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9h -10h15: L'exploration de l'hypersensibilité de type I: des extraits allergéniques aux allergènes moléculaires- F.Bienvenu
10h15 -10h45: Présentation d'un dossier clinique. O. Marchand
10h45 -11h00: Discussion – Pause
11h00 -11h30: Le test d'activation des basophiles: intérêt et limites J.Bienvenu
11h30 -12h00: L'exploration de l'hypersensibilité de type IV: application à l'immunité antituberculeuse- L.Garnier
BIOLOGIE DE L’ALLERGIE
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INTERET DU TEST D’ACTIVATION DES BASOPHILES
DANS L’EXPLORATION DE L’ALLERGIE MEDICAMENTEUSE
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J. Bienvenu , S. Viel , P. Rouzaire , L. Garnier , et F. Bienvenu
Laboratoire d’ImmunologieCHU Lyon-Sud
Biologie de l’allergieLyon - 20 Février 2014
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Introduction
Réactions d’hypersensibilité aux médicaments
Hypersensibilité Non-Allergique(HSNA)
Hypersensibilité Allergique(HSA)
LES REACTIONS D’HYPERSENSIBILITE AUX MEDICAMENTS…
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Introduction
Réactions d’hypersensibilité aux médicaments
Hypersensibilité Non-Allergique(HSNA)
Hypersensibilité Allergique(HSA)
Hypersensibilité Retardée (HSR)
24 à 72 heureslymphocytes T
Hypersensibilité Immédiate (HSI)
< 1 heureIgE médiée
Introduction LES REACTIONS D’HYPERSENSIBILITE AUX MEDICAMENTS
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Biologie de l’hypersensibilité immédiateDosages de médiateurs solubles au moment de l’accident
Dosages d’IgE spécifiques
Techniques d’activation ex vivo de basophiles
Biologie de l’hypersensibilité retardéeTests de transformation lymphocytaire
Tests d’activation lymphocytaire en cytométrie
Tests de détection de cytokines ( ELISPOT)
Biologie de l’hypersensibilité aux médicaments
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Biologie de l’hypersensibilité immédiateDosages de médiateurs solubles au moment de l’accident
Dosages d’IgE spécifiques
Techniques d’activation ex vivo de basophiles
Biologie de l’hypersensibilité retardéeTests de transformation lymphocytaire
Tests d’activation lymphocytaire en cytométrie
Tests de détection de cytokines ( ELISPOT)
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Physiopathologie de l’hypersensibilité de type I :
But : activer in vitro des basophiles porteurs d’IgE spécifiques de l’allergène
CD4
Cellule Th2
Cellule B
Phase de sensibilisation Phase de déclenchement
Plasmocyte
Basophile ou mastocyte sensibilisé
DEGRANULATION
+ allergène
IgE
IL-4,IL-5
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PrincipeApplications
Considérations généralesMarqueurs d’identification du basophileMarqueurs d’activation du basophile
Pourquoi étudier le basophile ?
