggested by the absence of para-sites in the dermal scrapings. On the other hand,it is feasible that the number of sand flies fed onthe dogs (<50) per xenodiagnosis was insufficientto detect truly infective individuals.

More recent work in our laboratory involving pa-tients with cutaneous leishmaniasis suggested

that xenodiagnoses carried out with less than 50engorged flies have low sensitivity, even in pa-tients showing large numbers of amastigotes inthe lesions (CIDEIM, unpublished). Therefore,negative xenodiagnoses obtained upon dissectionof fewer than 50 sand flies should be interpretedwith caution.

Nevertheless, the observations made on these twodogs contrasted with xenodiagnoses performedon dogs infected with L. infantum in which para-sites are readily transmitted to sand flies, includ-ing non-natural vector species (20-22). In our case,the low reservoir competence was emphasizedby the negative results obtained with Lutzomyiatrapidoi, L. gomezi, and L. youngi, which areproven vectors of cutaneous leishmaniasis(13,15), and have shown to acquire Leishmaniaat high rates (37-44%) after feeding on laboratoryanimals experimentally infected with L. Viannia(23; CIDEIM unpublished).

It is interesting to note that in the Pacific coastregion of Colombia Leishmania (Viannia)panamensis accounts for the majority (>90%) ofhuman cases (24), but the only two dogs that wehave found with skin ulcers were infected with L.braziliensis. Although this may be a fortuitousobservation, further field and experimental studiesare necessary to assess dog susceptibility to

Figure 1. Cutaneous leishmaniasis due to Leishmania (Viannia) braziliensis in a mongrel dog. A primary ulcer and smallsatellite lesion (arrow) on the external surface of the ear were present at the time of diagnosis (left). Clinical cure wasachieved in approximately 6 weeks after a single peri-lesional injection of pentavalent antimony was applied (right).

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Biomédica 2006;26(Supl.1):249-53TRAVI B.L., TABARES C.J., CADENA H.

Leishmania (Viannia) spp. and establish the res-ervoir role in Colombian foci of American cutane-ous leishmaniasis. Studies in Brazil have shownthat the majority of lesions were localized on theears (63.6% of all lesions detected), and this mayhave epidemiological implications because in otherLeishmania species (L. infantum) we determinedthat transmission to sand flies was more efficientat this site than in other body areas (21,25).

Systemic and local therapy for canine cutaneousleishmaniasis using pentavalent antimonials haveresulted in cure rates ranging from 80.9 to 86.6%,however in the intramuscular treatment clinicalresolution was followed by recurrence in a highpercentage of animals (>40%) (5,25). Clinical cure,even in the absence of parasite clearance, couldbe beneficial to reduce potential reservoircompetence. Therefore, if canines prove to beefficient sources of Leishmania for the naturalvectors, treatment of skin ulcers with localinjections of pentavalent antimonials could becomea reasonable approach to diminish the risk ofhuman infection in the peridomestic setting withoutsacrificing infected dogs.


The authors of the present article declare that thereare no conflicts of interest that may haveinfluenced the results of this work.

Financing

This study was partially supported by TMRC grantn° I-P50 AI 30603-03, and CIDEIM.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):254-63SALDARRIAGA O.A., TRAVI B.L., MELBY P.C.

NOTA TÉCNICA

Quantification of canine cytokines using real timereverse transcriptase polymerase chain reaction

Omar A. Saldarriaga 1,2,3, Bruno L. Travi 1,3, Peter C. Melby 1,2,3

1 Research Service, Department of Veterans Affairs Medical Center, South Texas Veteran Health CareSystem, San Antonio, Texas.

2 Department of Microbiology and Immunology, The University of Texas Health Science Center, San Antonio,Texas.

3 Department of Medicine, The University of Texas Health Science Center, San Antonio, Texas.

Introduction. Canines are the principal domestic reservoirs of visceral leishmaniasis in boththe Old and New World. The development of highly sensitive and quantitative methods, such asreal time reverse transcriptase polymerase chain reaction for measurement of canine cytokineshas not been exploited in studies of visceral leishmaniasis.Objective. To standardize the relative quantification of canine IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-12p40 andIL-12p35 using real time reverse transcriptase polymerase chain reaction.Materials and methods. RNA was isolated from PBMCs from 1 year–old foxhounds and culturedwith or without Con A, LPS or Staphylococcus aureus extract. This RNA was used in one-stepreal time reverse transcriptase polymerase chain reaction to optimize the concentrations of thecytokine primers and probes, generate standard curves for each cytokine, confirm equivalentamplification efficiency of cytokine and normalizer (18S rRNA) RNA, and to quantify theexpression of the cytokine RNA. The comparative Ct method was used to determine the relativelevels of gene expression in the samples, expressed as the fold-increase relative to the controlsamples.Results. The regression coefficient for the standard curves and the amplification efficiencies ofthe cytokine and normalizer RNA indicated that the quantification was reliable over a broadconcentration range of input RNA. Relative to control cells, activation of PBMCs led to increasedexpression of IFN-γ (132-fold), IL-4 (8.8-fold), IL-10 (7.2-fold), and IL-12p40 (275-fold). Basalexpression of IL-12p35 was also detected.Conclusion. This approach provides several advantages over conventional assays for cytokinemeasurement and can be exploited in the study of the immunopathogenesis and immunity incanine leishmaniasis.Key words: dogs, cytokines, reverse transcriptase polymerase chain reaction, visceralleishmaniasis, T-Lymphocytes.

