Χαρακτηριστική ιδιότητα και λειτουργία των ενζύµων, είναι ηκατάλυση των χηµικών αντιδράσεων. Μελέτη της καταλυτικής δράσης, πρέπει να βασίζεται στονποσοτικό προσδιορισµό της ταχύτητας της χηµικής

αντίδρασης που καταλύεται. Από τη µελέτη της µεταβολής της ταχύτητας, καταλήγουµεσε συµπεράσµατα χρήσιµα για τη δοµή και για το µηχανισµό

δράσης των ενζύµων ( κυρίως όταν το ένζυµο είναι υψηλήςκαθαρότητας).Η µελέτη της ενζυµικής κινητικής είναι σηµαντική και για

πρακτικούς λόγους: Ο ορισµός ικανοποιητικών µονάδων (Units) απαιτεί ναγνωρίζουµε

τις βέλτιστες συνθήκες (pΗ, θερµοκρασία κ.λπ.) για τηδράση του ενζύµου, καθώς και την επίδραση των διαφόρων παραγόντων

(αναστολείς, ενεργοποιητές κ.λπ.) σ’ αυτήν.

Η γνώση της ενζυµικής κινητικής βοηθάει: στην κατανόηση των βιολογικών φαινοµένων τα οποία, είναι πολύ ευαίσθητα σε αλλαγές θερµοκρασίας, pΗ κ.λπ. στην επίλυση του ερωτήµατος “µε ποιο τρόπο δρουν ταένζυµα µέσα στο κύτταρο”.

Για όλους τους παραπάνω λόγους, η ενζυµική κινητική ήκινητική ενζυµικών αντιδράσεων, έχει εξελιχθεί σε έναιδιαίτερο επιστηµονικό κλάδο. Στην ενζυµική κινητική πρωταρχικό ρόλο παίζει η µελέτη

της ταχύτητας (v) της ενζυµικής αντίδρασης σε συνάρτηση µετους διάφορους παράγοντες που επιδρούν σ’ αυτήν,

µε επίκεντρο τη µελέτη της σχέσης µεταξύ της ταχύτητας

της ενζυµικής αντίδρασης και της συγκέντρωσης

του ενζύµου (Ε) και του υποστρώµατος (S).

ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΗΣ ∆ΡΑΣΗΣ ΤΩΝ

ΕΝΖΥΜΩΝ Μερικά µόνο ένζυµα µπορούν να προσδιοριστούν µε

άµεσες φασµατοµετρικές µεθόδους. Η παρουσία των περισσοτέρων ενζύµων πιστοποιείται

από τη θετική έκβαση των συγκεκριµένων αντιδράσεων που

καταλύουν

Το ποσό των ενζύµων υπολογίζεται από την ταχύτητα της

αντίδρασης. Η µέτρηση λοιπόν της ταχύτητας της αντίδρασης, είναι τοπιο σηµαντικό κοµµάτι των τεχνικών που χρησιµοποιούνται

στη µελέτη των ενζύµων.

Για να αποφευχθούν οι παραπάνω λόγοι, υιοθετήθηκε ηµέτρηση της αρχικής ταχύτητας, κατά την οποία οιπαραπάνω λόγοι δεν έχουν τη χρονική δυνατότητα να

παρέµβουν. Κατά τη µελέτη των ενζύµων, είναι απόλυτα αναγκαίο ναπροσδιορίζεται η επίδραση στην αρχική ταχύτητα ενός

παράγοντα (pΗ, θερµοκρασία, συγκέντρωση ενζύµου κ.λπ.) κάθε φορά. Για τη µέτρηση της αρχικής ταχύτητας, επιλέγεται συνήθωςένας τέτοιος χρόνος, ώστε η αλλοίωση του υποστρώµατος, να είναι κάτω από το 20% της συνολικής. Μέχρι αυτού του ορίου, οι καµπύλες της ταχύτητας, σεσυνάρτηση µε το µεταβαλλόµενο παράγοντα είναι συνήθως

ευθείες γραµµές.

ΕΠΙ∆ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΤΟΥ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ

ΣΤΗΝ ΤΑΧΥΤΗΤΑ ΤΗΣ ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΗΣ

Η πλειοψηφία των ενζυµικών αντιδράσεων περιλαµβάνει

περισσότερα από ένα υποστρώµατα.Ακόµα και στις υδρολάσες, οι οποίες συχνά θεωρούνταιαντιδράσεις ενός υποστρώµατος, το δεύτερο υπόστρωµα(το Η2Ο) υπάρχει σε υψηλές συγκεντρώσεις, και το ένζυµονα είναι κορεσµένο στο Η2Ο σε όλες τις χρονικές στιγµές.

Αν και η περίπτωση των ενζυµικών αντιδράσεων ενός

υποστρώµατος είναι σπάνια στα βιοχηµικά συστήµατα, παρ’όλ’ αυτά αντιπροσωπεύει ένα χρήσιµο µοντέλο για τηνανάπτυξη της θεωρίας της ενζυµικής κινητικής και τα

περισσότερα συµπεράσµατα που εξάγονται βρίσκουν

εφαρµογή και στα πιο πολύπλοκα ενζυµικά συστήµατα. Για τους λόγους αυτούς, θα αναπτυχθεί κυρίως η κινητικήτων ενζυµικών αντιδράσεων µε ένα υπόστρωµα πριν

αναφερθούν οι περιπτώσεις των ενζύµων µε πολλά

υποστρώµατα.

Η συγκέντρωση του υποστρώµατος [S], είναι ένας από τουςσηµαντικότερους παράγοντες που επιδρούν στην ταχύτητα

[v], των ενζυµικών αντιδράσεων. Σε µια πρώτης τάξης µη εvζυµική αvτίδραση, η µεταβoλήτης ταχύτητας, καθώς αυξάvει η συγκέντρωση τουυποστρώµατος, είvαι σταθερή και η καµπύλη v = f(S) είvαιευθεία. Στις περισσότερες

περιπτώσεις σε µια

ενζυµική αντίδραση, το διάγραµµα της αρχ-ικής ταχύτητας (ν) συν-αρτήσει της συγκέντρω-σης του υποστρώµα-τος έχει τη µορφή

καµπύλης υπερβολής.

Στις ενζυµικές αντιδράσεις ακολουθείται κινητική κορεσµού.Σε χαµηλές [S], η v εξαρτάται τόσο από τη [S] όσο και απότη [E]. Από µία τιµή [S] και µετά (όταν το Ε έχει κορεσθεί από το S)η v είναι ανεξάρτητηαπό τη [S] καιεξαρτάται µόνο

από τη [E]. ∆ηλαδή, σε υψηλέςτιµές [S], το E έχεικορεσθεί από

το S και η v έχειαποκτήσει τη

µέγιστη τιµή της

το Vmax.

Tο 1902, οι Βrown και Ηenri πρότειναν ότι το ένζυµοδηµιουργεί αρχικά ένα σύµπλοκο µε το υπόστρωµα, τοοποίο διασπάται στη συνέχεια σε ένζυµο και στα

προϊόντα της αντίδρασης (Ρ)

Ε + S ES (1) και ES → E + P (2)όπου οι κ1, κ-1 και κ2 σταθερές ταχύτητας,µε διαστάσεις Μ-1 sec-1 για την κ1 και

sec-1 για τις κ-1 και κ2.

Tο 1913, οι Μichaelis - Μenten απέδωσαν µε µαθηµατικότρόπο το µηχανισµό δράσης των ενζύµων, στηριζόµενοιστην ιδέα της δηµιουργίας του ενδιάµεσου συµπλόκου

ενζύµου-υποστρώµατος.

Θεωρία των Μichaelis - Μenten

(παραδοχή αποκατάστασης ισορροπίας) Βασίζεται στη γενική παραδοχή ότι έχει αποκατασταθεί µια

ισορροπία στο σύστηµα. Oι σηµαντικές παραδοχές είναι οι εξής:

Η αντίδραση µεταξύ του Ε και του S, Ε + S ES (1)παραµένει σε ισορροπία και

οποιαδήποτε επίδραση της αντίδρασης ES → E + P (2)στην (1), θεωρείται αµελητέα.

Οι συνθήκες αυτές επιτυγχάνονται όταν ο ρυθµός

διάσπασης του συµπλόκου ΕS προς Ε και S είναι πολύµεγαλύτερος από το ρυθµό διάσπασής του σε Ε και Ρ

(δηλαδή κ-1 >>κ2). Η συγκέντρωση του ελεύθερου S παραµένει σχεδόναµετάβλητη κατά την αρχική περίοδο της αντίδρασης,

και ισούται µε τη συγκέντρωση του ολικού S,δηλαδή [S] = [St].

κ1

κ-1

κ2

)( = [ES]

[E][S] = K

1+

1-

S 3

κ

κ

Η σταθερά διάστασης (Κs) του συµπλόκου ΕS ορίζεται ως

Οι διαστάσεις της Κs είναι sec-1/M-1 sec-1=M,δηλαδή η Κs έχει διαστάσεις συγκέντρωσης.

Στην (3) ισχύει η σχέση [Ε] = [Εt] - [ΕS] (4)Η ταχύτητα της συνολικής αντίδρασης, µε βάση τηναντίδραση ES → E + P (2) δίνεται από τον τύπο

Με αντικατάσταση της [Ε] από την εξίσωση (4) στηνεξίσωση (3) λαµβάνεται η κάτωθι εξίσωση (6)

)(S] [ = dt

dP = v 2 5Εκ

)( [ES]

[S] [ES])-]E([ = K

t

S 6

Η εξίσωση (6) αν λυθεί ως προς [ΕS] και αντικατασταθείστην εξίσωση (5) λαµβάνεται η εξίσωση (7)

Όταν η [S] είναι πολύ µεγάλη σε σύγκριση µε την ΚS

(δηλαδή ΚS/S τείνει στο 0), τότε η v ισούται µε το γινόµενοκ2[Εt] και έχει ήδη ορισθεί σαν Vmax.

Άρα η εξίσωση (8) µπορεί να γραφεί

)( K+[S]

][S]E[ = v

S

t27

κ

)(] [ = [S]

][S]E[ = v t2

t28Εκ

κ

)( K+[S]

[S]V = v

S

9max

Η σταθερά διάστασης του συµπλόκου (ΚS) ονοµάζεταισταθερά Μichaelis - Μenten (ΚΜ) και η εξίσωση (9)

παίρνει την τελική µορφή της εξίσωσης Μichaelis- Μenten(10)

)( K+[S]

[S]V = v

S

9max

)( K+[S]

[S]V = v

M

10max

Θεωρία των Βriggs – Ηaldane

(παραδοχή της αποκατάστασης σταθεροποιηµένης

κατάστασης) Μία διαφορετική µαθηµατική προσέγγιση για τον τρόπο

δράσης των ενζύµων, αποδόθηκε το 1925 από τους Βriggsκαι Ηaldane. Η θεωρία τους βασί-στηκε στην παραδοχή

ότι σε κάθε χρονική

στιγµή, ο ρυθµός σχη-µατισµού και διάσπα-σης του συµπλόκου

ΕS είναι σχεδόν ίσος,έτσι ώστε να αποκαθί-

σταται µια δυναµική

ισορροπία

(steady state).

Με βάση τη θεωρία αποκατάστασης σταθεροποιηµένης

κατάστασης

Ε + S ES → E + P ισχύει ότι

)( 0 =[ES] -[ES] -[E][S] = dt

[ES] d21-1 11κκκ

Λύνοντας την (4) ως προς [Ε] και αντικαθιστώντας την τιµήαυτή στην (11), η οποία λύνεται στη συνέχεια ως προς [ES] και αντικαθιστώντας την τιµή αυτή στην (5) προκύπτει ησχέση

κ1

κ-1

κ2

)(S] [ = dt

dP = v 2 5Εκ

[Ε] = [Εt] - [ΕS] (4)

)( +

+[S]

[S]V = v

++[S]

[S]]E[ = v

1

21-21-1

1t212

max

κ

κκκκκ

κκ

Ονοµάζοντας το κλάσµα (κ-1+ κ2)/κ1 = ΚΜ, η τελευταία

εξίσωση είναι ίδια µε την εξίσωση των Μichaelis-Μenten, µε

εξαίρεση ότι η ΚS έχει αντικατασταθεί από την ΚΜ όπου

)(1 KK1+

SM 32

1

21

κ

κ

κ

κκ+=

+=

−

Η ΚΜ έχει διαστάσεις συγκέντρωσης διότι

τόσο η ΚS

όσο και ο λόγος κ2/κ1=sec-1/M-1 sec-1=M, έχουν διαστάσεις συγκέντρωσης.

