beat blattmann ve patrick sticher, protein...
TRANSCRIPT
Proteini kristallere büyütme
Max Perutz ve John Kendrew 1959
yılında balina hücrelerinde oksijen
taşınımından sorumlu, küçük bir protein
olan balina miyoglobininin üç boyutlu
yapısı hakkında bir makale yayımladılar.
Bu iki bilim adamı protein yapısının
araştırılması ile ilgili olarak, moleküler
düzeyde oksijen taşıma mekanizmasını
anlamayı istiyorlardı. Araştırmacılar,
proteinin kristallerini büyüttüler ve X
ışını analizi ile kristalin kırınım motifine
bağlı olarak yapısını belirlemeye
çalıştılar.
30 Science in School Issue 11 : Spring 2009
www.scienceinschool.org
Türkçe çeviri: Aslı Giray Kurt, Hikmet Geçkil
İnönü Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü
İsviçre Zürih Üniversitesi’nden Beat Blattmann ve Patrick Sticher, protein
kristallografisinin temelini oluşturan bilimi açıklıyor ve bilim adamları tarafından
protein yapılarını belirlemek için kullanılan bir protein kristallerinin büyütülmesi
protokolü sunuyorlar.
Perutz ve Kendrew balina miyoglobin kristalleri ile
kullanışlı kırınım motifini elde edene kadar, daha
önce diğer türlerden bir dizi miyoglobini test
etmişlerdi. Bu öncü çalışma, 1962w1 yılında Kimya
dalında Nobel Ödülü'ne layık görüldü. Ancak 50 yıl
sonra bile, yapısal çalışmalar için protein kristalleri
elde etmek hala önemli bir sorun olarak
durmaktadır.
Proteinler nedir?
Proteinler canlı hücrelerde sulu olmayan
bileşenlerin en büyük grubudur. Hemen her
biyokimyasal reaksiyon, enzim olarak adlandırılan
belirli bir protein gerektirir. Proteinlerin diğer
tipleri mekanik ve yapısal (ör.,bağ dokusundaki
kolajen) veya hücre sinyalini düzenlemede (ör.,
hormon reseptörleri) immün cevap (ör.,
antikorlar) ya da küçük moleküllerin taşınımı (ör.,
iyon kanalları) gibi işlevlere sahiptir. Bu çeşitlilik
oldukça geniştir: sadece insanda 20,000’den fazla
farklı proteinin var olduğu bilinmektedir.
Öğretim aktiviteleri
Protein kristalleri, çapı
milimetreden daha küçük ve
gelişimi zor olan küçük ve
narin nesnelerdir. Oysa
protein kristalleri, X
ışınları ile analiz edilen
yapısal biyolojik çalışmalar
için gereklidir.
www.scienceinschool.org
Bu çeşitliliğe rağmen, tüm proteinler benzer bir yapısal prensibi paylaşırlar. Proteinler amino asit olarak adlandırılan 20 farklı yapıtaşından oluşurlar. Amino asitler birbirlerine kovalent bağlarla bağlanarak düz bir zincir oluştururlar (bkz. aşağıdaki Şekil). Protein zincirinin uzunluğu birkaç düzine amino asitten binlerce amino asite kadar olabilir. Hücrelerde her protein, ona karşılık gelen gelen gen tarafından kodlanır. Proteinin sentezi karmaşık bir moleküler makine olan, protein ve RNA’dan oluşan ribozom tarafından yapılır.
Proteinler kendilerine özgü üç
boyutlu yapılara katlanırlar
Normal koşullar altında amino
asitlerden oluşan lineer zincirler
belli üç boyutlu yapılara
kendiliğinden katlanırlar. Amino
asitlerden oluşan zincirin belli
bölgeleri karakteristik sekonder
yapılı elementler oluştururlar. Bu
elementler arasında en önemlileri
tipik olarak amino asitler arasında
hidrojen bağları ile kurulan α-
heliks ve β- tabakalı yapılardır (bkz.
aşağıdaki Şekil). Proteinin tamamı
böyle çeşitli yapısal elementlerin
oluşturduğu bir üçüncül (tersiyer)
yapıyı oluşturur.
a
b
Yapı, işlevdir: Bir proteinin üç
boyutlu yapısı bize neyi anlatır?