Cuantificación de citocinas caninas mediante reacción en cadena de la polimerasa detranscriptasa reversa en tiempo real

Introducción. Los caninos son el principal reservorio domestico de la leishmaniasis visceralen el Nuevo y Viejo mundo. La reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa reversaen tiempo real para la medición de citocinas caninas no ha sido implementada para el estudiode la leishmaniasis visceral.Objetivo. Estandarizar la cuantificación relativa de IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-12p40 y IL-12p35caninas utilizando reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa reversa en tiemporeal.Materiales y métodos. Células mononucleares de sangre periférica de perros Fox-Houndfueron estimuladas con ConA, LPS y extracto de Staphylococcus aureus. El ARN fue utilizadoen la reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa reversa en tiempo real de un solopaso para optimizar las concentraciones de iniciadores y sondas especificas de cada citocina,generar curvas estándar, confirmar la eficiencia de amplificación de las citocinas y delnormalizador (18S ARNr) y cuantificar la expresión de ARN. El método comparativo Ct fue


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Biomédica 2006;26(Supl.1):254-63 CITOCINAS CANINAS DETECTADAS POR RT-PCR EN TIEMPO REAL

utilizado para determinar los niveles relativos de expresión de ARN en las muestras, expresadocomo el incremento en el número de veces comparado con los controles.Resultados. El coeficiente de regresión para las curvas estándar y las eficiencias deamplificación de las citocinas y el normalizador, indicaron que la cuantificación fue confiableen un amplio rango de concentraciones de ARN. La activación de células mononucleares desangre periférica resultó en un incremento en la expresión de IFN-γ (132), IL-4 (8.8), IL-10(7,2), y IL-12p40 (275), relativo a células control. La expresión basal de IL-12p35 fue tambiéndetectada.Conclusión. Esta metodología, comparada con los métodos convencionales disponibles parala medición de citocinas, ofrece varias ventajas y podría ser utilizada en estudios sobreinmunopatogenia e inmunidad en leishmaniasis visceral canina.

Palabras clave: perros, citocinas, reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa reversa,leishmaniasis visceral, linfocitos T.

Canines are the principal domestic reservoirs ofvisceral leishmaniasis in both the Old and NewWorld, and for this reason major efforts to controlLeishmania infantum (=L. chagasi) transmissionhave targeted the dog. Because dog culling hasshown conflicting results with regard to L.infantum control, a more recent approach to makecanines less efficient reservoirs is to developvaccines that could significantly decrease theinfectivity for sand fly vectors (1). Although thereis substantial information on both humoral and cell-mediated immunity of dogs infected with L.infantum, new molecular methodologies such asreal time reverse transcriptase polymerase chainreaction (RT-PCR) have not been exploited instudies of visceral leishmaniasis. Therefore, thedevelopment of sensitive and reliable moleculartools for assessing the immune response of dogshas become of particular interest.

It is well established that cytokines play a pivotalrole in the development and maintenance ofcellular immunity against the majority of infectiousagents. The quantification of cytokine expressionin leishmaniasis is especially important since it isa critical determinant of susceptibility and resis-tance to disease (2) and vaccine-induced immu-nity (3,4). Recently, semi-quantitative RT-PCR has

been used to determine expression of cytokinesin normal dogs and during disease evolution indogs naturally or experimentally infected with L.infantum (5-10). RT-PCR was also employed todetermine the cytokine profile of asymptomaticdogs experimentally infected with L. infantum (11).Collectively, these results indicated that duringactive disease there is mixed Th1/Th2 cytokineexpression and that asymptomatic dogs prefer-entially expressed Th1-type cytokines, which wasassociated with parasite containment and no pro-gression towards overt disease.

Because the samples available to be analyzedare often too small for evaluating cytokines at theprotein level, the detection of mRNA by RT-PCRis widely used to investigate the cytokine profilesin different tissues. However, this techniquerequires intensive manipulation (the multiple stepsof reverse transcription, PCR, gel electrophoresisand detection, and semi-quantitiativedensitometry) to obtain only a semi-quantitativelevel of analysis. Recently, real time RT-PCR hasbeen shown to be a more accurate and sensitivemethod for quantifying messenger RNA.

This new approach exploits the 5’ nuclease activ-ity of DNA polymerase (12), to cleave a TaqManprobe that is labeled with a reporter fluorescentdye [FAM (6-carboxy-fluorescein)] covalentlylinked to the 5’ end, and a quencher fluorescentdye [TAMRA (6-carboxi-tetramethyl-rodamine)]linked at the 3’ end.

When the probe is intact, the reporter dye emis-sion is quenched owing to physical proximity ofthe reporter and quencher fluorescent dyes, pri-marily by Foster-type energy transfer (13). During

Correspondencia:Peter C. Melby, Department of Medicine, Division of Infec-tious Diseases, The University of Texas Health ScienceCenter, 7703 Floyd Curl Drive, San Antonio, Texas 78229-3900.Phone: (210) 567 4614; Fax: (210) [email protected]


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the extension phase of the PCR cycle, however,the nucleolytic activity of the DNA polymerasecleaves the hybridization probe and releases thereporter dye from the probe, resulting in increasedfluorescence of the reporter only if the probe hy-bridizes to the target. The probe fragments arethen displaced from the target, and polymeriza-tion of the strand continues. The fluorescent dyeemission is monitored in real time during PCRamplification using a detector.

