beta talasemİde oksİdatİf stresβ-talasemide oksidatif stres hücreler metabolik sürecin bir...
TRANSCRIPT
-
T.C.
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOKİMYA ANABİLİM DALI
BETA TALASEMİDE OKSİDATİF STRES
Ş. EFSUN ANTMEN
YÜKSEK LİSANS TEZİ
DANIŞMANI
Prof. Dr. Levent KAYRIN
ADANA-2005
-
iii
TEŞEKKÜR
Yüksek lisans öğrenimim boyunca bilgi ve deneyimleriyle bana yol
gösteren, hoşgörü ve sabırla her konuda beni destekleyen tez danışmanım sayın
Prof.Dr. Levent KAYRIN’a teşekkürü borç bilirim.
Eğitim ve tez çalışmama bilgi birikimleri ve görüşleriyle katkıda bulunan
Biyokimya Anabilim Dalı öğretim üyelerine, asistanlarına, arkadaşlarıma ve
bölüm çalışanlarına teşekkür ederim.
Deneysel çalışmalarım boyunca bilimsel ve sosyal desteğini esirgemeyen
Doç. Dr. Bülent ANTMEN’e ve Pediatrik Hematoloji Bilim Dalı çalışanlarına
sonsuz teşekkürler.
Tez çalışmamı TF2003YL5 nolu proje olarak destekleyen Ç.Ü
Rektörlüğüne ve Araştırma Projeleri Birimi’ne teşekkür ederim.
Yüksek lisans eğitimim boyunca sabır ve desteğini esirgemeyen aileme ve
eşime şükranlarımı sunarım.
Biyolog Efsun ANTMEN
Adana/2005
-
iv
İÇİNDEKİLER
KABUL VE ONAY ii TEŞEKKÜR iii İÇİNDEKİLER iv ŞEKİLLER DİZİNİ vi ÇİZELGELER DİZİNİ vii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ viii ÖZET ix ABSTRACT x 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. OKSİDATİF STRES 3 2.2. SERBEST RADİKALLER 5 2.3. REAKTİF OKSİJEN TÜRLERİ 7 2.3.1. SÜPEROKSİT RADİKALİ(O2˙) 7 2.3.2. HİDROJEN PEROKSİT (H2O2) 8
2.3.3. HİDROKSİL RADİKALİ (˙OH) 8 2.3.4. SİNGLET OKSİJEN (1O2) 9 2.3.5. NİTRİK OKSİT (NO˙) 9 2.4. SERBEST RADİKALLERİN ETKİLERİ 10 2.4.1. DNA VE NÜKLEİK ASİTLERE ETKİLERİ 10 2.4.2. PROTEİNLERE ETKİLERİ 10 2.4.3. KARBOHİDRATLARA ETKİLERİ 11 2.4.4. LİPİTLERE ETKİLERİ 11 2.5. ANTİOKSİDAN SİSTEM 13 2.5.1. REDÜKTE GLUTATYON (GSH) 16 2.5.2. GLUTATYON PEROKSİDAZ ENZİMİ (GSH-PX) 16 2.5.3. GLUTATYON REDÜKTAZ ENZİMİ (GSH-RD) 17 2.5.4. GLUTATYON S TRANSFERAZ ENZİMİ (GST) 18 2.5.5. SÜPEROKSİT DİSMUTAZ ENZİMİ (SOD) 19 2.5.6. KATALAZ ENZİMİ (CAT) 19 2.5.7. TİYOREDOKSİN SİSTEM 20
2.5.8. UBİKİNON (KOENZİM Q-Q10) 20 2.5.9. ASKORBİK ASİT (C VİTAMİNİ) 21 2.5.10. KAROTENLER (A VİTAMİNİ) 21 2.5.11. TOKOFEROLLER (E VİTAMİNİ) 21 2.5.12. FLAVONOİDLER 21 2.5.13. SELENYUM 22 2.5.14. TRANSFERRİN VE LAKTOFERRİN 22 2.5.15. ÜRİK ASİT 22 2.5.16. BİLİRUBİN 22 2.5.17. HAPTOGLOBİN (HP) 22 2.5.18. SERULOPLAZMİN (CP) 23
2.6. HEMOGLOBİN YAPISI VE SENTEZİ 23
-
v
2.6.1. HEM YAPISI 23 2.6.2. GLOBİN YAPISI 24 2.7. TALASEMİ SENDROMLARI 26 2.7.1. ALFA TALASEMİ 26 2.7.2. BETA TALASEMİ 27 2.8. TALASEMİ VE OKSİDATİF STRES 28 2.9. TALASEMİ DAĞILIMI 29 2.10. TALASEMİDE TEDAVİ 30 3. GEREÇLER VE YÖNTEMLER 32 3.1. GEREÇLER 32 3.1.1. CİHAZLAR 32 3.1.2. KİMYASAL MADDELER 32 3.2. ÖRNEK TOPLAMA 33 3.3. ANALİZ YÖNTEMLERİ 33 3.3.1. HEMATOLOJİK ANALİZLER 33 3.3.2. HEMOLİZAT HAZIRLANMASI 33
3.3.3. GLUTATYON PEROKSİDAZ (GSH-PX) 34 ÖLÇÜM YÖNTEMİ 3.3.4.GLUTATYON REDÜKTAZ (GSH-RD) 36 ÖLÇÜM YÖNTEMİ
3.3.5. KATALAZ (CAT) ÖLÇÜM YÖNTEMİ 38 3.3.6.GLUTATYON S TRANSFERAZ ( GST ) 39 ÖLÇÜM YÖNTEMİ 3.3.7. SÜPEROKSİT DİSMUTAZ (SOD ) 41
ÖLÇÜM YÖNTEMİ 3.3.8.MALONDİALDEHİD (MDA) ÖLÇÜM YÖNTEMİ 45
3.3.9. HEMOGLOBİN TAYİNİ 48 4. BULGULAR 50 5. TARTIŞMA 69 6. SONUÇLAR 74 7. KAYNAKLAR 75 8. ÖZGEÇMİŞ 82
-
vi
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1. : Oksijen molekülünün orbital yapısı 4 Şekil 2.2. : Vücuttaki major serbest radikaller ve serbest radikal 6
hasarı sonuçları Şekil 2.3. : Radikallerin yol açtığı hücre hasarı 13 Şekil 2.4. : İnsan dokularındaki major antioksidan enzimler ve bağlı yollar 15 Şekil 2.5. : Redükte Glutatyon (GSH) 16 Şekil 2.6. : Glutatyon redoks döngüsü 18 Şekil 2.7. : Hemoglobin A yapısı 23 Şekil 2.8. : Hem molekülü yapısı 24 Şekil 2.9. : Globin sentezi 25 Şekil 2.10. : Globin gen kümeleri 26 Şekil 2.11. : Periferik yaymada talasemik eritrositlerin hipokromileri 28
ve mikrositerliği Şekil 2.12. : Talasemi,orak hücre anemisi ve diğer yaygın hemoglobin 30
hastalıklarının dünya üzerindeki yayılımı Şekil 4.1. : Kontrol grubu ve hasta grubu SOD değerlerinin karşılaştırılması 62 Şekil 4.2. : Kontrol grubu ve hasta grubu CAT değerlerinin karşılaştırılması 63 Şekil 4.3. : Kontrol grubu ve hasta grubu GST değerlerinin karşılaştırılması 63 Şekil 4.4. : Kontrol grubu ve hasta grubu GSH-Px değerlerinin 64
karşılaştırılması Şekil 4.5. : Kontrol grubu ve hasta grubu GSH-Rd değerlerinin 64
karşılaştırılması Şekil 4.6. : Kontrol grubu ve hasta grubu MDA değerlerinin karşılaştırılması 65 Şekil 4.7. : Kontrol grubu ve hasta grubu Wbc verilerinin karşılaştırılması 65 Şekil 4.8. : Kontrol grubu ve hasta grubu Rbc verilerinin karşılaştırılması 66 Şekil 4.9. : Kontrol grubu ve hasta grubu Hb verilerinin karşılaştırılması 66 Şekil 4.10. : Kontrol grubu ve hasta grubu Hct verilerinin karşılaştırılması 67 Şekil 4.11. : Kontrol grubu ve hasta grubu MCV verilerinin karşılaştırılması 67 Şekil 4.12. : Kontrol grubu ve hasta grubu MCH verilerinin karşılaştırılması 68 Şekil 4.13. : Kontrol grubu ve hasta grubu MCHC verilerinin karşılaştırılması 68
-
vii
ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1. : Radikal ve radikal olmayan oksijen türleri 1 Çizelge 2.2. : Oksidatif stres ile ilişkili bazı hastalıklar 5 Çizelge 2.3. : Oksijenin indirgenmesi 7 Çizelge 2.4. : Hidrofilik ve lipofilik fazda bazı antioksidanlar 14 Çizelge 2.5. : İnsan hemoglobinlerindeki globin zincirleri 24 Çizelge 2.6. : Beta talasemide eritrosit indeksi değişimi 28 Çizelge 2.7. : Beta talasemide hemoglobin düzeyleri 28 Çizelge 4.1. : Kontrol grubu hematolojik verileri 51 Çizelge 4.2. : Hasta grubu hematolojik verileri 52 Çizelge 4.3. : Kontrol grubu hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları 53 Çizelge 4.4. : Hasta grubu hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları 53 Çizelge 4.5. : Kontrol grubunda bulunan erkek çocukların 54
hematolojik verileri Çizelge 4.6. : Kontrol grubunda bulunan erkek çocukların 54
hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları Çizelge 4.7. : Kontrol grubunda bulunan kız çocukların hematolojik verileri 55 Çizelge 4.8. : Kontrol grubunda bulunan kız çocukların 55
hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları Çizelge 4.9. : Hasta grubunda bulunan erkek çocukların hematolojik verileri 56 Çizelge 4.10. : Hasta grubunda bulunan erkek çocukların 56
hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları Çizelge 4.11 : Hasta grubunda bulunan kız çocukların hematolojik verileri 57 Çizelge 4.12. : Hasta grubunda bulunan kız çocukların 57
hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları Çizelge 4.13. : Eritrositlerde antioksidan sistemde bulunan 58
enzim düzeylerinin ve MDA ölçümünde kullanılan yöntemlerin tekrarlanabilirliği
Çizelge 4.14. : Kontrol grubunda eritrositlerde ölçülen antioksidan 59 enzimler ve MDA düzeyleri
Çizelge 4.15. : Hasta grubunda eritrositlerde ölçülen antioksidan 60 enzimler ve MDA düzeyleri
Çizelge 4.16. : Kontrol grubunda eritrositlerde ölçülen antioksidan 61 enzimler ve MDA düzeylerinin istatistiksel verileri
Çizelge 4.17. : Hasta grubunda eritrositlerde ölçülen antioksidan 61 enzimler ve MDA düzeylerinin istatistiksel verileri
Çizelge 4.18. : Kontrol ve hasta grubunun hematolojik verilerinin 61 ortalama, standart sapma değerleri ve iki grup arasındaki ilişki
Çizelge 4.19. : Kontrol ve hasta grubunun antioksidan enzimleri ve MDA 62 değerlerinin ortalama, standart sapma değerleri ve iki grup arasındaki ilişki
-
viii
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ
α Alfa β Beta δ Delta ε Epsilon ζ Zeta γ Gamma ATP Adenozintrifosfat CAT Katalaz cGs Gama Glutamil Transpeptidaz cGcs Gama Glutamil Sisteinil Sentetaz Cp Seruloplazmin DNA Deoksiribonükleik asit EDTA Etilen diamin tetraasetik asit FAD Flavin adenin dinükleotid GS Glutatyon sentaz GSH Redükte glutatyon GSH-Rd Glutatyon redüktaz GPxe Ekstrasellüler glutatyon peroksidaz GSH-Px Glutatyon peroksidaz GSSG Okside glutatyon G6PD Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz GST Glutatyon S transferaz Hb Hemoglobin Hct Hematokrit Hp Haptoglobin IgG İmmunglobin G MCV Ortalama eritrosit hacmi MCH Ortalama eritrosit hemoglobini MCHC Ortalama eritrosit hemoglobin konsantrasyonu MDA Malondialdehit MRP Multidrug resistans protein NADPH Redükte nikotinamid adenin dinukleotid fosfat PUFA Çoklu doymamış yağ asitleri RBC Eritrosit RES Retiküloendotelyal sistem RNS Reaktif nitrojen türleri ROS Reaktif oksijen türleri SOD Süperoksit dismutaz MnSOD Manganez süperoksit dismutaz ECSOD Ekstrasellüler süperoksit dismutaz CuZnSOD Bakır-çinko süperoksit dismutaz Trx Tiyoredoksin TrxR Tiyoredoksin redüktazı
-
ix
ÖZET
β-Talasemide Oksidatif Stres
Hücreler metabolik sürecin bir parçası olarak devamlı serbest radikal ve
reaktif oksijen türlerini oluştururlar. Bu serbest radikaller ve reaktif oksijen türleri kompleks bir antioksidan sistem tarafından nötralize edilirler. Oksidatif stres, reaktif oksijen türleri veya serbest radikaller ile antioksidan sistem arasında oluşan dengesizliktir ve bu dengesizlik önemli hücre kompartımanlarında geri dönüşümsüz hasara neden olabilir.
