bazı bitki örneklerinin antioksidan kapasitenin spektrofotometrik ve kromatografik tayini
TRANSCRIPT
İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
İSTANBUL
BAZI BİTKİ ÖRNEKLERİNDE ANTİOKSİDAN KAPASİTENİN SPEKTROFOTOMETRİK VE
KROMATOGRAFİK TAYİNİ
Leyla YILDIZ Kimya Anabilim Dalı
Analitik Kimya Programı
Danışman Yrd. Doç. Dr. Kevser SÖZGEN BAŞKAN
II. Danışman
Prof. Dr. Reşat APAK
Haziran, 2007
İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
İSTANBUL
BAZI BİTKİ ÖRNEKLERİNDE ANTİOKSİDAN KAPASİTENİN SPEKTROFOTOMETRİK VE
KROMATOGRAFİK TAYİNİ
Leyla YILDIZ Kimya Anabilim Dalı
Analitik Kimya Programı
Danışman Yrd. Doç. Dr. Kevser SÖZGEN BAŞKAN
II. Danışman
Prof. Dr. Reşat APAK
Haziran, 2007
Bu çalışma İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Yürütücü Sekreterliğinin T-919/06102006 numaralı projesi ile desteklenmiştir.
i
ÖNSÖZ
Yüksek lisans öğrenimim boyunca birikimlerini benimle paylaşan ve olumlu düşünceleriyle beni teşviklendiren tez danışmanım Yrd. Doç. Dr. Kevser Sözgen BAŞKAN’a, ulusal ve uluslararası kimya alanında önemli bir yere sahip olan değerli hocalarım, ikinci danışmanım Prof. Dr. Reşat APAK’a ve Prof. Dr. Esma TÜTEM’e, aynı süre boyunca desteklerini, yardımlarını esirgemeyen ve özellikle lisans öğrenim boyunca deneysel uygulamalarda önemli bir tecrübe kazandığım Doç. Dr. Erol ERÇAĞ ve Ar. Gör. Ayşem ARDA’ya, birlikte çok şey paylaştığımız değerli arkadaşım ve meslektaşım Şeyda KARAMAN’a ve daha ismini sayamadığım sevgili hocalarıma, arkadaşlarıma ve değerli aileme en içten dileklerimle teşekkür ederim. Tezimle aynı ismi taşıyan T-919/06102006 sayılı projeme maddi destek sağlayan İ.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Yürütücü Sekreterliği’ne teşekkür ederim. 105T402 nolu, ‘Antioksidanlar ve Polinitro-Aromatikler için Spektrofotometrik Yöntem Tasarımı’ isimli araştırma projesi ile, tezim sırasında bana burs sağlayan TÜBİTAK’a teşekkür ederim. Haziran, 2007 Leyla YILDIZ
ii
İÇİNDEKİLER
ÖNSÖZ .................................................................................................... i
İÇİNDEKİLER ...................................................................................... ii
ŞEKİL LİSTESİ ..................................................................................... vi
TABLO LİSTESİ ....................................................................................x
SEMBOL LİSTESİ .............................................................................. xii
ÖZET ................................................................................................... xiii
SUMMARY ............................................................................................xv
1. GİRİŞ ...................................................................................................1
2. GENEL KISIMLAR ............................................................................3
2.1. SERBEST RADİKALLER VE ANTİOKSİDANLAR ...................................3
2.2. DOĞAL ANTİOKSİDANLAR........................................................................5
2.2.1. C Vitamini..................................................................................................5
2.2.2. E Vitamini..................................................................................................6
2.2.3. Karotenoidler.............................................................................................7
2.2.4. Polifenolik Bileşikler..................................................................................9
2.2.4.1. Flavonoidler .........................................................................................9
2.2.4.2. Fenolik Asitler ....................................................................................17
2.2.4.3. Fenolik Polimerler (Tanenler) ............................................................19
2.3. ÇALIŞILAN BİTKİLERİN SAĞLIK ÜZERİNDEKİ ŞİFALI
ETKİLERİ VE ETKEN BİLEŞİKLERİ......................................................20
2.3.1. Civanperçemi ( Achillea millefolium ).....................................................20
2.3.2. Arslanpençesi ( Alchemilla xantochlora )................................................20
2.3.3. Dereotu ( Anethum graveolens ) ..............................................................21
2.3.4. Kereviz ( Apium graveolens )...................................................................21
2.3.5. Nane ( Mentha piperita ) ..........................................................................21
iii
2.3.6. Mercanköşk ( Origanum sp. ) ................................................................22
2.3.7. Maydanoz ( Petroselinum crispum ) ......................................................22
2.3.8. Adaçayı ( Salvia triloba )........................................................................23
2.3.9. Kekik ( Thymus sp. ) ..............................................................................23
2.3.10. Ihlamur ( Tilia sp. ) ................................................................................23
2.3.11. Isırgan ( Urtica sp. )...............................................................................23
2.4. TOPLAM ANTİOKSİDAN KAPASİTE TAYİN YÖNTEMLERİ..............26
2.4.1. CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity; Cu(II) İyonu
İndirgeme Antioksidan Kapasite) Yöntemi .........................................26
2.4.2. TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity; Troloks
Eşdeğeri Antioksidan Kapasitesi) / ABTS Yöntemi ............................26
2.4.3. FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power; Demir(III) İyonu
İndirgeyici Antioksidan Gücü) Yöntemi..............................................28
2.4.4. Folin Ciocalteu Yöntemi.......................................................................28
2.4.5. TRAP (Total Radical Trapping Parameter; Toplam Radikal
Tutma Parametresi) Yöntemi...............................................................29
2.4.6. Luminol Yöntemi..................................................................................29
2.4.7. Diklorofloresin-diasetat (DCFH-DA) Yöntemi....................................30
2.4.8. Fikoeritrin (PE) Esaslı Yöntemler .......................................................30
2.4.9. Krosin Yöntemi.....................................................................................31
2.4.10. DPPH Yöntemi .....................................................................................32
2.4.11. ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity; Oksijen Radikal
Absorbans Kapasitesi) Yöntemi...........................................................33
2.4.12. TOSC (Total Oxyradical Scavenging Capacity; Toplam
Oksiradikal Süpürme Kapasitesi) Yöntemi.........................................33
2.4.13. Siklik Voltametri Yöntemi ...................................................................33
2.5. BİTKİLERDE TOPLAM ANTİOKSİDAN KAPASİTE TAYİNİNDE
KULLANILMIŞ OLAN SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLER
VE HPLC UYGULAMALARI ....................................................................34
3. MALZEME VE YÖNTEM ...............................................................39
3.1. KULLANILAN CİHAZLAR.........................................................................39
3.2. KİMYASAL MADDELER ...........................................................................39
iv
3.2.1. Çözeltilerin Hazırlanması .......................................................................40
3.3. BİTKİ ÖRNEKLERİNİN ANALİZE HAZIRLANMASI............................40
3.3.1. Bitki Örneklerinin Kurutulması .............................................................40
3.3.2. Bitki Örneklerinin Ekstraksiyonu ..........................................................40
3.3.2.1. Kurutulmuş Bitki Örneklerinin Ekstraksiyonu .....................................40
3.3.2.2. Yaş Maydanozda C Vitamini Analizi İçin Ekstraksiyon .......................41
3.3.3. Bitki Örneklerinin İnfüzyonu (Demlenmesi)..........................................41
3.3.4. Bitki Örneklerinin Hidrolizi ...................................................................41
3.3.4.1. Bitki Ekstraktlarının Hidrolizi.............................................................41
3.3.4.2. Katı Bitki Örneklerinin Hidrolizi.........................................................42
3.3.4.3. Demlenmiş Bitkilerin Hidrolizi ...........................................................42
3.4. SENTETİK KARIŞIMLARIN HAZIRLANMASI.......................................42
3.4.1. Sentetik Karışım-1...................................................................................42
3.4.2. Sentetik Karışım-2...................................................................................43
3.5. UYGULANAN YÖNTEMLER .....................................................................43
3.5.1. Spektrofotometrik Yöntemler.................................................................43
3.5.1.1. CUPRAC Yöntemi ..............................................................................43
3.5.1.2. ABTS-Persülfat Yöntemi ....................................................................44
3.5.2. Kromatografik Analizler.........................................................................45
3.5.2.1. HPLC Analizi .....................................................................................45
4. BULGULAR ......................................................................................47
4.1. BAZI ANTİOKSİDANLARIN KALİBRASYON DOĞRULARI VE
Cu(I)-Nc KELATININ GÖRÜNÜR BÖLGE SPEKTRUMLARI ..............47
4.1.1. Mirisetin...................................................................................................48
4.1.2. İzokuersitrin ............................................................................................49
4.1.3. Luteolin....................................................................................................50
4.1.4. Kamferol ..................................................................................................51
4.1.5. Apigenin...................................................................................................52
4.1.6. Rozmarinik Asit.......................................................................................53
4.2. BAZI ANTİOKSİDANLARIN MOLAR ABSORPLAMA
KATSAYILARI VE TEAC DEĞERLERİ...................................................54
v
4.3. HPLC İLE ANTİOKSİDANLARIN KALİBRASYON
DOĞRULARININ OLUŞTURULMASI......................................................56
4.4. BİTKİ ANALİZLERİNİN SONUÇLARI .....................................................59
4.4.1. Maydanoz ( Petroselinum sativum ).........................................................59
4.4.2. Kereviz Yaprağı ( Apium graveolens ) ....................................................65
4.4.3. Nane ( Mentha piperita ) ..........................................................................69
4.4.4. Isırgan ( Urtica dioica ) ............................................................................72
4.4.5. Adaçayı ( Salvia triloba )..........................................................................73
4.4.6. Ihlamur ( Tilia rubra ) .............................................................................77
4.4.7. Arslanpençesi ( Alchemilla xantochlora )................................................78
4.4.8. Dereotu ( Anethum graveolens ) ..............................................................80
4.4.9. Civanperçemi ( Achillea millefolium ).....................................................82
4.4.10. Mercanköşk ( Origanum majorona ) .....................................................84
4.4.11. Kekik ( Thymus vulgaris )......................................................................86
4.5. SENTETİK KARIŞIMLARIN ANALİZ SONUÇLARI ..............................87
4.5.1. Sentetik Karışım-1...................................................................................87
4.5.2. Sentetik Karışım-2...................................................................................89
5. TARTIŞMA VE SONUÇ ..................................................................94
KAYNAKLAR .....................................................................................101
ÖZGEÇMİŞ .........................................................................................110
vi
ŞEKİL LİSTESİ
Şekil 2.1 : Reaktif oksijen türlerinin çeşitli doku, organlarda neden olduğu hastalıklar ve hasarlar.............................................................................5
Şekil 2.2 : Askorbik asitte meydana gelen redoks reaksiyonları...............................6 Şekil 2.3 : α-tokoferol’ün kimyasal yapısı ...............................................................7 Şekil 2.4 : β-karoten, likopen ve lutein’in kimyasal yapıları ....................................8 Şekil 2.5 : Flavonoidlerin genel yapısı ..................................................................10 Şekil 2.6 : Flavonol, flavon, flavanon, flavanol, izoflavon ve antosiyanidin’in
kimyasal yapıları..................................................................................11 Şekil 2.7 : Kuersetin, rutin, izokuersitrin, kamferol, mirisetin ve izoramnetin’in
kimyasal yapıları..................................................................................11 Şekil 2.8 : Apigenin, luteolin ve krisin’in kimyasal yapıları ..................................12 Şekil 2.9 : Kateşin, epikateşin, epigallokateşin, epikateşin gallat ve
epigallokateşin gallat’ın kimyasal yapıları............................................12 Şekil 2.10 : Naringin, naringenin, hesperidin, hesperetin ve eriodiktol’ün
kimyasal yapıları..................................................................................13 Şekil 2.11 : Daidzein ve genistein’in kimyasal yapıları ...........................................13 Şekil 2.12 : Siyanidin, malvidin, apigenidin ve delfinidin’in kimyasal yapıları........14 Şekil 2.13 : Hidroksi sinnamik asitlerin yapıları ve biyosentetik ilişkileri................18 Şekil 2.14 : Rozmarinik asit’in kimyasal yapısı.......................................................18 Şekil 2.15 : Gallik, protokateşik, vanilik asit’in kimyasal yapıları ...........................19 Şekil 2.16 : Fenolik polimerin kimyasal yapısı........................................................20 Şekil 2.17 : Kekik, ıhlamur, ısırgan ve nane bitkilerinin resimleri ...........................24 Şekil 2.18 : Civanperçemi, mercanköşk, dereotu ve adaçayı bitkilerinin
resimleri ..............................................................................................25 Şekil 2.19 : ABTS.+ radikal katyonunun yapısı........................................................27 Şekil 2.20 : ABTS.+ radikal katyonunun absorbsiyon spektrumu ............................27 Şekil 4.1 : Mirisetinin kalibrasyon doğrusu ...........................................................48 Şekil 4.2 : Mirisetinin CUPRACN spektrumu........................................................48 Şekil 4.3 : İzokuersitrinin kalibrasyon doğrusu......................................................49 Şekil 4.4 : İzokuersitrinin CUPRACN spektrumu ..................................................49 Şekil 4.5 : Luteolinin kalibrasyon doğrusu ............................................................50 Şekil 4.6 : Luteolinin CUPRACN spektrumu.........................................................50 Şekil 4.7 : Kamferolün kalibrasyon doğrusu..........................................................51 Şekil 4.8 : Kamferolün CUPRACN spektrumu .....................................................51 Şekil 4.9 : Apigeninin kalibrasyon doğrusu...........................................................52 Şekil 4.10 : Apigeninin CUPRACİ spektrumu.........................................................52 Şekil 4.11 : Rozmarinik asitin kalibrasyon doğrusu.................................................53 Şekil 4.12 : Rozmarinik asitin CUPRACN spektrumu..............................................53 Şekil 4.13 : Çeşitli standart antioksidanları içeren sentetik karışımın
kromatogramı.......................................................................................57 Şekil 4.14 : Rozmarinik asit standartının kromatogramı ..........................................57
vii
Şekil 4.15 : Mirisetin standartının kromatogramı ....................................................58 Şekil 4.16 : Askorbik asit standartının kromatogramı ..............................................58 Şekil 4.17 : Metanolün farklı oranları ve sadece bidistile su ile ekstrakte edilmiş
maydanoz örneklerinin spektrumu........................................................60 Şekil 4.18 : Etanolün farklı oranları ile ekstrakte edilmiş maydanoz örneklerinin
spektrumu ............................................................................................60 Şekil 4.19 : Asetonun farklı oranları ile ekstrakte edilmiş maydanoz
örneklerinin spektrumu ........................................................................60 Şekil 4.20 : %100 metanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı.................61 Şekil 4.21 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı..................61 Şekil 4.22 : % 50 metanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı..................61 Şekil 4.23 : % 100 bidistile su ile ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı .........62 Şekil 4.24 : % 100 etanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı...................62 Şekil 4.25 : % 70 etanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı.....................62 Şekil 4.26 : % 50 etanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı.....................63 Şekil 4.27 : % 70 metanollü maydanoz ekstraktının 2 ve 4 saat hidroliz sonucu
elde edilen hidrolizat kromatogramları .................................................63 Şekil 4.28 : Kurutulmuş maydanoz örneklerine uygulanan 2 ve 4 saat hidroliz
sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramları .....................................64 Şekil 4.29 : Yaş maydanozda askorbik asit analizi sonucu elde edilen
kromatogram........................................................................................64 Şekil 4.30 : Çeşitli çözücü ve oranları ile ekstrakte edilmiş kereviz yaprağı
örneklerinin spektrumu ........................................................................65 Şekil 4.31 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş kereviz yaprağı kromatogramı..........66 Şekil 4.32 : % 50 metanolle ekstrakte edilmiş kereviz yaprağı kromatogramı..........66 Şekil 4.33 : % 50 etanolle ekstrakte edilmiş kereviz yaprağı kromatogramı.............66 Şekil 4.34 : Kereviz yaprağı ekstrakt hidrolizatlarının ve kurutulmuş örnek
hidrolizatının spektrumu.......................................................................67 Şekil 4.35 : % 70 metanollü kereviz yaprağı ekstraktının 4 saat hidroliz sonucu
elde edilen hidrolizat kromatogramı .....................................................67 Şekil 4.36 : Kurutulmuş kereviz yaprağına doğrudan uygulanan 4 saat hidroliz
sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı .........................................68 Şekil 4.37 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş nane kromatogramı ..........................69 Şekil 4.38 : Kurutulmuş naneye doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen
hidrolizat kromatogramı .......................................................................69 Şekil 4.39 : Nane ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının
spektrumu............................................................................................70 Şekil 4.40 : Demlenerek hazırlanan nane çözeltisinin kromatogramı .......................70 Şekil 4.41 : Demlenerek hazırlanan nane çözeltisinin sadece asit ile hidrolizi
sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı .........................................71 Şekil 4.42 : Demlenerek hazırlanan nane çözeltisinin asit+metanol ile hidrolizi
sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı .........................................71 Şekil 4.43 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş ısırgan kromatogramı .......................72 Şekil 4.44 : Kurutulmuş ısırgana doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde
edilen hidrolizat kromatogramı.............................................................72 Şekil 4.45 : Isırgan ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının
spektrumu ............................................................................................73 Şekil 4.46 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş adaçayı kromatogramı......................74
viii
Şekil 4.47 : Kurutulmuş adaçayına doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı.............................................................74
Şekil 4.48 : Adaçayı ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu ............................................................................................75
Şekil 4.49 : Demlenerek hazırlanan adaçayı çözeltisinin kromatogramı...................75 Şekil 4.50 : Demlenerek hazırlanan adaçayı çözeltisinin sadece asit ile hidrolizi
sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı .........................................76 Şekil 4.51 : Demlenerek hazırlanan adaçayı çözeltisinin asit+metanol ile
hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı ...........................76 Şekil 4.52 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş ıhlamur kromatogramı .....................77 Şekil 4.53 : Kurutulmuş ıhlamura doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde
edilen hidrolizat kromatogramı.............................................................77 Şekil 4.54 : Ihlamur ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının
spektrumu ............................................................................................78 Şekil 4.55 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş arslanpençesi kromatogramı ............79 Şekil 4.56 : Kurutulmuş arslanpençesine doğrudan uygulanan hidroliz sonucu
elde edilen hidrolizat kromatogramı .....................................................79 Şekil 4.57 : Arslanpençesi ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki
hidrolizatının spektrumu.......................................................................80 Şekil 4.58 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş dereotu kromatogramı......................81 Şekil 4.59 : Kurutulmuş dereotuna doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde
edilen hidrolizat kromatogramı.............................................................81 Şekil 4.60 : Dereotu ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının
spektrumu ............................................................................................82 Şekil 4.61 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş civanperçemi kromatogramı.............82 Şekil 4.62 : Kurutulmuş civanperçemine doğrudan uygulanan hidroliz sonucu
elde edilen hidrolizat kromatogramı .....................................................83 Şekil 4.63 : Civanperçemi ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki
hidrolizatının spektrumu.......................................................................83 Şekil 4.64 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş mercanköşk kromatogramı...............84 Şekil 4.65 : Kurutulmuş mercanköşke doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde
edilen hidrolizat kromatogramı.............................................................85 Şekil 4.66 : Mercanköşk ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının
spektrumu ............................................................................................85 Şekil 4.67 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş kekik kromatogramı.........................86 Şekil 4.68 : Kurutulmuş kekiğe doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen
hidrolizat kromatogramı .......................................................................86 Şekil 4.69 : Kekik ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının
spektrumu............................................................................................87 Şekil 4.70 : Sentetik Karışım-1’in kromatogramı ....................................................88 Şekil 4.71 : Sentetik Karışım-1’in 2 saat hidrolizi sonucunda elde edilen
hidrolizat kromatogramı .......................................................................88 Şekil 4.72 : Sentetik Karışım-1’in 4 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat
kromatogramı.......................................................................................88 Şekil 4.73 : Sentetik Karışım-2’in kromatogramı ....................................................89 Şekil 4.74 : Sentetik Karışım-2’in 2 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat
kromatogramı.......................................................................................90 Şekil 4.75 : Sentetik Karışım-2’in 4 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat
kromatogramı.......................................................................................90
ix
Şekil 5.1 : Rozmarinik asit standartının 2 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı .......................................................................96
Şekil 5.2 : % 70 metanolde hazırlanan tannik asit çözeltisinin kromatogramı ........97 Şekil 5.3 : % 70 metanolde hazırlanan tannik asit çözeltisinin 2 saat hidrolizi
sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı .........................................98
x
TABLO LİSTESİ
Tablo 2.1 : Flavonoid sınıflarına ait bileşikler, sübstitüsyon konumları ve besin kaynakları ............................................................................................15
Tablo 4.1 : Mirisetin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri ..............................................................................................48
Tablo 4.2 : İzokuersitrin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri...............................................................................................49
Tablo 4.3 : Luteolin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri ..............................................................................................50
Tablo 4.4 : Kamferol için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri...............................................................................................51
Tablo 4.5 : Apigenin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri ..............................................................................................52
Tablo 4.6 : Rozmarinik asit için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri ...............................................................................................53
Tablo 4.7 : Çeşitli antioksidanların CUPRAC yöntemi ile elde edilen molar absorplama katsayıları ve doğrusal aralıkları ........................................54
Tablo 4.8 : Çeşitli antioksidanların ABTS yöntemi ile elde edilen molar absorplama katsayıları ve doğrusal aralıkları ........................................55
Tablo 4.9 : Çeşitli antioksidanların CUPRAC ve ABTS yöntemlerine göre elde edilen TEAC değerleri ..................................................................55
Tablo 4.10 : Çeşitli antioksidanların HPLC ile elde edilen doğru denklemleri ve alıkonma zamanları ..............................................................................56
Tablo 4.11 : Maydanoz örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................65
Tablo 4.12 : Kereviz yaprağı örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................68
Tablo 4.13 : Nane örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................71
Tablo 4.14 : Isırgan örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................73
Tablo 4.15 : Adaçayı örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................76
Tablo 4.16 : Ihlamur örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................78
Tablo 4.17 : Arslanpençesi örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................80
Tablo 4.18 : Dereotu örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................82
Tablo 4.19 : Civanperçemi örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................84
xi
Tablo 4.20 : Mercanköşk örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................85
Tablo 4.21 : Kekik örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................87
Tablo 4.22 : Sentetik karışım-1 ve hidrolizatlarının toplam antioksidan kapasite değerleri (mM TR-eşdeğeri) .................................................................89
Tablo 4.23 : Sentetik karışım-2 ve hidrolizatlarının toplam antioksidan kapasite değerleri (mM TR-eşdeğeri) .................................................................90
Tablo 4.24 : Bitki örneklerinin ve sentetik karışımların toplam antioksidan kapasitesinin HPLC yardımıyla belirlenebilen %’si ..............................91
xii
SEMBOL LİSTESİ
ROS : reaktif oksijen türleri CUPRAC : bakır(II) iyonu indirgeme antioksidan kapasitesi ABTS : 2,2’-azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonat) TEAC : troloks eşdeğeri antioksidan kapasite HPLC : yüksek performanslı sıvı kromatografisi Cu(II)-Nc : bakır(II)-neokuproin Cu(I)-Nc : bakır(I)-neokuproin ABTS.+ : ABTS radikal katyonu FRAP : demir(III) iyonu indirgeyici antioksidan gücü TPTZ : tripridiltriazin FCR : Folin Ciocalteu reaktifi TRAP : toplam radikal tutma parametresi AAPH : azobis (2-amido propan)dihidroklorür DCFH-DA : diklorofloresin-diasetat DCF : diklorofloresin PE : fikoeritrin DPPH : 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil ORAC : oksijen radikal absorbans kapasitesi AUC : eğri altında kalan alan KMBA : α-keto-γ metiolbutirik asit CUPRACN : normal CUPRAC yöntemi CUPRACi : inkübasyonlu CUPRAC yöntemi TR : troloks ε : molar absorplama katsayısı tR : alıkonma zamanı M : molar derişim v/v : hacim/hacim w/v : ağırlık/hacim eks. : ekstrakt hid. : hidrolizat met. : metanol eta. : etanol dem. : demleme çöz. : çözelti
xiii
ÖZET
BAZI BİTKİ ÖRNEKLERİNDE ANTİOKSİDAN KAPASİTENİN SPEKTROFOTOMETRİK VE KROMATOGRAFİK TAYİNİ Vücutta çeşitli metabolik reaksiyonlar sonucu oluşan ve bir veya daha fazla eşleşmemiş elektronu olması sebebiyle oldukça reaktif olan serbest radikallerin aşırı miktarları bir çok doku, organ ve sistemlerde hasarlara neden olmaktadır. Bu hasarı sınırlandırmak için vücutta birçok savunma mekanizması geliştirilmiştir ve genellikle besinlerle alınan C ve E vitaminleri, selenyum, β-karoten, likopen, lutein ve diğer karotenoidler de bu savunmaya yardımcı antioksidanlar olarak rol almaktadır. Bunlara ilave olarak flavonoidler gibi ikincil bitki metabolitleri ve terpenoidler de sayılabilir. Bu da antioksidan bileşikler içeren meyve ve sebzelerin yanı sıra geleneksel olarak tıbbi amaçla kullanılan ve antioksidan bileşikler bakımından zengin olan şifalı bitkilerin insan sağlığı açısından önemini ortaya koymaktadır. Son yıllarda, şifalı bitkiler ve bunlardan elde edilen aktif maddeler üzerindeki çalışmalar yoğunlaşmıştır. Bu çalışmada, insanlar tarafından yiyecek veya içecek olarak tüketildiği gibi çeşitli hastalıkların tedavisinde de kullanılan adaçayı, arslanpençesi, civanperçemi, dereotu, ıhlamur, ısırgan, kekik, kereviz yaprağı, maydanoz, mercanköşk ve nane bitkilerinde bulunan antioksidan özelliğe sahip olan temel bileşiklerin ve bunların neden olduğu toplam antioksidan kapasitenin belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışma üç aşamadan oluşmaktadır. Spektrofotometrik olarak toplam antioksidan kapasitenin belirlenmesinde Cu(II)-neocuproin (2,9-dimetil-1,10-fenantrolin) reaktifinin kullanıldığı, maliyeti düşük, uygulanması basit olan ve kısa sürede gerçekleştirilen genel adı ‘bakır(II) iyonu indirgeme antioksidan kapasite tayini’ kısaca CUPRAC yöntemi, karşılaştırma yöntemi olarak ise antioksidan kapasitenin belirlenmesinde yaygın kullanımı olan ABTS/persülfat yöntemi kullanılmıştır. Antioksidan kapasiteye neden olan temel türlerin belirlenmesi ise yine antioksidan özelliğe sahip pek çok bileşiğin tanınmasında kullanılan HPLC (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi) yönteminden yararlanılarak yapılmıştır. Bir bitki ekstraktında mevcut antioksidanların tümü belirlenirse, bunların derişimleri denel olarak saptanmış TEAC (troloks eşdeğeri antioksidan kapasite) katsayıları ile çarpılarak ve bu çarpımlar toplanarak ekstraktın kuramsal olarak beklenen toplam antioksidan kapasitesi hesaplanabilir. Eğer HPLC kromatogramından tüm antioksidanlar saptanmış ise bu yolla bulunan kapasite, denel olarak ölçülen antioksidan kapasite ile bağdaşmalıdır. Çalışılan bitki örneklerinin HPLC ile elde edilen kapasite değerleri; CUPRAC yöntemi ile belirlenen kapasite değerlerinin ısırgan ekstraktında % 82’lik; maydanozun farklı hidrolizatlarında % 60-77; nane ekstraktında % 63; mercanköşk ekstraktında % 61; kereviz yaprağının farklı hidrolizatlarında % 41-57’lik kısmına karşılık gelmektedir. Kromatogramlarda belirlenemeyen türlerin bu sonuca yol açtığı düşünülmektedir.
xiv
Çalışılan bitki örneklerinin ekstraktlarında CUPRAC yöntemi ile belirlenmiş olan toplam antioksidan kapasitesi sıralaması; arslanpençesi > kekik > ıhlamur > mercanköşk > adaçayı > nane > civanperçemi > kereviz yaprağı> dereotu > ısırgan > maydanoz şeklindedir.
xv
SUMMARY
SPECTROPHOTOMETRIC AND CHROMATOGRAPHIC DETERMINATION OF ANTIOXIDANT CAPACITY IN SOME PLANT SAMPLES Excessive amounts of free radicals that are produced from various metabolic reactions in the organism and are highly reactive due to their unpaired electrons cause significant damage in tissues, organs and physiological systems. The organism has developed a great many defence mechanisms for restricting this damage, and the food-ingested C and E vitamins, selenium, β-carotene, lycopene, lutein and other carotenoids act as antioxidants aiding this defence. Flavonoids as secondary plant metabolites and terpenoids may be considered as additional defense elements. This signifies the importance for human health of the antioxidant-rich fruits and vegetables as well as of traditionally used medicinal plants also bearing these antioxidants. In recent years, studies focusing on therapeutic plants and the active principles isolated from them have intensified. In this study, it has been aimed to identify the essential compounds having antioxidant properties contained in a number of food and medicinal plants such as sage, lady’s mantle, yarrow, dill, linden, nettle, thyme, celery leaves, parsley, oregano and mint, and to determine the total antioxidant capacity caused by these compounds. The study consists of three parts. For determining total antioxidant capacity, the cupric ion reducing antioxidant capacity assay (abbreviated as the CUPRAC method) that is low cost, easily applied, and rapid, utilizing the copper(II)-neocuproine (2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline) reagent was used, and the results were compared to those found by the ABTS/persulfate assay, the widely used method for antioxidant capacity measurement. For identification and individual quantitation of basic species giving rise to antioxidant capacity, the HPLC (High Performance Liquid Chromatography) method that has also found wide use in the identification of various antioxidant compounds was selected. If all the antioxidants in a plant extract are identified, then the theoretically expected total antioxidant capacity can be calculated by multiplying the concentration of each antioxidant with its TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity) coefficient and summing up the described products. In case when all the antioxidants were successfully identified, from the HPLC chromatogram, then the so calculated theoretically expected capacity should be in accord with the experimentally found antioxidant capacity. The theoretically calculated-with the aid of HPLC-capacity values of the tested plant samples compensated for the experimentally found CUPRAC capacities at the following percentages: nettle extract 82 %, different hydrolyzates of parsley 60-77 %, mint extract 63 %, oregano extract 61 %, and different hydrolyzates of celery leaves 41-
xvi
57 %. It was thought that unestimated species in the chromatograms were responsible for this case. The order of plant samples with respect to CUPRAC total antioxidant capacity was: lady’s mantle > thyme > linden > oregano > sage > mint > yarrow > celery leaves > dill nettle > parsley.