Belli bir proteinin fonksiyonu onun üç
boyutlu yapısına bağlıdır. Bir protein
sadece katlandığında, proteinin belirli
amino asitleri aktif bölgeyi oluşturacak
şekilde biri birine yeterince yakın
gelirler. Enzimlerde olduğu gibi bu
bölgeler biyokimyasal reaksiyonları
katalizleyebilir veya antikorlarda
olduğu gibi spesifik bir bağlanma
bölgesi oluşturabilirler. Yaşamın temel
süreçlerinin moleküler seviyede nasıl
işlediğini anlamak için bir proteinin
yapısal detaylarının araştırılması büyük
önem taşır: yapısal biyolojinin
araştırma alanı budur. Bugün yapısal
biyolojinin önemli hedeflerinden biri,
büyük makromolekül komplekslerinin
ve zar proteinlerinin etkileşim, yapı ve
işlevlerinin aydınlatılmasıdırw2.
Karmaşıklıkları nedeniyle, bu
proteinlerin deneysel olarak çalışılması
ve yapılarının belirlenmesi son derece
zordur. Bu tür bir işi yapmak her
zaman büyük bir başarı olarak
addedilmiştir. Ancak, bu kompleks
proteinler temel biyolojik süreçlerde
gerekli oldukları için, yapı ve
fonksiyonlarının anlaşılması için
bunlara büyük bir ilgi vardır ve bilim
adamları bunları kristalize etmeyi
denemeye devam etmektedirler.
a. Proteinler düz bir
zincir oluşturmak için
birbirine kovalent
olarak bağlanan amino
asitlerden oluşur.
b. Proteinler, kendi
işlevlerini belirleyen
üç boyutlu bir yapıya
katlanırlar. Amino asit
zincirinin belli
bölgeleri karakteristik
katlanmalar gösterir.
Bu katlanmalara iki
önemli örnek α-
heliksler ve β-
tabakalarıdır.
Resim
, Gab y S
ennhause’n
in
iiizniyleizn
iyle’r izn
iyleU
niversity o
f Zürih
c
30
Resim, Beat Blattmann ve Patrick Sticher’in izniyle
Protein Kristal Yapı
Seçme
Üretim
Saflaştırma
Analiz
Protein
Kristilizasyon Veri eldesi
Yapı çözümlemesi
Arıtım
Doğrulama
Biyolojik bağlam
X- ışını kırınımı ile protein yapı tayini için iş şeması
Proteinler doğrudan gözlem için çok küçüktürler Proteinler, yalnızca birkaç
nanometre ile ölçülen (1 nm = 1x 10-6
mm) küçük yapılardır, Bu parçacıklar
bu boyutları ile 1 mikrometrelik
maksimum çözünürlüğe sahip güçlü
ışık mikroskobu ile bile
gözlemlenemezler (1 mikron = 1x
10-3 mm).
Protein yapılarını 'görünür'
yapmak için üç önemli teknoloji kullanılır:
• Protein kristallerinin X-ışını kırınımı
• Nükleer manyetik rezonans (NMR)
• Elektron kristalografisi
Halka açık biyolojik makro-
moleküllerin veritabanındaw3
bulunan tüm proteinlerin %90’ından
fazlasının yapısı X-ışını kırınımı ile
belirlendiğinden, bu yöntem üzerinde özellikle duracağız.
Kristaller aşırı doygunlukta
olan sulu bir protein
solüsyonu içinde gelişirler.
Kristallendirme, iki fazda
devam eder: çekirdeklenme
ve büyüme.
Çekirdeklenmeden sonra,
düzenli büyük kristallerin
büyümesi için en uygun
koşuların olduğu
“metakararlı zon” olarak
bilinen noktaya ulaşmak
önemlidir. Aşırı doymuş
durumdaki protein
konsantrasyonunu iki
yarışmalı süreçle azaltır: (I)
kristalizasyon, (II) çöktürme.
