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Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

orellano@gmail.com ; eorellan@fbioyf.unr.edu.arConsulta: jueves 16 hs

Biología Molecular Año 2018

Elena G. Orellano

PRINCIPIOS Y EQUIPAMIENTO: etapas y ciclos dela PCR

SELECCIÓN DE CONDICIONES: componentes

DISEÑO DE CEBADORES

APLICACIONES Y TIPOS DE PCR: Nested PCR,Multiplex PCR, RT‐PCR, PCR en tiempo real o qRT‐PCR

Contenidos a desarrollar

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Clases de PCR

1)PCR I: bases PCR‐ 1 ejercicio colocar!!!

2) PCR II: reactivos, componentes‐ armar un protocolo de temperatura

3) PCR III: especiales

4) Clases de problemas grupales y en las comisiones

5) Laboratorios del tema PCR

6) Evaluación en el parcial

PCR• La reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)

fue desarrollada por Kary B. Mullis.• Mullis diseñó la PCR en el año 1983, trabajando en Cetus, una de

las primeras compañías biotecnológicas, en California. Él estabaencargado de diseñar y sintetizar cadenas de DNA cortas paraotros científicos. Mullis relata que él concibió la PCR mientrascruzaba la carretera de la costa del Pacífico una noche en sumoto. Pensaba en una nueva manera de analizar mutaciones en elDNA cuando se dió cuenta de que había inventado un métodopara amplificar cualquier región del DNA.

• Mullis recibió U$10,000 de prima de Cetus por su invención. En1992 Cetus, vendió la patente de la PCR y la Taq polimerasa aHoffmann‐La Roche por U$300 millones de dólares.

• Mullis fue galardonado con el premio Nobel de Química en 1993.

http://www.authorstream.com/Presentation/onuorpi‐1683121‐pcr‐revolutionized‐life‐scinces‐history/

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¿Por qué reacción?

Una reacción consiste en la combinación de dos o más  sustancias o componentes para dar 

un nuevo compuesto

Reacción en cadena de la polimerasa

¿Por qué reacción en cadena?

Reacción en cadena porque da origen a sustancias que ocasionan sucesivamente reacciones iguales 

a la primera.Sucesión de acontecimientos en la que cada uno 

es provocado por el anterior.Cada ciclo de la PCR se repite n veces

Reacción en cadena de la polimerasa

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¿Por qué reacción en cadena de la polimerasa?

Las reacciones son catalizadas/dirigidas por la DNA polimerasa

Reacción en cadena de la polimerasa

PCR: método selectivo, específico, sensible y 

rápido

Constituye la técnica más importante para amplificar ácidos nucleicos in vitro. 

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Ambas hebras del DNA de interés son replicadas exponencialmente mediante la síntesis enzimática 

dirigida por una DNA polimerasa termoestable que es cebada por 2 oligonucleótidos (cebadores o primers) y por el agregado de los desoxirribonucleósidos trifosfato

(dNTPs sustratos de la enzima) en un medio buffer adecuado

Reacción en cadena de la polimerasa

Produce grandes cantidades de UN fragmento específico a partir de un molde de DNA complejo

regiones flanqueantes

regiones flanqueantes

Amplificación de la región de interés

fragmento de interés

fragmento de interés

fragmento amplificado

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Constituye la técnica más importante para amplificar ácidos nucleicos in vitro

Método para la amplificación exponencial de secuencias de DNA (ó RNA)

Revolucionó las técnicas de Biología Molecular

PCR: método selectivo, específico, sensible y rápido

Conceptos de la PCR

Sensibilidad: cantidad mínima de DNA necesaria para quese produzca la amplificación.

Especificidad: obtención de un solo producto amplificado.

Eficiencia o rendimiento: amplificación máxima que sepuede obtener con un número determinado de ciclos, serefiere a la cantidad de producto obtenido.

Fidelidad: errores que comete la DNA polimerasa durantela amplificación.