1
1. GİRİŞ
İnsan sağlığı açısından büyük risk oluşturan başta kanser olmak üzere kalp ve damar
hastalıkları gibi pek çok hastalığın ortaya çıkma riskini azaltan veya olumlu etkiler
gösteren antioksidanlar, günümüzde oldukça ilgi çeken ve üzerinde pek çok araştırmalar
yapılan bir konudur [1-3].
Vücutta çeşitli metabolik reaksiyonlar sonucu oluşan ve bir veya daha fazla eşleşmemiş
elektronu olması sebebiyle oldukça reaktif olan serbest radikallerin aşırı miktarları
(reaktif oksijen türleri üretiminin, tüketiminden fazla olması ‘oksidatif stres’ olarak
adlandırılır) bir çok doku, organ ve sistemlerde hasarlara neden olur [4-6]. ROS (Reaktif
Oksijen Türleri) düzeylerini ve bunların meydana getirdiği hasarı sınırlandırmak için
vücutta birçok savunma mekanizması geliştirilmiştir. Süperoksit dismutaz, katalaz ve
glutatyon peroksidaz gibi enzimlerin serbest radikallere karşı savunmada önemli rolleri
vardır. C vitamini, E vitamini, selenyum, β-karoten, likopen, lutein ve diğer
karotenoidler de yardımcı antioksidanlar olarak kullanılmaktadır. Bunların haricinde
flavonoidler gibi ikincil bitki metabolitleri ve terpenoidler de sayılabilir [7,8]. Bu da
antioksidan bileşikler içeren meyve ve sebzelerin yanı sıra geleneksel olarak tıbbi
amaçla kullanılan ve şifalı bitkiler olarak bilinen bitki türlerinin insan sağlığı açısından
önemini ortaya koymaktadır.
Bu bitkiler, günümüzde tıbbın tamamlayıcısı olarak ya da alternatif tıpta oldukça geniş
kullanım alanı bulmaktadır. En önemli üstünlükleri, ucuz olmaları, kolaylıkla elde
edilebilmeleri ve ham olarak ya da basit preparatları halinde kullanılabilmeleridir. Şifalı
bitkilerin değişik kısımları (kökleri, yaprakları, dalları/gövdeleri, kabukları, çiçekleri ve
meyveleri) genellikle fenolik bileşikler (flavonoidler, fenolik asitler, stilbenler,
tanninler, kumarinler, lignanlar ve ligninler) bakımından zengindir. Bunlar antioksidan
aktivite de dahil olmak üzere pek çok biyolojik etkiye sahiptir [9].
2
İnsan sağlığı açısından önemli olan bu antioksidan bileşiklerin biyolojik sıvı, gıda ve saf
bileşiklerde antioksidan kapasitelerini ölçmek amacıyla birçok yöntem geliştirilmiştir
[10-30]. Bu çalışmada ise daha önce biyolojik bakımdan önemli indirgenler [31], sistein
[32], E vitamini [33], C vitamini [34] ve proteinlerin [35] spektrofotometrik tayini için
kullanılan, bakır(II)-neokuproin (2,9-dimetil-1,10-fenantrolin) reaktifinin,
spektrofotometrik yolla bitki örneklerinin toplam antioksidan kapasitesinin
belirlenmesine uyarlandığı maliyeti düşük, uygulanması basit ve kısa sürede
gerçekleştirilen [36] ve bazı bitkisel çay ve kayısı örneklerinde [37,38] ve insan
serumunda [39] uygulanmış genel adı ‘bakır(II) iyonu indirgeme antioksidan kapasite
tayini’ kısaca CUPRAC yöntemi, karşılaştırma yöntemi olarak ise antioksidan
kapasitenin belirlenmesinde yaygın kullanımı olan ABTS/persülfat yöntemi [40]
kullanılmıştır.
HPLC ile çok sayıda antioksidan bileşenin mümkün olan en kısa sürede ayrılması ve
belirlenebilmesi için uygun sabit faz ve hareketli faz bileşimi öncelikle antioksidan
yapay örnekleri kullanılarak saptanmış ve her bir bileşen için ayrı kalibrasyon grafikleri
oluşturulduktan sonra bunlardan yararlanarak bitki örneklerindeki antioksidan
bileşiklerin kalitatif ve kantitatif değerlendirilmesi yapılmıştır.
Sonuç olarak HPLC yöntemi ile belirlenen antioksidan bileşenlerin derişimlerinin
troloks eşdeğeri antioksidan kapasite (TEAC) katsayıları (Bir antioksidanın TEAC
katsayısı, o antioksidanın 1 mM'lık çözeltisinin indirgeme gücü bakımından eşdeğer
olduğu troloks çözeltisinin mM derişimidir) ile çarpılması ile elde edilen toplam
antioksidan kapasite, CUPRAC ve ABTS/persülfat yöntemleri ile elde edilen toplam
antioksidan kapasite değerleri ile karşılaştırılmıştır.
3
2. GENEL KISIMLAR
2.1. SERBEST RADİKALLER VE ANTİOKSİDANLAR
Bir veya birden fazla eşleşmemiş elektronu bulunan atom ya da moleküllere serbest
radikaller denir. Bu tip maddeler, eşleşmemiş elektronu olması sebebiyle oldukça
reaktiftirler. Biyolojik sistemlerde serbest radikaller önemli role sahiptir. Serbest
radikaller herhangi bir etkileşime girerek elektron alırlar veya elektron verirler. Bu
nedenle, pozitif, negatif veya nötral olabilirler. Oksijen türevi serbest radikaller
proteinlere, yağlara, karbonhidratlara ve nükleik asitlere zarar verebilir. Plazma
membranları, serbest radikal reaksiyonlarının en önemli hedefidir.
Antioksidanlar ise radikal oluşumunun sınırlandırılması, radikal reaksiyonlarının sona
erdirilmesi, oluşan radikallerin etkisiz hale getirilmesi ve hasarlı moleküllerin ortadan
kaldırılmasından sorumlu moleküllerdir. Reaktif oksijen türlerinin üretimi ve çeşitli
antioksidan savunmaları arasındaki dengesizlik, antioksidanların yetersizliğinden
ve/veya reaktif oksijen türlerin artan oluşumundan çıkan oksidatif stresle sonuçlanır
[41].
Antioksidanlar, yiyecek veya vücutta düşük konsantrasyonlarda bulunduğu zaman,
oksidasyonu önemli derecede engelleyen veya geciktiren maddelerdir [42]. Gıda
üreticileri gıdaların bozunmasını önlemek ve gıdanın besin değerini korumak amacıyla
sentetik gıda koruyucu antioksidanları kullanırlar. Antioksidanlar, biokimyacıların ve
sağlık uzmanlarının ilgi konusudur, çünkü reaktif oksijen türlerinin ve dejeneratif
hastalıkların neden olduğu zararlara karşı vücudu korumaktadırlar.
Antioksidanların yağ moleküllerinin farklı oksidatif kademelerinde rol oynadığı
bilinmektedir. Antioksidanlar; oksijen derişimini azaltmada, singlet oksijeni
durdurmada, hidroksil radikali gibi başlatıcı radikalleri süpürerek birinci başlatıcı zinciri
engellemede, reaktif oksijen türlerinin üretim katalizleyicisi metal iyonlarını bağlamada,
4
radikal olmayan bileşiklerin temel ürünlerini bozundurmada ve substratlardan hidrojen
alınmasını önlemek amacıyla zincir kırmada görev alırlar.
Yağların yükseltgenme derecesi, yağ asidlerinin kimyasal yapısına bağlı olduğu kadar,
gıdaların saklanma koşulları ve reaksiyon ortamına da bağlıdır [43]. Besinlerde
otoksidasyon ve acılaşmanın oluşma prosesi; başlama, ilerleme ve sonlanma kademeleri
ile yürümektedir [44]. Başlama kademesinde radikal üretilir, ilerleme kademesinde
molekülden hidrojen atomu çıkışı ile radikal, doymamış yağ asidi ile reaksiyona girer.
Sonlanma reaksiyonuna kadar ilerleme kademesinde bir zincir reaksiyonu devam eder.
Başlama;
LH → L. (2.1)
İlerleme;
L. + O2 → LOO
. (2.2)
LOO. + LH → LOOH + L
. (2.3)
Sonlanma;
LOO. + LOO
. → Radikal olmayan ürünler (2.4)
LOO. + L
. → Radikal olmayan ürünler (2.5)
L. + L
. → Radikal olmayan ürünler (2.6)
Antioksidanlar (AH), yukarıdaki oluşumu aşağıda gösterilen reaksiyonlarla doymamış
yağlardan oluşan radikallere bir hidrojen atomu veya elektron vererek bozarlar.
LOO. + AH → LOOH + A
. (2.7)
5
A. + LOO
. → Radikal olmayan ürünler (2.8)
A. + A
. → Radikal olmayan ürünler (2.9)
Oksidan ve radikaller; triplet oksijen, su ve doymamış yağ moleküllerinden oluşan
oldukça reaktif türlerdir. Bundan dolayı, lipid peroksidasyonu sadece yenilebilen yağ ve
gıda endüstrisi için değil aynı zamanda insan sağlığı için de bir problemdir. Şekil 2.1’de
reaktif oksijen türlerinin çeşitli doku, organlarda neden olduğu hastalıklar ve hasarlar
görülmektedir [45].
Şekil 2.1: Reaktif oksijen türlerinin çeşitli doku, organlarda neden olduğu hastalıklar ve hasarlar
2.2. DOĞAL ANTİOKSİDANLAR
2.2.1. C Vitamini
C vitamini (askorbik asit, askorbat) bitkilerde yaygın olarak bulunan, suda çözünen bir
vitamindir. Altı karbonlu lakton yapısına sahiptir [45]. Çoğu hayvanın karaciğer veya
böbreklerinde glikozdan, bitkilerde ise yaprak kısımlarında özellikle kloroplastlarında
[46] sentezlenir. İnsanlar bu vitamini vücutta sentezleyemezler [47]. Bundan dolayı bu
ihtiyaçlarını taze sebze ve meyvelerden karşılarlar [48]. Özellikle çilek, papaya,
portakal, kivi, greyfurt, kavun, mango gibi meyvelerde, brokoli, brüksel lahanası,
kırmızı veya yeşil biber, domates, lahana, patates, karnıbahar gibi sebzelerde, portakal
suyu, domates suyu gibi meyve sularında bol miktarda bulunmaktadır [45].
Reaktif oksijen türleri
Atheroskleroz İskemik; beyin,kalp
Diabet
Kanser
Bulaşıcı: sıtma,AIDS
Yaşlanma
İltihap
Kireçlenme
Şok
Soğuk kızarması
Parkinson Radyasyon Hasarı
6
C vitamini, reaktif oksijen (süperoksit, peroksil radikalleri, singlet oksijen, ozon),
reaktif azot (peroksinitrit, azot dioksit) ve reaktif klor (hipoklorik asit) türlerini kolayca
süpürür ve bu suretle diğer substratları oksidatif hasardan korur [49].
Hem askorbik asit hem de bunun bir elektron yükseltgenmiş hali olan askorbil radikali
düşük redüksiyon potansiyeline sahiptir [50]. Böylece ilgili radikal ve oksidanlarla
reaksiyona girebilir. Askorbil radikali, eşleşmemiş elektronun rezonans kararlılığı
nedeniyle düşük redüksiyon potansiyeli gösterir ve kolayca askorbat ve dehidroaskorbik
asite dönüşür [51]. Bununla birlikte, askorbik asit, hem askorbil radikalinden hem de
dehidroaskorbik asitten enzimatik veya enzimatik olmayan yollarla kolaylıkla üretilir.
Bu özelliklerinden dolayı askorbik asit etkili bir antioksidandır [45].
Askorbat ( AH- ) Askorbil Radikali ( A.- )
Dihidroaskorbik Asit (DHA)
Şekil 2.2: Askorbik asitte meydana gelen redoks reaksiyonları
2.2.2. E Vitamini
E vitamini α-, β-, γ-, δ- tokoferolleri ve tokotrienolleri içeren grubu kapsamaktadır. α-
tokoferol, özellikle D-α-tokoferol, (Şekil 2.3) en yüksek biyolojik aktiviteye sahip
tokoferoldür [52,53]. E vitamini dokularda önemli zincir kırıcı bir antioksidandır ve
7
lipid peroksidasyonuna karşı savunma etkisinin olduğu, hücre membranlarını serbest
radikal saldırısına karşı koruduğu düşünülmektedir [54,55].
Yağca zengin bitkiler, E vitaminin temel doğal kaynaklarıdır. Tokotrienoller, palm
yağında ve pirinç kepeğinde yüksek miktarda, hindistan cevizi yağı, kakao yağı, soya
fasülyesi, arpa, buğday, kırmızı et ve yumurtada bulunmaktadır. Ayçiçeği, yer fıstığı,
ceviz, susam ve zeytin yağı ise sadece tokoferol içermektedir [56,57].
O
OH
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3CH3
CH3
Şekil 2.3: α-tokoferol’ün kimyasal yapısı
2.2.3. Karotenoidler
Doğal pigmentler olan karotenoidler bitkilerde ve çoğu mikroorganizmalarda
sentezlenir. Şimdiye kadar doğal kaynaklardan 600’ü aşkın karotenoid izole edilmiştir
[58]. Çoğu çiçek ve meyvelerin renkleri gibi birçok kuş, böcek ve deniz hayvanlarının
renklerinden de sorumludurlar. Karotenoidler, yağda çözünen poliizoprenoid
bileşiklerdir ve 2 ana gruba ayrılırlar.
(a): Karotenler veya sadece hidrojen ve karbon içeren hidrokarbon karotenoidler
(b): Hidroksi, keto, epoksi, metoksi veya karboksilik asit grubu gibi en az bir oksijen
grubu taşıyan oksijenlenmiş hidrokarbon türevleri olan ksantofiller [59].
Likopen, β-karoten ve α-karoten, karotenler olarak adlandırılan; β-kriptoksantin, lutein
ve zeaksantin, ksantofiller olarak adlandırılan karotenoid sınıfına örnek olarak
verilmektedir [45]. Yapılarındaki konjuge çift bağlar, kimyasal, biyokimyasal ve
fiziksel özelliklerini etkiler [59].
8
β-karoten
Likopen
Lutein
Şekil 2.4: β-karoten, likopen ve lutein’in kimyasal yapıları
Bu farklı yapı polien zinciri boyunca etkili bir elektron delokalizasyonuna yol açar.
Likopende açık zincir veya asiklik polien yapısı görülürken, β-karoten molekülün her
iki ucunda β-iyonon halkasına sahip disiklik yapı göstermektedir [45].
Hidroksil grubu taşıyan karotenoidler (ksantofiller) doğada genellikle glikozidleri veya
uzun zincirli yağ asidleri ile esterleşmiş haliyle bulunurlar ve daha hidrofobik özellik
gösterirler [60]. Yapılarındaki konjuge çift bağlar sebebiyle yüksek antioksidan aktivite
gösterirler. Bu yapısal özellikleri, bazı molekülleri süpürme veya etkisiz hale getirmeye
olanak sağlar. Sonuç olarak, karotenoidler singlet oksijen türlerini giderme ve doğrudan
serbest radikalleri süpürme etkisine sahiptirler [61,62]. Konjuge çifte bağ sistemine
sahip karotenoidlerin bazı koşullar altında pro-oksidan (lipid ve benzeri substratların
oksidasyonunu hızlandırıcı) aktivite de gösterdiği düşünülmektedir [63]. β-karoten
fizyolojik koşullarda, düşük oksijen kısmi basıncı altında serbest radikalleri süpürme
özelliği gösterirken, yüksek oksijen basıncında ve özellikle yüksek derişimlerde pro-
oksidan etki göstermektedir [45].
9
2.2.4. Polifenolik Bileşikler
Polifenoller, fitokimyasalların en geniş sınıflarından biri olup bitki aleminde geniş çapta
yer almaktadırlar [45]. Polifenoller güçlü antioksidanlardır ve aktiviteleri kimyasal
yapılarına bağlıdır [19,64,65]. Bitki polifenolleri çok fonksiyonlu olup hidrojen atomu
verici, singlet oksijeni süpürücü ve indirgeyici olarak davranır [45]. Bazı polifenoller ise
antioksidan özelliklerini metal iyonlarını kelatlama özelliklerine borçludurlar [66].
Bir polifenolun antioksidan olarak tanımlanabilmesi için iki temel özelliğin sağlanması
gerekmektedir [45]. Bunlar,
a) Okside olabilen substratlara oranla düşük konsantrasyonlarda bulunduklarında,
otooksidasyonu veya serbest radikal merkezli oksidasyonu erteleyebilmeli,
geciktirebilmeli veya önleyebilmelidir.
b) Süpürme sonunda oluşan radikal, oksidasyon zincir reaksiyonunu kesmekte
kararlı olmalıdır.
Polifenolik antioksidanlar (PPH), peroksil radikaline (ROO.) hızlı bir şekilde hidrojen
atomu vererek denklem 2.10’da görüldüğü gibi onları alkil hidroperoksit (ROOH)
yapısına dönüştürerek lipid peroksidasyonunu inhibe eder.
ROO . + PPH → ROOH + PP . (2.10)
Oluşan polifenol fenoksil radikali bir başka hidrojen atomu vererek ve kinonların
oluşumu ile kararlı hale gelmekte veya başka fenoksil radikali gibi bir radikal ile
reaksiyona girerek yeni bir zincir reaksiyonu başlanmadan kesilmektedir.
Besin fenolikleri; flavonoidler, fenolik asitler, fenolik polimerler (tanenler) olmak üzere
üç sınıfa ayrılır.
2.2.4.1. Flavonoidler
Bitki fenollerinin en geniş sınıfını difenilpropan (C6C3C6) iskeletine sahip flavonoidler
oluşturmaktadır. Şu ana kadar bitkilerin yaprak, tohum, kabuk ve çiçek kısımlarında
4000’in üzerinde farklı yapıda flavonoid belirlenmiştir. Molekül yapısı; aromatik A
halkası yanında bulunan heterosiklik C halkası ve bu halkaya bağlı ikinci aromatik B
10
halkasından oluşmaktadır. Bu halkalara bağlanan çeşitli fenolik hidroksil grupları, bu
yapıların antioksidan aktivite göstermelerini sağlar. Farklı türdeki bitkilerde veya aynı
bitkinin değişik kısımlarında bulunan flavonoidlerin büyük yapısal farklılıkları vardır
[45].
Çoğu flavonoid doğada D-glikoz, L-ramnoz, glukoramnoz, galaktoz, lignin ve arabinoz
gibi şekerli bileşikleri (glikozidleri) şeklinde bulunur [67]. Bağırsaklarda
hidrolizlenerek biyolojik bakımdan aktif aglikonlara dönüşürler [68]. İnsan ve
hayvanlarda mide-bağırsak sisteminden emilirler veya değişmeden ya da metabolitleri
halinde idrar ve dışkı ile atılırlar. Lipid peroksidasyonunu inhibe eden flavonoidler
etkili antioksidan, serbest radikal süpürücü, metal kelatlayıcıdır [69].
Şekil 2.5: Flavonoidlerin genel yapısı
Flavonoidler; antosiyaninler ve antoksantinler şeklinde sınıflandırılır. Antoksantinler ise
renksiz veya beyazdan sarıya dönük renkte olurlar ve flavonol, flavanol, flavon,
flavanon ve izoflavonlar olarak sınıflandırılırlar. Antosiyaninler, antosiyanidinlerin
glikozidleri olup çiçeklere ve meyvelere kırmızı, mavi ve mor renkleri veren, suda
çözülebilen en önemli bitki pigment sınıfıdır [45]. Flavanonlar ve flavonlar çoğunlukla
birlikte bulunur ve belirli enzimlerle bağlıdırlar. Çoğu bitki familyasında, flavonlar ve
flavonoller arasında karşılıklı bir dışlama vardır ve flavanonca zengin bitkilerde
antosiyaninler neredeyse hiç yoktur [70].
11
Flavonol Flavon Flavanon
Flavanol İzoflavon Antosiyanidin
Şekil 2.6 : Flavonol, flavon, flavanon, flavanol, izoflavon ve antosiyanidin’in kimyasal yapıları
Flavonoidlerin en yaygın sınıfı flavonollerdir ve en önemli bileşikleri kuersetin,
kuersetin glikoziti rutin, kamferol, mirisetin, izoramnetindir. Kuersetin bitkilerin en
temel flavonollerindendir ve soğan, elma, lahana ve çayda yüksek miktarda
bulunmaktadır.
Kuersetin Rutin İzokuersitrin
Kamferol Mirisetin İzoramnetin
Şekil 2.7: Kuersetin, rutin, izokuersitrin, kamferol, mirisetin ve izoramnetin’in kimyasal yapıları
12
Flavon sınıfına ait temel bileşikler apigenin, luteolin ve krisindir. Maydanoz, kereviz ve
zeytinde bol miktarda bulunmaktadırlar.
Apigenin Luteolin Krisin
Şekil 2.8: Apigenin, luteolin ve krisin’in kimyasal yapıları
Flavanoller ise flavonların indirgenmiş türevleridir. En önemlileri kateşin ve epikateşin’
dir. Kateşin ve epikateşinin gallik asitle kombinasyonları sonucu kateşin ve epikateşin
gallatlar meydana gelir. Bu bileşikler çoğunlukla yeşil çay, kırmızı şarap, şeftalide fazla
miktarda, ayrıca beyaz şarap ve elmada bulunurlar.
Kateşin Epikateşin Epigallokateşin
Epikateşin gallat Epigallokateşin gallat
Şekil 2.9: Kateşin, epikateşin, epigallokateşin, epikateşin gallat ve epigallokateşin gallat’ın kimyasal yapıları
13
Flavonların dihidro türevleri ise flavanonlardır. En önemlileri eriodiktol, naringenin,
naringin, hesperidin ve hesperetin’dir. Naringin naringenin’in, hesperidin hesperetin’in
glikozitidir. Greyfurt ve portakalda bol miktarda bulunurlar.
Naringin Naringenin Eriodiktol
Hesperidin Hesperetin
Şekil 2.10: Naringin, naringenin, hesperidin, hesperetin ve eriodiktol’ün kimyasal yapıları
Flavonların izomeri olan izoflavonların en bilinen bileşikleri genistein ve daidzein olup
baklagil ve soya fasülyesinde fazla miktarda bulunmaktadırlar.
Daidzein Genistein
Şekil 2.11: Daidzein ve genistein’in kimyasal yapıları
Antosiyaninler, antosiyanidinlerin glikozidleri olup çiçeklere ve meyvelere kırmızı,
mavi ve mor renkleri veren, suda çözülebilen en önemli bitki pigment sınıfıdır. En
önemlileri; apigenidin, siyanidin, malvidin ve delfinidin’dir.
14
Siyanidin Malvidin
Apigenidin Delfinidin
Şekil 2.12: Siyanidin, malvidin, apigenidin ve delfinidin’in kimyasal yapıları
Flavonoid sınıfına ait bileşiklerin sübstitüsyon konumları ve yaygın olarak bulundukları
besin kaynakları Tablo 2.1’de [71] özetlenmiştir.
15
Tablo 2.1: Flavonoid sınıflarına ait bileşikler, sübstitüsyon konumları ve besin kaynakları
Aşağıdaki özelliklerden bir ya da daha fazlasına sahip yapıda olan flavonoidler oldukça
yüksek antioksidan etki gösterirler [19].
a) Radikal formun daha yüksek kararlılığını sağlayan ve elektron
delokalizasyonuna katılan, B halkasındaki o-dihidroksi yapısı (aynı zamanda bu
yapıdan kararlı 3’,4’-dikinonlar oluşur)
b) 2. ve 3. karbon atomları arasındaki çifte bağ, C halkasının 4. karbon atomunda
keto grubunun oluşmasını sağlar ve bu da B halkasında radikalin elektron
delokalizasyonunu artırır. Antioksidan güç, aromatik çekirdeğin elektron
delokalizasyonuna bağlıdır. Bu bileşikler serbest radikallerle reaksiyona
SINIFI ADI SÜBSTİTÜSYON
KONUMLARI BESİN KAYNAKLARI
Flavanol
(+)-Kateşin (-)-Epikateşin Epigallokateşin gallat
3,5,7,3’,4’-OH 3,5,7,3’,4’-OH 3,5,7,3’,4’,5’-OH,3-gallat
Çay Çay Çay
Flavon Krisin Apigenin Luteolin
5,7-OH 5,7,4’-OH 5,7,3’,4’-OH
Meyve kabuğu Maydonoz, kereviz Kırmızı biber
Flavonol
Kamferol Kuersetin Mirisetin Rutin
3,5,7,4’-OH 3,5,7,3’,4’-OH 3,5,7,3’,4’,5’-OH 5,7,3’,4’-OH, 3-rutinoz
Pırasa, brokoli, hindiba, greyfurt, siyah çay Soğan, marul,brokoli, , çay, k.şarap, mor meyveler, zeytinyağı, elma kabuğu Yabanmersini,üzüm,k. şarap K.şarap, kara buğday, domates kabuğu, turunçgiller
Flavanon
Naringin Naringenin Taksifolin Hesperidin Eriodiktol
5,4’-OH, 7-ramnoglukoz 5,7,4’-OH 3,5,7,3’,4’-OH 3,5,3’-OH,4’-OMe,7-rutinoz 5,7,3’,4’-OH
Turunçgiller, greyfurt Turunçgiller Turunçgiller Portakal Limon
İzoflavon
Genistin Genistein Daidzin Daidzein
5,4’-OH,7-glukoz 5,7,4’-OH 4’-OH, 7-glukoz 7,4’-OH
Soya fasulyesi Soya fasulyesi Soya fasulyesi Soya fasulyesi
Antosiyanidin
Apigenidin Siyanidin
5,7,4’-OH 3,5,7,4’-OH,3,5-OMe
Renkli meyveler Kiraz, ahududu, çilek
16
girdiğinde üretilen fenoksil radikalleri aromatik çekirdeğin rezonans etkisiyle
kararlı hale getirilir. 2,3-çifte bağı, tüm moleküldeki rezonansı arttırır.
c) C halkasının 4. karbon atomunda keto grubu ile beraber C ve A halkalarındaki 3.
ve 5. pozisyondaki hidroksil grupları maksimum radikal-süpürme potansiyeli
için gereklidir. Aynı zamanda 5-hidroksi-4-keto grubu güçlü bir metal
kelatlayıcı olarak da antioksidan etkinliğe katkıda bulunur.
