Universidade Federal do Rio de Janeiro

BASES MOLECULARES DA ATENUAÇÃO VIRAL:

MODELO REOVÍRUS AVIÁRIO

Felipe Gomes Naveca

2006

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II

BASES MOLECULARES DA ATENUAÇÃO VIRAL:

MODELO REOVÍRUS AVIÁRIO

Felipe Gomes Naveca

Tese de doutorado apresentada ao Programa de

Pós-graduação em Ciências (Microbiologia),

Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes

(IMPPG), da Universidade Federal do Rio de

Janeiro, como parte dos requisitos necessários à

obtenção do título de Doutor em Ciências

(Microbiologia).

Orientadora: Vera de Souza Gouvêa

Rio de Janeiro Agosto de 2006

III

Naveca, Felipe Gomes.

Bases moleculares da atenuação viral: modelo reovírus aviário/ Felipe Gomes Naveca. Rio de Janeiro: UFRJ / IMPPG, 2006.

xii, 142f. Orientadora: Vera de Souza Gouvêa. Tese (doutorado) – UFRJ / IMPPG / Programa de Pós-Graduação em

Ciências (Microbiologia), 2006. Referências Bibliográficas: f. 130-142. 1. reovírus aviário. 2. análise de seqüências. 3. bioinformática. 4.

patogênese. 5. atenuação. 6. proteína recombinante. I. Gouvêa, Vera. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Microbiologia). III. Título.

IV

RESUMO

BASES MOLECULARES DA ATENUAÇÃO VIRAL:

MODELO REOVÍRUS AVIÁRIO

Felipe Gomes Naveca

Orientadora: Vera de Souza Gouvêa

Resumo da tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes (IMPPG), da

Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários

à obtenção do título de Doutor em Ciências (Microbiologia).

Os reovírus vem sendo utilizados há vários anos como modelo no estudo da patogênese viral em infecções naturais e experimentais. Muito progresso foi alcançado no estudo de amostras de reovírus isolados de mamíferos, entretanto não foi possível estabelecer um quadro clínico como característica da infecção por esse grupo de reovírus. Por outro lado, os reovírus aviários são importantes patógenos, que podem levar a perdas consideráveis na avicultura. A principal doença relacionada à infecção pelos reovírus aviários é a artrite/tenosinovite. Nosso modelo de estudo consistiu de duas amostras de reovírus aviários: S1133wt, uma amostra artrogênica isolada nos anos 70 nos EUA e P100, uma amostra vacinal atenuada derivada de S1133wt. Reportamos as seqüências completas de cinco dos dez segmentos de dsRNA que compõem cada genoma viral, caracterizando as diferenças entre as amostras, tanto ao nível de ácido nucléico quanto das seqüências protéicas deduzidas. As principais diferenças foram encontradas nas seqüências das proteínas σC, onde uma substituição de aminoácido, T106R, cria um ambiente favorável para formação de uma ponte salina entre Asp102 e Arg106. Para proteína µB foi criado um modelo tridimensional onde ficou demonstrado que três das substituições de aminoácidos estão localizadas na região responsável pela interação com a célula hospedeira durante a penetração da membrana plasmática. A segunda parte desta tese foi a expressão da proteína, de função desconhecida, p17 em E. Coli. As diferenças entre as amostras patogênica e vacinal observadas nesse estudo, certamente contribuirão para um melhor entendimento dos mecanismos envolvidos na patogênese e atenuação de amostras virais.

Palavras Chaves: reovírus aviário; análise de seqüências; bioinformática; patogênese; atenuação; proteína recombinante.

Rio de Janeiro

Agosto de 2006

V

ABSTRACT

MOLECULAR BASIS OF VIRAL ATTENUATION:

THE AVIAN REOVIRUS MODEL

Felipe Gomes Naveca

Orientadora: Vera de Souza Gouvêa

Abstract da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em

Ciências, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes (IMPPG), da

Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários

à obtenção do título de Doutor em Ciências (Microbiologia).

Reoviruses have long been used as a model to study viral pathogenesis in natural and experimental infections. A great deal of progress was achieved by studying mammalian reoviruses, but definitive association with a specific disease could not be established. On the other hand, avian reoviruses are important pathogens of poultry, which may lead to economic losses. The principal disease related to avian reovirus infection is viral arthritis, otherwise known as tenosynovitis, characterized by an intense inflammatory response in the hock joints and flexor tendons. Our study model consisted of two avian reoviruses: S1133wt, an arthrogenic strain isolated in 70´s in USA and P100, an attenuated vaccine strain derived from S1133wt. We report the complete sequences of five dsRNA segments of each virus genome, characterizing differences between the two strains at the nucleic acid and deduced protein levels. Major differences were found on σC, the virus spike, in which a residue substitution, T106R in P100, creates the environment of a predicted salt bridge between Asp102 and Arg106, and on µB protein, in which three important differences were located on 3D model at domain IV, responsible for interaction with the plasmatic membrane during infection. The second part of this thesis was the expression of p17 in E. Coli., an avian reovirus protein of yet unknown function. Differences between pathogenic and attenuated strains demonstrated in this study should contribute to a better understanding of the mechanisms involved in pathogenesis and attenuation of viral strains.

Keywords: avian reovirus; sequence analysis; bioinformatics; pathogenesis;

attenuation; recombinant protein.

Rio de Janeiro

Agosto de 2006

VI

Dedico esta Tese à minha família:

Minha mulher Vivianne,

Meu irmão Fábio e meus pais Vanda e Felipe.

Em especial aos meus incansáveis e queridos avós Tereza e Zildo,

Meu muito obrigado.

Aos meus saudosos avós Maria e João, In memorian.

VII

Agradecimentos

Ao final desta tese gostaria de expressar meus agradecimentos a todos aqueles que

de uma maneira ou de outra contribuíram para a sua realização.

Agradeço a Deus pela vida e pela saúde afim de que eu pudesse realizar esse

trabalho;

Agradeço a Professora Vera de Souza Gouvêa, minha orientadora, por ter

confiado em mim e ter me dado condições de desenvolver meu trabalho;

Agradeço a minha mulher Vivianne o carinho e a compreensão durante o

desenvolvimento desta tese;

Agradeço aos meus avós Teresa e Zildo pela dedicação demonstrada durante toda

minha vida estudantil;

Agradeço a meus pais Felipe e Vanda e a meu irmão Fábio pelas palavras de

incentivo em todos os momentos;

Agradeço a meus amigos e amigas do Laboratório de Virologia Molecular e

Tropical pelo convívio agradável e a ajuda no desenvolver dessa tese;

Agradeço a Professora Viviana Malirat e ao amigo José Barros pela ajuda com a

análise das seqüências obtidas nesta tese;

Agradeço ao professor José Nelson Couceiro do Laboratório de Virologia

Molecular I e aos professores Maria Isabel Liberto e Maulorí Curie Cabral do

Laboratório de Estruturas de Superfície e Interferon pela utilização da infra-estrutura

de seus laboratórios durante o desenvolvimento dessa tese;

Agradeço a todos os meus amigos do Departamento de Virologia, em especial a

amiga Marleide, por sempre estarem dispostos a colaborar;

Agradeço as minhas ex-orientadoras professoras Maria Genoveva Von Hubinger e

Iná Pires de Carvalho pela contribuição na minha formação acadêmica;

Agradeço ao Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, na pessoa de sua

diretora professora Ângela Hampshire;

Agradeço a Pós-graduação do Instituto de Microbiologia, na pessoa de sua

coordenadora à época de minha entrada no doutorado, professora Leila Fonseca;

Agradeço a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) pela bolsa de doutorado;

Agradeço a todos aqueles que se interessarem em consultar esta obra.

VIII

Sumário

1. Introdução 13 1.1 Histórico 13

1.2 Família Reoviridae 14

1.3 Gênero Orthoreovirus 14

1.3.1 Genoma 15

1.3.1.1 Genoma segmentado 15

1.3.1.2 Seqüências não traduzidas 18

1.3.2 Mutantes 19

1.3.3 Partículas virais e sub-virais 20

1.3.4 Proteínas Estruturais 22

1.3.5 Proteínas não estruturais 28

1.3.6 Replicação dos reovírus 29

1.3.6.1 Entrada dos reovírus nas células hospedeiras 30

1.3.6.2 A proteína de ligação à célula: σ1 31

1.3.6.3 Interações de μ1/μ1C com a membrana celular durante a penetração 32

1.4 Patogênese na infecção experimental 34

1.4.1 Infecção experimental em mamíferos 34

1.4.2 Reovírus aviários 36

1.4.2.1 Diagnóstico 41

1.4.2.2 Proteínas codificas pelos reovírus aviários 41

1.4.2.3 Prevenção e controle da infecção pelos reovírus aviários 44

2. Objetivos 47

3. Material e métodos 48 3.1 Amostras virais 48

3.1.2 Extração de dsRNA 49

3.1.3 Desenho dos iniciadores para o segmento S1 49

3.1.4 RT-PCR para o segmento genômico S1 50

3.1.5 Seqüenciamento do segmento genômico S1 51

3.1.6 Desenho dos iniciadores para os segmentos genômicos da classe M e S2 54

3.1.7 RT-PCR para os segmentos genômicos da classe M e S2 55

3.1.8 Amplificação por PCR dos segmentos genômicos classe M 56

3.1.9 Amplificação por PCR do segmento genômico S2 57

IX

3.1.10 Semi-nested PCR para segmentos da classe M e S2 58

3.1.11 Seqüenciamento dos segmentos genômicos da classe M e S2 60

3.1.12 Ferramentas de bioinformática utilizadas na análise das seqüências 64

3.2 Clonagem e expressão da proteína p17 68

3.2.1 Desenho dos iniciadores 68

3.2.2 Amplificação por PCR da ORF-p17 68

3.2.3 Purificação do amplicon ORF-p17 69

3.2.4 Clonagem da ORF-p17 no vetor pCR T7 / NT-TOPO 69

3.2.5 Transformação de células competentes TOP10F´ 69

3.2.6 Análise dos transformantes por PCR 70

3.2.7 Análise dos transformantes por seqüenciamento 70

3.2.8 Estocagem do clone com o plasmídeo TOPO-p17 71

3.2.9 Transformação de células BL21(DE3)pLysS 71

3.2.10 Indução da expressão da proteína p17 72

3.2.11 Análise da expressão da proteína His-p17 por SDS-PAGE 73

3.2.12 Confirmação da expressão de His-p17 por western blotting 74

4. Resultados 76 4.1. Seqüenciamento e análise dos segmentos genômicos M1, M2, M3, S1 e S2. 76

4.1.1 Desenho dos iniciadores para os segmentos M1, M2, M3, S1 e S2. 76

4.1.2 Transcrição reversa e amplificação das seqüências de cDNA por PCR 77

4.1.3 Comparação das seqüências dos segmentos M1, M2, M3, S1 e S2 77

4.1.4 Análise filogenética das proteínas µA, µB, µNS, p10, p17, σC e σA 84

4.1.5 Análise da seqüência das proteínas µA, µB, µNS, p10, p17, σC e σA 93

4.1.6 Alinhamento da região N-terminal de σC 102

4.1.7 Análise da hidrofobicidade da região N-terminal de σC 104

4.1.8 Modelagem por homologia da proteína µB 105

4.2 Expressão de p17 em sistema heterólogo 108

4.2.1 Amplificação e clonagem da ORF2 do segmento S1 de S1133wt 108

4.2.2 Seqüenciamento do plasmídeo TOPO-p17 108

4.2.3 Comprovação da expressão de His-p17 por SDS-PAGE e western-blotting 109

5. Discussão 111

6. Conclusões 127

7. Bibliografia 129

X

Índice de Figuras

Figura 1. Representação esquemática da partícula de reovírus. 22 Figura 2. Reconstrução 3D da secção central do vírion de ARV (amostra 138). 44 Figura 3. Estratégia de seqüenciamento do segmento S1. 52 Figura 4. Estratégia de semi-nested PCR para os segmentos da classe M e S2. 59 Figura 5. Estratégias de seqüenciamento para os segmentos da classe M e S2. 62 Figura 6. Árvore filogenética de µA. 85 Figura 7. Árvore filogenética de µB. 86 Figura 8. Árvore filogenética de µNS. 87 Figura 9. Árvore filogenética de p10. 88 Figura 10. Árvore filogenética de p17. 89 Figura 11. Árvore filogenética de σC. 91 Figura 12. Árvore filogenética de σA. 92 Figura 13. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µA de S1133wt. 96 Figura 14. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µA de P100. 96 Figura 15. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µB de S1133wt. 97 Figura 16. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µB de P100. 97 Figura 17. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µNS de S1133wt. 98 Figura 18. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µNS de P100. 98 Figura 19. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína p10 de S1133wt. 99 Figura 20. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína p10 de P100. 99 Figura 21. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína p17 de S1133wt. 99 Figura 22. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína p17 de P100. 99 Figura 23. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína σC de S1133wt. 100 Figura 24. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína σC de P100. 100 Figura 25. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína σA de S1133wt. 101 Figura 26. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína σA de P100. 101 Figura 27. Alinhamento N-Terminal das seqüências de σC, entre 35 amostras. 103 Figura 28. Gráfico de hidrofobicidade da região N-terminal de σC. 104 Figura 29. Alinhamento estrutural de µB versus µ1. 105 Figura 30 (A). Modelo 3-D da Proteína µB de P100. 106 Figura 30 (B). Modelo 3-D da Proteína µB de P100. 107 Figura 31. Seqüenciamento do plasmídeo TOPO-p17. 109 Figura 32. SDS-PAGE proteína His-p17. 110 Figura 33. Western-blotting proteína His-p17. 110

XI

Índice de Tabelas

Tabela 1. Segmentos genômicos e proteínas dos reovírus de mamíferos (T3D*). 17 Tabela 2. Segmentos genômicos e proteínas dos reovírus aviários. 43 Tabela 3. Iniciadores desenhados para esta tese. 63 Tabela 4A. Números de acesso no GenBank para as seqüências das proteínas µA, µB, µNS, p10, p17 e σA utilizadas nas análises. 66 Tabela 4B. Números de acesso no GenBank para as seqüências da proteína σC utilizadas nas análises. 67 Tabela 5. Diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento M1. 78 Tabela 6. Diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento M2. 80 Tabela 7. Diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento M3. 81 Tabela 8. Diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento S1. 82 Tabela 9. Diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento S2. 83 Tabela 10. Resultados da Ferramenta ProtParam. 93

XII

Abreviaturas utilizadas

μg Micrograma μl Microlitro Å Angstron AA Aminoácidos ATPase Adenosina Trifosfatase BCIP 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato bp Pares de base cap 7-metil guanosina trifosfato cDNA Ácido desoxirribonucléico complementar CEF Fibroblasto de embrião de galinha DMSO dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucléico dNTP Desoxirribonucleosídeo trifosfato dsRNA Ácido ribonucléico fita-dupla DTT Ditiotreitol EDTA Ácido etilenodiaminotetracético ELISA Ensaio imunoenzimático em fase sólida FAST Proteína transmembrana associada a fusão GITC Isotiocianato de guanidina HCA Análise de cluters hidrofóbicos IBDV Vírus da doença infecciosa da Bursa IFN Interferon IPTG Isopropil-β -D-thiogalactopiranosídeo ISVPs Partículas sub-virais infecciosas kDa Kilodaltons LB Meio Luria-Bertani MDa Mega Dalton mM Milimolar mRNA Ácido ribonucléico mensageiro NBT Nitro-azul tetrazolio nm Namômetro ORF Seqüência de leitura aberta PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida PCR Reação em cadeia da polimerase RdRp RNA polimerase RNA dependente RNA Ácido ribonucléico RPM Rotações por minuto RT Reação da transcriptase reversa RT-PCR Reação em cadeia da polimerase associada à transcrição reversa SCID Imunodeficiência combinada severa SDS Dodecil sulfato de sódio SPF Livre de patógeno específico TEMED N,N,N´,N´- tetrametiletilenodiamina ts Temperatura sensível UV Ultravioleta

13

1. Introdução

1.1 Histórico

Em 1959, Sabin propôs que um grupo de vírus previamente classificados como

membros do grupo 10 dos echovírus fossem re-classificados em uma nova família.

Como estes vírus eram tipicamente isolados do trato respiratório e gastrointestinal e

não estavam associados com nenhuma doença conhecida, ele propôs o nome reovírus

(respiratory, enteric, orphan viruses). No inicio dos anos 70 se descobriu um grande

grupo de vírus, denominados rotavírus. Devido à sua característica aparência na

microscopia eletrônica e ao seu genoma de RNA fita-dupla segmentado esses agentes

virais também foram introduzidos na família Reoviridae (Fields, 1996).

Os vírus de RNA fita-dupla são agrupados em 25 gêneros divididos em sete

famílias (Fauquet et al., 2005). Duas dessas famílias Reoviridae e Birnaviridae

infectam vertebrados e apenas os membros da família Reoviridae infectam mamíferos

(Nibert & Schiff, 2001).

Atualmente a família Reoviridae é constituída de doze gêneros: Orthoreovirus,

Orbivirus, Rotavirus, Coltivirus, Seadornavirus, Aquareovirus, Cypovirus,

Idnoreovirus, Fijivirus, Phytoreovirus, Oryzavirus e Mycoreovirus (Fauquet et al.,

2005). Quatro desses gêneros, Orthoreovirus, Orbivirus, Rotavirus e Coltivirus

infectam humanos, enquanto que os outros foram encontrados em insetos, plantas,

peixes, répteis, aves, aracnídeos, crustáceos e fungos (Mertens, 2004).

14

1.2 Família Reoviridae

Os vírus de genoma de RNA fita-dupla (dsRNA) ilustram o potencial de

evolução, organização e replicação que os genomas podem adotar. Vários patógenos

humanos apresentam este tipo de organização do genoma, sendo os principais os

rotavírus e o vírus da febre do carrapato do Colorado.

Os estudos com a família Reoviridae contribuíram para vários conceitos

fundamentais nos campos da virologia e biologia molecular (Nibert & Schiff, 2001).

Através desses estudos foram obtidas algumas das primeiras descobertas envolvendo

a síntese de RNA in vitro, além da evidência da estrutura do cap 5´ nos RNA

mensageiros (mRNA) eucarióticos, a importância destes no processo de tradução

protéica e a evidenciação da existência de uma seqüência consenso para o início da

tradução dos mRNA eucarióticos (Kozak & Shatkin, 1978).

Estudos relacionados às bases da patogênese viral, como o papel de uma

molécula receptora para a ligação da partícula viral, são outros exemplos de

descobertas obtidas através do estudo de vírus de genoma dsRNA, em particular os

reovírus de mamíferos (Nibert & Schiff, 2001).

1.3 Gênero Orthoreovirus

Os protótipos do gênero Orthoreovirus são os reovírus de mamíferos. Dessa

forma a grande maioria das informações obtidas no estudo dos reovírus são baseadas

na homologia entre os diferentes sorotipos desses vírus.

Uma amostra isolada de uma criança sadia é o protótipo do reovírus tipo 1 (T1L

ou Lang); uma outra isolada de uma criança com diarréia é o protótipo do reovírus

15

tipo 2 (T2J ou Jones); os protótipos do tipo 3 foram isolados de uma criança com

diarréia (T3D ou Dearing) e de uma criança com doença respiratória (T3A ou Abney)

(Nibert & Schiff, 2001).

1.3.1 Genoma

A observação de que células infectadas com reovírus coram-se

ortocromaticamente com Laranja de Acridina levou à descoberta de que o RNA

genômico era constituído de moléculas de fita-dupla. Todas as propriedades físico-

químicas do vírion são consistentes com sua natureza de vírus de genoma em fita-

dupla: (I) sua alta temperatura de desnaturação; (II) sua densidade de 1,61g/cm3 em

gradiente de CsCl, a qual é menor do que aquela esperada para RNA fita-simples; (III)

sua relativa resistência a RNase I, e susceptibilidade a RNase III, a qual é específica

para RNA fita-dupla. Ademais, a composição do RNA indica uma razão purina :

pirimidina de 1, sugerindo que existem duas fitas complementares. Estudos de

difração de raios-X indicam que o RNA fita-dupla dos reovírus forma uma dupla

hélice, orientada à direita, com aproximadamente 10 pares de base por volta, e

nucleotídeos orientados em um ângulo de 75-80o em relação ao longo do eixo (Nibert

& Schiff, 2001).

1.3.1.1 Genoma segmentado

O RNA dos reovírus ocorre em segmentos lineares discretos. A eletroforese em

gel de poliacrilamida revelou que se tratavam de dez segmentos de RNA fita-dupla

(Shatkin, Sipe & Loh, 1968). Uma outra evidência de que os fragmentos não são

16

artificialmente gerados a partir de uma única molécula incluem as observações de

que: (I) existem vinte terminais 3` hidroxila livres em cada partícula de reovírus; (II)

cada segmento possui um cap na extremidade 5`da fita positiva.

Os segmentos de RNA fita-dupla são resistentes à digestão pela nuclease S1,

indicando que as fitas positivas e negativas são colineares e complementares. Os

segmentos são separados em três classes: grandes (large ou L), médios (medium ou

M) e pequenos (small ou S), apresentando-se com três, três e quatro segmentos em

cada classe, respectivamente (Shatkin, Sipe & Loh, 1968). Dessa forma a classe de

segmentos grandes tem como representantes os segmentos L1, L2 e L3, a classe de

tamanho médio engloba os segmentos M1, M2 e M3, e finalmente na classe dos

pequenos, os segmentos: S1, S2, S3 e S4 (Nibert & Schiff, 2001).

Nas preparações purificadas existem quantidades equimolares dos dez

segmentos (Joklik, 1998). Os segmentos homólogos de diferentes isolados, incluindo

os três protótipos dos reovírus de mamíferos, exibem mobilidade eletroforética

diferente em um mesmo gel. O fato dos reovírus possuírem genoma de RNA fita-

dupla segmentado tem uma importante conseqüência biológica: a alta capacidade de

gerar rearranjos moleculares ou reagrupamentos (reassortment) durante infecções

mistas (Nibert & Schiff, 2001).

As proteínas codificadas pelos dez segmentos também podem ser separadas por

eletroforese em diferentes géis de SDS-PAGE (McCrae & Joklik, 1978). Os dez

segmentos dos reovírus codificam onze proteínas para os protótipos de mamíferos

(λ1, λ2, λ3, μ1, μ2, μNS, σ1, σ1s, σ2, σNS, σ3) sendo oito estruturais e três não

estruturais que medeiam funções durante as etapas da replicação viral (Nibert &

Schiff, 2001) (Tabela 1).

17

Tabela 1. Segmentos genômicos e proteínas dos reovírus de mamíferos (T3D*).