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Preparación de la mezcla de reacción 

para la PCR

Reacción de la PCR en el Termociclador

Visualización de los resultados/fragmentos

Duración de una PCR: 2‐3hs

Pasos de la PCR 

DNA polimerasa termoestable

DOS oligonucleótidos (cebadores o primers)  simple hebra

Sustratos: dNTPs (desoxirribonucleósidostrifosfato)

Cofactor Mg2+

Buffer adecuado

Componentes de la reacción de PCR

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regiones flanqueantes

regiones flanqueantes

Amplificación de la región de interés

fragmento de interés

fragmento de interés

fragmento amplificado

El ciclo de la PCR: 3 etapas

Desnaturalización Anillado Síntesis

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minutos

• Temperatura de Desnaturalización

• Temperatura de Anillado‐ Hibridación

• Temperatura de Extensión‐ Síntesis

Tres temperaturas

Los ciclos de la PCR

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Extensión: 

72ºC 30 seg‐3 min

Desnaturalización: 

92‐95ºC 30 seg‐1 min

Anillado o Hibridación:

40–65ºC 30 seg‐1 min

DNA molde o templado

Producto delimitado por los 

cebadores

Productos largos de longitud variable

Supongamos que partimos de 1 copia de templado (en la práctica no es así!!)

En el 3er ciclo aparecen 2 moléculas de la longitud deseada

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n: número de ciclos   X : número de copias del molde de DNA original

Considerando que la eficiencia de amplificación es igual a 1

Número total de productos: 2n. XNúmero de productos secundarios: 2.n. XNúmero de productos de longitud esperada: (2n – 2.n). X

EFICIENCIA DE LA PCR: determinada por la DNA polimerasa termoestable, inhibidores, etc.

A partir del ciclo 30 se alcanza la fase “plateau”

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Temperatura necesaria para separar las 2 hebras del DNA molde

•Depende del contenido GC (%) 

•Longitud del fragmento a amplificar (DNA molde)

Usualmente 92‐95ºC, separa las 2 hebras del molde de DNA (porej. 45 segundos si G+C < 55%)

Etapa previa de desnaturalización

Etapa de Desnaturalización

Etapa de desnaturalización

Temperatura necesaria para separar las 2 hebras del DNA molde

Depende:  contenido GC (%) 

longitud del fragmento a amplificar (DNA molde)

Es importante tener en cuenta la vida media de la DNA  polimerasa. Por ejemplo la Taq polimerasa:

2 horas        a  92°C

40 min.        a 95°C

5 min.          a 97,5°C

Usualmente 92‐95ºC, separa las 2 hebras del molde de DNA (45 segundossi G+C < 55%)

Etapa previa de desnaturalización (no la del ciclo de la PCR) si el DNAmolde es complejo: por ejemplo genómico. Sirve también para eliminarimpurezas (proteasas, cloroformo, etc.) de la preparación.

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Etapa de Anillado(annealing, hibridación o apareamiento)

DNA Es la etapa de unión del cebador o primer al DNA molde desnaturalizado

Al bajar la T° los primers se anillan o hibridan al DNA molde

Esta etapa depende de la TEMPERATURA, del tiempo de anillado del primer, de la composición de bases del DNA molde, 

de la longitud, de la concentración de los primers, etc.

Es la T° a la cual la mitad de los oligonucleótidos están anillados al DNA molde

Usualmente es de 45‐60ºC, permite a los primers o cebadoreshibridar al templado o molde, rastrea/barre el DNA molde paraencontrar su correcta secuencia blanco. Debe ser calculada odeterminada empíricamente para cada par de primers

Etapa de anillado (annealing o hibridación, apareamiento)

En esta etapa se produce la unión del cebador o primer al DNA simple hebra molde desnaturalizado, por lo tanto se baja la 

temperatura para favorecer el anillado.

La temperatura de anillado debe ser unos grados menor  (3 a 5°C) que la T de fusión o “melting”  que es la T° en donde los oligos se disocian del templado (Tm= es la T° a la cual la mitad 

de los oligonucleótidos están anillados al DNA molde)

Tm = 2 (A+T) + 4 (G+C)(para 20 a 30 nt)

Fórmula de Wallace

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Temp. annealing = 2 (A+T) + 4 (G+C) – 4(anillado ó  Temperatura de apareamiento)

Ta:  debe ser calculada o determinada empíricamente para cada par de primers y si no son iguales se usa la menor. En el equipo se puede 

programar una sola temperatura de anillado por eso  los primers deben tener  temperaturas similares.