Lipid peroksidasyonu inhibisyonunda flavonoidlerin yapı-aktivite ilişkisi incelendiğinde
[69];
a) C halkasındaki 3. karbon atomu üzerinde hidroksil grubunun varlığı;
Bu yapıya sahip fisetin, (+)-kateşin (Şekil 2.9), kuersetin, mirisetin (Şekil 2.7) ve
morin lipid peroksidasyonunu, C-3. karbon atomu üzerinde hidroksil grubu
taşımayan diosmetin, apigenin (Şekil 2.8), hesperetin ve naringenine (Şekil 2.10)
göre daha kuvvetli inhibe eder.
b) C halkasındaki 2. ve 3. karbon atomları arasındaki çifte bağın varlığı;
Bu bağın hidrojenlenmesi antiperoksidatif etkiyi azaltır.
c) Hidroksil gruplarının sayısı;
A ve B halkalarında polihidroksillenmiş yapıların önemi, kuersetin, mirisetin,
mirisetrin, filoretin, (+)-kateşin, morin ve fisetinin, apigenin, hesperetin,
hesperidin, naringenin, naringin, krisin ve 3-hidroksiflavona göre
karşılaştırılmasıyla belirlenmeye çalışılmıştır. İlk gruptakiler 4-6 arasında, ikinci
gruptakiler 1-3 arasında hidroksil taşıyan flavonoidlerdir. Flavonoidlerin
hidroksil radikali süpürme aktivitesi, B halkasındaki hidroksil grupları sayısıyla
(özellikle C-3’ konumunda) artar ve hidroksil grupları sayısının azalmasıyla hızlı
bir şekilde azalır. Mirisetinin (Şekil 2.7) (Hidroksil konumları: 3,5,7,3’,4’,5’)
hidroksil radikali süpürme aktivitesi kamferolden (Hidroksil konumları: 3,5,7,4’)
daha kuvvetlidir.
d) Hidroksil konumları;
A halkasındaki C-5 ve C-7, B halkasındaki C-3’ ve C-4’ ve C halkasındaki C-3
konumundaki hidroksil gruplarının varlığı lipid peroksidasyonun inhibisyonuna
katkıda bulunur. Flavonoller, antiperoksidatif aktivite için C-2’ konumunda bir
hidroksil grubu ve pirogallol grubuna (C-3’, C-4’, C-5’) gereksinim duyarlar.
17
e) Şeker yapısının varlığı;
Genelde flavonoid glikozidler, tekabül eden aglikon türlerinden daha az
antioksidan aktiftir. Malondialdehit üretiminin inhibisyonunda apigenin,
naringenin, hesperetin, diosmetin, kuersetin, filoretin ve mirisetin karşılık gelen
glikozidlerine göre daha etkilidir. Şeker yapısı, sterik engellemeden ötürü çok
bitişik konumda bulunan hidroksil gruplarının antiperoksidasyon verimini
azaltır.
f) Metoksi gruplarının varlığı;
Sterik engellemeden dolayı flavonoidlerin antiperoksidatif verimini azaltır.
Ancak aynı sayıda hidroksil grubu içeren flavonoidlerde –OH’e göre orto- ve
para- konumundaki –OMe grupları, elektron desteğiyle aril oksi radikallerini
stabilize edeceğinden sonuçta antioksidan aktiviteyi arttırırlar.
g) Rutin ve kuersetin gibi (Şekil 2.7) C-4 konumunda karbonil grubu ve C-3 veya
C-5 konumunda hidroksil grubu taşıyan flavonoidler, demir iyonlarıyla kelat
oluşturur. Flavanoidler demir iyonlarıyla kompleks oluşturduktan sonra da
serbest radikal süpürme aktivitelerini yitirmezler.
2.2.4.2. Fenolik Asitler
Fenolik asitler hidroksi benzoik asit ve hidroksi sinnamik asit olarak adlandırılan farklı
iki sınıftan oluşmaktadır [45]. Fenolik asitlerin ve esterlerinin antioksidan aktiviteleri,
sterik engelleme ile güçlenen moleküldeki hidroksil gruplarının sayısına bağlıdır [72].
Benzoik asidlerde karboksilat grubunun elektron-çekme özelliği, hidroksi benzoatların
hidrojen atomu verme yeteneklerine negatif etki yapar. Hidroksi sinnamik asitler
eşdeğer benzoatlarından daha etkilidirler [19].
Hidroksi sinnamik asitler, (fenilpropanoidler), bitkilerin fenolik metabolizmasında
temel rol oynayan ve fenil alaninden biyosentetik olarak türeyen fenolik bileşiklerdir
[73,74]. Bitkilerin hücre duvarı yapısına katılırlar ve flavonoidlerin biyosentetik
öncüsüdürler [74]. Genellikle bu tür fenolik asitler, bitkilerde şeker, organik asit veya
yağlarla birleşmiş veya esterleri halinde bulunurlar ve aralarında etkili bir dönüşüm
görülmektedir [75] (Şekil 2.13). Meyve, sebze, çiçek, tohum ve şarap, çay, kahve,
zeytin yağı gibi bitki türevli ürünlerde bulunmaktadırlar [44,76]. Kafeik asit, onun
kuinik ester türevi klorojenik asit, p-kumarik asit bitkilerde en fazla bulunan hidroksi
sinnamik asitlerdir. Klorojenik asidin, kafeik asidin depolanmış türü olduğu
18
düşünülmektedir, çünkü klorojenik asidin biyosentezi sırasında kuinik asit çiftinin
kafeik kısma olan dönüşümü tersinirdir [77,78]. İki aromatik halkada ikişer tane
hidroksil grubu taşıyan, rozmarinik asit ise kafeik asit ve 3,4-dihidroksifenillaktik asitin
esteridir. Hidroksi sinnamik asidler, doğada trans- konumunda olduklarında daha
kararlıdırlar ama ultraviyole ve görünür ışığa maruz kaldıklarında, yavaş yavaş cis-
konumuna izomerize olurlar [79].
Tirozin
Klorojenik Asit
Şekil 2.13: Hidroksi sinnamik asitlerin yapıları ve biyosentetik ilişkileri
Şekil 2.14: Rozmarinik asit’in kimyasal yapısı
Fenil Alanin Sinnamik Asit p-kumarik Asit Kafeik Asit Ferulik Asit Sinapik Asit
19
Hidroksi Benzoik Asitler, monohidroksi benzoik asidler, orto ve para konumlarında
antioksidan aktivite göstermezken, m-hidroksi asit TEAC katsayısı = 0.84 mM aktivite
gösterir. Fenolik halka ile karboksilat grubu arasına metilen grubu girmesiyle oluşan
fenil asetik asitlerde orto ve meta hidroksi türevleri TEAC katsayısı = 1 mM’a yakın
antioksidan aktivite gösterirken, p-hidroksi fenil asetik asidin aktivitesinde küçük bir
artış olur. Dihidroksi benzoik asit türevlerinin antioksidan aktiviteleri hidroksil
gruplarının pozisyonlarına bağlı olup, o- ve m- pozisyonlarında aktivite yüksek olurken
(2,3-dihidroksi benzoik asit gibi), m-p pozisyonlarına sahip olanlarda (3,4-dihidroksi
benzoik asit-protokateşik asit gibi) aktivite düşer. Gallik asit, üç hidroksil grubuna sahip
olmasından dolayı en fazla aktivite gösteren hidroksi benzoik asittir. Ancak karboksilat
grubu esterlendiğinde aktivite düşer [19].
Gallik Asit Protokateşik Asit Vanilik Asit
Şekil 2.15: Gallik, protokateşik, vanilik asit’in kimyasal yapıları
2.2.4.3. Fenolik Polimerler (Tanenler)
Polimerik yapıdaki yüksek molekül tartısına sahip tanenler kondanse ve
hidrolizlenebilir olmak üzere iki alt sınıfa ayrılır [80]. Kondanse tanenler polimerik
flavonoidlerdir [81]. Hidrolizlenebilir tanenler, gallik asit ve benzer bileşiklerin
karbonhidratlara esterlenmiş yapılarıdır [80]. Bu bileşikler çay, kırmızı şarap, meyve,
baklagil ve tahıllarda bol miktarda bulunmaktadırlar [45].
20
Şekil 2.16: Fenolik polimerin kimyasal yapısı
2.3. ÇALIŞILAN BİTKİLERİN SAĞLIK ÜZERİNDEKİ ŞİFALI ETKİLERİ VE
ETKEN BİLEŞİKLERİ
2.3.1. Civanperçemi ( Achillea millefolium )
Antienflamatuar1, antispazmodik2, etkilidir. Damar hastalıkları, safra ve idrar söktürücü,
hemoroid, safra salgısı yetersizliği ve romatizmada etkilidir. Özellikle sikatrizan3 olarak
kullanılır. Etken bileşikleri; azulen taşıyan uçucu yağ, flavonlar (apigenin ve luteolin
türevleri), seskiterpen laktonlardır.
2.3.2. Arslanpençesi ( Alchemilla xantochlora )
Tanenlerden dolayı astrenjandır4. Kanama ve ishale karşı yara iyileştirici etkisi
bulunmaktadır. Bazı bitkisel ilaçların bileşimine girerek kadın hastalıklarında
kanamalara ve alt batının zayıflığına karşı, ayrıca böbrek ve idrar yollarındaki taş
düşürücü olarak kullanılır. Etken bileşikleri; tanen (% 6-8 gallotanenler) ve flavonoidler
(kuersetin-3-O-β-D-glukuronit)’dir.
1 İltihap giderici madde 2 Spazmları dindirmek için kullanılan madde 3 Yaraların iyileşmesini kolaylaştıran madde 4 Kan durdurucu
21
2.3.3. Dereotu ( Anethum graveolens )
Aromatik, antispazmodik, galaktagog5 ve bakteriostatik6 etkilidir. Koliklerde7 (özellikle
bebeklerde), öksürük, soğuk algınlığı ve gripte yararlıdır. Antispazmodiklerle (örneğin
Viburnum opulus- gilaburu) kullanılırsa ağrı dindirir. Emziren annelerde sütü arttırır.
İştahsızlıklarda, ağız yaralarında ve mide bulantılarında kullanılır. Etken bileşikleri;
meyvalarda %5 uçucu yağ (% 43-63 karvon ayrıca limonen), sabit yağ, flavonoid,
kumarin, ksanton, tanen, reçine, triterpen ve glikanlardır.
2.3.4. Kereviz ( Apium graveolens )
İdrar yolları temizleyicisi, kan sulandırıcı, romatizmal hastalıklar, zayıflama kürleri
sonunda oluşan sinirlilik hallerinde rahatlatıcı etki gösterir. İdrar söktürücü, adet
düzenleyici, salgı organları düzenleyicisi, zayıflama kürlerinde sinirsel bozukluğu
giderici olarak, ayrıca iştahsızlık ve bitkinliklerde kullanılır. Etken bileşikleri; meyvalar
% 2-3 uçucu yağ, selerin, furanokumarin, furanokumarin glikozit, apigravin, selereoin,
apiumosit gibi kumarin bileşikleri, luteolin-7-O-apiosilglikozit ile krisoeriyol, apigenin
ve izokuersitrin gibi flavonlar taşımaktadır. Uçucu yağ başlıca %6 limonen, %10
selinen ve p-simen, β-terpineol, α-santalol, dihidrokarvon içermektedir. Kökler, % 0.3-
0.7 arasında uçucu yağ (p-apiol, miristisin, limonen, terpinolen vb.), % 1.6 kadar flavon
(başlıca apiin) ve furanokumarinler (bergapten, imperatorin vb.), ligustilid ve butiftalid
benzeri ftalitler ile poliasetilen türevi falkarinonol, falkarinol adlı bileşikleri
taşımaktadır.
2.3.5. Nane ( Mentha piperita )
Yapraklar taşıdığı uçucu yağdaki mentolden dolayı antibakteriyel, spazmolitik,
kolagog8 etkilidir. Antispazmodik etki özellikle mide-bağırsak sistemi üzerinde
belirgindir. Mide bulantısına karşı ve diğer mide şikayetleri, akut ve kronik gastrit9 ve
enteritte10 etkilidir. Uçucu yağ mide-bağırsak kaslarına spazmolitik etkilidir. Bronşları
yumuşatıcı etki de göstermektedir. Cilde ve mukozaya sürüldüğünde serinlik-ferahlık
5 Süt salgılanmasına yardımcı madde 6 Bakterileri öldürmeden çoğalmasını engelleyen madde 7 Bir kasılmadan dolayı ileri gelen her çeşit karın ağrısı 8 Safra kesesinde ve safra yollarında bulunan safranın onikiparmak bağırsağına akmasını kolaylaştıran madde 9 Mide mukozasının iltihaplanması 10 Bağırsak mukozasının iltihaplanması
22
hissi uyandırır. Dahilen mide spazmlarında, mide bulantısını engelleme, ayrıca soğuk
algınlığında üst solunum yolları antiseptiği11 olarak kullanılır. Etken bileşikleri;
yapraklar % 0.8-4 oranında uçucu yağ ile flavonlar, rozmarinik asit, kafeik ve
klorojenik asit ve triterpenik maddeler taşımaktadır. Uçucu yağ: % 45-50 mentol, % 5-
20 mentol esterleri (mentil asetat ve mentil izovalerat) ile daha az miktarlarda menton,
mentofuran ökaliptol, (-) limonen ve (-) β-karyofillen içermektedir.
2.3.6. Mercanköşk ( Origanum sp. )
Uçucu yağların bileşimindeki fenolik maddeler timol ve izomeri karvakrolün salgı
arttırıcı, bronş spazmını çözücü ve antimikrobiyal etkileri nedeniyle, soğuk algınlığı
öksürüklerinin tedavisinde kullanılır. Düz kaslar üzerine gevşetici etkileri vardır. Uçucu
yağlar cilde sürüldüğünde kızartıcı, yakıcı etki göstermektedir. Soğukalgınlığı
şikayetlerinde, iştahsızlık, hazımsızlık hallerinde kullanılmaktadır. Halk arasında şeker
hastalığına karşı da kullanılmaktaysa da bu etkisi henüz araştırma aşamasındadır. Etken
bileşikleri; türlere ve toplanma yerlerine göre miktarları değişen uçucu yağ, flavonlar,
başta ursolik asit ve oleanolik asit olmak üzere triterpenik maddeler ve Labiatae
tanenleri taşırlar.
2.3.7. Maydanoz ( Petroselinum crispum )
Kuvvetli idrar söktürücüdür, tahriş edici etkisi de vardır. Apiol ve miristisinden dolayı
spazmolitik ve rahim düzenleyicidir. İdrar yolları antiseptiği, ayrıca halk arasında adet
bozukluklarında, safra söktürücü olarak ve haricen saç diplerine de kullanılmaktadır.
Etken bileşikleri; tohumlar % 1-6 uçucu yağ taşır, uçucu yağın başlıca maddeleri fenil
propan türevi olan p-apiol, miristisin ve 1-allil 2,3,4,5-tetrametoksibenzol, ayrıca α- ve
β-pinen, limonen, β-felladrendir. Tohumlar % 25 kadar sabit yağ, flavonlar (apiin ve
benzeri) ve bazı furanokumarinler de içermektedir. Kökler, % 0.3-0.7 arasında uçucu
yağ (p-apiol, miristisin, limonen, terpinolen vb.), flavonlar (başlıca apigenin) ve
furanokumarinler (bergapten, imperatorin vb.), ligustilid ve butilftalid benzeri ftalitler
ile poliasetilen türevi falkarinonol, falkarinol adlı bileşikleri taşımaktadır.
11 Vücut içinde yada dışında, özellikle sindirim borusunda bulunan mikropları yok edebilen ya da onlara karşı koruyan madde
23
2.3.8. Adaçayı ( Salvia triloba )
Ağız ve boğaz mukazasında antiflojistik12 etkilidir, gargara olarak kullanılır. Soğuk
algınlığı ve mide bulantısı şikayetlerinde etkilidir. Etken bileşikleri; yapraklar % 2-3
uçucu yağ, % 5 rozmarinik asit, tanen bileşikleri, flavonlar (salvigenin, luteolin,
hispiludin) ile karnosol gibi diterpenler ve ursolik asit ve benzeri triterpenler içerir.
Uçucu yağ, % 60-64 civarında ökaliptol (1,8-sineol), % 8.2 kafur ve % 5’in altında
tuyon türevleri taşımaktadır.
2.3.9. Kekik ( Thymus sp. )
İştah açıcı, hazım kolaylaştırıcı etkileri bulunmaktadır. Solunum yolları
enfeksiyonlarında, soğuk algınlığında, kuru ve balgamlı öksürüklerde çay veya
ekstrelerinden hazırlanmış bitkisel ilaçlardan yararlanılmaktadır. Etken bileşikleri; tıbbi
amaçla kullanılacakların % 0.6-2.5 oranında uçucu yağ taşıdıkları, bu uçucu yağın da en
az % 20 (timol-karvakrol) fenolik madde içermesi gerektiği kayıtlıdır. Drogda ayrıca
flavonoid bileşikler ve başta ursolik, oleanolik asit olmak üzere triterpenik maddeler ve
Labiatae tanenleri bulunmaktadır.
2.3.10. Ihlamur ( Tilia sp. )
Solunum yolları yumuşatıcısı, gıcık kesici ve ateşli soğuk algınlığı rahatsızlıklarında
kullanılır. Fenil etil alkol esterleri sedatif etkilidir. Uçucu yağ ve flavonoidleri nedeniyle
antispazmodik ve idrar söktürücü etkisi vardır. Etken bileşikleri; flavonlar, özellikle
kamferol ve kuersetin türevleri, % 2 civarında tanen ve lökoantosiyanidin, % 0.02-0.1
oranında uçucu yağ taşımaktadır. Uçucu yağın bileşiminde eikozan, trikozan gibi
hidrokarbürler yanında eser miktarda linalol, geraniol gibi monoterpenik bileşikler ile
fenil etil alkol ve esterleri (etil ve benzoil esterleri) yer almaktadır.
2.3.11. Isırgan ( Urtica sp. )
Topraküstü kısımları idrar söktürücü, kökler miksiyon13 bozukluklarında etkilidir.
Topraküstü kısımlar, dahilen idrar yolları iltihapları, haricen romatizma; kökler prostat
adenomlarının14 I ve II kademelerindeki miksiyon bozukluklarında kullanılır. Etken
bileşikleri; topraküstü kısımlarında özellikle kalsiyum, potasyum ve silisik asit tuzları,
12 İltihaplarla savaşan madde 13 İdrara çıkma 14 Bir salgı bezinde gelişen tehlikesiz epitelyum uru
24
yaprak tüylerinde histamin ve serotonin gibi biyojenik aminler ve köklerde serbest ve
glikozidik β-sitosterol ve skopoletin içermektedir [82].
Kekik Ihlamur
Isırgan Nane
Şekil 2.17: Kekik, ıhlamur, ısırgan ve nane bitkilerinin resimleri
25
Civanperçemi Mercanköşk
Dereotu Adaçayı
Şekil 2.18: Civanperçemi, mercanköşk, dereotu ve adaçayı bitkilerinin resimleri
26
2.4. TOPLAM ANTİOKSİDAN KAPASİTE TAYİN YÖNTEMLERİ
2.4.1. CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity; Cu(II) İyonu İndirgeme
Antioksidan Kapasite) Yöntemi
Apak ve arkadaşlarının [36] geliştirdiği bu yöntemde, 2,9-dimetil-1,10-fenantrolin
(Neocuproin-Nc)’in Cu(II) ile oluşturduğu bakır(II)-neokuproin kompleksinin (Cu(II)-
Nc), 450 nm’ de maksimum absorbans veren bakır(I)-neokuproin [Cu(I)-Nc] kelatına
indirgenme yeteneğinden yararlanarak antioksidan kapasitesi hesaplanmaktadır. Bu
özellikten yola çıkarak geliştirilen antioksidan kapasite yöntemine ‘bakır(II) iyonu
indirgeme antioksidan kapasite yöntemi’ denilmiştir ve kısaca CUPRAC metodu olarak
adlandırılmıştır.
Yöntem; sulu Cu(II) klorür çözeltisi, alkolde hazırlanmış neokuproin çözeltisi ve sulu
amonyum asetat (pH 7 tamponu) çözeltilerinin karıştırılmasından sonra, üzerine tayin
edilecek herhangi bir antioksidan çözeltisinin ilave edilmesi ve bunu takip eden 30
dakika sonunda, içerisinde antioksidan bulunmayan referansa karşı 450 nm’de
absorbanslarının ölçülmesinden ibarettir. Askorbik asit, gallik asit ve kuersetin için renk
oluşumu hızlı olurken naringin, naringenin gibi yavaş reaksiyona giren antioksidanlar
için 50 oC’de 20 dakika inkübasyon işlemi uygulanmaktadır. Flavonoid glikozidlerine
% 50 metanol içeren son çözeltide 1.2 M HCl ile hidroliz işlemi uygulanarak,
maksimum indirgeme güçlerini daha fazla gösterdikleri aglikon haline dönüşmeleri
sağlanarak yöntem uygulanmıştır.
n Cu(Nc)2
2+ + Ar(OH)n n Cu(Nc)2
+ + Ar(=O)n + n H
+ (2.11)
Yöntem hem hidrofilik hem de lipofilik antioksidanlara uygulanabilir.
2.4.2. TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity; Troloks Eşdeğeri
Antioksidan Kapasitesi) / ABTS Yöntemi
Troloks eşdeğeri antioksidan kapasitesi olarak ifade edilen TEAC/ABTS yöntemi, ilk
olarak Miller ve arkadaşları [10,20] tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntem; 2,2’-
azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonat) (ABTS) kromojen radikal katyonunun
absorbansının, antioksidanlar tarafından inhibisyonunu temel alır. Antioksidanlar
varlığında ABTS.+ radikal katyonunun (Şekil 2.19) absorbansında belirli bir süre
içindeki azalmadan yararlanarak toplam antioksidan kapasitesi troloks cinsinden
27
bulunur. Bu nedenle bu yönteme “troloks eşdeğeri antioksidan kapasite
yöntemi”(ABTS/TEAC) adı da verilir.
Şekil 2.19: ABTS.+ radikal katyonunun yapısı
660, 734 ve 820 nm’de maksimum veren ABTS.+ radikal katyonu metmiyoglobinin
H2O2 ile aktivasyonu ile üretilen ferrilmiyoglobin radikal türlerinin ABTS ile
etkileşiminden meydana gelmektedir.
ABTS .+ katyon radikalini oluşturmak için, ABTS; myoglobin ve H2O2 ile inkübe edilir
[83].
HX-Feııı + H2O2 X-[Feıv (O] + H2O (2.12)
ABTS + X-[Feıv(O] ABTS .+ + HX-Feııı (2.13)
(HX-Feııı = myoglobin; X-[ FeIV(O] =ferrilmyoglobin)
Orijinal TEAC denemesinin bağıl standart sapma değerleri, gün içi denemeler için %
0.54 - 1.59, günler arası denemeler için % 3.6 - 6.1 olarak bulunmuştur [20].
Şekil 2.20: ABTS.+ radikal katyonunun absorbsiyon spektrumu
28
Re ve arkadaşları [40] tarafından modifiye edilmiş ve geliştirilmiş TEAC yönteminde
potasyum persülfatla ABTS’in oksidasyonu sonucu üretilen ABTS.+ radikal katyonları
kullanılır. Üretilen bu ABTS radikalleri oda sıcaklığında karanlıkta beklediği zaman 2
gün kararlıdır. Geliştirilen bu yöntem, hem lipofilik hem de hidrofilik sistemlerde
kullanılabilmektedir.
2.4.3. FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power; Demir(III) İyonu İndirgeyici
Antioksidan Gücü) Yöntemi
Benzie ve Strain tarafından geliştirilen bu yöntemde [22] demir(III)’in indirgenme
kapasitesi yoluyla antioksidanların toplam miktar tayini yapılmaktadır. Düşük pH larda
oluşan Fe(III) ’ün, kısa adı TPTZ olan tripiridiltriazin ile reaksiyonu sonucu oluşan
[Fe(III)-TPTZ] kompleksi antioksidanların etkisiyle Fe(II)-tripiridiltriazin [Fe(II)-
TPTZ] kompleksine indirgenmektedir. Meydana gelen Fe(II)-TPTZ kompleksinin rengi
koyu mavidir ve 593 nm’de maksimum absorbans vermektedir.
2.4.4. Folin Ciocalteu Yöntemi
Bu yöntem Singleton ve arkadaşları [28,29] tarafından antioksidanların toplam fenolik
içeriğini ölçmek için geliştirilmiştir. Yöntemde kullanılan CuSO4 (bakır(II) sülfat) alkali
ortamda protein veya antioksidanla kompleks yapar. Folin fenol reaktifi (fosfo-
molibdik-fosfotungstik asit) eklendiğinde, folin reaktifi proteine bağlanır. Protein veya
antioksidanla Cu(II)’nin reaksiyonundan açığa çıkan Cu(I) olasılıkla molibdatotungstat
reaktifini heteropoli mavisine indirger ve rengi sarıdan maviye dönüşür. Reaksiyon
tamamlanınca 750 nm’de örnek absorbansları ölçülür.
Bu denemede, ard arda geri dönüşümlü bir veya iki elektron indirgeme reaksiyonları,
P(MoW11O40)4- olması muhtemel mavi türlerin oluşumunu sağlar. Esasen, molibdenin
kompleks içinde indirgenmesinin daha kolay olduğuna ve elektron-transfer
reaksiyonunun indirgenler ve Mo(VI) arasında gerçekleştiğine inanılır.
Mo(VI) + e- Mo(V) (2.14)
Fenolik bileşikler FCR (Folin Ciocalteu reaktifi) ile sadece bazik ortamlarda reaksiyon
verirler. (Sodyum karbonat çözeltisi ile pH 10’a ayarlanır). Fenolik protonun
29
dissosiasyonu, reaktifi indirgeme yeteneği bu nedenle artan fenolat anyonunun
oluşumunu sağlar.
2.4.5. TRAP (Total Radical Trapping Parameter ; Toplam Radikal Tutma
Parametresi) Yöntemi
Wayner ve arkadaşları [14] tarafından geliştirilen bu metodda; plazma ve diğer
biyolojik sıvılarda bulunan peroksitlenebilen maddelerden ve 2,2’-azobis (2-amido
propan) dihidroklorürden (AAPH) meydana gelen peroksil radikalleri kullanılır.