II
32 Science in School Issue 11 : Spring 2009 www.scienceinschool.org
Öğrenme aktiviteleri
1.0l
rezervuar çözeltisi
1.0l
protein çözeltisi Şeffaf mühürleme bantı
Damla oturağı
0.5 ml rezervuar çözletisi
Buhar difüzyon yöntemi protein kristallerinin büyümesinde en sık kullanılan yöntemdir: a. Bir kristalizasyon
solüsyonunun küçük bir miktarı küçük bir rezervuar içine konur.
b. Protein solüsyonu ve kristalizasyon solüsyonunun bir damlası, haznede bulunan damlanın üzerine pipetlenir.
c. Kristalizasyon işlemlini başlatmak için hazne kapatılır (mühürlenir)
Kristallografinin tarihi hakkında daha fazla bilgi edinmek ve yapısı çözülene kadar bir laboratuvardan başka bir laboratuvara bir proteinin yolculuğunu öğrenmek için Dominique Cornuéjol’nun bu sayıdaki makalesine bakınız (Sayfa 70-76). Proteinlerin kristalleşmesi oldukça hünerli bir iştir, çünkü her yeni proteini kristalize edecek uygun koşulları belirlemek zor olup hatta bazen imkansızdır. Böylece tekrarlanabilir kristal kalitesini sağlamak için (yani, aynı derecede iyi kristallerin tekrar büyütülmesi) bilim adamları kontrollü deneyler kurarlar. Protein kristalografisi içinde en sık kullanılan yöntem buhar difüzyon yöntemidir (bkz. Şekil): bu yöntemde, bir kristalizasyon solüsyonunun küçük bir miktarı rezervuarın kristalizasyon haznesine eklenir.
Protein solüsyonu ve kristalizasyon solüsyonunun bir damlası bu haznenin merkezinde bulunan bir damlanın üzerine pipetlenir. Tüm solüsyonlar ekledikten sonra
buharlaşmayı önlemek için hazne
mühürlenir. Kristalizasyon
solüsyonunda tuz iyonlarının
konsantrasyonu haznenin merkezinde
bulunan damladakinden daha yüksek
olduğu için, gaz fazında buhar
difüzyonu ile çözücü (solvent)
moleküller protein damlasından
rezervuara doğru hareket ederler. Bu
işlem sırasında, damladaki proteinin
çözünürlüğü azalır. Sonunda aşırı
doymuş hale gelen protein solüsyonu
termodinamik olarak kararsız
durumdur. Bu durum, damladaki
proteinin bir kısmının sonuçta daha
büyük kristallerle büyümesini
sağlayan kristal çekirdeği
oluşturmasına (bkz. Resim) veya X
ışını analizinde kullanışsız amorf bir
proteini çökeltisine neden olur.
Kristalizasyon ve çöktürme birbiriyle
yarış halinde olan süreçlerdir. Bu
yüzden istenem kristalizasyonla
sonuçlanacak optimal koşulları tespit
etmek son derece önemlidir.
www.scienceinschool.org Science in School Issue 11 : Spring 2009 33
her
‘in iz
niyl
e S
tic
k
atric
P
ve
B
lattm
ann
B
eat
R
esim
,
3.0 ml, 3M NaCl stok solüsyonu (son kons. 0.9
M) 6.0 ml DI-su
5.0 ml, 3M NaCl stok solüsyonu (son kons. 1.5
M) 4.0 ml DI-su
Sınıfta lizozim kristalleri
Bu pratik etkinlikte öğrenciler bir protein için optimal kristalizasyon
koşullarını belirleyerek X ışını kristalografisi hakkında daha fazla
bilgi edinirler.Öğrenciler pH ve tuz konsantrasyonunun bir
fonksiyonu olarak lizozim kristallerinin oluşumunu araştırırlar.
Lizozim
Lizozim, bakteriyel hücre duvarına hasar veren anti-bakteriyel
enzimlerin ailesine ait bir proteindir. İnsanlarda gözyaşı, tükürük
ve mukus gibi bir dizi salgıda bol miktarda bulunmaktadır.