Talaseminin tüm patofizyolojik özellikleri, globin zincir sentezindeki dengesizlikle ilişkilidir. Globin zincirlerinin yapımındaki şiddetli dengesizlikler farklı talasemi fenotiplerinin ortaya çıkmasına yol açar. Eğer alfa zincir yapımında bozukluk varsa alfa talasemi, beta zincir yapımında bozukluk varsa beta talasemi olarak isimlendirilir. Beta talasemide beta globin zincir yapımındaki dengesizlik nedeniyle artan alfa globin zincirleri, eritrositlerin zar yapılarını bozarak ve eritrosit öncül hücrelerinin erken yıkımını tetikleyerek eritrositlere zarar verirler. Eşleşmemiş, kararsız globin zincirleri oksidatif strese neden olan zincir reaksiyonları başlatan süperoksit ve hidroksil radikallerini oluştururlar. Ülkemizde talasemi yaygınlığı %2’dir. Bu çalışmada beta talasemi hastalarında antioksidan durum ve oksidatif hasarın incelenmesi amaçlanmış olup yaşları 16’nın altında olan beta talasemi hastası çocuklar (n=35) ve sağlıklı kontrol grubu (n=40) örnekleri kullanılmıştır. Tüm örneklerin hematolojik verileri incelendikten sonra eritrosit süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GSH-Px), glutayon redüktaz (GSH-Rd), glutatyon s transferaz (GST) enzim ölçümleri antioksidan durumun, plazma malondialdehit (MDA) analizi ise lipit peroksidasyonunu gözlemek için yapılmıştır. GSH-Px, GSH-Rd, CAT ölçümü Beutler yöntemiyle, MDA ölçümü tiyobarbitürik asit yöntemiyle ve GST ölçümü ise glutatyonun 1 kloro 2,4 dinitro benzen ile konjugat oluşturma yöntemiyle yapılmıştır. Kontrol grubu ile hasta grubu karşılaştırıldığında hematolojik verilerde anlamlı farklar gözlenmiş ancak antioksidan sistem ve MDA düzeyinde anlamlı fark gözlenmemiştir. Sonuçta oksidatif stres araştırması için talasemi majorlü olgularda yapılan çalışmaların transfüzyon almamış olgularda yapılmasının daha sağlıklı olabileceği düşünülmüştür. Anahtar sözcükler: Antioksidan, lipit peroksidasyonu, oksidatif stres, serbest radikaller, talasemi,
-
x
ABSTRACT
Oxidative Stress in β-Thalassemia Cells continuously produce free radicals and reactive oxygen species as a part of metabolic process. These free radicals are neutralized by a complex antioxidant system. Oxidative stres is an imbalance between reactive oxygen species or free radicals and antioxidant system and can cause irreversible damage at important cell compartments. All pathophysiological properties of thalassemia are related to imbalance of globin chains. Several imbalance of producing globin chains can cause constitute different thalassemia fenotypes. If the production of alpha chains is impaired, is called alpha thalassemia and if the production of beta chains is impaired is called beta thalassemia. Because of the imbalance with production of beta globin chains excess free alpha globin chains are deleterious to the red cells, damaging the membran structures and triggering premature destruction of the red cell precursors. Unpaired, instabile globin chains generate the superoxide and hydroxyl radicals that start the chain reactions which can cause oxidative stres. Prevalance of Turkey for thalassemia is %2. In this study we aimed to indicate antioxidant status and oxidative damage in beta thalassemia patients. For this purpose the children with beta thalassemia (n=35) and healthy controls (n=40), who ages under sixteen, were used. Erythrocyte superoxide dismutase(SOD), catalase(CAT), glutathione peroxidase(GSH-Px), glutathione redüktase(GSH-Rd), glutathione s transferase(GST) were measured to show antioxidant status and plasma malondialdehyde(MDA) analyzed to show lipid peroxidation. GSH-Px, GSH-Rd, CAT enzyme activity were assayed according to beutler, MDA were assayed thiobarbituric acid and GST were assayed according to glutathione conjugate with 1 choloro 2,4 dinitrobenzen methods. Control and patient groups when compared, there are significant interaction with hematological results but there are no significant interaction with antioxidant system and MDA level. In this result studying for oxidative stres is reliable in untransfused thalassemia major patients transfused patients. Key words: Antioxidant, free radicals, lipid peroxidation, oxidative stress, thalassemia.
-
1
1.GİRİŞ Patolojik bir olayı takiben organizmada meydana gelen fizyopatolojik
değişiklikler temelde belirli mekanizmaların harekete geçmesi ile oluşmaktadır. Serbest
radikaller, reaktif oksijen türleri veya oksijen metabolitleri olarak da adlandırılabilen bir
kısım maddelerin ortaya çıkması ile hücre ölümü, doku hasarı ve nekroz sonucunda,
organ veya sistemlerde işlev yetersizliği meydana gelmektedir 1.
Serbest radikaller, dış yörüngesinde eşleşmemiş en az bir elektron içeren
moleküllerdir. Özellikleri, dengesiz ve tek olan elektronu çiftlemek için diğer
moleküller ile tepkimeye girmeye yatkın olmalarıdır. Anyonik, katyonik veya nötral
konumda olabilirler 2.
Serbest radikaller etkilerini protein, lipit, karbohidrat ve DNA oksidasyonu
yaparak; hücre zarında, hücre organellerinde ve DNA’larda patolojik değişiklikler
oluştururarak gösterirler. Bunların sonucunda işlev bozukluğu veya hücre ölümü
olmakta ya da mutant özellikler kazandırarak tümör oluşturabilmektedirler 1.
Organizmada essansiyel maddelerin oksidasyonuna neden olabilecek
moleküllerin etkilerini önleyen veya geciktirebilen maddelere ise antioksidan
denilmektedir. Oksidanlar ve antioksidanlar arasındaki dengesizlik aşırı derecede reaktif
oksijen türlerinin yapılmasına ve oksidatif hasara neden olur. Bu durum oksidatif stres
olarak belirtilir 3,4.
Talasemide genetik bozukluk hemoglobin zincir veya zincirlerinin düşük
miktarlarda veya hiç sentezlenememesidir. Bozukluk aynı hastada α, β, γ, δ globin
zincirlerini veya bunların bazı kombinasyonlarını da etkileyebilir. Globin zincirlerinin
yapımındaki dengesizlik ve çok fazla eşleşmemiş globin zincir içeriği eritrositlerin
kemik iliğinde ve dolaşımda yıkımına neden olmaktadır. Beta talasemide, beta globin
zincir sentezi yeterli miktarda yapılamaz iken serbest α zincirlerinin yıkım ürünleri ise
eritrosit zarlarında hasara neden olur. Aşırı demir, serbest oksijen radikalleri, eritrosit
zarındaki lipit ve protein gibi bileşenlere ve hücre içi organellere hasar verir, rijid,
dehidrate eritrosit oluşumu, rijit inklüzyonların varlığı, eritrositlerin dalaktan geçiş
sırasında da yıkılmasına neden olur 5.
-
2
Oksijen taşınımından sorumlu hemoglobin hücrelerin gereksindiği yaklaşık
bütün oksijeni akciğerden dokulara taşımanın yanı sıra, hücresel solunumun iki son
ürünü olan H+ ve CO2’yi de dokulardan akciğerlere ve böbreklere taşır. Ayrıca bir
hemoglobin alt birimine O2 bağlanması hemoglobin üç boyutlu yapısında değişikliğe
neden olur ve bu durumdan en çok alfa ve beta globin zincirleri etkilenir, dolayısıyla
globin zincir bozukluğunda hemoglobinin O2 bağlaması etkilenecektir. Sonuçta
eritrositler sürekli olarak oksitleyici ajanlara maruz kaldıklarından oksidatif hasardan
korunmak için enzimatik ve nonenzimatik antioksidan sistemler geliştirmişlerdir 6.
Bu çalışmamızda eritrositlerde bulunan antioksidan sistem ve oksidatif stres
durumunu araştırmak amacıyla beta talasemi majorlü hasta grubu ve kontrol grubu
olarak talasemi tanısı konmamış çocukluk yaş grubu bireyler seçilmiş, her iki grupta da
aynı parametrelerin çalışılması planlanmıştır.
Talasemik eritrositlerde antioksidan sistem ve oksidatif stresi araştırmak
amacıyla yapılan bu çalışmada lipit peroksidasyonu ürünü olan MDA, peroksitleri suya
metabolize eden katalaz ve glutatyon peroksidaz, okside glutatyonu redükte glutatyona
dönüştürerek glutatyonun hücre içi döngüsünü sağlayan glutatyon redüktaz ve
elektrofilik bileşiklerin glutatyon ile konjugasyonunu sağlayan glutatyon s transferaz
enzim aktivitelerinin ölçülmesini amaçladık.
-
3
2.GENEL BİLGİ
2.1. Oksidatif Stres
Vücuttaki fizyolojik aktivitenin doğal ürünü olan serbest
radikalleri, organizma doğuştan kazandığı çok hassas bir donanımla
oksidan-antioksidan denge olarak tanımlanabilecek bir çizgide tutmaya
çalışır. Bu dengenin bozulması oksidatif strese yol açar 7.
Reaktif oksijen türleri (ROS), reaktif nitrojen türleri (RNS) ve
sülfür merkezli radikaller oksidan sınıfına girer. Ancak tüm reaktif türleri
radikal değildirler. Radikal olan ve olmayan reaktif türleri Çizelge 2.1’de
özetlenmiştir 8,9.
Çizelge 2.1. Radikal ve radikal olmayan reaktif oksijen türleri 3
Reaktif Türleri
Radikal Non-Radikal
Hidroksil (˙OH) Peroksinitrit (ONOO-)
Alkoksil (L(R)O˙) Hipoklorit (-OCl)
Hidroperoksil (HOO˙) Hidroperoksit (L(R)OOH)
Peroksil (L(R)OO˙) Singlet oksijen (1O2)
Nitrik oksit (NO˙) Hidrojen peroksit (H2O2)
Süperoksit (O˙2) Ozon (O3)
Canlı organizma için önemli olan yapıları, fiziksel ve kimyasal özellikleri,
hücresel kaynakları, rol oynadıkları tepkimeler ve etkileri ile çeşitli klinik durumların
patogenezinde rol oynayan serbest radikaller, atomik yörüngelerinde eşleşmemiş
elektron bulundurarak, bağımsız olarak varolabilen moleküllerdir. Eşleşmemiş
elektronun kazandırdığı en önemli özellik birçok radikal ile bu elektronun
paylaşılabilinmesidir 10,11,12.
-
4
Serbest radikallerin en önemli tepkimeleri , moleküler oksijen ve onun reaktif
türlerinin olduğu tepkimelerdir. Şekil 2.1’de oksijenin orbital yapısı ve oluşan reaktif
türleri belirtilmiştir 13.
Şekil.2.1. Oksijen molekülünün orbital yapısı 12
Demir, bakır, mangan, molibten gibi geçiş metalleri de dış
yörüngelerinde birer elektron taşımalarına rağmen radikal karakter
göstermezler. Serbest radikal kabul edilen atom ve moleküller elektron
dağılımlarının yanı sıra termodinamik yapıları ve lokal kinetik
reaktiviteleri ile değerlendirilir 14,15.
Antioksidan ise; okside olabilen substrata göre ortamda daha az
derişimde bulunan ve bu substratın oksidasyonunu belirgin şekilde
geciktiren veya engelleyen madde olarak tanımlanabilir. Bu tanıma göre
antioksidanların fizyolojik rolü, serbest radikalleri içeren kimyasal
tepkimelerin sonucunda hücresel bileşenlere gelebilecek zararı
önlemektir 16.