Φυσική σηµασία των σταθερών ΚΜ και Vmax

Για τον πλήρη ορισµό της φυσικής σηµασίας της σταθεράς

ΚΜ πρέπει να είναι γνωστές οι τιµές των σταθερών ταχύτητας

αφού µε βάση την εξίσωση

)(1 KK1+

SM 32

1

21

κ

κ

κ

κκ+=

+=

−

µπορεί να ισχύουν οι σχέσεις: κ-1 >> κ2

κ-1 = κ2

κ-1 < < κ2

Αν κ-1 > > κ2, τότε η εξίσωση απλοποιείται καιη ΚΜ ισούται µε την ΚS και

ισχύει η παραδοχή της αποκατάστασης ισορροπίας που

έγινε στη θεωρία Μichaelis-Μenten, δηλαδή είναι η σταθερά διάστασης του συµπλόκου

ενζύµου- υποστρώµατος.

Αν κ-1 = κ2, τότε η εξίσωση παραµένει ως έχει καιη ΚΜ έχει την τιµή που βγαίνει από την παραδοχή της

αποκατάστασης σταθεροποιηµένης κατάστασης.

Ε + S ES → E + P κ2

κ1

κ-1

ΚΜ = κ-1 + κ2

κ+1

ΚS = κ-1

κ+1

Αν κ-1 < < κ2, τότε η ΚΜ ισούται µε κ2/κ1 δηλαδή δεν είναι

παρά ο λόγος δύο σταθερών ταχύτητας των δύο διαδοχικών

και πρακτικά µη αµφίδροµων αντιδράσεων

κ1 κ2

E + S ES E + Pόπου το αποτέλεσµα εξαρτάται πλέον από τη σχέση µεταξύ

κ2 και κ1 δηλαδή αν

κ2<κ1 ή

κ2>κ1

Ε + S ES → E + P κ2

κ1

κ-1

ΚΜ = κ-1 + κ2

κ+1

ΚS = κ-1

κ+1

Με άλλα λόγια, η εξίσωση Michaelis-Menten µπορεί ναθεωρηθεί µερική περίπτωση της γενικής εξίσωσης της

Θεωρία των Βriggs – Ηaldane που ισχύει όταν η ταχύτηταδιάσπασης του [ES] προς E+P είναι αµελητέα (δηλαδή η κ2

είναι πολύ µικρότερη της κ-1). Από τα παραπάνω φαίνεται ότι αν η ταχύτητα µιας

ενζυµικής αντίδρασης ανταποκρίνεται στην εξίσωση

Μichaelis-Μenten, δε σηµαίνει ότι ανταποκρίνεται και στοπρότυπό της, δηλαδή ότι η ΚΜ είναι σταθερά διάστασης τουσυµπλόκου και ισούται µε την ΚS. Αν στις εξισώσεις των δύο θεωριών

δώσουµε v=Vmax/2, προκύπτει ότιΚΜ=[S], αλλά και το αντίστροφο. ∆ηλαδή η ΚΜ ισούται µε εκείνη τη

συγκέντρωση υποστρώµατος, στηνοποία η ταχύτητα της αντίδρασης έχει

τη µισή τιµή της µέγιστης ταχύτητας.

K+[S]

[S]V = v

M

max

Η σταθερά ΚΜ όπως φαίνεται

έχει µονάδες συγκέντρωσης και

αποτελεί χαρακτηριστική σταθερά του ενζύµου για

συγκεκριµένο υπόστρωµα. Επιπλέον,

όσο µεγαλύτερη είναι η τιµή της ΚΜ, δηλαδή(όσο περισσότερο ποσό υποστρώµατος απαιτείται για νααποκτήσει η

αντίδραση

v = Vmax/2) τόσο µικρότερη

είναι

η τάση σύνδεσης

(χηµική συγγένεια) µεταξύ Ε και S καιαντίστροφα.

Τo ΚΜ είvαι σπoυδαία σταθερά χαρακτηριστική τoυεvζύµoυ,

έστω και αv δεv είvαι γvωστή η ακριβής σηµασία της, αφoύ καθoρίζει τηv πoσoτική εξάρτηση τoυ S από τoE.

Η ΚΜ αποτελεί λοιπόν ποσοτική έκφραση της αντίδρασης

σχηµατισµού του συµπλόκου ΕS

Ε + S → ΕS

δείχνει την χηµική συγγένεια του Ε και S και είναι ανεξάρτητηαπό τη συγκέντρωση του ενζύµου.

Η Vmax αποτελεί ποσοτική έκφραση της αντίδρασηςδιάσπασης του ΕS

ΕS → Ε + Ρ

και εξαρτάται από τη συγκέντρωση του ενζύµου.

Οι παράγοντες που επηρεάζουν την αρχική ταχύτητα των

ενζυµικών αντιδράσεων, επιδρώντας είτε στο σχηµατισµό του συµπλόκου, είτε στη διάσπασή του, είτε και στα δύο,

µεταβάλλουν τις τιµές των ΚΜ και Vmax. Όταν είναι γνωστή η µοριακή συγκέντρωση του ενζύµου, τότε το Vmax εκφράζεται σε µονάδες ποσότητας (mol/L=M) αντιδρώντος υποστρώµατος (ή σχηµατιζόµενου προϊόντος) ανά µονάδα χρόνου, για συγκεκριµένη συγκέντρωσηενζύµου, δηλαδή έχει µονάδες Μ.min-1. Αν στην εξίσωση Vmax = κ2[Εt] θεωρηθεί ότι η [Εt]=1mol/L, προκύπτει ότι Vmax =κ2 (min-1). Για το λόγο αυτό, το κ2 ονοµάζεται αριθµός ανακύκλωσης

και δηλώνει πόσα µόρια υποστρώµατος αλλοιώνονται από

ένα µόριο ενζύµου στη µονάδα του χρόνου. Ο αριθµός ανακύκλωσης αποτελεί επίσης χαρακτηριστική

σταθερά του ενζύµου για συγκεκριµένο υπόστρωµα

Γραφικές παραστάσεις της εξίσωσης Michaelis-

Menten. Υπολογισµός των ΚΜ και Vmax

Η εξίσωση Μichaelis-Μenten µπορεί να αποδοθεί σε πολλά

διαγράµµατα διαφορετικών τύπων, όπου το µόνο που

απαιτείται είναι ο προσδιορισµός της αρχικής ταχύτητας σε

διαφορετικές συγκεντρώσεις υποστρώµατος.

Με κατάλληλoυς µετασχηµατισµoύς της εξίσωσηςMichaelis-Menten πρoκύπτoυv και εξισώσεις µε τις

ακόλoυθες γραφικές παραστάσεις.

Από τις γραφικές αυτές παραστάσεις µπoρoύv vαυπoλoγιστoύv τα ΚΜ και Vmax εvός εvζύµoυ.

Στις δύo πρώτες περιπτώσεις, για vα βρεθεί τo Vmax και

στη συvέχεια από αυτό τo ΚΜ απαιτoύvται µεγάλες τιµές της[S], πράγµα δύσκoλo πειραµατικά.

Αυτό δε συµβαίvει για τις τρεις άλλες περιπτώσεις, πoυχρησιµoπoιoύvται αραιέςσυγκεvτρώσεις υπoστρώµατoςγια τη χάραξη της καµπύλης

και τηv εύρεση, στη συvέχεια,τωv Vmax και ΚΜ. Οι περιπτώσεις αυτές έχουν το

µειονέκτηµα ότι συνήθως οι τιµές

[S] που απαιτούνται για να

µετρηθούν µεγαλύτερες τιµές της

v (δηλαδή κοντά στη Vmax) είναιυπερβολικά µεγάλες, µε αποτέ-λεσµα να χρησιµοποιούνται

αραιότερες συγκεντρώσεις [S] και να προκύπτουν µεγάλα

σφάλµατα.

Επίδραση της συγκέvτρωσης τoυ υπoστρώµατoς

στηv ταχύτητα της αvτίδρασης

µε αδιάλυτα υπoστρώµατα Tα ένζυµα δρουν συνήθως σε υποστρώµατα τα οποία είναι

σε διάλυµα. Στην περίπτωση που

το S που προστίθεταιπαραµένει αδιάλυτο, η περίσσεια αυτού δεν

είναι διαθέσιµη για να

δράσει το ένζυµο. Tότε, ακολουθείταιη καµπύλη Μichaelis-Μenten µόνο µέχρι το

όριο διαλυτοποίησης.

Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις υποστρώµατος δεν

παρουσιάζεται αύξηση της ταχύτητας, η οποία άλλωστε δε

φθάνει ποτέ στη µέγιστη τιµή της (Vmax).

Υπάρχουν ένζυµα τα οποία απαιτούν για τη δράση τους

το υπόστρωµα να έχει τη µορφή γαλακτώµατος (γιατίµόνο τότε µπορεί να σχηµατισθεί το σύµπλοκο ενζύµου-υποστρώµατος). Έvα χαρακτηριστικό παράδειγµα είvαι η περίπτωση της

παγκρεατικής λιπάσης.

ΕΞΑΡΤΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ

ΤΗΣ ΕΝΖΥΜIΚΗΣ ΑΝΤI∆ΡΑΣΗΣ

ΑΠΟ ΤΗ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ

Η ταχύτητα της εvζυµικής αvτίδρασης είvαι αvάλoγηπρoς τη συγκέvτρωση τoυ εvζύµoυ (όταν όλα τα άλλα

συστατικά του ενζυµικού συστήµατος διατηρούνται

σταθερά) µόvo στηv περίπτωση πoυ δύo µόρια εvζύµoυδρoυv αvεξάρτητα στo διάλυµα

πράγµα τo oπoίo σηµαίvει ότι µεταφέρoυv(αλλoιώvoυv) διπλάσια µόρια υπoστρώµατoς απόόσα µεταφέρει τo έvα µόριo εvζύµoυ

δηλαδή v = κ[Ε]. Όµως, κατά τηv πειραµατική µελέτη της ταχύτητας σε

συvάρτηση µε τη συγκέvτρωση τoυ εvζύµoυ, διαπιστώvovται απoµακρύvσεις από τηv ευθεία.

ΕΞΑΡΤΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ

ΤΗΣ ΕΝΖΥΜIΚΗΣ ΑΝΤI∆ΡΑΣΗΣ ΑΠΟ ΤΟ pH

Ένας από τους κυριότερους παράγοντες που επιδρά στην

ταχύτητα της ενζυµικής αντίδρασης είναι το pΗ του όλου

ενζυµικού συστήµατος. Οποιαδήποτε αλλαγή στην τιµή του pΗ, προκαλεί αλλαγήστην ιοντική κατάσταση των συστατικών του ενζυµικού

συστήµατος, δηλαδή Του ενζύµου

Του συµπλόκου ενζύµου – υποστρώµατος

Του υποστρώµατος

Των άλλων άµεσων και έµµεσων συστατικών.

Αλλαγή στην ιοντική κατάσταση των υπόλοιπων

άµεσων συστατικών (όπως είναι τα συνένζυµα, οιενεργοποιητές, οι αναστολείς κ.λπ.) και

έµµεσων συστατικών (π.χ. προσµίξεων κ.λπ.).

Επoµέvως τo pH µεταβάλλει, για κάπoιo από τoυς πιoπάvω λόγoυς, τηv κιvητική τoυ εvζυµικoύ συστήµατoς καικατά συvέπεια τηv ταχύτητα της όλης εvζυµικής αvτίδρασης. Tο διάγραµµα της δραστικότητας

του ενζύµου σε συνάρτηση µε το

pΗ έχει τη µορφή του σχήµατος.Από το διάγραµµα αυτό, φαίνεταιότι τα ένζυµα είναι συνήθως

ενεργά σε στενή περιοχή pΗ υπάρχει περιoχή τoυ pH µε

"βέλτιστες" συvθήκες(optimum pΗ).

ΕΞΑΡΤΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ

ΤΗΣ ΕΝΖΥΜIΚΗΣ ΑΝΤI∆ΡΑΣΗΣ

ΑΠΟ ΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣIΑ Η θερµοκρασία έχει µεγάλη επίδραση στην ταχύτητα της

ενζυµικής αντίδρασης, η οποία οφείλεται σε πολλούς

διαφορετικούς λόγους: Επιδρά στη σταθερότητα του ενζύµου (µετουσίωση). Επιδρά στην ταχύτητα διάσπασης του συµπλόκου ΕS προς Ε και Ρ (δηλαδή επιδρά στην κ2). Επιδρά στη χηµική συγγένεια του ενζύµου µε το

υπόστρωµα (δηλαδή επιδρά στην κ1 και κ-1). ∆ιαφοροποιεί τις τιµές pΚs ενός ή όλων των συστατικών

της ενζυµικής αντίδρασης. Επιδρά στη χηµική συγγένεια του ενζύµου µε τυχόν

υπάρχοντες ενεργοποιητές ή αναστολείς. ∆ιαφοροποιεί κάποιες άλλες ιδιότητες των συστατικών

της ενζυµικής αντίδρασης, όπως για παράδειγµα τη

διαλυτότητα ενός ή περισσότερων συστατικών.

Από τα παραπάνω φαίνεται ότι η επίδραση της

θερµοκρασίας είναι ένα πολύπλοκο φαινόµενο. Η επίδραση της θερµοκρασίας στη σταθερότητα του

ενζύµου µπορεί να µελετηθεί, αν η ενζυµική αντίδραση γίνει

σε διάφορες θερµοκρασίες και µετρηθεί η ταχύτητα της

ενζυµικής αντίδρασης, σε διάφορες χρονικές στιγµές για κάθε

θερµοκρασία. Σε µικρούς χρόνους (t1), µε την αύξηση της θερµοκρασίας

αυξάνεται και η δραστικότητα του ενζύµου. Σε µεγάλους χρόνους (t2) δεν ακολουθείται η αντιστοιχία

αυτή, γιατίσυγχρόνως

µειώνεται η

σταθερότητα

του ενζύµου,(µετουσίωση).

Ο ρυθµός απενεργοποίησης των ενζύµων σε διαλύµατα

αυξάνει ραγδαία µε την αύξηση της θερµοκρασίας. Tα περισσότερα ένζυµα απενεργοποιούνται στους 700Cενώ σχεδόν όλα στους 1000C είναι απενεργοποιηµένα. Tο φαινόµενο της απενεργοποίησης (το οποίο οφείλεται

στη µετουσίωση της πρωτεΐνης), είναι αντιστρεπτό σε

πολλές περιπτώσεις κάτω από συγκεκριµένες συνθήκες, όπου ανακτάται η δραστικότητα του ενζύµου όταν το ένζυµο

ψυχθεί. Πρέπει να τονισθεί ότι η απενεργοποίηση των ενζύµων από

τη θερµοκρασία εξαρτάται άµεσα από την τιµή του pΗ του

διαλύµατός του. Πολλά ένζυµα είναι ανενεργά ακόµα και σε θερµοκρασία

δωµατίου όταν το pΗ είναι 4-5 και 8-10. Επιπλέον, σηµαντικό ρόλο παίζουν και άλλοι παράγοντες, όπως η συγκέντρωση του νερού π.χ. τα λυοφιλοποιηµένα

ένζυµα είναι συγκριτικά σταθερότερα στη θερµοκρασία.

Αν και η σταθερότητα των ενζύµων είναι συνήθως

µεγαλύτερη σε χαµηλές θερµοκρασίες, υπάρχουνπεριπτώσεις ενζύµων που

είναι πιο σταθερά σε θερµοκρασία δωµατίου απ’ ότιστους 00C (π.χ. γλουταµινική αποκαρβοξυλάση

βακτηρίων) είναι ευαίσθητα σε χαµηλές θερµοκρασίες π.χ. ηµιτοχονδριακή αδενοσινο-τριφωσφατάση που

απενεργοποιείται στους 00C, ενώ σε θερµοκρασία

δωµατίου είναι σταθερή ή ακόµα εµφανίζει µικρή αύξηση

δραστικότητας.

Tέλος, το διάγραµµα της ταχύτητας της ενζυµικής

αντίδρασης σε συνάρτηση µε τη θερµοκρασία έχει τη µορφή

του σχήµατος: για κάθε αντίδραση, υπάρχουν βέλτιστες συνθήκεςθερµοκρασίας και σε αρκετές περιπτώσεις και βέλτιστη

τιµή (optimum θερµοκρασία). Πειραµατικά, χρησιµο-ποιούνται θερµοκρασίες

µικρότερες από τη βέλτι-στη, για να αποφευχθεί

η παρουσία ανενεργών

ποσών του ενζύµου, στο διάλυµα. Οι βέλτιστες θερµο-κρασίες για τα ένζυµα

των ζώων είναι µεταξύ

40 και 500C, ενώτων φυτών 50 και 600C.

ΕΞΑΡΤΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΕΝΖΥΜIΚΗΣ ΑΝΤI∆ΡΑΣΗΣΑΠΟ ΤΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ∆IΑΛΥΤΗ

Η σύσταση του διαλύτη σε ένα ενζυµικό σύστηµα µπορεί να

µεταβληθεί

µε προσθήκη αλάτων, τα οποία µεταβάλλουν την ιοντική

ισχύ του διαλύµατος ή προκαλούν επίδραση κοινού

ιόντος

µε προσθήκη οργανικών (µη πολικών) µορίων και µε συµµετοχή του ίδιου του διαλύτη στην αντίδραση.

Επίσης, στις περισσότερες περιπτώσεις που ο διαλύτης

είναι το νερό, δε λαµβάνεται υπόψη η πιθανή συµµετοχή του

στην αντίδραση, ενώ µπορεί να εφυδατώνει το ενεργό κέντρο

του ενζύµου ή/και το υπόστρωµα. Tότε, η ενζυµική αντίδραση περιλαµβάνει και µετακίνηση

µορίων νερού ως εξής:Ε-Η2Ο + S-Η2Ο → ΕS + 2Η2Ο.

ΕΞΑΡΤΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ

ΤΗΣ ΕΝΖΥΜIΚΗΣ ΑΝΤI∆ΡΑΣΗΣΑΠΟ ΤΗ ΠΙΕΣΗ

Η πίεση επιδρά στην ταχύτητα της ενζυµικής αντίδρασης, µόνο στην περίπτωση, που ένα από τα συστατικά της

αντίδρασης είναι αέριο. Αν η αντίδραση οδηγεί σε µείωση του όγκου του

συστήµατος

ευνοείται µε αύξηση της πίεσης

Αν η αντίδραση οδηγεί σε αύξηση του όγκου του

συστήµατος

ευνοείται µε µείωση της πίεσης. Η επίδραση της πίεσης στην κιvητική της όλης εvζυµικήςαvτίδρασης (οπότε και στην ταχύτητα της εvζυµικήςαvτίδρασης), συµβαίvει γιατί επηρεάζεται η σταθερά

ταχύτητας της αvτίδρασης και κατά συvέπεια η σταθερά ΚΜ.

ΕΞΑΡΤΗΣΗ ΤΗΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΕΝΖΥΜIΚΗΣ ΑΝΤI∆ΡΑΣΗΣΑΠΟ ΤΟ ΧΡΟΝΟ

(ΓΕΝIΚΕΥΜΕΝΗ ΕΞIΣΩΣΗ MICHAELIS-MENTEN) Σε όλες τις προηγούµενες περιπτώσεις της επίδρασης των

διαφόρων παραγόντων στην ταχύτητα της ενζυµικής

αντίδρασης, έχει γίνει η παραδοχή ότι αναφερόµαστε σε

αρχικές ταχύτητες (δηλαδή σε πολύ µικρούς χρόνους µετά

την προσθήκη του ενζύµου, όταν ακόµα οι συγκεντρώσεις

των προϊόντων είναι αµελητέες).E+S ES → E+P

Στην περίπτωση που η µείωση της ταχύτητας οφείλεται

αποκλειστικά και µόνο στη µείωση του κορεσµού του

ενζύµου από το υπόστρωµα, καθώς η συγκέντρωση του

υποστρώµατος µειώνεται συνεχώς, η πορεία της ενζυµικής

αντίδρασης περιγράφεται από τη γενικευµένη εξίσωση

Μichaelis-Μenten, η οποία προκύπτει µε ολοκλήρωση της

Μichaelis-Μenten.

Αν S0 είναι η αρχική συγκέντρωση υποστρώµατος σε

χρόνο t0=0 και µετά από κάποιο χρονικό διάστηµα, έστω σε

χρόνο t, έχει αλλοιωθεί ψ ποσότητα υποστρώµατος, τότε ηποσότητα υποστρώµατος που έχει παραµείνει σε χρόνο t είναι S0-ψ και η ταχύτητα της αντίδρασης, σύµφωνα µε την

εξίσωση Μichaelis-Μenten, δίνεται από την ακόλουθη

εξίσωση:

(1) K+)-S(

)-S(V =

dt

d = v

M0

0

ψψψ max

Με ολοκλήρωση της (1) λαµβάνεται η εξίσωση (2) και µεκατάλληλο µετασχηµατισµό η (3)

(3) )-S(

S K+ = tV (2), d

)-S(

)-S(+K = dtV

0

0M

0

0M

=

=0ψ

ψψψψψψ

ψ

lnmaxmax ∫∫

Τελικά µε ανάλογους µετασχηµατισµούς λαµβάνεται η

ακόλουθη τελική σχέση, η οποία αποτελεί τη γενικευµένη

εξίσωση Μichaelis-Μenten,

(4) t

K

1-

K

V =

)-S(

S

t

2,303

MM0

0 ψψ

maxlog

Η γραφική παράσταση

της σχέσης:

)-S(

S

t

2,303

0

0

ψlog

σε συνάρτηση µε το ψ/t,δίνει ευθεία

µε κλίση -1/ΚΜ

τέµνει τον χ στο ψ/tτέµνει τον ψ στο Vmax/KM

Η παραπάvω σχέση (4) χρησιµοποιείται στις περιπτώσειςπoυ είvαι δυvατή, µε κάπoια γρήγoρη µέθoδo (π.χ. UV), ηπαρακoλoύθηση της εξαφάvισης τoυ υπoστρώµατoς (µεάµεσo ή έµµεσo τρόπo) µε τηv πάρoδo τoυ χρόvoυ, για vαυπoλoγιστoύv τα Vmax και ΚΜ τoυ εvζυµικoύ συστήµατoςαπό την αντίστοιχη γραφική παράσταση. Επίσης, µπορούν να γίνουν οι ακόλουθες τροποποιήσεις:

Αν S0 >>ψ και ΚΜ, τότε log(S0/S0-ψ)≈log1=0 και η (4) απλοποιείται και παίρνει τη µορφή Vmax t = ψ. Αν S0 (και άρα και η τιµή ψ) << ΚΜ, τότε ψ/ΚΜ ≈ 0 και η (4)

παίρνει την ακόλουθη µορφή (5):

(4) t

K

1-

K

V =

)-S(

S

t

2,303

MM0

0 ψψ

maxlog

(5) K

V =

-S

S

t

2,303

M0

0 maxlog

ψ

Όταν λοιπόν η καµπύλη της σχέσης [log So/So-ψ], σεσυvάρτηση µε τo χρόvo [t] είvαι οριζόντια ευθεία γραµµή,

τότε ισχύει η εξίσωση (5) και συµπεραίνεται ότι

η τιµή S0 που χρησιµο-ποιήθηκε στο πείραµα

είναι πολύ µικρότερη

από την ΚΜ.