Segmento

Tamanho

(bp) Proteína

Tamanho

(AA) Massa (kDa)

Localização

No de cópias

Vírion Propriedades

L1 3854 λ3 1267 142 Capsídeo interno 12 RNA polimerase RNA dependente (RdRp)

L2 3916 λ2 1290 145 Capsídeo externo 60 Guanililtransferase

L3 3896 λ1 1233 137 Capsídeo interno 120 Liga-se ao dsRNA

M1 2304 μ2 736 83 Capsídeo interno 12 Co-fator RdRp

M2 2203 μ1 708 76 Capsídeo externo 600 Penetração / transcrição

M3 2235 μNS 719 80 Não estrutural 0 Montagem/ transcrição 2a

S1 1416 σ1 +σ1s 455 + 120 49 + 14 Capsídeo externo 36-48 / 0 Ligação à célula

S2 1331 σ2 418 47 Capsídeo interno 120-180 Liga-se a dsRNA

S3 1198 σNS 366 41 Não estrutural 0 Montagem

S4 1196 σ3 365 41 Capsídeo externo 600 Tradução

*Adaptado de (Nibert & Schiff, 2001).

18

Cada segmento genômico é transcrito em um mRNA que inclui uma longa

seqüência de leitura aberta (ORF) capaz de codificar a maior proteína prevista para

este segmento. Na maioria dos reovírus de mamíferos, o segmento genômico S1 é o

único que codifica uma segunda proteína, σ1s, em uma seqüência de leitura separada,

porém sobreposta, àquela de σ1. A exceção a esta regra é o reovírus Baboon, que

possui também o segmento S4 como bicistrônico (Dawe & Duncan, 2002). O códon

de iniciação para a tradução de σ1s é o primeiro AUG fora do código de leitura,

dentro da ORF para σ1. Outras seqüências de leitura aberta são encontradas em vários

segmentos genômicos dos reovírus, porém suas traduções em células infectadas ainda

não foram comprovadas (Nibert & Schiff, 2001).

1.3.1.2 Seqüências não traduzidas

Estudos de seqüenciamento revelaram que as regiões não traduzidas nos

terminais 5´ e 3´ presentes nos segmentos dos reovírus representam uma pequena

parte do genoma. O tamanho das regiões não traduzidas na extremidade 5´ varia entre

12 e 32 bases, e na extremidade 3´ varia entre 35 e 184 bases. Essas regiões não

traduzidas incluem seqüências para o empacotamento do mRNA, reconhecimento

pela RNA polimerase para iniciação da síntese das fitas positiva e negativa, e ainda

determinam a eficiência de tradução (Nibert & Schiff, 2001).

Estudos com criomicroscopia eletrônica e difração de raios-X de pequeno

ângulo indicam que o genoma dos reovírus se encontra dentro de uma esfera central

de 49nm de diâmetro, ordenado como hélices adjacentes localizadas paralelamente e

separadas por distâncias de 25 a 27Å (Joklik, 1998). O peso molecular total do RNA

genômico é calculado em 15,1 MDa (Nibert & Schiff, 2001).

19

1.3.2 Mutantes

Muitos progressos nos estudos dos reovírus foram obtidos através da análise de

amostras que surgem naturalmente, apresentando diferenças fenotípicas ou

polimorfismos (Ramig et al., 1978; Sharpe et al., 1978; Hrdy, Rosen & Fields, 1979;

Wu et al., 1994; Chappell et al., 1997). Um ensaio clássico tem sido o de identificar

um polimorfismo entre amostras, definir os eletroferótipos dos rearranjos obtidos

através da co-infecção com diferentes amostras e analisar as características

polimórficas desses rearranjos para associar isto a um segmento específico (Nibert &

Schiff, 2001).

Alguns estudos identificaram o segmento S1 como o determinante primário de

diferenças entre amostras, no que se refere a tropismo e/ou virulência (Chappell et al.,

1997; Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001). Alguns estudos tiveram êxito em

associar diferenças relativas a um único segmento, enquanto que outros verificaram

diferenças relativas a mais de um segmento (Nibert & Schiff, 2001). As diferenças

entre os eletroferótipos de diferentes amostras são além de úteis para estudos

genéticos, aplicados na classificação dos reovírus (Hrdy, Rosen & Fields, 1979; Wu et

al., 1994).

Com exceção do segmento genômico S1, os segmentos homólogos dos

protótipos são idênticos quanto ao tamanho, perfeitamente alinhados, sem gaps, e

muito similares quanto à seqüência, com 75 a 96% de identidade para os nucleotídeos

e 86 a 99% de identidade referente à seqüência de aminoácidos (Nibert & Schiff,

2001).

O segmento S1 dos reovírus é aquele que exibe a maior variabilidade. Esta

variabilidade inclui diferenças no tamanho, utilização de gaps para alinhar seqüências

20

deduzidas para a proteína σ1, com uma conseqüente redução na similaridade de 26 a

49% de identidade nestas seqüências entre diferentes amostras de reovírus (Nibert &

Schiff, 2001).

Uma característica importante encontrada em algumas amostras virais é o

fenótipo sensível à temperatura (ts). Os mutantes de reovírus sensíveis à temperatura

são definidos pela sua reduzida capacidade de replicação a 39oC, diferentemente do

que acontece a 31oC (Ramig et al., 1978). A reversão de mutantes ts para o fenótipo

normal pode ocorrer devido a uma mudança no mesmo segmento, no mesmo ponto da

mutação original (reversão verdadeira) ou em um segundo sítio (supressão

intragênica) (Nibert & Schiff, 2001). De uma maneira alternativa, uma mutação em

um segundo segmento pode suprimir o defeito produzido pela mutação original, o que

é chamado de supressão extragênica. Um possível mecanismo para supressão

extragênica envolve mutações em produtos gênicos que interagem diretamente (Nibert

& Schiff, 2001).

1.3.3 Partículas virais e sub-virais.

Os vírions podem ser convertidos em dois tipos distintos de partículas sub-

virais: partículas infecciosas ou ISVPs e o cerne. Essas partículas diferem em

composição protéica, conformação e outras propriedades biológicas e físico-químicas

(Nibert & Schiff, 2001). Estudos de microscopia eletrônica com coloração negativa

indicaram diâmetros de 73nm para os vírions, 64nm para as ISVPs e 51nm para os

cernes. Os diâmetros obtidos com criomicroscopias eletrônicas, nas quais artifícios

comuns à coloração negativa são mínimos foram: 85nm para os vírions, 80 para as

partículas sub-virais e 60nm para o cerne (excluindo-se as espículas). Os valores

21

obtidos através de criomicroscopia eletrônica corroboram aqueles encontrados por

difração de raios-X de pequeno ângulo (Nibert & Schiff, 2001).

As observações através da microscopia eletrônica com coloração negativa

definiram a organização das partículas de reovírus em duas camadas concêntricas de

proteínas denominadas capsídeo interno e externo, além do cerne englobando o

genoma de RNA fita-dupla (Joklik, 1998; Nibert & Schiff, 2001). A descrição de duas

camadas protéicas individualizadas é confirmada pelos resultados utilizando

espalhamento dinâmico de luz, difração de raios-X de pequeno ângulo, e

criomicroscopia eletrônica com reconstrução de imagens. Os capsídeos internos e

externos exibem simetria icosaédrica (Nibert & Schiff, 2001).

As proteínas λ2 (60 cópias) e μ1 (600 cópias) juntas formam a estrutura T=13

do capsídeo externo. As duas proteínas restantes, σ1 (36-48 cópias) e σ3 (600 cópias)

ocupam posições mais externas que λ2 e μ1 (Nibert & Schiff, 2001). As proteínas λ1

(120 cópias) e σ2 (120-180 cópias estimadas) são as principais proteínas do cerne e

formam a estrutura icosaédrica primária do capsídeo interno. As proteínas λ3 e μ2

(com números estimados de 12 cópias para cada uma) ainda não possuem suas

localizações exatas determinadas no capsídeo interno (Nibert & Schiff, 2001).

As partículas de reovírus são conhecidamente estáveis visto que mantêm sua

infecciosidade mesmo após longos períodos de estocagem. Tal como outros vírus não-

envelopados, possuem relativa resistência aos tratamentos com solventes orgânicos e

detergentes (Nibert & Schiff, 2001).

Os vírions resistem à exposição a forças iônicas extremas: variação de pH entre

dois e nove e a temperaturas de até 55oC. A exposição da partícula à radiação

ultravioleta ou à luz visível na presença de corantes fotoreativos causa uma redução

22

na infecciosidade de uma preparação viral. Os reovírus são estáveis em aerossóis,

especialmente em alta umidade (Nibert & Schiff, 2001). Aparentemente é a proteína

σ3 que dá ao vírion uma estabilidade maior que aquela das ISVPs e deve ser crucial

para manter infecciosa a partícula quando a mesma é transmitida entre diferentes

hospedeiros na natureza (Nibert & Schiff, 2001).

1.3.4 Proteínas Estruturais

As proteínas incorporadas aos vírions maduros (proteínas estruturais)

apresentam diversas funções relacionadas à infecção pelo reovírus. Essas mesmas

proteínas podem desempenhar importantes funções nas células infectadas (Nibert &

Schiff, 2001).

Figura 1. Representação esquemática da partícula de reovírus.

λ1, λ2, λ3, µ1C, µ2, σ1, σ2 e σ3 proteínas estruturais; L, M, S classe de segmentos

genômicos. Adaptado de Duncan, 1996.

23

λ1

A proteína λ1 é o principal componente do capsídeo interno, onde interage com

as proteínas σ2, λ3 e com λ2, a espícula do cerne (McCrae & Joklik, 1978). Esta

proteína também pode interagir com a proteína do capsídeo externo μ1. A dedução da

seqüência de aminoácidos de λ1 inclui um motivo de ligação a nucleotídeos próximos

à região N-terminal, sugerindo uma atividade enzimática relacionada à transcrição

(Yue & Shatkin, 1998).

A seqüência de λ1 contém um motivo de “dedo de zinco” próximo ao terminal

amino. O papel do Zn2+ na função de λ1 é desconhecido, todavia, a proteína λ1 pode

se ligar a RNA fita-dupla, sugerindo que o “dedo de zinco” possa estar envolvido

nesta atividade (Nibert & Schiff, 2001).

λ2

Pentâmeros da proteína λ2 formam as espículas do cerne nas partículas de

reovírus. Acredita-se que λ2 interaja com σ1, σ3 e μ1 no capsídeo externo e com λ1 e

λ3 no capsídeo interno (Nibert & Schiff, 2001). Vírus mutantes, sensíveis à

temperatura, que apresentam lesões no segmento L2, que codifica λ2, formam, em

temperaturas não permissivas, partículas semelhantes ao cerne, mas não partículas

inteiras, sugerindo um papel para λ2 na montagem do capsídeo externo.

Estudos bioquímicos demonstraram que λ2 é a guanililtransferase dos reovírus

(Yue & Shatkin, 1998). A proteína λ2 também pode agir como uma metiltransferase

que modifica as bases de guanina na extremidade 5´ do mRNA dos reovírus (Yue &

Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001).

24

λ3

A proteína λ3 é encontrada em pequena quantidade no capsídeo interno, porém

sua localização exata no cerne ainda não foi determinada. Esta proteína interage com

λ1 e λ2 e acredita-se que também interaja com μ2 (McCrae & Joklik, 1978; Nibert &

Schiff, 2001).

Partículas virais mutantes ts com lesões no segmento L1 apresentam a síntese de

RNA seriamente afetada e formam partículas vazias em temperaturas não

permissíveis (Ramig et al., 1978). A seqüência de aminoácidos deduzida de λ3 inclui

um motivo GDD comum a todas as polimerases (Nibert & Schiff, 2001). A expressão

de λ3 através de um vetor vaccínia revelou uma proteína com uma atividade de

polimerase poli(C)-poli(G) dependente. Estes resultados sugerem que λ3 contêm o

sítio catalítico da RNA polimerase RNA-dependente (RdRp) dos reovírus (Yue &

Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001). Tal como outras enzimas com a mesma

atividade supõe-se que λ3 funcione durante a transcrição e a síntese da fita negativa

do genoma viral na presença de co-fatores (Nibert & Schiff, 2001).

μ1

A proteína μ1 é o principal componente do capsídeo externo (McCrae & Joklik,

1978), onde interage com as proteínas λ2 e σ3. Evidências genéticas sugerem ainda

que esta proteína também interage com λ1, proteína do capsídeo interno (Nibert &

Schiff, 2001). A proteína μ1 é modificada pela adição de um ácido mirístico na região

N-terminal. A presença deste grupamento miristoil em μ1 confere caráter hidrofóbico

a esta região da proteína, sugerindo participação durante a penetração nas membranas

celulares (Yue & Shatkin, 1998).

25

A maioria das proteínas μ1 existentes no capsídeo externo são encontradas na

forma de um fragmento de 72-kDa, μ1C, gerado através da clivagem proteolítica de

μ1, entre os resíduos de Asn42 e Pro43 (Nibert & Schiff, 2001; Su et al., 2006). As

proteínas μ1 e μ1C passam por uma distinta clivagem proteolítica próximo às suas

extremidades carboxílicas quando expostas a proteases in vitro, ou quando dentro dos

compartimentos endocíticos de células infectadas. Esta clivagem gera um fragmento

N-terminal denominado μ1δ, quando derivado de μ1, e denominado δ quando

derivado de μ1C, tal como um fragmento C-terminal menor, altamente básico,

denominado φ. Acredita-se que a clivagem proteolítica de μ1/μ1C seja importante

para a penetração de membranas celulares (Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff,

2001).

A apoptose, induzida pelos reovírus, já foi associada às proteínas σ1 e µ1,

contudo um estudo recente associa µ1 como único determinante viral para apoptose

induzida pela ligação de partículas opsonizadas via receptor de Fc, nesse caso a

proteína µ1 teria um papel essencial na sinalização de estímulos pré-apoptóticos

(Danthi et al., 2006).

μ2

μ2, assim como λ3, é uma proteína encontrada em pequena quantidade no

capsídeo interno (Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001). Foram relatados

casos de mutantes defeituosos no segmento M1 que falhavam na síntese do RNA fita-

dupla, o que pode sugerir um papel inicial para esta proteína na síntese de RNA, ou na

montagem da estrutura em fita-dupla (Brentano et al., 1998; Yue & Shatkin, 1998).

De fato a proteína µ2 já foi associada a diversas funções biológicas tais como:

NTPase, ligação a RNA, associação com microtúbulos e co-fator da RNA dependente

26

RNA polimerase viral (Su et al., 2006) Outros trabalhos sugerem que μ2 pode

determinar diferenças na extensão do efeito citopático e no tamanho das placas em

ensaios de plaqueamento. Existe ainda uma hipótese de que μ2 possa agir como um

regulador dos efeitos citopáticos ao nível da transcrição in vivo (Nibert & Schiff,

2001).

σ1

A proteína σ1 é a responsável pela ligação à célula hospedeira. É a

hemaglutinina viral e contém os epítopos primários para os quais a resposta específica

é dirigida (Chappell et al., 1997; Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001). A

proteína σ1 interage com λ2 e talvez com σ3 no capsídeo externo (Nibert & Schiff,

2001). σ1 está presente tanto nos vírions como nas ISVPs em uma forma oligomérica

e pode assumir uma conformação estendida na qual aparece como uma longa fibra

com uma morfologia de “cabeça e cauda” projetando-se a partir da superfície da

partícula.

Estudos com a mutagênese de resíduos conservados na porção N-terminal de σ1

sugerem que aminoácidos não contínuos contribuam para a estrutura e função do

domínio de ligação ao receptor (Nibert & Schiff, 2001). Um grande número de

trabalhos sugere que σ1 atinja sua conformação nativa via um processo em etapas

(Yue & Shatkin, 1998). Monômeros de σ1 não se ligam às células e exibem uma

extrema sensibilidade às proteases, indicando a importância da oligomerização de σ1

para sua estrutura final e função biológica (Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff,

2001).

27

σ2

A proteína σ2 interage com λ1 para formar o capsídeo interno. Partículas de

vírus com mutações no segmento genômico σ2 apresentam redução na síntese de

RNA e formam capsídeos vazios quando em temperaturas não permissíveis, o que

sugere que σ2 esteja envolvida em uma ou mais etapas da montagem da partícula,

incluindo o recrutamento de moléculas de RNA ou a replicação (Nibert & Schiff,

2001). O estudo de mutantes ts mostrou que a reversão para o fenótipo normal se dá

exclusivamente através de eventos intragênicos. Em todos os casos analisados foi

observada uma reversão verdadeira no resíduo 383 (Coombs, 1996).

σ3

A proteína σ3, juntamente com μ1, forma a base do capsídeo externo. As

evidências mostram que σ3 interage com λ2 e μ1 e talvez com σ1 nos vírions (Nibert

& Schiff, 2001). Essa proteína aparenta ser responsável pela estabilidade da partícula

em ambientes extracelulares, entretanto, é necessária que seja feita a sua remoção dos

vírions, por meio de proteólise, para que a infecção ocorra (Yue & Shatkin, 1998;

Nibert & Schiff, 2001). Estudos analisando o segmento S4 levam a crer que σ3

desempenhe um papel importante na montagem do capsídeo externo. Alguns estudos

genéticos sugerem que mutações no segmento S4 são responsáveis pelo

estabelecimento de infecções persistentes, enquanto outros estudos sugerem que S4

seja responsável pela inibição da síntese de RNA e proteínas celulares (Nibert &

Schiff, 2001).

28

1.3.5 Proteínas não estruturais

A análise das proteínas sintetizadas nas células infectadas com reovírus levou à

descoberta de duas proteínas não estruturais μNS e σNS (McCrae & Joklik, 1978;

Nibert & Schiff, 2001). Essas proteínas são sintetizadas em grande quantidade nas

células sugerindo que, como elas não são proteínas estruturais dos vírions, devem

desempenhar papeis chaves na montagem das partículas. Estudos posteriores levaram

à identificação de uma outra proteína não estrutural codificada por uma segunda ORF

no segmento S1. Essa proteína é denominada σ1s e está presente em quantidade

relativamente pequena (Nibert & Schiff, 2001).

μNS / μNSc

Duas proteínas relacionadas, μNS e μNSc são produzidas em quantidades

similares nas células infectadas por reovírus (McCrae & Joklik, 1978). Embora

anteriormente se achasse que μNSc era um produto da clivagem de μNS, estudos

recentes mostram que μNSc é sintetizada a partir de uma tradução alternativa que se

inicia de um segundo AUG na seqüência de leitura aberta (Nibert & Schiff, 2001).

Outros estudos verificaram que a única diferença das duas proteínas é que μNS possui

5 kDa a mais que μNSc na sua região N-terminal. Não se conhecem diferenças

funcionais entre μNS e μNSc. A proteína μNS associa-se com o citoesqueleto, para

talvez, ancorar as estruturas virais. O mRNA dos reovírus liga-se a μNS logo após a

síntese, antes de se ligar a outras proteínas (Nibert & Schiff, 2001).

σNS

A proteína σNS é rica em cisteínas e, em seqüências capazes de formar α-

hélices. Ela apresenta grande afinidade por RNA fita-simples (Yin & Lee, 1998; Yin

29

& Lee, 2000). A proteína σNS liga-se de uma maneira única a cada classe de tamanho

do mRNA; acredita-se que essa atividade de ligação ao mRNA seja responsável pela

formação de complexos das moléculas durante a morfogênese (Nibert & Schiff,

2001).

σ1s

Estudos de seqüenciamento indicam que σ1s é uma proteína básica e que um

conjunto de resíduos básicos na região N-terminal é conservado entre as proteínas

σ1s. Essa proteína pode ser responsável por algumas das funções biológicas

associadas ao segmento S1 e atribuídas à proteína σ1, tais como a inibição da síntese

de DNA celular. Todavia, a proteína σ1s parece ser dispensável para propagação em

cultura de células (Rodgers et al., 1998; Nibert & Schiff, 2001).

1.3.6 Replicação dos reovírus

De uma maneira geral, as amostras virais são selecionadas de forma que,

somente se estabelecem aquelas que conseguem utilizar sua limitada informação

genética de maneira a vencer as barreiras de defesa do hospedeiro (Duncan, 1996).

Os vírus de RNA fita-dupla multisegmentados, tais como os reovírus,

aparentemente possuem funções ligadas a replicação ao nível de proteínas estruturais,

ao invés do mRNA. Nas infecções por reovírus são produzidos mRNAs que

correspondem a praticamente todo o tamanho do segmento genômico, não sofrem

splicing e, com uma exceção, possuem uma única seqüência de leitura aberta (ORF).

A maioria das proteínas estruturais, se não todas, possuem atividades enzimáticas que

são essenciais para a propagação viral (Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001).

30

1.3.6.1 Entrada dos reovírus nas células hospedeiras

A fase de entrada, na infecção pelos reovírus, inclui diversas etapas distintas:

ligação à superfície celular, endocitose, internalização e desnudamento. As proteínas

do capsídeo externo σ1, μ1/μ1C e σ3 estão todas envolvidas nesses eventos (Yue &

Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001).

A entrada dos reovírus nas células hospedeiras é mediada primeiramente por

interações de μ1/μ1C e σ1 com os componentes e receptores presentes na superfície

celular (Sharpe & Fields, 1981; Yin & Lee, 1998). Uma etapa chave no processo de

desnudamento é a remoção proteolítica da proteína σ3 gerando as ISVPs. Essas

partículas contêm fragmentos gerados através de clivagem de μ1/μ1C e possuem a

proteína σ1 em uma conformação estendida. As ISVPs são infecciosas e são geradas

em sítios extracelulares in vivo e dentro dos endossomos tardios ou lisossomos de

células infectadas (Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001). Dentro destes

vacúolos lisossomais as proteínas do capsídeo externo sofrem clivagens específicas,

que são dependentes de pH ácido e representam uma etapa essencial no processo de

infecção. Este processo é mediado in vivo por uma ou mais proteases endossomais e

pode ser mimetizado in vitro pela digestão de vírions purificados com quimotripsina.

A entrada das ISVPs, geradas por proteólise extracelular, é independente de pH ácido

e não requer endocitose (Nibert & Schiff, 2001). A remoção de σ1 e μ1 das ISVPs

resulta no cerne, que são partículas subvirais não infecciosas, porém ativas para a

transcrição. As ISVPs são as formas predominantes do vírus encontradas nas

primeiras 8 horas de infecção (Nibert & Schiff, 2001).

31

Embora as etapas iniciais da infecção por reovírus estejam descritas como uma

endocitose mediada por receptor, seguida da associação dos vacúolos com

endossomas e lisossomas, alguns detalhes das interações entre as proteínas do

capsídeo e das proteínas da superfície viral com a membrana celular permanecem

indefinidos (Yue & Shatkin, 1998).

1.3.6.2 A proteína de ligação à célula: σ1

Um grande número de trabalhos demonstrou que σ1, a hemaglutinina viral,

medeia a ligação do vírus aos receptores celulares (Chappell et al., 1997; Yue &

Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001). Embora σ1 seja o componente em menor

quantidade na superfície do vírion, é responsável pelo sorotipagem, infecciosidade e

tropismo celular. Esta proteína interage no capsídeo externo com σ3 e a proteína

pentamérica λ2 (Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001).