Aerobik metabolizmada denge, serbest radikal oluşumu ve
bunların benzer hızla antioksidan sistemler tarafından uzaklaştırılmasıyla
karakterizedir. Geri dönüşümsüz oksidatif hasarın birikimi ile önce hücre
daha sonra doku ve organ sistemlerinde yapısal ve işlevsel bozukluklar
ortaya çıkabilir. Oksidatif stres ile ilişkili hastalıkların bazıları çizelge
2.2’de belirtilmiştir 17.
-
5
Çizelge 2.2. Oksidatif stres ile ilişkili bazı hastalıklar 17
• Astım • Ateroskleroz • Serebral vaskuler hastalıklar • Kronik obstruktif pulmoner hastalık • Konjestif kalp yetmezliği • Diabet • Hipertansiyon • Grip • Miyokard enfaktüs • Pnömoni • Hepatit • Kanser • İnflamasyon hastalıklar
2.2. Serbest Radikaller
Serbest radikaller hücrede metabolik dengenin bir parçası olarak
devamlı yapılırlar 18.
Serbest radikaller 3 yolla meydana gelirler 19,20.
1. Kovalent bağlı normal bir molekülün, her bir parçasında ortak elektronlardan
birisinin kalarak homolitik bölünmesi.
X : Y → X· + Y·
2. Normal bir molekülden tek bir elektronun kaybı veya bir molekülün
heterolitik bölünmesi. Heterolitik bölünmede kovalent bağı oluşturan her iki
elektron atomların birinde kalır. Böylece serbest radikaller değil, iyonlar
meydana gelir.
X:Y → X:⎯ + Y+
3. Normal bir moleküle tek bir elektronun eklenmesi
A + e- → A·-
-
6
Organizmada oksidatif strese neden olan radikal yapımı endojen
ve çevresel faktörleri içeren çeşitli mekanizmalarla gerçekleşir (Şekil
2.2)16.
Endojen faktörler mitokondriyal sızıntı, solunumsal patlama,
enzim reaksiyonları, otooksidasyon tepkimeleridir. Çevresel faktörlerin
başlıcaları ise sigara dumanı, hava kirliliği, ultraviyole ışınları, iyonize
radyasyon ve ksenobiotiklerdir 16.
Örneğin bir nefes sigara dumanında yaklaşık 1014-16 serbest
radikal bulunmaktadır, aşırı egzersiz ile mitokondri oksijeninin yaklaşık
%2-5’i serbest radikal yapımında kullanılır 18,21.
Çevresel Faktörler Serbest radikal yapımı Endojen Faktörler
O2˙, H2O2
Geçiş Metalleri
Fe+2,Cu+
OH·
Lipit peroksidasyonu DNA Hasarı Protein Hasarı
Doku Hasarı
Şekil 2.2. Vücuttaki önemli serbest radikaller ve serbest radikal hasarı sonuçları
Serbest radikallerin aerobik hücrelerde en önemli tepkimeleri
moleküler oksijen ve onun reaktif türleri (süperoksit anyonu ve hidroksil
radikali), peroksitler ve geçiş metallerinin olduğu tepkimelerdir13.
-
7
2.3. Reaktif oksijen türleri
Normal şartlarda oksijen kararlı, kokusuz, tatsız, renksiz, sudaki
çözünürlüğü sınırlı bir gazdır. İnsan hayatı için hem gerekli hem de
toksik olan bir moleküldür. Oksijenin iki eşleşmemiş elektronlarının ayrı
orbitallerde aynı yönde dönmesi sonucu oksijen bir radikaldir 22.
Moleküler oksijen elektron transferiyle suya kadar indirgenir. Bu
yol 4 elektron gerektirir ve bu yolda reaktif ara moleküller oluşur ki
bunlar süperoksit, hidrojen peroksit ve hidroksi radikalleridir. Bunlar
önemli oksidatif stres ajanları olup reaktif oksijen türleri (ROS) olarak
adlandırılır (Çizelge 2.3) 23,24.
Çizelge 2.3. Oksijenin indirgenmesi
O2 + e + H+ → HO2˙ Hidroperoksil radikali
HO2˙ → H+ + O2˙ Süperoksit radikali
O2˙ + 2H+ + e → H2O2 Hidrojen peroksit
H2O2 + e → OH- + ˙OH Hidroksil radikali
˙OH + e + H+ → H2O
2.3.1. Süperoksit Radikali (O2˙) Oksijenli ortamda yaşam, oksidatif fosforilasyon ile ATP üretimi
açısından önemli ölçüde yarar sağlarken bazı tehlikeleri de beraberinde
getirir. Oksidatif fosforilasyonun ana bileşeni olan oksijene bir elektron
eklenmesi ile süperoksit radikali oluşur (Şekil 2.1) 4.
Süperoksit radikali serbest radikal olmasına karşın reaktifliği
yüksek değildir. Kendiliğinden, özellikle elektronca zengin bir ortam
olan iç mitokondri zarında solunum zinciriyle birlikte oluşur. Süperoksit
ayrıca iskemi-reperfüsyonda aktive olan ksantin oksidaz gibi
flavoenzimlerce endojen olarak da oluşturulur. Lipooksijenaz ve
siklooksijenaz ise diğer süperoksit oluşturan enzimlerdir 25,26,27.
Süperoksit ayrıca yüksek enerjili elektromanyetik dalgalar gibi
fiziksel ve kimyasal ajanlar ile, bazı bileşiklerin otooksidasyonunda ve
fagositozda oluşur 28.
-
8
Süperoksit kimyası çözelti ortamına bağlı olarak farklılıklar
gösterir. Süperoksit sulu çözeltide askorbik asit, tiyol gibi molekülleri
oksitleyebilen zayıf bir oksitleyici ajandır. Bunun yanında süperoksit
güçlü bir indirgeyici ajan olup sitokrom c ve ferrik-EDTA gibi çeşitli
demir komplekslerini indirgeyebilir 29.
Süperoksit, hidrojen peroksit ve moleküler oksijenin oluştuğu
dismutasyon tepkimesinden dolayı sulu ortamda hızlıca kaybolur. Diğer
taraftan SOD enzimiyle katalizlenen dismutasyon tepkimesi ise spontan
dismutasyondan 109 kat daha hızlıdır 30.
2O2˙ + 2H+ → H2O2 + O2
2.3.2. Hidrojen Peroksit (H2O2)
Hidrojen peroksit serbest radikal olmamasına karşın biyolojik
zarlara nüfuz edebilmesi ve daha reaktif oksijen türlerinin yapım
aşamasında aldığı rolden dolayı önemlidir. Diğer bir önemli işlevi ise
hücre içi sinyal molekülü olarak görev yapmasıdır 24.
Hidrojen peroksit süperoksit radikalinin dismutasyon tepkimesi
sonucu oluşur. Ürat oksidaz, glukoz oksidaz, d-aminoasit oksidaz gibi
birçok enzim oksijene iki elektron transfer ederek direk hidrojen peroksit
oluşturabilirler 19.
Hidrojen peroksitin redoks özelliği ve geçiş metalleri varlığında
yüksek reaktif serbest radikalleri oluşturmasına karşı vücut, savunma
sistemi geliştirmiştir. İstenmeyen hidrojen peroksit katalaz, glutatyon
peroksidaz ve diğer oksidazlar ile hücreden uzaklaştırılır 29.
2.3.3. Hidroksil radikali (˙OH)
Hidroksil radikalinin major oluşumu suyun yüksek enerji ile
iyonizasyonudur.
H2O → ˙OH + H˙ + eaq- → H2O2
-
9
Hidrojen peroksit ise süperoksit ile tepkimeye girerek en reaktif
ve zarar verici serbest oksijen radikali olan hidroksil radikali oluşturmak
üzere kolaylıkla yıkılabilir.
H2O2 + O2˙ → ˙OH + OH־ + O2
Bu tepkimeye Haber-Weiss tepkimesi denir ve tepkime
katalizörsüz ortamda oldukça yavaşken, demirin katalizörlüğünde çok
hızlıdır.
O2˙ + Fe+3 → O2 + Fe+2 Fe+2 + H2O2 → Fe+3 + ˙OH + OH־
O2˙ + H2O2 → ˙OH + OH־ + O2
Katalizörlü tepkimede demir önce ferrik formdan (Fe+3) süperoksit ile ferröz
forma (Fe+2) indirgenir. Ferröz form Fenton tepkimesi ile ferrik forma tekrar
yükseltgenirken ˙OH ve OH־ üretilir 22,29.
2.3.4. Singlet Oksijen (1O2)
Singlet oksijen eşleşmemiş elektron içermediği için serbest radikal değildir.
Bununla birlikte dönme yönlerinin farklılığından dolayı oksijenin yüksek reaktif
formudur (Şekil 2.1) 29.
Moleküler oksijende paylaşılmamış iki dış elektron aynı yönde, ayrı
yörüngelerdedir. Singlet oksijende ise elektron dönme yönleri birbirine zıttır ve
oluşturdukları delta veya sigma formuna göre aynı veya ayrı yörüngelerde bulunurlar.
Aynı yörüngede ise delta singlet oksijen , ayrı yörüngelerde iseler sigma singlet oksijen
formu oluşur. Sigma formu delta formuna göre daha enerjetik olup kolayca delta
formuna dönüşebilir 12,31.
2.3.5. Nitrik Oksit (NO˙)
NO˙ enzimatik olarak nitrik oksit sentaz enzimi tarafından L-arjinin’den
sentezlenir.
-
10
L-arjinin + NADPH + O2 → L-sitrullin + NO˙ + NADP+
NO˙ eşleşmemiş elektron bulundurmasına rağmen birçok biyomolekül ile
kolayca tepkimeye giremez, öte yandan peroksil, alkil gibi diğer serbest radikallerle
kolayca tepkimeye girerek daha az reaktif moleküller oluşturur 24.
Yüksek miktarlarda O2˙ yapımı NO˙ ile paraleldir ve birbirlerini etkileyerek ˙OH
ve ˙NO2 oluşumuna neden olurlar. Tepkime sırasında ise peroksinitrit (ONOO-) ve
peroksinitröz asit (ONOOH) ara ürünleri oluşur 24.
NO˙ + O2˙ → ONOO-
ONOO- + H+ → ONOOH
ONOOH → ˙OH + NO2
2.4. Serbest Radikalerin Etkileri
2.4.1. DNA ve Nükleik Asitlere Etkileri
İyonize edici radyasyona maruz kalınması ile oluşan serbest radikaller DNA’yı
etkileyerek hücrede mutasyona neden olurlar. Sitotoksik etki, büyük oranda nükleik asit
baz modifikasyonlarından kaynaklanan kromozom değişikliklerine veya DNA’daki
diğer değişikliklere bağlıdır. Hidroksil radikali deoksiriboz ve bazlarla kolayca
reaksiyona girer. Hidrojen peroksit zarlardan kolayca geçip hücre çekirdeğine ulaşarak
DNA hasarına, hücrede fonksiyon bozukluğuna ve hatta hücre ölümüne neden olabilir 32,33.
2.4.2. Proteinlere Etkileri
Proteinler, radikallerin etkilerine lipitlere oranla daha az hassastır ve amino asit
dizilişlerine bağlı olarak etkilenirler. Özellikle doymamış bağ ve sülfür içeren
moleküllerin serbest radikallerle etkileşimi yüksektir. Bu nedenle triptofan, tirozin, fenil
alanin, histidin, metionin ve sistein gibi amino asitleri içeren proteinler serbest
radikallerden daha kolay etkilenirler. İmmungulobin G ve albumin gibi disülfit bağı
fazla olan proteinlerin ise üç boyutlu yapıları bozulur 22,29,32.
-
11
2.4.3. Karbohidratlara Etkileri
Monosokkaritlerin otooksidasyonu sonucu hidrojen peroksit, peroksit ve
okzoaldehitler meydana gelir. Açığa çıkan okzoaldehitler proteinlere bağlanabilme
özelliklerinden dolayı antimitotik etki göstererek etki eder ve böylece kanser ve
yaşlanmaya neden olabilirler 32.
Serbest oksijen radikalleri bağ dokunun önemli bir bileşeni olan hiyalüronik asit
gibi karbohidratların parçalanmalarına da yol açabilirler 4.