A computer algorithm compares the amount ofreporter dye emission (R) with the quenching dyeemission (Q) every 8.5 seconds during the PCRamplification, generating a DRn value (R/Q) whichreflects the amount of hybridization probe that hasbeen degraded. The algorithm calculates the cycleat which each PCR amplification reaches a sig-nificant threshold (Ct). This Ct value is propor-tional to the number of target copies present inthe sample. Thus, the Ct value is a quantitativemeasurement of the copies of the target found inany sample (14). The relative expression analysisbased on real time analytical reverse transcription(RT-PCR) offers several advantages over othercurrent quantitative methods. It has proved to berapid, reliable, and highly sensitive method toquantify the simultaneous expression levels of alarge number of genes.

Real time RT-PCR has been successfully appliedto the quantification of several cytokines in canineintestinal mucosa (15). Here we describe in detailthe standardization of real time RT-PCR forquantification of the expression levels of IFN-gamma, IL-4, IL-10, IL-12-p40, IL-12-p35. We vali-dated the methodology by quantifying the cytokineexpression in activated canine peripheral bloodmononuclear cells (PBMC).


Dogs

8-12 month-old outbred Foxhound dogs were ob-tained from Marshall Farms USA, Inc. (North Rose,NY) and maintained in the ALAAC-approved ani-mal facility at UTHSCSA. Animals were handledaccording to local and federal regulations and re-search protocols were approved by the UTHSCSAInstitutional Animal Care and Use Committee.Dogs were screened and treated for intestinal

helminth infection prior to vaccination. Exceptwhere noted, there were 4 dogs per experimentalgroup.

Cell isolation and culture for cytokine analysis

Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) wereisolated from heparinized blood using standardNycoPrep 1.077/265 animal gradient centrifuga-tion (Accurate Chemical Westbury, NY). In orderto determine cytokine expression, several differ-ent stimuli known to activate PBMCs were em-ployed.

These cells were cultured at a density of 4x106

cells/mL in RPMI 1640 medium supplemented with10% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 100 IUof penicillin/mL, 100 µg of streptomycin/mL and10-5 M 2-mercaptoethanol (Sigma, St. Louis, MO).Assays were conducted in 2 mL round-bottomedpolypropylene tubes incubated at 37°C, 5% CO2at different time points. PBMCs were stimulatedwith either concanavalin A (ConA; Sigma, St.Louis, MO) (2.5, 1.25. 0.625 .0.3125 and 0.1562µg /mL), lipopolysaccharide (LPS, E. coli 0111B4;Sigma, St. Louis, MO) (100 ng/mL) or 0.05% Sta-phylococcus aureus extract (Pansorbin;Calbiochem, San Diego, CA). After each time pointthe cells were washed once with cold PBS and180 µL of RNAlater (Ambion Inc. Austin, TX) wereadded to cellular pellet for RNA preservation. Thecells were stored at 4°C until the RNA extractionwas carried out.

In one case (standardization of IL-12p35 PCR) theDH82 canine macrophage cell line (obtained fromATCC; No. CRL-10389) was used. The cells weregrown to confluence in complete medium(Minimum Essential Medium Eagle with 15% heatinactivated fetal bovine serum, 1% Hepes buffer,2 mM L-glutamine, 1 mM Sodium pyruvate, 1500mg sodium bicarbonate/L, 100 U/ml of penicillin,and 100 mg/ml of streptomycin) and harvestedwith 0.25 mg/ml trypsin in PBS, washed, and usedfor RNA isolation.

RNA isolation

Ten volumes of RNA lysis buffer (RLT)(guanidinium based) were used to dilute thesamples (in RNAlater) and the RNA was recoveredaccording to the manufacture’s protocol (QIAGEN

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Inc. Valencia, CA). Finally, total RNA was elutedfrom the columns in 50 µl of nuclease-free water.To make the DNA more susceptible to DNase di-gestion the RNA was heated 3 minutes at 95°Cthen quenched on ice and treated with 5 ml (50units) of RNase-free DNase and 50 µL of DNAsedigestion buffer (Stratagene, Cedar Creek, TX).After 1 hour incubation at 37°C, the RNA wasextracted once again and eluted in a final volumeof 35 µL of nuclease free water and stored at –70°Cuntil used.

Primers and probes

Except for the endogenous control, ribosomal RNAcontrol reagents (VIC Probe, Applied Biosystems,Foster City, CA), all primers and probes used inthis study (sequences listed in table 1) were syn-thesized at Midland (Texas), and were designedaccording with Primer Express software (AppliedBiosystems, Foster City, CA). In all cases exceptIFN-g the primers and/or probe were located ondifferent exons. The internal probe was labeled atthe 5’ end with the reporter dye FAM (6carboxyfluorescein), and the 3’ end with the

quencher dye TAMRA (6-carboxy-tetra-methil-rhodamine).

The length of the PCR products (table 1) variedbetween 67-75 basepairs. Each primer pair wasoptimized at different temperatures (55 and 60°C)and 3 different concentrations (100, 300, 600 nM),using a fixed amount of target template. The opti-mal performance was achieved by selecting theprimer concentrations that provided the lowestcycle threshold (Ct) and highest magnitude of thesignal generated by the PCR (DRn). Similarly, theprobe concentration was optimized by 50-200 nM.