Baseando-se nas diferenças de infecciosidade e hemaglutinação específica dos

vírions e das partículas sub-virais infecciosas derivadas de diferentes amostras, foi

sugerido que a proteína σ1 do sorotipo 3 (T3D) contém mais de um domínio de

ligação aos receptores celulares (Nibert & Schiff, 2001). A glicoforina A poderia agir

como um receptor para os reovírus (Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001),

porém, recentemente, foi descrito que a molécula de adesão de junção (JAM) é o

principal receptor celular para os reovírus de mamíferos (Barton et al., 2001). Foi,

também, demonstrado que o ácido siálico pode agir como co-receptor (Yue &

Shatkin, 1998; Tyler, 2001).

32

1.3.6.3 Interações de μ1/μ1C com a membrana celular durante a penetração

Existe um consenso de que a principal proteína do capsídeo externo μ1/μ1C

desempenhe um papel importante na penetração das partículas de reovírus na

membrana da célula hospedeira (Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001).

O desnudamento do vírus é geralmente precedido da remoção de σ3 para expor

um domínio de interação com a membrana em μ1/μ1C. Esta proteína contém uma

seqüência de miristilação conservada na região N-terminal que é modificada tanto in

vitro quanto in vivo pela adição de um grupamento miristil ao resíduo de glicina na

posição dois. A adição de grupamentos de ácidos graxos aumenta a hidrofobicidade, o

que, presumivelmente, facilita a interação com a membrana celular. Em segundo lugar

diversas regiões distintas de hidrofobicidade estão presentes na região N-terminal de

μ1, e um longo par de α-hélices anfipáticas delimitam um sítio de clivagem para

tripsina ou quimotripsina na região C-terminal (Yue & Shatkin, 1998).

μ1C e μ1 são ambas clivadas na região C-terminal para gerar o grande

fragmento N-terminal δ (ou μ1δ) e um fragmento menor φ. Este processamento

proteolítico ocorre in vivo nos endossomos e lisossomos tardios e pode ser

mimetizado pelo tratamento com proteases em preparações de vírions purificados. As

ISVPs resultantes contêm quantidades estoiquiométricas de δ (μ1δ) e φ (Yue &

Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001).

Em concordância com esses resultados, a entrada dos reovírus em células L de

camundongo é dependente da atividade próton-ATPase no vacúolo, que pode

acidificar os endossomos e ativar as proteases. Foi também sugerido que a região

33

central de μ1/μ1C seria também responsável pela permeabilização da membrana

celular (Yue & Shatkin, 1998).

Muito avanço vem sendo alcançado no estudo dos mecanismos pelo quais os

reovírus e outros vírus não-envelopados tais como os rotavírus penetram a bicamada

lipídica (Dormitzer et al., 2004; Zhang et al., 2005a). De acordo com o papel de

penetração na membrana descrito para a proteína μ1/μ1C processada, partículas de

reovírus ts defeituosas no segmento M2 ficam aparentemente aprisionadas nos

endossomos nas temperaturas não permissíveis, o que resulta em um decréscimo na

replicação (Yue & Shatkin, 1998; Zhang et al., 2005a).

A transcrição dos reovírus é conservativa e assimétrica. Dez diferentes

transcritos foram identificados por hibridização e seqüenciamento e aparentam

representar cópias inteiras dos dez fragmentos genômicos. Durante a morfogênese, as

proteínas dos reovírus desempenham atividades de polimerase, helicase, RNA tri-

fosfatase, guanililtransferase e metiltransferase (Yue & Shatkin, 1998; Nibert &

Schiff, 2001; Tyler, 2001).

Dois tipos de transcrição ocorrerem no interior de células infectadas. A

transcrição primária mediada pelas partículas sub-virais que entraram na célula e a

transcrição secundária mediada pelas partículas recém formadas. Os transcritos

primários são detectados cerca de duas horas pós-infecção (pi), atingindo um pico

máximo entre 6-8 horas pi e, a partir de 12 horas pi não são mais detectados (Nibert &

Schiff, 2001). Após dez horas de infecção quase todas as proteínas sintetizadas pela

célula são virais (Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001; Tyler, 2001).

O mecanismo pelo qual os segmentos genômicos são colocados no interior do

vírion recém montado permanece obscuro. De uma maneira geral é aceito que o

34

arranjo dos dez segmentos genômicos ocorre ao nível de mRNA e a síntese da fita

negativa para formação do RNA fita-dupla se dá no interior das partículas virais

recém formadas (Joklik, 1998; Patton & Spencer, 2000).

A replicação dos reovírus desenvolve a formação de viroplasmas (locais onde

ficam agrupadas as proteínas virais), reorganização de elementos do citoesqueleto,

inibição da síntese de DNA, RNA e proteínas celulares, além da indução de interferon

e outras citocinas (Martínez-Costas et al., 2000; Tyler, 2001; Forrest & Dermody,

2003).

1.4 Patogênese na infecção experimental

1.4.1 Infecção experimental em mamíferos

A patogenia viral é o processo pelo qual são produzidas doenças durante um

quadro de virose. Muito do conhecimento sobre a patogenia causada pelas infecções

virais foi obtido através do estudo em modelos animais. Esses modelos, mesmo não

sendo perfeitos, são muitas vezes, aquilo de mais próximo que se pode chegar para a

compreensão de doenças humanas. A patogenia das infecções virais está intimamente

ligada à virulência de uma amostra viral e à capacidade de resposta do hospedeiro

frente à infecção (Tyler & Nathanson, 2001).

A virulência de uma amostra viral é definida como sua capacidade de quando

comparada com outras amostras semelhantes, produzir danos ao hospedeiro. Dessa

maneira, a virulência está ligada a fatores tais como o tamanho do inóculo, capacidade

de resistir ao meio ambiente até chegar a um hospedeiro suscetível, rota de entrada e

fatores genéticos de melhor adaptação da amostra frente ao hospedeiro. Enquanto que

35

os fatores relativos ao hospedeiro: idade, sexo, estado imunitário e espécie, estão

intimamente ligados à defesa do organismo (Tyler & Nathanson, 2001).

Uma vez infectado um hospedeiro susceptível, há um processo de replicação

inicial com conseqüente aumento do número de partículas virais, geralmente próximo

ao local de entrada. As amostras virais que produzem infecções sistêmicas precisam

ainda vencer barreiras do hospedeiro a fim de utilizar as principais vias de

disseminação pelo organismo: sanguínea, linfática e neural. Atravessar com sucesso

todas essas etapas resulta na chance de estabelecer o quadro clínico associado à

determinada virose (Tyler & Nathanson, 2001).

Em modelos experimentais observou-se que os reovírus são capazes de

espalhar-se a partir do trato gastrintestinal para outros órgãos e até atingir o sistema

nervoso central (SNC) após inoculação oral. Estudos com rearranjos entre os

protótipos T1L X T3D indicaram que o segmento S1 determina o padrão de

espalhamento da infecção dos músculos para o SNC (Tyler, 2001). A importância do

segmento S1 para o neurotropismo também é verificada em culturas de células

neuronais (Sharpe & Fields, 1981; Chappell et al., 1997; Tyler, 2001). Ensaios

envolvendo rearranjos entre diferentes amostras dentro do sorotipo T3 mostraram que

o segmento M2 também era responsável pela neurovirulência (Rubin & Fields, 1980).

Esses foram experimentos clássicos mostrando as diferentes capacidades patogênicas

de diferentes sorotipos de reovírus.

Outros quadros clínicos relacionados à inoculação de reovírus via

intraperitoneal em camundongos SCID e nude são: miocardite, característica

associada aos segmentos M1 e L2; infecção pulmonar associada ao segmento S1 e

inflamações hepatobiliares, pancreáticas e endócrinas ainda não associadas a um

36

determinado segmento (Chappell et al., 1997; Brentano et al., 1998; Tyler, 2001;

Forrest & Dermody, 2003).

Os Orthoreovirus nunca foram comprovadamente associados a nenhum quadro

clínico específico em mamíferos, por via de infecção natural, dessa forma não são

considerados patógenos para o homem. Apesar de não se ter uma comprovação de que

os reovírus são responsáveis por quadros clínicos no homem, esses vírus já foram

isolados de casos de enterite, infecções respiratórias, exantema, hepatite neonatal,

miocardite e de casos de linfoma de Burkitt (Tyler, 2001).

De uma maneira geral, a grande maioria das infecções por reovírus são

assintomáticas e levantamentos epidemiológicos mostram que a maioria das pessoas

possui anticorpos para os reovírus já na infância (Tyler, 2001).

1.4.2 Reovírus aviários

Ao contrário dos reovírus de mamíferos, os reovírus aviários (ARV) são uma

importante causa de diversas doenças que causam considerável perda na criação de

aves (Gouvea & Schnitzer, 1982; Gouvea et al., 1983; Jones, 2000).

Os resultados de estudos presentes na literatura sugerem que os reovírus

aviários são muito similares, em estrutura e composição molecular, aos reovírus de

mamíferos (Schnitzer, Ramos & Gouvea, 1982; Varela et al., 1996; Martínez-Costas

et al., 1997). Os reovírus aviários diferem dos de mamíferos na ausência de

capacidade hemaglutinante, na capacidade de induzir fusão celular, na variação de

hospedeiro e na associação com importantes condições patológicas (Duncan, 1996;

Duncan & Sullivan, 1998).

37

A infecção pelos reovírus aviários é bastante difundida e todos os animais de

granja são infectados em algum momento da vida. Todavia, cerca de 85-90% das

infecções não são patogênicas. Estudos sobre a estabilidade das partículas de reovírus

em materiais comuns encontrados nas granjas mostraram que as partículas podem

permanecer infecciosas mesmo após dez dias em penas, madeira, vidro, borracha,

metal galvanizado e água. As partículas de reovírus aviários são resistentes a agentes

químicos tais como formaldeído 2% e fenol 2%, porém são rapidamente inativadas

pelo álcool etílico (Jones, 2000).

A artrite/tenosinovite é o quadro clínico característico da infecção patogênica

pelos reovírus aviários. Outros quadros tais como: enterite ulcerativa, doença

respiratória, osteoartrite, hepatite e lesões cardíacas (Gouvea & Schnitzer, 1982) e/ou

renais em aves jovens e a síndrome de má-absorção são relacionados às infecções

pelos reovírus (van der Heide, Lutticken & Horzinek, 1981; Sterner et al., 1989;

Jones, 2000). Mesmo amostras virais caracterizadas como artrotrópicas são

encontradas em vários tecidos durante a fase inicial da doença. Vasconcelos et al.,

(2001b) observaram lesões esplênicas 48 horas após a inoculação de uma amostra

artrogênica de reovírus aviários, 72 horas pi foram observadas processos inflamatórios

no miocárdio e fígado.

Em um grande número de casos de síndrome de má-absorção foram encontrados

outros agentes infecciosos tais como: parvovírus, enterovírus, calicivírus bem como

alguns tipos de bactérias. Este fato leva à suspeita de que a síndrome de má-absorção

seja uma doença multi-fatorial, no entanto as amostras de reovírus 1733 e 2408,

classificadas como altamente patogênicas (Rosenberger et al., 1989), são capazes de

induzir a síndrome de má-aborção sem a presença de outros patógenos (van der

Heide, 2000).

38

A artrite/tenosinovite é uma doença predominantemente de aves para abate e é

uma importante causa de fraqueza nas pernas. As aves maiores geralmente

manifestam os piores quadros de artrite/tenosinovite em função até do próprio peso,

contudo o nível de comprometimento patológico é determinado por um conjunto de

fatores que vão desde a idade da ave, desenvolvimento do sistema imune, até a

variante com que a ave foi infectada (Rosenberger et al., 1989; Sterner et al., 1989;

Jones, 2000).

Essa condição clínica é rara em aves com menos de quatro a cinco semanas e é

comumente encontrada em aves de até dezesseis semanas de idade, com um pico de

incidência por volta das sete semanas de vida. Os efeitos patogênicos podem variar

em função da amostra com que a ave está infectada, sendo que a grande maioria das

amostras patogênicas apresenta tropismo pelos tecidos das juntas (Jones, 2000).Vários

estudos têm demonstrado que o tropismo e a virulência das amostras de reovírus

aviários são geneticamente determinados pelo segmento S1. Mecanismos de

patogênese também estão associados a segmentos da classe M (Huang et al., 1987b).

Os reovírus aviários causam lesões de caráter inflamatório crônico na

articulação tibiotársica levando as aves acometidas a dificuldade de locomoção e

alteração na conversão alimentar, havendo incidência de mortes devido a desidratação

e desnutrição. A primeira alteração observada na articulação de aves inoculadas tanto

por via oral como no coxim plantar é um infiltrado inflamatório na bainha tendinosa

do tendão flexor digital cerca de uma semana após a inoculação, porém quando o

local inoculado é o coxim plantar, as primeiras lesões locais são observadas cerca de

24 horas pi (Vasconcelos et al., 2001a).

Na inoculação oral, as partículas virais são replicadas primeiramente no epitélio

intestinal atingindo a circulação através das Placas de Peyer. O aparecimento do

39

infiltrado inflamatório com presença de heterófilos e células mononucleares é a lesão

característica da fase aguda, enquanto que a formação de folículos linfóides, a

hiperplasia das células da membrana sinovial e a fibroplasia com substituição do

tecido tendíneo por fibrose são alterações encontradas na fase de cronificação da

doença (Vasconcelos et al., 2001a).

A maior severidade das lesões provocadas pela inoculação no coxim plantar em

relação aquelas encontradas através da inoculação por via oral sugerem que baixos

títulos virais atinjam as articulações, uma vez que grande parte das partículas virais é

excretada nas fezes. Seguindo este raciocínio, altos títulos virais estão relacionados ao

nível de patogênicidade observada em uma infecção, além de que na via de

inoculação oral haveria maior probabilidade de sensibilizar o sistema imunológico

(Vasconcelos et al., 2001a).

A reação inflamatória pode ser tão intensa que, nos casos mais graves, ocorre a

ruptura total dos tendões e a necrose da cartilagem da articulação. A ruptura dos

tendões é acompanhada de uma intensa hemorragia. Alguns agentes infecciosos tais

como Mycoplasma synoviae, Staphylococcus aureus, os vírus IBDV (Infectious

bursal disease virus) e o vírus da anemia das galinhas parecem aumentar os efeitos

patogênicos da infecção pelos reovírus aviários (Shirai et al., 1990; Jones, 2000).

Aves adultas SPF, infectadas experimentalmente via nasal, apresentam o vírus

distribuído por todo o trato respiratório, entérico e nas juntas. Após três dias o vírus

pode ser encontrado por todo o corpo. Anticorpos circulantes podem ser

demonstrados no soro de aves infectadas através de técnicas de neutralização,

imunodifusão e ELISA. Os anticorpos maternos (imunização passiva) são eficazes na

proteção da prole sendo assim uma das bases da imunização em granjas (Jones, 2000).

40

Alguns trabalhos sugerem que a artrite causada pela infecção com reovírus

aviários é uma doença auto-imune e que, como tal, poderia servir de modelo para a

artrite reumatóide em humanos. Apesar de algumas evidências apontarem para essa

semelhança, nenhum fator reumatóide foi demonstrado. A infecção pelos reovírus

aviários não compromete a capacidade funcional das células T, porém induz a

ativação de macrófagos supressores que inibem a função das células T (Jones, 2000).

A resistência de aves mais velhas à infecção pelos reovírus pode estar

relacionada à maturação da resposta imune mediada por células T. A maturação dos

macrófagos também pode estar relacionada a esta resistência, uma vez que essas

células são possíveis alvos da infecção e, com o amadurecimento, teriam melhores

condições de responder à infecção (Roessler & Rosenberger, 1989; O´Hara et al.,

2001). Quando não leva ao óbito, a infecção pelos reovírus aviários pode levar ao

estabelecimento de um quadro de persistência, principalmente se a infecção for

causada por uma amostra de alto grau de patogenicidade (Jones, 2000).

A transmissão dos vírus se dá tanto vertical como horizontalmente, conforme

pode ser confirmado em laboratório (Menendez, Calnek & Cowen, 1974). Os estudos

de campo mostram que é comum encontrar infecções mistas em uma mesma ave,

assim, mais de uma amostra de reovírus pode ser isolada de um mesmo animal

(Moradian, Thorsen & Julian, 1990; Shirai et al., 1990).

Devido a uma série de fatores que vão desde a grande resistência da partícula de

reovírus até a rota de transmissão, torna-se praticamente impossível a criação de aves

livres de reovírus. Esse fato demonstra que são imprescindíveis uma boa estratégia de

vacinação e a caracterização das amostras em circulação (Jones, 2000).

41

1.4.2.1 Diagnóstico

O diagnóstico da infecção pelos reovírus requer uma confirmação laboratorial

através do isolamento do vírus proveniente das juntas afetadas. Alguns métodos

rápidos têm sido utilizados, tais como o PCR. Na rotina das granjas são utilizadas

técnicas sorológicas, principalmente a de ELISA, porém devido à infecção pelos

reovírus ser muitas vezes sub-clínica, a interpretação dos resultados torna-se difícil

(Jones, 2000).

Diversos tipos de cultura de células primárias de embriões ou de aves adultas

são susceptíveis à infecção pelos reovírus aviários, sendo as células de fígado de

embrião de galinha (CELi) as mais sensíveis (Gouvea & Schnitzer, 1982). O típico

efeito citopático observado em culturas de células infectadas com os reovírus aviários

é a formação de sincícios (Gouvea et al., 1983; Theophilos, Huang & Holmes, 1995;

Jones, 2000).

1.4.2.2 Proteínas codificas pelos reovírus aviários

A capacidade fusogênica dos reovírus aviários tem sido alvo de alguns estudos

recentes (Shmulevitz & Duncan, 2000; Bodélon et al., 2002). Esses trabalhos

mostraram que essa capacidade fusogênica é atribuída a uma proteína não estrutural

(p10) codificada pela menor ORF das três do segmento S1 (Bodélon et al., 2001).

Essa proteína apresenta uma estrutura bem diferente das demais proteínas fusogênicas

conhecidas, sendo assim, foi criada uma nova família com a sigla FAST - fusion-

associated small transmembrane (Shmulevitz & Duncan, 2000).

42

Existem outros dois reovírus que induzem a formação de sincícios e não são

vírus de aves: o vírus Nelson Bay e o vírus Baboon, os quais apresentam proteínas

não estruturais semelhantes à p10 dos reovírus aviários (Shmulevitz et al., 2002).

Uma segunda proteína não estrutural é codifica pelo segmento S1 (ORF2) dos

reovírus aviários. A proteína p17 não possui homologia significativa com outras

proteínas, o que impede que sejam feitas predições quanto a sua função (Bodelón et

al., 2001). Algumas propriedades foram recentemente descritas (Costas et al., 2005;

Liu et al., 2005), porém sua função biológica durante a replicação dos reovírus ainda

não foi definitivamente comprovada.

A nomenclatura das proteínas dos reovírus aviários já foi motivo de muita

controvérsia. Em uma mesma época, diferentes autores usavam nomenclaturas

também diferentes para a mesma proteína. Atualmente, há um consenso em se utilizar

a nomenclatura inicialmente proposta por Schnitzer, Ramos & Gouvea (1982) (Tabela

2 e Figura 2).

43

Tabela 2. Segmentos genômicos e proteínas dos reovírus aviários.

Segmento genômico Tamanho (bp) ORF Proteína

Análogo Mamífero Tamanho (aa) Localização Função ou

propriedade

L1 3959 22-3903 λA λ1 1293 Cerne Participa do complexo replicase12

L2 ND ND λB λ3 ND Cerne RNA polimerase RNA dependente (RdRp)12

L3 3907 13-3870 λC λ2 1285 Cerne + superfície Guanililtransferase8

M1 2283 13-2211 µA µ2 732 Cerne Co-fator RdRp, NTPase13, DNA metilase?14

M2 2158 30-2060 µB µ1 676 Superfície Penetração de membranas celulares9, 13, 14

M3 1996 25-1932 µNS µNS 635 Celular Montagem da partícula12, 13, 14

S1 1643 25-321 293-733 630-1610

p10 p17 σC

NE NE σ1

98 146 326

Celular Celular

Superfície

Fusão5 Retardo ciclo celular11

Ligação à célula2,1

S2 1324 16-1266 σA σ2 416 Cerne Ligação a dsRNA6,10, resistência ao IFN4

S3 1202 24-1127 σB σ3 367 Superfície Proteção de µB9 Ligação dsRNA7

S4 1192 17-1120 σNS σNS 367 Celular Ligação a ssRNA3

Adaptado de 1Schnitzer, Ramos & Gouvea, 1982; 2Martínez-Costas et al., 1997; 3Yin & Lee, 1998; 4Martínez-Costas et al., 2000; 5Shmulevitz & Duncan, 2000; 6Yin, Shien & Lee, 2000; 7Olland et al., 2001; 8Hsiao et al., 2002; 9Liemann et al., 2002; 10Yin, Su & Lee, 2002; 11Liu et al., 2005; 12Zhang et al., 2005b; 13Noad et al., 2006; 14Su et al., 2006. (ND: não determinado, NE: não existe).

44

Figura 2. Reconstrução 3D da secção central do vírion de ARV (amostra 138).

Adaptado de Zhang et al., 2005b. λA, λB, λC, µA, µB, σA, σB e σC proteínas

estruturais. 2f, 3f e 5f eixos de simetria icosaédrica. Pontilhados representam

disposição das fitas de dsRNA.

1.4.2.3 Prevenção e controle da infecção pelos reovírus aviários

O principal método para a prevenção da artrite/tenosinovite viral é através da

utilização de vacinas atenuadas em aves jovens com a intenção de proteger a prole

com os anticorpos maternos. A grande maioria das vacinas atenuadas comercializadas

atualmente é oriunda de uma das sementes preparadas por van der Heide a partir da

amostra S1133wt, isolada nos EUA. (van der Heide, 2000).

O próprio Louis van der Heide desenvolveu algumas sementes de vacinas a

partir da propagação da amostra S1133wt em ovos embrionados. Essas sementes

foram enviadas para outros laboratórios sendo testadas ao todo em mais de 400.000

45

aves nos EUA. Assim, existem diversas variantes da amostra S1133wt sendo usadas

como vacinas atenuadas ou inativadas (van der Heide, 2000).

A amostra S1133wt, quando no curso de uma infecção normal, causa um quadro

clínico severo de artrite/tenosinovite com moderada taxa de mortalidade, contudo em

infecções experimentais através da inoculação subcutânea ou intramuscular na pata do

animal é observada uma altíssima taxa de mortalidade (Gouvea et al., 1983).

A vacina P100 foi desenvolvida após 235 passagens seriadas da amostra

S1133wt em ovos embrionados e mais 100 passagens em células primárias de

fibroblasto de embrião de galinha (CEF), sendo que 65 dessas passagens em CEF

foram feitas a 32oC (van der Heide, Kalbac & Brustolon, 1983). As passagens

seriadas em CEF a 32oC para a obtenção da amostra P100 induziram a atenuação da

amostra S1133wt a ponto de poder ser usada com segurança e eficácia em aves jovens

mesmo com um dia de idade, algo que não é encontrado em outras amostras virais

usadas para a vacinação, mesmo aquelas derivadas de S1133wt (van der Heide,

Kalbac & Brustolon, 1983; Huang et al., 1987a; Huang et al., 1987b).