2.4.4. Lipitlere Etkileri
Serbest radikallerin biyolojik dokulardaki doymamış yağ asitlerine etkileri lipit
peroksidasyonu olarak bilinir. Biyolojik zarların yapısı lipit ve proteinden oluşmaktadır,
lipit peroksidasyonu lipitlere olduğu kadar zar proteinlerine de zarar verir 12.
Lipit peroksidasyonu, çoklu doymamış yağ asitlerinin(PUFA) reaktif oksijen
türleri tarafından peroksitler, alkoller, malondialdehit, etan ve pentan gibi ürünlere
yıkılma tepkimelerine denilmektedir. Yağ asitlerinin peroksidasyonu sonrasında açığa
çıkan ürünler zar geçirgenliğini ve akışkanlığını ciddi şekilde etkileyip hücre ve organel
içeriklerinin ayrılmasına neden olan kopma ve kırılmalara yol açar. Lipit
peroksidasyonu ile meydana gelen zar hasarı geri dönüşümsüzdür 4,29.
Zincir reaksiyonu şeklinde olan lipit peroksidasyonu, organizmada oluşan
radikal etkisiyle çoklu doymamış yağ asitleri üzerindeki metilen grubundan bir hidrojen
atomu uzaklaştırılması ile başlar. Bu reaksiyon başlangıç reaksiyonu olarak
isimlendirilir. Hidrojen atomu uzaklaşması ile karbon atomu üzerinde eşleşmemiş
elektron kalır ve bunun sonucu yağ asidi zinciri bir lipit radikali(L·) niteliği kazanır.
LH + R· → L· +RH
Oluşan lipit radikalinin molekül içi çift bağlarının pozisyonunun değişmesiyle
konjuge dienler oluşur. Bir alkenin iki çift bağı arasında bir tane tekli bağ varsa bu yapı
konjuge dien olarak isimlendirilir. Bu şekilde moleküler düzenleme sağlanmış olur.
Lipit radikalinin moleküler oksijen ile etkileşmesi sonucu lipit peroksil radikali(LOO·)
oluşur.
-
12
L· + O2 → LOO·
Peroksil radikali diğer komşu yağ asitlerini etkileyerek yeni lipit radikallerinin
oluşmasına neden olurken kendisi de açığa çıkan hidrojen atomunu alarak lipit
hidroperoksitlerine (LOOH) dönüşür. Böylece peroksidasyon başladıktan sonra kendi
kendine yayılabilmekte ve çok sayıda yağ asidi zinciri lipit hidroperoksitlerine
dönüşebilmektedir. Bu tepkime ilerleme reaksiyonu olarak isimlendirilir 4,29,33,34,35.
LH + LOO· → L· + LOOH
Oldukça kararlı olan lipit hidroperoksitleri lipit peroksidasyonunun ilk ürünüdür.
Lipit peroksidasyonunun sürekli olarak devam ettiği durumlarda E vitamini gibi
zincirleme tepkimeyi sonlandırıcı bir antioksidan ile lipit peroksidasyonu sonlanabilir36.
L˙ + E Vit → LH + E Vit
E Vit + L˙ → LH + Okside E Vitamini
Geçiş metalleri varlığında lipit hidroperoksitleri bu metallerin redoks
döngüsüyle birlikte lipit peroksidasyonunu başlatabilecek radikallerin oluşumuna neden
olabilirler.
Lipitlerden araşidonik asit metabolizması sonucu serbest radikal üretimine
“enzimatik lipit peroksidasyonu”, diğer radikallerin sebep olduğu lipit
peroksidasyonuna ise “non-enzimatik lipit peroksidasyonu” denir 22.
Lipit proksidasyonunun son bileşeni olan malondialdehit (MDA) peroksidasyona
uğramış çoklu doymamış yağ asitlerinin bölünmesiyle oluşan üç karbonlu bir
dialdehidtir ve oksidatif durumun göstergesi olarak yaygın kullanılır. Bu dialdehid
biyolojik ortamda makromoleküllerin NH2 ve/veya SH gruplarına bağlı veya serbest
olarak bulunur. Oluşan MDA; deformasyon, iyon transportu, enzim aktivitesi ve hücre
yüzey bileşenlerinin agregasyonu gibi zar özelliklerinin değişmesine yol açar 4,37.
-
13
2.5. Antioksidan Sistem
Organizma içindeki radikaller, geri dönüşümsüz hücre hasarına yol açan birçok
tepkimeye neden olurlar (Şekil 2.3). Süperoksit ve hidroksil radikalleri hücresel,
mitokondrial, nükleer ve endoplazmik zarlarda lipit peroksidasyonunu başlatırlar.
Geçirgenlikteki artış mitokondrial hasara neden olan Ca+2’un hücreye akın etmesine
neden olur 9.
Şekil 2.3. Radikallerin yol açtığı hücre hasarı.
Hücre ve organ sistemlerini reaktif oksijen türlerine karşı koruyabilmek için
organizma karmaşık bir sistem geliştirmiştir. Bu sistem endojen ve eksojen orjinli,
etkileşimli ve birlikte çalışan çeşitli bileşenler içerir 38.
Antioksidan sistem hasar öncesi radikal oluşumunu önler, oksidatif hasarı onarır,
hasara uğramış molekülleri temizler ve mutasyonları önler. Nötralize olması gereken
çeşitli reaktif ara ürünleri ve indirgenmesi gereken okside biyomolekülleri etkileyen
hem lipofilik hem hidrofilik fazda pek çok antioksidan çizelge 2.4’de özetlenmiştir 39.
-
14
Çizelge 2.4. Hidrofilik ve lipofilik fazda bazı antioksidanlar
Antioksidan Faz Etki
Süperoksit Dismutaz(SOD) Hidrofilik O2˙’nin H2O2 ve O2’e
dismutasyonu
Katalaz(CAT) Hidrofilik H2O2’nin H2O ve O2’e
dismutasyonu
Glutatyon peroksidaz(GSH-Px) Hidrofilik veya R-OOH’nin R-OH indirgenmesi
Lipofilik
Glutatyon redüktaz (GSH-Rd) Hidrofilik Okside glutatyonun
indirgenmesi
Glutatyon S Transferaz (GST) Hidrofilik R-OOH’nin GSH ile
konjugasyonu
Metallotieninler Hidrofilik Geçiş metalleriyle
nötralizasyon
Tiyoredoksinler Hidrofilik R-S-S-R’nin R-SH’a
indirgenmesi
Glutatyon Hidrofilik R-S-S-R’nin R-SH’a indirgenmesi
Serbest radikal temizleyicisi
GSH-Px ve GST’nin kofaktörü
Ubikinon Lipofilik Serbest radikal temizleyicisi
Lipid peroksidasyonunda korun
Askorbik asit Hidrofilik Serbest radikal temizleyicisi
Tokoferol kazanımı Enzimlerin redükte formda korunması Karotenler Lipofilik Serbest radikal temizleyicisi
O2˙ baskılayıcı
Tokoferol Lipofilik Selenyum absorbsiyonunu arttırır
Serbest radikal temizleyicisi
Lipid peroksidasyonunda korun
Selenyum Amfifilik Tiyoredoksin, GSH-Px yapıtaşı
Antioksidanları hücre içi, hücre dışı ve zar antioksidanları olarak
sınıflandırabiliriz. Bunlara örnek vermek gerekirse;
Hücre içi antioksidanlar için süperokit dismutazları, katalazı, glutatyon
peroksidazı, glutatyon S transferazı, glutatyon redüktazı,
-
15
Zar antioksidanları için E vitaminini, β karoteni, koenzim Q’yu,
Hücre dışı antioksidanlar da ise transferini, laktoferrini, haptoglobini,
hemopeksini, albumini, seruloplasmini, ekstrasellüler süperoksit dismutazı,
ekstrasellüler glutatyon peroksidazı, bilirubini, askorbik asiti sayabiliriz 29.
Reaktif oksijen türlerine karşı primer savunma enzimatik ve enzimatik olmayan
intrasellüler antioksidanlarca yapılır (Şekil 2.4 ) 40.
Şekil 2.4. İnsan dokularındaki major antioksidan enzimler ve bağlı yollar.
CuZnSOD (bakır-çinko SOD), MnSOD (manganez SOD), ECSOD
(ekstrasellüler SOD), CAT (katalaz), GSH-Px (glutatyon peroksidaz), GSH-Rd
(glutatyon redüktaz), GSH (redükte glutatyon), GSSG (okside glutatyon), GST
(glutatyon S transferaz), MRP (Multidrug resistans protein), G6PD (glukoz-6-
fosfat dehidrogenaz), cGS (gama glutamil transpeptidaz), cGCS (gama glutamil
sisteinil sentetaz),(glutamat sistein ligaz), GS (glutatyon sentaz), GPxe
(ekstrasellüler glutatyon peroksidaz) 41
-
16
2.5.1. Redükte Glutatyon (GSH)
Tripeptid yapıdaki GSH (L-γ- glutamil-L-sisteinil-glisin) oksidatif ve elektrofilik
stres ve radyasyona karşı hücrelerin korunmasında önemli rol oynar (Şekil 2.5). GSH
sitozolik GSH redoks döngüsünde substrat olarak rol alırken, ROS’a karşı direkt olarak
da savunma yapabilir 42.
Şekil 2.5. Redükte Glutatyon (GSH).
Hücrede milimolar derişimde bulunan GSH primer olarak redükte formda(GSH)
bulunur ancak okside formda disülfüd dimeri (GSSG) olarakta bulunabilir 43,44.
GSH’ın hücresel seviyesi γ-glutamil transpeptidaz, aminoasit transporterları,
glutatyon sentetaz, glutatyon peroksidaz ve glutatyon redüktazı içeren çoklu bir enzim
sistemi tarafından korunur 45.
2.5.2. Glutatyon Peroksidaz Enzimi (GSH-Px)(EC 1.11.1.9)
Glutatyon Peroksidaz organik hidroperoksitlerin (lipit hidroperoksitler, DNA
hidroperoksitler) veya hidrojen peroksitin GSH tarafından indirgenmesi tepkimesini
katalizler. 1957’de Mills tarafından keşfedilmiştir 42.
H2O2 + 2 GSH 2 H2O + GSSG
ROOH + 2 GSH ROH + GSSG + H2O
Glutatyon Peroksidaz enzimi iki gruba ayrılabilir: selenyum bağlı ve selenyum
bağlı olmayan. Selenyum bağlı grupta hidrojen peroksit ve diğer organik peroksitleri
indirgeyen beş üye vardır, selenyum bağımsız Glutatyon Peroksidaz ise
GSH-Px
GSH-Px
-
17
hidrojenperoksit ile ihmal edilebilir bir aktifliğe sahip olup sadece organik
hidroperoksitleri redükler 45.
Selenyum bağımlı üyelerden, GSH-Px 1 veya hücresel GSH-Px bütün
hücrelerde eksprese edilen, tetramerik yapıda, sitozolik bir enzimdir. Eritrosit, böbrek
ve karaciğerde yüksek miktarda bulunur. GSH-Px 2 veya gastrointestinal GSH-Px
insanlarda karaciğer ve gastrointestinal kanalda eksprese edilir; böbrek, kalp, akciğer,
plasenta ve uterusta bulunmaz. GSH-Px 3 veya plazma GSH-Px plazmanın lipit
kısmından izole edilmiş bir glikoproteindir, akciğer, plazma ve diğer ekstrasellüler
sıvılarda bulunur. GSH-Px 4 veya fosfolipit GSH-Px sitozolde, mitokondri ve hücre
zarında bulunur. GSH-Px 5 veya epididimal GSH-Px selenyum bağlı değildir ve yalnız
epididimiste eksprese edilir. GSH-Px 6 hücresel GSH-Px ile homoloji gösterir, burun
epiteli ve embriyolarda eksprese edilir 42,46,47.
2.5.3. Glutatyon Redüktaz Enzimi (GSH-Rd)(EC 1.6.4.2)
Okside glutatyon (GSSG) NADPH bağlı flavo enzim olan Glutatyon Redüktaz
tarafından redükte formuna (GSH) indirgenir 16,24,42.
GSSG + NADPH 2GSH + NADP
Glutatyon redüktazın kalıtımı otozomal dominanttır, 8. kromozom üzerindedir.
Glutatyon peroksidaz ile benzer doku dağılımı gösterir.