Standard curves and amplification efficiencies

Using one step RT-PCR Taq Man reagents (Ap-plied Biosystems), two fold serial RNA dilutionswere employed to produce a standard curve andcalculate the reaction efficiency for the targetgenes and the normalizer 18S rRNA. Purified RNAfrom canine PMBCs stimulated with ConA (2.5gg/ml) was used for determining the standard curvefor IFN-γ, IL-4, and IL-12 p40/35, while LPS wasused for IL-10. A graph of threshold cycle (Ct)versus log ng total RNA from the dilution series

Table 1. Oligonucleotides for RT-PCR.

Target Oligo 1 Priming site Oligonucleotide sequence (5’ → 3’) Product Primer/(cDNA) 2 size probes 3

Fw (553 → 573) AGGAAGCGGAAAAGGAGTCAG 100nMIFN-γ Rv (599 ← 619) GGCAGGATGACCATTATTTCG 67 bp 100nM

Probe (576 ← 597) TGCTCTGCGGCCTCGAAACAGA 100nM

IL-12 Fw (675 → 693) CACCAGCAGCTTCTTCATCAGA 300nM p40 Rv (722 ←741) CAATGGCTTCAGCTGCAGGT 67 bp 300nM

Probe (695 → 720) ACATCATCAAACCAGACCCACCCACA 100nM

IL-12 Fw (337 → 354) TGCCTGGCCTCTGGAAAG 600nMp35 Rv (392 ← 410) TACATCTTCAAGTCCTCAT 74 bp 600nM

Probe (363 → 390) TATGACGGTCCTGTGCCTTAGCAGCATC 100nM

Fw (185 → 205) TCCTCACAGCGAGAAACGACT 300nMIL-4 Rv (240 ← 259) CGCTTGTGTTCTTTGGAGCA 75 bp 300nM

Probe (208 ← 233) ACGTCCTTGACAGTCAGCTCCATGCA 100nM

Fw ( 361→ 378) CAGGCTGAGACTGAGGCT 300nMIL-10 Rv (409 ← 428) CCACCGCCTTGCTCTTATTC 68 bp 300nm

Probe (382 → 407) ACGCTGTCACCGATTTCTTCCCTGTG 100nM

1 Fw: forward primer; Rv: reverse primer; probe labeled with 6 FAM at the 5’-end and quenched with TAMRA at the 3’-end.

2 The position of the primers relative to the published canine cDNA sequences (accession numbers: AF126247 [IFN-g];U49100 [IL-12p40]; U49085 [IL-12p35]; AF187322 [IL-4]; U33843 [IL-10]).

3 Final concentration of primers and probes after titration.

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was produced. The difference between the cytokinetarget gene and the normalizer (18S rRNA) or thedelta Ct value was plotted against the log of theng total RNA concentration to estimate the ampli-fication efficiency. For the amplification of the tar-get and housekeeping genes to have equivalentefficiency the plot of the delta Ct and RNA con-centration should have a low regression coeffi-cient (<0.1).

One tube RT-PCR

Each sample was assayed for cytokine mRNAexpression and for 18S rRNA as an endogenouscontrol (normalizer) in the same tube in 25 µl RT-PCR mixture. Samples were assayed in triplicatetubes (25 µl each) obtained from a 100 ml reac-tion mixture that contained a specific concentra-tion of target and normalizer primers (from 100nM to 600 nM) and probe (100 nM), 50 ml of 2Xmaster mix, 2.5 mL of 40X multiScribe (both inTaqMan one-step RT-PCR master mix reagents,Applied Biosystems) and 10 ng of template.

The samples were placed in Micro Amp opticaltubes, (Applied Biosystems) and amplified in anautomated fluorometer (ABI Prism 7700 sequencedetection system; Applied Biosystems). Amplifi-cation conditions were 48°C/30 min (reverse tran-scription), 95°C/10 min (ampliTaq gold activation),95°C/15 sec (PCR, denature) and 60°C/1 min(PCR anneal/ extend). The spectral compensa-tion for the post run analysis was made to im-prove dye spectral resolution. The results wereexpressed in relative mRNA quantities of anygiven cytokine to the reference samples(unstimulated PBMCs) using the comparative(DDC

T) method (16).

Relative mRNA expression data calculation

The comparative Ct method (∆∆Ct) for relativequantification of gene expression. This methodenables relative quantitation of template and in-creases sample throughput by eliminating the needfor standard curves. The values are expressedrelative to a reference sample (called the calibrator,unstimulated PBMC sample). For this method tobe successful, the dynamic range of both the tar-get and the reference should be similar. A sensi-tive method to control this is to look at how ∆Ct

(the difference between the two CT values of twoPCR for the same initial template amount) varieswith template dilution.

If the efficiencies of the two amplicons are ap-proximately equal, the plot of log input amountversus DCt will have a nearly horizontal line (aslope of <0.10) and this means that both PCRperform equally efficiently across the range of ini-tial template amount. If the plot shows unequalefficiency, the standard curve method should beused for quantitation of gene expression. It isexpected that the normalizer will have a higherexpression level that the target (thus, a smallerCt value).

In this way the Ct for the target and the Ct for theinternal control were determined for each sample.Differences in the Ct for the target and the Ct forthe internal control, called ∆Ct were calculated tonormalize for the differences in the amount of totalnucleic acid added to each reaction and the effi-cacy of the RT step. The ∆Ct for each experi-mental sample was substracted from the ∆Ct ofthe calibrator, this difference is called the ∆∆Ctvalue. If the calibrator is representing the minimumlevel of expression, the ∆∆Ct values are expectedto be negative. The last step in quantification isto transform these values to absolute values, asfollow; 2-(∆∆Ct). Thus, all the experimentalsamples are expressed as an n-fold differencerelative to the calibrator (17).