Plazmaya AAPH’ün ilavesinden sonra, yükseltgenebilen maddelerin oksidasyonu,
reaksiyon sırasında tüketilen oksijenin ölçülmesi ile belirlenir. Plazma içerisinde
bulunan antioksidanlar oksidasyon reaksiyonunun yavaş gerçekleşmesine sebep olur.
Reaksiyonun gecikme zamanı ölçülerek plazmadaki toplam antioksidan kapasitesi, iç
standart olarak kullanılan troloks eşdeğeri cinsinden hesaplanmaktadır.
Wayner ve arkadaşları [82] peroksil radikalleri tarafından oksidasyon başlatılmadan
önce, plazma örneğine linoleik asit ilavesi yaparak yöntemi modifiye etmişlerdir. Bu
yöntemin dezavantajı, oksijen elektrodunun son noktasının tam olarak tespit
edilememesi ve oksijen elektrodunun gereken zaman dilimi içinde kararlılığını
koruyamamasıdır [20].
2.4.6 Luminol Yöntemi
Metsä-Ketelä ve arkadaşları tarafından 1991’de geliştirilen ve yayınlanan
kemiluminesans esaslı TRAP yöntemi daha sonra Alho ve Leinonen tarafından detaylı
şekilde ifade edilmiştir [26]. AAPH’dan üretilen peroksil radikallerinin luminolü
yükseltgemesi sonucu ışık yayan luminol radikalleri meydana gelmektedir. Yayılan ışık
luminometre cihazı ile ölçülür. Örnek içindeki antioksidanlar, kemiluminesans
ışımasının oluşumunu belli bir zaman için engeller. Gecikme zamanı bir örnekteki
toplam antioksidan potansiyeli ile doğrudan orantılıdır. Elde edilen sonuçlar troloks
eşdeğeri cinsinden hesaplanmaktadır.
Whitehead ve arkadaşları [11] 1992 yılında bu kemilüminesans yöntemini biyolojik
sıvılarda antioksidan kapasitenin ölçümü için geliştirmişlerdir. Geliştirilen bu yöntemde
luminol AAPH yerine, H2O2 veya perborat ile yükseltgenerek luminol radikallerini
30
oluşturur. Reaksiyonu daha hızlı gerçekleştirebilmek için katalizör olarak horseradish
peroksidaz kullanılmış ve böylece ışık yayılması daha çabuk olmuştur. Normal şartlar
altında bu reaksiyon, hızla azalan düşük şiddetli bir ışık yayılması olarak gerçekleşir.
Ortama p-iyodofenol ilave edildiği zaman ışık emisyonu daha şiddetli, uzun süreli ve
kararlı hale gelir. Işığın luminol radikalleri tarafından yayılması için ortamdaki bütün
antioksidanların tüketilmesi gerekmektedir.
2.4.7. Diklorofloresin-diasetat (DCFH-DA) Yöntemi
TRAP yöntemini temel alan başka bir yöntem ise Valkonen ve Kuusi’ nin geliştirdiği
Diklorofloresin-diasetat (DCFH-DA) yöntemidir. Bu yöntemde AAPH peroksil
radikalini oluşturmak için, DCFH-DA ise yükseltgenebilen substrat olarak
kullanılmıştır. Peroksil radikali ile DCFH-DA arasındaki oksidasyon reaksiyonu
sonucu oluşan diklorofloresin (DCF) yüksek floresans özelliğine sahip olmaktadır. DCF
480 nm de uyarılıp 526 nm de emisyon yapmaktadır. 504 nm de maksimum
absorbsiyon göstermektedir. Bu bakımdan hem floresans yöntemi hem de
spektrofotometrik yöntem kullanılarak DCF miktarı ve buna bağlı olarak toplam
antioksidan kapasitesi hesaplanmaktadır.
Bu yöntemde toplam antioksidan kapasitesi iki kademede bulunmaktadır. İlk kademede
örnek içindeki antioksidanların kapasitesi gecikme zamanı cinsinden hesaplanmaktadır.
Sonra aynı örnek üzerine miktarı bilinen troloks çözeltisi ilave edilmektedir. Troloks
çözeltisi serbest radikaller tarafından tüketildikten sonra ikinci gecikme zamanı
hesaplanır. Bu iki gecikme zamanı arasındaki farktan yararlanarak troloks cinsinden
toplam antioksidan kapasitesi hesaplanmaktadır. Gecikme zamanlarının belirlenmesini
sağlayan TRAP esaslı bu yöntemin gün içi ve günler arası bağıl standart sapma
değerlerinin sırasıyla % 3.4 ve 4.6 olduğu ifade edilmiştir [23].
2.4.8. Fikoeritrin (PE) Esaslı Yöntemler
Ghiselli ve arkadaşları [13] tarafından 1994 yılında yayınlanan bu yöntem, peroksil
radikallerinin kullanıldığı ve 1990 yılında yayınlanan Glazer çalışmasının [16] temelde
bir benzeridir. Glazer, peroksil radikallerini oluşturmak için AAPH, hidroksil
radikallerini oluşturmak için Cu(II)-askorbat, yükseltgenebilir substrat olarak B- veya
R-PE kullanmıştır. B- veya R-PE substratının peroksil veya hidroksil radikalleri
31
varlığında gösterdiği floresansın zamanla lineer olarak azaldığı belirtilmiştir. B- veya
R-PE’nin peroksil veya hidroksil radikallerine karşı sağladığı gecikme zamanının
uzunluğu troloksun sağladığı gecikme zamanına oranlanarak örneğin antioksidan
kapasitesi troloks eşdeğeri cinsinden belirlenir. Ama, PE fluoresans sönümünün
kinetikleri, peroksil veya hidroksil radikalleri varlığında lineer değildir. Ayrıca analiz
edilen örnek, plazma veya serum olduğu zaman gecikme zamanını belirlemek genellikle
zordur [85].
Yeni bir yöntem olarak yayınlanan Ghiselli’ nin yönteminde Glazer’ ın geliştirmiş
olduğu yönteme atıf yapılmamıştır. Ayrıca yapılan çalışmada R-PE fluoresansının
yaklaşık % 80’ in söndürülmesine kadar R-PE fluoresansının zamanla lineer olarak
azaldığı belirtilmiştir. Ancak bu çalışma farklı kişiler tarafından tekrarlandığında aynı
sonuçlar alınamamıştır [12,21]. Ayrıca, yöntemin plazmanın toplam antioksidan
kapasitesini ölçmeye yönelik bir yöntem olduğu belirtilse de yöntemde, yapay plazma
örnekleri kullanılmıştır ve % 0.96 bağıl standart sapma değeri yapay serum örnekleri
için oldukça düşüktür [85].
2.4.9. Krosin Yöntemi
Tubaro ve arkadaşlarının geliştirdiği bu yöntemde kinetik parametreler karşılaştırılarak
plazma içindeki antioksidan kapasitesi ölçülmektedir. Bu yöntem; AAPH tarafından
oluşturulan peroksil radikallerinin krosini yükseltgemesi (rengini gidermesi) esasına
dayanmaktadır Krosinin peroksil radikalleri ile yükseltgenme reaksiyonunda
antioksidanların olmadığı durumdaki hızı (V0) ve antioksidanların olduğu durumdaki
hızı ise (V), 10 dakika içinde ölçülmektedir. Bu ölçülen hızların oranı (V0 / V) x
eksenini, antioksidan konsantrasyonunun [A] krosin konsantrasyonuna [C] oranı y
eksenini oluşturacak şekilde bir grafik oluşturulmaktadır. Oluşan bu lineer grafiğin
eğimi ka / kc oranını yani peroksil radikalleri ile etkileşen bileşiğin göreceli kapasitesini
belirtir. ka ; antioksidanlar ile peroksil radikalleri arasındaki reaksiyon hız sabiti, kc ;
krosin ile peroksil radikalleri arasındaki arasındaki reaksiyon hız sabitidir. Bulunan ka /
kc oranı, daha önceden troloks ile hesaplanan ka / kc oranına bölünerek sonuçlar troloks
cinsinden hesaplanmaktadır. Bu yöntemde iki antioksidanın peroksil radikalleriyle
etkileşimleri kıyaslanabilmektedir.
32
Gün içi denemelerin bağıl standart sapma değerlerinin % 8’den az olduğunu belirten
Tubaro ve arkadaşları, bu kinetik yaklaşım sayesinde antioksidan koruma etkinliğinin
kesin olarak değerlendirilebileceğine inanmaktadırlar [27]. Ancak bu metod bir
antioksidanın diğer bir antioksidana karşı yarışma yeteneğini ölçmektedir. Ayrıca
kullanılan krosinin konsantrasyonu sabittir (10 µM) fakat analizlenecek olan bileşiğin
farklı konsantrasyonlarının kullanılması için farklı krosin konsantrasyonları
gerekmektedir. [85].
2.4.10. DPPH Yöntemi
Bu yöntem; antioksidanların kararlı bir organik azot radikali olan DPPH (1,1-difenil-2-
pikrilhidrazil) radikalini süpürücü etkilerini ölçmeye dayalı bir yöntemdir. Bu radikal
hidrojen donörlerle etkileştiğinde hidrazine indirgenir. Kırmızı renkli DPPH radikali
515 nm’de maksimum absorbsiyon verir. DPPH çözeltisine antioksidanın ilave
edilmesiyle absorbansta düşüş meydana gelir ve antioksidanların varlığıyla radikalin
rengi kırmızıdan sarıya döner. Bu yöntem antioksidanların radikal süpürme
kabiliyetlerini değerlendiren kolay ve geçerli bir yöntem olarak bilinmektedir [25].
Yöntem hızlı ve basittir. Ancak, bazı bileşenlerin (özellikle karotenoidler) 515 nm’ de
DPPH ile çakışık spektrum vermesi analizin yorumunu güçleştirir. Ayrıca çoğu
antioksidan sterik engellemeden dolayı DPPH ile yavaş reaksiyona girer. Bundan dolayı
yöntem; DPPH. ile reaksiyona giren antioksidanların antioksidan kapasitesi hakkında
doğru bir değerlendirme vermez. Bunlara ek olarak DPPH’ın rengi, ışık, hava oksijeni,
rutubet ve pH'a fazlaca duyarlı olduğundan tekrarlanabilir sonuçlar eldesi güçtür.
N
N.
NO2O2N
NO2
+ AH N
NH
NO2O2N
NO2
(2.15)
33
2.4.11. ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity; Oksijen Radikal Absorbans
Kapasitesi) Yöntemi
ORAC yöntemi [12,21,86]; büyük oranda Glazer [16] tarafından yayınlanan çalışmayı
esas alır. Peroksil radikalini oluşturmak için AAPH, hidroksil radikalini oluşturmak için
Cu(II) - H2O2 ve yükseltgenebilen protein substratı olarak fikoeritrin kullanılmaktadır.
Oluşturulan radikaller ile fikoeritrin arasındaki yükseltgenme reaksiyonu sonucunda,
fikoeritrinin floresansındaki zamana bağlı düşüş ölçülerek toplam antioksidan kapasitesi
hesaplanmaktadır. Serbest radikal etkisini inceleyen ve miktar tayininde eğri altında
kalan alan (area under curve-AUC) tekniğini kullanan bu yöntem, antioksidanların
serbest radikalleri hem inhibe etme yüzdesini ve hem de inhibe etme süresini tek bir
değer olarak ifade edebilen bir yöntemdir [85]. Net AUC, antioksidan miktarıyla
orantılıdır.
2.4.12. TOSC (Total Oxyradical Scavenging Capacity; Toplam Oksiradikal
Süpürme Kapasitesi) Yöntemi
Winston ve arkadaşları tarafından geliştirilmiş olan bu yöntem; AAPH bileşiğinden elde
edilen peroksil radikallerinin α-keto-γ metiolbutirik asiti (KMBA) etilene
yükseltgemesini esas alır [24]. Antioksidanlar varlığında kısmen engellenen etilen gaz
kromatografisi ile ölçülmektedir. Toplam kapasiteyi elde etmek için aşağıdaki denklem
kullanılmaktadır. Denklemde örnek reaksiyon eğrisinden integre edilen alan (∫ SA) ve
kontrol reaksiyon eğrisinden integre edilen alan (∫ CA) kullanılarak işlem yapılır:
TOSC = 100- (∫ SA / ∫ CA × 100) (2.16)
Antioksidan veya TOSC değerleri 0-100 arasında verilmiştir. TOSC yönteminde, gün
içi ve günler arası denemelerin bağıl standart sapma değerlerinin sırasıyla % 2 ve 6
olarak belirtilmiştir [24]. Bu durum kullanılan alan integrallerine göre açık bir
sistemdir, çünkü KMBA sınırlayıcı bir faktör olmazsa, antioksidanların tüketimi
sonrasında KBMA’dan etilen üretimi artabilir [85].
2.4.13. Siklik Voltametri Yöntemi
Kohen ve arkadaşları [87,88] tarafından geliştirilen bu yöntem, biyolojik sıvılarda veya
doku homojenatlarındaki düşük molekül ağırlıklı antioksidanların toplam indirgeme
güçlerini değerlendiren bir yöntemdir. Bu yöntemde örnek hazırlama işlemini takiben,
34
örnek camsı karbon bir çalışma elektrodu, Ag/AgCl den oluşan referans elektrot ve
platin telden oluşan yardımcı elektrot olmak üzere üç elektrotlu bir sistem içine
yerleştirilir. Çalışma elektroduna sabit bir hızla (100 mV/dk) pozitif (indirgeme
cinsinden değerlendirme) ve negatif (yükseltgeme cinsinden değerlendirme)
potansiyeller uygulanmaktadır. Bu işlem sırasında potansiyel akım eğrisi (çevrimsel
voltamogram) elde edilir. Örneğin indirgeme gücü, pik potansiyeli olan [ Ep(a)] ve
anodik akım olan (AC) ye bağlıdır. Ep(a) akımın yarı artışında ölçülür ve yarı dalga
potansiyeli (E1/2) olarak ifade edilir ; bu indirgenlerin türüne bağlıdır. Yarı dalga
potansiyelinin düşük olması durumunda, analizlenen bileşiklerin çalışma elektroduna
elektron verme yeteneği daha yüksektir. Ancak bazı antioksidanlar camsı karbon
elektroduna elektronlarını yeterli miktarda vermez. Örneğin tiyol yapısında glutatyon
camsı karbon elektrodu ile tayin edilemez (Bunun yerine Au/Hg gibi elektrodlara
ihtiyaç duyulur) [87].
2.5. BİTKİLERDE TOPLAM ANTİOKSİDAN KAPASİTE TAYİNİNDE
KULLANILMIŞ OLAN SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLER VE HPLC
UYGULAMALARI
Surveswaran ve arkadaşlarının [7] yaptığı çalışmada, Hindistan’daki 133 tane tıbbi
bitkinin antioksidan kapasitesi ABTS, DPPH ve FRAP yöntemleri ile değerlendirilmiş
ve toplam fenolik içerikleri Folin-Ciocalteu yöntemi ile hesaplanmıştır. Bu bitkilerin
antioksidan aktiviteleri, ABTS yönteminde 0.16 – 500.7 mmol TEAC/100 g kuru ağırlık
arasında değişen geniş bir aralık göstermektedir. Antioksidan aktivite değerleri DPPH
ve FRAP yöntemlerinde benzer şekilde değişmektedir. Toplam antioksidan kapasite ve
toplam fenolik içerik arasında önemli ve pozitif doğrusal korelasyon bulunmuştur. Bu
durum, analizlenen tıbbi bitkilerdeki baskın antioksidan bileşenlerin fenolik yapılar
olduğunu göstermektedir. Seçilmiş 83 bitkinin ters-faz HPLC ile yapılan analizlerinde,
temel fenolik bileşiklerin; fenolik asitler, tanenler, flavonoidler, kurkuminoidler,
kumarinler, lignanlar ve kuininler olduğu belirlenmiştir.
Iqbal ve arkadaşlarının [89] yaptığı çalışmada Pakistan’da yetişen 5 buğday türünün
kepek ekstraklarının antioksidan aktiviteleri değerlendirilmiştir. Tüm kepek ekstraktları,
önemli miktarda toplam fenolik içerik (2.12 – 2.37 mg gallik asit eşdeğeri/ g kepek),
35
toplam flavonoid içerik (epikateşin eşdeğeri 262-304 µg/g kepek), kelatlama aktivitesi
(etilendiamintetraasetikasit eşdeğeri 597-716 µg/g kepek), DPPH aktivitesi (% 51-79)
göstermektedir. ABTS kapasitesi 27-36 µmol/g; ORAC kapasitesi 97-123 µmol/g ve
toplam antosiyanin içeriği 30-38 mg/kg kepek olarak bulunmuştur. Tokoferol (22-26
ppm) ve tokotrienol içerikleri (59-74 ppm) ters faz-HPLC ile değerlendirilmiştir.
Oszmianski ve arkadaşları [90] yaptıkları bir çalışmada, Rosaceae familyasından bazı
bitki köklerinde antioksidan tanenleri belirlemeye çalışmışlardır. Polifenoller,
proantosiyanidin polimerlerinin tiyoasidoliz, fenolik asit esterlerinin asit hidrolizinden
sonra analizlenmiştir. Aruncus Silvester ve Potentilla alba köklerinin en baskın
prosiyanidin birimleri (-)epikateşin ve Geum rivale ve Waldsteinia geoides köklerinde
ise (+) kateşin olarak bulunmuştur. En yüksek proantosiyanidin derişimleri, Potentilla
alba (80 g/kg) ve Waldsteinia geoides (64 g/kg) köklerinde belirlenmiştir. G. Rivale
(2.68 g/kg) ve W. geoides (2.75 g/kg) kuru köklerinde yüksek miktarda ellagik asit
bulunmuştur. DPPH yöntemi ile antioksidan aktivite, bitkilerin türüne göre 0.72
(Filipendula vulgaris) ile 4.40 (W.geoides) mM troloks eşdeğeri/kg kuru kök, ABTS
yönteminde ise 1.50 - 6.60 mM troloks eşdeğeri/kg kuru kök arasında değişmektedir.
Chun ve arkadaşlarının [91] yaptığı bir çalışmada, mercanköşk (oregano) doku
kültürlerinden yüksek antioksidan aktivite ve antimikrobiyal potansiyel gösteren, birkaç
fenolik ve rozmarinik asit izole edilmiştir. Araştırmada, fenolik içeriği zengin
mercanköşk ekstraktlarının antioksidan aktivitesi ve antimikrobiyal aktivitesi
Helicobacter pylori kaynaklı ülsere karşı değerlendirilmiştir. Ekstraktlar farklı
bölgelerden sağlanmış ticari mercanköşklerle karşılaştırılmıştır. Toplam fenolik içeriği
%60 etanol ekstraktlarında en yüksek bulunmuştur. Çalışmada uygulanan ABTS+
yöntemi ile toplam fenolik miktarı arasında korelasyon vardır. Mercanköşk
ekstraktlarının fenolik profilleri (protokateşuik asit, kafeik asit, kumarik asit, rozmarinik
asit, kuersetin) HPLC ile analizlenmiştir. C6-C1-COOH fenolik ve C6-C3-COOH
hidroksisinnamik asitlerin fizikokimyasal özellikleri arasındaki farklılığın H.pylori
gelişmesini engellediği varsayılmaktadır.
Apak ve arkadaşlarının [37] yaptığı çalışmada, demlenerek hazırlanan bazı endemik
bitki örneklerinin toplam antioksidan kapasitesi, bakır(II) iyonu indirgeme antioksidan
36
kapasite tayini olarak kısaltılan CUPRAC yöntemiyle belirlenmiştir. Türkiye’nin yerel
marketlerinden temin edilen bitkilerden siyah çay dışındaki en yüksek antioksidan
kapasite, fare kulağı-çuha çiçeği (Anagallis arvensis), fesleğen (Ocimum basilicum),
yeşil çay (Camellia sinensis) ve oğulotu (Melissa officinalis) bitkilerinde sırasıyla; 1.63,
1.18, 1.07, ve 0.99 mmol Troloks eşdeğeri (TR)/g kapasite ile belirlenmiştir.
Demlenerek hazırlanan, hazır poşet çay örneklerinde en yüksek CUPRAC değerleri,
Ceylon harmanlanmış klasik çay (4.41), limonlu yeşil çay (1.61), klasik İngiliz çayı
(1.26) ve yeşil çay (0.94) saptanmıştır. Adaçayı, kekik, kişniş, öksürük otu, böğürtlen ve
altın otunun kapasite değerleri ise 0.5 mmol TR/g civarında belirlenmiştir. Bitkisel
çayların Folin yöntemiyle bulunan toplam fenolik içerikleri, CUPRAC ve ABTS toplam
antioksidan kapasite yöntemleri ile sırasıyla 0.966 ve 0.936 korelasyon katsayıları ile
doğrusallık göstermektedir.
Güçlü ve arkadaşlarının [38] yaptığı çalışmada, Malatya’nın 5 farklı bölgesinden temin
edilen taze, güneşte ve sülfitlenerek kurutulmuş kayısı örneklerinin antioksidan
kapasitesi, CUPRAC, ABTS ve toplam polifenol ölçümleri Folin yöntemleri ile
yapılmıştır. CUPRAC yöntemi ile renk veren sülfit, kuvvetli bazik anyon değiştirici
reçinede pH 3’te HSO3- formunda toplanarak ayrılmıştır. CUPRAC yönteminin ABTS
ve Folin yöntemleri ile korelasyonu (0.93) uygun bulunmuştur. Saf flavonoidlerin ve
standart katkı yapılmış kayısı ekstraktlarının kalibrasyon doğruları paralellik
göstermektedir. CUPRAC yöntemi ile yapılan bu çalışma, hem toplam antioksidan
kapasite hem de çeşitli kayısı örneklerinin sülfit miktarını belirlemektedir.
Toker ve arkadaşları [92], Tilia platyphyllos (ıhlamur) türlerinin, çiçek, taç yaprak ve
yapraklarının flavonoid bileşimini, geliştirdikleri ters faz-HPLC yöntemi ile
değerlendirmişlerdir. Sonuçlar, Türkiye’de yetişen iki ıhlamur türünün (Tilia rubra ve
Tilia argentea ) belirtilen kısımlarında karşılaştırılmıştır. Her iki türün yapılan HPLC
analizleri sonucu, çiçek kısımlarında kuersetin-3,7-diramnozid, izokuersitrin+rutin,
kuersitrin ve astragallin, taç yaprak ve yaprak kısımlarında ayrıca kamferol-3,7-
diramnozid belirlenmiştir. Tilia argentea türünün çiçek, taç yaprak ve yaprak
kısımlarında farklı miktarlarda tiliozid saptanmıştır.
37
Exarchou ve arkadaşlarının [93] yaptığı çalışmada, eczacılıkta kullanılan bazı metanollü
bitki ekstaktlarında, antioksidanların hızlı bir şekilde belirlenmesi için birleştirilmiş
kromatografik yöntemlerden yararlanılmıştır. Tilia europea (ıhlamur), Urtica dioica
(ısırgan), Lonicera periclymenum (hanımeli) ve Hypericum perforatum (sarı
kantaron)’un metanollü ekstraktlarındaki antioksidan bileşenler öncelikle on-line DPPH
ve ABTS radikal süpürme yöntemleri ile görüntülenmiştir. Analitlerin yapısal yorumu
LC-MS ve LC-MS-SPE-NMR ile belirlenmiştir. UV, NMR ve MS uygulama esaslı
çalışmada, ekstraktların antioksidan bileşenleri olarak hem flavonoid glikozidleri hem
de mono- ve dikaffeoilkuinik asitler bulunmuştur.
Urbonavičiūtė ve arkadaşlarının [94] yaptığı çalışmada, alıç (Crataegus monogyna
Jacq.) adlı bitkinin yaprak ve filiz kısımlarının sulu etanol ekstraktları kapiler bölge
elektroforezi ile analizlenmiştir. Ekstraktın kalitatif bileşimi ve flavonoid miktarı
üzerinde bitki örtüsünün etkisi incelenmiştir. Farklı sulu etanol derişimleri (% 40-96) ile
ekstraksiyon yapılarak örnek hazırlanmış ve flavonoidlerin geri kazanımında ekstraktant
bileşiminin etkisi araştırılmıştır. Kapiler bölge elektroforezi ile elde edilen sonuçlar,
spektrofotometrik ve HPLC analizleri ile karşılaştırılmış ve etanollü alıç ekstraktlarında;
rutin, viteksin-2’’-O-ramnozid, viteksin, hiperosid, klorojenik asid belirlenmiştir.
Flavonoidlerin bozunmasında ekstraktın saklanma koşullarının etkisi de (güneş ışığı,
sıcaklık, saklama süresi) incelenmiştir.
Justesen ve arkadaşlarının [95] yaptığı çalışmada bazı meyve, sebze ve içeceklerdeki
flavonol, flavon, ve flavononları miktarlandırmak ve belirlemek için, foto-diyot array ve
kütle spektrometrik dedeksiyonlu yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ayırma
yöntemi geliştirilmiştir. Dondurularak kurutulmuş gıdaların asit hidrolizinden sonra,
bileşikler aglikon olarak analizlenmiştir. Gıda bileşimindeki flavonoidler, ticari
standartların alıkonma zamanları, UV ve kütle spektrumları ile karşılaştırılmış ve
flavonoid içerikleri pik alanları ile hesaplanmıştır. Çalışmada analizlenen kereviz
yaprağında apigenin ve luteolin; ıhlamurda hesperetin, naringenin ve kuersetin;
maydanozda apigenin, kamferol ve luteolin belirlenmiş ve miktarlandırılmıştır.
Justesen ve arkadaşlarının [96] yaptığı başka bir çalışmada, sıklıkla tüketilen 15 taze
bitkinin flavonoid miktarı belirlenmeye çalışılmıştır. Bu amaçla, fesleğen, frenk soğanı,
38
kişniş, tere, dereotu, oğulotu, selamotu, mercanköşk, maydanoz, biberiye, adaçayı, nane,
tarhun, kekik ve su teresi taze bitkileri HPLC ve kütle spektrometrisi ile analizlenmiştir.
Asit hidrolizinden sonra, 5 temel aglikon flavonoid olarak apigenin, izoramnetin,
kamferol, luteolin ve kuersetin belirlenmiş ve miktarlandırılmıştır. En yüksek flavonoid
miktarları, maydanozda (510-630 mg apigenin/100 g), selamotunda (170 mg
kuersetin/100 g), nanede (18-100 mg apigenin/100 g, ayrıca luteolin) ve dereotunda (48-
110 mg kuersetin/100 g, ayrıca kamferol ve izoramnetin) belirlenmiştir.
Areias ve arkadaşları [97] yaptıkları çalışmada, nanede 10 fenolik bileşiği (eriodiktol-7-
O-rutinozid, eriodiktol-7-O-glikozid, luteolin-7-O-rutinozid, luteolin-7-O-glikozid,
hesperetin-7-O-rutinozid, apigenin-7-O-rutinozid, rozmarinik asit, 5,6-dihidroksi-
7,8,3’,4’-tetrametoksiflavon, pebrellin ve gardenin B) belirlemek için bir ters-faz
yüksek performanslı sıvı kromatografisi yöntemi geliştirmişlerdir. Ekstraksiyon için
farklı organik çözücüler denenmiş, etanolün kalitatif ve kantitatif değerlendirme için en
uygun çözücü olduğuna karar verilmiştir. HPLC’de en iyi ayrım, su-fosforik asit (999:1)
ve asetonitril ikili çözücü sisteminin gradienti ile elde edilmiştir. Geliştirilen yöntem 14
nane örneğine uygulanmıştır.
Karakaya ve arkadaşlarının [98] yaptığı çalışmada, ısırgan (Urtica sp.), kuşburnu (Rosa
cannina), adaçayı (Salvia officinalis), ıhlamur çiçeği (Tilia platyphyllos), siyah çay,
şalgam suyu (Daucus carota L. spp sativus), üzüm pekmezi, bal ve tarhana örneklerinin
kuersetin, luteolin, apigenin ve kamferol içerikleri HPLC ile belirlenmiştir. Siyah çay ve
ıhlamur çiçeğinde kuersetin ve kamferol; adaçayında kuersetin ve luteolin, kuşburnu,
şalgam suyu, tarhana ve üzüm pekmezinde kuersetin; balda apigenin ve kamferol;
ısırganda kuersetin ve apigenin temel bileşenler olarak belirlenmiştir.