Para oligont más largos:

Ecuación propuesta por Balton y McCarthy, modificada por Baldino (1989) que predice la Tm de oligont de 14-70 nt (en conc. de cationes 0,4 M o menos) (n= es el Nº de bases del oligo)

Tm ( en ºC)= 81,5 ºC + 16,6(log10[K+]) + 0,41(% [G+C]) – (675/n)

Tm = 2 (A+T) + 4 (G+C) (para 20 a 30 nt)

Fórmula de Wallace

Ta = 2 (A+T) + 4 (G+C) ‐ 4

Temperatura de melting

Temperatura de apareamiento

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Rango Standard: 45°C‐ 65°C, 30‐120 segundos.Durante el annealing, los primers son rápidamente hibridados.Diferencias en la Km presentada por diferentes DNA polimerasaspueden cambiar la hibridación efectiva del primer.

Tiempos de Anillado influyen también en la especificidad

Mejoras en la especificidad:

1. Incrementar la temperatura de anillado (incrementos de 2‐5°C son recomendados) puesto que reduce las posibilidadesde cebado‐priming no específico y por lo tanto de formaciónde productos no específicos.

2. Reducir los tiempos de anillado puesto que tiempos muylargos no mejoran normalmente la producción, pero puedenproducir un aumento en el apareamiento espurio y asímayores cantidades de productos no específicos de PCR.

Corresponde a la  síntesis del Corresponde a la Temperatura de síntesis del DNA

Depende de la DNA polimerasa   

Taq polimerasa  es altamente procesiva: 35‐100 nt/s, 2‐4 kb /min

Longitud del fragmento a amplificar:                               1000‐2000 bp 1 minuto

Depende de la naturaleza del molde

Usualmente es de 72ºC, la DNA polimerasa se ancla en el complejo molde‐cebador (‐3´OH) y extiende a través de la región 

blanco

Etapa de Extensión o Polimerización

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Etapa de extensión‐ polimerización

La Temperatura de esta etapa es la óptima de la DNA polimerasa.

Taq. polimerasa: T° óptima 72°C (35‐100nt/seg: depende del buffer, pH, sales, etc.).

El tiempo depende de la longitud del fragmento a amplificar

400‐500 bp 30 segundos

1000‐2000 bp 1 minuto

Hasta 4 kb   1‐2 minuto

Depende de la Enzima DNA pol.  

(Taq pol. es altamente procesiva: 2‐4 kb /min).

Si la concentración del molde es baja se pueden alargar los tiempos en los primeros ciclos. 

PCR standard es ineficiente en la amplificación de fragmentos > 3 Kb.

Altas T° de annealing: alta discriminación contra primersincorrectamente hibridados y baja la adición de nucleótidos incorrectos 

en el 3´

Altas T° de annealing: en los primeros ciclos aumentan la especificidad

Bajas T° de annealing: aumentan los productos inespecíficos

Tº demasiado alta = poco o nada de producto

Tº muy‐baja=anillado no específico = productos incorrectos

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Hot start: disminuye la inespecificidad causada por el anillado y la elongación a bajas T°: agregando a altas T° la enzima Taq polimerasa o por exclusión de 1 reactivo (dNTPs, primers, Mg2+ ) de la mezcla de reacción hasta que la reacción llega a la temperatura de desnaturalización del ciclo. 

También puede ser con anti‐Taq: anticuerpo unido a la polimerasa que inhibe la actividad de la Taq polimerasa hasta la etapa desnaturalización .

Touch down: utiliza T° variables en una sola reacción. Se requiere programar el termociclador.

Inicio a 15°C por sobre la Tm, luego bajar gradualmente (1° a 2° C por ciclo) hasta llegar a 4 °C por debajo de la Tm.

Método útil para evitar productos inespecíficos en la PCR, no deseados (para molde DNA genómico generalmente)

Se generan moldes específicos y luego se los copia a baja Tm.

Estrategias empleadas para una amplificación selectiva en los primeros ciclos y evitar el apareamiento inespecífico:

Las polimerasas termoestables tienen por lo general Temperaturas de polimerización de 72 ºC : la DNA polimerasa se ancla en el 

complejo molde‐cebador (‐3´OH) y extiende a través de la región blanco.

72º C para Taq polimerasa: 1 kb/min de longitud, dado que sintetiza 1000 pb/min

Elongación final‐última etapa de extensión: 7 minutos para asegurar que los extremos sean romos (doble hebra).

Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70‐74 °C durante 5‐15 minutos tras el último ciclo de PCR. 

Con ella se asegura que cualquier DNA de cadena simple restante sea totalmente polimerizado.

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Desnaturalización previa: (no la del ciclo de la PCR) si el DNA molde es complejo,por ejemplo DNA genómico. Sirve también para eliminar impurezas (proteasas,cloroformo, etc.) resultado de la preparación del DNA.

Extensión final: Elongación final‐última etapa de extensión: 7 minutos para asegurar que losextremos sean romos (doble hebra). Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de70‐74 °C durante 5‐15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquierDNA de cadena simple restante sea totalmente ampliado.

Etapas fuera de los ciclos de la PCR

Ejemplo: Secuencia de DNA doble hebra que se desea amplificar o molde:

5´TTAACGGGGCCCTTTAGC.....450nt…TGTAAACCCGGGTTGAC3´3´AATTGCCCCGGGAAATCG....450nt…ACATTTGGGCCCAACTG 5´

(18nt) (17nt)

• Sólo se necesita conocer la secuencia de bases de la región que flanquea elsegmento, región particular que se desea amplificar

• El primer paso para la PCR es diseñar y sintetizar el par de "primers" que engeneral poseen cerca de 20 nucleótidos (14‐30) (Cebadores, oligonucleótidos)

• El primer directo o foward es exactamente igual a la secuencia izquierda de lahebra top y el primer reverso o reverse es complementario a la secuenciaderecha de la hebra top. Concentración: 0,1 ‐0,5 µM (1012 ‐ 1013 moléculas).

5’

3’

3’

3’ 5’

O. DirectoO. Reverso

5’

3’ 5’

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5´TTAACGGGGCCCTTTAGC.....450nt…TGTAAACCCGGGTTACGTGAC 3´(18nt)                                     3´ACATTTGGGCCCAATGCACTG 5´

5´TTAACGGGGCCCTTTAGC 3´ (21nt)3´AATTGCCCCGGGAAATCG.....450nt…ACATTTGGGCCCAATGCACTG 5´

5´TTAACGGGGCCCTTTAGC.....450nt……..TGTAAACCCGGGTTGAC3´3´AATTGCCCCGGGAAATCG.....450nt……..ACATTTGGGCCCAACTG 5´

(18nt) (17nt)

5’

3’

3’

3’

O. DirectoO. Reverso

5’

3’

5’

5’

E: Fase temprana o de screening

M: Fase media o de amplificación exponencial

L: Fase tardía, efecto Plateau

Cinética de la reacción de PCR

Las tres fases de la PCR

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PCR: tres fases primariasFase screening: es la selección del fragmento de DNA deseado en un molde complejo por la unión de cebadores específicos al templado

Síntesis por la DNA polimerasa:    

5’ ‐T A C G T A C G T A C G A

3’ ‐A T G C A T G C A T G C T A T G C A C A C C G G 5’

3’

5’

3’

3’

5’5’

3’ 5’

Templado

o molde

Fase de amplificación:el fragmento flanqueado por los primers seempieza a acumular en forma exponencialdurante ciclos en donde la temperatura sube ybaja permitiendo la síntesis de DNA (exceso molarde reactivos).

Fase tardía:efecto “plateau” (reasociación del productoporque se encuentra en alta concentracióncompitiendo por los sitios de hibridación de loscebadores, inactivación de compuestos,agotamiento de compuestos, etc.)

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Pérdida de eficiencia de PCR: Efecto Plateau

Factores que llevan a la pérdida de eficiencia de PCR 

luego de varios ciclos:

Disminución de actividad de la polimerasa.

Disminución de la disponibilidad de  dNTPs y 

cebadores. Disminución de la 

disponibilidad de Mg2+, para el funcionamiento de la 

enzima.

[DNA]

Nº de ciclo

Fase lag

Fase exponencial

Fase de meseta

El Efecto “Plateau”

Fase plateau, se alcanza al acumularse de 0,3 a 1 pmol del producto.Hebras del producto están en tal concentración que la hebrascomplementarias se anillan entre sí, removiendo muchos de los sitiosde fijación de los primers, restringiendo la síntesis. Se generanproductos espurios. La concentración del producto es mayor que la delprimer. Puede ocurrir por baja unión primer‐molde, inhibición porproducto, baja enzima o desnaturalización de la misma, bajo dNTPs,bajo primer, etc.