(5) K

V =

-S

S

t

2,303

M0

0 maxlog

ψ

ΑΝΑΣΤΟΛΕIΣ ΕΝΖΥΜIΚΩΝ ΑΝΤI∆ΡΑΣΕΩΝ Όταv εκτός από τα αvτιδρώvτα σώµατα και τα πρoϊόvτα της

αvτίδρασης, υπάρχoυv και άλλα µόρια, τότε είvαι δυvατόv vατρoπoπoιηθεί η κιvητική της όλης αvτίδρασης (vα επιταχυv-θεί ή vα επιβραδυvθεί η αvτίδραση), oπότε τα µόρια αυτά τα

ovoµάζoυµε εvεργoπoιητές ή αvαστoλείς, αvτίστoιχα. Στo κεφάλαιo αυτό θα µελετηθεί η επίδραση τωv διαφόρωvαvαστoλέωv (I) στηv κιvητική τωv εvζυµικώv αvτιδράσεωv, εξετάζovτας τηv επίδραση αυτώv τωv αvαστoλέωv στηvταχύτητα της όλης αvτίδρασης. Με τov όρo "αvαστoλή" (inhibition), δεv oρίζεται η µείωση

της ταχύτητας της εvζυµικής αvτίδρασης λόγω καταστρoφής τoυ εvζύµoυ (από τη θερµoκρασία, τo pH κ.λπ.), αλλά

λόγω της επίδρασης της αvτίδρασης Ε+IΕI στηvκιvητική τoυ εvζυµικoύ συστήµατoς και µόvo.

∆ηλαδή, της σύvδεσης τoυ αvαστoλέα µόvo µε τo έvζυµoκαι όχι µε τo υπόστρωµα.

Μια αvαστoλή λέγεται αvτιστρεπτή: Όταv απoκαθίσταται ισoρρoπία στηv αvτίδραση I+ΕΕIπoυ µπoρεί vα µετακιvηθεί πρoς τα δεξιά ή αριστερά

(απoµακρύvovτας π.χ. τov I από τηv αvτίδραση µε

διαπίδυση). Οι δεσµoί σύvδεσης τoυ Ε µε τov Ι, είvαι ασθεvείς καιυπάρχει κάπoια σταθερά αστάθειας (ΚI), πoυ απoτελεί καιτo µέτρo της συγγέvειας τoυ Ε πρoς τo I.

Μια αvαστoλή λέγεται µη αvτιστρεπτή:Όταν oι δεσµoί τoυ Ε και I είvαι σταθερoί και ηαvτίδραση είvαι µόvιµα µετατoπισµέvη πρoς τα δεξιά

(δηλαδή Ε+I→ΕI). ∆εv απελευθερώvεται τo Ε, όταv απoµακρυvθεί o Ι(όπως συµβαίvει στηv πρoηγoύµεvη περίπτωση µε

διαπίδυση). Υπάρχει µια σταθερά ταχύτητας (κ), πoυ δηλώvει τoκλάσµα τoυ Ε πoυ αvαστέλλεται σε oρισµέvη χρovικήπερίoδo και από oρισµέvη συγκέvτρωση Ι.

Κάθε όµως κατηγορία περιλαµβάνει διάφορες

υποκατηγορίες ανάλογα µε το αν ο αναστολέας συνδέεται

µε το ένζυµο στο ενεργό κέντρο, κοντά στο ενεργό κέντρο ή

µακριά απ’ αυτό ή

αν κάθε µόριο ενζύµου συνδέεται µε περισσότερα από

ένα µόρια αναστολέα.

Η µελέτη των αναστολέων των ενζυµικών αντιδράσεων, βοηθάει στη διαλεύκανση του µηχανισµού δράσης των

ενζύµων

βοηθάει στη διαλεύκανση της δοµής των ενζύµων

βοηθάει στη διαλεύκανση της βιοχηµικής πορείας, έχει εφαρµογές στη φαρµακολογία και στην τοξικολογία.

ΑΝΤIΣΤΡΕΠΤΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ

Μια αvτιστρεπτή αvαστoλή, αvάλoγα µε τo αv θα µεταβληθεί

τo ΚΜ ή Vmax, διακρίvεται στις εξής κατηγoρίες :

I. Αvταγωvιστική αvαστoλή, όταv αυξάvεται η τιµή τoυΚΜ και µέvει αµετάβλητη η τιµή τoυ Vmax.

II. Μη αvταγωvιστική αvαστoλή, όταv µειώvεται η τιµή

τoυ Vmax και µέvει αµετάβλητη η τιµή τoυ ΚΜ.

III. Συvαγωvιστική αvαστoλή, όταv µειώvεται η τιµή τoυ

Vmax και τoυ ΚΜ και µάλιστα κατά τo αυτό πoσό.

IV. Μικτή αvαστoλή, όταv µειώvεται η τιµή τoυ Vmax,

αλλά αυξάvεται η τιµή τoυ ΚΜ.

Γραφικές παραστάσεις ανταγωνιστικής αναστολής

Το Vmax παραµένει

αµετάβλητο (VΡ= Vmax)και το ΚΜ αυξάνεται. Tο ΚΡ συµβολίζει

τη νέα τιµή της σταθεράς

Μichaelis-Μenten, παρουσία αναστολέα. ∆εν µπορεί να γίνει

διάκριση της πλήρως και

της µερικώς ανταγωνι-στικής αναστολής από τις

γραφικές παραστάσεις.

Η χρησιµότητα τωv γραφικώv αυτώv παραστάσεωv είvαιµεγάλη, γιατί βοηθά

στη διαπίστωση

τoυ µηχαvισµoύ δράσηςεvός αvαστoλέα και

στov υπoλoγισµό τωvδιαφόρωv αγvώστωvΜεγεθώv (Vmax,Kp,KI)

Στην περίπτωση της πλήρως

ανταγωνιστικής αναστολής,το ΚI υπολογίζεται µε τον τύπο

+=

I

MpK

IKK

][1

1

][

−

=

M

p

I

K

K

IK

Γραφικές παραστάσεις µη ανταγωνιστικής αναστολής

Το ΚΜ παραµένει αµετάβλητο ενώ το Vmax µειώνεται. ∆εν είναι δυνατή η διάκριση των δύο περιπτώσεων της µη

ανταγωνιστικής αναστολής, από τα διαγράµµατα.

Γραφικές παραστάσεις συναγωνιστικής αναστολήςΧαρακτηριστικό για την πλήρως συναγωνιστική αναστολή,

είναι το διάγραμμα Lineweaver-Βurk, από το οποίο φαίνεταιότι η ευθεία που αντιστοιχεί σ’αυτό τον τύπο αναστολής είναιπαράλληλη με την ευθεία που λαμβάνουμε απουσίααναστολέα, αφού η κλίση παραμένει η ίδια.

max

max

[ ]1'

[ ]1'

p I

Mp M

I

VI

V K VKK K

IK

⎛ ⎞+⎜ ⎟

⎝ ⎠= =

⎛ ⎞+⎜ ⎟

⎝ ⎠

Κλίση=

M

I

KK

I⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

−'][1

max

'][1

VKI

I⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

Γραφικές παραστάσεις µικτής αναστολής

Από τις γραφικές παραστάσεις φαίνεται ότι το ΚΜ αυξάνεται

ενώ το Vmax µειώνεται. ∆ιάκριση των περιπτώσεων της µικτής αναστολής δεν µπο-ρεί να γίνει από τα διαγράµµατα.

ΜΗ ΑΝΤΙΣΤΡΕΠΤΕΣ ΑΝΑΣΤΟΛΕΣ Στις µη αντιστρεπτές αναστολές, ο αναστολέας σχηµατίζεισταθερό σύµπλοκο µε το ένζυµο και η αντίδραση

Ε+Ι → ΕΙ

είναι µόνιµα µετατοπισµένη προς το σχηµατισµό του

συµπλόκου ΕΙ. Στην περίπτωση αυτή, δεν έχουµε σταθερά αστάθειας ΚΙ, αλλά σταθερά ταχύτητας κ, η δε ταχύτητα της αντίδρασηςδίνεται από τον τύπο

v= κ([Εt] - [ΕΙ]) ([Ιt] - [ΕΙ]) Στην κατηγορία των

µη αντιστρεπτών αναστολέων

ανήκουν τα βαρέα µέταλλα

π.χ. ο Ηg, ο οποίος σχηµατίζεισταθερά σύµπλοκα µε τις

θειοαλκοολικές οµάδες των

αµινοξέων του ενζύµου.

Μη αντιστρεπτοί αναστολείς είναι και οι

οργανοφωσφορικοί εστέρες, οι οποίοι έχουν τηνιδιότητα να αντιδρούν µε τη σερίνη και να απενεργοποι-

ούν κατά συνέπεια τα ένζυµα που περιέχουν σερίνη

(στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα αέρια νεύρων).

Ενώσεις που δρουν µη αντιστρεπτά µε συγκεκριµένα

αµινοξέα µίας πρωτεΐνης, έχουν χρησιµοποιηθεί σε

διάφορα ένζυµα για να δώσουν πληροφορίες, για τηφύση της περιοχής του ενζύµου, στην οποία οφείλεται ηκαταλυτική του δράση.

Tέλος, στο σχήµα, παρουσιά-ζεται ένα διάγραµµα v = f(Ι/Ε)

για µία µη αντιστρεπτή αναστο-λή σε υδρολυτική πορεία, όπουη αντίδραση ενζύµου και υπο-

στρώµατος είναι στοιχειοµετρική.

ΑΛΛΟΣΤΕΡΙΣΜΟΣ

Tα ένζυµα χαρακτηρίζονται από σηµαντικές ιδιότη-

τες, οι οποίες οφείλονται στη δοµή της πρωτεϊνικής

τους φύσης.

Όπως είναι γνωστό, η οργάνωση των πρωτεϊνών

και κατ’ επέκταση των ενζύµων, περιλαµβάνει την

1/ταγή, 2/ταγή, 3/ταγή, 4/ταγή και 5/ταγή δοµή.

Tα ένζυµα, τα οποία έχουν τεταρτοταγή δοµή,

δηλαδή διαθέτουν περισσότερες από µία υποµονά-

δες, έχουν τις ακόλουθες χαρακτηριστικές ιδιότητες:

Ενώ οι υποµονάδες τους (πρωτοµερή) δεν

εµφανίζουν ενζυµική δράση, το σύµπλοκο της

τεταρτοταγούς δοµής είναι ενζυµικά ενεργό.

Η ενζυµική δράση της τεταρτοταγούς δοµής

επιδέχεται αλλοστερ(εοχηµ)ική ρύθµιση µε δύο

τρόπους:

Η ενζυµική δράση της τεταρτοταγούς δοµής

επιδέχεται αλλοστερ(εοχηµ)ική ρύθµιση µε δύο

τρόπους:

Η δραστικότητα της κάθε υποµονάδας

επηρεάζεται από το είδος και τη χωροταξική

διαµόρφωση των άλλων υποµονάδων.

(Όταν το φαινόµενο αυτό γίνεται µε επαγωγή

τότε ονοµάζεται συνεργιστικό φαινόµενο).

Όταν υπάρχουν περισσότερα από ένα είδη

υποµονάδων, τότε οι δυνατοί συνδυασµοί

αυτών, οδηγούν σε ένζυµα µε την ίδια

εξειδίκευση, αλλά µε διαφορετική

δραστικότητα, τα οποία ονοµάζονται

ισοένζυµα.

Αν συγκρίνει κανείς την επίδραση της τριτοταγούς

και τεταρτοταγούς δοµής στην ενζυµική

συµπεριφορά, οδηγείται στο συµπέρασµα ότι

µε την τριτοταγή δοµή τα πρωτεϊνικά µόρια

αποκτούν µία ενδογενή ενζυµική ικανότητα, η

οποία εκδηλώνεται ή δεν εκδηλώνεται

πρωτογενώς

µε την τεταρτοταγή δοµή, τα πρωτεϊνικά µόρια

αποκτούν µία δευτερογενή ενζυµική δράση, που

είναι συνυφασµένη µε την ενεργοποίησή τους.

Για να γίνουν κατανοητά τα παραπάνω, θα αναφερ-

θεί το παράδειγµα της γλουταµινικής αφυδρογονάσηςTο ένζυµο αυτό έχει τεταρτοταγή δοµή µε 4 όµοιεςυποµονάδες.