Results

Determination of optimal primer concentra-tion and annealing temperature

The optimal performance of the real time RT-PCRassay was achieved by selecting the primerconcentrations that provided the lowest CT andhighest ∆Rn for each cytokine (table 1). We foundthat the optimal (17) and most cost-efective primer/probe concentrations were 100 nM/100 nM for IFN-g, as this concentration gave the greatest signaland breadth of experimental linear amplificationand equivalent Ct value (figure 1A). Using thesame approach, the optimal primer/probeconcentrations were determined for IL-4, IL-10, IL-12p40 and IL-12 p35 (table 1 and data not shown).All the cytokines amplified properly at a 60°C of

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Figure 1. Standard curve and amplification efficiency forcanine IFN-γ real time RT-PCR. (A) identification of optimalprimer concentrations. Real time RT-PCR was set up with 3different concentrations of primers: 100, 300 and 600 nM.Shown is the real time amplification tracing with the 100 nMconcentrations showing the greatest fluorescence intensity(∆∆∆∆∆Rn). (B) IFN-γ standard curve. Two-fold serial dilutions ofRNA from PBMCs from different animals stimulated with ConAfor 48 hr were amplified. The average Ct values of triplicatesamples are plotted against the log of the ng total RNA andthe slope of the line with regression coefficient is shown. Thestandard deviations were so narrow they are not included inthe graph. (C) Determination of amplification efficiency. Thecomparative Ct method for relative quantification requiresthat the efficiency of target (IFN-gamma) and normalizer(18S rRNA) amplified in the same tube are approximatelyequal (the absolute value of the slope should be approximately0.1). Standard curves of IFN-γ and 18S rRNA were used todetermine the amplification efficiency. Shown is the plot oflog input amount of RNA versus the delta Ct and the absolutevalue of the slope was 0.034.

annealing temperature, except for IL-12 p35, whichamplified at 55°C.

Standard curves and amplification efficiencies

The regression coefficient (R2) for the standardcurves of the different cytokines was determinedby plotting the Ct data against the log of total RNA.We found a high R2 value for all of the cytokines,i.e., IFN-g: 0.989 (figure 1B); IL-4: 0.979, IL-10:0.989, IL-12–p40: 0.941, IL12-p35: 0.977 (curvesnot shown), indicating that there was a linear am-plification over a broad range of concentrations.The efficiency (Eff) of the reaction can be calcu-lated by the formula:

Efficiency =10(-1/slope) -1

The efficiency of the PCR should be 90 - 100%(– -3.6 > slope > – -3.1). A number of variablescan affect the efficiency of the PCR, these fac-tors include length of the amplicon, secondarystructure and primer quality. The amplification effi-ciencies for each of the cytokines were accept-able with each of the regression coefficients beingapproximately 0.1: IFN-γ: 0.03 (figure 1C); IL-4:0.03; IL 10: 0.18; IL-12–p40: 0.04; IL12-p35: 0.11(curves not shown). This indicates that over abroad concentration range of input RNA the rateof amplification of normalizer and cytokinetemplate remains the same.

Relative quantification of mRNA

Once the real time RT-PCR was standardized itwas validated by determining the relativeexpression of cytokines in resting and activatedcanine PBMCs. Total RNA from the PBMCs wassubjected to single tube RT-PCR using thecytokine and the normalizer (18S) primers. Todetect the possibility of genomic DNAcontamination in the samples, a control tubewithout reverse transcriptase was included. Noamplification for cytokine cDNAs was observedin the absence of reverse transcriptase.

The relative IFN-γ mRNA expression was deter-mined after stimulation of PBMCs with differentconcentrations of ConA and for different times (0,6, 12, 24, and 48 h). The greatest expression ofthis cytokine was found 6h after stimulation (figure2A) and at a concentration of 2.5 µg/mL of ConA(figure 2B). Since in lymphoproliferative assays

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using 3H incorporation, at least 48h are needed tosee a significant cell proliferation, we stimulatedPBMCs from 4 different canine donors with 2.5µg/mL ConA, and evaluated the samples at thattime point. The expression level of IFN-γ was sig-nificantly greater than unstimulated PBMCs (figure3A), but this was lower compared to the peak ex-pression at 6h (see figure 2A). The stimuli alsoupregulated the mRNA expression of IL-4 (8.8 fold)when compared with unstimulated PBMCs (figure3B).

To quantify canine IL-10 expression, PBMCs werecultured in medium alone or stimulated with LPS

Figure 2. Expression of canine IFN-γ mRNA in stimulatedPBMCs: canine PBMCs were cultured at 37°C in 5% CO2

with ConA for different times and at various concentrations.(A) Time course of IFN-g expression. PBMCs were stimu-lated with 2.5 µg/mL Con A for 6, 12, 24 and 48 h. After eachtime point the cells were collected for RNA isolation and thelevel of expression of IFN-γ mRNA was determined by realtime PCR. (B) Dose response of ConA-induced IFNg ex-pression. PBMCs were stimulated with ConA at 2.5, 1.25,0.625, 0.3125 and 0.1562 µg/ml for 48 h. The data are shownas the fold-increase normalized IFN-g mRNA in stimulatedcompared to unstimulated PBMCs.