As amostras S1133wt e P100 apresentam diferenças quanto à replicação em

sistemas com temperaturas diferentes. A amostra P100 apresenta-se como uma

amostra ts apresentando replicação eficiente entre 33-37oC com um pico em 33oC,

após 48 horas; já a amostra S1133wt alcança bons títulos (até 109,5 PFU/ml) entre 37-

41oC no mesmo período de 48 horas (Gouvea et al., 1983).

Embora os efeitos patológicos causados pela infecção com os reovírus aviários

tenham sido bem descritos (Gouvea & Schnitzer, 1982), pouco é sabido a respeito dos

mecanismos envolvidos na patogênese ou de sua bioquímica ou biologia molecular

(Yin & Lee, 1998; Grande et al., 2000; Yin & Lee, 2000; Yin, Shien & Lee, 2000).

46

Em um estudo anterior (Naveca, 2002) foram verificadas diferenças em pelo

menos três segmentos genômicos entre as amostras S1133wt e P100. Essas diferenças

foram demonstradas nos segmentos M1, M2 e S1. Esse resultado aliado aos dados

presentes na literatura sobre os segmentos genômicos dos reovírus associados a

virulência nos levaram a certeza de que a caracterização das diferenças entre S1133wt

e P100 servem como um importante modelo no estudo dos mecanismos de patogênese

e atenuação de amostras virais.

47

2. Objetivos

Para esta tese foram estabelecidos os seguintes objetivos:

Objetivo Geral:

Comparar duas amostras de reovírus, uma patogênica e uma vacinal, a fim de

entender os mecanismos envolvidos na atenuação viral.

Objetivos específicos:

A. Caracterização das diferenças entre os segmentos genômicos

M1, M2, M3 e S1 das amostras S1133wt e P100; através da análise da

seqüência de nucleotídeos e da dedução das seqüências protéicas;

B. Promover uma análise filogenética das seqüências deduzidas

das proteínas virais das amostras S1133wt e P100 frente a outras seqüências

depositadas no GenBank;

C. Analisar a estrutura primária das proteínas virais e assim

caracterizar as principais diferenças entre as amostras virais que possam ter

levado ao fenótipo vacinal de P100;

D. Obtenção da proteína de função desconhecida, p17 através de

sistema de expressão heteróloga.

48

3. Material e métodos

3.1.1 Amostras virais

As amostras de reovírus aviários S1133wt (73ª passagem em membrana

corioalantóica - CAM) isolada originalmente de aves com artrite/tenosinovite durante

um surto em Connecticut, EUA por van der Heide & Kalbac (1975) e P100, uma

vacina obtida através da atenuação da amostra S1133wt devido a 235 passagens em

CAM, seguida de 65 passagens em culturas de células primárias de fibroblasto de

embrião de galinha (CEF) a 32ºC, e outras 35 passagens à 37ºC (van der Heide,

Kalbac & Brustolon, 1983), foram originalmente cedidas pelo Doutor Louis van der

Heide, para estudos anteriores onde foram propagadas em CEF e purificadas por

plaqueamento três vezes (Gouvea et al 1983), sendo desde então mantidas alíquotas

em nitrogênio líquido.

Para esta tese foram utilizadas alíquotas do sobrenadante de culturas de células

Vero (rim de macaco verde africano) previamente inoculada com a amostra de

reovírus aviário S1133wt ou com a amostra P100. Após o desenvolvimento do efeito

citopático, cerca de 72 horas após a inoculação, as culturas foram submetidas a três

ciclos de congelamento-descongelamento, centrifugadas a 1.000g para remoção dos

debris celulares, sendo os sobrenadantes das culturas de células recolhidos e

armazenados à -20ºC, até a hora da extração do dsRNA viral.

49

3.1.2 Extração de dsRNA

O genoma viral foi extraído do sobrenadante das culturas de células utilizando

isotiocianato de guanidina (GITC) e sílica, de acordo com o seguinte protocolo. Em

um tubo de 1,5ml, tipo eppendorf, foram colocados 400µl do sobrenadante de cultura

de células, adicionados de 600µl de GITC 6M, sendo os tubos incubados durante

cinco minutos a temperatura ambiente. Após esse período foi adicionado 3µl de

matriz de sílica (Biotools) sendo essa mistura colocada em um homogeneizador de

sangue durante 20 minutos a temperatura ambiente. Em seguida foi feita a

centrifugação do tubo a 11.000g durante três minutos, sendo então descartado o

sobrenadante com uma pipeta. Ao precipitado adicionou-se 300µl da solução de

lavagem gelada (20mM Tris-HCl pH 7,4; 1mM EDTA; 50mM NaCl e 50% etanol),

ressuspendendo com uma pipeta. Foi feita nova centrifugação a 11.000g e repetiu-se a

lavagem. Ao final dessa etapa foi feita nova centrifugação sendo removida toda a

solução de lavagem. O tubo aberto foi colocado durante um minuto em banho-seco a

60ºC sendo então adicionado 25µl de água livre de nucleases (Promega - P1193) pré-

aquecida. O precipitado foi reconstituído e novamente centrifugado a 11.000g durante

três minutos, sendo que agora o sobrenadante contendo o dsRNA extraído foi

estocado a -20ºC. Este protocolo foi utilizado todas as vezes em que foi feita extração

de dsRNA.

3.1.3 Desenho dos iniciadores para o segmento S1

O primeiro passo foi pesquisar por seqüências do segmento S1 de reovírus

aviários depositadas no GenBank. Selecionamos quatro seqüências completas de

50

reovírus aviários: Amostras 1733 e 176, classificadas como altamente patogênicas;

138 classificada como pouco patogênica e S1133B (oriunda de um dos lotes sementes

de vacinas derivados de S1133wt). Como existem algumas seqüências depositadas no

GenBank com o nome S1133, colocamos um sufixo no nome da amostra para poder

especificá-la. No caso anterior a amostra S1133B, recebeu este sufixo por ter sido

depositada pelo grupo do Professor Javier Benavente da Universidade de Santiago de

Compostela, Espanha.

Com base nessas seqüências fizemos um alinhamento no programa MegAlign

do pacote DNASTAR que demonstrou as regiões conservadas, nas extremidades 5´ e

3´, o que é uma característica da família Reoviridae. Para esta região foram

desenhados, utilizando o programa PrimerSelect (DNASTAR), os iniciadores ARS1a

e ARS1b (Tabela 3) a fim de serem utilizados em reação de transcritase reversa (RT)

para a obtenção do cDNA do segmento S1, seguindo-se de reação em cadeia da

polimerase (PCR) para amplificação do número de cópias em DNA do segmento S1.

3.1.4 RT-PCR para o segmento genômico S1

O dsRNA genômico das amostras S1133wt e P100 extraído com sílica e GITC

conforme descrito anteriormente, foi utilizado como molde para reação de RT-PCR

utilizando “SuperScript One-Step RT-PCR with Platinum Taq” (Invitrogen - 10928-

034) de acordo com as recomendações do fabricante.

Brevemente: foi preparado um master mix para duas reações de 25µl contendo

14µl de H2O livre de nucleases, 25µl da mistura de reação 2X (Solução tampão

adicionada de 0,4mM de cada deoxinucleotídeo (dNTP) e 2,4mM de MgSO4) e 1µl da

mistura de transcritase reversa (SuperScript II) mais Taq DNA polimerase com hot

51

start (Platinum Taq). Em dois tubos de 0,2ml, uma para cada amostra viral, foi

preparada a mistura do dsRNA genômico para desnaturação. Três microlitros do

dsRNA extraído, 1,7µl de DMSO (Sigma – D8418, 7% concentração final) 0,5µl de

cada iniciador (ARS1a e ARS1b – 0,4µM). Esses tubos foram incubados a 95ºC

durante três minutos sendo rapidamente colocados em banho de gelo. Após um

minuto foi adicionado 20µl do master mix em cada tubo. Os dois tubos com as

reações de RT-PCR foram colocados em um termociclador Applied Biosystems

modelo 2400, utilizando o seguinte programa: 45ºC / 30´, 94ºC / 2´, 35 X [94ºC / 45´´,

50ºC / 45´´, 72ºC / 2´] 72ºC / 7´ 4ºC / ∞. Após esse período, 8µl de cada reação foram

submetidos à eletroforese em gel de agarose 0,8% adicionado de brometo de etídeo

(0,5µg/ml), a 100V durante uma hora, sendo em seguida observado em

transiluminador UV.

3.1.5 Seqüenciamento do segmento genômico S1

Para o seqüenciamento do segmento S1 foram realizadas novas reações de RT-

PCR, de maneira a obter uma quantidade maior de DNA. As reações foram feitas

exatamente como descrito anteriormente, exceto que foram feitas reações de 100µl.

Após a etapa de RT-PCR o volume total de cada reação foi submetido à eletroforese

em gel de agarose, tal como descrito anteriormente; a fim de purificar as bandas

correspondentes aos segmentos S1 de S1133wt e de P100. Para essa purificação foi

utilizado “Wizard SV gel and PCR clean-up system” (Promega - A9281), de acordo

com as recomendações do fabricante.

Brevemente, as bandas correspondentes aos segmentos S1 foram cortadas do gel

com o auxílio de uma lâmina sendo colocadas em tubos tipo eppendorf de 1,5ml

52

previamente pesados. Em seguida foi feita nova pesagem dos tubos e adicionado a

solução de ligação à membrana (membrane binding solution), na proporção de 10µl

para cada 10mg do gel. Os tubos foram então incubados à 60ºC durante 10 minutos

com agitação ocasional. Após esse período cada gel dissolvido foi colocado em uma

coluna do kit e incubado durante um minuto à temperatura ambiente, sendo em

seguida centrifugado a 10.000g, também durante um minuto. Os precipitados foram

descartados e a coluna adicionada de solução de lavagem (membrane wash solution).

Finalmente o DNA correspondente ao segmento S1 de cada amostra foi eluído da

coluna com 35µl de H2O livre de nucleases (Promega).

Para seqüênciar os amplicons previamente purificados, foi utilizada uma

estratégia (Figura 3) utilizando os iniciadores ARS1a e ARS1b, utilizados para o RT-

PCR, além de outros quatro iniciadores internos: FN2GC, FN3, P10AS e ARS1c

(Tabela 3), desenhados da mesma maneira que ARS1a e ARS1b. Assim foram

processadas seis reações de seqüenciamento para cada segmento genômico, três no

sentido senso e outras três, no sentido anti-senso.

Figura 3. Estratégia de seqüenciamento do segmento S1. As setas indicam o sentido

dos iniciadores.

Todas as reações foram realizadas utilizando o kit ABI PRISM BigDye

Terminator v3.1 da Applied Biosystems (4337455), baseado na metodologia de

dideoxinucleotídeos (Sanger, Nicklen & Coulson, 1977), utilizando o seguinte

53

protocolo. Em cada tubo de 0,2ml foi adicionado 3µl do DNA de S1

(aproximadamente 50ng), 2µl de H2O tridestilada, 2µl de tampão de MgCl2 5X

(80mM Tris-HCl pH 9,0; 2mM MgCl2), 2µl de BigDye e 1µl do iniciador (0,33µM).

As doze reações, seis para S1 de S1133wt e seis para S1 de P100, foram colocadas em

um termociclador Applied Biosystems modelo 2400, sendo utilizado o seguinte

programa: 94ºC / 4´, 30 X [96ºC / 10´´, 50ºC / 5´´, 60ºC / 4´] 4ºC / ∞. Ao final da

reação os produtos foram purificados por precipitação com isopropanol (Berger &

Kimmel, 1987). Os precipitados foram secos durante três minutos em bloco aquecedor

à 60ºC sendo em seguida reconstituídos em 10µl de formamida Hi-Di (Applied

Biosystems - 4311320), incubados à 95ºC durante dois minutos e finalmente

colocados em um seqüenciador automático ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer de 16

capilares.

Os arquivos de saída do seqüenciador (*.abi) foram inicialmente inspecionados

no programa Chromas versão 1.4, disponível gratuitamente em

(http://www.technelysium.com.au/chromas_lite.html), para rapidamente se ter uma

noção da qualidade do cromatograma e do tamanho confiável da seqüência. Em

seguida esses arquivos foram analisados cuidadosamente e utilizados para montar o

contig de cada amostra utilizando o programa SeqManII (DNASTAR). Uma vez

terminada essa etapa, foi salva a seqüência consenso de cada contig.

Assim obtivemos os arquivos S1 S1133wt.seq e S1 P100.seq, com as

seqüências de nucleotídeos dos segmentos S1 de ambas as amostras. Essas mesmas

seqüências foram utilizadas para dedução das seqüências de aminoácidos das

proteínas p10, p17 e σC, todas produtos do segmento genômico S1, no programa

EditSeq (DNASTAR) utilizando o mecanismo de busca por fases de leitura aberta

(ORF) e comparando com os dados da literatura. As seqüências de nucleotídeos e

54

aminoácidos foram alinhadas no programa MegAlign (DNASTAR), e dessa maneira

foram determinadas as diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento

genômico S1.

3.1.6 Desenho dos iniciadores para os segmentos genômicos da classe M e S2.

Em uma nova pesquisa no GenBank, verificamos que haviam sido recém

depositadas seqüências completas para o segmento genômico M3, o que nos

encorajou a desenhar iniciadores para as regiões altamente conservadas 5´e 3´

verificadas através do alinhamento das seqüências utilizando o programa MegAlign.

Fizemos então o desenho no programa PrimerSelect dos iniciadores ARM3a e

ARM3b. Esses iniciadores foram utilizados para obtenção do cDNA e posterior

amplificação por PCR de todo o segmento genômico M3. Além de serem utilizados

para o seqüenciamento das amostras.

Ainda baseado no alinhamento das seqüências de M3 depositadas no GenBank,

foram desenhados outros seis iniciadores: ARM3c, ARM3e e ARM3g no sentido

senso e ARM3d, ARM3f e ARM3h no sentido anti-senso (Tabela 3). Para todos os

iniciadores internos desenhados foi observado um cuidado para que não fosse

utilizada uma região com alguma mutação, em qualquer das seqüências do GenBank,

nas últimas sete posições da extremidade 3´ do iniciador. Outro cuidado foi tomado de

maneira que os iniciadores ficassem a uma distância entre 400 e 550 bases uns dos

outros em um mesmo sentido.

Esta mesma análise foi realizada para as seqüências depositadas para os

segmentos M1 e M2, os quais tiveram as suas primeiras seqüências depositadas nesta

ordem. A exceção para os segmentos M1 e M2 foi um número maior de iniciadores

55

internos, oito para M1: ARM1c, ARM1e, ARM1g e ARM1i, no sentido senso e

ARM1d, ARM1f, ARM1h e ARM1j, no sentido anti-senso. E outros oito para M2:

ARM2c, ARM2e, ARM2g e ARM2i, no sentido senso e ARM2d, ARM2f, ARM2h e

ARM2j, no sentido anti-senso (Tabela 3).

De maneira análoga ao que foi utilizado para os segmentos da classe M,

decidimos obter iniciadores também para o segmento S2. Assim foram desenhados

ARS2a, ARS2c, ARS2e e ARS2g no senti senso e ARS2b, ARS2d, ARS2f e ARS2h

no sentido anti-senso (Tabela 3). Com a inclusão do segmento S2, aumentamos para

cinco o número de segmentos genômicos seqüenciados nesta tese, superando os

objetivos iniciais.

3.1.7 RT-PCR para os segmentos genômicos da classe M e S2

Tal como para o segmento S1, o sobrenadante das culturas de células Vero

inoculadas com as amostras de reovírus aviários S1133wt e P100, foi utilizado para

extração do dsRNA viral, utilizando o mesmo protocolo de sílica e GITC descrito

anteriormente.

A partir do segmento M3, foi utilizada uma outra metodologia. As etapas de RT

e PCR, não foram mais realizadas em um único passo, e sim passamos a fazer as

reações separadas, em duas etapas distintas.

Cinco microlitros de cada dsRNA extraído foram colocados em dois tubos de

0,2ml adicionados de 1,4µl de DMSO (7% concentração final) e 0,25µl de cada

iniciador (ARM3a e ARM3b - 0,25µM). Os tubos com essa mistura foram incubados

à 95ºC durante três minutos para promover a desnaturação das fitas de dsRNA, sendo

imediatamente acondicionados em banho de gelo, durante um minuto. Um outro tubo

56

foi preparado com os outros reagentes necessários para a reação. Nesse tubo foi

adicionado 8,2µl de H20, 8µl de tampão de reação 5X (50mM Tris-HCl pH 8,3;

75mM KCl; 3mM MgCl2), 4µl de DTT (20mM), 2µl de dNTPs (0,5mM cada), 2µl

(40U) de RNasin (Promega - N2611) e 2µl (200U) da transcritase reversa (Superscript

II - 18064-014). Dessa maneira foram preparadas duas reações de 20µl, uma para

cada amostra viral. Os tubos com as reações foram então colocados em um

termociclador Applied Biosystems modelo 2400 utilizando o seguinte programa: 42ºC

durante 50 minutos, seguida de uma etapa a 70ºC durante 15 minutos para inativação

da transcritase reversa, sendo as amostras então incubadas à 37ºC durante 20 minutos.

Nesta última etapa foi adicionado 1µl (2U) de RNaseH em cada tubo (Life

Technologies - 18021-014). Este mesmo protocolo para reação de transcritase reversa

foi utilizado para as reações subseqüentes: M1, M2 e S2, apenas utilizando o par de

iniciadores próprios de cada segmento.

3.1.8 Amplificação por PCR dos segmentos genômicos classe M

Após a obtenção do cDNA dos segmentos genômicos, foi realizada a etapa de

amplificação do número de cópias de DNA por PCR. Para tanto foram utilizados 1µl

de cada reação de RT para 25µl de reação de PCR. Durante a etapa de otimização do

PCR para os segmentos genômicos da classe M foi utilizado primeiro um protocolo

com uma DNA polimerase comum (Taq DNA polimerase Invitrogen - 11615-010).

Uma vez estabelecidas as melhores condições para as reações, passamos a utilizar

uma mistura de enzimas com atividade de correção e hot start (Platinum Taq HiFi

Invitrogen - 11304-011). Nesse protocolo definitivo preparava-se uma mistura de

reação com 40,5µl de H2O, 5µl de tampão de reação 10X (60mM Tris-SO4 pH 8,9;

57

18mM de sulfato de amônio), 2µl de MgSO4 (2mM), 1µl de dNTPs (0,2mM cada),

0,3µl de cada iniciador (0,25µM) e 0,2µl (1U) de Platinum Taq HiFi, essa mistura foi

dividida em dois tubos com 24µl. Cada tubo então recebeu 1µl de uma das reações de

RT, ou para S1133wt ou para P100. Estabelecemos este protocolo de maneira que

todas as reações fossem elas para M1, M2 ou M3, seriam realizadas da mesma forma.

Uma vez preparadas as misturas para as reações de PCR, os tubos de 0,2ml

foram então colocados em um termociclador Applied Biosystems modelo 2400. Foi

então utilizado o seguinte programa para a amplificação de qualquer segmento

genômico da classe M. 94ºC / 2´ 35X [94ºC / 45´´, 55ºC / 45´´ e 68ºC / 2,5´] 68ºC / 7´

4º / ∞.

Uma vez terminada a reação, 8µl de cada amplicon foram submetidos à

eletroforese em gel de agarose 0,8% acrescido de brometo de etídio (0,5µg/ml) a

100V durante uma hora. Após este período o gel foi então visualizado em

transiluminador de UV. O segmento genômico M3 foi, em ordem cronológica, o

segundo totalmente seqüenciado nesta tese, posteriormente foram determinadas as

seqüências dos segmentos M1, M2 e S2.

3.1.9 Amplificação por PCR do segmento genômico S2

Para a amplificação do segmento genômico S2 foi utilizado o mesmo protocolo

descrito para a classe M, com a exceção dos iniciadores utilizados (ARS2a e ARS2b)

e do programa de PCR que foi utilizado: 94ºC / 2´ 30X [94ºC / 45´´, 47ºC / 45´´ e

68ºC / 1,5´] 68ºC / 7´ 4º / ∞.

58

3.1.10 Semi-nested PCR para segmentos da classe M e S2

A fim de facilitar o seqüenciamento dos segmentos genômicos da classe M e de

S2, decidimos mudar a estratégia utilizada anteriormente para o segmento S1. Agora

antes de purificar os amplicons para o seqüenciamento, foi adicionada uma nova etapa

de PCR em semi-nested. Utilizando como molde a primeira reação de PCR na qual

era amplificado todo o segmento genômico.

Nesta segunda etapa era utilizada uma nova combinação de pares de iniciadores:

ARM3a com ARM3d e ARM3c com ARM3b para o segmento genômico M3. Para os

segmentos genômicos M1 e M2 foram utilizados os pares de iniciadores ARMXa com

ARMXf e ARMXe com ARMXb, onde X corresponde ao número do segmento

amplificado. Por exemplo, se estivesse sendo amplificado o segmento M1 seria

utilizada a combinação ARM1a com ARM1f e ARM1e com ARM1b. O programa

utilizado para o semi-nested PCR dos segmentos da classe M foi: 94ºC / 2´ 28X [94ºC

/ 45´´, 55ºC / 45´´ e 68ºC / 1,5´] 68ºC / 7´ 4º / ∞

Esta metodologia foi utilizada para todos os segmentos da classe M, sendo,

portanto gerados dois amplicons, parcialmente sobrepostos, para cada segmento

(Figura 4). Metodologia semelhante foi utilizada para o segmento genômico S2, a

diferença sendo a combinação dos pares de iniciadores utilizados, ARS2a com ARS2d

e ARS2c com ARS2b (Figura 4) e o programa utilizado: 94ºC / 2´ 28X [94ºC / 45´´,

52ºC / 45´´ e 68ºC / 1´] 68ºC / 7´ 4º / ∞. As reações de semi-nested foram realizadas

tal como descrito anteriormente para a amplificação por PCR dos segmentos

genômicos da classe M e S2, com a diferença de que foi utilizado um volume total de

100µl para cada reação.

59

Figura 4. Estratégia de semi-nested PCR para os segmentos da classe M e S2. As setas

indicam o sentido de cada iniciador.

1324bp 1 ARS2a

ARS2b

ARS2c

S2.2

Estratégia de Semi-Nested S2

S2.1 ARS2d

1996bp 1 ARM3a

ARM3b

ARM3e

ARM3dM3 .1

M3.2

1 ARM3a

ARM3b

ARM3e

ARM3dM3 .1

M3.2

1 ARM3a ARM3a

ARM3b ARM3b

ARM3eARM3e

ARM3dARM3dM3 .1

M3.2Estratégia de Semi-Nested M3

2158bp 1 ARM2a

ARM2b

ARM2e

ARM2fM2 .1

M2.2

1 ARM2a

ARM2b

ARM2e

ARM2fM2 .1

M2.2

1 ARM2a ARM2a

ARM2b ARM2b

ARM2eARM2e

ARM2fARM2fM2 .1

M2.2Estratégia de Semi-Nested M2

2283bp 1 ARM1a

ARM1b

ARM1e

ARM1fM1 .1

M1.2

1 ARM1a

ARM1b

ARM1e

ARM1fM1 .1

M1.2

1 ARM1a ARM1a

ARM1b ARM1b

ARM1eARM1e

ARM1fARM1fM1 .1

M1.2

Estratégia de Semi-Nested M1

60

Todos os amplicons obtidos por semi-nested foram purificados com “GFX PCR

DNA and Gel Band Purification Kit” (GE Healthcare - 27-9602-01), de acordo com o

protocolo do fabricante.