Activation des mastocytes et des basophiles à l’origine desréactions d’hypersensibilité immédiate
Accessibilité : Les basophiles sont présents dans le sangcirculant contrairement aux mastocytes dont ils présentent lamajorité des propriétés, en particulier pour détecter unesensibilisation
Les basophiles présentent à leur surface des récepteurs deforte affinité pour les IgE (FcεRI). Après «pontage» de cesrécepteurs par l’allergène, les médiateurs libérés déclenchent lesphénomènes allergiques
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PrincipeApplications
Considérations généralesMarqueurs d’identification du basophileMarqueurs d’activation du basophile
La signalisation…
Wu LC, J Biol Chem, 2011
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PrincipeApplications
Considérations généralesMarqueurs d’identification du basophileMarqueurs d’activation du basophile
Concrètement pour nous…
Dosage des médiateurs libérésMesure des modifications phénotypiques en cytométrie
Expression constitutive faible de CD203c à la
surface
1. Incubation des basophiles
sensibilisés avec l’allergène ayant
provoqué la réaction
2. Pontage des récepteurs RcεRI par l’allergène (via les IgE spécifiques de celui-ci)
Expression de CD63 à la surface
Relargage de médiateurs
solubles
Surexpression de CD203c à la surface
3. Libération des médiateurs et
modifications du phénotype du
basophile
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Cytométrie en Flux / Principes
Laser Photodiode
Suspension cellulaire
Liquide de gaine
PMT 2
PMT 1
Filtres dichroïques
Taille (FSC)
Granulosité (SSC)Filtres
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Anti-IgE :Première stratégie décrite
Peu spécifique (monocytes, éosinophiles, cellules dendritiques)
Variation inter- et intra-individuelle de la densité des récepteurs des IgE
CD203c et anti-IgE :CD203c présent uniquement sur les basophiles au niveau du sang
CD123 et HLA-DR :CD123+ : IL3-R
HLA-DR- : exclusion des monocytes
CCR3 et faible SSC :CCR3 présent sur les basophiles, éosinophiles, détectable sur les lymphocytes Th1 et Th2
CRTH2 et CD3 :CRTH2+ : récepteur de la prostaglandine D2 exprimé par les Th2, éosinophiles et basophiles
CD3- : exclusion des lymphocytes Th2
PrincipeApplications
Considérations généralesMarqueurs d’identification du basophileMarqueurs d’activation du basophile
Principales stratégies utilisées :
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PrincipeApplications
Considérations généralesMarqueurs d’identification du basophileMarqueurs d’activation du basophile
CCR3 - faible SSC :
CRTH2
A
Basophiles
Lymphocytes Th2
Eosinophiles
CRTH2 - faible SSC - CD3 :
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CD203c et CD63 sont les plus utilisés
PrincipeApplications
Considérations généralesMarqueurs d’identification du basophileMarqueurs d’activation du basophile
CD203c CD63
Nom Ectonucleotide Pyrophosphatase Phospho-diesterase (E-NPP3)
Lysozyme Associated Membrane Protein (LAMP-3)
Exprimé par Basophiles, mastocytes PBMCs, plaquettes
Basophiles quiescents Expression constitutive faible
- Non exprimé à la surface cellulaire- Exprimé à la surface des granules intracytoplasmiques
Basophiles activés Sur-expression Expression à la surface cellulaire
Cinétique Rapide (5-15 min) Plus lente (10-25 min)
Effet de l’IL-3 Non induit par l’IL-3 (ou processus lent, >90min) Induction par l’IL-3
Magnitude de variation Données contradictoires dans la littérature
Fonction Inconnue Associée à la libération des médiateurs
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PrincipeApplications
Considérations généralesMarqueurs d’identification du basophileMarqueurs d’activation du basophile
Ebo DG, Allergy, 2006
NB : d’autres marqueurs « d’activation » décrits : :• CD63 « like » : CD107a , plus associés à la dégranulation• CD203c « like » : CD13, CD164 , plus associés au « priming » et à l’activation
CD203c et CD63 sont les plus utilisés
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Protocole de routine au laboratoire :
Témoin négatif Témoin positif Tubes testsPBS 20 µLAnti-IgE 20 µLAllergène dilué 20 µLCRTH2-FITC 10 µL 10 µL 10 µLCD203c-PE 10 µL 10 µL 10 µLCD3-PC5 10 µL 10 µL 10 µLSolution d’activation
100 µL 100 µL 100 µL
Sang (EDTA) 100 µL 100 µL 100 µL
Vortexer et incuber 15 minutes à 37°C.