(100 ng/ml) for 3, 6, 12, 24 and 48 h. LPS induceda clear but transient expression of IL-10 mRNA inpurified PBMCs, with a peak (7.2 fold) at 6h afterstimulation compared with unstimulated PBMCs(figure 3C). To quantify canine IL-12 expressionwe cultured PBMCs and stimulated them with asuboptimal concentration of ConA (1.25 µg/mL),SAC (0.05%), or both for 3, 6, or 12 h. Under theseconditions IL-12p40 peaked at 6 h after stimulation,reaching higher expression levels (275 fold) thanthose seen in cells stimulated with ConA alone(figure 3D). The constitutive basal expression ofIL-12p35 was detected in the canine DH82- mac-rophage like cell line (data not shown).

Discussion

We have designed and tested primers and probessuitable for real-time RT-PCR quantification ofcanine cytokines that are potentially involved inprotection (IL-12p35, IL-12p40, IFN-γ) orsusceptibility (IL-4, IL-10) to L. infantum.

The standardization method we used has beendescribed here in detail with the aim of makingthese protocols available to other researchers whocould either use these validated real-time PCRprimers and probes or design additional primersfor the study of dog cytokines. Primer concentra-tions were identified that gave optimal signal tonoise ratios and broad dynamic amplificationsranges.

Different approaches to quantify the amount oftemplate can be performed (17). We chose thecomparative Ct method because it does not useknown amounts of standard but compares the rela-tive amount of the target sequence to any of thereference values chosen and the result is givenas relative to the reference value (in our case theexpression level of resting PBMC). Additionally,it is not necessary to have cDNA plasmids for thetarget gene, which are required standards for ab-solute quantification.

Our validation experiment showed that efficien-cies of target and reference were approximatelyequal, which is important for the Ct calculation tobe valid. This enables relative quantification oftemplate without having to set up a standard curvefor each run, and therefore increases samplethroughput. We successfully used two different

261


dyes with distinct emission wavelengths (FAM-for the cytokines and VIC for the 18S rRNA) inthe same tube after spectral compensation for thepost run analysis was applied.

The cytokines presented here are well known tobe transcriptionally regulated so measurement ofmRNA expression is a valid approach.Furthermore, antibody reagents are not readilyavailable for most of the canine cytokines, soexamination of mRNA is often the only approachthat can be used.

There is a wide range of methods that could beused to quantify mRNA expression, such as North-ern blotting, in situ hybridization, RNase protec-tion assays, cDNA arrays, and RT-PCR. RT-PCRhas the ability to quantify cytokine mRNAs thathave low expression levels. Real time RT-PCR isbecoming widely used in the research and clinicalfields (18). Real-time RT-PCR is advantageousover standard RT-PCR (17), because: 1) there isa requirement of 1,000-fold less RNA than con-ventional assays; 2) there is a broad dynamicrange of detection; 3) there is no-post PCR

Figure 3. Expression of cytokines in activated canine PBMCs. (A) IFN-γ expression at 48 hrs after stimulation with 2.5 µg/ml ConA. (B) IL-4 expression at 48 hrs after stimulation with 2.5 µg/ml ConA. (C) IL-10 expression at 6 hrs after stimulationwith 100 ng/ml LPS. (D) IL-12p40 expression at 6 hr after stimulation with suboptimal ConA (1.25 µg/ml) and S. aureusCowan extract (0.05%). The data are shown as the fold-increase (normalized to 18s) of mRNA in stimulated compared tounstimulated PBMCs (IFN-γ, IL-4, IL-10) or maximally stimulated (ConA + SAC) compared to suboptimally stimulated(ConA) in the case of IL-12p40.

262


processing required such as electrophoreticalseparation of amplified DNA; 4) it provides a con-stant record amplification of an amplicon, and 5)as opposed to traditional PCR, which is measuredat end-point (plateau), real-time PCR collects datain the exponential phase (17).

The real-time RT-PCR has been recently appliedto determine the local cytokine response in skinbiopsies from Leishmania infected dogs. Althoughboth Th1 and Th2 cytokine subsets were found tobe part in the local immune response, the expres-sion of Th2 cytokines like IL-4 were associatedwith severe clinical signs and high parasite bur-den in the skin lesions (19). The capacity to de-termine expression of cytokines that are consid-ered to be markers of Th1 or Th2 responses isessential for studying the pathogenesis of visceralleishmaniasis in the dog model, and more impor-tantly, for evaluating candidate vaccines. In sepa-rate immunogenicity studies related to the testingof anti-Leishmania DNA vaccines we have usedthe primers and methods described herein to as-sess the relative expression of cytokines suchas IL-4 and IFN-γ following vaccination (20). Inthis study we observed that intramuscularvaccination induced a strong in vitro antigenspecific IFN-γ but not IL-4 response. Similarly,we were able to perform relative quantification ofIL-12p35/p40 in the canine DH-82 macrophage cellline transfected with a canine IL-12 heterodimericcDNA adjuvant construct (21).

Although real-time RT-PCR for cytokine detectioncould be used in a variety of canine infectious andnon-infectious diseases (15,22), in the particularcase of visceral leishmaniasis, the implementa-tion of this method will complement and improveother methods aimed at characterizing the immuneresponse during asymptomatic infection, diseaseevolution, and following vaccination.