Brevemente: as bandas correspondentes aos amplicons foram cortadas do gel

com o auxílio de uma lâmina sendo colocadas em tubos tipo eppendorf de 1,5ml

previamente pesados. Em seguida foi feita nova pesagem dos tubos e adicionado o

tampão de captura 10µl para cada 10mg do gel. Os tubos foram então incubados a

60ºC durante 10 minutos com agitação ocasional. Após esse período os géis

dissolvidos foram colocados um em cada coluna do kit e incubados durante um

minuto à temperatura ambiente, sendo em seguida centrifugados a 10.000g durante 30

segundos. Os precipitados foram descartados e a coluna lavada com 500μl de tampão

de lavagem. Finalmente o DNA correspondente aos segmentos de cada amostra foram

eluídos da coluna com 35µl de H2O livre de nucleases (Promega).

3.1.11 Seqüenciamento dos segmentos genômicos da classe M e S2

Para o seqüenciamento dos segmentos genômicos da classe M e o segmento S2,

foi utilizada estratégia semelhante àquela utilizada para o segmento S1. A diferença

entre as estratégias foi dada pelo fato de que para cada segmento havia dois

amplicons, de maneira que deveriam ser observados quais os iniciadores deveriam ser

utilizados com cada amplicon.

Para seqüênciar o amplicon M3.1, flanqueado pelos iniciadores ARM3a e

ARM3d, foram utilizados os iniciadores ARM3a e ARM3c no sentido senso e

ARM3d, ARM3f e ARM3h no sentido anti-senso. O amplicon M3.2 flanqueado pelos

61

iniciadores ARM3e e ARM3b, foi seqüenciado fazendo-se o uso dos iniciadores

ARM3e e ARM3g no sentido senso e ARM3b no sentido anti-senso.

O amplicon M1.1, flanqueado pelos iniciadores ARM1a e ARM1f, foi

seqüenciado utilizando os iniciadores ARM1a, ARM1c e ARM1e no sentido senso e

ARM1f, ARM1h e ARM1j no sentido anti-senso. Para o amplicon M1.2, flanqueado

pelos iniciadores ARM1e e ARM1b, foram utilizados os iniciadores ARM1e, ARM1g

e ARM1i no sentido senso e ARM1b, ARM1d e ARM1f no sentido anti-senso.

Por último para a classe M, o amplicon M2.1, flanqueado pelos iniciadores

ARM2a e ARM2f, foi seqüenciado utilizando os iniciadores ARM2a, ARM2c e

ARM2e no sentido senso e ARM2f, ARM2h e ARM2j no sentido anti-senso. Para o

amplicon M2.2, flanqueado pelos iniciadores ARM2e e ARM2b, foram utilizados os

iniciadores ARM2e, ARM2g e ARM2i no sentido senso e ARM2b, ARM2d e ARM2f

no sentido anti-senso.

Para o segmento S2, O amplicon S2.1, flanqueado por ARS2a e ARS2d foi

seqüenciado utilizando os iniciadores ARS2a e ARS2c no sentido senso e ARS2d,

ARS2f e ARS2h, no sentido anti-senso. A segunda parte do segmento S2, S2.2 foi

seqüenciada utilizando os iniciadores ARS2c, ARS2e e ARS2g no sentido senso,

enquanto que no sentido anti-senso foram utilizados os iniciadores ARS2b e ARS2d.

Todas as estratégias de seqüenciamento dos segmentos da classe M e do segmento S2

estão ilustradas na Figura 5, assim como todos os iniciadores estão listados na Tabela

3.

62

Figura 5. Estratégias de seqüenciamento para os segmentos da classe M e S2. As setas

indicam o sentido de cada iniciador.

Estratégia de Seqüenciamento M1

ARM1aM1.1 1352pb

ARM1c

ARM1fARM1hARM1j

ARM1e

ARM1bM1.2 1446pb

ARM1e ARM1g ARM1i

ARM1f ARM1d

Estratégia de Seqüenciamento M1

ARM1aM1.1 1352pb

ARM1c

ARM1fARM1hARM1j

ARM1eARM1aARM1aM1.1 1352pb

ARM1cARM1c

ARM1fARM1fARM1hARM1hARM1jARM1j

ARM1eARM1e

ARM1bM1.2 1446pb

ARM1e ARM1g ARM1i

ARM1f ARM1d ARM1bARM1bM1.2 1446pb

ARM1eARM1e ARM1gARM1g ARM1iARM1i

ARM1fARM1f ARM1dARM1d

Estratégia de Seqüenciamento M2

ARM2aM2.1 1258pb

ARM2c

ARM2fARM2hARM2j

ARM2e

ARM2bM2.2 1267pb

ARM2e ARM2g ARM2i

ARM2f ARM2d

Estratégia de Seqüenciamento M2

ARM2aM2.1 1258pb

ARM2c

ARM2fARM2hARM2j

ARM2eARM2aARM2aM2.1 1258pb

ARM2cARM2c

ARM2fARM2fARM2hARM2hARM2jARM2j

ARM2eARM2e

ARM2bM2.2 1267pb

ARM2e ARM2g ARM2i

ARM2f ARM2d ARM2bARM2bM2.2 1267pb

ARM2eARM2e ARM2gARM2g ARM2iARM2i

ARM2fARM2f ARM2dARM2d

ARM3aM3.1 1190pb

ARM3c

ARM3dARM3fARM3h

ARM3bM3.2 922pb

ARM3e ARM3g

Estratégia de Seqüenciamento M3

ARM3aM3.1 1190pb

ARM3c

ARM3dARM3fARM3h

ARM3aARM3aM3.1 1190pb

ARM3cARM3c

ARM3dARM3dARM3fARM3fARM3hARM3h

ARM3bM3.2 922pb

ARM3e ARM3g

ARM3bARM3bM3.2 922pb

ARM3eARM3e ARM3gARM3g

Estratégia de Seqüenciamento M3

Estratégia de Seqüenciamento S2

ARS2a S2.1 911pb

ARS2c

ARS2dARS2f

ARS2b S2.2 928pb

ARS2c ARS2e

ARS2h

ARS2g

ARS2d

63

Tabela 3. Iniciadores desenhados para esta tese.

Segmento Iniciador Sentido Seqüência 5´- 3´ Tamanho posição

M1 ARM1a S 5´- GCTTTTCTCGACATGGCCTATC - 3´ 22 1 - 22 M1 ARM1c S 5´- AAATCCACTGATCGCATCTTCG - 3´ 22 544 - 565 M1 ARM1e S 5´- GCAATGACACCTCCTCGTGG - 3´ 20 838 - 857 M1 ARM1g S 5´- GATGTGGGTGATGCTTTGG - 3´ 19 1330 - 1348 M1 ARM1i S 5´- GTGTTAGCATGGTATATTCCTTCC - 3´ 24 1831 - 1854 M1 ARM1j AS 5´- GAACGACGAGAAGGAAGCAA - 3´ 20 241 - 260 M1 ARM1h AS 5´- GAGGAGGTGTCATCGCTTGAAC - 3´ 22 832 - 853 M1 ARM1f AS 5´- GGATCCAAAGCATCACCCAC - 3´ 20 1333 - 1352 M1 ARM1d AS 5´- GGAAGGAATATACCATGCTAACAC - 3´ 24 1831 - 1854 M1 ARM1b AS 5´- GATGAGTATCTCAAGACGACTAACCC - 3´ 26 2258 - 2283 M2 ARM2a S 5´- GCTTTTTCAGTGCCAGTCTTTCTC - 3´ 24 1 - 24 M2 ARM2c S 5´- CTATGTCGATTGTTTTGTGGGT - 3´ 22 455 - 476 M2 ARM2e S 5´- AATCAATGCGCTTGGTGAATG - 3´ 21 892 - 912 M2 ARM2g S 5´- TATCGCCCAAGTGGCTGAAGT - 3´ 21 1289 - 1309 M2 ARM2i S 5´- AGCACGCGCACTCCAACCT - 3´ 19 1778 - 1796 M2 ARM2j AS 5´- GGAAGAAACCCAGTAGAATTACC - 3´ 23 267 - 289 M2 ARM2h AS 5´- TGTCATTAGTAGCAAGTGAAGGAG - 3´ 24 799 - 822 M2 ARM2f AS 5´- TCAAAAGGTATTTTCGACTGCAT - 3´ 23 1236 - 1258 M2 ARM2d AS 5´- GGAGTGCTAAAGGGAGAAGACTC - 3´ 23 1704 - 1726 M2 ARM2b AS 5´- GATGAATAACGTGCCAATCCAG - 3´ 22 2137 - 2158 M3 ARM3a S 5´- GCTTTTTGAGTCCTAGCGTGG - 3´ 21 1 - 21 M3 ARM3c S 5´- AAGATCTTAGCTAAGCAGCAGAC - 3´ 23 508 - 530 M3 ARM3e S 5´- GAGGCTGCTATTCTCATGGAT - 3´ 21 1075 - 1095 M3 ARM3g S 5´- CATGAGGCTAGTGCTGAGTGG - 3´ 21 1612 - 1632 M3 ARM3h AS 5´- AGTAGGAATTTCTCATAATGCTC - 3´ 23 307 - 329 M3 ARM3f AS 5´- GCGTAGTACATGTCCATAAACGG - 3´ 23 640 - 662 M3 ARM3d AS 5´- AGCGCACCGAGTAAGAAGG - 3´ 19 1172 - 1190 M3 ARM3b AS 5´- GATGAATAACCGAGTCCGCC - 3´ 20 1977 - 1996 S1 ARS1a S 5´- GCTTTTTCAATCCCTTGTTC - 3´ 20 1 - 20 S1 FN3 S 5´- ATGGCGGGTCTCAATCCAT - 3´ 19 630 - 648 S1 ARS1c S 5´- ACTAGTAACGTCGTGTTATTAACC - 3´ 24 1347 - 1370 S1 P10AS AS 5´- TCAAACGTCGTATGGCGGAGCC - 3´ 22 300 - 321 S1 FN2GC AS 5´- CCGCCGCCCGTCAGCCGTTCATAGAT - 3´ 26 726 - 751 S1 ARS1b AS 5´- GATGAATAACCAATCCCAGTAC - 3´ 22 1622 - 1643

S1 ORF2 *P17S S 5´- ATGCAATGGCTCCGCCATACGAC - 3´ 23 293 - 315 S1 ORF2 *P17AS AS 5´- TCATAGATCGGCGTCAAATCGCC - 3´ 23 711 - 733

S2 ARS2a S 5´- GCTTTTTCTTCCACGATGGCG - 3´ 21 1 - 21 S2 ARS2c S 5´- TACCCTAGATGGGCAAACAGACG - 3´ 23 397 - 419 S2 ARS2e S 5´- GCATTTCGCTTACGTGTGTGC - 3´ 21 810 - 830 S2 ARS2g S 5´- AACGCAGGAGGCTAATGACTT - 3´ 21 1080 -1100 S2 ARS2h AS 5´- TGACAATCCTTCATCAGTCCA - 3´ 21 298 - 318 S2 ARS2f AS 5´- TCATATTCGGCCACGTCTCAAC - 3´ 22 499 - 520 S2 ARS2d AS 5´- GGTTGACGGCAAGCCAT - 3´ 17 895 - 911 S2 ARS2b AS 5´- GATGAATACATCCACGTGCTGCC - 3´ 23 1302 -1324

S: Sentido senso; AS: Anti-senso; * iniciadores para clonagem.

64

Para todas as reações de seqüenciamento dos segmentos da classe M foram

utilizados entre 60 e 80ng de DNA das amostras, 2µl de tampão de MgCl2 5X (80mM

Tris-HCl pH 9,0; 2mM MgCl2), 2µl de BigDye v3.1, 1µl do iniciador (0,33µM) e H20

tridestilada q.s.p. 10µl. O mesmo programa foi utilizado para todas as reações: 40X

[94º / 10´´; 50ºC / 30´´; 60ºC / 4´] em um termociclador Applied Biosystems modelo

2400.

Ao final da reação os produtos foram purificados por precipitação com

isopropanol, como utilizado anteriormente para S1. Os precipitados foram secos

durante três minutos em bloco aquecedor à 60ºC sendo em seguida reconstituídos em

10µl de formamida Hi-Di (Applied Biosystems), incubados à 95ºC durante dois

minutos e, finalmente lidos em um seqüenciador automático modelo 3100 Avant

Genetic Analizer (Applied Biosystems) de 4 capilares.

Os arquivos de saída do seqüenciador foram analisados da mesma maneira que

para o segmento S1, sendo, ao final da análise obtidos os arquivos M3 S1133wt.seq,

M3 P100.seq, M1 S1133wt.seq, M1 P100.seq, M2 S1133wt.seq, M2 P100.seq, S2

S1133wt.seq e S2 P100.seq. Tal como realizado para o segmento S1, foram

determinadas as ORFs e deduzidas as seqüências de aminoácidos. Foram então

utilizadas para a análise as seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos relativas aos

segmentos genômicos M1, M2 e M3 e S2.

3.1.12 Ferramentas de bioinformática utilizadas na análise das seqüências

Foram utilizadas diversas ferramentas de bioinformática para realizar as análises

das seqüências de nucleotídeos e aminoácidos relativas aos segmentos genômicos S1,

S2 e M1 a M3 seqüenciados nesta tese, além de outras seqüências de reovírus aviários

65

disponíveis no GenBank (Tabela 4A e 4B). Além dos já mencionados anteriormente:

EditSeq, MegAlign, PrimerSelect e SeqManII todos do pacote de programas

DNASTAR e do programa Chromas para visualização dos cromatogramas também

foram utilizadas ferramentas disponíveis gratuitamente tanto para download quanto

outras em servidores da Internet.

Foram utilizados o programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics

Analysis v. 3.1) descrito por Kumar, Tamura & Nei (2004) para analise filogenética; o

programa BioEdit (Hall, 1999) para alinhamento e análise de seqüências de

nucleotídeos e aminoácidos. Os programas ProtParam e ProtScale (Gasteiger et al.,

2003; Gasteiger et al., 2005) no servidor do ExPASy (Expert Protein Analysis System

– www.expasy.org) para cálculo de parâmetros físico-químicos relacionados as

seqüências deduzidas das proteínas. Marcoil (http://www.isrec.isb-

sib.ch/webmarcoil/webmarcoilC1.html - Delorenzi & Speed, 2002) e MultiCoil

(http://multicoil.lcs.mit.edu/cgi-bin/multicoil - Wolf, Kim & Berger, 1997) para

predição de estruturas em coiled-coil (Lupas, van Dyke & Stock, 1991; Lupas, 1997).

O servidor 2ZIP (http://2zip.molgen.mpg.de/index.html - Bornberg-Bauer, Rivals &

Vingron, 1998) para predição de motivos de zíperes de leucina; o servidor DrawHCA

(http://bioserv.rpbs.jussieu.fr - Gaboriaud et al., 1987) para análise de clusters

hidrofóbicos; o programa Swiss-PdbViewer (http://www.expasy.org/spdbv/ - Guex

& Peitsch, 1997) e o servidor Swiss-Model (http://swissmodel.expasy.org/) para

modelagem por homologia; e o programa RasMol (www.rasmol.org – Sayle &

Milner-White, 1995), para visualização de estruturas de proteínas.

66

Tabela 4A. Números de acesso no GenBank para as seqüências das proteínas µA, µB, µNS, p10, p17 e σA utilizadas nas análises.

Números de acesso das seqüências de proteínas Amostras µA µB µNS p10 p17 σA

1017-1 AAV49512 AAV34177 AAS78988 AAR10964 AAR11843 AAG44961 138 AAT52024 AAW78485 AAT52026 AAF45154 AAF45155 AAC18122 1733B ND ND AAQ81873 ND ND ND 1733L AAV49513 AAV34180 AAS78989 AAB61605 AAB61606 AAG44956 176 AAT52025 AAW78486 AAT52027 AAF45151 AAF45152 AAC18121 2408 AAV49514 AAV34179 AAS78990 AAR10969 AAR11848 AAG09473 601G AAV49515 AAV34183 AAS78991 AAR10961 AAR10971 AAG45147 601SI ND ND ND AAR10963 AAR11842 AAG44968 750505 AAV49516 AAV34184 AAS78992 AAQ92364 AAR10970 AAG44966 916 AAV49517 AAV34185 AAS78993 AAR10968 AAR11847 AAG44963 918 AAV49518 AAV34187 AAS78994 AAR10960 AAR10972 AAG44965 919 AAV49519 AAV34181 AAS78995 AAR10967 AAR11846 AAG44962 FC ND ND ND DQ868789* DQ868789* ND OS161 AAV49520 AAV34186 AAS78996 AAR10965 AAR11844 AAG44969 R2 AAV49521 AAV34182 AAS78997 AAR10966 AAR11845 AAG44964 S1133B ABC01917 ABC01918 AAT85608 AAK18186 AAK18187 ND S1133L AAV49511 AAV34176 AAS78987 ND ND AAD17921 T6 AAV49522 AAV34178 AAS78998 AAR10962 AAR11841 AAG44967

ND: não disponível; * Seqüência do segmento S1 completo.

67

Tabela 4B. Números de acesso no GenBank para as seqüências da proteína σC

utilizadas nas análises.

Amostras Números de Acesso σC 1017-1 AAG44982

138 AAF45156 1733L AAB61607

176 AAF45153 2408 AAF97730 601G AAG44983 601SI AAF97732

750505 AAF97735 916 AAG44980 918 AAG44981 919 AAF97734 FC DQ868789*

OS161 AAF97731 R2 AAG44979

S1133B AAK18188 S1133G AAW55563 S1133S AAC42113

T6 AAF97733 GuangxiR1 AAY32587

RAM-1 AAA57268 Somerville 4 AAA57218 GEI09 97M AAL83491 GEI10 97M AAL83490 GEL01 96T AAL83492 GEL03 97T AAL83493 GEL05 97M AAL83494 GEL06 97M AAL83495 GEL12 98M AAL83496 GEL13a98M AAL83497 GEL13b98M AAL83498 NLA13 96T AAL83499 NLI02 88M AAL83500 NLI12 96M AAL83501

* Seqüência do segmento S1 completo.

68

3.2 Clonagem e expressão da proteína p17

3.2.1 Desenho dos iniciadores.

Com o auxílio do programa PrimerSelect foram desenhados dois iniciadores,

P17S e P17AS (Tabela 3) de maneira a amplificar toda a segunda ORF do segmento

S1. Não foram incluídos sítios para enzimas de restrição nos iniciadores, mas apenas o

códon de iniciação (ATG) na extremidade 5´ do iniciador P17S e a seqüência para o

códon de terminação (TGA) na extremidade 5´ do iniciador P17AS.

3.2.2 Amplificação por PCR da ORF-p17

O amplicon purificado utilizado para seqüenciamento do segmento S1 da

amostra S1133wt foi utilizado como molde para a amplificação da ORF-p17 com os

iniciadores P17S e P17AS. Em um tubo de 0,2ml foi adicionado 41µl de H20, 5µl de

tampão de reação 10X (10mM Tris-HCl, pH 8,3; 50mM KCl; 2,5mM MgCl2 e

0,001% gelatina), 0,5µl de dNTPs (0,125mM cada), 1µl de cada iniciador (0,4µM),

0,5µl (2,5U) de Platinum Taq e 1µl do DNA molde. Após o preparo da reação o tubo

foi colocado em um termociclador , utilizando o seguinte programa: 94ºC / 2´ 25X

[94ºC / 30´´, 55ºC / 30´´, 72ºC / 50´´] 72ºC / 10´ 4ºC / ∞. Ao final da reação 5µl do

amplicon foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 0,8% acrescido de

brometo de etídio (0,5µg/ml) a 100V durante 40 minutos.

69

3.2.3 Purificação do amplicon ORF-p17

Todo o restante do produto de PCR da ORF-p17 (45µl) foi purificado com GFX

(GE Healthcare) diretamente do tubo de PCR, de acordo com as instruções do

fabricante.

3.2.4 Clonagem da ORF-p17 no vetor pCR T7 / NT-TOPO

Dois microlitros do amplicon ORF-p17 purificado foram adicionados a um tubo

de 0,2ml contendo 1µl de uma solução salina (200mM NaCl; 10mM MgCl2), 2µl de

H20 estéril (Invitrogen) e 1µl do vetor (10ng). Essa reação foi misturada gentilmente e

incubada durante 20 minutos a temperatura ambiente. Após esse período a reação foi

colocada em banho de gelo. Essa construção permitiu a expressão da proteína p17

fusionada a uma cauda de histidina N-terminal codificada pelo vetor.

3.2.5 Transformação de células competentes TOP10F´

O kit utilizado para a clonagem e expressão da proteína p17, pCR T7 / NT-

TOPO TA expression (Invitrogen - K4200-01) fornece células TOP10F´

quimicamente competentes as quais foram utilizadas para a transformação com o

plasmídeo TOPO-p17. Assim 2µl da reação de clonagem foram adicionados a um

tubo contendo células TOP10F’ competentes. Após uma breve homogeneização o

tubo foi incubado em banho de gelo durante 15 minutos. Após essa incubação o tubo

foi submetido a um choque térmico por incubação à 42ºC durante 30 segundos, sendo

imediatamente colocado em banho de gelo por mais dois minutos. Em seguida foram

70

adicionados 250µl de meio SOC à temperatura ambiente. O tubo foi então incubado à

37ºC sob agitação (70 RPM) durante 30 minutos. Ao final desse período três alíquotas

(10, 50 e 100µl) foram estriadas em placas de ágar LB contendo ampicilina

(100µg/ml) sendo incubadas durante 16 horas à 37ºC.

3.2.6 Análise dos transformantes por PCR

Algumas colônias crescidas nas placas de ágar LB foram analisadas quanto à

presença e correta orientação do incerto por PCR utilizando os iniciadores T7 forward

(Invitrogen) e P17AS. Em cada tubo de 0,2ml, um para cada colônia, foram

adicionados 20,5µl de H20, 2,5µl de tampão de reação 10X, 0,75µl de MgCl2

(1,5mM), 0,5µl de dNTPs (0,2mM cada), 0,3µl do iniciador T7 forward (0,2µM),

0,25µl do iniciador P17AS (0,2µM) e 0,2µl (1U) de Taq DNA polimerase (Invitrogen

- 11615-010).