39
3. MALZEME VE YÖNTEM
3.1. KULLANILAN CİHAZLAR
Bu çalışmada kullanılan cihazlar; kimyasal madde ve bitki örneklerini tartmak için
Shimadzu-AX 200 analitik terazi, pH ölçümleri için Metrohm Herisau E512 pH metre,
ekstraksiyon işlemleri ve kimyasal maddelerin çözünmesine yardımcı olmak için
Bransonic 221 ultrasonik banyo, inkübasyon işlemleri için 10 kademeli Clifton su
banyosu, hidroliz işlemleri için HB4 basic KIKA-WERKE su banyosu, çözeltileri
karıştırmak için Elektro-mag girdap karıştırıcı, bitki örneklerinin kurutulmasında Telstar
Cryodos freeze-dryer, bidistile su temini için Millipore Simpak 1 Synergy 185 bidistile
su sistemi, absorbans ölçümleri için Cary 1E UV-Vis spektrofotometre, HPLC ayrımları
için Perkin Elmer Series 200 UV-Vis dedektör, Perkin Elmer Series 200 pompa, Perkin
Elmer Series 200 vakum degazer, Perkin Elmer 600 Series Link Chromatography ara
yüzey (interface) ve Hamilton marka 250 x 4.6 mm, HxSil 5 µm C18 HPLC kolonudur.
3.2. KİMYASAL MADDELER
Kullanılan kimyasal maddeler; gallik asit (Fluka), kateşin (Fluka), klorojenik asit
(Sigma), kafeik asit (Aldrich), ferulik asit (Aldrich), p-kumarik asit (Aldrich), naringin
(Aldrich), naringenin (Sigma), hesperidin (Fluka), hesperetin (Sigma), rutin (Sigma),
izokuersitrin (Fluka), kuersetin (Fluka), mirisetin (Acros Organics), rozmarinik asit
(Fluka), kamferol (AppliChem), luteolin (Alfa Aesar), apigenin (Alfa Aesar), askorbik
asit (Sigma-Aldrich), bakır(II)klorür dihidrat (CuCl2.2H2O) (Merck), amonyum asetat
(Riedel-de Haën), neocuproin (2,9-dimetil-1,10-fenantrolin) (Sigma-Aldrich), ABTS
(2,2’-azinobis[3-etilbenzotiazolin-6-sulfonat]) (Fluka), potasyum persülfat (K2S2O8)
(Merck), % 96’lık etanol (Riedel-de Haën), metanol (Merck), aseton (Riedel-de Haën),
% 37’lik hidroklorik asit (Merck), m-fosforik asit (Sigma), o-fosforik asit (Merck),
potasyum hidroksit (Merck), sodyum hidroksit (Merck) ve tannik asittir (General
Chemical Company).
40
3.2.1. Çözeltilerin Hazırlanması
Gallik asit, kateşin, klorojenik asit, kafeik asit, ferulik asit, p-kumarik asit, naringin,
naringenin, hesperetin, rutin, izokuersitrin, kuersetin, mirisetin ve luteolin stok
çözeltileri metanolde; rozmarinik asit ve kamferol stok çözeltileri etanolde; apigenin
(bazik ortamda çözündüğünden) stok çözeltisi KOH ve etanol karışımında; hesperidin
(bazik ortamda çözündüğünden) KOH ve bidistile su karışımında; askorbik asit % 1’lik
m-fosforik asitte; tannik asit % 70 metanolde çözüldü. Tüm stok antioksidan çözeltileri
–20 o C’ de saklanarak kullanıldı.
CUPRAC yönteminde; 1.0 x 10-2 M Cu(II) klorür çözeltisi ve 1 M amonyum asetat
tampon (pH 7) çözeltisi distile suda, 7.5 x 10-3 M neokuproin çözeltisi % 96’lık
etanolde hazırlandı.
ABTS yönteminde; ABTS radikal çözeltisi 7 mM ABTS ve 2.45 mM potasyum
persülfat içerecek şekilde suda hazırlanıp 12-16 saat karanlıkta ve oda sıcaklığında
bekletilerek kullanıldı.
3.3. BİTKİ ÖRNEKLERİNİN ANALİZE HAZIRLANMASI
3.3.1. Bitki Örneklerinin Kurutulması
Yaş maydanoz, kereviz, dereotu, nane, ısırgan örnekleri semt pazarlarından temin
edilerek yaprak kısımları freeze-dryer’da – 40 oC’de 8-14 saat süreyle kurutuldu.
Ihlamur, kekik, mercanköşk, civanperçemi, arslanpençesi, adaçayı örnekleri kurutulmuş
haliyle yerel marketlerden temin edildi. Tüm bitki örnekleri karanlıkta, oda sıcaklığında
ve ağızları kapalı cam erlenler içerisinde saklandı. Analizleri öncesinde porselen havan
ve tokmak kullanarak, ince toz haline gelinceye kadar öğütülüp analizlendi.
3.3.2. Bitki Örneklerinin Ekstraksiyonu
3.3.2.1. Kurutulmuş Bitki Örneklerinin Ekstraksiyonu
Maydanoz yaprakları metanol, etanol ve asetonun % 100; 70; 50 (v/v) oranları ve
sadece bidistile su ile, kurutulmuş kereviz yaprakları ise % 70 ve 50 metanol; %50
etanol ile ekstrakte edildi. Diğer bitki örnekleri % 70 metanol ile ekstrakte edildi.
Bunun için yaklaşık 1 g tartılan kurutulmuş örnekler önce çözücünün 15 mL’si ile 45
41
dakika, 5 mL daha ilave edilerek ikinci bir 45 dakika ve en son 5 mL daha çözücü
ilavesi ile 15 dakika (toplam 105 dakika) ultrasonik banyoda, ağızları kapalı cam
erlenler içinde ekstrakte edildi. Bitki ekstraktları önce süzgeç kağıdından, daha sonra
GF/PET (Glass fiber/polietilentereftalat) 1.0/0.45 µm’lik enjektör uçlu mikro filtreden
geçiririlerek analizlendi. Çalışılan tüm bitki ekstraktlarının (kendi çözücüleri ile 50 veya
100 kat seyreltilerek) aynı çözücülere karşı 200-800 nm arasında spektrumu alındı.
3.3.2.2. Yaş Maydanozda C Vitamini Analizi İçin Ekstraksiyon
Maydanoz yaprakları önce mutfak robotundan geçirilip daha sonra porselen havanda
dövüldü. Bu örnekten yaklaşık 5 g alınarak % 1’lik (w/v) m-fosforik asitin 25 mL’si ile
45 dakika ultrasonik banyoda ağzı kapalı cam erlen içerinde ekstrakte edildi [99].
Ekstrakte edilen kısım alınarak, katı örnek üzerine tekrar bir 25 mL % 1’lik m-fosforik
asit ilavesi yapıldı. 45 dakika daha ekstraksiyona aynı şekilde devam edilip (toplam 90
dakika) toplanan ekstraktlar önce % 1’lik m-fosforik asit ile ıslatılmış süzgeç
kağıdından daha sonra mikro filtreden geçirilerek analizlendi.
3.3.3. Bitki Örneklerinin İnfüzyonu (Demlenmesi)
Yaklaşık 1 g olarak tartılmış kurutulmuş adaçayı, ısırgan ve nane bitkileri 50 mL
bidistile kaynar su içinde 5 dakika infüze edildi (demlendi). Demlenmiş örnekler önce
süzgeç kağıdından daha sonra mikro filtreden geçirilerek analizlendi.
3.3.4. Bitki Örneklerinin Hidrolizi
3.3.4.1. Bitki Ekstraktlarının Hidrolizi
Bunun için % 70 ve 50 metanollü maydanoz yaprak ekstraktları ve % 70; 50 metanollü
ve % 50 etanollü kereviz yaprak ekstraktları son derişimi % 50 metanol ve 1.2 M HCl
olacak şekilde 80 oC’de 4 saat hidroliz edildi [100]. Diğer bitki örneklerinin % 70
metanollü ekstraktları ısırgan ve kekik örnekleri için 80 oC’de 4 saat; ıhlamur, nane,
mercanköşk, arslanpençesi, adaçayı, civanperçemi ve dereotu örnekleri için 80 oC’de 2
saat, son derişimi % 50 metanol ve 1.2 M HCl olacak şekilde hidroliz edildi.
• % 70 metanollü bitki ekstraktların hidrolizinde;
[ 6 mL % 70 metanollü ekstrakt + 5,8 mL metanol + 2 mL derişik HCl + 6,2 mL
bidistile su ] içeren karışım hidroliz edildi (son derişim % 50 metanol ve 1.2 M HCl).
Hidroliz sonunda hidrolizat hacmi hidroliz balonunu yıkamak suretiyle 25 mL’ye
metanolle tamamlandı, mikro filtreden süzülerek analizlendi.
42
Çalışılan tüm bitki ekstrakt hidrolizatlarının (% 50 metanol ile 50 veya 100 kat
seyreltilerek) % 50 metanole karşı 200-800 nm arasında spektrumu alındı.
3.3.4.2. Katı Bitki Örneklerinin Hidrolizi
Yaklaşık 0,2 g olarak tartılmış kurutulmuş bitki örneğine 16 mL % 62.5 metanol ve 4
mL 6 M HCl ilave edilerek (son derişim % 50 metanol ve 1.2 M HCl) 80 o C’de
maydanoz, kereviz yaprağı, ısırgan ve kekik bitkileri için 4 saat; adaçayı, arslanpençesi,
civanperçemi, dereotu, ıhlamur, mercanköşk ve nane bitkileri için 2 saat hidroliz işlemi
uygulandı. Hidroliz sonunda hidrolizat önce metanolle ıslatılmış süzgeç kağıdından
süzülüp katı örnek ve hidroliz balonunu metanolle yıkamak suretiyle hacmi 25 mL’ye
metanolle tamamlandı, mikro filtreden süzülerek analizlendi. Çalışılan tüm katı bitki
örnek hidrolizatlarının (% 50 metanol ile 50 veya 100 kat seyreltilerek) % 50 metanole
karşı 200-800 nm arasında spektrumu alındı.
3.3.4.3. Demlenmiş Bitkilerin Hidrolizi
Nane, adaçayı ve ısırganın demlenme ile hazırlanmış çözeltilerinin hidrolizi; sadece asit
ile (son derişim 1.2 M HCl olacak şekilde ) ve asit + metanol (son derişimde % 50
metanol ve 1.2 M HCl) ile olmak üzere iki şekilde gerçekleştirildi.
• Sadece asit ile yapılan hidrolizde;
12 mL demlenmiş bitki çözeltisi + 4 mL 12 M HCl + 24 mL su içeren karışım 80 oC’de
2 saat hidroliz edildi. Son hacim 50 mL’ye bidistile su ile tamamlandı. Mikro filtreden
geçirilerek analizlendi.
• Asit + metanol ile yapılan hidrolizde;
12 mL demlenmiş bitki çözeltisi + 20 mL metanol + 4 mL 12 M HCl + 4 mL su içeren
karışım 80 oC’de 2 saat hidroliz edildi. Son hacim 50 mL’ye metanolle tamamlandı.
Mikro filtreden geçirilerek analizlendi.
3.4. SENTETİK KARIŞIMLARIN HAZIRLANMASI
3.4.1. Sentetik Karışım-1
Mirisetin, izokuersitrin, luteolin, kamferol, apigenin, rozmarinik asit stok
çözeltilerinden belirli hacimler alınarak son derişimleri 2 x 10-4 M olacak şekilde 50
mL’lik sentetik karışım-1 çözeltisi hazırlandı. Karışımdan 5 mL alınarak; üzerine 10
mL metanol, 2 mL derişik HCl ve 3 mL su (son derişimi % 50 metanol ve 1.2 M HCl)
43
ilavesi yapıldı. Bu şekilde hazırlanan hidroliz karışımı 2 saat ve 4 saat 80 oC’de hidroliz
edildi. Son hacim 25 mL’ye metanolle tamamlandı.
3.4.2. Sentetik Karışım-2
Mirisetin, izokuersitrin, luteolin, kamferol ve apigenin stok çözeltilerinden belirli
hacimler alınarak son derişimleri 2 x 10-4 M olacak şekilde 25 mL’lik sentetik karışım-2
çözeltisi hazırlandı. Karışımdan 8 mL alınarak; üzerine 10 mL metanol ve 2 mL derişik
HCl (son derişimi % 50 metanol ve 1.2 M HCl) ilavesi yapıldı. Bu şekilde hazırlanan
hidroliz karışımı 2 saat ve 4 saat 80 oC’de hidroliz edildi. Son hacim 25 mL’ye
metanolle tamamlandı.
3.5. UYGULANAN YÖNTEMLER
3.5.1. Spektrofotometrik Yöntemler
3.5.1.1. CUPRAC Yöntemi
• Normal Metod
Bir deney tübü içerisine sırasıyla 1 mL 1.0 x 10-2 M Cu(II) klorür çözeltisi, 1 mL 1 M
amonyum asetat tampon (pH 7) çözeltisi, 1 mL 7.5 x 10-3 M neokuproin çözeltisi ilave
edildi. Daha sonra x mL antioksidan çözeltisinden ve son olarak (1,1 – x) mL distile su
ilave edilerek çözeltiler karıştırıldı. Tüpler oda sıcaklığında ağzı kapalı olarak 30 dakika
bekletildi. Süre sonunda çözeltilerin içinde örnek bulunmayan referans çözeltiye karşı
450 nm’deki absorbansları ölçüldü [36].
Mirisetin için 3.66 x 10-6 M – 1.34 x 10-5 M, izokuersitrin için 1.83 x 10-6 M – 1.65 x
10-5 M, luteolin için 2.33 x 10-6 M – 2.09 x 10-5 M, kamferol için 4.88 x 10-6 M – 4.39 x
10-5 M, apigenin için 1.83 x 10-5 M – 6.70 x 10-5 M, rozmarinik asit için 1.83 x 10-6 M –
6.70 x 10-6 M, kuersetin için 1.95 x 10-6 M – 9.76 x 10-6 M, askorbik asit için 9.76 x 10-6
M – 4.88 x 10-5 M derişim aralığında çalışılarak normal metod uygulandı. Kalibrasyon
doğruları oluşturulup, molar absorplama katsayıları hesaplandı.
Sentetik karışım-1, sentetik karışım-2 çözeltilerine ve bunların 2 saat ile 4 saat hidroliz
işlemi uygulanmış çözeltilerine yöntem uygulanıp antioksidan kapasite değerleri
hesaplandı.
44
Bitki ekstraktları ve demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltileri % 50 etanol ile uygun
oranlarda seyreltilerek; bitki ekstrakt hidrolizatları, katı bitki hidrolizatları ve
demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltilerinin hidrolizatlarından antioksidan
kapasitesi düşük olanlar (maydanoz, kereviz yaprağı, ısırgan) 2 M NaOH ile
nötralleştirildikten sonra % 50 etanol ile, kapasitesi yüksek olanlar ise (kekik, ıhlamur,
nane, mercanköşk, arslanpençesi, adaçayı, civanperçemi ve dereotu) doğrudan % 50
etanol ile uygun oranlarda seyreltilerek normal metod uygulandı ve toplam antioksidan
kapasiteleri hesaplandı.
• İnkübasyonlu Metod
Normal metoda göre hazırlanmış çözeltiler ağızları kapatılarak 50 oC’lik su banyosunda
20 dakika bekletilerek inkübe edildi. Süre sonunda tüpler soğuk su içinde birkaç dakika
soğutuldu. Tüplerin ağızları açılıp tekrar karıştırıldıktan sonra içinde örnek bulunmayan
referans çözeltiye karşı 450 nm’deki absorbansları ölçüldü [36].
3.5.1.2. ABTS-Persülfat Yöntemi
Bir deney tübü içerisine sırasıyla; (4 – x) mL etanol ve x mL antioksidan çözeltisinden
ilave edildi. Bu şekilde hazırlanan örnek çözeltileri ve sadece 4 mL etanol içeren çözelti
üzerine (radikal çözeltisi) 15’şer saniye aralıklarla 1 mL 1:10 oranında etanolle
seyreltilmiş ABTS radikal çözeltisinden katıldı. Çözeltiler karıştırılıp, 6. dakika
sonunda etanole karşı 734 nm’deki absorbansları ölçüldü. Radikal çözeltisinin
absorbansından, örnek içeren çözeltinin absorbansı çıkarılarak ∆A absorbans değerleri
hesaplandı [40].
Mirisetin için 2.00 x 10-6 M – 1.00 x 10-5 M, izokuersitrin için 6.00 x 10-6 M – 3.00 x
10-5 M, luteolin için 3.82 x 10-6 M – 1.91 x 10-5 M, kamferol için 8.00 x 10-6 M – 4.00 x
10-5 M, apigenin için 1.00 x 10-5 M – 5.00 x 10-5 M, rozmarinik asit için 4.00 x 10-6 M –
2.00 x 10-5 M, kuersetin için 1.60 x 10-6 M – 8.00 x 10-6 M, askorbik asit için 8.00 x 10-6
M – 4.00 x 10-5 M derişim aralığında ABTS yöntemi uygulanıp, derişime karşı ∆A
değerleri kaydedilmek suretiyle kalibrasyon doğruları oluşturularak molar absorbsiyon
katsayıları hesaplandı.
45
Sentetik karışım-1, sentetik karışım-2 çözeltilerine ve bunların 2 saat ile 4 saat hidroliz
işlemi uygulanmış çözeltilerine yöntem uygulanıp antioksidan kapasite değerleri
hesaplandı.
Bitki ekstraktları, demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltileri, bitki ekstrakt
hidrolizatları, katı bitki hidrolizatları ve demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltilerinin
hidrolizatlarından % 50 etanol ile uygun oranlarda seyreltilerek yöntem uygulandı ve
toplam antioksidan kapasiteleri hesaplandı.
3.5.2. Kromatografik Analizler
3.5.2.1. HPLC Analizi
HPLC analizlerinde iki elüsyon programı kullanıldı.
• Polifenolik bileşiklerin analizi için geliştirilen HPLC metodunda;
Metanol (A) ve % 0.2 o-H3PO4 içeren bidistile su (B) ikili çözücü sisteminden oluşan
hareketli fazın gradient elüsyonu uygulandı. Bunun için 280 nm’de pik dedeksiyonuyla
ve 1 mL/dakika akış hızıyla;
8 dakika % 7 (A) , eğim (0.0); 8-13 dakika % 30 (A), eğim (–4.0); 13-48 dakika % 66
(A), eğim (1.0); 48-55 dakika % 75 (A), eğim (–4.0) gradient elüsyon kullanıldı.
Bu elüsyon metodu ile,
Gallik asit, kateşin, klorojenik asit, kafeik asit, ferulik asit, p-kumarik asit, naringin,
naringenin, hesperidin, hesperetin, rutin, kuersetin, mirisetin, rozmarinik asit, kamferol,
luteolin, ve apigenin için 4 x 10-5 – 5 x 10-4 M; izokuersitrin için 4 x 10-5 – 3 x 10-4 M
derişim aralığında çalışılarak kalibrasyon doğruları oluşturuldu.
% 70 metanolde çözülerek hazırlanan tannik asit çözeltisi, bu çözeltinin 80 oC’de 2 saat
hidroliz edilen çözeltisi ve 1.5 x 10-3 M 80 oC’de 2 saat hidroliz edilen rozmarinik asit
çözeltisi analizlendi.
Bitki ekstraktları, demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltileri, bitki ekstrakt
hidrolizatları, katı bitki hidrolizatları ve demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltilerinin
hidrolizatları analizlendi, kalitatif ve kantitatif değerlendirmeleri yapıldı.
46
• Askorbik asit analizi için;
Metanol (A) ve % 0.2 o-H3PO4 içeren bidistile su (B) ikili çözücü sisteminden oluşan
hareketli fazın izokratik elüsyonu uygulandı. 215 nm’de 1 mL/dakika akış hızıyla;
8 dakika % 7 (A) , eğim (0.0) izokratik elüsyonu kullanıldı.
Bu elüsyon metodu ile;
1 x 10-4 – 1 x 10-3 M derişim aralığında çalışılarak askorbik asit kalibrasyonu
oluşturuldu.
Yaş maydanozun m-fosforik asitli ekstraktında askorbik asit analizi yapıldı.
Çalışılan her bitki örneğinin enjeksiyonu öncesinde 10 dakika metanolle kolonu yıkama
ve 10 dakika % 7 (A): % 93 (B) ile kolonu dengeleme işlemi gerçekleştirildi.
47
4. BULGULAR
4.1. BAZI ANTİOKSİDANLARIN KALİBRASYON DOĞRULARI VE Cu(I)-Nc
KELATININ GÖRÜNÜR BÖLGE SPEKTRUMLARI
CUPRAC yöntemi ile daha önceden çalışılmamış mirisetin, izokuersitrin, luteolin,
kamferol, apigenin ve rozmarinik asit standart antioksidanlarına normal metod ve
inkübasyonlu metod uygulanarak doğru denklemleri oluşturulmuş ve CUPRAC normal
yöntemle kalibrasyon doğruları çizilmiştir.
Ayrıca mirisetin, izokuersitrin, luteolin, kamferol ve rozmarinik asit için normal
yöntemle, apigenin için inkübasyonlu yöntemle elde edilen Cu(I)-Nc kelatının görünür
bölge spektrumları çizilerek aşağıda gösterilmiştir.
Doğru denklemlerinde verilen; x: derişim, y: absorbans ve r: korelasyon katsayısı
karşılığını ifade etmektedir.
48
4.1.1. Mirisetin
Tablo 4.1. Mirisetin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri
DERİŞİM
(mol L-1)
CUPRACN
ABSORBANSI
CUPRACİ
ABSORBANSI
3.66 x 10-6 0.2293 0.3629
6.10 x 10-6 0.4141 0.5871
8.54 x 10-6 0.5855 0.7922
1.10 x 10-5 0.7471 1.0277
1.34 x 10-5 0.9336 1.2285
(CUPRACN) Doğru Denklemi: y = 7.14 x 104 x – 0.028 r = 0.9997
(CUPRACİ) Doğru Denklemi: y = 8.91 x 104 x + 0.039 r = 0.9998
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 3 6 9 12 15
Derişim x 106 M
Ab
so
rb
an
s
Şekil 4.1: Mirisetinin kalibrasyon doğrusu
Şekil 4.2: Mirisetinin CUPRACN spektrumu
49
4.1.2. İzokuersitrin
Tablo 4.2: İzokuersitrin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri
DERİŞİM
(mol L-1)
CUPRACN
ABSORBANSI
CUPRACİ
ABSORBANSI
1.83 x 10-6 0.1148 0.1542
5.49 x 10-6 0.2968 0.4126
9.15 x 10-6 0.5057 0.6624
1.28 x 10-5 0.6816 0.9025
1.65 x 10-5 0.8834 1.1360
(CUPRACN) Doğru Denklemi: y = 5.24 x 104 x + 0.016 r = 0.9997
(CUPRACİ) Doğru Denklemi: y = 6.69 x 104 x + 0.041 r =0.9997
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 3 6 9 12 15 18
Derişim x 106 M
Ab
so
rb
an
s
Şekil 4.3: İzokuersitrinin kalibrasyon doğrusu
Şekil 4.4: İzokuersitrinin CUPRACN spektrumu
50
4.1.3. Luteolin
Tablo 4.3: Luteolin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri
DERİŞİM
(mol L-1)
CUPRACN
ABSORBANSI
CUPRACİ
ABSORBANSI
2.33 x 10-6 0.1285 0.1681
6.99 x 10-6 0.3613 0.4497
1.16 x 10-5 0.5922 0.7355
1.63 x 10-5 0.8086 1.0019
2.09 x 10-5 1.0301 1.2512
(CUPRACN) Doğru Denklemi: y = 4.84 x 104 x + 0.021 r = 0.9998
(CUPRACİ) Doğru Denklemi: y = 5.85 x 104 x + 0.041 r = 0.9996
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 4 8 12 16 20 24
Derişim x 106 M
Ab
so
rb
an
s
Şekil 4.5: Luteolinin kalibrasyon doğrusu
Şekil 4.6: Luteolinin CUPRACN spektrumu
51
4.1.4. Kamferol
Tablo 4.4: Kamferol için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri
DERİŞİM
(mol L-1)
CUPRACN
ABSORBANSI
CUPRACİ
ABSORBANSI
4.88 x 10-6 0.1518 0.2213
1.46 x 10-5 0.4325 0.5945
2.44 x 10-5 0.6781 0.9499
3.41 x 10-5 0.8955 1.2620
4.39 x 10-5 1.1221 -----
(CUPRACN) Doğru Denklemi: y = 2.46 x 104 x + 0.055 r = 0.9986
(CUPRACİ) Doğru Denklemi: y = 3.57 x 104 x + 0.061 r = 0.9992
0
0,3
0,6
0,9
1,2
0 1 2 3 4 5
Derişim x 105 M
Ab
so
rb
an
s
Şekil 4.7: Kamferolün kalibrasyon doğrusu
Şekil 4.8: Kamferolün CUPRACN spektrumu
52
4.1.5. Apigenin
Tablo 4.5: Apigenin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri
DERİŞİM
(mol L-1)
CUPRACN
ABSORBANSI
CUPRACİ
ABSORBANSI
1.83 x 10-5 0.1210 0.3635
3.05 x 10-5 0.1793 0.5361
4.27 x 10-5 0.2401 0.7233
5.49 x 10-5 0.2935 0.9402
6.70 x 10-5 0.3435 1.0879
(CUPRACN) Doğru Denklemi: y = 4.59 x 103 x + 0.039 r = 0.9993
(CUPRACİ) Doğru Denklemi: y = 1.52 x 104 x + 0.081 r = 0.9987
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0 1 2 3 4 5 6 7
Derişim x 105 M
Ab
so
rb
an
s
Şekil 4.9: Apigeninin kalibrasyon doğrusu
Şekil 4.10: Apigeninin CUPRACİ spektrumu
53
4.1.6. Rozmarinik Asit
Tablo 4.6: Rozmarinik asit için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri
DERİŞİM
(mol L-1)
CUPRACN
ABSORBANSI
CUPRACN
ABSORBANSI
1.83 x 10-6 0.1740 0.2084
3.05 x 10-6 0.2905 0.3519
4.27 x 10-6 0.4132 0.4948
5.49 x 10-6 0.5197 0.6241
6.70 x 10-6 0.6341 0.7560
(CUPRACN) Doğru Denklemi: y = 9.43 x 104 x + 0.003 r = 0.9998
(CUPRACİ) Doğru Denklemi: y = 1.12 x 105 x + 0.008 r = 0.9997
0
0,2
0,4
0,6
0 1 2 3 4 5 6 7
Derişim x 106 M
Ab
so
rb
an
s
Şekil 4.11: Rozmarinik asitin kalibrasyon doğrusu
Şekil 4.12: Rozmarinik asitin CUPRACN spektrumu
54
4.2. BAZI ANTİOKSİDANLARIN MOLAR ABSORPLAMA KATSAYILARI VE
TEAC DEĞERLERİ
Mirisetin, izokuersitrin, luteolin, kamferol, apigenin, rozmarinik asit, kuersetin ve
askorbik asit standart antioksidanlarına uygulanan CUPRAC normal ve inkübasyonlu
yöntem ve ABTS-Persülfatlı yöntem sonrasında, absorbans ve derişim arasında çizilen
kalibrasyon grafiğinin eğiminden molar absorplama katsayıları (ε) bulunarak, bu
değerin troloksun molar absorplama katsayısına bölünmesiyle elde edilen troloks
eşdeğeri antioksidan kapasiteleri (TEAC) hesaplanmıştır.