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Factores que pueden llevar al plateau:

• La disminución de sustratos, cebadores o dNTPs (degradación de losreactivos: enzima, etc.)

• La estabilidad de los reactivos‐ estabilidad de la enzima

• Inhibición por productos finales (formación de PPi)

• Competencia por reactivos, por productos no específicos o dímerosde los primers

• Re‐anillado del producto a altas concentraciones las cualesprevienen la extensión del proceso (10nM)

• Incompleta desnaturalización en concentraciones altas de producto

Número de Ciclos

• Número de ciclos:‐ algunos componentes se tornan limitantes después de 30 ciclos (si el númeroinicial = 105 moléculas de molde)‐ se necesitan >25 ciclos para amplificar un gen de copia única a partir de DNAgenómico de mamífero‐ pocos ciclos: bajan el rendimiento‐ muchos ciclos: aumentan la inespecificidad por eso incrementar el N° deciclos no incrementa la eficiencia. El efecto plateau beneficia lasamplificaciones inespecíficasDepende de la relaciónmolar primer/DNA moldeLimitado por el efecto plateauMayor a 40 ciclos: se aumenta la cantidad y complejidad de los productos no ‐

‐‐‐específicos

• Rango Standard : 25‐40 ciclos• Mejorar especificidad: Reducir el número de ciclos.• Mejorar eficiencia: Para amplificar fragmentos grandes (> 1 kb) incrementar la

duración de cada paso térmico.

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Método selectivo, sensible, específico, y rápido

Especificidad: se refiere a la obtención de un solo producto amplificado. Está determinada por los cebadores y la especificidad con la que se unen al DNA molde. De esta forma, si los cebadores tienen más de un sitio al que se pueden unir aparecerá más de un producto amplificado. Depende de 

distintas variables pero la Temperatura es la más importante.

Sensibilidad: se refiere a la cantidad mínima de DNAnecesaria para que se produzca la amplificación. Se 

relaciona con los falsos negativos, ya que puede ocurrir que una muestra sea positiva pero sea dada como negativa, porque no se ha amplificado por no tener 

suficiente cantidad de DNA molde, de partida o sea del número de copias iniciales. Depende de cual es el material de partida para hacer la PCR . Por eso es 

importante conocer el “período ventana” en el caso de las infecciones virales.

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Eficiencia o rendimientose refiere a la cantidad de producto obtenido

O sea la amplificación máxima que se puede obtener en un número determinado de ciclos, 

Fidelidadse refiere a los errores que comete la DNA polimerasadurante la amplificación. Este concepto es de especial importancia en la secuenciación, pero en otros casos 

no es tan importante. Asociado con la actividad3´‐ 5´ exonucleasa de la polimerasa.

Otros parámetros

Termocicladores

3 ‐ 5 min 94 ‐95ºC (DNA genómico)

30 ‐ 60 seg 94 ºC

30 – 60 seg T anillado

30 seg – 3 min 72 ºC

5 ‐ 10 min extensión final 72 ºC

25- 30 ciclos

Procedimientospre y post PCR:

‐se deben hacer enáreas separadas dellaboratorio.

‐Set de pipetas, tubos,guantes, etc.

‐la reacción se hace enmuy pequeño volumenen tubos de eppendorf(opcional: agregar 1 gota

de aceite mineral)

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Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) In vitro Amplification of DNA bythe Polymerase Chain Reaction. In: Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T(Eds.) Molecular Cloning: a Laboratory Manual. New York: Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, chapter 14.Sambrook J, Russell DW (2001) In vitro Amplification of DNA by thePolymerase Chain Reaction. In: Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (Eds.)Molecular Cloning: a Laboratory Manual. New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, Vol. 2, chapter 8.Sharrocks, A.D. (1994). The design of primers for PCR. In: Griffin, H.G. andGriffin, A.M (Eds.) PCR Technology: Current Innovations. London: CRCPress, pp. 5–11.Dale JW, von Schantz M, Plant N (2011) From Genes to Genomes:Concepts and Applications of DNA Technology, 3rd Ed., pp. 109‐130.Libre en internetMcPherson MJ, Møller SG (2006) PCR Second Edition, Taylor & FrancisGroup

Bibliografía