Lizozimin büyük bir miktarlarda tavuk yumurtası akında da
bulunabilir.
Malzeme ve materyal
Sınıf başına bir veya iki Cryschem™
kristalizasyon tabağı (Hampton Araştırma)
Kristal berraklığında sızdırmayan bant (5 cm)
(Hampton Araştırma)
1 ml ve 1 μl‟lik pipetler
Kristalleri gözlemlemek için bir mikroskop
20 °C‟de depolama kabini
Kimyasallar
Lizozim (Sigma-Aldrich Ürün # 62971, BioChemika derecesinde) – lizozimi farklı bir kaynaktan da kullanılabilir. Ancak, bu protokol için başarılı bir şekilde test edildiğiiçin yukarıdaki marka tavsiye edilir).
Sodyum klorür (NaCl) (süpermarketteki sofra tuzu da aynı işi görür)
Sitrik asit
Sodyum asetat
Sodyum fosfat, tek bazlı
Sodyum hidroksit çözeltisi
Glasiyel asetik asit
Deiyonize su (DI-su)
Stok çözeltiler
Aşağıdaki sulu stok solüsyonları öğretmen tarafından önceden
hazırlanmış olmalıdır:
Su içinde hazırlanmış 50 mg / ml lizozim stok solüsyonu
3 M sodyum klorür (100 ml DI-suda 17.53 g NaCl çözünür).
1 M sodyum sitrat, pH 3.5 (100 ml DI-suda 19.24 g sitrik asit
çözünür ve sodyum hidroksit çözeltisi ile pH 3.5‟e ayarlanır).
1 M sodyum asetat, pH 4.5 (100 ml DI-suda 13.6 g sodyum
asetat çözünür ve glasiyel asetik asit ile pH 4.5‟e ayarlanır)
1 M sodyum asetat, pH 5.5 (100 ml DI-suda 13.6 g sodyum
asetat çözünür ve glasiyel asetik asit ile pH 5.5‟e ayarlanır)
1 M sodyum fosfat, pH 6.5 (100 ml DI-suda 15.6 g sodyum
fosfat çözünür ve sodyum hidroksit çözeltisi ile pH 6.5‟e
ayarlanır).
1
2.0 ml, 3M NaCl stok solüsyonu (son kons. 0.6 M) 7.0 ml DI-su
2 3 4 5 6
4.0 ml, 3M NaCl stok solüsyonu (son kons.. 1.2 M) 5.0 ml DI-su
6.0 ml, 3M NaCl stok solüsyonu (son kons. 1.8 M)
3.0 ml DI-su
7.0 ml,3M NaCl stok solüsyonu (son kons. 2.1 M) 2.0 ml DI-su
1.0 ml sodyum sitrat
(son kons. 0.1 M), pH 3.5
pH 41.0 ml sodyum asetat
(son kons. 0.1 M), pH 4.5
1.0 ml sodyum asetat
(son kons. 0.1 M), pH 5.5
1.0 ml sodyum fosfat
(son kons. 0.1 M), pH 6.5
A A1 A2 A3 A4 A5 A6
B B1 B2 B3 B4 B5 B6
C
D
C1 C2 C3 C4 C5 C6
D1 D2 D3 D4 D5 D6
NaCl son konsantrasyonu 0.6 M‟dan 2.1 M‟a artar
Kristal büyütme deneyi için pipetleme şeması
34 Science in School Issue 11 : Spring 2009 www.scienceinschool.org
pH
artar 3.5‟ten 6.5‟e
AK
TİV
İTE
Sİ
SIN
IF
Öğrenme aktiviteleri
X ışını ile kristalleriniz ölçüldü mü? Sınıfınız protein kristallerini başarıyla büyüttü ise Dr Patrick Sticher
[email protected] adresinden sizinle iletişim kurmaktan memnun
olacaktır. İsviçre NCCR (Araştırmada Yeterlilik Ulusal Merkezi) Yapısal
Biologyw2 bu protokolü kullanarak protein kristallerini başarıyla büyüten ilk
10 okulun için bir X-ışını kırınımı görüntüsü üretmeyi teklif etmiştir. X-ışını
ölçümleri hem doğrudan okul örneklerinden veya postalama bir sorun ise
sınıfınız tarafından belirlenen optimize kristalizasyon şartları kullanılarak
büyütülen kristaller üzerinde yapılabilir. Bilim adamları da kırınım
görüntüleri ile birlikte, bu bilgilerin proteinin gerçek yapısını elde etmek için
gelecekte nasıl kullanılacağı konusunda bilgi verirler ve gerekirse bir
sertifika verirler.