Glutatyon redüktaz flavin adenin dinükleotid (FAD) içerir, NADPH’tan bir
elektronun GSSG’nin disülfüd bağlarına aktarılmasını katalizler. Bu nedenle NADPH
serbest radikal hasarına karşı gereklidir ve major kaynağı pentoz fosfat yoludur (Şekil
2.6)33.
GSH-Rd
-
18
Şekil 2.6. Glutatyon redoks döngüsü
2.5.4. Glutatyon-S-Transferaz Enzimi (GST)(EC 2.5.1.18)
GST memeli türlerinde elektrofilik bileşenlerin GSH ile konjugasyonunu
katalizleyen izoenzimlerin oluşturduğu çoklu bir gen ailesinden oluşur; alfa,mu, teta, pi,
zeta, sigma, kappa ve omega olarak gösterilen 8 esas gen sınıfı ile düzenlenmiştir.
Alfa kromozom 6’da, mu kromozom 1’de, teta kromozom 22’de, pi kromozom
11’de, zeta kromozom 14’de, sigma kromozom 4’de, kappa ve omega kromozom 10’da
kodlanır 33,48.
GST karsinojenleri, çevresel etmenleri, ilaç ve geniş spektrumlu kasenobiotikleri
metabolize eder. Mikrozomal GST belirlendiyse de GST aktivitesi esasen sitozoliktir 42.
GST iki subüniteden oluşmuş dimerik bir proteindir. Bu subünitelerden her biri
glutatyon bağlanma bölgesi (G bölgesi) ve buna komşu elektrofilik substrata bağlanan
nispeten hidrofobik olan bölge içerir. Bunun yanında çeşitli izoenzimlerde transport
veya düzenleyici fonksiyonu olduğu düşünülen substrat bağlanmayan bölge de
belirlenmiştir.
GST, hidroksialkenler, lipit peroksidasyonunun ürünlerinden propenaller ve
DNA hidroperoksitleri gibi endojen zararlı bileşiklerin detoksifikasyonunu
sağlayabildiği için oksidatif strese karşı savunmaya katılır, bunun yanında epoksidler ve
kinonlar gibi maddelerin biotransformasyonunda elektrofilik ksenobiotikler ve/veya
reaktif ara ürünler oluşabilir 33,45.
GST enziminin teta ve alfa sınıfları selenyum bağlı olmayan Glutatyon
peroksidaz aktivitesi gösterirler, GST pi formu lipit hidroperoksitleri ve
hidroksialkenler, malondialdehitler ve propenalleri inaktive eder. GST pi ayrıca hassas
-
19
SH- grubuyla ROS ile direkt reaksiyona girerek disülfüd yapımının inaktif olmasına
neden olur 45.
2.5.5. Süperoksit Dismutaz Enzimi (SOD)(EC 1.15.1.1)
Reaktif oksijen türlerine karşı primer antioksidan enzim Süperoksit
Dismutaz’dır. Formları arasında aminoasit dizilimi, aktif metal bölgesi ve hücresel
dağılım farkı vardır. Prokaryotlarda Fe ve Mn-SOD bulunurken, ökaryotlarda Mn,
CuZn ve ekstrasellüler SOD (EC-SOD) bulunur 49.
Mn-SOD homotetramer yapıdadır, her subünitesinde bir Mn iyonu bulunur, ve
88 kDa ağırlığındadır. Hücresel Mn-SOD içeriği kalp, beyin, karaciğer, böbrek gibi
yüksek metabolik aktivitesi olan dokularda daha fazladır. CuZn-SOD 32 kDa
ağırlığında olup memelilerde en çok karaciğer, böbrek, eritrosit ve santral sinir
sisteminde bulunur. İki protein subünitesi içerir her subünitede Cu ve Zn atomları
bulunur. EC-SOD ise en çok vaskülatür, akciğer, uterus ve tiroid bezlerinde bulunur 41,50.
SOD, süperoksit molekülünün hidrojen peroksite ve moleküler oksijene
tepkimesini katalizler 16,22,24.
2 O2˙ + 2H+ H2O2 + O2
Tepkimede süperoksit anyonu Cu+2 ve bir arjinin rezidüsünün guanido grubuna
bağlanır. Bu şekilde süperoksitten bir elektron Cu+2’a transfer olurken Cu+1 ve
moleküler oksijen oluşur. İkinci süperoksit anyonu Cu+1’dan bir elektron,bağlanma
ortağından ise iki elektron alarak hidrojen peroksiti oluşturur 22,41.
SOD-Cu+2 → SOD-Cu+1 + O2
SOD-Cu+1 + O2˙ + 2H+ → SOD-Cu+2 + H2O2
2.5.6. Katalaz Enzimi (CAT)(EC 1.11.1.6)
Katalaz çoğu organizmada bulunan ve hem içeren homotetramerik bir enzimdir.
Peroksizomlarda yüksek derişimlerde bulunur 51,52.
SOD
-
20
Katalaz yapı ve işlevlerine göre bifonksiyoneldir. Tüm prokaryot ve
ökaryotlarda bulunur. Her subünite bir hem grubu ve NADPH molekülü içerir. Birçok
katalazda NADPH molekülü yüzeye yakın ve sıkıca bağlıdır. Bu kofaktör peroksitin
oksijene dönüşümünde katalazın inaktivasyonunu koruduğu ve etkisini arttırdığı
gözlenmiştir 52.
Katalaz hidrojen peroksitin su ve moleküler oksijene dismutasyonunu katalizler.
2H2O2 O2 + 2H2O
Katalaz ayrıca fenol, alkol gibi farklı substratların, hidrojen peroksitin çift
redüksiyonu ile detoksifikasyonunu sağlar.
H2O2 + RH2 R + 2 H2O
Glukoz-6-fosfat eksikliklerinde NADPH’ın olgun eritrostlerdeki düşüklüğünün
katalazda inhibisyona neden olduğu ve hemolizin GSH-Rd/GSH-Px’den çok katalazdan
kaynaklandığı düşünülmektedir 24.
2.5.7. Tiyoredoksin sistem
Tiyoredoksin sistem oksidoredüktaz enzim aktivitesi gösteren tiyoredoksin (Trx)
ile tiyoredoksin redüktazı (TrxR) içeren iki antioksidan enzim sistemi içerir. Memeli ve
prokaryotik hücrelerde bulunur. Tiyoredoksin redüktaz NADPH kullanarak
tiyoredoksinin disülfit aktif bölgesini ve pek çok substratı redükler. Yapılan
çalışmalarda, tiyoredoksinin insanda immun sistem düzenlenmesiyle ilişkili olduğu ve
farklı genlerce kodlanan üç farklı varyantı gösterilmiştir.Tiyoredoksin redüktaz
izoenzimleri, her subünitesinde bir FAD bulunduran NADPH bağlı
oksidoredüktazlardır. Tiyoredoksin redüktazın ilk saflaştırılması 1977’de yapılmıştır 24.
2.5.8. Ubikinon (Koenzim Q)
Ubikinon esas olarak mitokondride elektron transport zincirinin bir parçası
olarak kullanılmaktır, bunun yanında ubikinon düşük derişimlerde plazmada ve hücre
zarlarında lipit peroksidasyonuna karşı koruyucu antioksidan olarak bulunur.
CAT
CAT
-
21
Ubikinonun yenilenmesi lipoamid dehidrogenaz ve kısmen tiyoredoksin redüktazı da
içeren enzim ailesinin diğer üyeleriyle gerçekleştirilir 53,54.
2.5.9. Askorbik Asit (C Vitamini)
Askorbik asit insan plazmasında ve hücre zarında bulunan, zarı geçebilen major
antioksidanlardan biridir.Suda çözünebilir düşük moleküler ağırlıklı bu antioksidan
kollojen sentezi, demir absorpsiyonu ve hücrelerin redoks durumunun korunmasında
gereklidir. Tokoferoller, peroksidler ve süperoksit gibi reaktif oksijen türlerini redükler.
Askorbik asitin antioksidan olarak esas görevi lipit hidroperoksitlerin oluşumunu
engellemektir. Bu da aterosklerotik plak oluşumunu engellemede önemli rol
üstlendiğini gösterir 55.
2.5.10. Karotenler (A Vitamini)
Alkoller(retinoller), aldehitler(retinaller) ve retinoik asitler başta olmak üzere A
vitamininin çeşitli türleri bulunur. A vitamininin en etkili ve en yaygın türü β-
karoten’dir. Suda çözünmeyen bu bileşik havada okside olarak inaktif ürünler
oluşturur56.
A vitamininin antioksidan etkisi yanında gerekli olduğu sistemik etkiler hücre ve
intrasellüler zar dayanıklılığının sağlanması, epitel dokunun bütünlüğünün
sürdürülmesi, ve glikoprotein sentezidir 56.
2.5.11. Tokoferoller (E Vitamini)
α, β, γ, δ olmak üzere dört farklı tokoferol formu bulunur. Biyolojik olarak en
yaygın ve en aktif E vitamini şekli olan d-α-tokoferoldür. Yağda çözünen fakat suda
çözünmeyen bu bileşikler oksijen bulunmayan ortamlarda asit ve sıcaklığa
dayanıklıdır57.
Eşleşmemiş elektronlarla reaksiyona giren ve indirgeyebilen hidroksil grubu
içerir. Radikal reaksiyonları sırasında zincir kırıcı etkiye sahiptir. Glutatyon ve askorbik
asit ile antioksidan etkisi artar 13,57,58.
2.5.12. Flavonoidler
Flavonoidler çeşitli sebze, meyve ve otlarda bulunan polifenol grubu doğal
kimyasallardır. Doğada altı binin üzerinde flavonoid vardır. Antioksidan,
-
22
antiarteriyosklerotik, antiinflamatuvar, antitümör, antitrombojenik, antiviral, antialerjik
etkileri vardır. Flavonlar, flavonollar, flavanonlar; kateşinler, isoflavonlar,
antosiyanidinler olarak altı sınıfa ayrılırlar.
Flavonoidler, önemli metal şelatörleri ve serbest radikal temizleyicisi gibi rol
oynarlar. Flavonoidler tarafından temizlenebilen ve formasyonları inhibe edilebilen
reaktif oksijen ürünleri; süperoksit anyonları, hidroksil radikali, alkol radikali, peroksil
radikali ve perhidroksi radikalidir. Flavonoidler, radikallerin reaktif kısımlarıyla
etkileşerek, reaktif oksijen ürünlerini stabilize ederler.59
2.5.13. Selenyum
Selenyum yiyeceklerde selenosistein öncü maddesi olan selenitler, selenatlar ve
selenometiyonin olarak bulunur. İn vitro hayvan deneylerinde Se bileşiklerinin
apoptozisi ve transforme hücrelerde hücre siklusunu indirgediği gösterilmiş ve bundan
dolayı da kanser hücre gelişimini durduğu ileri sürülmüştür 58,60.
2.5.14. Transferin ve Laktoferrin
Transferin kanda demir taşıyan bir β-globindir. Laktoferrin ise dolaşımdaki
serbest demiri düşük pH’larda bağlar 22,58..
2.5.15. Ürik Asit
İnsanlarda pürin nükleozidleri olan adenozin ve guanozin katabolizmasın temel
ürünü ürik asittir. Metal bağlayıcı ve serbest radikal temizleyicisi olarak görev alır 61.
2.5.16. Bilirubin
Bilirubinin büyük bir kısmı ömrünü dolduran eritrositlerin parçalanmasından
kaynaklanır ve dolaşımdan karaciğer tarafından alınır ve biyotransformasyona uğrar,
safra ve idrarla atılır. Antioksidan olarak peroksil radikalleri toplar 58.
2.5.17. Haptoglobin (Hp)
Haptoglobin hemoglobini geri dönüşümsüz olarak bağlayan bir
α2-glikoproteindir. Ekstrasellüler hemoliz sırasında hemoglobin eritrositlerden salınır ve
serbest hemoglobin dimerleri tümüyle haptoglobine bağlanır 58.
-
23
2.5.18. Seruloplazmin:(Cp)
Seruloplazmin total serum bakırının yaklaşık %95’ini içeren α2-globulindir.
Cp’nin primer fizyolojik rolü plazma redoks reaksiyonlarıyla ilişkilidir. Serbest ferrik
iyonları ve ferritin bağlayan bölgelerin varlığı gibi faktörlere bağlı olarak oksidan veya
antioksidan olarak işlev görür. Cp’nin demirin iyonik durumunu düzenlemede ve toksik
demir ürünleri oluşmaksızın demirin transferine girmesinde. yaşamsal önemi vardır 58.