Yöntemde daha önceden çalışılan troloks, gallik asit, kateşin, klorojenik asit, kafeik asit,
p-kumarik asit, ferulik asit, naringin, naringenin, hesperidin, hesperetin, rutin için
hesaplanan molar absorplama katsayıları ve TEAC değerleri kullanılmıştır [36].
Tablo 4.7’de çeşitli antioksidanların CUPRAC yöntemi ile elde edilen, Tablo 4.8’de
ABTS yöntemi ile elde edilen molar absorplama katsayıları ve doğrusal aralıkları ve
Tablo 4.9’da çeşitli antioksidanların CUPRAC ve ABTS yöntemlerine göre elde edilen
TEAC değerleri görülmektedir.
Tablo 4.7: Çeşitli antioksidanların CUPRAC yöntemi ile elde edilen molar absorplama katsayıları ve doğrusal aralıkları
MOLAR ABSORPLAMA KATSAYISI
(ε) Lmol-1cm-1 ANTİOKSİDAN
CUPRACN CUPRACİ
DOĞRUSAL ARALIK
(mol L-1)
Troloks 1.67 x 104 1.86 x 104 2.60 x 10-6 – 7.50 x 10-5
Mirisetin 7.14 x104 8.91 x 104 3.66 x 10-6 – 1.34 x 10-5
Luteolin 4.84 x104 5.85 x104 2.33 x 10-6 – 2.09 x 10-5
Kamferol 2.46 x104 3.57 x104 4.88 x 10-6 – 4.39 x 10-5
Apigenin 4.59 x103 1.52 x104 1.83 x 10-5 – 6.70 x 10-5
İzokuersitrin 5.24 x104 6.69 x104 1.83 x 10-6 – 1.65 x 10-5
Rozmarinik Asit 9.43 x104 1.12 x105 1.83 x 10-6 – 6.70 x 10-6
55
Tablo 4.8: Çeşitli antioksidanların ABTS yöntemi ile elde edilen molar absorplama katsayıları ve doğrusal aralıkları
Tablo 4.9: Çeşitli antioksidanların CUPRAC ve ABTS yöntemlerine göre elde edilen TEAC değerleri
ANTİOKSİDAN
MOLAR
ABSORPLAMA
KATSAYISI
(ε) Lmol-1cm-1
DOĞRUSAL ARALIK
(mol L-1)
Troloks 2.60 x 104 5.00 x 10-6 – 3.00 x 10-5
Mirisetin 8.93 x104 2.00 x 10-6 – 1.00 x 10-5
Luteolin 2.63 x104 3.82 x 10-6 – 1.91 x 10-5
Kamferol 2.25 x104 8.00 x 10-6 – 4.00 x 10-5
Apigenin 1.69 x104 1.00 x 10-5 – 5.00 x 10-5
İzokuersitrin 2.63 x104 6.00 x 10-6 – 3.00 x 10-5
Rozmarinik Asit 5.99 x104 4.00 x 10-6 – 2.00 x 10-5
TEACCUPRAC
ANTİOKSİDAN TEACN TEACI
TEACABTS
Mirisetin 4.27 4.79 3.43
Kuersetin 5.49 5.57 3.21
Kamferol 1.47 1.92 0.86
Rutin 2.56 2.56 1.15
İzokuersitrin 3.14 3.60 1.01
Apigenin 0.27 0.82 0.65
Luteolin 2.90 3.14 1.01
Kateşin 3.09 3.56 3.14
Naringin 0.02 0.13 0.62
Naringenin ---- 2.28 0.64
Hesperidin 0.97 1.11 1.40
Hesperetin 0.99 1.05 1.11
Gallik asit 2.62 3.48
Rozmarinik Asit 5.65 6.02 2.30
Ferulik asid 1.20 1.23 2.16
p-Kumarik asid 0.55 1.00 1.63
Kafeik asid 2.89 2.96 1.39
Klorojenik asid 2.47 2.72 1.21
Askorbik asid 1.06 1.34 1.15
56
4.3. HPLC İLE ANTİOKSİDANLARIN KALİBRASYON DOĞRULARININ
OLUŞTURULMASI
Tablo 4.10’da belirtilen standart antioksidanların HPLC’de geliştirilen metodla elde
edilen alıkonma zamanları ve pik alanları ile derişim arasında çizilen doğru denklemleri
görülmektedir.
Tabloda verilen tR : Alıkonma Zamanı, y: Pik Alanı, c: Derişim ve r: Korelasyon
katsayısını ifade etmektedir.
Tablo 4.10: Çeşitli antioksidanların HPLC ile elde edilen doğru denklemleri ve alıkonma zamanları
Antioksidan tR
(dakika)
Doğrusal Aralık
(mol L-1) Doğru Denklemi
(r)
Askorbik Asit 3.55 1 x 10-4 – 1 x 10-3 y = 3.16 x 109 c + 16794 0.9999
Gallik Asit 12.96 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 9.04 x 109 c + 73233 0.9997
Kateşin 18.11 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 3.79 x 109 c + 4474 0.9997
Klorojenik Asit 20.19 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 9.00 x 109 c + 37950 0.9996
Kafeik Asit 22.72 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 9.44 x 109 c + 69934 0.9999
p-kumarik Asit 28.00 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 1.48 x 1010 c + 30571 0.9999
Ferulik Asit 29.01 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 1.05 x 1010 c - 24807 0.9998
Rozmarinik Asit 31.17 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 9.49 x 109 c + 64341 0.9995
Naringin 32.25 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 1.69 x 1010 c + 9146 0.9999
Hesperidin 33.06 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 1.65 x 1010 c - 44514 0.9988
Rutin 34.99 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 8.79 x 109 c + 3687 0.9999
İzokuersitrin 34.99 4 x 10-5 – 3 x 10-4 y = 6.43 x 109 c + 55614 0.9991
Mirisetin 38.67 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 5.93 x 109 c - 42007 0.9996
Naringenin 42.95 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 1.47 x 1010 c + 5985 0.9999
Hesperetin 43.67 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 1.43 x 1010 c - 81556 0.9983
Kuersetin 44.41 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 9.12 x 109 c + 88516 0.9989
Luteolin 45.97 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 9.02 x 109 c - 79509 0.9990
Kamferol 48.90 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 7.23 x 109 c - 36137 0.9996
Apigenin 50.17 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 1.04 x 1010 c - 1727 0.9999
57
Şekil 4.13: Çeşitli standart antioksidanları içeren sentetik karışımın kromatogramı
1. pik: Askorbik Asit; 2.pik: Gallik Asit; 3. pik: Kateşin; 4. pik: Klorojenik Asit; 5.pik: Epikateşin; 6. pik: Kafeik Asit ; 7. pik: p-
kumarik Asit; 8. pik: Ferulik asit + Sinapik Asit; 9. pik: Naringin; 10. pik: Hesperidin; 11. pik: Rutin + İzokuersitrin; 12. pik:
Naringenin; 13. pik: Hesperetin; 14. pik: Kuersetin; 15. pik: Luteolin; 16 pik: Kamferol; 17. pik: Apigenin
Şekil 4.14: Rozmarinik asit standartının kromatogramı
58
Şekil 4.15: Mirisetin standartının kromatogramı
Şekil 4.15’de mirisetin standartının kromatogramı görülmektedir. Kalibrasyon doğrusu
1 numara ile gösterilen pike göre oluşturulmuştur.
Şekil 4.16: Askorbik asit standartının kromatogramı
Şekil 4.16’da görülen kromatogramda 1 numara ile belirtilen pik askorbik asite aittir.
Öncesinde gelen pik askorbik asitin çözünmesinde kullanılan m-fosforik asitin pikidir.
59
4.4. BİTKİ ANALİZLERİNİN SONUÇLARI
Bitki ekstraktları, ekstrakt hidrolizatları, katı bitki hidrolizatları, demlenerek hazırlanan
bitki örnek çözeltileri, demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltilerinin
hidrolizatlarından antioksidan kapasitesi spektrofotometrik olarak CUPRAC-normal,
CUPRAC-inkübasyonlu ve ABTS yöntemleri ile, antioksidan bileşenleri ise HPLC
uygulaması ile belirlenmiştir. HPLC’de pik alanlarıyla madde derişimleri arasında
çizilen kalibrasyon doğruları yardımıyla, bitki örneklerinin bireysel antioksidan
içerikleri bulunmuştur. Derişimler bileşenlerin TEAC değerleri ile çarpılmış ve örnek
içinde bileşenlerin kuramsal olarak göstermesi gereken kapasiteler belirlenmiştir.
Bileşenlerin hesaplanan kapasiteleri toplanarak, bitkinin toplam antioksidan kapasitesi
hesaplanmıştır. Bu şekilde HPLC verilerinden toplam antioksidan kapasite hesabına
geçilmiştir. Tablo 4.11 - 4.23’de gösterilen HPLC-CUPRACN, HPLC-CUPRACİ ve
HPLC-ABTS ifadeleri HPLC’de belirlenen derişimlerin sırasıyla CUPRAC-normal,
CUPRAC-inkübasyonlu ve ABTS yöntemindeki TEAC katsayıları kullanılarak
hesaplanan kapasiteyi ifade etmektedir. Hesaplanan bu kapasite değerleri hem
kromatografik hem de spektrofotometrik verilere dayandığından bunları ifade ederken
her iki enstrümental tekniğin sembolleri kullanılmıştır.
(Antioksidan Kapasite)Toplam = i=1
C∑ i
n
TEACi (2.17)
(ci : i- bileşeninin HPLC yoluyla bulunan derişimini; TEACi : i- bileşeninin seçilen
kapasite ölçüm yöntemine göre TEAC katsayısını ifade etmektedir.)
4.4.1. Maydanoz ( Petroselinum sativum )
Şekil 4.17-4.19 olarak belirtilen spektrumlarda; çeşitli çözücü ve oranları ile ekstrakte
edilen maydanoz örneklerinin spektrumları görülmektedir.
60
Şekil 4.17: Metanolün farklı oranları ve sadece bidistile su ile ekstrakte edilmiş maydanoz örneklerinin spektrumu
Şekil 4.18: Etanolün farklı oranları ile ekstrakte edilmiş maydanoz örneklerinin spektrumu
Şekil 4.19: Asetonun farklı oranları ile ekstrakte edilmiş maydanoz örneklerinin spektrumu
61
Şekil 4.20 - 4.26 ile gösterilen kromatogramlarda çeşitli çözücü ve oranları ile ekstrakte
edilen maydanoz örneklerinin kromatogramları görülmektedir.
Şekil 4.20: %100 metanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı
Şekil 4.21: %70 metanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı
Şekil 4.22: % 50 metanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı
62
Şekil 4.23: % 100 bidistile su ile ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı
Şekil 4.24: % 100 etanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı
Şekil 4.25: % 70 etanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı
63
Şekil 4.26: % 50 etanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı
Şekil 4.27 ve 4.28’de; maydanoz örneklerinin 2 saat ve 4 saat hidroliz edilmesi sonucu
elde edilen hidrolizatların kromatogramları görülmektedir. Maydanoz hidrolizatlarının
HPLC analizlerinde standart madde katkısı yapılarak; p-kumarik asit, mirisetin ve
apigenin belirlenmiştir.
Şekil 4.27: % 70 metanollü maydanoz ekstraktının 2 ve 4 saat hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramları
1. pik: p-kumarik asit; 2. pik: mirisetin; 3. pik: apigenin
64
Şekil 4.28: Kurutulmuş maydanoz örneklerine uygulanan 2 ve 4 saat hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramları
1. pik: p-kumarik asit; 2. pik: mirisetin; 3. pik: apigenin
Yaş maydanozda askorbik asit analizi için yapılan çalışmada elde edilen kromatogram
Şekil 4.29’da görülmektedir.
Şekil 4.29: Yaş maydanozda askorbik asit analizi sonucu elde edilen kromatogram
1.pik: askorbik asit
Tablo 4.11’de maydanoz örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri
görülmektedir.
65
Tablo 4.11: Maydanoz örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)
ÖRNEK CUPRACN CUPRACİ ABTS HPLC
(CUPRACN)
HPLC
(CUPRACİ)
HPLC
(ABTS)
% 100 Metanollü Ekstrakt
% 70 Metanollü Ekstrakt
% 50 Metanollü Ekstrakt
% 100 Sulu Ekstrakt
% 100 Etanollü Ekstrakt
%70 Etanollü Ekstrakt
%50 Etanollü Ekstrakt
% 100 Asetonlu Ekstrakt
% 70 Asetonlu Ekstrakt
% 50 Asetonlu Ekstrakt
% 50 Met. Eks. 4 saat Hid.
% 70 Met. Eks. 2 saat Hid.
% 70 Met. Eks. 4 saat Hid.
Katı Bitki 2 saat Hidrolizatı
Katı Bitki 4 saat Hidrolizatı
m-fosforik Asitli Ekstrakt
0,094
0,049
0,036
0,023
0,068
0,084
0,055
0,054
0,095
0,053
0,033
0,056
0,058
0,082
0,093
0,016
0,112
0,079
0,059
0,054
0,087
0,113
0,089
0,068
0,131
0,093
0,063
0,099
0,104
0,166
0,193
0,023
0,035
0,040
0,038
0,044
0,030
0,062
0,075
0,037
0,062
0,069
0,014
0,011
0,012
0,022
0,021
7.95 x 10-3
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0,023
0,043
0,034
0,049
0,035
8.44 x 10-3
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0,033
0,067
0,062
0,074
0,068
0,011
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0,024
0,051
0,049
0,056
0,054
9.16 x 10-3
4.4.2. Kereviz Yaprağı ( Apium graveolens )
Şekil 4.30’da çeşitli çözücü ve oranları ile ekstrakte edilen kereviz yaprağı örneklerinin
spektrumu görülmektedir.
Şekil 4.30: Çeşitli çözücü ve oranları ile ekstrakte edilmiş kereviz yaprağı örneklerinin
spektrumu
66
Şekil 4.31 - 4.33 ile gösterilen kromatogramlarda çeşitli çözücü ve oranları ile ekstrakte
edilen kereviz yaprağı örneklerinin kromatogramları görülmektedir.
Şekil 4.31: % 70 metanolle ekstrakte edilmiş kereviz yaprağı kromatogramı
Şekil 4.32: % 50 metanolle ekstrakte edilmiş kereviz yaprağı kromatogramı
Şekil 4.33: % 50 etanolle ekstrakte edilmiş kereviz yaprağı kromatogramı
67
Şekil 4.34’de kereviz yaprağı ekstrakt hidrolizatlarının ve katı bitki hidrolizatının
spektrumu görülmektedir.
Şekil 4.34: Kereviz yaprağı ekstrakt hidrolizatlarının ve kurutulmuş örnek hidrolizatının
spektrumu
Şekil 4.35 ve 4.36’da; kereviz yaprağı örneklerinin 4 saat hidroliz edilmesi sonucu elde
edilen hidrolizatların kromatogramları görülmektedir. Kereviz yaprağı hidrolizatlarının
HPLC analizlerinde standart madde katkısı yapılarak; klorojenik asit, mirisetin, luteolin
ve apigenin belirlenmiştir.
Şekil 4.35: % 70 metanollü kereviz yaprağı ekstraktının 4 saat hidroliz sonucu elde edilen
hidrolizat kromatogramı
1.pik: klorojenik asit; 2.pik: mirisetin; 3.pik: luteolin; 4.pik: apigenin
68
Şekil 4.36: Kurutulmuş kereviz yaprağına doğrudan uygulanan 4 saat hidroliz sonucu elde
edilen hidrolizat kromatogramı
1.pik: klorojenik asit; 2.pik: mirisetin; 3.pik: luteolin; 4.pik: apigenin
Tablo 4.12’de kereviz yaprağı örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri
görülmektedir.
Tablo 4.12: Kereviz yaprağı örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)
ÖRNEK CUPRACN CUPRACİ ABTS HPLC
(CUPRACN)
HPLC
(CUPRACİ)
HPLC
(ABTS)
% 70 Metanollü Ekstrakt
% 50 Metanollü Ekstrakt
% 50 Etanollü Ekstrakt
% 70 Met. Eks. Hidrolizatı
% 50 Met. Eks. Hidrolizatı
% 50 Eta. Eks. Hidrolizatı
Katı Bitki Hidrolizatı
0,148
0,135
0,138
0,141
0,140
0,151
0,179
0,180
0,176
0,179
0,169
0,164
0,178
0,229
0,087
0,086
0,090
0,096
0,099
0,094
0,133
-
-
-
0,067
0,057
0,061
0,069
-
-
-
0,097
0,083
0,092
0,095
-
-
-
0,053
0,046
0,049
0,049
Maydanoz ve kereviz yaprağında çeşitli organik çözücü oranları ile ekstraksiyon
yapılmış, gerek spektrofotometrik gerekse kromatografik çalışmalarda en uygun
çözücünün % 70’lik metanol olduğuna karar verilmiştir. Bundan dolayı diğer bitki
örnekleri % 70 metanol ile ekstrakte edilmiştir. % 70 metanollü ekstrakt hidrolizatları
ve katı örnek hidrolizatlarının kromatogramları değerlendirildiğinde belirlenen bileşen
69
açısından farklılık olmadığı için bundan sonra belirtilen bitkilerde katı bitki örneklerinin
hidrolizat kromatogramları verilmiştir.
4.4.3. Nane ( Mentha piperita )
Şekil 4.37’de % 70 metanollü nane ekstraktının ve Şekil 4.38’de katı nane hidrolizatının
kromatogramı görülmektedir. Nane ekstraktının HPLC analizlerinde standart madde
katkısı yapılarak rozmarinik asit; hidrolizatlarında ise kafeik asit, rozmarinik asit ve
luteolin belirlenmiştir.
Şekil 4.37: % 70 metanolle ekstrakte edilmiş nane kromatogramı
1.pik: rozmarinik asit
Şekil 4.38: Kurutulmuş naneye doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat
kromatogramı
1.pik: kafeik asit; 2.pik: rozmarinik asit; 3.pik: luteolin
70
Şekil 4.39’da % 70 metanol ile ekstrakte edilmiş nane ekstraktının, ekstrakt
hidrolizatının ve katı bitki hidrolizatının spektrumu görülmektedir.
Şekil 4.39: Nane ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu
Şekil 4.40 - 4.42’de demlenerek hazırlanan nane çözeltisinin, bu çözeltinin sadece asit
ile olan hidrolizi ve asit+metanol ile hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizatların
kromatogramları görülmektedir.
Şekil 4.40: Demlenerek hazırlanan nane çözeltisinin kromatogramı
71
Şekil 4.41: Demlenerek hazırlanan nane çözeltisinin sadece asit ile hidrolizi sonucu elde edilen
hidrolizat kromatogramı
Şekil 4.42: Demlenerek hazırlanan nane çözeltisinin asit+metanol ile hidrolizi sonucu elde
edilen hidrolizat kromatogramı
Tablo 4.13’de nane örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri görülmektedir.
Tablo 4.13: Nane örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)
ÖRNEK CUPRACN CUPRACİ ABTS HPLC
(CUPRACN)
HPLC
(CUPRACİ)
HPLC
(ABTS)
% 70 Metanollü Ekstrakt
% 70 Met. Eks. Hidrolizatı
Katı Bitki Hidrolizatı
Demleme Çözeltisi
Dem. Çöz. Asit ile Hid.
Dem. Çöz. Asit+Met. Hid.
0,391
0,366
0,598
0,346
0,362
0,354
0,402
0,468
0,742
0,421
0,421
0,468
0,183
0,177
0,252
0,054
0,156
0,160
0,245
0,058
0,088
-
-
-
0,261
0,061
0,094
-
-
-
0,099
0,024
0,037
-
-
-
72
4.4.4. Isırgan ( Urtica dioica )
Şekil 4.43’de % 70 metanollü ısırgan ekstraktının; Şekil 4.44’de katı ısırgan
hidrolizatının kromatogramı görülmektedir. Isırgan ekstraktının HPLC analizlerinde
standart madde katkısı yapılarak kateşin ve klorojenik asit; hidrolizatlarında ise kafeik
asit ve klorojenik asit belirlenmiştir.
Şekil 4.43: % 70 metanolle ekstrakte edilmiş ısırgan kromatogramı
1.pik: kateşin; 2. pik: klorojenik asit
Şekil 4.44: Kurutulmuş ısırgana doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat
kromatogramı
1.pik: klorojenik asit; 2.pik: kafeik asit
73
Şekil 4.45’de % 70 metanol ile ekstrakte edilmiş ısırgan ekstraktının, ekstrakt
hidrolizatının ve katı bitki hidrolizatının spektrumu görülmektedir.
Şekil 4.45: Isırgan ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu
Tablo 4.14’de ısırgan örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri görülmektedir.
Tablo 4.14: Isırgan örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)
ÖRNEK CUPRACN CUPRACİ ABTS HPLC
(CUPRACN)
HPLC
(CUPRACİ)
HPLC
(ABTS)
% 70 Metanollü Ekstrakt
% 70 Met. Eks. Hidrolizatı
Katı Bitki Hidrolizatı
Demleme Çözeltisi
Dem. Çöz. Asit ile Hid.
Dem. Çöz. Asit+Met. Hid.
0,076
0,077
0,186
0,050
0,072
0,078
0,097
0,094
0,247
0,081
0,103
0,116
0,058
0,060
0,170
0,036
0,027
0,027
0,062
0,017
0,017
-
-
-
0,069
0,018
0,018
-
-
-
0,038
8.32 x 10-3
8.38 x 10-3
-
-
-
4.4.5. Adaçayı ( Salvia triloba )
Şekil 4.46’da % 70 metanollü adaçayı ekstraktının, Şekil 4.47’de katı adaçayı
hidrolizatının kromatogramı görülmektedir. Adaçayı ekstraktının HPLC analizlerinde
standart madde katkısı yapılarak naringin, rozmarinik asit ve mirisetin; hidrolizatlarında
ise kafeik asit, rozmarinik asit, mirisetin, naringenin, luteolin ve apigenin belirlenmiştir.
74
Şekil 4.46: % 70 metanolle ekstrakte edilmiş adaçayı kromatogramı
1.pik: naringin; 2.pik: rozmarinik asit; 3.pik: mirisetin
Şekil 4.47: Kurutulmuş adaçayına doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat
kromatogramı
1.pik: kafeik asit; 2.pik: rozmarinik asit; 3.pik: mirisetin; 4.pik: naringenin; 5.pik: luteolin; 6.pik: apigenin
Şekil 4.48’de % 70 metanol ile ekstrakte edilmiş adaçayı ekstraktının, ekstrakt
hidrolizatının ve katı bitki hidrolizatının spektrumu görülmektedir.
75
Şekil 4.48: Adaçayı ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu
Şekil 4.49-4.51’de demlenerek hazırlanan adaçayı çözeltisinin, bu çözeltinin sadece asit
ile olan hidrolizi ve asit+metanol ile hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizatların
kromatogramları görülmektedir.
Şekil 4.49: Demlenerek hazırlanan adaçayı çözeltisinin kromatogramı
76
Şekil 4.50: Demlenerek hazırlanan adaçayı çözeltisinin sadece asit ile hidrolizi sonucu elde
edilen hidrolizat kromatogramı
Şekil 4.51: Demlenerek hazırlanan adaçayı çözeltisinin asit+metanol ile hidrolizi sonucu elde
edilen hidrolizat kromatogramı
Tablo 4.15: Adaçayı örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)
ÖRNEK CUPRACN CUPRACİ ABTS HPLC
(CUPRACN)
HPLC
(CUPRACİ)
HPLC
(ABTS)
% 70 Metanollü Ekstrakt
% 70 Met. Eks. Hidrolizatı
Katı Bitki Hidrolizatı
Demleme Çözeltisi
Dem. Çöz. Asit ile Hid.
Dem. Çöz. Asit+Met. Hid.
0,504
0,458
0,726
0,349
0,414
0,416
0,526
0,541
0,875
0,425
0,484
0,515
0,238
0,317
0,468
0,154
0,104
0,105
0,168
0,089
0,121
-
-
-
0,180
0,103
0,138
-
-
-
0,081
0,050
0,068
-
-
-
77
4.4.6. Ihlamur ( Tilia rubra )
Şekil 4.52’de % 70 metanollü ıhlamur ekstraktının, Şekil 4.53’de katı ıhlamur
hidrolizatının kromatogramı görülmektedir.
Şekil 4.52: % 70 metanolle ekstrakte edilmiş ıhlamur kromatogramı
Ihlamur hidrolizatlarının HPLC analizlerinde standart madde katkısı yapılarak kafeik
asit, mirisetin, kuersetin ve kamferol belirlenmiştir.
Şekil 4.53: Kurutulmuş ıhlamura doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı
1.pik: kafeik asit; 2.pik: mirisetin; 3.pik: kuersetin; 4.pik: kamferol
78
Şekil 4.54’de % 70 metanol ile ekstrakte edilmiş ıhlamur ekstraktının, ekstrakt
hidrolizatının ve katı bitki hidrolizatının spektrumu görülmektedir.
Şekil 4.54: Ihlamur ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu
Tablo 4.16’da ıhlamur örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri
görülmektedir.
Tablo 4.16: Ihlamur örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)
ÖRNEK CUPRACN CUPRACİ ABTS HPLC
(CUPRACN)
HPLC
(CUPRACİ)
HPLC
(ABTS)
% 70 Metanollü Ekstrakt
% 70 Met. Eks. Hidrolizatı
Katı Bitki Hidrolizatı
0,616
0,758
0,680
0,734
0,928
0,835
0,375
0,267
0,258
-
0,136
0,067
-
0,142
0,070
-
0,082
0,039
4.4.7. Arslanpençesi ( Alchemilla xantochlora )
Şekil 4.55’de % 70 metanollü arslanpençesi ekstraktının, Şekil 4.56’da katı
arslanpençesi hidrolizatının kromatogramı görülmektedir.
79
Şekil 4.55: % 70 metanolle ekstrakte edilmiş arslanpençesi kromatogramı
Arslanpençesi hidrolizatlarının HPLC analizlerinde standart madde katkısı yapılarak
klorojenik asit, kafeik asit, p-kumarik asit, mirisetin, kuersetin ve kamferol
belirlenmiştir.
Şekil 4.56: Kurutulmuş arslanpençesine doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı
1.pik: klorojenik asit; 2.pik: kafeik asit; 3.pik: p-kumarik asit; 4.pik: mirisetin; 5.pik: kuersetin; 6.pik: kamferol
Şekil 4.57’de % 70 metanol ile ekstrakte edilmiş arslanpençesi ekstraktının, ekstrakt
hidrolizatının ve katı bitki hidrolizatının spektrumu görülmektedir.
80
Şekil 4.57: Arslanpençesi ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu
Tablo 4.17’de arslanpençesi örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri
görülmektedir.
Tablo 4.17: Arslanpençesi örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)
ÖRNEK CUPRACN CUPRACİ ABTS HPLC
(CUPRACN)
HPLC
(CUPRACİ)
HPLC
(ABTS)
% 70 Metanollü Ekstrakt
% 70 Met. Eks. Hidrolizatı
Katı Bitki Hidrolizatı
1,230
1,010
1,610
1,520
1,240
1,930
0,766
0,591
0,798
-
0,121
0,156
-
0,135
0,173
-
0,092
0,117
4.4.8. Dereotu ( Anethum graveolens )
Şekil 4.58’de % 70 metanollü dereotu ekstraktının, Şekil 4.59’da katı dereotu
hidrolizatının kromatogramı görülmektedir.
81
Şekil 4.58: % 70 metanolle ekstrakte edilmiş dereotu kromatogramı
Dereotu hidrolizatlarının HPLC analizlerinde standart madde katkısı yapılarak mirisetin
ve kuersetin belirlenmiştir.