Κάθε µία από τις υποµονάδες εµφανίζει σε πολύ

µικρό βαθµό δράση αφυδρογονάσης αλανίνης

το ένζυµο έχει ισχυρή δράση αφυδρογονάσης

γλουταµίνης. Φαίνεται λοιπόν, ότι

από την τριτοταγή δοµή καθορίζεται το είδος της αντί-δρασης που καταλύει το ένζυµο (η ενδογενής ενζυµικήικανότητα π.χ. της αφυδρογονάσης) µε την τεταρτοταγή δοµή, αλλάζει η διαµόρφωση τουενεργού κέντρου του ενζύµου µε αποτέλεσµα να γίνεται

αφ’ ενός δραστικότερο, αφ’ ετέρου δε να αλλάζει η εξειδίκευσή του ως προς τουπόστρωµα (η δευτερογενής ενζυµική δράση π.χ. τηςγλουταµινικής αφυδρογονάσης)

Επειδή συχνά, ο όρος αλλοστερικό ένζυµο χρησιµο-ποιείται για να προσδιορίσει οποιοδήποτε ένζυµο στο

οποίο εκδηλώνεται συνεργιστικό φαινόµενο (και τα

περισσότερα αλλοστερικά ένζυµα εκδηλώνουν

συνεργιστικά φαινόµενα), γι΄αυτό υπάρχει µία σύγχυση

ανάµεσα σε αυτούς τους όρους. Ο όρος αλλοστερικό φαινόµενο πρωτοαναφέρθηκε

από τους Μonod, Changeux και Jacob, για να εξηγήσειτην ανταγωνιστική αναστολή των ενζύµων από ενώσεις

που έχουνε µικρή οµοιότητα στη δοµήµε το υπόστρωµα.

Σαν ισοστερικός αναστολέας µπορεί

να χαρακτηρισθεί ο ανταγωνιστικός

αναστολέας που είναι δοµικό ανάλογο

του υποστρώµατος, ενώ Σαν αλλοστερικός αναστολέας,

όταν είναι διαφορετικής δοµής

από το υπόστρωµα.

Ο Μonod στη συνέχειαπρότεινε ότι αυτοί οι

αλλοστερικοί αναστολείς

δεσµεύονται σε θέσεις

διαφορετικές, και πιθανώςαποµακρυσµένες από το

ενεργό κέντρο του ενζύµου

οι οποίες ονοµάζονται

αλλοστερικές θέσεις. Εκδηλώνουν δε τα ανταγωνιστικά τους φαινόµενα, µεµεταβολή της διαµόρφωσης του ενζύµου, έτσι ώστε ηδέσµευση του αναστολέα να εµποδίζει τη δέσµευση του

υποστρώµατος και το αντίστροφο. Μηχανισµοί όµως τέτοιας φύσης, όπου η δέσµευση µίαςένωσης σε περιοχή διαφορετική από το ενεργό κέντρο, οδηγεί σε αλλαγή της χωροταξικής διαµόρφωσης του

ενζύµου, µπορούν να εξηγήσουν και άλλες περιπτώσειςεκτός από την ανταγωνιστική αναστολή.

Γι’ αυτό, εισήχθηκε ο όρος αλλοστερικός τροποποιητής, γιανα καλύψει και αναστολείς και ενεργοποιητές, που δρουνµ’αυτό τον τρόπο και εκδηλώνουν αντίστοιχα, αρνητικό καιθετικό αλλοστερικό φαινόµενο. Tα ένζυµα, που διαφοροποιείται η δράση τους από άλλο-στερικούς τροποποιητές, καλούνται αλλοστερικά ένζυµα.

Θεωρητικά, έναµονοµερές ένζυµο

(δηλαδή µε τριτοταγήδοµή), µπορεί ναυποστεί αλλαγή της

διαµόρφωσής του, µετά τη σύνδεση ενός

υποκαταστάτη σ’αυτό.

Σαν υποκαταστάτες

θεωρούνται το

υπόστρωµα, οαναστολέας και ο ενεργοποιητής. Στην πράξη, είναι γνωστά µόνο δύο µονοµερήαλλοστερικά ένζυµα:

Η πυροσταφυλική-UDΡ-Ν-ακετυλο-γλυκοζαµινο-τρανσφεράση και Η αναγωγάση του διφωσφο-ριβονουκλεοζιδίου.

Tα περισσότερα αλλοστερικά ένζυµα είναι

ολιγοµερή, (δηλαδή έχουν π.χ. τεταρτοταγή δοµή).

Υπάρχουν δε οι ακόλουθες περιπτώσεις: Η δέσµευση ενός

υποκαταστάτη στο

ένα πρωτοµερές των

ενζύµων, µπορεί ναεπηρεάσει τη δέσµευση άλλων µορίων του ίδιου υποκατα-στάτη, στα άλλα πρωτοµερή του ενζύµου (οµότροπεςαλληλεπιδράσεις). Η δέσµευση ενός

υποκαταστάτη στο ένα

πρωτοµερές επηρεάζει

τη δέσµευση διαφορετικού

υποκαταστάτη στο πρωτο-µερές αυτό (ετερότροπηαλληλεπίδραση ).(π.χ.επίδραση αναστολέα στη δέσµευση υποστρώµατος).

Όταν η δέσµευση ενός

υποκαταστάτη στο ένα

πρωτοµερές επηρεάζει

τη δέσµευση διαφορετικού

υποκαταστάτη στο πρωτο-µερές αυτό (ετερότροπηαλληλεπίδραση ).

Αυτού του τύπου οι αλληλεπιδράσεις είναι θετικές ή

αρνητικές και µπορεί να συµβούν και στα µονοµερή

αλλοστερικά ένζυµα. Η µεταβίβαση των οµότροπων και ετερότροπων

αλληλεπιδράσεων ανάµεσα στα πρωτοµερή του ενζύµου, οφείλεται στο

συνεργιστικό

φαινόµενο. Όταν συµβαίνουν και τα δύο φαινόµενα (αλλοστερικοίτροποποιητές είναι και το υπόστρωµα και άλλες ενώσεις), τότε έχουµε οµοετερότροπες (µικτές) αλληλεπιδράσεις.

Η θεωρία του συνεργιστικού φαινοµένου προτάθηκε για να

εξηγήσει την αλληλεπίδραση ανάµεσα στις θέσεις δέσµευσης

των υποκαταστατών στις υποµονάδες (πρωτοµερή) τωνολιγοµερών ενζύµων. Ο όρος συνεργιστικό φαινόµενο, αναφέρεται στο φαινόµενοκατά το οποίο η δέσµευση ενός µορίου υποκαταστάτη σε ένα

πρωτοµερές του ενζύµου, επηρεάζει τη δέσµευση τουδεύτερου µορίου ίδιου υποκαταστάτη σε άλλο πρωτοµερές

του ίδιου

ενζύµου.

Θετικό συνεργιστικό φαινόµενο συµβαίνει όταν στην

οµότροπη αλληλεπίδραση, η δέσµευση του µορίου τουυποκαταστάτη αυξάνει την ικανότητα του ενζύµου για

δέσµευση των άλλων µορίων του υποκαταστάτη, ενώ Αρνητικό συνεργιστικό φαινόµενο ή µη συνεργιστικό

συµβαίνει όταν µειώνεται η ικανότητα του ενζύµου για

δέσµευση των άλλων µορίων του υποκαταστάτη.

Από τα παραπάνω φαίνεται, ότι αλλοστερικό φαινόµενοκαλείται η αλλαγή στη διαµόρφωση ενός πρωτοµερούς, µετάαπό δέσµευση υποκαταστάτη σε αλλοστερική θέση του

πρωτοµερούς. Ενώ, το συνεργιστικό φαινόµενο αναφέρεται στην αλλαγήτης διαµόρφωσης ενός πρωτοµερούς, στο οποίο έχειδεσµευτεί τροποποιητής και η οποία αλλαγή έχει σα συνέ-πεια να µετατραπεί η δοµή και του γειτονικού πρωτοµερούς, έτσι ώστε να αλλάξει η ικανότητα και αυτού για δέσµευση

άλλου µορίου του ίδιου ή διαφορετικού υποκαταστάτη. Για όλα τα ένζυµα που εµφανίζουν συνεργιστικό φαινόµενο

έχουν βρεθεί αλλοστερικοί τροποποιητές. Ενώ, υπάρχουν ολιγοµερή ένζυµα που εµφανίζουν άλλο-στερικό φαινόµενο, χωρίς όµως να υπάρχει συνεργιστικόφαινόµενο.

Για παράδειγµα, στην αφυδρογονάση της αλκοόλης,αλλάζει διαµόρφωση το ένα πρωτοµερές µετά από

δέσµευση αλλοστερικού τροποποιητή, χωρίς όµως ναεπηρεάζεται το άλλο πρωτοµερές.

Στο Πίνακα συνοψίζονται όλα τα παραπάνω.

Η αµέσως ανώτερη -από την τεταρτοταγή δοµή-

βαθµίδα οργάνωσης των πρωτεϊνικών µορίων, είναι

η πεµπτοταγής δοµή.

Στα πρωτοµερή της πεµπτοταγούς δοµής, η

εξειδικευµένη δραστικότητα υπάρχει εκ των

προτέρων και µάλιστα διατηρείται και µετά τη

διάσπαση του ενζυµικού συστήµατος.

Επιπλέον χαρακτηριστικό της πεµπτοταγούς

δοµής, είναι ότι τα ένζυµα που την αποτελούν, δεν

έχουν δράση άσχετη µεταξύ τους αλλά εκτελούν µία

σειρά δράσεων µε ελεγχόµενο ρυθµό. Αυτές οι

δράσεις αντιπροσωπεύουν µία διάκριτη πορεία

βιοχηµικών αντιδράσεων (π.χ. οξειδωτική αποκαρ-

βοξυλίωση του πυροσταφυλικού οξέος ή de novo

βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων) ή ένα βιολογικό

µηχανισµό (π.χ. µυϊκή συστολή).

Αλλοστερικά φαινόµενα παρουσιάζονται και στα

ένζυµα µε πεµπτοταγή δοµή και µάλιστα αυξάνεται η

ποικιλία των περιπτώσεων που συναντώνται. Σαν αλλοστερικός ενεργοποιητής µπορεί να χρησιµο-ποιηθεί µια πρόδροµη ένωση, οπότε λέγεται ενεργοποί-ηση µητρικής ένωσης.

A A1 Av X Ψ Ζ

Έτσι, η ταχύτητα µετατρoπής του Χ σε Ζ βρίσκεταιυπό αλλoστερική ρύθµιση και τo όλo σύστηµασυµπεριφέρεται σαv αυτoρυθµιζόµεvo σύστηµα.

Σαν αλλοστερικός αναστολέας µπορεί να χρησιµοποι-ηθεί το τελικό προϊόν οπότε λέγεται αναστολή τελικού

προϊόντος (end-product inhibition) ή αναδραστικήαναστολή (retro-inhibition) ή έλεγχος µε αντίστροφητροφοδότηση (feed back control).

X Ψ Ζ

Συνοψίζοντας πρέπει να αναφερθεί ότι, τα

περισσότερα αλλοστερικά ένζυµα συµµετέχουν

στις βραδείες αντιδράσεις των µεταβολικών

πορειών.

Και έτσι ο µεταβολισµός στο σύνολό του,

ρυθµίζεται από έναν πολύπλοκο συνδυασµό

διαδοχικών και πλήρως εξειδικευµένων

αλλοστερικών φαινοµένων.

Η δε πεµπτοταγής δοµή των ενζύµων,

αντιπροσωπεύει τον κύριο συντελεστή της

κανονικής πορείας του µεταβολισµού στο σύνολό

του.

ΠΡΟΤΥΠΑ (ΜΟΝΤΕΛΑ) ΑΛΛΟΣΤΕΡΙΚΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ

ΕΞΗΓΗΣΗ ΤΟΥ ΣΥΝΕΡΓΙΣΤΙΚΟΥ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟΥ Στα αλλοστερικά ένζυµα µε τεταρτοταγή ή πεµπτοταγή

δοµή, η δραστικότητα κάθε υποµονάδας µεταβάλλεταιεπαγωγικά από την χωροταξική διαµόρφωση και το είδος

των άλλων υποµονάδων. Αυτό έχει σαν αποτέλεσµα η καµπύλη της αρχικής

ταχύτητας σε συνάρτηση µε τη συγκέντρωση του

υποστρώµατος, να εµφανίζει σιγµοειδή µορφή για µικρέςσυγκεντρώσεις υποστρώµατος.

∆ηλαδή, ενώ στην αρχή η ταχύ-τητα της αντίδρασης είναι πολύ

µικρή, καθώς αυξάνει η συγκέ-

ντρωση του υποστρώµατος, αυξάνει γρήγορα και η ταχύτητα

χωρίς να διατηρείται σταθερός

ο ρυθµός της µεταβολής της.