2.6. Hemoglobin Yapısı ve Sentezi
Hemoglobin eritrositlerin kırmızı rengini sağlayan ve oksijen taşıma yeteneği
kazandıran bileşenidir. Protein yapısındaki hemoglobin oksijeni akciğerlerden dokulara,
karbondioksiti ise dokulardan akciğerlere taşımaktadır 62.
Molekül ağırlığı yaklaşık 64.500 dalton olup molekülün %96’sını globin
proteini, %4’ünü de hem yapısı oluşturmaktadır (Şekil 2.7)63.
Şekil 2.7. Hemoglobin A yapısı
2.6.1. Hem Yapısı
Hem grubu dört pirol halkasından meydana gelen protoporfirin halka sistemi ile
bir demir atomundan oluşmaktadır. Meten köprüleri ile birbirine bağlanan dört pirol
halkasından meydana gelen tetrapirol halkasına yan zincir olarak dört metil, iki vinil ve
iki propiyonat eklenmiştir.(Şekil 2.8) Protoporfirin halkasına zincirler onbeş farklı
-
24
şekilde bağlanabilmektedir. Biyolojik sistemde protoporfirin IX olarak isimlendirilen
izomerinin bulunduğu belirlenmiştir 60.
Şekil 2.8. Hem molekülü yapısı
Molekülde Protoporfirin IX halkasının merkezine prostetik grup olarak demir
yerleşir. Hem dönüşümlü olarak oksijenle bağlanması ancak demir ferröz (Fe2+)
formunda iken olur. Demir ferrik (Fe3+) duruma okside olduğunda hem oksijene
bağlanamaz ve methemoglobin olarak isimlendirilir. Hemoglobinin globin proteininden
ayrı olarak demir serbest halde oksijene bağlanamaz. 64.
2.6.2. Globin Yapısı
İki farklı globin zinciri kombine olarak hemoglobini oluşturur. Bu zincirlerden
biri alfa iken diğeri non-alfa zinciridir. Embriyogenezin ilk haftaları dışında globin
zincirlerinden biri daima alfadır (Çizelge 2.5)64.
Çizelge 2.5. İnsan hemoglobinlerindeki globin zincirleri 65
Embriyonik hemoglobinler
Fetal hemoglobin
Yetişkin hemoglobinleri
gower 1- ζ2, ε2 gower 2- α2, ε2 Portland- ζ2, γ2
hemoglobin F- α2, γ2 hemoglobin A- α2, β2 hemoglobin A2- α2, δ2
-
25
Embriyoda ilk sentezlenen globin zinciri zeta (ζ ) ve alfa (α) zincirine benzeyen
epsilondur (ε). Beş altı haftalık gestasyon öncesinde Hb Gower 1 (ζ 2, ε2 ) major
hemoglobin olarak gözlenir. Hb Gower 2 (α2 , ε2 ) 4-13 haftalar arası embriyoda
gözlenir, diğer bir erken dönem hemoglobini ise Portland ( ζ 2,γ2 )’dır.Hb F (α2 , γ2) fetal
hayatın major hemoglobinidir.(Şekil 2.9) Normal erişkin hemoglobininde Hb A %97
oranındadır ve 9 haftalık fetusta gösterilebilir. Hb A2 erişkin hemoglobininin %2.5’ini
oluşturur 66.
Şekil 2.9. Globin sentezi
Globin komponentlerini şifreleyen α benzeri genler16. kromozomda, β benzeri
genler 11. kromozomda yer alır 62.
α globin gen kümesi üç fonksiyonel gen içeir; ζ geni, α1 geni ve α2 geni. Gen
delesyonları veya zincir sentez eksikliği veya yokluğu sonucu α-talasemi oluşur. β
globin gen kümesi ise ε geni, γ geni, δ geni ve β geni olmak üzere beş gen içerir (Şekil
2.10)63.
β globin geni, β globin zincirindeki 146 aminoasidi kodlamak için gerekli
bilgiyi, 3 ekson, 2 intron ve 5’, 3’ düzenleyici bölgelerden oluşan yaklaşık 1.8 kb
üzerinde taşımaktadır 67.
-
26
Şekil 2.10. Globin gen kümeleri
2.7. Talasemi Sendromları
Normal bir erişkinde yapısal olarak birbirinden farklı üç hemoglobin vardır;
bunlar Hb A, Hb F, ve Hb A2 dir. Talasemi bu üç farklı hemoglobinin yapısındaki dört
(α,β,δ,γ) farklı globin zincirlerinden bir veya birden fazlasının yapım azlığı veya hiç
yapılamama durumudur 68.
Talasemi ilk kez Detroitli bir çocuk hekimi olan Thomas Cooley tarafından 1925
yılında derin anemisi, dalak büyümesi, büyüme geriliği, ve kemik deformiteleri gibi
benzer bulguları olan çocuklarda ayrı bir hastalık olarak tanımlanmıştır 69.
Talasemi otozomal resesif geçiş gösteren heterozigot formda taşıyıcılığa,
homozigot formda hastalığa yol açan kronik hemolitik bir anemidir 70.
Talasemi sınıflandırması yetersiz globin zincir yada zincirlerine göre
yapıldığında, α zincir sentezinin yokluğu yada eksikliği α-talasemi , β zincir sentezinin
yokluğu yada eksikliği β–talasemi olarak adlandırılır 63.
2.7.1. Αlfa Talasemi
α-Talasemide en sık rastlanılan patoloji gen delesyonudur. Dört α geninden bir
tanesi delesyona uğradığında α+-talasemi, (sessiz talasemi veya α- talasemi-2), iki α
geni delesyona uğradığında αo-talasemi (α-talasemi taşıyıcılığı veya α-talasemi-1) adı
verilen taşıyıcılık, üç α-geni delesyona uğradığında ise Hb H (β 4) hastalığı adı verilen
hastalık ortaya çıkar. Hb Bart’s (γ4) (hidrops fetalis) ise dört α-geni de delesyona
uğramıştır, bu durumda intra uterin tedavi yapılmazsa fetal ölüm veya doğumu takiben
1-2 dakika içinde bebek ölümü gerçekleşir 68,71,72.
-
27
2.7.2. Beta Talasemi
11. kromozomdaki β geninde çesitli ve çok sayıda genetik mutasyonlar sonucu,
β globin zincir yapısının azalması veya hiç yapılmaması ile β-talasemi hastalıgı ortaya
çıkmaktadır 73.
β-talaseminin en önemli nedenini, α-talasemide görülen büyük delesyonlar değil
gen içindeki nokta mutasyonları oluşturmaktadır. Bugüne kadar β-talasemi’ye neden
olan 200’den fazla nokta mutasyon belirlenmiştir. lVS-l-110 Türkiye’de en sıklıkla
rastlanan β talasemi mutasyonudur (%40)74.
β talasemi klinik durum göz önüne alınarak sınıflandırıldığında major klinik
bulguları ve derin anemisi olan hastalar talasemi major, anemisi düzenli transfüzyon
gerektirmeyen hastalar talasemi intermedia , anormal eritrosit morfolojisi olmasına
rağmen anemisi olmayan veya çok az olan hastalar talasemi minör, talasemi geni
taşımasına rağmen anormal eritrosit morfolojisi göstermeyen hastalar da talasemi
minima olarak sınıflandırılır 63.
β globin zincirinin eksikligi veya yokluğuyla gama ve delta zinciri artışı HbA2
ve HbF artmasına neden olmaktadır. β-talasemi’li hastalarda inutero γ globin sentezi
yeterli olduğu için β globin sentezindeki defekt HbA’nın HbF ile yer değiştirmesi
gereken dönemde başlar. Klinik bulguların yaşamın ilk birkaç ayında görülmemesinin
nedeni budur 70.
β-talasemide anemi, periferal sirkülasyondaki eritrositlerin inefektif eritropoesisi
ve prematür hemolizinin kombinasyonundan kaynaklanmaktadır 73.
Hastalığı ağırlaştıran ikinci ve daha önemli olay ise β globin zinciri eksikliği
nedeniyle eşlenmemiş fazla α globin subünitelerinin birikip, çökmesi eritrosit membran
ve organellerinde geri dönüşümsüz harabiyete neden olup, eritrositlerin dalakta yıkımını
arttırmaktadır 73.
β-talasemi tanısında öncelikle mikrositik hipokromik anemiyi ortaya koymak
için eritrosit indeksine bakılır,(Çizelge 2.6) daha sonra periferik yaymada eritrosit
morfolojileri incelenir,(Şekil 2.11) hemoglobin analiziyle HbA düşüklüğü ve HbA2,HbF
artışı araştırılır.(Çizelge 2.7) İleriki basamakta ise genetik testlerle mutasyon taraması
yapılır 75.
-
28
Çizelge 2.6. Beta talasemide eritrosit indeksi değişimi65
Normal Hasta Taşıyıcı Eritrosit İndeksi Erkek Kadın ß-Thal Major ß-Thal Minor
MCV 80-94 fl 81-99 fl 50-70 fl
-
29
nedeniyle eritrosit membranının antijenik yapısında değişiklik olmaktadır. Bu antijenik
yapı değişikliği otoreaktif IgG antikorları olusumuna neden olmaktadır. IgG antikorları
antigalaktosit ile reaksiyona girer ve eritrositlerin retiküloendotelyal sistem'de(RES)
yıkımı artar 13,23.
Globin zincirlerinin yapımındaki şiddetli dengesizlikler farklı talasemi
fenotiplerinin ortaya çıkmasına yol açar. Talasemik eritrositlerin oksidatif streslere
artmıs duyarlılığı, serbest radikallerle olusan oksidatif hasar, lipid peroksidasyonu ve
demir toksisitesi ile belirlenmiştir 37,76.
Talasemide oksidatif hasarı ayrıca kolaylaştıran mekanizmalar multifaktöryeldir.
Bunlar;
1- Eşleşmemiş fazla alfa globin zincirleri
2- Non hemoglobin demiri
3- Hücre içinde Hb'nin düşük oluşudur.
Serbest, eşleşmemiş, instabil globin subünitleri süperoksit ve hidroksil radikali
olustururlar. Bunlar oksidatif olaylar zincirini baslatırlar. Önce methemoglobin olusur,
sonra reversible ve irreversible hemikromlar çökerler ve membranın çesitli
komponentleri ile iliskiye girerler. Hem ve globulini parçalarlar. Hemin degredasyonu
ile açığa çıkan serbest demir Fenton reaksiyonu yolu ile çok güçlü sekilde okside
radikal olusumuna yol açmaktadır 77.
Oluşan ve çok toksik olan hidroksil radikali membran iskeletinde bozulma ile,
deformabilitede azalma, rijiditede artma, membran lipidlerinde peroksidasyon, antijenik
degişme ile eritrositlerde erken yaşlanma, katyon degişiminde bozulma ile hücre içi K+
kaybı gibi olaylara neden olmaktadır 77.
2.9. Talasemi Dağılımı
Talasemi dünyadaki en yaygın kalıtsal hastalıktır. Akdeniz, Afrika’nın bir kısmı,
Orta doğu, Arap yarımadaları, güney-doğu Asya olmak üzere geniş bölgelerde görülür 71,78.
β-talasemi Akdenizi de içine alan bir kuşak içinde sıklıkla gözlenirken alfa
talasemi uzak doğuda önemli bir sorundur 79.
Her yıl doğan bebeklerin %6,5’i taşıyıcı olarak dünyaya gelirken, bunun yanında
yaklaşık 300,000 hasta çocuk doğmaktadır (Şekil 2.12)80.
-
30
Şekil 2.12. Talasemi,orak hücre anemisi ve diğer yaygın hemoglobin hastalıklarının dünya üzerindeki yayılımı.
Talasemi çeşitli ülkelerde ve aynı ülkenin farklı bölgelerinde dağılım
bakımından heterojenite gösterir. Talaseminin yaygın olduğu kuşakta bulunan
ülkemizde de hastalığa her bölgede rastlanmakta ve Türkiye ortalaması %2 olarak
belirtilmektedir 80,81.
β-talasemi ve diğer hemoglobinopatiler Türkiye’de son yıllarda sağlık
bakanlığınca yaygın sağlık sorunu olarak kabul edildi. Ulusal Hemoglobinopati Konseyi
2000 yılında sağlık otoriteleriyle tüm Türkiye’de hastalığın tanı, tedavi ve kontrol
standardizasyonunu sağlamak için yasa önerisi hazırlamış ve bu yasalaşmıştır 80.