Kristal büyütme deneyi
1. Kristalizasyon deneyleri için stok solüsyonlarından, tabloya
göre 24 rezervuar çözeltisi hazırla. Öğrenciler küçük gruplar
halinde ayrılabilir ve her bir grup bu 24 farklı çözeltinin birkaçını
hazırlar. Tüm gruplar aynı stok çözeltilerini kullanabilir.
2. Referans olarak tabloyu kullanarak, bir Cryschem ™ tabağının
24 rezervuarlık kuyusunun her birinin içine, ona karşılık gelen
rezervuar çözeltisinden 0.5 ml pipetlenir. Tablo, her bir şartı
özetler ve plaka üzerindeki kuyuların pozisyonunu gösterir.
3. Rezarvuar solüsyonundan 1 μl kristalizasyon kabında bulunan
her damlanın üzerine ilave ediniz (yukarıdaki şekilde „b‟).
4. Her rezervuar solüsyon damlasının 1 μl‟ sine lizozim stok
solüsyonundan 1 μl ekleyin (yukarıdaki şekilde 'b' için).
5. Protein solüsyon damlasını ekledikten sonra buharlaşmayı
önlemek için hemen şeffaf sızdırmaz bant ile kristalizasyon
damarını kapatın (yukarıdaki şekilde “c”).
6. Plakayı 20 ° C‟de sakla. Bazı kuyularda kristaller hemen
büyümeye başlar ve 1-2 saat aralıklarla büyüme doğrudan
mikroskop altında görülebilir. Plakalar son analiz için, sonraki
derste kadar saklanabilir. Yaklaşık 1-2 hafta sonra kristal, nihai
boyutuna büyümüş olacaktır. “A” işaretli plaka bir yıl kadar
hatta bazen daha uzun devam edecektir.
7. Lizozim kristallerinin sayısı, büyüklüğü ve dağılımı analiz edilir.
Kristaller, çıplak gözle görülemeyecek kadar cok küçük olabilir.
Bu nedenle iyi bir büyüteç yada mikroskop çok daha yararlı
olacaktır.
8. 24 rezervuar sonucunun karşılaştırılmasıyla kristalizasyon için
uygun koşullar belirlenir.
Bilim adamları ile sohbet edin Öğrenciler, kendi deneylerini yaptıktan sonra Skypew4 aracılığıyla bilim
adamları ile, çevrimiçi sohbet edebilirler. Randevu almak için, Patrick
Sticher ([email protected]) e-posta adresinden” proteincrystallography”
Skype hesabını kullanarak onunla sohbet edebilirsiniz.
www.scienceinschool.org Science in School Issue 11 : Spring 2009 35
Ek öğretim materyali indiriniz
Bir seri powerpoint sunum, resim ve daha fazla
deney çevirimiçiw5
mevcuttur.
Malzeme tedarikçileri
Aşağıdaki tedarikçilerw6
gerekli malzemeleri ve
kimyasalları sağlar:
Hampton Research: •
Cryschem ™ 24-1 SBS plaka, Cat.
No HR1-002 (Bu tür plaka
kullanmanızı öneririz. Bir plakanın
maliyeti yaklaşık olarak 3$
Amerikan doları).
Kristal Şeffaflıkta Sızdırmaz Bant (5
cm), Cat. No HR4-51
Gilson Inc:
1 ml ve 1 l manual pipetler
Sigma Aldrich:
Lizozim, Ürün #62971
Sodyum klorür, Ürün #71380
Sitrik asit, Ürün #27488
Sodyum asetat, Ürün #71190
Sodyum fosfat, monobazik,
Ürün #71502
Referanslar
Cornuéjols D (2009) Biological
crystals: at the interface between
physics, chemistry and biology.