The authors of the present article declare that thereare no conflicts of interest that may haveinfluenced the results of this work.

Financing

This work was supported by NIH grant AI48823awarded to PCM.

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Instrucciones para los autores

Biomédica es la revista del Instituto Nacional deSalud de Colombia cuyo fin primordial es ladifusión de trabajos originales que contribuyan aampliar los conocimientos en biomedicina.

Información general

Biomédica publicará trabajos científicos, escritosen español o en inglés, en las siguientes categorías:

Artículo original: trabajo inédito derivado de unainvestigación biomédica que aporta informaciónnueva sobre aspectos específicos y contribuye demanera relevante al conocimiento científico.

Comunicación breve: es el informe de resultadosparciales o finales de una investigación cuyadivulgación rápida es de gran importancia o cuyocontenido no satisface los requisitos paraconsiderarlo como un artículo original.

Nota técnica: describe en detalle una técnica delaboratorio novedosa o modificaciones realizadasa una técnica ya establecida, enfatizando lasventajas que tiene el procedimiento o la innovacióndesarrollados.

Ensayo: es un manuscrito filosófico, literario ocientífico que presenta la opinión sustentada delautor sobre un tema específico o de actualidad.

Comentario: manuscrito sobre un artículopublicado en la revista.

Reseña histórica: es un manuscrito que destacapersonajes o sucesos y su contribución aldesarrollo de las ciencias biomédicas.

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· presentado por profesionales interesados enun tema particular; en este caso, se debeenviar una propuesta en la que se indiqueporqué el tema escogido es pertinente paralos lectores de Biomédica, el cual debe incluir

una breve descripción del contenido, algunasreferencias claves, su probable extensión y elnúmero aproximado de ilustraciones.

· La revisión debe incluir un resumen con énfasisen el significado de los hallazgos recientes, unaintroducción al tema señalando hitos pasadosy desarrollos presentes, y los encabezamientosdel texto con el objeto de hacer más provechosasu lectura. La revisión debe incluir un análisiscrítico de la literatura y datos propios de losautores. El desarrollo del tema queda adiscreción del autor pero se aconseja queincluya tablas, esquemas y figuras que haganágil el texto y ofrezcan una comprensión másrápida de su contenido.

Imágenes en biomedicina: es un trabajoilustrado con fotografías que muestran y explicande manera didáctica un concepto, una estructura,una enfermedad o un diagnóstico biomédico. Debeincluir un comentario corto que resalte laimportancia del tema ilustrado.

Haga usted el diagnóstico: pretende retar lacapacidad diagnóstica de los lectores, utilizandoilustraciones o fotografías de casos clínicos o dehallazgos microscópicos. Consta de dos partes,la presentación clínica y los hallazgos corres-pondientes y el diagnóstico correcto; este últimoaparece en página aparte y debe acompañarsede un comentario actualizado sobre la entidad quese pretende ilustrar.

Presentación de casos: son ejemplos de casosclínicos de enfermedades que destacan algunaparticularidad llamativa o señalan un hallazgo es-pecial de las mismas, con una revisión breve dela literatura pertinente.

Cartas al editor: los lectores pueden solicitaraclaraciones o presentar comentarios sobre elmaterial publicado en la revista. La decisión sobrela publicación de las cartas recibidas queda adiscreción del Comité Editorial.

Comentarios bibliográficos: son escritoscríticos breves sobre libros de biomedicina.

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Todo material propuesto para publicación enBiomédica será revisado por el Comité Editorial yenviado para evaluación externa a dos evaluadoreso pares científicos; para facilitar este paso, losautores deben enviar el nombre y la dirección decuatro posibles evaluadores. Los editoresinformarán al autor principal que su trabajo ha sidorecibido; posteriormente, le harán llegar loscomentarios de los evaluadores y le harán conocerla decisión final sobre la publicación de sumanuscrito. Los autores deben incluir una cartaen la que expresen si existen conflictos de interéso si no los hay; de la misma forma, deben incluiruna nota sobre la fuente de financiación de lainvestigación adelantada.

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Una vez que el autor reciba los comentarios delos evaluadores, deberá proceder a contestarlospunto por punto y a incorporar las modificacionescorrespondientes en el texto. Si en el transcursode las 6 semanas siguientes, Biomédica no harecibido las respuestas de las evaluaciones, seretirará el manuscrito.

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Preparación del manuscrito

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Panamericana de Salud Pública (Rev PanamSalud Pública 2004;15:41-57).

Después de realizadas la edición y la correcciónde estilo, los autores recibirán las galeradas delartículo, las cuales deben ser cuidadosamenterevisadas y devueltas al Editor en un términomáximo de 48 horas.

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Texto: todo el manuscrito, incluso la página deltítulo, los resúmenes, las referencias, los cuadrosy las leyendas de figuras y cuadros, debe estarescrito a doble espacio, por un solo lado de lahoja, sin dejar espacios extras entre párrafo ypárrafo; deje un solo espacio después del puntoseguido o aparte. Use la fuente Arial de tamaño

Información general sobre los manuscritos

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12 y no justifique el texto. Use letra bastardilla ocursiva para los términos científicos, por favor, nolos subraye.

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citada; si la revista no aparece, escriba el títulocompleto de la revista. Transcriba únicamente losseis primeros autores del artículo, seguidos de etal. Se recomienda la inclusión de referenciasnacionales y latino-americanas para lo cual puedeconsultar Lilacs, Latindex, Sibra, el índice deColciencias y otras fuentes bibliográficaspertinentes.