Ajouter 2mL de solution de lyse
Vortexer et incuber 10 minutes à température ambiante
Centrifugation 5 minutes à 200g - Laver en PBS
Reprendre avec du PBS / 0,1% PFA
Vortexer 5 secondes et analyser au cytomètre
PrincipeApplications
Considérations généralesMarqueurs d’identification du basophileMarqueurs d’activation du basophile
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Conditions importantes à respecter :
PrincipeApplications
Considérations généralesMarqueurs d’identification du basophileMarqueurs d’activation du basophile
Réalisation de contrôles: • Contrôle négatif: en présence de tampon seul• Contrôle positif : stimulation par anti-IgE ou anti-récepteur FcεRI
N.B. ≈ 10% de non répondeurs ( ↓ Syk)
Réalisation des dilutions de médicaments:• Au moins 3 dilutions en se basant sur le Prick Test et couvrant 3 log• Utiliser des formes injectables• Vérifier l’absence de toxicité pour les basophiles
Critères d’interprétation des résultats:• Expression en % de basophiles activés et/ou index de stimulation• Seuil de positivité: 10% voire 5%, à définir pour chaque médicament• Activation beaucoup plus faible que pour les allergènes protéiques
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PrincipeApplications
Considérations généralesHypersensibilités médicamenteusesCe qu’il reste à faire
Très utile lorsque les tests de détection d’IgE spécifiques ne sont pasdisponibles pour les molécules impliquées : fréquent pour lesmédicaments
Médicaments : haptènes : monovalents le plus souventSous-entend donc la liaison à une protéine porteuse pour pouvoir ponter
deux IgE et induire le signal d’activationBeaucoup plus difficile
Allergènes protéiques : excellente sensibilitéà visée diagnostiquepour le suivi de désensibilisationavant une réintroduction ou un TPO
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Béta-lactamines :
Pour quelles molécules ?
Ebo DG et al., Expert Review, 2011
Introduction Introduction PrincipeApplications
Considérations généralesHypersensibilités médicamenteusesCe qu’il reste à faire…
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Introduction Introduction PrincipeApplications
Considérations généralesHypersensibilités médicamenteusesCe qu’il reste à faire…
CRTH2
CD
203c
Contrôle négatif Contrôle positif (anti-IgE) Allergène (Clamoxyl®)
β−lactamines : exemple de résultats
Pour quelles molécules ?
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Pour quelles molécules ?
Curares :
Ebo DG et al., Expert Review, 2011
Introduction Introduction PrincipeApplications
Considérations généralesHypersensibilités médicamenteusesCe qu’il reste à faire…
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Pour quelles molécules ?
La question des AINS :
Controversé, du fait du mécanisme non-IgE médié d’activation dans la plupart des cas :Déviation de la cascade de l’acide arachidonique vers la production de leucotriènesRésultats positifs chez des sujets sains tolérantsDose dépendant
Ebo DG et al., Expert Review, 2011
Introduction Introduction PrincipeApplications
Considérations généralesHypersensibilités médicamenteusesCe qu’il reste à faire…
47%
9%
3%2%
1%
5%
3%
30%
Demande de TAB au laboratoire d’Immunologie du CHLS entre 2012 et 2013 (n=1840)
Curares Clamoxyl RocephineAugmentin Pyostacine Produits de ContrastePlatines Autres
curares
Antibiotiques
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Pour quelles molécules ?
Les quinolones :
Rouzaire P et al., Int Arch Allerg and Clin Immunol, 2012
Introduction Introduction PrincipeApplications
Considérations généralesHypersensibilités médicamenteusesCe qu’il reste à faire…
34 patients
17 patients 17 patients
negative positive
4 patients13 patients
negative positive
13 patients4 patients
negative positive
challenge test
13x
15 patients with non-allergic
hypersensitivity
challenge test
2x2x contraindicated
13x negative
2x negative
13 patients with high probability of
allergic hypersensitivity
1x
1x positive
1 patient with allergic hypersensitivity
3x contraindicated
BAT
skin test skin test
challenge test
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Introduction Introduction PrincipeApplications
Considérations généralesHypersensibilités médicamenteusesCe qu’il reste à faire…
Mise au point TAB aux médicaments difficile : médicaments = haptènesmonovalents le plus souvent
Très utile lorsque la détermination des IgE spécifiques n’est pas possible
Intérêt pour la prise de décision de réintroduction d’un médicament
Utilité pour le choix d’une molécule qui ne donne pas de réaction croisée
Sensibilité faible,
Spécificité excellente
Nécessité d’augmenter la sensibilité
Nécessité de standardiser le test
En conclusion :