Cada colônia a ser analisada foi tocada com uma ponteira sendo essa utilizada

para homogeneizar um tubo de reação de PCR. Após isso ser feito para cada colônia

analisada os tubos com as reações foram colocados no termociclador, utilizando o

seguinte programa: 94ºC / 10´ 25X [94ºC / 45´´, 47ºC / 30´´, 72ºC / 1´] 72ºC / 7´ 4ºC /

∞.

3.2.7 Análise dos transformantes por seqüenciamento

Uma colônia selecionada pela reação de PCR foi inoculada em 10ml de meio

LB suplementado com ampicilina (100µg/ml) e incubada durante 16 horas à 37ºC. No

dia seguinte o plasmídeo TOPO-p17 foi extraído (miniprep) com “Wizard Plus SV

71

Minipreps DNA Purification System” (Promega – A1330), de acordo com as

recomendações do fabricante.

Foram preparadas duas reações de seqüenciamento para o plasmídeo TOPO-

p17. A primeira utilizou 2µl do plasmídeo, 3µl de H2O tridestilada, 2µl do tampão

MgCl2 5X, 2µl de BigDye v3.1 e 1µl do iniciador T7 forward (0,33µM). A segunda

reação foi preparada exatamente como a primeira, exceto pela utilização do iniciador

T7 reverse. Dessa maneira foi obtida a seqüência do plasmídeo na região com o

inserto.

3.2.8 Estocagem do clone com o plasmídeo TOPO-p17

O clone caracterizado por PCR e seqüenciamento foi inoculado em 2ml de meio

LB suplementado com ampicilina (100µg/ml) e incubado à 37ºC até atingir a fase

estacionária de crescimento. Em seguida o meio inoculado foi dividido em duas

alíquotas as quais foram adicionadas de glicerol estéril (15% concentração final) e

congeladas em nitrogênio líquido. O plasmídeo TOPO-p17, purificado na miniprep,

foi estocado a -20ºC.

3.2.9 Transformação de células BL21(DE3)pLysS

O plasmídeo TOPO-p17 está sob controle de um promotor T7, o qual necessita

da T7 RNA polimerase para que o inserto seja transcrito. Por esse motivo o plasmídeo

TOPO-p17 foi utilizado para transformar células BL21(DE3)pLysS.

O plasmídeo TOPO-p17 foi diluído de maneira a se ter 10ng do vetor em 2µl de

H2O. Esses 2µl foram então adicionados a tubo de “One Shot BL21(DE3)pLysS”,

72

células quimicamente competentes (Invitrogen) e incubados em banho de gelo durante

30 minutos.

O tubo foi exposto a um choque térmico por incubação à 42ºC em banho-maria

durante 45 segundos, sendo então imediatamente recolocado em banho de gelo por

dois minutos. Foram adicionados 250µl de meio SOC à temperatura ambiente, sendo

o tubo incubado a 37ºC durante 30 minutos sob agitação (70 RPM).

Após esse período de incubação, toda a reação de transformação foi adicionada

a 10ml de meio LB suplementado de ampicilina (100µg/ml) e cloranfenicol

(34µg/ml). O tubo então foi incubado durante 16 horas à 37ºC sob agitação.

3.2.10 Indução da expressão da proteína p17

A partir do tubo que foi deixado durante 16 horas com a transformação de

células BL21(DE3)pLysS foram retirados 500µl para cada novo inóculo (três) em

10ml de meio LB. Os tubos foram então incubados à 37ºC até atingir uma OD600 entre

0,5 e 0,8, o que ocorreu aproximadamente duas horas após a incubação. Cada uma das

culturas foi então dividida em duas com 5ml cada. Foi então adicionado IPTG nas

concentrações de 0,5; 0,75; 1; 1,5 e 2,0 mM. Um tubo permaneceu sem a adição de

IPTG como controle negativo da indução.

Foram retirados 500µl de cada cultura, centrifugados a 13.000g e descartados os

sobrenadantes. Esses precipitados, tempo zero de indução, foram guardados a -20ºC.

As culturas foram incubadas até 5 horas à 37ºC sendo retiradas duas alíquotas de

250µl a cada hora. As alíquotas foram centrifugadas e guardadas tal como feito para o

tempo zero.

73

3.2.11 Análise da expressão da proteína His-p17 por SDS-PAGE

Uma das alíquotas de 250µl retirada a cada tempo foi reconstituída em 40µl de

tampão de amostra de SDS-PAGE 1X. Todos os tubos foram então incubados a 100ºC

durante cinco minutos e centrifugados 15 segundos. Cinco microlitros de cada

amostra foram aplicados em gel de SDS-PAGE descontínuo (4% gel de empilhamento

e 10% gel de resolução) (Laemmli, 1970).

A outra alíquota de cada tempo foi descongelada e reconstituída em 250µl de

tampão de lise (50mM de fosfato de potássio pH 7,8; 100mM NaCl; 100mM KCl;

10% glicerol; 0,5% Triton X-100 e 10mM imidazol). As amostras foram congeladas

rapidamente em nitrogênio líquido e descongelas em banho-maria à 42ºC. Esse ciclo

de congelamento e descongelamento foi repetido 3 vezes.

As amostras foram então centrifugadas a 13.000g durante um minuto à 4ºC para

precipitar as proteínas insolúveis. Os sobrenadantes foram transferidos para os tubos

de 1,5ml e colocados em banho de gelo. Vinte microlitros do sobrenadante foram

retirados e misturados volume a volume em tampão de amostra de SDS-PAGE 2X

(Laemmli, 1970) e incubados a 100ºC durante cinco minutos.

Os precipitados foram reconstituídos em 100µl de tampão de amostra de SDS-

PAGE 1X e também incubados a 100ºC durante cinco minutos. Dez microlitros do

sobrenadante em tampão de amostra e 5µl do precipitado, também em tampão de

amostra, foram submetidos a SDS-PAGE. Para todos os géis de SDS-PAGE foi

aplicada uma tensão de 100V, durante duas horas e dez minutos. Ao final da

eletroforese, os géis foram corados com azul de Coomassie e observados em

transiluminador.

74

3.2.12 Confirmação da expressão de His-p17 por western blotting

Para a confirmação de que a proteína superexpressa encontrada nos precipitados

era His-p17, foi realizada a detecção da cauda de histidina por western blotting. As

amostras testadas foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida, tal como

descrito anteriormente. Após a eletroforese os géis foram utilizados para transferência

das amostras para uma membrana de nitrocelulose Hybond-C extra (Amersham –

RPN203E) durante 30 minutos a uma corrente de 140mA, utilizando tampão de

Bjerrum e Schafer-Nielsen gelado (48mM Tris base; 39mM glicina; 20% metanol pH

9,2) em um equipamento de transferência Trans-Blot Semi-Dry (Biorad - 170-3940).

Após a transferência, a membrana foi incubada em um tampão TBST-leite

(10mM Tris-HCl, pH 8,0; 150mM NaCl; 0,05% Tween-20; 5% (p/v) leite em pó

desnatado), durante uma hora, a fim de saturar sítios de ligação não específicos. Ao

final dessa etapa a membrana foi lavada três vezes, durante 10 minutos, com TBST.

Uma vez lavada a membrana, foi adicionada a solução com o anticorpo

monoclonal primário anti-cauda His (Novagen - 70796-4) diluído 1:10.000 em

tampão TBST. A membrana foi então incubada à 37ºC durante uma hora com

agitação constante. Ao final desse período, a solução com os anticorpos primários foi

removida, foi feita então a lavagem da membrana três vezes, durante 10 minutos, com

TBST para efetuar a remoção de anticorpos não ligados.

Após a etapa de lavagem a membrana foi mergulhada em uma solução contendo

o anticorpo secundário anti-IgG de camundongo conjugado a fosfatase alcalina

(Novagen - 69266-3) diluído 1:5.000 e incubada novamente por uma hora à 37ºC.

Findo o tempo de incubação, a solução contendo o anticorpo secundário foi removida

e a membrana foi novamente lavada com TBST, como descrito anteriormente. Após

75

as lavagens com TBST foram feitas duas lavagens com TBS, também durante 10

minutos cada.

A reação foi revelada pela adição do substrato cromógeno BCIP/NBT (5-

bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato / nitro-azul tetrazólio, Promega – S3771) em tampão

de revelação de fosfatase alcalina (100mM NaCl; 5mM MgCl2; 100mM Tris-HCl pH

9,2). A membrana ficou mergulhada nessa solução, sob agitação, até ser atingida a

intensidade desejada para coloração das bandas, sendo então lavada duas vezes com

TBS, seca a temperatura ambiente e fotografada com câmera digital.

76

4. Resultados

4.1. Seqüenciamento e análise dos segmentos genômicos M1, M2, M3, S1 e S2.

4.1.1 Desenho dos iniciadores para os segmentos M1, M2, M3, S1 e S2.

Quando os objetivos desta tese foram traçados não havia sido publicada sequer

uma seqüência para quaisquer dos segmentos da classe M das amostras de reovírus

aviários. Em função disto, algumas metodologias foram estudadas de maneira a ser

possível a obtenção destas seqüências. Foi então escolhida a metodologia

originalmente descrita por Lambden et al., (1992) e posteriormente adaptada por

outros pesquisadores (Vreede et al., 1998; Potgieter, Steele & van Dijk, 2002), a qual

consiste na adição de um oligonucleotídeo aos terminais 3´ das moléculas de dsRNA e

a utilização de um iniciador complementar ao oligonucleotídeo ligado para então

promover a transcrição reversa e a posterior amplificação por PCR.

Estavam sendo realizados os primeiros ensaios com esta técnica quando foram

disponibilizadas as primeiras seqüências do segmento M3, logo em seguida do

segmento M1 e por fim do segmento M2. Uma vez que os terminais 5´ e 3´ das

moléculas de dsRNA dos reovírus aviários são bastante conservados, principalmente

quando comparados os mesmos segmentos, decidimos então desenhar os iniciadores

com base no alinhamento das seqüências disponíveis, tal como descrito em material e

métodos.

Para os segmentos S1 e S2 já eram conhecidas seqüências de outras amostras e

pode-se então fazer o alinhamento dessas seqüências e desenhar os iniciadores, como

depois foi realizado para os segmentos da classe M.

77

4.1.2 Transcrição reversa e amplificação das seqüências de cDNA por PCR

Todas os segmentos genômicos foram transformados em cDNA e amplificados

como descrito em material e métodos. Os amplicons foram submetidos a eletroforese

em gel de agarose para confirmação da amplificação dos produtos com os tamanhos

esperados. Dessa forma, foram visualizadas bandas de tamanho compatível com

1643bp para as amostras S1133wt e P100 quando da amplificação do segmento S1;

outras com tamanho próximo aos 1324bp para os segmentos S2 e bandas compatíveis

com o tamanho de 2283, 2158 e 1996bp quando foram amplificados os segmentos

M1, M2 e M3, respectivamente.

4.1.3 Comparação das seqüências dos segmentos M1, M2, M3, S1 e S2

Após os cromatogramas das reações de seqüenciamento terem sido devidamente

analisados e transformados em seqüências, foram realizados o alinhamento e

comparação das seqüências dos segmentos M1, M2, M3, S1 e S2 das amostras

S1133wt e P100.

O resultado do alinhamento das seqüências de nucleotídeos obtidas para o

segmento M1 mostrou 11 diferenças entre as amostras S1133wt e P100 (Tabela 5).

Todas as mutações foram observadas na região codificante de M1 (proteína µA),

dessas diferenças entre as duas amostras, seis estão localizadas em uma região entre

os nucleotídeos 1347 e 1602. Dez diferenças foram mutações nas terceiras posições

dos códons, enquanto que apenas uma foi encontrada em uma primeira posição. Nove

mutações em terceiras posições e a única em uma primeira posição foram provocadas

por transições (C – T = 5, T – C = 3, A – G = 1, G – A = 1) e somente a mutação

78

observada no nucleotídeo 1347, foi provocada por uma transversão (G – T). Não

foram observadas diferenças nas segundas posições dos códons. Entre as 11 mutações

na seqüência de nucleotídeos de M1 entre S1133wt e P100, nove foram silenciosas e

duas não silenciosas. As mutações nas posições 1347 e 2005, G – T e A – G,

respectivamente, levaram a alteração na seqüência de aminoácidos predita para a

proteína µA da amostra P100.

Tabela 5. Diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento M1.

Posição (nucleotídeos) 150 606 1011 1347 1353 1539 1548 1584 1602 2005 2112

S1133wt C C C G C T T T C A G P100 T T T T T C C C T G A

Códons S1133wt cgc agc ccc ttg ccc agt ttt ttt acc atc cag P100 cgt agt cct ttt cct agc ttc ttc act gtc caa

Posição (aminoácidos) 445 665 S1133wt Leu Ile P100 Arg Ser Pro

Phe Pro Ser Phe Phe Thr

Val Gln

Posições de nucleotídeos referentes ao segmento completo. Em negrito nucleotídeos diferentes em cada

códon. Aminoácidos diferentes foram coloridos de acordo com suas características (Hall, 1999).

O alinhamento entre as seqüências de nucleotídeos dos segmentos M2 de

S1133wt e P100 mostrou 23 diferenças (Tabela 6). Todas as mutações observadas

foram encontradas dentro da seqüência codificante do segmento M2 para a proteína

µB. Oito diferenças foram observadas entre os nucleotídeos 813 e 1197. Das 23

diferenças, 12 foram mutações nas terceiras posições dos códons, oito mutações em

primeiras posições e três foram mutações em segundas posições. Das 23 mutações, 20

79

foram provocadas por transições (T – C = 7, C – T = 6, A – G = 5 e G – A = 2), e as

outras três mutações foram provocadas por transversões (A – T = 1, C – A = 1 e A –

C = 1). Das 23 diferenças, 13 foram mutações silenciosas enquanto que dez levaram a

mutações não silenciosas. Especificamente as mutações das posições 309, 813, 915,

1003, 1122, 1191, 1197, 1473, 1651 e 1876, todas em primeira ou segundas posições,

levaram a diferenças na seqüência deduzida da proteína µB da amostra P100.

Para o segmento M3, o alinhamento das seqüências de S1133wt e P100 mostrou

14 diferenças de nucleotídeos (Tabela 7). Tal como encontrado nos outros segmentos

da classe M, todas as mutações foram localizadas dentro de uma região codificante,

neste caso para a proteína µNS. Quatro mutações foram localizadas entre os

nucleotídeos 196 e 258 e outras quatro entre as posições 1812 e 1914. Das 14

diferenças entre S1133wt e P100, 12 foram mutações nas terceiras posições dos

códons, uma mutação em uma primeira posição e outra em uma segunda posição.

Entre as 14 mutações, 13 foram provocadas por transições (G – A = 3, T – C = 6, C –

T = 1, A – G = 3) e apenas uma por uma transversão (A – C). Das 14 diferenças, 12

levaram a mutações silenciosas e duas provocaram mutações não silenciosas,

justamente aquelas ocorridas fora das terceiras posições dos códons, nucleotídeos 196

(primeira posição) e 494 (segunda posição).

.

80

Tabela 6. Diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento M2.

Posição (nucleotídeos)

80 143 251 309 402 431 704 813 915 926 1003 1122 1191 1196 1197 1473 1478 1496 1556 1634 1651 1745 1876

S1133wt T T C A C C C A G T C G C T A A A T A T A T C P100 C C T G T T T T A C T A A C G G C C G C G C T

Códons

S1133wt ggt ccc ctc atg ctg tcc gac act gtt gat aca gtt cag ggt act aat gta gat gta ggt aaa gct aca

P100 ggc cct ctt gtg ttg tct gat tct att gac ata att aag ggc gct gat gtc gac gtg ggc aga gcc ata

Posição (aminoácidos)

94 262 296 325 365 388 390 482 541 616

S1133wt Met Thr Val Thr Val Gln Thr Asn Lys Thr P100

Gly Pro Leu Val

Leu Ser Asp Ser Ile

Asp Ile Ile Lys

Gly Ala Asp

Val Asp Val Gly Arg

Ala Ile

Posições de nucleotídeos referentes ao segmento completo. Em negrito nucleotídeos diferentes em cada códon. Aminoácidos diferentes foram coloridos de

acordo com suas características (Hall, 1999).

81

Tabela 7. Diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento M3.

Posição (nucleotídeos)

30 75 196 204 225 258 474 494 597 975 1812 1848 1893 1914

S1133wt G T G T C A T T G T T A A A P100 A C A C T G C C A C C C G G

Códons

S1133wt gcg cat gtt gtt ttc tta gct gtc acg att aat gca gaa gaa

P100 gca cac att gtc ttt ttg gcc gcc aca atc aac gcc gag gag

Posição (aminoácidos)

58 157

S1133wt Val Val P100

Ala His Ile

Val Phe Leu Ala Ala

Thr Ile Asn Ala Glu Glu

Posições de nucleotídeos referentes ao segmento completo. Em negrito nucleotídeos diferentes em cada

códon. Aminoácidos diferentes foram coloridos de acordo com suas características (Hall, 1999).

As seqüências de nucleotídeos obtidas com as reações de seqüenciamento do

segmento S1 das amostras S1133wt e P100 também foram alinhadas e analisadas

quanto às suas diferenças. Foram observadas 11 diferenças entre as duas seqüências,

todas dentro da região codificante de S1, ORF1, ORF2 e ORF3 para as proteínas p10,

p17 e σC, respectivamente (Tabela 8).

A região entre os nucleotídeos 842 e 1034 apresentou sete das 11 mutações

encontradas. Três diferenças foram mutações nas primeiras posições dos códons,

outras três diferenças foram encontradas em segundas posições e seis nas terceiras

posições dos códons mutados restantes. Sete das 11 mutações foram provocadas por

transições (G – A = 3, A – G = 3 e C – T = 1), ao passo que as outras quatro mutações

foram provocadas por transversões (C – A = 2, C – G = 1 e A – C = 1).

Quatro das 11 mutações foram silenciosas, enquanto que as outras sete foram

responsáveis por alterações nas seqüências deduzidas de p10, p17 e σC. O fato do

82

segmento genômico S1 possuir três regiões codificantes parcialmente sobrepostas em

distintas fases de leitura proporcionou que uma única mutação (C – A) na posição 700

fosse ao mesmo tempo em uma terceira posição (ORF2) e em uma segunda posição

(ORF3). Essa mutação foi responsável por duas alterações de nas seqüências de

aminoácidos, uma na seqüência de p17 e outra na seqüência de σC. Outra

particularidade encontrada na comparação das seqüências dos segmentos S1 foi o fato

de que duas mutações (G – A) na posição 1032 e (A – C) na posição 1034, foram

responsáveis pela mudança de um mesmo códon, na primeira e terceira posições,

levando a uma mudança de aminoácido na seqüência de σC da amostra P100.

Tabela 8. Diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento S1.

Posição (nucleotídeos) ORF1 ORF2 ORF3 48 99 226 700 700 842 946 967 983 984 1032 1034

S1133wt G A G C C C C C A A G A P100 A G A A A A G T G G A C

Códons

S1133wt tcg caa gtc gac act acc aca aca caa act gta

P100 tca cag atc gaa aat aca aga ata cag gct atc Posição (aminoácidos) p10 p17 σC 68 136 24 106 113 119 135

S1133wt Ser Gln Val Asp Thr Thr Thr Thr Gln Thr Val P100 Ile Glu Asn Arg Ile Ala Ile

Posições de nucleotídeos referentes ao segmento completo. Em negrito nucleotídeos diferentes em cada

códon. Aminoácidos diferentes foram coloridos de acordo com suas características (Hall, 1999).

83

O alinhamento das seqüências de nucleotídeos do segmento S2 entre as

amostras S1133wt e P100 revelou sete nucleotídeos diferentes, distribuídos por todo o

segmento dentro da região codificante para a proteína σA (Tabela 9). Cinco das sete

diferenças foram mutações nas terceiras posições dos códons, enquanto que as outras

duas mudanças foram mutações encontradas em primeira e segunda posição.

Dentre as sete mutações observadas no segmento S2 de P100, seis foram

provocadas por transições (A – G = 3, G – A = 2 e T – C = 1) e uma por uma

transversão (A – C). Foram observadas cinco mutações silenciosas e outras duas não

silenciosas provocadas pelas mudanças de nucleotídeos nas posições 256 e 917.

Tabela 9. Diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento S2.

Posição (nucleotídeos) 174 256 291 432 687 917 1125

S1133wt A A G A G T A P100 C G A G A C G

Códons

S1133wt tca agt ggg caa ggg gtg cta

P100 tcc ggt gga cag gga gcg ctg

Posição (aminoácidos) 81 301

S1133wt Ser Val P100

Ser Gly

Gly Gln Gly Ala

Leu

Posições de nucleotídeos referentes ao segmento completo. Em negrito nucleotídeos diferentes em cada

códon. Aminoácidos diferentes foram coloridos de acordo com suas características (Hall, 1999).

84

4.1.4 Análise filogenética das proteínas µA, µB, µNS, p10, p17, σC e σA.

As seqüências deduzidas das proteínas µA, µB, µNS, p10, p17, σC e σA foram

utilizadas para um estudo filogenético frente a outras seqüências de reovírus aviários

depositadas no GenBank.

Para a análise das seqüências de µA, foram utilizadas outras 15 seqüências da

proteína µA, inclusive de duas seqüências depositadas com o nome de S1133. Para

facilitar a interpretação dos dados foram utilizados dois sufixos: B, já citado

anteriormente como a amostra seqüenciada e depositada pelo grupo do Professor

Javier Benavente e o sufixo L, para a seqüência depositada pelo grupo do professor

Long Huw Lee da Universidade Nacional de Chung Hsing, Taiwan. A mesma

nomenclatura foi utilizada para a amostra 1733 a qual, também teve mais de uma

seqüência depositada para o mesmo segmento.

Todas as análises filogenéticas foram conduzidas no programa MEGA

(Molecular Evolutionary Genetics Analysis v. 3.1) descrito por Kumar, Tamura & Nei

(2004) utilizando o método de neighbor-joining (Saitou & Nei, 1987). A árvore obtida

para a proteína µA (Figura 6) mostra uma proteína altamente conservada entre as

amostras de reovírus aviárias seqüenciadas até o momento. As amostras 1733L, 2408,

919 e T6 apresentam 99,9% de identidade com a amostra S1133wt, enquanto que as

amostras mais distantes, 916 e R2 possuem 2,8% de divergência com S1133wt. Os

mesmos resultados foram observados em relação a P100 que possui 99,7% de

identidade com S1133wt.

Com a utilização do programa BioEdit (Hall, 1999) foi realizada uma pesquisa

por regiões conservadas nas seqüências da proteína µA, com um tamanho mínimo de

15 resíduos. Esta análise demonstrou 17 regiões conservadas variando em tamanho de

85

15 a 46 resíduos. As regiões estão localizadas nas posições de 1 a 16; 23 a 41; 43 a

73; 103 a 126; 149 a 169; 214 a 243; 245 a 290; 331 a 374; 399 a 417; 419 a 444; 446

a 465; 554 a 575; 583 a 597; 599 a 626; 642 a 659; 666 a 698 e 700 a 732. A presença

de várias regiões conservadas corrobora com a baixa divergência encontrada no

alinhamento das seqüências de µA.