Şekil 4.59: Kurutulmuş dereotuna doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı
1.pik: mirisetin; 2.pik: kuersetin
Şekil 4.60’da % 70 metanol ile ekstrakte edilmiş dereotu ekstraktının, ekstrakt
hidrolizatının ve katı bitki hidrolizatının spektrumu görülmektedir.
82
Şekil 4.60: Dereotu ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu
Tablo 4.18: Dereotu örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)
ÖRNEK CUPRACN CUPRACİ ABTS HPLC
(CUPRACN)
HPLC
(CUPRACİ)
HPLC
(ABTS)
% 70 Metanollü Ekstrakt
% 70 Met. Eks. Hidrolizatı
Katı Bitki Hidrolizatı
0,103
0,132
0,268
0,129
0,146
0,368
0,049
0,100
0,118
-
0,039
0,059
-
0,042
0,063
-
0,027
0,041
4.4.9. Civanperçemi ( Achillea millefolium )
Şekil 4.61’de % 70 metanollü civanperçemi ekstraktının, Şekil 4.62’de katı
civanperçemi hidrolizatının kromatogramı görülmektedir.
Şekil 4.61: % 70 metanolle ekstrakte edilmiş civanperçemi kromatogramı
1.pik: klorojenik asit; 2.pik: kafeik asit; 3.pik: ferulik asit; 4.pik: naringin; 5.pik: mirisetin; 6.pik: luteolin
83
Civanperçemi ekstraktının HPLC analizlerinde standart madde katkısı yapılarak
klorojenik asit, kafeik asit, ferulik asit, naringin, mirisetin ve luteolin; hidrolizatlarında
ise klorojenik asit, kafeik asit, ferulik asit, mirisetin, naringenin, luteolin ve apigenin
belirlenmiştir.
Şekil 4.62: Kurutulmuş civanperçemine doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı
1.pik: klorojenik asit; 2.pik: kafeik asit; 3.pik: ferulik asit; 4. pik: mirisetin; 5.pik: naringenin; 6.pik: luteolin; 7.pik: apigenin
Şekil 4.63’te % 70 metanol ile ekstrakte edilmiş civanperçemi ekstraktının, ekstrakt
hidrolizatının ve katı bitki hidrolizatının spektrumu görülmektedir.
Şekil 4.63: Civanperçemi ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu
84
Tablo 4.19’da civanperçemi örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri
görülmektedir.
Tablo 4.19: Civanperçemi örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)
ÖRNEK CUPRACN CUPRACİ ABTS HPLC
(CUPRACN)
HPLC
(CUPRACİ)
HPLC
(ABTS)
% 70 Metanollü Ekstrakt
% 70 Met. Eks. Hidrolizatı
Katı Bitki Hidrolizatı
0,283
0,262
0,349
0,300
0,329
0,457
0,125
0,253
0,338
0,048
0,055
0,044
0,054
0,066
0,057
0,035
0,032
0,027
4.4.10. Mercanköşk ( Origanum majorona )
Şekil 4.64’de % 70 metanollü mercanköşk ekstraktının, Şekil 4.65’de katı mercanköşk
hidrolizatının kromatogramı görülmektedir.
Şekil 4.64: % 70 metanolle ekstrakte edilmiş mercanköşk kromatogramı
1.pik: kafeik asit; 2.pik: naringin; 3.pik: rozmarinik asit; 4.pik: mirisetin; 5.pik: luteolin
Mercanköşk ekstraktının HPLC analizlerinde standart madde katkısı yapılarak kafeik
asit, naringin, rozmarinik asit, mirisetin ve luteolin; hidrolizatlarında ise kafeik asit, p-
kumarik asit, rozmarinik asit, mirisetin, naringenin ve luteolin belirlenmiştir.
85
Şekil 4.65: Kurutulmuş mercanköşke doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı
1.pik: kafeik asit; 2.pik: p-kumarik asit; 3.pik: rozmarinik asit; 4.pik: mirisetin; 5.pik: naringenin; 6.pik: luteolin
Şekil 4.66’da % 70 metanol ile ekstrakte edilmiş mercanköşk ekstraktının, ekstrakt
hidrolizatının ve katı bitki hidrolizatının spektrumu görülmektedir.
Şekil 4.66: Mercanköşk ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu
Tablo 4.20: Mercanköşk örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)
ÖRNEK CUPRACN CUPRACİ ABTS HPLC
(CUPRACN)
HPLC
(CUPRACİ)
HPLC
(ABTS)
% 70 Metanollü Ekstrakt
% 70 Met. Eks. Hidrolizatı
Katı Bitki Hidrolizatı
0,616
0,555
0,821
0,640
0,688
0,994
0,341
0,360
0,495
0,377
0,068
0,107
0,410
0,083
0,124
0,177
0,036
0,056
86
4.4.11. Kekik ( Thymus vulgaris )
Şekil 4.67’de % 70 metanollü kekik ekstraktının, Şekil 4.68’de belirtilen katı kekik
hidrolizatının kromatogramı görülmektedir.
Şekil 4.67: % 70 metanolle ekstrakte edilmiş kekik kromatogramı
Kekik hidrolizatlarının HPLC analizlerinde standart madde katkısı yapılarak kafeik asit,
mirisetin ve luteolin belirlenmiştir.
Şekil 4.68: Kurutulmuş kekiğe doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı
1.pik: kafeik asit; 2.pik: mirisetin; 3.pik: luteolin
87
Şekil 4.69’da % 70 metanol ile ekstrakte edilmiş kekik ekstraktının, ekstrakt
hidrolizatının ve katı bitki hidrolizatının spektrumu görülmektedir.
Şekil 4.69: Kekik ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu
Tablo 4.21’de kekik örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri görülmektedir.
Tablo 4.21: Kekik örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)
ÖRNEK CUPRACN CUPRACİ ABTS HPLC
(CUPRACN)
HPLC
(CUPRACİ)
HPLC
(ABTS)
% 70 Metanollü Ekstrakt
% 70 Met. Eks. Hidrolizatı
Katı Bitki Hidrolizatı
0,890
0,900
1,420
1,100
1,010
1,650
0,483
0,467
1,010
-
0,040
0,064
-
0,044
0,071
-
0,027
0,044
4.5. SENTETİK KARIŞIMLARIN ANALİZ SONUÇLARI
4.5.1. Sentetik Karışım-1
Şekil 4.70’de sentetik karışım-1’in, Şekil 4.71’de sentetik karışım-1’in 2 saat hidroliz
sonrası; Şekil 4.72’de sentetik karışım-1’in 4 saat hidroliz sonrası kromatogramı
görülmektedir.
88
Şekil 4.70: Sentetik Karışım-1’in kromatogramı
1.pik: rozmarinik asit; 2.pik: izokuersitrin; 3.pik: mirisetin; 4. pik: luteolin; 5.pik: kamferol; 6.pik: apigenin
Şekil 4.71: Sentetik Karışım-1’in 2 saat hidrolizi sonucunda elde edilen hidrolizat kromatogramı
1.pik: rozmarinik asit; 2.pik: mirisetin; 3.pik: kuersetin; 4.pik: luteolin; 5.pik: kamferol; 6.pik: apigenin
Şekil 4.72: Sentetik Karışım-1’in 4 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı
1.pik: rozmarinik asit; 2.pik: mirisetin; 3.pik: kuersetin; 4.pik: luteolin; 5.pik: kamferol; 6.pik: apigenin
89
Tablo 4.22’de sentetik karışım-1 ve hidrolizatlarının hesaplanan toplam antioksidan
kapasite değerleri (mM TR-eşdeğeri) görülmektedir.
Tablo 4.22: Sentetik karışım-1 ve hidrolizatlarının toplam antioksidan kapasite değerleri (mM TR-eşdeğeri)
ÖRNEK CUPRACN CUPRACİ ABTS HPLC
(CUPRACN)
HPLC
(CUPRACİ)
HPLC
(ABTS)
Sentetik Karışım
Sentetik Karışım 2 saat Hid.
Sentetik Karışım 4 saat Hid.
4,03
3,75
3,52
4,54
4,31
3,98
1,99
1,17
1,15
3,49
2,95
1,94
3,99
3,38
2,23
1,65
1,81
1,19
4.5.2. Sentetik Karışım-2
Şekil 4.73’de sentetik karışım-2’nin, Şekil 4.74’de sentetik karışım-2’in 2 saat hidroliz
sonrası; Şekil 4.75’de sentetik karışım-2’in 4 saat hidroliz sonrası kromatogramı
görülmektedir.
Şekil 4.73: Sentetik Karışım-2’in kromatogramı
1.pik: izokuersitrin; 2. pik: mirisetin; 3.pik: luteolin; 4.pik: kamferol; 5.pik: apigenin
90
Şekil 4.74: Sentetik Karışım-2’in 2 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı
1.pik: mirisetin; 2.pik: kuersetin; 3.pik: luteolin; 4.pik: kamferol; 5.pik: apigenin
Şekil 4.75: Sentetik Karışım-2’in 4 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı
1.pik: mirisetin; 2.pik: kuersetin; 3.pik: luteolin; 4.pik: kamferol; 5.pik: apigenin
Tablo 4.23’de sentetik karışım-2 ve hidrolizatlarının hesaplanan toplam antioksidan
kapasite değerleri (mM TR-eşdeğeri) görülmektedir.
Tablo 4.23: Sentetik karışım-2 ve hidrolizatlarının toplam antioksidan kapasite değerleri (mM TR-eşdeğeri)
ÖRNEK CUPRACN CUPRACİ ABTS HPLC
(CUPRACN)
HPLC
(CUPRACİ)
HPLC
(ABTS)
Sentetik Karışım
Sentetik Karışım 2 saat Hid.
Sentetik Karışım 4 saat Hid.
2,60
2,94
2,80
2,88
3,27
3,24
1,42
0,90
0,91
2,28
2,51
2,54
2,70
2,87
2,89
1,28
1,59
1,60
91
Tablo 4.24; HPLC’den hesaplanan kapasite değerlerinin, spektrofotometrik kapasite
değerlerine bölünmesiyle, HPLC yardımıyla hesaplanan kapasitenin spektrofotometrik
yolla bulunan kapasitenin % kaçını belirleyebildiğini ifade etmektedir.
Tablo 4.24: Bitki örneklerinin ve sentetik karışımların toplam antioksidan kapasitesinin HPLC yardımıyla belirlenebilen %’si
ÖRNEK % CUPRACN % CUPRACİ % ABTS
MAYDANOZ
% 50 Met. Eks. 4 saat Hid.
% 70 Met. Eks. 2 saat Hid.
% 70 Met Eks. 4 saat Hid.
Katı Bitki 2 saat Hidrolizatı
Katı Bitki 4 saat Hidrolizatı
m-fosforik Asitli Ekstrakt
70
77
59
60
38
53
52
68
60
45
35
48
>> 100
>> 100
>> 100
>> 100
>> 100
115
KEREVİZ YAPRAĞI
% 70 Met. Eks. Hidrolizatı
% 50 Met. Eks Hidrolizatı
% 50 Eta. Eks. Hidrolizatı
Katı Bitki Hidrolizatı
48
41
40
38
57
51
52
41
55
46
52
37
NANE
% 70 Metanollü Ekstrakt
% 70 Met. Eks. Hidrolizatı
Katı Bitki Hidrolizatı
63
16
15
65
13
13
54
14
15
ISIRGAN
% 70 Metanollü Ekstrakt
% 70 Met. Eks. Hidrolizatı
Katı Bitki Hidrolizatı
82
22
9
71
19
7
66
14
5
92
ÖRNEK % CUPRACN % CUPRACİ % ABTS
ADAÇAYI
% 70 Metanollü Ekstrakt
% 70 Met. Eks. Hidrolizatı
Katı Bitki Hidrolizatı
33
19
17
34
19
16
34
16
14
IHLAMUR
% 70 Met. Eks. Hidrolizatı
Katı Bitki Hidrolizatı
18
10
15
8
31
15
ARSLANPENÇESİ
% 70 Met. Eks. Hidrolizatı
Katı Bitki Hidrolizatı
12
10
11
9
16
15
DEREOTU
% 70 Met. Eks. Hidrolizatı
Katı Bitki Hidrolizatı
30
22
29
17
27
35
CİVANPERÇEMİ
% 70 Metanollü Ekstrakt
% 70 Met. Eks. Hidrolizatı
Katı Bitki Hidrolizatı
17
21
13
18
20
12
28
13
8
MERCANKÖŞK
% 70 Metanollü Ekstrakt
% 70 Met. Eks. Hidrolizatı
Katı Bitki Hidrolizatı
61
12
13
64
12
12
52
10
11
KEKİK
% 70 Met. Eks. Hidrolizatı
Katı Bitki Hidrolizatı
4
5
4
4
6
4
93
ÖRNEK % CUPRACN % CUPRACİ % ABTS
SENTETİK KARIŞIM-1
Sentetik Karışım
Sent. Karışım 2 saat Hid.
Sent. Karışım 4 saat Hid.
87
79
55
88
78
56
83
>> 100
103
SENTETİK KARIŞIM-2
Sentetik Karışım
Sent. Karışım 2 saat Hid.
Sent. Karışım 4 saat Hid.
88
85
90
94
88
89
90
>> 100
>> 100
94
5. TARTIŞMA VE SONUÇ
Yiyecek ve içecek olarak tüketildiği gibi geleneksel olarak çeşitli hastalıkların
tedavisinde kullanılan pek çok bitki içinden seçilmiş olan adaçayı, arslanpençesi,
civanperçemi, dereotu, ıhlamur, ısırgan, kekik, kereviz yaprağı, maydanoz, mercanköşk
ve nane bitkilerinde bulunan ve antioksidan özelliğe sahip olan temel bileşiklerin neler
olduğunun, türlere göre nasıl bir dağılım gösterdiğinin, aynı zamanda türün toplam
antioksidan kapasitesine ne oranda katıldığının araştırıldığı çalışmada değişik
yöntemlerle elde edilen sonuçlar, mevcut sınırlı sayıdaki standart madde ile
karşılaştırma yapılarak değerlendirilmiştir.
Bu çalışmada spektrofotometrik toplam antioksidan kapasite tayininde; CUPRAC
yöntemi aşağıdaki avantajları nedeniyle seçilmiştir.
� Yöntem kolay, hızlı, etkili ve maliyeti düşük bir yöntemdir.
� Absorbansların toplamsallığı ilkesi geçerlidir.
� CUPRAC yöntemi ile hidrofilik antioksidanlar kadar lipofilik antioksidanların
da kapasiteleri ölçülebilmektedir.
� CUPRAC yönteminde kullanılan reaktif ABTS, DPPH gibi kromojenik radikal
reaktiflerinden çok daha kararlıdır. Ayrıca Folin reaktifiyle yükseltgenebilen
sitrik asit ve basit şekerler, CUPRAC reaktifi ile yükseltgenmezler.
� CUPRAC yöntemi ile tiyol içerikli (glutatyon ve sistein gibi) antioksidanların da
kapasite tayinini yapılabilirken FRAP yöntemi ile, bu yapıdaki antioksidanların
kapasite tayinleri yapılamaz. Bu durum Cu (II) ve Fe(III)’ün farklı kinetik
davranışlara sahip olması ile açıklanabilir. Cu (II)’nin reaksiyon kinetiği Fe(III)’
e göre daha hızlı gerçekleşir. Çünkü, Fe(III)’ ün yüksek spin d-orbitallerinin yarı
dolu oluşu ona kinetik bakımdan bir inertlik verir. Oysa Cu(II) ‘nin elektronik
konfigürasyonu, daha hızlı kinetik etki göstermesine imkan tanır. Sert ve
Yumuşak Asit-Baz teorisine göre; Cu(II) (yumuşak asit), Fe (III)’e göre tiyol
tipi (yumuşak baz) antioksidanlarla daha fazla etkileşir.
� CUPRAC yöntemi ile fizyolojik pH'a yakın ortamlarda çalışılabilirken,
fizyolojik pH’dan daha asidik koşullarda (FRAP; pH 3.6) örneğin indirgeme
95
kapasitesi, fenolik antioksidanların protonlanması sebebiyle bastırılır. Daha
bazik koşullarda ise (Folin; pH 10) fenolik türlerin dissosiasyonu nedeniyle
örneğin indirgeme kapasitesi artar.
Seçilen bitki örneklerinin analize hazırlanması için metanol, etanol ve aseton’un %100 ,
% 70 ve % 50 (v/v)’lik çözeltileri ve bisdistile su kullanılarak ekstraksiyon işlemi
uygulanmıştır. Maydanoz ve kereviz yaprağı ile yapılan ön denemeler sonucunda %
70’lik metanol çözeltisi ile 105 dakika ekstraksiyon işlemi uygulamanın uygun olduğu
görülmüştür. Bu nedenle de diğer örneklerde sadece belirlenen koşullarda ekstraksiyon
yapılmıştır. Literatürde metanolün koruyucu rolü olduğu ve fenolik bileşiklerin
fenoloksidaz gibi enzimlerle yükseltgenmesini engellediği de belirtilmiştir [101]. Bunun
haricinde yine antioksidan özelliğe sahip bileşiklerden olan askorbik asit açısından
zengin bir kaynak olduğu bilinen maydanoz bitkisinde ayrıca taze örnek kullanılarak %
1 (w/v)’lik m-fosforik asit çözeltisi ile ekstraksiyon yapılarak örnek hazırlanmıştır [99].
Adaçayı, nane ve ısırgan bitkileri için demleme işlemi uygulanarak, demleme çözeltileri
de hazırlanmış ve analiz işlemleri uygulanmıştır. Hazırlanan bütün örnekler 0.45 µm’lik
filtrelerden süzüldükten sonra ve gerektiği durumlarda seyreltme yapılarak
kullanılmıştır.
Antioksidan özelliğe sahip maddelerin en çok rastlanılanlarından olan flavonoid sınıfı
bileşikler genellikle glikozidleri halinde bulunmaktadır ve bu haliyle belirlenmeleri, her
biri için ayrı bir standart madde ihtiyacı gündeme geldiğinden dolayı oldukça zordur.
Bu sorunu ortadan kaldırmak için bitki örnekleri hidroliz edilmiş ve aglikon türevlerine
dönüştürülerek miktarlandırılmıştır. Bitki örnekleri, 1.2 M HCl ve % 50 metanol içeren
ortamda 80 oC’de 2 saat süre ile hidroliz edilmiştir. [100]. Civanperçemi, adaçayı,
mercanköşk ekstraktlarında belirlenen naringinin, hidroliz sonrasında aglikon türevi
naringenine dönüştüğü görülmüştür. Ancak özellikle maydanoz ve kereviz yaprağı gibi
apigeninin glikozidleri halinde bulunduğu bitkilerde, literatürde de belirtildiği gibi [102]
4 saatlik hidroliz uygulanmıştır. Şekil 4.27 ve 4.28’deki kromatogramlardan da
görüldüğü gibi 36. dakikada gelen pik 4 saatlik hidroliz sonunda oldukça azalmakta ve
apigenin pikinde artış olmaktadır. Ancak bu kadar uzun hidroliz süresinde maydanozda
belirlenen mirisetinin 4 saatlik hidroliz sonunda bulunan miktarı, 2 saatlik hidroliz
sonrasında bulunan miktarın yaklaşık yarısı kadardır. Dolayısıyla bu uzun hidroliz
96
süresinde mirisetinin, literatürde verilen bilgiye göre de [103,104,105] kısmen
bozulduğu bu çalışmada doğrulanmıştır.
Ayrıca bu hidroliz koşullarında fenolik asitlerin büyük oranda bozunmaya uğradığı
görülmüştür [103,105,106]. Isırganda yapılan çalışmada, ekstraktta yüksek oranda
klorojenik asit belirlenirken (Şekil 4.43), hidroliz sonrası miktarı önemli derecede
azalmaktadır (Şekil 4.44). Buna ek olarak ekstraktın kendisinde kafeik asit
belirlenemezken hidroliz sonrası kafeik asite rastlanması, literatürde de klorojenik asitin
kafeik asitin depolanmış türü olduğu ve klorojenik asitin biyosentezi sırasında kuinik
asit çiftinin kafeik kısma olan dönüşümü tersinir olduğu belirtildiğinden Şekil 2.13’de
de görüldüğü gibi klorojenik asitin kafeik asite dönüşebileceği ihtimali düşünülmektedir
[77,78]. Yine aynı şekilde nane ekstraktında ve adaçayı ekstraktlarında kafeik asit esteri
olan rozmarinik asit belirlenirken, hidroliz sonrasında rozmarinik asit miktarında bir
azalma görülmekte, ekstraktın kendisinde kafeik asit belirlenmezken hidroliz sonrasında
belirlenmesi türlerin dönüşümünü düşündürmektedir. Bu amaçla rozmarinik asit
standartı hidroliz edilmiş, bozunma ürünlerinden birinin standart madde katkısıyla
kafeik asit olduğu belirlenmiştir (Şekil 5.1).
Şekil 5.1: Rozmarinik asit standartının 2 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı
1.pik: Kafeik asit; 2.pik Rozmarinik asit
97
Bunların sonucu olarak, örnek ekstraktları ve hidrolizatları için spektrofotometrik olarak
belirlenmiş olan toplam antioksidan kapasite değerleri farklı olduğu gibi, HPLC
yardımıyla hesaplanmış olan değerler arasında da farklılıklar ortaya çıkmıştır. Elde
edilen verilerden yola çıkılarak türlerde bulunan antioksidan bileşiklerden aglikon ya da
glikozid halinde neler bulunduğu ve bunların toplam antioksidan kapasiteye olan
katkıları belirlenmeye çalışılmıştır.
Çalışılan bitkilerde HPLC ile belirlenebilen bileşenler açısından literatür ile tutarlılık
görülmektedir. Maydanozda apigenin [82,95,96]; kereviz yaprağında apigenin, luteolin
[82,95,100]; nanede rozmarinik asit [82,97]; luteolin [96,97], ısırganda klorojenik asit
[93]; ıhlamurda kuersetin, kamferol [82,92,93,98]; adaçayında rozmarinik asit, luteolin
[82]; dereotunda kuersetin [96]; arslanpençesinde kuersetin [82]; mercanköşkte kafeik
asit, kumarik asit, rozmarinik asit [91]; civanperçeminde apigenin ve luteolin [82]
belirlenmiştir.
Bunların dışında, bitkilerde kuvvetle olması muhtemel ve gerek CUPRAC gerekse
ABTS yöntemi ile reaksiyon veren tannik asitin (tanenler) kapasiteye etkisi
değerlendirilmek istenmiş ancak aşağıdaki kromatogramdan da görüldüğü gibi olasılıkla
polikondanse tanenlerden kaynaklanan çok sayıda pikin mevcut olduğu bir
kromatogram elde edilmiştir (Şekil 5.2). Bundan dolayı bitki örneklerinde kalitatif ve
kantitatif tannik asit değerlendirilmesi yapılamamıştır.
Şekil 5.2: % 70 metanolde hazırlanan tannik asit çözeltisinin kromatogramı
98
Çalışılan bütün bitki örneklerinin hidrolizat kromatogramların da görüldüğü gibi,
yaklaşık 12.5 ve 17.5 dakika alıkonma zamanına sahip piklerin tanımlanmasında
zorluklar yaşanmıştır. 12.5 dakikada gelen ilk pikin , gelme zamanı olarak gallik asit
olabileceği düşünülmüş yapılan standart madde katkı neticesinde gallik asit olmadığı
belirlenmiştir. Bunun gallik asit türevi bir yapı olabileceği tahmin edilmektedir. 17.5
dakikada gelen pikin, gelme zamanı olarak kateşin olabileceği düşünülmüş, standart
madde katkısıyla bazı bitki hidrolizatlarının pikinde artış yaratırken bazılarında tam
ayrılamayan pikler oluşturmuştur. Dolayısıyla standart kateşin katkısıyla piklerinde artış
yaratan bitkilerde de kateşin olarak kapasite hesabı yapılmamıştır. Ayrıca demlenerek
hazırlanan nane çözeltisinin sadece asit ile olan hidrolizinde (Şekil 4.41) kateşin olması
düşünülen pik görülmezken, metanollü HCl hidrolizinde (Şekil 4.42) bu pik
görülmektedir. Ancak spektrofotometrik kapasite sonuçları değerlendirildiğinde, sadece
asit ile ele geçen hidrolizatın kapasite değeri az da olsa metanollü HCl hidrolizinden
fazla çıkmakta (Tablo 4.13) dolayısıyla bu belirlenemeyen pikin kateşin olmadığı da
doğruluk kazanmaktadır. Yine aynı şekilde, demlenerek hazırlanan adaçayı çözeltisinin
asit ile olan hidrolizinde (Şekil 4.50) pik görülmemekte ancak metanollü HCl
hidrolizinde (Şekil 4.51) görülmektedir. Tablo 4.15’de, iki farklı hidroliz durumunda
toplam kapasite açısından farklılık olmadığı görülmektedir. Ayrıca, literatürde
kateşinlerin hidroliz koşullarında büyük oranda bozunduğu da belirtilmektedir
[103,104,106]. 280 nm’de belirlenen karakteristik bu iki pikin Şekil 5.3’de görüldüğü
gibi tannik asitin hidrolizi sonucu oluşan ürünler olduğu tahmin edilmektedir.
Şekil 5.3: % 70 metanolde hazırlanan tannik asit çözeltisinin 2 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı
99
Farklı yöntemler (spektrofotometri ve HPLC) kullanılarak elde edilmiş olan farklı
bulguların doğru olarak değerlendirilmesini yapabilmek için en çok rastlanılan
maddelerin standartları ile sentetik karışımlar hazırlanmış ve analiz yöntemleri
uygulanmıştır. Sentetik karışımların 2 saat ve 4 saat hidrolizatlarında ve antioksidan
kapasitesi düşük bitki örneklerinin hidrolizatlarında NaOH ile pH ayarlaması (∼ pH 6.0
-6.5) gerçekleştirilmiş, ancak ABTS yöntemi ile 6. dakikaya varmadan bu örneklerde
bulanıklık oluştuğu gözlenmiştir. Bu nedenle asidik örnekler uygun oranlarda
seyreltilerek, pH ayarlaması yapılmaksızın ABTS yöntemi uygulanmıştır. Sonuçlara
bakıldığında HPLC yardımıyla hesaplanan kapasite değerleri ile ABTS yöntemi ile elde
edilen kapasite değerleri arasında büyük bir uyumsuzluğun olduğu, HPLC kapasite
değerlerinin çok yüksek çıkmasıyla beklenen kapasitenin gerçekleşmediği görülmüştür.
Ancak sentetik karışımların ve hidrolizatlarının CUPRAC yöntemi ve HPLC analizleri
ile elde edilen toplam kapasite değerleri arasında uyum vardır. Bu da CUPRAC
yönteminde absorbansların toplamsallığı varsayımını doğrulamaktadır.
Tablo 4.9’daki TEAC (troloks eşdeğer antioksidan kapasite) verilerinin
incelenmesinden şu özellikler görülmektedir:
a) CUPRAC yönteminin, kuersetin ve rozmarinik asit için en yüksek TEAC
katsayılarını verdiği görülmektedir. Her iki bileşikte de –OH gruplarının
sayısına ve konumuna, aynı zamanda molekülün toplam konjugasyon derecesine
bakıldığında bu bileşiklerin en yüksek antioksidan etkinliği göstermesi
beklenmelidir ki CUPRAC yöntemi buna olanak vermektedir. Rozmarinik asitin
antioksidan aktivitesinin; troloks, α-tokoferol ve BHT’ye göre defalarca yüksek
olması gerektiği literatürde belirtilmiştir [107,108]. Rozmarinik asitin,
antioksidan aktivitesini doğrulamak bakımından CUPRAC yöntemi, ABTS
yöntemine göre üstündür.
b) Hidroksi sinnamik asitlerde CUPRAC yönteminin gösterdiği TEAC sırası:
Rozmarinik asit > kafeik asit ≥ klorojenik asit > ferulik asit > p-kumarik asit
şeklindedir (Tablo 4.9). Bu sıra, -OH gruplarının sayısı ve konumuna olduğu kadar
toplam konjugasyon derecesine ve orto- /para- mevkiinde elektron destekleyici
metoksi gruplarının varlığına duyarlı ve bunlarla uyum içindedir. Oysa bu
bileşiklerin ABTS yöntemine göre TEAC değerleri, belirtilen yapı-aktivite
100
ilişkileriyle uyarlı değildir [109]. Bu da CUPRAC yönteminin ABTS/TEAC’a bir
üstünlüğü sayılmalıdır.