Science in School 11: 70-76.
www.scienceinschool.org/2009/
issue11/crystallography
Web referansları
w1 - w1 – Kimya dalında 1962 Nobel ödüllü
sahipleri ve onların öncü çalışmaları hakkında
ek bilgi, Nobel Ödülü Komitesi web sitesinde
bulunabilir:
http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/la
ureates/1962/
w2 - İsviçre Araştırmada Mükemmeliyet
Ulusal Merkezi (NCCR) Yapısal Biyoloji, zar
proteinleri ve supra-moleküler komplekslerinin
yapı-işlev ilişkilerinin aydınlatılmasına
kendilerini adamış bilim adamlarının
oluşturduğu bir topluluktur:
www.structuralbiology.uzh.ch
Seçilmiş araştırma sonuçlarına buradan
ulaşabilirsiniz:
www.structuralbiology.uzh.ch/research004.asp
w3 - Biyolojik makromoleküllerin yapıları
(proteinler ve nükleik asitlerin) Protein Veri
Bankasında (PDB) mevcuttur. Web sitesi
ilginç öğretim kaynakları sunmaktadır:
www.pdb.org
Protein bilgileri için diğer değerli bir kaynak:
www.proteopedia.org
w4 - Skype yüklemek ve kaydetmek için, bkz.:
www.skype.com
w5 - Ek ders kaynaklarına şu adresten
ulaşabilirsiniz:
www.structuralbiology.uzh.ch/ teacher
Login: crystallization,
Password: xraybeam2008
Bu site düzenli olarak güncellenecektir.
w6 - malzeme tedarikçilerinin web siteleri
aşağıdaki gibidir:
Hampton Araştırma:
www.Hamptonresearch.com
Gilson Inc.: www.gilson.com
Sigma-Aldrich: www.sigmaaldrich.com
Bu makale, X-ışını kırınımı ile protein
kristalleri çalışma için iyi bir giriş
niteliğindedir. Bu anlamda, biyoloji,
fizik, kimya gibi - üç bilim için ilginç
bir egzersiz sunmakta ve üç bilim
arasındaki bağları göstermektedir.
Küçük şeylere nasıl bakıldığını ve
neden bu seviyedeki şeyleri
çalışmaya gerek duyulduğunu
tartışmaktadır. Makalede ayrıca
analitik bir araç olarak kırınım
kullanımının farkında olmayan
öğretmenler için iyi bir okuma zemini
sağlar.
Pratik deneyi kurmak ve
sonuçları elde etmek biraz zaman
alacak gibi görünüyor, fakat
sonuçların bir üniversitede
değerlendirilecek olması, diğer pratik
çalışmalarımıza farklı bir boyut
kazandırıyor.
Mark Robertson, UK
Kaynaklar
Abad-Zapatero C (2002) Crystals and
Life: A Personal Journey. La Jolla, CA,
USA: International University Line.
ISBN: 978-0972077408
Daha genç öğrencilere protein olmayan
kristalleri büyütmek için önerilen bazı
protokoller:
www.msm.cam.ac.uk/
phase-trans/2002/crystal/a.html
www.waynesthisandthat.com/
crystals.htm
http://chemistry.about.com/od/
growingcrystals/
Growing_Crystals.htm
Beat Blattmann NCCR Yapısal Biyoloji’de
yüksek verimlilik kristalizasyon tesisinden
sorumlu bir kimyagerdir. Bu sistem her gün
5000 kristalizasyon şartı için test imkânı sağlar.
Patrick Sticher mikrobiyoloji alanında doktora
yapmış olup NCCR’nin bilim yetkilisidir ve
eğitim, teknoloji transferi ve program
koordinasyonunundan sorumludur..
36 Science in School Issue 11 : Spring 2009 www.scienceinschool.org
GÖ
RÜ
Ş