2.10. Talasemide Tedavi
Modern dünyanın büyük kısmında yaygın olduğu anlaşıldıktan sonra bu grup
hastalıklarda yeni tedavi gelişimleri ilgi çekmeye başlamıştır. Ayrıca birçok ülkede
DNA temelli prenatal tanı önemli ölçüde hasta, taşıyıcı doğumunu engellemiştir 78.
Talasemi major ve diğer transfüzyon gerektiren talasemik sendromlarda tedavide
şu yöntemler kullanılır 82.
• Süper ve hipertransfüzyon tedavisi
• Splenektomi
• Şelasyon tedavisi
• Kemik iliği transplantasyonu
-
31
Bu tedavilerden düzenli kan transfüzyonu; yaşamı uzatır, anemi
komplikasyonlarını azaltır, kemik iliği hiperaktivitesini önler, normal büyüme ve
gelişmeyi sağlar.Sadece kan transfüzyonu alan hastalar demir birikimine bağlı olarak
kaybedilebilirler. Splenektomi;hipersplenizmi bulunan olgularda uygulanır, şelasyon
tedavisi; demir birikimini azaltarak yaşam süresini arttırır.
1982’de Thomas tarafından talasemi için yapılan transplantasyondan beri binin
üstünde allogenik transplantasyon rapor edilmiştir. Halen bilinen tek kür oluşturan
tedavi yöntemi hematopoetik kök hücre transplantasyonudur 78,83.
Gen terapisi ise umut vadeden bir tedavi yöntemidir. Tek gen fonksiyonunun
azalması veya tamamen kaybolması gen terapisi tedavisi için ilk düşünülen
sebeplerdendir. Bu beklenti yaklaşık 15 yıl önce β globin geni transfer edilen transgenik
farelerde talaseminin düzeltilmesiyle desteklenmiştir. Günümüzde de değişik metodlar
uygulanarak çalışmalar sürdürülmektedir 78.
-
32
3.GEREÇLER VE YÖNTEMLER
3.1. Gereçler
3.1.1.Cihazlar
1. Spektrofotometre Bausch and Lamb Spectronic 20D
2. UV spektrofotometre Schimadzu-UV 260
3. Su Banyosu Thermomix BU
4. Kan sayım cihazı Coulter T-890
5. Buz makinesi Scotsman AF-10
6. Soğutmalı Santrifüj Ependorf Centrifuge 5403
7. Santrifüj Hettich D7200
8. Manyetik karıştırıcı Heidolph MR 2002
9. Vorteks Elektro-mag M-16
10. Dijital pH metre WTW pH S25
11. Elektrikli Terazi Mettler P 1210
12. Otomatik pipet Gilson P-20, P-100, P-200, P-1000 µl
13. Aspiratör Vacumat
3.1.2.Kimyasal Maddeler
1. Redükte nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADPH) (Sigma)
2. Sodyum dodesil sülfat (SDS) (Sigma)
3. 1,1,3,3-tetrametoksipropan (Aldrich)
4. Redükte Glutatyon (GSH) (Sigma)
5. Glutatyon Redüktaz (Sigma)
6. t-butil hidroperoksit (Sigma)
7. Okside Glutatyon (GSSG) (Sigma)
8. SOD Ransod Kıt (Randox)
-
33
9. Flavin adenin dinukleotid (FAD) (Calbiıochem)
10. 1-kloro-2-4-dinitrobenzen (CDNB) (Aldrich)
11. n-Butanol (Merck)
12. Piridin (Sigma)
13. Asetik asit (Sigma)
14. Tiyobarbitürikasit (Sigma)
15. %30’luk Hidrojen peroksit (Merck)
3.2.Örnek Toplama
β talasemili hastaların kan örnekleri Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi
Hastanesi Pediatrik Hematoloji Anabilim Dalı’nda tanısı konmuş ve tedavi edilmekte
olan çocukluk yaş grubunda transfüzyondan hemen önce; kontrol grubunun kan
örnekleri ise β talasemi tanısı konmamış 16 yaş altı çocuklardan alınmıştır.
Olgulardan venöz staza yol açmadan EDTA içeren antikoagulanlı tüplere alınan
kan örneklerinin, hematolojik testleri yapıldıktan sonra santrifüj edilerek MDA analizi
için plazmaları ayrılmış elde edilen eritrosit pelletleri eritrosit SOD, GSH-Px, GSH-Rd,
GST, CAT, enzimlerinin aktivite ölçümü için serum fizyolojik ile yıkanmış ve bütün
kan örnekleri bekletilmeksizin aynı gün analiz edilmiştir.
3.3. Analiz Yöntemleri
3.3.1. Hematolojik Analizler
Hematolojik analizler coulter counter cihazıyla yapılmış; Hemoglobin(Hb),
Hematokrit(Hct), Eritrosit (RBC), ortalama eritrosit hacmi(MCV), ortalama eritrosit
hemoglobini(MCH) ve ortalama eritrosit hemoglobin konsantrasyonu(MCHC) ölçüm
sonuçları alınmıştır.
3.3.2.Hemolizat Hazırlanması:
Plazmaları ayrılan kan örnekleri 2 ml soğuk (+4 oC) serum fizyolojik ile alt üst
edilerek karıştırıldıktan sonra 3000xg’de 5 dakika santrifüj edildi ve süpernatan
atıldıktan sonra aynı işlem atılan süpernatan berrak oluncaya kadar 3-4 kez tekrarlandı.
-
34
Elde edilen eritrosit pelletinden 50 µl alınıp üzerine 2 ml saf su ilave edilerek
hemolizatlar hazırlandı ve hemolizatlar deney süresince buz içerisinde muhafaza edildi.
3.3.3. Glutatyon Peroksidaz (GSH-PX) Ölçüm Yöntemi
Prensip:
GSH-Px ile t-bütil hidroperoksit varlığında GSH’nin GSSG’ye oksidasyonu
gerçekleşir.Yöntem, bu oksidasyon sonucu oluşan GSSG’nin glutatyon redüktaz (GSH-
Rd) enzimi ile tekrar GSH’ye indirgenmesi tepkimesinde NADP’ye oksitlenen
NADPH’nin 340 nm dalga boyundaki absorbans değeri farkının zamana karşı okunması
prensibine dayanır 84.
2 GSH + R-O-O-H GSSG + H2O + ROH
GSSG + NADPH + H+ 2 GSH + NADP+
Ayıraçlar:
1. 1 M Tris Tamponu (pH: 8,0) Tris asit 8,8 g
Tris baz 5,4 g
EDTA 0,14 g
Saf su ile 100 ml’ye tamamlanır.
2. 0,1 M GSH GSH 31 mg
Saf su ile 1 ml’ye tamamlanır.
Gerekli miktarda günlük olarak hazırlanır.
3. 10 Ü/ml Glutatyon Redüktaz Kullanılan glutatyon redüktazın U/ml’si üzerinden hesaplanır.
4. 7 mM t-butil hidroperoksit %70’lik t-butil hidroperoksit 1:1000 saf su ile sulandırılır.
5. 2 mM NADPH NADPH 17 mg
GR
GSH-Px
-
35
Saf su ile 10 ml’ye tamamlanır.
Gerekli miktar günlük olarak hazırlanır
Yöntem:
Ayıraçlar 1 ml’lik küvetlere tabloda belirtilen oranlarda ilave edilir.
Kör (µl) Örnek (µl)
1 M Tris Tamponu 100 100
0,1 M GSH 20 20
10 Ü/ml Glutatyon Redüktaz 100 100
2 mM NADPH 100 100
Hemolizat 10 10
Saf Su 670 660
37 ºC’de 10 dakika inkubasyon
t-Bütil hidroperoksit − 10
Hesaplama:
1 cm ışık yollu kuvartz küvetlerde, 37 ºC’de, 340 nm dalga boyunda oluşan
tepkimenin absorbans değişikliği farklı zaman aralıklarında izlenir.
∆OD/ dak VToplam GSH-Px Aktivitesi (Ü/ml) = x
6,22 VÖrnek
∆OD = Optik Dansite Değişimi
6,22 = 1 mM NADPH’nin 1 cm’lik ışık yolunda verdiği OD değeri
VToplam = Toplam hacim
VÖrnek = Hemolizat hacmi
GSH-Px Aktivitesi GSH-Px Spesifik Aktivitesi =
Hb Değeri
-
36
3.3.4.Glutatyon Redüktaz (GSH-Rd) Ölçüm Yöntemi
Prensip:
Glutatyon Redüktaz , GSSG’nin NADPH tarafından GSH’a indirgenmesini
katalize eder. Enzim aktivitesi, tepkime sırasında yükseltgenen NAD(P)H’nin 37 ºC’de,
340 nm dalga boyunda absorbans farkı ölçülerek belirlenir 84.
NADPH + H+ + GSSG NADP+ + 2 GSH
Ayıraçlar:
1. 1 M Tris Tamponu ( pH: 8,0) Tris asit 8,8 g
Tris baz 5,4 g
EDTA 0,14g
Saf su ile 100 ml’ye tamamlanır.
2. 10 µM FAD Stok 100 mM FAD 0,0008 g
Saf su ile 10 ml’ye tamalanır.
1:10 seyreltilerek 10 mM FAD hazırlanır.
3. 0.033 M GSSG GSSG 210 mg
Saf su ile 10 ml’ye tamamlanır.
Kullanılacak olan miktar günlük olarak hazırlanır.
4. 2 mM NADPH NADPH 17 mg
Saf su ile 10 ml’ye tamamlanır.
Kullanılacak olan miktar günlük olarak hazırlanır.
GSH-Rd
-
37
Yöntem:
Ayıraçlar 1 ml’lik küvetlere tabloda belirtilen oranlarda ilave edilir.
FAD’siz çalışma FAD’li çalışma
Kör (µl) Örnek (µl) Kör (µl) Örnek (µl)
1M Tris Tamponu 50 50 50 50
Hemolizat 10 10 10 10
Saf Su 890 790 790 690
10 µM FAD − − 100 100
37 ºC’de 10 dakika inkubasyon
0,033 M GSSG − 100 − 100
37 ºC’de 10 dakika inkubasyon
2 mM NADPH 50 50 50 50
GSH-Rd bir flavin enzimdir. Normal hemolizatlarda FAD tarafından tam olarak
aktive edilmediği bulunmakla birlikte apoenzimin tam aktivasyonu için enzimin FAD
ile preinkübasyonu gereklidir. Bu nedenle yöntemde FAD’li ve FAD’siz tüpler
hazırlanmış ,aktivite farkı gözlenmiş ve FAD’li tüp kullanılmıştır.
Hesaplama: ∆OD/ dak VToplam GR Aktivitesi (Ü/ml) = x 6,22 VÖrnek
∆OD = Optik Dansite Değişimi
6,22 = 1 mM NADPH’nin 1 cm’lik ışık yolunda verdiği OD değeri
VToplam = Toplam hacim
VÖrnek = Hemolizat hacmi
GR Aktivitesi GR Spesifik Aktivitesi =
Hb Değeri
-
38
3.3.5. Katalaz (CAT) Ölçüm Yöntemi
Prensip:
Katalaz H2O2’nin su ve moleküler oksijene yıkımını katalizler. H2O2’nin ışığı
absorbe etmesinden yararlanılarak 230 nm’de enzimin yıkım hızı spektrofotometrik
olarak ölçülür 84.
2 H2O2 2 H2O + O2
Ayıraçlar:
1. 1 M Tris Tamponu ( pH: 8,0) Tris asit 8,8 g
Tris baz 5,4 g
EDTA 0,14g
Saf su ile 100 ml’ye tamamlanır
2. 10 mM H2O2 ( % 30’luk H2O2’den hazırlanır.)
1 M fosfat tamponu 1/10 oranında sulandırılır, bunun 0.9 ml’sinin saf su
olan köre karşı optik dansitesi 230 nm’de okunur. (OD1) 0.9 ml 1/10
oranında sulandırılmış 1 M fosfat tamponu üzerine 1/100 oranında
sulandırılmış %30’luk H2O2’den 0.1 ml eklenerek bu çözeltinin de optik
dansitesi okunur.(OD2) 1/100 sulandırılmış H2O2’nin derişimi c = 141x
(OD2-OD1) mM’dır.10 mM H2O2 hazırlamak için 1/100 seyreltilmiş
H2O2’nin 1 ml’si derişimin 1/10’u ölçüsünde saf su ile tamamlanır.