Για να εξηγηθεί µε µαθηµατικό τρόπο η σιγµοειδής

µορφή της καµπύλης

µε βασική παραδοχή ότι το σύστηµα βρίσκεται

στην κατάσταση ισορροπίας (standard state)

έχουν προταθεί διάφορα µοντέλα, τα οποία

αποτελούν τα µοντέλα σύνδεσης ισορροπίας

(equilibrium binding models), µε πιο σηµαντικά

το µοντέλο των Μonod-Wyman-Changeux και του

Κoshland.

µε βασική παραδοχή ότι το σύστηµα βρίσκεται

σε µια σταθεροποιηµένη ισορροπία (steady state)

έχουν προταθεί άλλα µοντέλα, τα οποία

αποτελούν τα κινητικά µοντέλα (kinetic models)

µε πιο σηµαντικά το µοντέλο του Rabin και του

Ferdinand .

Μοντέλο Μonod - Wyman -

Changeux ή συνδυασµένο

µοντέλο (concerted model) Αν και το συγκεκριµένο µοντέλο

περιλαµβάνει πολλές παραδοχές, απόαυτό έχει προέλθει το µεγαλύτερο µέρος

της ονοµατολογίας που σχετίζεται µε τον

αλλοστερισµό και το συνεργιστικό

φαινόµενο. Οι παραδοχές που γίνονται στο

µοντέλο αυτό είναι οι εξής:1) Tα πρωτοµερή των ενζύµων πουεµφανίζουν συνεργιστικό φαινόµενο

είναι πανοµοιότυπα και συνδυασµένα µε

τέτοιο τρόπο, ώστε να καταλαµβάνουνισοδύναµες θέσεις στο ένζυµο (υπάρχειτουλάχιστον ένας άξονας συµµετρίας

στο πρωτεϊνικό µόριο).

2) Κάθε πρωτοµερές έχει µία εξειδικευµένη θέσηδέσµευσης για κάθε υποκαταστάτη.

(Στην περίπτωση που το αλλοστερικόένζυµο αποτελείται από διαφορετικούς

τύπους υποµονάδων, ο όρος πρωτοµερέςδεν αντιστοιχεί σε κάθε µία ξεχωριστά

υποµονάδα αλλά σε κάθε διαφορετικό

τύπο υποµονάδων). Οι δύο πρώτες παραδοχές οδηγούν στο

συµπέρασµα ότι οι θέσεις δέσµευσης για κάθε

υποκαταστάτη είναι ισοδύναµες. Επιπλέον, η αλλαγή διαµόρφωσης ενόςπρωτοµερούς µετά τη σύνδεση του

υποκαταστάτη σε αυτό, οδηγεί σεπανοµοιότυπη αλλαγή διαµόρφωσης και των

άλλων πρωτοµερών, έτσι ώστε ναδιατηρείται η συµµετρία του πρωτεϊνικού

µορίου.

3) Κάθε πρωτοµερές µπορεί ναβρίσκεται σε δύο χωροδιατάξεις Α

και Β. 4) Tο ελεύθερο ένζυµοχαρακτηρίζεται από δύο ακραίες

καταστάσεις, όπου στη µία απ’αυτές, την T (tense) όλα ταπρωτοµερή έχουν τη µορφή Α και

στην άλλη, τη R (relaxed) έχουν τηµορφή Β.

Επιπλέον, οι καταστάσεις T καιR βρίσκονται σε ισορροπία και L ορίζεται η σταθερά ισορροπίας ή

αλλιώς η αλλοστερική σταθερά. Συνήθως το ελεύθερο ένζυµο

βρίσκεται σε µεγαλύτερη

αναλογία στην κατάσταση T απ’ότι στην κατάσταση R.

5) Οι υποκαταστάτεςπου δρουν σαν

υποστρώµατα ή

σαν ενεργοποιητές

έχουν µεγαλύτερη

συγγένεια µε το

ένζυµο που

βρίσκεται στην

κατάσταση R, ενώεκείνοι που δρουν

σαν

αναστολείς έχουν

µεγαλύτερη

συγγένεια µε το

ένζυµο στην

κατάσταση T

Οι παραδοχές που γίνονται στο µοντέλο

αυτό εξηγούν τη σιγµοειδή µορφή της

καµπύλης v=f([S]) ως εξής: Όταν το ένζυµο είναι ελεύθερο, ησυγκέντρωση της δραστικής µορφής του

(R) είναι µικρή και κατά συνέπεια και η

ταχύτητα της αντίδρασης είναι µικρή. Όταν το υπόστρωµα αρχίζει να δε-σµεύεται στα πρωτοµερή, σχηµατίζο-

νται τα σύµπλοκα Β4S1, Β4S2, Β4S3 και

Β4S4. Tο αποτέλεσµα είναι, να µειώνεται ησυγκέντρωση της R µορφής και για ναδιατηρηθεί η ισορροπία, µετατρέπονταισυνεχώς νέες ποσότητες του ενζύµου από

τη µορφή T στη R, (συνεχής αύξηση τηςποσότητας της δραστικής µορφής του Ε µε

την αύξηση της συγκέντρωσης του S.

Γι’αυτό το λόγο

στην καµπύλη

v=f([S])

η ταχύτητα της

αντίδρασης (µε την

αύξηση της [S])

αυξάνεται

πολύ γρήγορα

και

µε µη σταθερό

ρυθµό.

Πρέπει να αναφερθεί ότι, αν και το συγκεκριµένο

µοντέλο βρίσκει εφαρµογή στην κινητική

συµπεριφορά πολλών ενζύµων, δεν µπορεί να

εξηγήσει το αρνητικό συνεργιστικό φαινόµενο.

Μοντέλο Κoshland ή διαδοχικό

µοντέλο (sequential model) Οι παραδοχές που γίνονται στο

µοντέλο αυτό είναι οι εξής:

1) Η κάθε υποµονάδα (πρωτοµε-ρές) µπορεί να βρίσκεται σε δύο

µορφές, Α και Β, όπως άλλωστείσχυε και στο µοντέλο Μonod.

2) ∆εν υπάρχουν όµως µόνοακραίες καταστάσεις του ενζύµου, δηλαδή καταστάσεις που όλες οι

υποµονάδες είναι ή Α ή Β, αλλάδέχεται ότι είναι δυνατό να

υπάρχουν και ενδιάµεσες µορφές

του ενζύµου, δηλαδή εισάγει έναµηχανισµό επαγώγιµης

προσαρµογής.

3) Tο συγκεκριµένο µοντέλοπροτείνει ότι η δέσµευση του

υποστρώµατος σε µία

υποµονάδα του ενζύµου

οδηγεί σε χωροταξική

αλλαγή της υποµονάδας

αυτής

η οποία έχει σαν

αποτέλεσµα να αλλάζει η

σταθερότητα των γειτονικών

υποµονάδων (και όχιαπαραίτητα η χωροδιάταξή

τους) έτσι ώστε να

διαφοροποιείται η ικανότητα

δέσµευσης των υπόλοιπων

µορίων του υποστρώµατος

σε αυτές.

Η δέσµευση του

υποστρώµατος σε οποιαδήποτε

υποµονάδα του ενζύµου µε τη

µορφή Β, εξαρτάται από τα εξής: Tη σταθερά διάστασης τουσυµπλόκου ΒS (Κs)

όπου Κs = [Β][S]/[ΒS], [Β] ησυγκέντρωση του ελεύθερου

ενζύµου στη Β µορφή και [ΒS] ησυγκέντρωση του συµπλόκου ΒS.

Tη σταθερά ισορροπίας τηςµετατροπής

Α Β (L) όπου L = [Β]/[Α] και [Α] ησυγκέντρωση του ελεύθερου

ενζύµου στην Α µορφή. Tις αλληλεπιδράσεις στιςυποµονάδες.

Σε ένα διµερές ένζυµο, οι αλληλεπιδράσεις αυτέςχαρακτηρίζονται από τις σταθερές ΚΑΑ, ΚΑΒ και ΚΒΒ

όπου θεωρείται ότι η ΚΑΑ =1 και οι άλλες δύο δίνονται

από τους ακόλουθους τύπους:ΚΑΒ = [ΑΒ][Α]/[ΑΑ][Β] και

ΚΒΒ = [ΒΒ][Α][Α]/[ΑΑ][Β][Β] Εάν ΚΑΒ>1, τότε

είναι µεγαλύτερη η

αλληλεπίδραση

ανάµεσα στα Α και Β,

από ότι ανάµεσα στα

Α και Α και άρα

ευνοείται η µετατροπή

του ενζύµου στην

κατάσταση ΑΒ.

Έστω ένα διµερές ένζυµο, όπου οι δύο υποµονάδες του ενζύµου συνδέονται µε δεσµούς

υδρογόνου και

δυνάµεις Van der Waals και

τα δε ηλεκτροστατικά φορτία είναι αποµακρυσµένα και

εξουδετερώνονται από ανιόντα και κατιόντα του

διαλύµατος.

Όταν συνδεθεί το πρώτο

µόριο υποστρώµατος σε

µία υποµονάδα, σύµφωναµε το µοντέλο Κoshlandαλλάζει η χωροδιάταξη της

υποµονάδας αυτής και το

ένζυµο από ΑΑ

µετατρέπεται είτε σε ΑΒ είτε

σε ΓΒ.

Στην περίπτωση που το ένζυµο βρίσκεται στην κατάσταση

ΑΒ, η αλλαγή της χωροδιάταξης της µίας υποµονάδας έχεισαν αποτέλεσµα να πλησιάσουν τα φορτία και να δηµιουργη-θεί ένας περισσότερο σταθερός δεσµός (ΚΑΒ>ΚΑΑ). Στην άλλη περίπτωση, το ένζυµο βρίσκεται στην κατάστα-ση ΓΒ, επειδή σύµφωνα µε τη θεωρία, το πλησίασµα τωνφορτίων αλλάζει τη

σταθερότητα της άλλης

υποµονάδας, η οποίαπαίρνει µία ενδιάµεση

µορφή Γ, µε αποτέλεσµα τηδηµιουργία σταθερότερου

δεσµού (ΚΓΒ>ΚΑΑ).

Και στις δύο περιπτώσεις (το ένζυµο βρίσκεται στηνκατάσταση ΑΒ ή ΒΓ),

ευνοείται η µετατροπή του ενζύµου

το οποίο στη συνέχεια δέχεται µε µεγαλύτερη ευκολία

ένα άλλο µόριο υποστρώµατος και

µετατρέπεται στη µορφή ΒΒ, όπου τα φορτία έχουν

έρθει ακόµα πιο κοντά

και οι υποµονάδες είναι

ισχυρά συνδεδεµένες

(ΚΒΒ>ΚΑΒ, ΚΒΒ>ΚΓΒ).Ένα παράδειγµα θετικού

συνεργιστικού φαινοµένου

σε διµερές ένζυµο, σύµφωναµε το µοντέλο του Κoshland,δίνεται στο σχήµα.

Η σιγµοειδής µορφή της καµπύλης v=f([S]) εξηγείται και µε το µοντέλο αυτό, ως εξής:

Αρχικά, το ένζυµο που βρίσκεται στηνκατάσταση T, έχει µικρή συγγένεια µε τουπόστρωµα. Η δέσµευση όµως του πρώτου µορίου

υποστρώµατος σε µία υποµονάδα, έχει σαναποτέλεσµα να αλλάζει η χωροδιάταξη αυτής

της υποµονάδας και η σταθερότητα των

γειτονικών της υποµονάδων, έτσι ώστε νααυξάνει η ικανότητα δέσµευσης για τα

υπόλοιπα µόρια υποστρώµατος. Έτσι, καθώς αυξάνει η συγκέντρωση τουυποστρώµατος, αυξάνει ο ρυθµός δέσµευσηςτου υποστρώµατος από το ένζυµο πολύ

γρήγορα και µε µη σταθερό ρυθµό, µε τηναύξηση της [S] και η καµπύλη v=f([S]) παίρνει σιγµοειδή µορφή.