Çalışılan bitki örneklerinin HPLC ile edilen kapasite değerleri; CUPRAC yöntemi ile
elde edilen kapasite değerlerinin ısırgan ekstraktında % 82’lik; maydanozun farklı
hidrolizatlarında % 60-77; nane ekstraktında % 63; mercanköşk ekstraktında % 61;
kereviz yaprağının farklı hidrolizatlarında % 41-57 ve adaçayı ekstraktında 33’lük
kısmını belirlemektedir (Tablo 4.24). Ancak civanperçemi, ıhlamur ve arslanpençesi
hidrolizatlarında bu oran gerek CUPRAC gerekse ABTS yöntemleri ile % 10-20
arasında kalmaktadır. Standart madde eksikliğinden dolayı bazı bileşenlerin
belirlenememesi, tanenlerin kapasiteye katkısının değerlendirilememesi, hidroliz sonucu
türlerin birbirine dönüşümü gibi bir çok faktör göz önünde bulundurulduğunda HPLC
ile doğrulamanın güç olduğu görülmektedir.
Bir bitki ekstraktında mevcut antioksidanların tümü belirlenirse, bunların derişimleri
denel olarak saptanmış TEAC (troloks eşdeğeri antioksidan kapasite) katsayıları ile
çarpılarak ve bu çarpımlar toplanarak ekstraktın kuramsal olarak beklenen toplam
antioksidan kapasitesi hesaplanabilir. Eğer HPLC kromatogramından tüm
antioksidanlar saptanmış ise bu yolla bulunan kapasite, denel olarak ölçülen antioksidan
kapasite ile bağdaşmalıdır.
Sonuç olarak; seçilen bitki türlerindeki antioksidan özelliğe sahip bileşiklerin neden
olduğu toplam antioksidan kapasitenin ve bu bileşiklerin toplam kapasiteye olan
katkılarının tek tek belirlenmesi amacıyla yapılan çalışmalarda ısırgan, maydanoz,
kereviz yaprağı, nane, mercanköşk gibi türlerde başarılı sonuçlar alınırken çok sayıda
farklı özelliğe sahip bileşen içeren diğer türlerde yukarıda açıklamaya çalıştığımız
nedenlerden dolayı değerlendirmede güçlükler ortaya çıkmıştır.
Çalışılan bitki örneklerinin ekstraktlarında CUPRAC yöntemi ile belirlenmiş olan
toplam antioksidan kapasitesi sıralaması; arslanpençesi > kekik > ıhlamur > mercanköşk
> adaçayı > nane > civanperçemi > kereviz yaprağı> dereotu > ısırgan > maydanoz
şeklindedir.
101
KAYNAKLAR
1. NICHENAMETLA, S. N., TARUSCIO, T. G., BORNEY, D. L., EXON, J. H., 2006, A rewiev of the effects and mechanisms of the polyphenolics in cancer, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 46, 161-183.
2. CARDENAS, M., MANDER, M., BLANK, V. C., ROGUIN, L. P., 2006,
Antitumor activity of some natural flavonoids and synthetic derivatives on various human and murine cancer cell lines, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 14, 2966-2971.
3. SROKA, Z., 2005, Antioxidative and antiradical properties of plant phenolics,
Zeitschrift für Naturforschung, 60 (11-12) 833-843. 4. ARUOMA, O. I., 1994, Nutrition and health aspects of free radicals and
antioxidants, Food Chemistry Toxicology, 32, 671-683. 5. BURR, M. L., 1994, Antioxidant and cancer, Journal of Human Nutrition and
Dietetics, 7, 409-416. 6. HENNIG, B., TOBOREK, M., 1993, Antioxidants and atherosclerosis, Journal
of Optimal Nutrition, 2, 213-216. 7. SURVESWARAN, S., CAI, Y., CORKE, H., SUN, M., 2007, Systematic
evaluation of natural phenolic antioxidants from 133 Indian medicinal plants, Food Chemistry, 102, 938-953.
8. PARK, E. J., PEZZUTTO, J. M., 2002, Botanicals in cancer chemoprevention,
Cancer and Metastasis Reviews, 21, 231-255. 9. KÄHKONEN, M.P., HOPIA, A. I., VUROELA, H. J., RAUHA, J. P.,
PIHLAJA, K., KUJALA, T. S., et al., 1999, Antioxidant activity of plants extracts containing phenolic compounds, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47, 3954-3962.
10. MILLER, N. J., RICE EVANS, C. A., DAVIES, M. J., GOPINATHAN, V.,
MILNER, A., 1993, A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates, Clinical Science, 84, 407-412.
11. WHITEHEAD, T. P., THORPE, G. H. G., MAXWELL, S. R. J., 1992,
Enhanced chemiluminescent assay for antioxidant capacity in biological fluids, Analytica Chimica Acta, 266, 265-277.
102
12. CAO, G., ALESSIO, H. M., CUTLER, R. G., 1993, Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants, Free Radical Biology & Medicine, 14, 303-311.
13. GHISELLI, A., SERAFINI, M., MAIANI, G., AZZINI, E., FERRO-LUZZI, A.,
1995, A fluorescence-based method for measuring total plasma antioxidant capability, Free Radical Biology & Medicine, 18, 29-36.
14. WAYNER D.D.M., BURTON G. W., INGOLD K. LOCKE U. S., 1985,
Quantitative measurement of the total peroxyl radical-trapping antioxidant capability of human blood plasma by controlled peroxidation, FEBS Letters, 187, 33-37.
15. SALAH, N., MILLER, N. J., PAGANGA, G., TIJBURG, L., RICE-EVANS, C.
A., 1995, Polyphenolic flavonols as scavengers of aqueous phase radicals and as chain-breaking antioxidants, Archives Biochemistry and Biophysics, 322, 339-346.
16. GLAZER, A. N., 1990, Phycoerythrin fluorescence-based assay for reactive
oxygen species, Methods in Enzymology, 186, 161-168. 17. RICE-EVANS, C. A., MILLER, N. J., 1996, Antioxidant activities of flavonoids
as bioactive components of food, Biochemical Society Transactions, 24, 790-795.
18. WANG, H., CAO, G., PRIOR, R.L., 1996, Total antioxidant capacity of fruits,
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44, 701-705. 19. RICE-EVANS, C. A., MILLER, N. J., PAGANGA, G., 1996, Structure-
antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids, Free Radical Biology & Medicine, 20, 933-956.
20. MILLER, N. J., RICE-EVANS, C. A., 1994, Total antioxidant status in plasma
and body fluids, Methods in Enzymology, 234, 279-293. 21. CAO, G., VERDON, C. P., WU, A. H. B., WANG, H., PRIOR, R. L., 1995,
Automated oxygen radical absorbance capacity assay using the COBAS FARA II, Clinical Chemistry, 41, 1738-1744.
22. BENZIE, I. F. F., STRAIN, J. J., 1996, Ferric reducing ability of plasma (FRAP)
as a measure of ‘antioxidant power’; the FRAP assay, Analytical Biochemistry, 239, 70-76.
23. VALKONEN, M., KUUSI, T., 1997, Spectrophotometric assay for total radical-
trapping antioxidant potential in human serum, Journal of Lipid Research, 38, 823-833.
103
24. WINSTON, G. W., REGOLI, F., DUGAS, A. J. Jr., FONG, J. H., BLANCHARD, K. A., 1998, A rapid gas chromatographic assay for determining oxyradical scavenging capacity of antioxidants and biological fluids, Free Radical Biology & Medicine, 24, 480-493.
25. SANCHEZ, M. C., LARRAURI, J.A., SAURA, C. F., 1998, A procedure to
measure the antiradical efficiency of polyphenols, Journal of the Science of Food and Agriculture, 76, 270-276.
26. ALHO, H., LEINONEN, J., 1999, Total antioxidant activity measured by
chemiluminescence methods, Methods in Enzymology, 299, 3-14. 27. TUBARO, F., GHISELLI, A., PAPUZZI, P., MAIORINO, M., URSINI, F.,
1998, Analysis of plasma antioxidant capacity by competition kinetics, Free Radical Biology & Medicine, 24, 1228-1234.
28. SINGLETON, V. L., ROSSI, J. A., 1965, Colorimetry of total phenolics with
phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents, American Journal of Enology and Viticulture, 16, 144-158.
29. SINGLETON, V. L., ORTHOFER, R., LAMUELA-RAVENTOS, R. M., 1999,
Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu Reagent, Methods in Enzymolology, 299, 152-178.
30. LUSSIGNOLI, S., FRACCAROLI, M., ANDRIOLI, G., BROCCO, G.,
BELLAVITE, P., 1999, A microplate-based colorimetric assay of the total peroxyl radical trapping capability of human plasma, Analytical Biochemistry, 269, 38-44.
31. TÜTEM, E., APAK, R., BAYKUT, F., 1991, Spectrophotometric determination
of trace amounts of copper(I) and reducing agents with neocuproine in the presence of copper(II), The Analyst, 116, 89-94.
32. TÜTEM, E., APAK, R., 1991, Simultaneous spectrophotometric determination
of cystine and cysteine in amino acid mixtures using copper(II)-neocuproine reagent”, Analytica Chimica Acta, 255, 121-125.
33. TÜTEM, E., APAK, R., GÜNAYDI, E., SÖZGEN, K., 1997,
Spectrophotometric determination of vitamin E (α-tocopherol) by the copper(II)-neocuproine reagent, Talanta, 44, 249-255.
34. GÜÇLÜ, K., SÖZGEN, K., TÜTEM, E., ÖZYÜREK, M., APAK, R., 2005,
Spectrophotometric determination of ascorbic acid using copper(II)-neocuproine reagent in beverages and pharmaceutical, Talanta, 65, 1226-1232.
35. SÖZGEN, K., DEMİRCİ-ÇEKİÇ, S., TÜTEM, E., APAK, R., 2005,
Spectrophotometric total protein assay with copper(II)-neocuproine reagent in alkaline medium, Talanta, 68, 1601-1609.
104
36. APAK, R., GÜÇLÜ, K., ÖZYÜREK, M., KARADEMIR, S. E., 2004, Novel total antioxidant capacity index for dietary polyphenols and vitamins C and E, using their cupric ion reducing capability in the presence of neocuproine: CUPRAC Method, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 7970-7981.
37. APAK, R., GÜÇLÜ, K., ÖZYÜREK, M., KARADEMIR, S. E., ERÇAĞ, E.,
2006, The CUPRAC antioxidant capacity and polyphenolics content of some herbal teas, International Journal of Food Sciences and Nutrition, 57, 292-304.
38. GÜÇLÜ, K., ALTUN, M., ÖZYÜREK, M., KARADEMIR, S. E., APAK, R.,
2006, Antioxidant capacity of fresh, sun- and sulfited-dried Malatya apricot (Prunus Armeniaca) assayed by CUPRAC, ABTS/TEAC and Folin Methods, International Journal of Food Science Technology, 41, 76-85.
39. APAK, R., GÜÇLÜ, K., ÖZYÜREK, M., KARADEMIR, S. E., ALTUN, M.,
2005, Total antioxidant capacity assay of human serum using copper(II)-neocuproine as chromogenic oxidant: The CUPRAC Method, Free Radical Research, 39, 949-961.
40. RE, R., PELLEGRINI, N., PROTEGGENTE, A., PANNALA, A., YANG, M.,
RICE-EVANS C. A., 1999, Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorisation assay, Free Radical Biology & Medicine, 26, 1231-
41. GÖNENÇ, A., ATAK, Y., ORMAN, M. N., ŞIMŞEK, B., 2002, Lipid
Peroxidation and Antioxidant Systems in Hemodialyzed Patients, Dialysis and Transplantation, 31, 88-96.
42. HALLIWELL, B., AESCHBACH, R., LÖLIGER, J., ARUOMA, O. I., 1995,
The characterization of antioxidants, Food and Chemical Toxicology, 33, 601-617.
43. SHAHIDI, F., 1996, Natural Antioxidants, Chemistry, Health Effects and
Applications, AOCS Press, Champaign- Illinois, 0-935315-77-2. 44. SHAHIDI, F., NACZK, M., 1995, Food Phenolics: Sources, Chemistry, Effects
and Applications, Technomic Publ. Co., Lancaster-Basel, 1566762790. 45. CADENAS, E., PACKER, L., 2002, Handbook of Antioxidants, Marcel Dekker,
New York-Basel, 0-8247-0547-5. 46. WHEELER, G. L., JONES, M. A., SMIRNOFF, N., 1998, The biosynthetic
pathway of vitamin C in higher plants, Nature, 393, 365-369. 47. WOODALL, A.A., AMES, B. N., 1997, Diet and oxidative damage to DNA:
The importance of ascorbate as an antioxidant, Vitamin C in Health and Disease, Markel Dekker, New York, 193-203.
48. BENDICH, A., 1997, Vitamin C safety in humans, Vitamin C in Health and
Disease, Markel Dekker, New York, 367-379.
105
49. HALLIWELL, B., 1996, Vitamin C: antioxidant or pro-oxidant in vivo?, Free Radical Research, 25, 439-454
50. BUETTNER, G. R., 1993, The pecking order of free radicals and antioxidants:
lipid peroxidation, α-tocopherol, and ascorbate, Archives Biochemistry and Biophysics , 300, 535-543.
51. BUETTNER, G. R., JURKIEWICZ, B. A., 1996, Catalytic metals, ascorbate and
free radicals: combinations to avoid, Radiation Research, 145, 532-541.
52. BJORNEBOE, A., BJORNEBOE, G. E., DREVON, C. A., 1990, Absorption, transport and distribution of vitamin E, The Journal of Nutrition, 120, 233-242.
53. BRIGELIUS-FLOHE, R., TRABER, M. G., 1999, Vitamin E: function and
metabolism, FASEB Journal, 13, 1145-1155.
54. HORWITT, M. K., 1986, Interpretations of requirements for thiamin, riboflavin, niacin-tryptophan, and vitamin E plus comments on balance studies and vitamin B-6, American Journal of Clinical Nutrition, 44, 973-985.
55. VAN GOSSUM, A., SHARIFF, R., LEMOYNE, M., KURIAN, R.,
JEEJEEBHOY, K., 1988, Increased lipid peroxidation after lipid infusion as measured by breath pentane output, American Journal of Clinical Nutrition, 48, 1394-1399.
56. SHEPPARD, A. J., PENNINGTON, J. A. T., WEIHRAUCH, J. L., 1993,
Analysis and distribution of vitamin E in vegetable oils and foods, Vitamin E in Health and Disease, Markel Dekker, New York.
57. ONG, A. S.H., 1993, Natural sources of tocotrienols, Vitamin E in Health and
Disease, Markel Dekker, New York, 3-8.
58. PFANDER, H., 1987, Key to Carotenoids, Birkhäuser Verlag, Basel, 0817618600.
59. QUIRƠS, A. R.B., COSTA, H. S., 2006, Analysis of carotenoids in vegetable
and plasma samples: A review, Journal of Food Composition and Analysis, 19, 97-111.
60. OLSON, J.A., 1999, Carotenoids, Modern Nutrition in Health and Disease,
Williams & Wilkins, Baltimore, 0781741335.
61. KRINSKY, N. I., 1993, Actions of carotenoids in biological systems, Annual Review of Nutrition, 13, 561-587.
62. SIES, H., STAHL, W., 1995, Vitamins E and C, β-carotene, and other
carotenoids as antioxidants, American Journal of Clinical Nutrition, 62, 1315-1321.
106
63. BURTON, G. W., INGOLD, K. U., 1984, β-carotene: an unusual type of lipid antioxidant, Science, 224, 569-573.
64. RICE-EVANS, C.A., MILLER, N. J., BOLWELL, P.G., BRAMLEY, P. M.,
PRIDHAM, J. B., 1995, The relative antioxidant activities of plant-derived polyphenolic flavonoids, Free Radical Research, 22, 375-383.
65. VAN ACKER, S., VAN-DEN BERG, D. J., TROMP, M.N., GRIFFIOEN, D.
H., VAN BEBBEKOM, W.P., VAN DER, W.J.F., BAST, A., 1996, Structural aspects of antioxidants activity of flavonoids, Free Radical Biology & Medicine, 20, 331-342.
66. BROWN, J. A., KHODR, H., HIDER, R. C., RICE-EVANS, C., 1998,
Structural dependence of flavonoid interactions with Cu2+ ions: implications for their antioxidant properties, Biochemical Journal, 330, 1173-1178.
67. HAVSTEEN, B., 1983, Flavonoids, a class of natural products of high
pharmacological potency, Biochemical Pharmacology, 32, 1141-1148.
68. KUHNAU, J., 1976, The Flavonoids. A class of semi-essential food components: Their role in human nutrition, Wld. Rev. Nutr. Diet., 24, 117-191.
69. COOK, N. C., SAMMAN, S., 1996, Flavonoids –Chemistry, metabolism,
cardioprotective effects, and dietary sources, Nutritional Biochemistry, 7, 66-76. 70. HARBORNE, J. B., 1967, Comparative biochemistry of the flavonoids,
Academic Press, London. 71. HEIM, K. E., TAGLIAFERRO, A. R., BOBILYA, D. J., 2002, Flavonoid
antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships, Journal of Nutritional Biochemistry, 13, 572-584.
72. DZIEDZIC, S. Z., HUDSON, B. J. F., 1983, Polyhydroxychalcones and
flavanones as antioxidants for edible foods, Food Chemistry, 12, 205-212. 73. ABU-AMSHA, R., CROFT, K. D., PUDDEY, I. B., PROUDFOOT, J. M.,
BEILIN, L. J., 1996, Phenolic content of various beverages determines the extent of inhibition of human serum and low density lipoprotein oxidation in vitro: identification and mechanism of action of some cinnamic acid derivatives from red wine, Clinical Science, 91, 449-458.
74. HELLER, W., FORKMANN, G., 1993, Biosynthesis of flavonoids, The
flavonoids: Advances in Research since 1986, Chapman & Hall, London, 499-535.
75. WALLACE, G., FRY, S. C., 1994, Phenolic components of the plant cell wall,
International Review of Cytology, 151, 229-267.
107
76. HERRMANN, K., 1989, Occurrence and content of hydroxycinnamic and hydroxybenzoic acid compounds in foods, Critical Review Food Science and Nutrition, 28, 315-347.
77. RHODES, M., WOOLTORTON, L., 1976, The enzymic conversion of
hydroxycinnamic acids to p-coumarylquinic and cholorogenic acids in tomato fruits, Phytochemistry, 18, 929-933.
78. ULBRICH, B., ZENK, M., 1979, Partial purification and properties of
hydroxycinnamoyl-CoA: quinate hydroxycinnamoyl transferase from higher plants, Phytochemistry, 18, 929-933.
79. KAHNT, G., 1967, Trans-cis eqilibrium of hydroxy cinnamic acids during
irradiation of aqueous solutions at different pH, Phytochemistry, 6, 755-758. 80. BRUNE, M., ROSSANDER, L., HALLBERG, L., 1989, Iron absorption and
phenolic compound: Importance of different phenolic structures, European Journal of Clinical Nutrition, 43, 547-558.
81. MIDDLETON, E., KANDASWAMI, C., 1993, The impact of plant flavanoids
on mammalian biology: Implications for ımmunity, in flammation and cancer, The Flavonoids: Advances in Research Since 1986, Chapman and Hall, London, 0-412-48070-0.
82. ÇUBUKÇU, B., MERİÇLİ, A. H., MAT, A., SARIYAR, G., SÜTLÜPINAR,
N., MERİÇLİ, F., 2002, Fitoterapi Yardımcı Ders Kitabı, İ.Ü. Basım ve Yayınevi Müdürlüğü, İstanbul, 975-404-647-6.
83. GIROTTI S., FERRI E., MACCAGNANI L., BUDINI R., BIANCHI G., 2002
Plasma Antioxidant Capacity Determination: Comparative Evaluation of Chemiluminescent and Spectrophotometric Assays, Talanta, 56, 407-414.
84. WAYNER, D. D. M., BURTON, G. W., INGOLD, K. U., LOCKE, S., 1986,
The antioxidant efficiency of vitamin C is concentration-dependent, Biochimica et Biophysica Acta, 884, 119-123.
85. CAO, G., PRIOR, R.L., 1999, In vivo antioxidant capacity: comperison of
different analytical methods, Free Radical Biology & Medicine, 27, 1173-1181. 86. CAO, G., PRIOR, R. L ., 1999, The measurement of oxygen radical absorbance
capacity in biological samples, Methods in Enzymology 299, 50-62. 87. KOHEN, R., YANNAI, E., BERRY, E.M., TIROSH, O., 1999, Overall low
molecular weight antioxidant activity of biyological fluids and tissues by cyclic voltammetry, Methods in Enzymology, 300, 285-296.
88. CHEVION, S., BERRY, E. M., KITROSSKY, N. K., KOHEN. R., 1997,
Evaluation of plasma low molecular weight antioxidant capacity by cyclic voltammetry, Free Radical Biology and Medicine, 22, 411-421.
108
89. IQBAL, S., BHANGER, M. I., ANWAR, F., 2007, Antioxidant properties and components of bran extracts from selected wheat varieties commercially available in Pakistan, Food Science and Techonology, 40, 361-367.
90. OSZMIANSKI, J., WOJDYLO, A., LAMER-ZARAWSKA, E., SWIADER, K.,
2007, Antioxidant tannins from Rosaceae plant roots, Food Chemistry, 100, 579-583.
91. CHUN, S., VATTEM, D. A., LIN, Y. T., SHETTY, K., 2005, Phenolic
antioxidants from clonal oregano (Origanum vulgare) with antimicrobial activity against Helicobacter pylori, Process Biochemistry, 40, 809-816.
92. TOKER, G., ASLAN, M., YEŞİLADA, E., MEMİŞOĞLU, M., ITO, S., 2001,
Comparative evaluation of the flavonoid content in officinal Tiliae flos and Turkish lime species for quality assessment, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 26, 111–121.
93. EXARCHOU, V., FIANEGOS, Y. C., VAN BEEK, T. A., NANOS, C.,
VERVOORT, J., 2006, Hyphenated chromatographic techniques for the rapid screening and identification of antioxidants in methanolic extracts of pharmaceutically used plants, Journal of Chromatography A, 1112, 293-302.
94. URBONAVİČİŪTĖ, A., JAKSTAS, V., KORNYSOVA, O., JANULIS, V.,
MARUSKA, A., 2006, Capillary electrophoretic analysis of flavonoids in single-styled hawthorn (Crataegus monogyna Jacq.) ethanolic extracts, Journal of Chromatography A, 1112, 339-344.
95. JUSTESEN, U., KNUTHSEN, P., LETH, T., 1998, Quantitative analysis of
flavonols, flavones, and flavanones in fruits, vegetables and beverages by high-performance liquid chromatography with photo-diode array and mass spectrometric detection, Journal of Chromatography A, 799, 101-110.
96. JUSTESEN, U., KNUTHSEN, P., 2001, Composition of flavonoids in fresh
herbs and calculation of flavonoid intake by use of herbs in traditional Danish dishes, Food Chemistry, 73, 245-250.
97. AREIAS, F. M., VALENTÃO, P., ANDRADE, P. B., FERRERES, F.,
SEABRA, R. M., 2001, Phenolic fingerprint of peppermint leaves, Food Chemistry, 73, 307-311.
98. KARAKAYA, S., EL, N. S., 1999, Quercetin, luteolin, apigenin and kamferol
contents of some foods, Food Chemistry, 66 , 289-292. 99. SINGH, J., UPADHYAY, A. K., BAHADUR, A., SINGH, B., SINGH, K. P.,
RAI, M., 2006, Antioxidant phytochemicals in cabbage (Brassica oleracea L. var. capitata), Scientia Horticulturae, 108, 233-237.
109
100. HERTOG, M. G. L., HOLLMAN, P. C. H., VENEMA, D. P., 1992, Optimization of a quantitative HPLC determination of potentially anticarcinogenic flavonoids in vegetables and fruits, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 40, 1591-1598.
101. HARBORNE, J. B., 1998, Phenolic compounds. In J. B. Harborne,
Phytochemical methods; a guide to modern techiques of plant analysis, Chapman and Hall, London.
102. HERTOG, M. G. L., HOLLMAN, P. C. H., KATAN, M. B., 1992, Content of
potentially anticarcinogenic flavonoids of 28 vegetables and 9 fruits commonly consumed in the Netherlands, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 40, 2379-2383.
103. HÄKKINEN, S. H., KÄRENLAMPI, S. O., HEIONEN, I. M., MYKKÄNEN,
H. M., TORRONEN, A. R., 1998, HPLC method for screening of flavonoids and phenolic acids in berries, Journal of the Science of Food and Agriculture, 77, 543-551.
104. MERKEN, H. M., BEECHER, G. R., 2000, Measurement of food flavonoids by
high-performance liquid chromatography: a review. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 577-599.
105. NUUTILA, A., M., KAMMIOVIRTA, K., OKSMAN-CALDENTEY, K. -M.,
2002, Comparison of methods for the hydrolysis of flavonoids and phenolic acids from onion and spinach for HPLC analysis, Food Chemistry, 76, 519-525.
106. HUANG, Z., WANG, B., EAVES, D. H., SHIKANY, J., M., PACE, R., D.,
2007, Phenolic compound profile of selected vegetables frequently consumed by African Americans in the southeast United States, Food Chemistry, 103, 1395-1402.
107. CHEN, J. H., HO, C. T., 1997, Antoxidant activities of caffeic acid and its
related hydroxycinnamic acid compounds, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 2374-2378.
108. TEPE, B., EMİNAĞAOĞLU, Ö., AKPULAT, H. A, AYDIN, E., 2007,
Antioxidant potentials and rosmarinic acid levels of the methanolic extracts of Salvia verticillata (L.) subsp. verticillata and S. verticillata (L.) subsp. amasiaca (Freyn & Bornm.) Bornm, Food Chemistry, 100, 985-989.
109. APAK, R., GÜÇLÜ, K., ÖZYÜREK, M., ÇELİK, S. E., 2007, Mechanism of
antioxidant capacity assays and the CUPRAC method, Microchimica Acta, Baskıda, DOI: 10.1007/s00604-007-0777-0.
110
ÖZGEÇMİŞ
08.03.1981 Almanya doğumluyum. İlköğrenimimi Halil Bedii Yönetken İlköğretim Okulu’nda, lise öğrenimimi Bakırköy Sabri Çalışkan Lisesi’nde tamamladım. 1999 yılında Öğrenci Seçme ve Yerleştirme Merkezi tarafından düzenlenen üniversite giriş sınavı sonucunda İ.Ü. Mühendislik Fakültesi Kimya Bölümü’ne girmeye hak kazandım. Bir senelik yabancı dil hazırlık ve 4 senelik üniversite öğrenimimi tamamlayıp 2004 yılında mezun oldum. Ayrıca bu süre sonunda İ.Ü. Mühendislik Fakültesi Kimya Mühendisliği Bölümü’nde yandal programını tamamladım. 2003 yılı yaz döneminde stajımı İ.Ü. Mühendislik Fakültesi Kimya Bölümü Analitik Kimya Anabilim Dalı ve Javel Temizlik Maddeleri Ltd. Şti.’de tamamladım. 2003-2004 yılı güz ve bahar döneminde İ.Ü. Mühendislik Fakültesi Kimya Bölümü Analitik Kimya Anabilim Dalı’nda öğrenci asistanlığı yaptım. 2004 yılında İ.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Analitik Kimya Programı’nda yüksek lisans öğrenimime başladım.