Cuadros y figuras: elabore los cuadros usandoel programa del procesador de palabra queaparece como 'utilidad de cuadros'; absténgasede preparar archivos en columnas o tabulados enel texto mismo del manuscrito. Recuerde que debeenviar una página con los nombres de los archivos.Para las figuras (diagramas, dibujos o ilustraciones)en blanco y negro, envíe el original y dos copiasde la ilustración correspondiente. Si sonfotografías en blanco y negro, se deben enviar trescopias de excelente calidad; si son transparencias,envíe la diapositiva original y no una copia, juntocon dos impresiones en papel (fotocopia o porescáner) de la misma imagen para facilitar el envíode este material a los evaluadores del manuscrito.En las preparaciones de microscopio, recuerdeque debe mencionar la coloración y el aumentosegún el objetivo utilizado, pero no incluya el valordel ocular.

Remisión del manuscrito

El manuscrito debe ser remitido con una cartafirmada por todos los autores en la que consteque todos conocen y están de acuerdo con sucontenido. Se debe mencionar, igualmente, queel manuscrito no ha sido publicado anteriormenteni se ha sometido a publicación en otra revista. Eldocumento original y las dos copias exigidas debenser remitidos a los editores a la siguiente dirección:

Revista BiomédicaInstituto Nacional de SaludAvenida Calle 26 No.51-60Bogotá, D.C., Zona 6, Colombia, S.A.oApartado aéreo 80334 u 80080Bogotá, D.C., Zona 6, Colombia, S.A.

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BIOMÉDICA

Lista de verificación

Con el fin de comprobar que se han cumplido todas las instrucciones correspondientes a las normasde publicación de la revista Biomédica, le solicitamos nos devuelva debidamente diligenciada estalista de verificación junto con su manuscrito corregido.

Categoría

Artículo original ______ Comunicación breve______ Nota técnica______

Revisión de tema______ Reseña histórica______ Ensayo ______

Comentario ______ Imágenes en biomedicina ______

Presentación de caso ______ Haga usted el diagnóstico ______

Carta al editor ______ Reseña bibliográfica ______

1- Presentación:___ Texto escrito a doble espacio en fuente Arial de 12 puntos de tamaño, en una sola cara de la

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académicos.___ El autor de la correspondencia suministró los datos completos: nombre, apellidos, dirección,

teléfono, fax y correo electrónico.

3- Resumen:___ Se incluye el resumen estructurado en español e inglés, con una extensión máxima de 250

palabras y con los siguientes subtítulos: introducción, objetivos, materiales y métodos,resultados y conclusiones.El resumen estructurado es sólo para artículos originales y comunicaciones breves.

4- Palabras clave:___ De 6 a 10 por artículo en cada idioma.___ Se incluyen las palabras clave en español e inglés (keywords), indexadas en los Descriptores

en Ciencias de la Salud (DeCS), http://decs.bvs.br/E/homepagee.html.

5- Estructura del artículo original:Se incluyen los siguientes apartados:

___ Página de presentación: título en español, título en inglés, título abreviado en español,presentación de los autores y datos completos del autor de correspondencia.

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___ Resúmenes: en español e inglés.___ Materiales y métodos.___ Resultados.___ Discusión.___ Agradecimientos.___ Declaración de conflicto de intereses.___ Fuente de financiación.___ Referencias.___ Cuadros y figuras con sus respectivas leyendas.

6- Figuras:___ Se incluye cada una en página aparte.___ Se incluyen las leyendas correspondientes en hoja aparte.

7- Cuadros:___ Se adjuntan en hoja aparte, elaborados en el modelo más sencillo de tablas del programa

Word y las copias en impresora láser.___ Se ordenan secuencialmente.___ Se incluye el título correspondiente.

8- Fotografías:___ Se adjuntan tres copias.___ Se señala la identificación de la misma y la orientación al respaldo.___ Se acompañan del correspondiente pie de foto en hoja aparte.

9- Referencias:___ Las citas se numeran según orden de aparición en el texto.___ Se ordenan secuencialmente y en el formato adecuado, tal y como lo indican las normas de

Biomédica en las instrucciones a los autores (http://www.icmje.org/index.html).___ Cuando se citan referencias en los cuadros, éstas deben seguir el orden con el que se

venía en el texto.

10- Abreviaturas y siglas:___ Se anota entre paréntesis después de la primera vez cuando debe aparecer en formacompleta

y en el idioma original.11- Nomenclatura:

___ Los nombres de género y especie están escritos en letra cursiva.___ Los nombres de microorganismos se escriben completos la primera vez que se citan, incluso

en el título y en el resumen, y luego se usa la solamente inicial del género y permanece elnombre completo de la especie.

12- Consideraciones generales:___ Carta firmada por todos los autores.___ Incluye autorización del Comité de Ética para la experimentación en humanos.___ Incluye autorización del Comité de Ética para la experimentación en animales.___ Los autores deben certificarle al Comité Editorial que la (s) persona (s) mencionada (s) en los

agradecimientos tiene (n) conocimiento y está (n) de acuerdo con aparecer en ellos.___ Todos los manuscritos deben incluir declaración de conflicto de intereses y fuente de

financiación.___ Los decimales en español deben separarse de los enteros por comas, no por puntos.___ Se envían los nombres de 4 evaluadores con sus respectivos datos.

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