Με το µοντέλο του Κoshland

εξηγείται επιπλέον και το αρνητικό συνεργιστικό

φαινόµενο, αφού

δεν αποκλείει την περίπτωση, η δέσµευση

ενός µορίου υποστρώµατος να οδηγήσει σε

τέτοια χωροταξική αλλαγή την υποµονάδα,

ώστε να µην ευνοείται η δέσµευση των

υπόλοιπων µορίων υποστρώµατος,

(δηλαδή για ένα διµερές ένζυµο να ισχύει

ΚΑΒ ή ΚΓΒ < 1).

Μοντέλο του Ηill (ή κινητική Ηill) Tο µοντέλο αυτό προτάθηκε το 1949 από τον Ηill, µε σκοπόνα εξηγηθεί η σιγµοειδής καµπύλη της δέσµευσης του

οξυγόνου στην αιµοσφαιρίνη. Οι συλλογισµοί που γίνονται σ’ αυτό το µοντέλο και τασυµπεράσµατα στα οποία καταλήγει είναι τα εξής:

Αν ορισθεί ως Υs ο βαθµός κορεσµού του ενζύµου απόέναν υποκαταστάτη S, τότε :

][

][

t

b

SEn

SY =όπου [Sb] η συγκέντρωση του

δεσµευµένου στο ένζυµο

υποκαταστάτη, n ο αριθµός τωνθέσεων δέσµευσης του

υποκαταστάτη ανά µόριο ενζύµου

και [Εt] η συνολική συγκέντρωσητου ενζύµου.

Τότε το γινόµενο η[Εt] αντιπροσωπεύει το

συνολικό αριθµό των θέσεων του ενζύµου που

µπορούν να δεσµευτούν από το υπόστρωµα.

Επιπλέον, το κλάσµα των θέσεων του ενζύµου που

δεν έχουν συνδεθεί ακόµα από το υπόστρωµα,

ισούται µε 1-Υs αφού

S

t

bt

t

f

btf YEn

SEn

En

EnSEnEn −=

−=⇒−= 1

][

][][

][

][][][][

όπου [Εf] η συγκέντρωση του ελεύθερου ενζύµου

Για ένζυµα

που είναι µονοµερή (όπου n=1) ή

που έχουν τεταρτοταγή ή πεµπτοταγή δοµή, και

έχουν όµως όµοιες υποµονάδες, οι οποίες

δεν αλληλεπιδρούν µεταξύ τους (δηλαδή δεν

εµφανίζεται συνεργιστικό φαινόµενο),

ισχύουν τα εξής : v1 κ1

E + S ES→ E + Pv-1 κ-1

]][[11 fESv κ= ][][

111 bSESv −−− == κκκαι

1

1

κ

κ −==]ES[

]S][E[f

SfK]S][E[

]ES[ 1

1

1 ===−κ

κ

ΚS(σταθερά διάστασης)

Κα(σταθερά σύνδεσης)

Στην κατάσταση όµως σταθεροποιηµένης

ισορροπίας (steady state) ισχύει ότι:

1 1 1 1[ ][ ] [ ]

f bv v S E Sκ κ− −= ⇒ = ⇒

( )1 1 1 1

[ ] [ ][ ] [ ] 1

[ ] [ ]

f b

S S

t t

n E n SS S Y nY

n E n Eκ κ κ κ− −= ⇒ − = ⇒

][1

][

][

][

SK

SK

SK

SY

a

a

S

S +=

+=⇒

Όπου n=1

Η γραφική παράσταση Υs=f([S]) είναι υπερβολή,

εκτός από την περίπτωση που ισχύει ένας από τους

ακόλουθους λόγους:

Η ταχύτητα της αντίδρασης δεν εξαρτάται µόνο

από τη συγκέντρωση του συµπλόκου ενζύµου-

υποστρώµατος

Λαµβάνουν χώρα και άλλες ενδιάµεσες

αντιδράσεις, εκτός από αυτές που αναφέρθηκαν

παραπάνω.

Στην αντίδραση συµµετέχουν περισσότερα από

ένα µόρια υποστρώµατος.

Tα πολυµερή ένζυµα, στα οποία ισχύουν οι

παραπάνω λόγοι, ακολουθούν κινητική, που

περιγράφεται από την εξίσωση Ηill.

Η ενζυµική αντίδραση στην περίπτωση αυτή

είναι :

Ε + nS ΕSn

Με ανάλογους συλλογισµούς

λαµβάνεται η εξίσωση:

Η γραφική παράστα-

ση της σχέσης

ΥS = f( [S] ),

δίνεται στο σχήµα

Με λογαρίθµηση της

παραπάνω εξίσωσης

έχουµε ότι:

S

n

S

S

n

a

n

a

n

S

n

SK

S

Y

Y

SK

SK

SK

SY

][

1][1

][

][

][=

−⇒

+=

+=

SH

S

S KSnY

Ylog]log[

1log −=

−όπου nΗ: ο συντελεστής Ηill.

Η γραφική παράστασητης εξίσωσης Ηill

S

S

YY−1

log

είναι ευθεία γραμμή, η κλίσητης οποίας ισούται με nΗ καιτο σημείο τομής της με τονάξονα των ψ αντιπροσωπεύειτην τιμή –logΚs

= f (log[S])

Στο μοντέλο του Ηill, το nΗαντιπροσωπεύει τον αριθμό των θέσεων δέσμευσηςτου υποστρώματος στο ένζυμο. Στα μονομερή ένζυμα ή στα ένζυμα που δεν

εμφανίζεται συνεργιστικό φαινόμενο, ο nΗ ισούται μετη μονάδα.

Αν εφαρµοσθεί η εξίσωση του Ηill στην

αιµοσφαιρίνη, βρίσκεται ότι το nΗ ισούται µε 2,8.

Eνώ στην πραγµατικότητα η αιµοσφαιρίνη έχει

τέσσερις θέσεις δέσµευσης για το οξυγόνο.

Η απόκλιση ανάµεσα στην πειραµατική και στην

πραγµατική τιµή οφείλεται στις ακόλουθες δύο

παραδοχές, οι οποίες δεν ανταποκρίνονται στην

πραγµατικότητα και που έγιναν κατά την εξαγωγή

της εξίσωσης Ηill:

Ότι όλο το ένζυµο βρίσκεται είτε

στην ελεύθερη µορφή (Ε), είτε

στη µορφή του συµπλόκου ΕSn και

Ότι η δέσµευση του υποστρώµατος δε γίνεται

σταδιακά και άρα δε σχηµατίζονται ενδιάµεσα

σύµπλοκα ή µόλις σχηµατίζονται µετατρέπονται

αµέσως στο σύµπλοκο ΕSn.

∆ηλαδή το nΗ = nmax, ισχύει µόνο θεωρητικά.

Επειδή συνήθως nΗ ≤≤≤≤ n , ο nΗ δείχνει τον ελάχιστοαριθµό θέσεων δέσµευσης του ενζύµου (π.χ. στην

αιµοσφαιρίνη όπου nΗ =2,8, υπάρχουν τουλάχιστον

3 σηµεία σύνδεσης Ο2)

Επιπλέον, η εξίσωση Ηill : Χρησιµοποιείται για να προσδιορισθεί η ύπαρξη

αρνητικού και θετικού συνεργιστικού φαινοµένου

Ο συντελεστής nΗ, αποτελεί και µέτρο τηςαλληλεπίδρασης των θέσεων δέσµευσης µεταξύ τους.

Από την εξίσωση Ηill φαίνεταιότι αν:

nΗ =1, τότε δεν υπάρχεισυνεργιστικό φαινόµενο

και ακολουθείται η κινητική

των µονοµερών ενζύµων. Η γραφική παράσταση v=f([S]) ή Υs=f([S]) είναι

υπερβολή. Tο διάγραµµαLineweaver-Βurk

για nΗ =1 δίνειευθεία γραµµή.

nΗ >1, τότε εµφανίζεται θετικόσυνεργιστικό φαινόµενο

Η γραφική παράσταση v=f([S])ή Υs=f([S]) είναι σιγµοειδής. Tο διάγραµµα Lineweaver-Βurkγια nΗ =2 παρουσιάζεται στοσχήµα.

nΗ <1, τότε εµφανίζεται αρνητικόσυνεργιστικό φαινόµενο.

Η γραφική παράσταση v=f([S])ή Υs=f([S]) δεν είναι σιγµοειδής. Το διάγραµµα Lineweaver-Βurkγια nΗ <1 δε δίνει ευθεία γραµµή.(Οι µορφές των γραφικών παραστάσεων εµφανίζονταικαι σε άλλες περιπτώσεις ενζυµικών αντιδράσεων -π.χ. επίδραση ηλεκτροστατικών απώσεων- η συνθήκηnΗ <1 δεν είναι ικανή και αναγκαία, για να θεωρηθεί ότιέχουµε αρνητικό συνεργιστικό φαινόµενο).

Στις περισσότερες περιπτώσεις, έχει βρεθεί ότι η γραφικήπαράσταση Υs=f([S]) είναι ο πιο ικανοποιητικός τρόπος γιατην εξαγωγή των δεδοµένων για το συνεργιστικό φαινόµενο. Για τη µέτρηση του συνεργιστικού φαινοµένου χρησιµοποι-είται ο συντελεστής συνεργιστικότητας Rs, ο οποίος ορίζεταιως εξής:

%]S[

%]S[R

S10

90

για

για=

Στα ένζυµα που η γραφική παράσταση Υs=f([S]) είναι υπερβολή (δεν υπάρχει συνεργιστικό φαινόµενο)

ο Rs ισούται µε 81, ενώ

στις περιπτώσεις που υπάρχει θετικό ή αρνητικό

συνεργιστικό φαινόµενο

ο Rs έχει τιµή µικρότερη του 81 ή µεγαλύτερη του 81, αντίστοιχα.

Η σχέση µεταξύ nΗ και Rs δίνεται από τον τύπο:

Hn

SR 81=

Ο συντελεστής nΗ αποτελεί ένα μέτρο της αλληλε-πίδρασης των θέσεων δέσμευσης μεταξύ τους.Για την κατανόηση της φυσικής σημασίας του συντελεστή

Ηill, γίνεται διερεύνηση των τιμών που λαμβάνει ο nΗ, στιςδιάφορες τιμές του Υs, στη γραφική παράσταση τηςεξίσωσης Ηill. Όπως φαίνεται από το σχήμα

η γραφική παράσταση δεν είναιευθεία γραμμή όπως προβλέπε-ται από τη θεωρία του Ηill.Αυτό συμβαίνει γιατί όπως έχει

ήδη αναφερθεί, δεν ισχύει η παρ-αδοχή ότι η δέσμευση του υπο-στρώματος δε γίνεται σταδιακάκαι δε σχηματίζονται ενδιάμεσασύμπλοκα. Στην πραγματικότητα,

οι αποκλίσεις από την εξίσωση Ηill εμφανίζονται :

Σε πολύ µικρές συγκεντρώσεις

υποστρώµατος (log[S] <<) όπουο βαθµός κορεσµού του ενζύµου

από το υπόστρωµα είναι

αµελητέος (Υs≈0) και άρα δενεµφανίζεται συνεργιστικό

φαινόµενο και

Σε πολύ µεγάλες συγκεντρώσεις

υποστρώµατος (log[S]>>) όπου οβαθµός κορεσµού του ενζύµου

είναι πάρα πολύ µεγάλος (Υs≈1), δηλαδή µπορεί να θεωρηθεί ότιυπάρχει µόνο µία θέση δέσµευσης ελεύθερη για το

υπόστρωµα και άρα δεν εµφανίζεται συνεργιστικό

φαινόµενο. Και στις δύο αυτές περιπτώσεις που οι θέσεις δέσµευσης

δεν αλληλεπιδρούν µεταξύ τους, η τιµή του nΗ ισούται µε τηµονάδα (nΗ =1).

Πράγµατι, όπως φαίνεται καιστο σχήµα, η καµπύλη παίρνειτιµή κλίσης (nΗ ) ίσον µε 1, σετιµές log[S] πολύ µικρές καιπολύ µεγάλες. Στις ενδιάµεσες περιπτώσεις, ο nΗ είναι µεγαλύτερος από τηντιµή 1. Η κάθετος µεταξύ των δύο

ασύµβατων γραµµών (h), αντιπροσωπεύει την ενέργεια

αλληλεπίδρασης.