3. 1 M Fosfat tamponu (pH: 7.0)
Disodyum Fosfat 5,4 g
Sodyum Fosfat 9,5 g
Bir miktar su koyulduktan sonra NaOH ile pH ayarlanır ve 100 ml’ye
tamamlanır.
CAT
-
39
Yöntem: Ayıraçlar 1 ml’lik tabloda belirtilen oranlarda ilave edilir.
Kör (µl) Örnek (µl) 1 MTris Tamponu 50 50
10 mM H2O2 − 900 H2O 930 30
37 ºC’de 10 dakika inkubasyon
Hemolizat 20 20
Hesaplama: ∆OD/ dak VToplam
CAT Aktivitesi(Ü/ml): x 0,071 VÖrnek
∆OD = Optik Dansite Değişimi
0,071 = 1 µmol H2O2‘nin 1 cm’lik ışık yolunda verdiği optik dansite değeri .
VToplam = Toplam hacim
VÖrnek = Hemolizat hacmi
CAT Aktivitesi CAT Spesifik Aktivitesi =
Hb Değeri
3.3.6.Glutatyon S Transferaz ( GST ) Ölçüm Yöntemi
Prensip:
GST, 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) ile glutatyonun –SH grubu arasındaki
tepkimeyi katalizler. Enzim aktivitesi 340 nm’de 37 ºC’de GSH ve CDNB kullanılarak
dakikada oluşan S-2,4 dinitrofenilglutatyonun 1 µmolünü katalizleyen enzim miktarının
ölçülmesiyle belirlenir 85.
CDNB + GSH S-2,4 dinitrofenilglutatyon + HCl GST
-
40
Ayıraçlar:
1. 20 mM GSH GSH 6,1 mg
Saf su ile 1 ml’ye tamamlanır. Gerekli miktarda günlük olarak hazırlanır.
2. 20 mM CDNB CDNB 4,05 mg
% 95’lik etanolle 1 ml’ye tamamlanır. Gerekli miktarda günlük olarak
hazırlanır
3. 0.2 M NaK Fosfat Tamponu (pH 6.5) Disodyum fosfat 1,19 g
Potasyum fosfat 2,25 g
EDTA 29,2 mg
Saf su ile 100 ml’ye tamamlanır. pH doymuş sodyumhidroksit ile ayarlanır
Yöntem:.
Ayıraçlar 1 ml’lik küvetlere tabloda belirtilen oranlarda ilave edilir.
Kör (µl) Örnek (µl)
0,2M NaK Tamponu 500 500
GSH 50 50
Hemolizat − 20
Saf Su 400 380
CDNB 50 50
Hesaplama:
∆OD/ dak VToplam GST Aktivitesi (Ü/ml) = x
10 VÖrnek
∆OD = Optik Dansite Değişimi
10 = 1 µmol CDNB ‘nin 1 cm’lik ışık yolunda verdiği optik dansite değeri
VToplam = Toplam hacim
-
41
VÖrnek = Hemolizat hacmi
GST Aktivitesi GST Spesifik Aktivite = Hb Değeri
3.3.7. Süperoksit Dismutaz (SOD ) Ölçüm Yöntemi Prensip:
Süperoksit Dismutaz enzimi, oksidatif enerji üretimi sırasında oluşan toksik
süperoksit radikallerinin hidrojen peroksit (H2O2) ve moleküler oksijene (O2)
dismutasyonunu hızlandırır. Yöntemde, ksantin ve ksantin oksidaz (XOD) kullanılarak
2-[4-iyodofenil]-3-[4-nitrofenol]-5-feniltetrazoliyum klorid (INT) ile tepkimeye giren
ve kırmızı renkli formazon boyası oluşturan süperoksit radikalleri üretilmektedir. Enzim
aktivitesi ölçümü ise reaksiyonun 505 nm’de ortamda bulunan SOD enzimi ile
inhibisyonuna dayanır 86.
Ksantin Ürik asit + O2-.
INT Formazon boyası
veya
O2˙ O2 + H2O2
Ayıraçlar:
1. CAPS (3-(sikloheksilamino)-1-propan sülfonik asit) Tamponu
2. Stok substrat karışımı
3. Ksantin Oksidaz (80 Ü/L)
4. 0,01 M Fosfat Tamponu (pH: 7.0)
5. Standart (S6) :5.4 Ü/ml SOD içeren ransod kitinin standartıdır.
XOD
O2˙
SOD SOD
-
42
Standart Eğri Çizimi:
Liyofilize olarak hazırlanmış ayıraç 10 ml bidistile su ile sulandırılır. Standart
eğri çiziminde kullanılacak olan diğer SOD derişimleri ise 0,01 M’lık fosfat tamponu ile
tabloda verildiği şekilde hazırlanır.
Kullanılacak 0,01 M Fosfat SOD Derişimi
Standart Tamponu (Ü/ml)
S5 5 ml S6 5 ml 2,8
S4 5 ml S5 5 ml 1,4
S3 5 ml S4 5 ml 0,7
S2 5 ml S3 5 ml 0,23
Standart eğri çizimi için ayıraçlar 1 ml’lik küvetlere tabloda belirtilen oranlarda ilave edilir.
Kör (ml) Standart (ml) Standart - 0,05 Fosfat Tamponu 0,05 - Substrat Karışımı 1,7 1,7
Tüpler iyice karıştırılır
Ksantin oksidaz 0,25 0,25
Tüpler iyice karıştırıldıktan 30 saniye sonra 37 oC, 505 nm dalga boyunda
havaya karşı başlangıç absorbansı (A1), 3 dakika sonra son absorbans (A2) okunur.
Hesaplama:
Çalışma körü içinde SOD olmadığı için inhibisyona uğramamış reaksiyon olarak
kabul edilir ve değeri %100 olarak alınır. Tüm standart ve örnekler için %
inhibisyon değeri bunlara ait değerin çalışma körüyle oranlanarak 100’den
çıkarılması sonucu hesaplanır.
A2 –A1 ∆A/dak = 3 dakika
-
43
∆A/dakstandart x 100 % inhibisyon standart = 100 -
∆A /dak çalışma körü
Hesaplama yapıldıktan sonra eğride x yatay eksenine SOD derişimlerinin
(Ü/ml) logaritmik dönüşüm değerleri, y dikey eksenine standartlara ait % inhibisyon
değeri yazılarak standart eğri oluşturulur.
SOD STANDART EĞRİSİ
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
-0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8
log Ü/ml
%in
hibi
syon
-
44
Yöntem:
Ayıraçlar 1 ml’lik küvetlere tabloda verildiği oranlarda ilave edilir.
Kör(ml) Örnek (ml)
Hemolizat − 0,05
Fosfat Tamponu 0,05 −
Substrat Karışımı 1,7 1,7
Tüpler İyice karıştırılır
Ksantin Oksidaz 0,25 0,25
Tüpler iyice karıştırıldıktan 30 saniye sonra 37 oC, 505 nm dalga boyunda
havaya karşı başlangıç absorbansı (A1), 3 dakika sonra son absorbans olan (A2)
okunur.
Hesaplama:
Örneğe ait inhibisyon hesaplandıktan sonra standart eğriden inhibisyona karşılık
gelen SOD değeri kullanılarak SOD aktivitesi hesaplanır.
A2 –A1 ∆A/dak = 3 dak
∆Aörnek/dak x 100 % inhibisyon örnek = 100 - ∆A çalışma körü/dak
SOD Değeri (Ü/ml)
SOD Spesifik Aktivitesi (Ü/gHb) = Hemoglobin Değeri (g/dl)
-
45
3.3.8.Malondialdehid (MDA) Ölçüm Yöntemi
Prensip:
Lipid peroksidasyonu sonucu malondialdehit sekonder ürünü oluşur. Ölçümü
aerobik şartlarda pH 3.4’te MDA’nın 95 oC’de tiyobarbitürik asit (TBA) ile
inkubasyonu sonucu oluşan pembe renkli kompleksin 532 nm’de absorbans ölçümü
esasına dayanır 87.
Ayıraçlar:
1. %8,1’lik SDS Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) 8,1 g
Saf suyla 100 ml’ye tamamlanır.
2. %20’lik Asetik Asit (pH:3.5) Asetik asit 20 ml
Saf su ile 100 ml’ye tamamlanır.
pH: 3,5’e doymuş NaOH ile ayarlanır.
3. %0,8’lik Tiyobarbitürik asit (pH:3,5) Tiyobarbitürik asit 0,8 g
Saf su ile 100 ml’ye tamamlanır.
pH: 3,5’e doymuş NaOH ile ayarlanır
4. n-Butanol/Piridin (nBu/Pi) çözeltisi n-Butanol 15 ml
Piridin 1 ml
5. Stok standart 1,1,3,3 tetramethoksipropan (yoğunluk = 0,99 g/ml)
-
46
Standart Eğri Çizimi:
Günlük standart MDA stok standartından (1,1,3,3 tetramethoksipropan) 10 μl
alınıp 100 ml’ye saf su ile tamamlanarak hazırlanır. Eğri çizimi için günlük standarttan
saf su ile 40,20,10,8,5,4 seyreltme yapılarak 15,30,60,75,121,151 n/mol derişiminde
çalışma standartları hazırlanır.
Ayıraçlar tüplere aşağıdaki gibi eklenir.
Tüp No Kör 1 2 3 4 5 6
Std (ml) - 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
SDS (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
HAc (ml) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
TBA (ml) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
Saf su(ml) 0,8 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7
95 oC’de 30 dakika inkube edilip, soğutulur.
Saf su (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
nBu/Pri (ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
n-butanol/piridin eklendikten sonra çözeltiler vorteks kullanılarak karıştırılır,
daha sonra 4000 rpm’de 10 dakika santrifüj edilir.santrifüj sonrası üstteki organik kısım
alınıp 532 nm’de absorbans değeri okunur. Standart eğri grafiği derişimler nmol/ml
biriminden hesaplanarak çizilir.
-
47
MDA STANDART EĞRİSİ
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 20 40 60 80 100 120 140 160
nmol/ml
Opt
ik D
ansi
te (5
32 n
m)
Yöntem:
Ayıraçlar 3 santrifüj tüpüne tabloda belirtildiği gibi konur.
Kör (ml) Örnek(ml) Plazma - -
SDS 0,2 0,2
HAc 1,5 1,5
TBA 1,5 1,5
Saf su 0,8 0,7
95 oC’de 30 dakika inkübe edilir, soğutulur.
Saf su 1,0 1,0
nBu/pi 5,0 5,0
n-butanol/piridin eklendikten sonra çözeltiler vorteks kullanılarak karıştırılır,
daha sonra 4000 rpm’de 10 dakika santrifüj edilir. Santrifüj sonrası üstteki organik
kısım alınıp 532 nm’de absorbans okunur.
-
48
Hesaplama:
532 nm’de okunan optik dansite standart eğriden karşılaştırılarak bulunup sonuç
nmol/ml olarak hesaplanır.
3.3.9. Hemoglobin Tayini
Prensip:
Hemoglobin molekülündeki +2 değerlikli demir drabkin çözeltisindeki
ferrosiyanür ile +3 değerliğe yükseltgenerek methemoglobine daha sonra potasyum
siyanür ile kararlı bir bileşik olan siyanmethemoglobine dönüşür.
.Siyanmethemoglobinin 540 nm dalga boyunda verdiği transmitans değeri ölçülerek
hemoglobin (Hb) miktarı belirlenir 88.
Ayıraçlar:
1. Drabkin Çözeltisi
K3Fe(CN)6 0,198 gr
KCN 0,052 gr
NaHCO3 1,0 gr
Saf su ile 1000 ml’ye tamamlanır.
Eğri çizimi için 2, 4, 8, 12, 18, 20 g/dl’lik derişimlerde standartlar hazırlanarak
15 dakika oda ısında bekletilir. Spektrofotometrede 540 nm dalga boyunda tansmitans
okunarak standart eğri çizilir.
Yöntem:
Çözeltiler tüplere aşağıdaki gibi konulur.
Kör(ml) Örnek(µl) Drabkin Çözeltisi 5 5
Hemolizat - 20
-
49
Tüpler 15 dakika oda ısısında bekletildikten sonra 540 nm’de transmitans değeri
okunarak standart eğriden hemoglobin (Hb) miktarı saptanır.
-
50
4. BULGULAR
Beta Talasemi’de oksidatif stres varlığının belirlenmesini amaçlayan bu
çalışmada, hast