Figura 6. Árvore filogenética de µA. Escala significa número de aminoácidos

diferentes.

Para as seqüências de µB a análise filogenética mostrou um grau maior de

divergência que aquele encontrado para µA. A maior distância frente à amostra

S1133wt foi encontrada na amostra 918 com 15.5% de divergência, enquanto que

S1133L, 1733L, 2408 e T6 apresentaram a maior identidade (99,3%) com S1133wt.

Em relação a P100 também foi a amostra 918 que apresentou a maior divergência

919 T6 2408 1733L S1133B S1133wt P100 S1133L 176 601G 750505 918 OS161 138 1017-1 916 R2

02468

86

(16,4%), enquanto que a amostra S1133B apresentou a maior identidade (99,1%)

frente a P100. A amostra S1133wt em relação a P100 possui 98,5% de identidade.

A procura por regiões conservadas, tal qual realizada pra µA demonstrou apenas

seis regiões conservadas em todas as 17 seqüências analisadas. O tamanho destas

seqüências também foi menor se comparado a µA, variando entre 15 a 21 resíduos. As

regiões conservadas estão localizadas entre os aminoácidos 12 a 26; 28 a 48; 116 a

135; 440 a 458, 558 a 573 e 640 a 659. Ainda com base nestes resultados pode ser

verificada uma grande região entre os aminoácidos 136 e 438 onde estão localizadas a

maioria das diferenças entre as seqüências.

S1133wt

2408

P100

S1133BVacinas

S1133L

1017-1

1733L

T6

176

919

R2

138

601G

750505

916

OS161

918

010203040

Figura 7. Árvore filogenética de µB. Escala significa número de aminoácidos

diferentes.

Para a proteína µNS, a análise filogenética mostrou uma divergência menor que

aquela encontrada para µB, porém maior que do que foi encontrado para µA. A

87

amostra mais distante de S1133wt foi novamente 918 com 10,2% de divergência, por

outro lado as amostras 2408 e 919 apresentam 99,5% de identidade com S1133wt. Em

relação a P100, a amostra mais distante também é a 918 com 10,6% de divergência. A

amostra S1133B apresenta a maior identidade com P100 (99,8%). S1133wt em

relação a P100 possui 99,7% de identidade.

Sete regiões conservadas foram localizadas nas regiões: 14 a 31; 36 a 55; 64 a

78; 329 a 348; 360 a 381; 462 a 496 e 553 a 571, com um tamanho variando entre 15

e 35 resíduos. Novamente foi observada uma grande região entre os aminoácidos 79 e

328 onde estão localizadas a maioria das diferenças entre as amostras.

2408

919

S1133wt

1733L

S1133L

1733B

P100

S1133BVacinas

176

138

T6

OS161

601G

750505

1017-1

916

918

R2

051015202530

Figura 8. Árvore filogenética de µNS. Escala significa número de aminoácidos

diferentes.

As seqüências deduzidas das três proteínas codificadas pelo segmento S1 foram

utilizadas para análise filogenética frente a seqüências depositadas no GenBank. Para

88

a comparação com as seqüências da proteína p10 de S1133wt e P100 foram utilizadas

16 seqüências de reovírus aviários. A análise da árvore de p10 mostrou a baixa

diversidade das seqüências desta proteína. Dez amostras (176, T6, 750505, 919, 1017-

1, OS161, 1733, 601SI, 918 e 2408) possuem 100% de identidade com a amostra

S1133wt, enquanto que a amostra mais distante de S1133wt foi a amostra 138 com

95,8% de identidade. Quando analisada a seqüência de P100 foi encontrada uma

amostra com 100% de identidade S1133B, enquanto que novamente a amostra 138 foi

aquela com menor identidade também com 95,8%. A comparação entre S1133wt e

P100 também mostra alta identidade 98,9%. Foi encontrada uma grande região

conservada com 39 resíduos de tamanho entre as posições 16 e 54.

176 S1133wt 1017-1 1733 2408 601SI 918 919 750505 T6 OS161 FC P100 S1133B

Vacinas

138 601G 916 R2

0.00.51.01.5

Figura 9. Árvore filogenética de p10. Escala significa número de aminoácidos

diferentes.

89

As mesmas amostras foram utilizadas na análise filogenética para a proteína

p17, onde foi observado o maior número de seqüências idênticas entre todas as

analisadas, 11 seqüências (OS161, T6, 750505, 919, 918, 601SI, 2408, 1733, 1017-1,

176 e FC) possuem 100% de identidade com a amostra S1133wt, enquanto duas

amostras 916 e 601G apresentaram a maior divergência 19,8%. Em relação a P100,

uma amostra apresentou 100% de identidade, S1133B. Novamente as amostras 916 e

601G foram as mais distantes com 20,6% de divergência. A comparação entre

S1133wt e P100 mostrou uma identidade de 99,3%. Foi encontrada uma região

conservada, com 18 resíduos entre os resíduos 58 e 75.

1733 918 176 T6 1017-1 919 S1133wt 750505 2408 FC 601SI OS161 P100 S1133B

Vacinas

138 R2 601G 916

024681012

Figura 10. Árvore filogenética de p17. Escala significa número de aminoácidos

diferentes.

90

A proteína σC é aquela com maior número de seqüências depositadas no

GenBank, por esse motivo foram adicionadas às seqüências de S1133wt e P100 outras

33, todas de reovírus aviários, inclusive além de S1133B, outras duas seqüências

depositadas com o nome de S1133. Da mesma maneira que utilizado anteriormente

foram atribuídos sufixos ao nome S1133 a fim de diferenciar as amostras. A

seqüência depositada por Shapouri et al. (1995), recebeu o sufixo S, sendo então

S1133S e a seqüência depositada por Ghorashi e Morshedi, não publicada, recebeu o

sufixo G, sendo então nomeada S1133G. O grande número de seqüências analisadas

fez com que fossem observadas várias linhagens. Quase todas as amostras asiáticas,

canadenses e norte-americanas ficaram agrupadas em um grande ramo (I). Uma

amostra asiática e uma alemã ficaram juntas no pequeno ramo II. As amostras alemãs

restantes juntamente com as amostras holandesas e as amostras australianas RAM-1 e

Sommerville -4 ficaram agrupadas no ramo III.

Duas amostras (FC e 176) demonstraram possuir 100% de identidade com

S1133wt, outras quatro amostras também apresentaram identidade alta com S1133wt:

1733 (99,7%); 2408, OS161 e T6 todas com 99,1% de identidade. Contudo, a

filogenia frente à proteína σC também mostrou as maiores distâncias entre aquelas

observadas nesse estudo. Duas amostras 1017-1 e 918, mostraram possuir a maior

divergência frente a S1133wt (72% para ambas).

Em relação a seqüência de P100, duas amostras mostraram 100% de identidade:

S1133B e S1133G; outras cinco amostras encontraram-se muito próximas a P100:

S1133S, 1733, 2408, OS161 e T6, (98,8% de identidade). A identidade entre S1133wt

e P100 ficou em 98,5%. Não foram observadas regiões conservadas utilizando os

mesmos parâmetros descritos anteriormente. O mesmo resultado foi obtido quando

foram utilizadas somente as amostras analisadas para as proteínas da classe M.

91

2408º

OS161ª

T6ª

919ª

601SIª

750505ª

1733º

GuangxiR1ª

S1133wtº

FCªª

176ªª

S1133Sº

P100º

S1133Bº

S1133Gº

Vacinas

138ªª

601Gª

R2ª

GEL06ºº

GEL12ºº

GEI09ºº

I

916ª

GEL13a98Mºº II

GEL13b98Mºº

RAM-1**

Somerville**

GEI10ºº

1017-1ª

918ª

NLI02*

GEL01ºº

GEL03ºº

NLI12*

NLA13*

GEL05ºº

III

020406080

Figura 11. Árvore filogenética de σC. Escala significa número de aminoácidos

diferentes. Origem das amostras: ª asiáticas, ªª canadenses, º norte-americanas,

ºº alemãs, * holandesas e ** australianas.

92

Para a análise filogenética da proteína σA foram incluídas outras 15 seqüências

depositadas no GenBank. Verificamos que σA é outra proteína altamente conservada

entre as amostras de reovírus aviários seqüenciadas até o momento. Em relação a

S1133wt foi encontrada uma amostra com 100% de identidade (2408), enquanto que

cinco amostras: 176, 750505, 1733L, 919 e OS161 apresentaram 99,8% de identidade.

A amostra com menor identidade foi R2 (97,3%). Para P100 foram encontradas duas

seqüências com 99,5% de identidade: S1133wt e 2408, enquanto que cinco amostras,

novamente 176, 750505, 1733L, 919 e OS161, apresentaram 99,3% de identidade. A

amostra com a menor identidade foi novamente R2 (97,3%).

A procura por regiões conservadas demonstrou onze regiões variando em

tamanho de 17 a 36 resíduos, localizadas nas posições 6 a 29; 44 a 63; 92 a 117; 144 a

179; 187 a 212; 214 a 231; 265 a 300; 302 a 318; 320 a 342; 345 a 375 e 391 a 416.

Figura 12. Árvore filogenética de σA. Escala significa número de aminoácidos

diferentes.

S1133wt

2408

176

750505

T6

1733L

919

OS161

P100

918

S1133L

601G

138

1017-1

916

R2

601SI

012345

93

4.1.5 Análise da seqüência das proteínas µA, µB, µNS, p10, p17, σC e σA

Os principais parâmetros físico-químicos das proteínas µA, µB, µNS, p10, p17,

σC e σA foram avaliados em função das seqüências primárias utilizando a ferramenta

ProtParam (Gasteiger et al., 2003; Gasteiger et al., 2005) no servidor do ExPASy

(Expert Protein Analysis System) mantido pelo Instituto Suíço de Bioinformática

(SIB). Os resultados estão agrupados na tabela seguinte.

Tabela 10. Resultados da Ferramenta ProtParam.

Amostra Proteína Tamanho Mw pI AA (+)

AA (-) EC1 EC2 HL II AI GRAVY

S1133wt µA 732 82080,6 8,39 74 69 102635 101760 >10 43,22 98,29 0,035

P100 µA 732 82100,6 8,39 74 69 102635 101760 >10 42,78 97,62 0,033

S1133wt µB 676 73234,7 5,31 57 69 84380 83880 >10 37,71 86,41 -0,152

P100 µB 676 73239,7 5,32 58 70 84380 83880 >10 36,96 88,43 -0,130

S1133wt µNS 635 70850,9 5,88 73 84 54485 53860 >10 49,06 90,02 -0,280

P100 µNS 635 70836,8 5,88 73 84 54485 53860 >10 49,31 89,87 -0,284

S1133wt p10 98 10270,9 8,80 7 4 11710 11460 >10 37,46 93,78 0,427

P100 p10 98 10285,0 8,80 7 4 11710 11460 >10 36,89 94,80 0,430

S1133wt p17 146 16868,3 8,34 16 14 24200 23950 >10 55,12 90,89 -0,125

P100 p17 146 16882,4 8,34 16 14 24200 23950 >10 55,12 90,89 -0,125

S1133wt σC 326 34761,5 4,90 18 31 16055 15930 >10 37,87 88,22 -0,054

P100 σC 326 34825,6 5,00 19 31 16055 15930 >10 41,68 90,03 -0,050

S1133wt σA 416 46062,1 8,77 26 30 94100 93850 >10 41,34 76,54 -0,205

P100 σA 416 46004,1 8,77 26 30 94100 93850 >10 41,18 76,08 -0,209

Tamanho: Número de aminoácidos; Mw: Peso molecular em Dáltons; pI: Ponto isoelétrico teórico; AA (+):

Número de aminoácidos carregados positivamente (Asp + Glu); AA (-): Número de aminoácidos carregados

negativamente (Arg + Lys); EC1: Coeficiente de extinção 1 (assumindo todas cisteínas como meia cistina);

EC2: Coeficiente de extinção 1 (assumindo nenhuma cisteína como meia cistina); HL: Meia vida teórica em

E. coli (horas); II: Índice de instabilidade; AI: Índice Alifático; GRAVY: Média de hidropaticidade.

94

A predição de estruturas em coiled-coil foi avaliada pela utilização de duas

ferramentas, Marcoil (http://www.isrec.isb-sib.ch/webmarcoil/webmarcoilC1.html -

Delorenzi & Speed, 2002) e MultiCoil (http://multicoil.lcs.mit.edu/cgi-bin/multicoil -

Wolf, Kim & Berger, 1997).

Em ambas as análises, somente as proteínas µNS e σC apresentaram alta

probabilidade de formação de estruturas em coiled-coil. A análise com a ferramenta

Marcoil demonstrou uma região com 99% de probabilidade de formação de estrutura

em coiled-coil na proteína µNS entre os aminoácidos 543 e 585, tanto para a

seqüência de S1133wt, quanto para a de P100. Para a proteína σC também foi

verificada a presença de uma região com 99% de probabilidade para formação de

estruturas em coiled-coil entre os aminoácidos 47 e 149, tanto para S1133wt quanto

para P100.

Os resultados da ferramenta Multicoil revelaram uma predição idêntica para

µNS e muito próxima para a proteína σC em relação a S1133wt e P100. As predições

realizadas no programa Multicoil indicam uma maior possibilidade de que as regiões

em coiled-coil sejam formadas por trímeros, tanto na proteína µNS quanto em σC.

Para completar esta análise sobre predições de estruturas em coiled-coil foi feita

uma pesquisa por motivos de zíperes de leucina no servidor 2ZIP

(http://2zip.molgen.mpg.de/index.html - Bornberg-Bauer, Rivals & Vingron, 1998).

Para ambas as amostras S1133wt e P100 somente foram detectados motivos de

zíperes de leucina nas proteínas µNS, entre os aminoácidos 571 e 592, e em σC, entre

os aminoácidos 65 e 103.

Uma análise de clusters hidrofóbicos (HCA) (Gaboriaud et al., 1987) foi

realizada utilizando o servidor DrawHCA. Não foram observadas diferenças na

comparação das seqüências de µA entre S1133wt e P100; de acordo com os

95

resultados de HCA µA apresenta uma distribuição de aminoácidos hidrofóbicos

compatível com uma proteína com muitas regiões em folha-beta além de uma grande

região hidrofóbica entre os aminoácidos 340 e 350 (Figuras 13 e 14).

A comparação entre as seqüências de µB mostrou duas diferenças em regiões

hidrofóbicas (setas), uma próxima ao resíduo 325, onde uma alteração T – I na

seqüência de P100 torna maior um cluster hidrofóbico, o mesmo acontecendo na

região próxima ao aminoácido 616 onde outra mutação T – I também aumenta a

interação hidrofóbica nesta região. Uma grande região hidrofóbica foi localizada entre

os aminoácidos 140 e 150 em ambas as seqüências (Figuras 15 e 16).

Para a proteína µNS foi encontrada uma pequena diferença próxima ao resíduo

157 (seta) devido a uma mutação V – A. Várias regiões hidrofóbicas estão presentes

ao longo da estrutura protéica, muitas vezes em mesmo contexto com diversos

aminoácidos carregados por toda a extensão da proteína (Figuras 17 e 18).

Entre as proteínas codificadas pelo segmento S1, somente σC apresentou uma

alteração relacionada a regiões hidrofóbicas, causada pela mutação T113I observada

em P100 a qual tornou maior a interação hidrofóbica nesta região (seta) (Figuras 23 e

24). A distribuição de aminoácidos hidrofóbicos em σC é compatível com a predição

de estrutura em coiled-coil na região N-terminal e em folhas-beta na região C-

terminal. Em p10 foi observada uma grande região hidrofóbica entre os aminoácidos

52 e 62 (Figuras 19 e 20), enquanto que p17 apresenta diversas pequenas regiões

hidrofóbicas em toda sua extensão (Figuras 21 e 22).

Na seqüência da proteína σA foi observada uma grande região hidrofóbica entre

os aminoácidos 207 e 226 para as ambas amostras e uma pequena redução em uma

região hidrofóbica causada pela substituição V301A na seqüência de P100 (seta)

(Figuras 25 e 26)

96

Figura 13. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µA de S1133wt.

Figura 14. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µA de P100.

Verde: aminoácidos hidrofóbicos; Vermelho: aminoácidos carregados (+); Azul: aminoácidos carregados (-);Thr ( ); Gly ( ); Ser ( ) e Pro ( ).

97

Figura 15. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µB de S1133wt.

Figura 16. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µB de P100.

Verde: aminoácidos hidrofóbicos; Vermelho: aminoácidos carregados (+); Azul: aminoácidos carregados (-);Thr ( ); Gly ( ); Ser ( ) e Pro ( ).

98

Figura 17. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µNS de S1133wt.

Figura 18. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µNS de P100.

Verde: aminoácidos hidrofóbicos; Vermelho: aminoácidos carregados (+); Azul: aminoácidos carregados (-);Thr ( ); Gly ( ); Ser ( ) e Pro ( ).

99

Figura 19. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína p10 de S1133wt.

Figura 20. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína p10 de P100.

Figura 21. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína p17 de S1133wt.

Figura 22. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína p17 de P100.

Verde: aminoácidos hidrofóbicos; Vermelho: aminoácidos carregados (+); Azul: aminoácidos carregados (-);Thr ( ); Gly ( ); Ser ( ) e Pro ( ).

100

Figura 23. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína σC de S1133wt.

Figura 24. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína σC de P100.

Verde: aminoácidos hidrofóbicos; Vermelho: aminoácidos carregados (+); Azul: aminoácidos carregados (-);Thr ( ); Gly ( ); Ser ( ) e Pro ( ).

101

Figura 25. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína σA de S1133wt.

Figura 26. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína σA de P100.

Verde: aminoácidos hidrofóbicos; Vermelho: aminoácidos carregados (+); Azul: aminoácidos carregados (-);Thr ( ); Gly ( ); Ser ( ) e Pro ( ).

102

As análises das seqüências de aminoácidos revelaram que as mudanças mais

importantes ocorridas durante o processo de atenuação da amostra S1133wt até a

obtenção da amostra P100 aconteceram nas proteínas µB e σC. Por esse motivo, essas

proteínas foram estudadas em maior detalhe.

4.1.6 Alinhamento da região N-terminal de σC

Para que fosse possível a comparação das mutações encontradas na proteína σC

de P100, as trinta e cinco seqüências utilizadas para análise filogenética foram

alinhadas na região N-terminal. Nove seqüências (P100, S1133B, S1133G, S1133S,

1017-1, 916, 918, GEL12 98M e GEI09 97M) apresentaram uma asparagina na

posição 24 (Figura 27).

Somente as quatro amostras vacinais utilizadas para o alinhamento (P100,

S1133B, S1133G e S1133S) apresentaram uma arginina, ou qualquer outro

aminoácido carregado na posição 106. Somente nas amostras vacinais foi observada a

presença de uma isoleucina na posição 113 e/ou 135, nesta última posição todas as

outras amostras apresentam uma valina. Finalmente uma alanina na posição 119 foi

uma característica somente encontrada em P100 (Figura 27). As setas indicam as

posições das substituições encontras na amostra P100.

103

Figura 27. Alinhamento N-Terminal das seqüências de σC, entre 35 amostras.

10 20 30 40 50 60 70....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

S1133wt MAGLNPSQRREVVSLILSLTSNVTISHGDLTPIYERLTNLEASTELLHRSISDISTTVSNISANLQDMTHFC ......................................................................176 ......................................................................P100 .......................N..............................................S1133B .......................N..............................................S1133G .......................N..............................................S1133S .......................N................................S.............138 ......................AH.N............S....A.S.Y....SM.....D...D..NV.R1017-1 .D..TQ.......G.........N.NP...AQLR..VSA..SANASINE.V.NVLSEMTSL.SRMGQL.T1733 ......................................................................2408 ......................................I...............................601G ......L..............ST.TNP....AV...........KS.RQ.L.S.VSDL.DV.VD...T.R601SI ......................................I...............................916 ....T........G.......SANTNC.....V.D..LS..SAVAS.DG.VGVL.QK..DLESD..GVVS918 .D..TQ.......G.........N.NP...AQLR..VSA..SANASINE.V.NVLSEMTSL.SRMEKL.T919 ......................................I...............................750505 ......................................I...............................OS161 ......................................I...............................R2 ......L..............ST.TNP....AV...........KS.RQ.L.S.VSDL.DV.VD...T.RT6 ......................................I...............................GuangxiR1 ........................M...........................G.................RAM-1 .D..TQQ......G.......S....P....H.R...SA..SASVS.SE.VNTALSKLAGL.VA.DN.AASomerville 4 .D..TQQ......G.......S...NP....Q.R...SA..SANAS.SE.VNTALSRLTDL..A.GN.ATNLI12 96M .E..TQ.......G.......SA.T.T...AQ.RS..SA..S.NA..SETVNGALSQLVVL.SR.DNLAANLI02 88M .E..TQ.......G.......SAIT.T...AQ.RN..SA..S..AS.SETVNGALSQLVLL.SR.DNLAANLA13 96T .E..TQ.......G.......SA.T.T...AQ.RS..SA..S.NA..SETVNGALSQLVVL.SR.DNLAAGEL13b98M .E..T.L......G.......S.S..S...I.L....SAI.KMCTTVND.LGHLTSS..E...RID.LAEGEL13a98M ....T.L......G.......ST.T.C...AA.N.K.IK.DSAV.S.TD..GIL.QK.LTLESE.RNTASGEL12 98M ......L................NTNP....SV.....S......S..Q.V.SM.A.I.D.F.D...T.RGEL06 97M ......L.................TNP....SV.....S......S..Q.V.GM.AAI.D...D...T.RGEL05 97M .E..TQ.......G.......SA.T.T...AQ.RS..SA..S.NA..SETVNGALSQLVVL.SR.DNLAAGEL03 97T .E..TQ.......G.......SA.T.T...AQ.RS..SA..S.NA..GETVNGALSQLVVL.SR.DNLAAGEL01 96T .E..TQ.......G.......SA.T.T...AQ.RN..SA..SFNAS.SETVNGALSQLVAF.SR.DNLAAGEI09 97M ......L................NTNP....SV.....S......S..Q.V.SMAA...D...D...T.RGEI10 97M .D..TQQ......G.......S...NP....Q.R...SA..SANAS.SE.VNAVLSKLADL.VA.NN.AV

80 90 100 110 120 130 140....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

S1133wt TLDDVTANLDGLRTTVTALQDSVSILSTNVTDLTNTSSAHAATLSSLQTTVDGNSTAISNLKSDVSSNGLFC ......................................................................176 ......................................................................P100 ...................................R......I.....A...............I.....S1133B ...................................R......I.....................I.....S1133G ...................................R......I.....................I.....S1133S ..........................P........R......I.....................I.....138 A..........M.V.I.T......T...T.........V.SEA....R.I......T.D...........1017-1 SVTGIN.E.NSVAINMQE.RV.LNSI.DTL.S.SANVDD..SS..D.RQS..TL..DVA.......TQ..1733 I.....................................................................2408 I.....................................................................601G A...AI.T.K..N...A...N..AS..ST.NG..DI....SEA..F.R..I...TV...K..G...T...601SI I.....................................................................916 S.GQANST.TE.SKELRQ.SS..DN.M.SLS..ST.V.GNQ.AIAGI..S.HA.T.D......S..AIS.918 SVTGIN.E.NSVAINIQEFRV.LNSI.DTL.S.SANVDD..SS..D.RQS..TL..DVA.......TQ..919 I.....................................................................750505 I.....................................................................OS161 I.....................................................................R2 A...AI.T.K..N...A...N..AS..ST.NG..DI....SEA..F.R..I...TV......G...T...T6 I.....................................................................GuangxiR1 I.....................................................................RAM-1 SVAETKVE.NS.VSD.Q..RT.LDSS.SELAS.SLLVRN..SSI.D..KEGHAL.GE.D..N.S...Q..Somerville 4 SVAEMKVE.NS.ISD.Q..RT.LDSS.SELAS.SLLVHD.DSSI.D..KESHAL.GD.T..N.S..AQ..NLI12 96M .VA.GQLE.RS.T.D.KNIRSLLDDI..T.AS.SASVHE.DSSI.D.AHQFGLLT.DTA...T..ATQS.NLI02 88M .VA.GQLE.RA.T.D.KNIRSLLDDI..T.AS.SASVRE.DSSITD.ARQIGLLT.DTA...T..AAQS.NLA13 96T .VA.GQLE.RS.T.D.KNIRSLLDDI..T.AS.SASVHE.DSSI.D.ARQFGLLT.DTA...T..ATQS.GEL13b98M .VRNTVTD.NNVQIR.....S.FDS..S...T.SSSV.NQESQ.ATVS.S.NAL..NV...Q.....TA.GEL13a98M SVGQI.SSVAE.SDKLHQ.SV.LTDVV.S.SGISG.LTE.GNLI.A..VS.QN.T.DVD....S..TL..GEL12 98M A.....VT.KS.S.SI....N.ITT..AT.AE..D.....SG.........S...S..AS......A.S.GEL06 97M A.....VT.SN.S.SIA...N..TT..AT.DE........SGA........S...S...S......A.S.GEL05 97M .VA.GQLE.RS.T.D.KNIRSLLDDI..T.AS.SASVHE.DSSI.D.ARQFGLLT.DTA...T..ATQS.GEL03 97T .VA.GQLE.RS.T.D.KNIRSLLDDI..T.AS.SASVHE.DSSI.D.ARQFGLLT.DTA...T..ATQS.GEL01 96T .VA.GQLE.RS.T.D.GSIRSLLDDI..I.AS.SVSVRE.DSSI.D.VRQFGLLT.DTA...T..AAQS.GEI09 97M A.....VT.KS.S.SI....N..TT..AT.AE..D.....SG.........S...N..AS......A.S.GEI10 97M SVAETRVE.NSVASD.QG..T.LDSSISELASISSLVHD.SSSI.G..RDSGAL.SEVG....S...Q..