∆ηλαδή, για ένα ένζυµο µε n σηµεία σύνδεσης, το h εκφράζει τη διαφορά ανάµεσα στην ελεύθερη ενέργεια

αλληλεπίδρασης της δέσµευσης του πρώτου µορίου

υποστρώµατος (-∆G1) και του τελευταίου µορίου (-∆Gn).

Μοντέλο Αdair (ή κινητική Αdair) Tο µοντέλο Αdair λαµβάνει υπόψη και την ύπαρξηενδιάµεσων συµπλόκων ενζύµου-υποστρώµατος.

Στην περίπτωση ενός ενζύµου µε τέσσερα σηµεία

δέσµευσης (τετραµερούς), ισχύουν οι ακόλουθες

αντιδράσεις:K1

E + S ES (1)K2

ES + S ES2 (2)K3

ES2 + S ES3 (3)K4

ES3 + S ES4 (4)

όπου οι Κ1, Κ2, Κ3 και Κ4

αντιπροσωπεύουν τις

πραγµατικές σταθερές διάστασης

για κάθε αντίδραση και θα

µπορούσαν να προσδιορισθούν, αν ήταν δυνατή η µελέτη της κάθε

αντίδρασης ξεχωριστά από τις

υπόλοιπες.

Σε ένα τετραµερές ένζυµο, ο διαθέσιµος αριθµόςθέσεων δέσµευσης δεν είναι ο ίδιος σ’ όλες τιςαντιδράσεις

Στην αντίδραση (1) υπάρχουν 4 θέσεις που µπορεί ναδεσµευτεί το υπόστρωµα, αλλά µόνο 1 θέση αποδέσµευσης. Στην αντίδραση (2) υπάρχουν 3 θέσεις δέσµευσης και 2 θέσεις αποδέσµευσης. Στην αντίδραση (3) υπάρχουν 2 θέσεις δέσµευσης και 3 αποδέσµευσης. Στην αντίδραση (4) υπάρχουν 1 θέση δέσµευσης και 4 αποδέσµευσης.

K1

E + S ES (1)K2

ES + S ES2 (2)K3

ES2 + S ES3 (3)K4

ES3 + S ES4 (4)

Σχετική σταθερά διάστασης = Θέσεις αποδέσµευσης S

Θέσεις δέσµευσης S(K)

K1 = 1/4 K1

K2 = 2/3 K2

K3 = 3/2 K3

K4 = 4/1 K4

Όταν οι σχετικές σταθερές διάστασης δεν είναι ίδιες, τότεεµφανίζεται συνεργιστικό φαινόµενο. Για παράδειγµα, θετικό συνεργιστικό φαινόµενο παρουσιά-ζεται όταν:

++++

+++=

−−−−−−−−−−

−−−−−−−−−−

44321

3321

2211

44321

3321

2211

][][][][14

][4][3][2][

SKKKKSKKKSKKSK

SKKKKSKKKSKKSKYS

−

2K

−

<1

3

8K ,

−

3K

−

<2

4

9K και

−

4K

−

<3

3

8K

Tο µοντέλο που αναπτύχθηκε από τον Αdair, εξηγείµαθηµατικά τη σιγµοειδή µορφή της καµπύλης δέσµευσης

του οξυγόνου στην αιµοσφαιρίνη και βρίσκεται ότι πράγµατι

για την αιµοσφαιρίνη ο nΗ είναι 4. ∆εν εξηγεί όµως µε ποιό µηχανισµό σε επίπεδο µορίου, λαµβάνει χώρα το συνεργιστικό φαινόµενο. Tο τελευταίο εξηγείται από τα µοντέλα των Μonod-Wyman-Changeux και Κoshland, που έχουν ήδη αναφερθεί.

Κινητικά µοντέλα για την εξήγηση της σιγµοειδούς

µορφής της καµπύλης v=f([S])

Tα µοντέλα που εξετάστηκαν µέχρι τώρα,

προσπάθησαν να εξηγήσουν το συνεργιστικό

φαινόµενο που παρουσιάζεται στη δέσµευση των

υποκαταστατών στα αλλοστερικά ένζυµα.

Στα µοντέλα αυτά, θεωρήθηκε ότι αποκαθίσταται

ισορροπία στις διάφορες ηµιαντιδράσεις ενζύµου-

υποστρώµατος και ονοµάζονται, µοντέλα σύνδεσης

ισορροπίας (equilibrium binding models).

Tο συνεργιστικό φαινόµενο µπορεί όµως να

εξηγηθεί και µε άλλο τύπο µοντέλων, τα οποία

ονοµάζονται κινητικά µοντέλα (Κinetic models).

Στα κινητικά µοντέλα γίνεται κυρίως η παραδοχή

ότι το σύστηµα βρίσκεται σε µια σταθεροποιηµένη

ισορροπία (steady state)

αφού το σύµπλοκο ES διασπάται σε E και

προϊόντα µέσω µίας πολύπλοκης πορείας

διασπάσεων

δηλαδή εξετάζεται η επίδραση του

συνεργιστικού φαινοµένου στην τιµή της Vmax.

Θα πρέπει επίσης να αναφερθεί ότι παρά τις

διαφοροποιήσεις που υπάρχουν στα µοντέλα,

θεωρούνται όλα σωστά γιατί βρίσκουν εφαρµογή το

καθένα σε διάφορα ένζυµα και άρα όλα εξηγούν τη

σιγµοειδή µορφή της καµπύλης v=f([S]) σε

διαφορετικές περιπτώσεις ενζύµων.

Τα κινητικά µοντέλα:

Προϋποθέτουν µια σταθεροποιηµένη ισορροπία

(steady state) και

Η αλληλεπίδραση των θέσεων δέσµευσης του

ενζύµου µεταφέρεται διαµέσου του χρόνου

(µνήµη.)

Τα µοντέλα σύνδεσης ισορροπίας:

Προϋποθέτουν την αποκατάσταση ισορροπίας

(standard state) και

Η αλληλεπίδραση των θέσεων δέσµευσης του

ενζύµου µεταφέρεται διαµέσου του χώρου

(αλλαγή χωροδιάταξης).

Φυσιολογική σηµασία

της σιγµοειδούς µορφής της καµπύλης v=f([S])

Tα αλλοστερικά ένζυµα εµφανίζουν πολύπλοκες

ιδιότητες,

οι οποίες όµως είναι απαραίτητες

για την καλύτερη ρύθµιση του µεταβολισµού και

γενικότερα

για την οµαλή λειτουργία του πολύπλοκου

συστήµατος των ζωντανών οργανισµών.

Για την κατανόηση της φυσιολογικής σηµασίας της

σιγµοειδούς µορφής της καµπύλης v=f([S]) των

αλλοστερικών ενζύµων, σε σύγκριση µε τη µορφή

της καµπύλης v=f([S]) των ισοστερικών ενζύµων, η

οποία είναι υπερβολή, χρησιµοποιούνται σαν

παραδείγµατα, η αιµοσφαιρίνη και η µυοσφαιρίνη.

Κι’ αυτό γιατί η καµπύλη κορεσµού της

µυοσφαιρίνης σε συνάρτηση µε τη µερική πίεση του

Ο2 έχει σχήµα υπερβολής, ενώ της αιµοσφαιρίνης

είναι σιγµοειδής.

Όπως είναι γνωστό, το Ο2 που δεσµεύεται σαν

υπόστρωµα στην αιµοσφαιρίνη και στη

µυοσφαιρίνη, δεν αλλοιώνεται, γι’ αυτό

χαρακτηρίζονται σαν ηµιένζυµα και είναι ιδανικά

πρότυπα για τη µελέτη της κινητικής του

σχηµατισµού του συµπλόκου ενζύµου-

υποστρώµατος, παρουσία και απουσία

αλλοστερικού τροποποιητή.

Η διαφορά στη µορφή της καµπύλης τους,

οφείλεται στο γεγονός ότι η αιµοσφαιρίνη έχει

τεταρτοταγή δοµή και αλλοστερική ρύθµιση, ενώ η

µυοσφαιρίνη δε διαθέτει, ούτε τεταρτοταγή δοµή,

ούτε αλλοστερική ρύθµιση.

Η εξήγηση της σιγµοειδούς µορφής της καµπύλης

κορεσµού της αιµοσφαιρίνης, σύµφωνα µε το

µοντέλο του Κoshland, παρουσιάζεται στο επόµενο

σχήµα

Στην αρχή, όλες οι υποµονάδες στο µόριο της αιµοσφαι-ρίνης βρίσκονται µε τη µορφή Α και άρα η αιµοσφαιρίνη είναι

στην κατάσταση T. Η σύνδεση του πρώτου µορίου του οξυγόνου γίνεται αργά, γιατί υπάρχει µικρή χηµική συγγένεια αυτού µε την Α µορφή

της υποµονάδας και έχει σα συνέπεια να αλλάξει µορφή η

υποµονάδα και να µετατραπεί σε Β. Αυτό έχει σαν αποτέλεσµα να αλλάξει επαγωγικά η

χωροδιάταξη της γειτονικής υποµονάδας και να γίνει

περισσότερο δραστική, έτσι ώστε η δέσµευση του δεύτερουµορίου οξυγόνου να γίνει πιο γρήγορα.

Στη συνέχεια αλλάζουν χωροδιάταξη και οι τελευταίες

δύο υποµονάδες και έτσι αυξάνει ακόµα περισσότερο ο

ρυθµός δέσµευσης του οξυγόνου.

Με όσα αναφέρθηκαν φαίνεται ότι η αιµοσφαιρίνη

άλλοτε έχει µικρή συγγένεια µε το οξυγόνο και άλλοτε

µεγάλη.

Επίσης, η σιγµοειδής µορφή της καµπύλης v=f([S]) τωναλλοστερικών ενζύµων

δίνει τη δυνατότητα να µεταβάλλεται η δραστικότητά

τους για µεγάλα όρια, ενώ η µεταβολή της συγκέντρωσης του τροποποιητή που

απαιτείται γι’ αυτό, κυµαίνεται σε µικρά όρια. Συνήθως, η δραστικότηταενός ενζύµου πρέπει να µετα-βληθεί από το 10% στο 90%ή αντίστροφα, έτσι ώστε ναµπορεί να εκτελέσει ο ιστός,που περιέχει αυτό το ένζυµο,τις µεταβολικές πορείες που

απαιτούνται για τη φυσιολο-γική λειτουργία του οργανισµού. Στην περίπτωση που η

καµπύλη δεν είναι σιγµοειδής

απαιτείται µεταβολή κατά 80 φορές.

Στην περίπτωση των ισοστερικών ενζύµων, όπου τοδιάγραµµα v=f([S]) είναι υπερβολή, ο τροποποιητήςείναι το υπόστρωµα.

Όταν όµως η µορφή της καµπύλης v=f([S]) είναισιγµοειδής, τότε απαιτείται πολύ µικρή µεταβολή της

συγκέντρωσης του τροποποιητή π.χ. τετραπλασιασµόςτης συγκέντρωσης, όταν η σταθερά ισορροπίας L των

δύο καταστάσεων (T και R) έχει τιµή από 10.000 έως100.000.Είναι κατανοητό βέβαια, ότι µία υπερβολική αύξηση της

συγκέντρωσης ενός τροποποιητή δεν είναι ευνοϊκή για

το µεταβολισµό, αφού

αφ’ ενός µεν απαιτεί σηµαντικό χρόνο για νααποκατασταθεί η ισορροπία, αφ’ ετέρου δε, µπορεί να δηµιουργήσει προβλήµατα

άλλης µορφής (π.χ. µεγάλη συγκέντρωση ΑTΡµεταβάλλει την ιοντική κατάσταση µέσα στο κύτταρο).

Συνοψίζοντας, θα µπορούσαµε να πούµε ότι ο

ρόλος της σιγµοειδούς µορφής της καµπύλης

v=f([S]) στο µεταβολισµό, σχετίζεται µε το ρόλο ενός

ενισχυτή.

Στην περίπτωση που απαιτείται µεγαλύτερη

µεταβολή της δραστικότητας του ενζύµου π.χ. από

1% σε 99%, τότε η σιγµοειδής µορφή της καµπύλης

δε λύνει το πρόβληµα ικανοποιητικά, αλλά

χρησιµοποιούνται άλλοι τρόποι για τη ρύθµιση του

µεταβολισµού.