104

4.1.7 Análise da hidrofobicidade da região N-terminal de σC

As regiões N-terminais das proteínas σC de S1133wt e P100 foram submetidas

à análise de hidrofobicidade com a ferramenta ProtScale (Gasteiger et al., 2003;

Gasteiger et al., 2005) no servidor do ExPASy, utilizando os parâmetros definidos por

Kyte & Doolittle (1982). Verificamos nesta análise uma maior variação entre as

seqüências de S1133wt e P100 na região das substituições T106R, T113I e T119A.

Quando analisamos individualmente essas mutações ficou demonstrado que esta

maior variação se deveu às mutações das posições 106 onde, com a substituição de

treonina para arginina houve um aumento de contribuição hidrofílica, e na

substituição da posição 113, onde ocorreu justamente o inverso com um ganho de

hidrofobicidade devido a mudança de treonina para uma isoleucina (Figura 28)

A

-2,2

-1,7

-1,2

-0,7

-0,2

0,3

0,8

1,3

1,8

2,3

5 15 25 35 45 55 65 75 85 95 105 115 125 135 145

Aminoácido

Hid

rofo

bici

dade

Figura 28. Gráfico de hidrofobicidade da região N-terminal de σC.

___ S1133wt e ---P100

105

4.1.8 Modelagem por homologia da proteína µB

A fim de obter um melhor entendimento das mudanças ocorridas na seqüência

da proteína µB de P100, construímos um modelo da estrutura da proteína µB, usando

como base a estrutura resolvida por cristalografia de raios-X para a proteína mu1 da

amostra de reovírus de mamíferos T1L (Liemann et al., 2002). Utilizamos o programa

Swiss-PdbViewer (www.expasy.org/spdbv/ - Guex & Peitsch, 1997) para fazer o

alinhamento estrutural da seqüência de µB e do arquivo EXpdb 1jmuB (Figura 29).

Figura 29. Alinhamento estrutural de µB versus µ1. Asterístico: resíduos

conservados; pontos: aminoácidos com características semelhantes.

106

O alinhamento de µB e 1jmuB foi submetido ao servidor do Swiss-Model,

sendo então gerado um modelo baseado nas coordenadas atômicas do modelo de µ1.

As principais alterações na seqüência de aminoácidos da proteína µB da amostra

P100: T325I (verde), Q388K (azul), T390A (roxo), N482D (vermelho) e T616I

(amarelo) foram destacadas no programa RasMol (www.rasmol.org), sendo o modelo

observado por dois ângulos diferentes (Figuras 30A e 30B).

(A)

107

Figuras 30A e 30B. Modelo 3-D da Proteína µB de P100. Substituições T325I

(verde), Q388K (azul), T390A (roxo), N482D (vermelho) e T616I (amarelo).

(B)

108

4.2 Expressão de p17 em sistema heterólogo

4.2.1 Amplificação e clonagem da ORF2 do segmento S1 de S1133wt

A eletroforese em gel de agarose de uma alíquota da amplificação da ORF2 do

segmento S1 mostrou uma única banda com tamanho compatível com 441bp, o que

corresponde a amplificação completa da região codificante para a proteína p17.

Portanto, o restante da reação, ainda no tubo de PCR foi purificado e utilizado para a

clonagem no vetor pCR T7 / NT-TOPO.

A transformação das células TOP10F´ foi confirmada pelo crescimento em meio

seletivo com ampicilina, sendo a correta orientação do incerto confirmada por PCR.

Quatro das cinco colônias analisadas foram amplificadas por PCR com os iniciadores

T7 forward e P17AS, como descrito em material e métodos, produzindo uma banda

com tamanho compatível aos 626bp esperados.

4.2.2 Seqüenciamento do plasmídeo TOPO-p17

Escolhemos a colônia cujo PCR apresentou a banda mais intensa para

seqüênciar. Para isso a colônia foi crescida em meio LB líquido, sendo posteriormente

realizada uma miniprep. O DNA purificado foi utilizado como molde para a reação de

seqüenciamento. Utilizando os iniciadores T7 forward e T7 reverse, comprovamos a

correta construção do plasmídeo TOPO-p17 (Figura 31).

109

Figura 31. Seqüenciamento do plasmídeo TOPO-p17. Em caixa alta a seqüência da ORF-p17.

O sublinhado pontilhado indica seqüência deduzida da cauda fusionada de histidina e em

sublinhado contínuo a seqüência deduzida de p17.

4.2.3 Comprovação da expressão de His-p17 por SDS-PAGE e western-blotting

Através da análise de géis de SDS-PAGE verificamos que a proteína His-p17

não podia ser observada junto as proteínas encontradas na fração solúvel, pelo

contrário a proteína p17 estava sendo encontrada em corpos de inclusão. Após o

tratamento dos corpos de inclusão com tampão de lise e ciclos de congelamento e

descongelamento, foi possível observar a proteína His-p17 como uma banda de

aproximadamente 22kDa nos géis de SDS-PAGE (Figura 32).

10 20 30 40 50 60 70 80 90....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

TOPO-p17 atgcggggttctcatcatcatcatcatcatggtatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgggatctgtacgacgatgacgatHIS-p17 MetArgGlySerHisHisHisHisHisHisGlyMetAlaSerMetThrGlyGlyGlnGlnMetGlyArgAspLeuTyrAspAspAspAsp

100 110 120 130 140 150 160 170 180....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

TOPO-p17 aaggatccaacccttATGCAATGGCTCCGCCATACGACGTTTGAAGTGCAACGATTTAATTTCTGTCCGCTATCACTTCGCGAACTTGCTHIS-p17 LysAspProThrLeuMetGlnTrpLeuArgHisThrThrPheGluValGlnArgPheAsnPheCysProLeuSerLeuArgGluLeuAla

190 200 210 220 230 240 250 260 270....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

TOPO-p17 ATCCCATCATTTACTGCTATAACTGGGGCTGACCCATCACAGTATTTTAACATTGAGCTCCCACACACTCATCCTCTCTATTCCAAATTGHIS-p17 IleProSerPheThrAlaIleThrGlyAlaAspProSerGlnTyrPheAsnIleGluLeuProHisThrHisProLeuTyrSerLysLeu

280 290 300 310 320 330 340 350 360....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

TOPO-p17 CCTACTCTGTTATCTCAACCTTGTAGGGTCCACGTGCGGCTGATTCGCCGGTTCGCTCTCTATTCAACATTGTCAAGTATTTGTGAGTACHIS-p17 ProThrLeuLeuSerGlnProCysArgValHisValArgLeuIleArgArgPheAlaLeuTyrSerThrLeuSerSerIleCysGluTyr

370 380 390 400 410 420 430 440 450....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

TOPO-p17 GATTGTGCTCTACTATTCTCCCCACACGCTATCGTTCCATTGCCTGCATCCGATCGGCGGTCTTGTCTTATAGTTCATTGGGATGGCGGGHIS-p17 AspCysAlaLeuLeuPheSerProHisAlaIleValProLeuProAlaSerAspArgArgSerCysLeuIleValHisTrpAspGlyGly

460 470 480 490 500 510 520 530 540....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

TOPO-p17 TCTCAATCCATCGCAGCGAAGAGAGGTCGTCAGCTTGATACTGTCATTGACTTCGAACGTGACTATAAGTCATGGCGATTTGACGCCGATHIS-p17 SerGlnSerIleAlaAlaLysArgGlyArgGlnLeuAspThrValIleAspPheGluArgAspTyrLysSerTrpArgPheAspAlaAsp

....|.

TOPO-p17 CTATGAHIS-p17 Leu

110

Figura 32. SDS-PAGE proteína His-p17. Linhas: (1) 0,5mM; (2) 0,75mM e (3)

1mM de IPTG com 2 horas de indução. (4) 0,5mM; (5) 0,75mM e (6) 1mM de IPTG

com 4 horas de indução. (7) Padrão de peso molecular Benchmark (Invitrogen -

10748-010).

A confirmação de que a banda observada nos géis de SDS-PAGE era His-p17

foi obtida através de uma reação de western-blotting, frente a uma preparação

monoclonal de anticorpos anti-His. Foi observado o aparecimento de uma única banda

de aproximadamente 22kDa nas alíquotas testadas (Figura 33).

Figura 33. Western-blotting proteína His-p17. Linhas: (1) Padrão de peso

molecular Benchmark (Invitrogen); (2) 0,5mM; (3) 0,75mM e (4) 1mM de IPTG com

4 horas de indução.

1 2 3 4 5 6 7

His-p17

1 2 3 4

His-p17

111

5. Discussão

A patogenia das infecções virais sempre foi um dos principais alvos de estudos

da virologia. Os mecanismos envolvidos nesse processo estão diretamente ligados a

capacidade de defesa do hospedeiro e ao potencial de virulência imposto por um

agente viral (Tyler & Nathanson, 2001).

No presente estudo seqüenciamos cinco dos dez segmentos genômicos de duas

amostras de reovírus aviários: S1133wt, uma amostra patogênica isolada

originalmente de galinhas com quadros de artrite/tenosinovite (van der Heide &

Kalbac, 1975) e P100, uma vacina derivada da amostra S1133wt obtida através de

sucessivas passagens em ovos embrionados, seguida de passagens em cultura de

células primárias de embrião de galinha mantidas à 32ºC e depois novas passagens a

37ºC (van der Heide, Kalbac & Brustolon, 1983).

O histórico de passagens associado ao desenvolvimento de uma amostra vacinal

fez com que surgisse uma amostra temperatura sensível (ts). P100 apresenta baixa

capacidade replicativa quando do curso de uma infecção na temperatura fisiológica do

hospedeiro (41ºC) (Gouvea & Schnitzer, 1982; Gouvea, et al., 1983), sendo assim

acredita-se que somente em regiões de menor temperatura corporal, juntas

tibiotársicas por exemplo, poderiam servir como locais para propagação da amostra

P100 (Gouvea, et al., 1983).

Os segmentos genômicos da classe M e o segmento S1 já foram associados à

patogênese em diversos estudos, tanto da patogênese experimental com amostras de

reovírus oriundas de mamíferos, quanto em estudos envolvendo amostras de reovírus

aviários (Huang et al., 1987b; Hazelton & Coombs, 1995; Tyler et al., 1996; O'Hara,

et al., 2001; Derrien, Hooper & Fields, 2003; Forrest & Dermody, 2003).

112

Estávamos estudando estratégias para o seqüenciamento dos segmentos

genômicos da classe M, cujas seqüências até então eram desconhecidas, quando dois

grupos que também vislumbraram a importância de se conhecer melhor a informação

contida nesses segmentos genômicos depositaram no GenBank as primeiras

seqüências no início do ano de 2005 (Noad et al., 2006; Su et al., 2006). O fato de não

sermos mais os primeiros a publicar uma seqüência dos segmentos da classe M a

principio foi desencorajador, por outro lado reforçava a idéia de que havia

importância em se conhecer as peculiaridades dessa classe de segmentos do genoma

viral, principalmente caracterizando as diferenças encontradas no modelo de

atenuação viral estudado nesta tese. Uma vez que já existiam seqüências de outras

amostras de reovírus aviários, utilizamos esta informação para, através do

alinhamento dessas seqüências, verificar a presença de regiões conservadas além das

regiões não codificantes 5´e 3´e assim desenhar os iniciadores que foram utilizados

para a obtenção das seqüências, tal como descrito em material e métodos.

De posse das seqüências dos segmentos da classe M, S1 e S2 foi feita à

comparação das seqüências das amostras desse estudo, S1133wt e P100. A alta

similaridade entre todas as comparações das seqüências de nucleotídeos demonstra

que apesar do intenso histórico de passagens ao qual foi submetida a amostra S1133wt

para a obtenção da vacina P100, 235 vezes em ovos embrionados e 100 vezes em

cultura de células com passagens em baixa temperatura, o genoma permaneceu pouco

alterado. O máximo de divergência encontrado foi pouco mais de 1% para o segmento

M2 e o mínimo de divergência, pouco mais de 0,5%, foi encontrado quando

comparados os segmentos S2. Em um estudo anterior já haviam sido demonstradas

diferenças entre os segmentos M1, M2 e S1, quando comparadas as amostras

S1133wt e P100 (Naveca, 2002).

113

A baixa divergência encontrada nas seqüências analisadas demonstra que, pelo

menos em relação aos segmentos M1, M2, M3, S1 e S2, foram poucas as mutações

que contribuíram para o aparecimento do fenótipo não patogênico de P100. Quando

são comparadas as seqüências de proteínas codificadas por esses segmentos

genômicos, fica ainda mais restrito o número de diferenças que chamam a atenção em

função de uma mudança de caráter físico-químico do resíduo de aminoácido

substituinte. A seqüência de aminoácidos é a principal força que define o

enovelamento e a conformação tridimensional das proteínas (Mitraki & King, 1992;

Aramli & Teschke, 1999) sendo, portanto um dos principais parâmetros para

comparação de proteínas mutantes.

As principais alterações nas seqüências preditas de proteínas foram observadas

em µB e σC, codificadas pelos segmentos genômicos: M2 e S1. De uma maneira

interessante esses dois segmentos foram relacionados à patogênese experimental de

amostras de reovírus de mamíferos (Hazelton & Coombs, 1995; Tyler et al., 1996;

O'Hara, et al., 2001; Forrest & Dermody, 2003) e também de amostras aviárias

(Huang et al., 1987b; Shih et al., 2004). Mutantes ts de amostras de reovírus aviários

foram associados ao segmento M2, em alguns casos, com uma única alteração de

aminoácido da seqüência da proteína µB predita (Xu et al., 2005).

As duas únicas alterações encontradas quando comparadas as seqüências das

proteínas µA das amostras S1133wt e P100 foram para aminoácidos que

compartilham das mesmas características: na alteração L445F as características de

hidrofobicidade e de neutralidade foram preservadas, contudo houve uma troca no que

tange ao tipo de cadeia lateral com a substituição de uma cadeia alifática, da

isoleucina por um grupamento aromático presente da fenilalanina. Já a segunda

alteração na seqüência de µA foi ainda mais conservadora, uma vez que a substituição

114

I665V, manteve as propriedades hidrofóbicas, de neutralidade e alifáticas (Stryer,

1996).

Para a proteína µNS também foram observadas apenas duas substituições na

seqüência de aminoácidos. A primeira V58I foi novamente uma substituição em que

foram mantidas as propriedades dos aminoácidos, tal como descrito anteriormente

para a mutação I665V na seqüência de µA. A segunda modificação na seqüência de

µNS foi a substituição de uma valina por uma alanina na posição 157, onde

novamente foram mantidas as características principais de neutralidade, cadeia

alifática e hidrofobicidade, sendo que nesta última houve uma diminuição por conta

do menor índice hidrofóbico da alanina de acordo com o trabalho de Kyte & Doolittle

(1982).

Na comparação das seqüências para proteína σA das amostras S1133wt e P100,

verificamos novamente duas alterações entre os 416 aminoácidos. A alteração S81G

mantêm algumas características entre os aminoácidos, tais como neutralidade e

características hidrofílicas. Um fator importante, e que exatamente por esse motivo

não acarretaria mudanças mais drásticas, refere-se a uma característica intrínseca da

glicina: é o único aminoácido que não apresenta cadeia lateral, essa peculiaridade

permite que a glicina apresente as maiores possibilidades de rotação ao longo das

ligações C-C e C-N na cadeia polipeptídica, o que pode levá-la a assumir a posição de

outros aminoácidos, sem, na maioria das vezes, acarretar importantes mudanças

conformacionais (Varfolomeev, Uporov & Fedorov, 2002). A mudança de valina para

alanina na posição 301 foi comentada anteriormente para a proteína µNS na posição

157 e a princípio não deve acarretar mudanças significativas.

Em função do descrito anteriormente para as proteínas µA, µNS e σA, especial

atenção foi dada para as alterações encontradas na comparação das seqüências dos

115

segmentos M2 e S1, mais precisamente para as seqüências deduzidas das proteínas

µB e σC.

O segmento M2 foi aquele em que foram encontrados o maior número de

mutações na seqüência de nucleotídeos, das 23, dez foram responsáveis por alterações

nas seqüências de aminoácidos da proteína µB. Entre essas dez substituições de

resíduos, cinco despertaram um maior interesse. A substituição de uma treonina por

uma isoleucina na posição 325, a substituição de uma glutamina por uma lisina na

posição 388, a substituição de treonina por uma alanina na posição 390, a substituição

de uma asparagina por um ácido aspártico na posição 482 e a substituição de uma

treonina por uma isoleucina na posição 616.

Na substituição T325I a principal mudança ocorrida foi relacionada a

hidropaticidade, uma vez que houve a substituição de um resíduo hidrofílico

(treonina) por um altamente hidrofóbico, no caso uma isoleucina. Na substituição

Q388K foi mantido o caráter hidrofílico do resíduo, porém foi observada uma

importante alteração com respeito à carga do aminoácido: a glutamina é um

aminoácido neutro em pH 6-7, enquanto que a lisina em um mesmo ambiente pode

adquirir carga negativa (Stryer, 1996).

Na posição T390A houve uma alteração novamente relacionada a

hidropaticidade: a substituição de um aminoácido pouco hidrofílico no caso a treonina

por um aminoácido com características hidrofóbicas, a alanina. Na substituição

N482D houve outra mudança relacionada à carga do aminoácido na seqüência de

P100: foi observada uma alteração entre um resíduo hidrofílico e neutro, uma

asparagina, por um também hidrofílico, porém que pode apresentar carga positiva, no

caso um ácido aspártico. Por fim, na seqüência de µB de P100 foi observada uma

substituição T616I, a mesma observada na posição 325 onde a diferença principal

116

mais uma vez fica relacionada a alteração de um aminoácido hidrofílico por um

hidrofóbico (Stryer, 1996).

Quando pensamos nas alterações encontradas na seqüência da proteína µB de

P100 em relação ao encontrado na seqüência de S1133wt, verificamos que uma

melhor compreensão do significado dessas mudanças seria obtida através da

comparação dessas diferenças em nível estrutural. Para alcançar este objetivo

construímos um modelo tridimensional da proteína µB de P100, usando como base a

estrutura resolvida de µ1, proteína análoga de µB nos reovírus de mamíferos que teve

sua estrutura resolvida por cristalografia de raios-X (Liemann et al., 2002).

Utilizando o recurso da modelagem comparativa, fizemos um alinhamento

estrutural das duas seqüências que foi enviado ao servidor do Swiss-Model no

Instituto Suíço de Bioinformática, o qual retornou um modelo com as prováveis

posições das cadeias laterais dos aminoácidos da seqüência de µB de P100. Esse

modelo compreende os resíduos 68 ao 676, portanto todas as mudanças observadas na

seqüência de P100.

No modelo criado foi possível observar que as alterações T325I (verde nas

Figuras 30A e 30B) e T616I (amarelo nas Figuras 30A e 30B) estão situadas em um

mesmo plano voltado para o interior da estrutura quando esta é posicionada próximo

ao observado no homotrímero de µB (Figura 30A), forma como é encontrada a

proteína µB no vírion (Liemann et al., 2002). Outras observações, talvez até mais

importantes, são verificadas nas posições ocupadas pelos resíduos Lys388, Ala390 e

Asp482 no modelo (azul, roxo e vermelho, respectivamente). Todas estão localizadas

no domínio IV da proteína µB. Essa região predominantemente em folhas-beta

interage com a proteína σB e provavelmente é responsável também pela interação

com estruturas de superfície na célula hospedeira (Liemann et al., 2002).

117

O modelo ainda ressalta a possibilidade da formação de uma ponte salina devido

à proximidade dos resíduos de lisina e acido aspártico, fato que não poderia ser

previsto sem a utilização de um modelo como este, lembrando que na seqüência da

amostra virulenta S1133wt não existe este tipo de interação, pelo menos não nesta

posição. Ainda deve ser levado em consideração que tipo de alterações uma mudança

como esta observada na proteína µB de P100 pode estar causando na estrutura

trimérica, ou mesmo no complexo heterohexamérico (µB3σB3) formado pelo trímero

de µB com o trímero de σB (Liemann et al., 2002).

No modelo proposto para penetração de membranas celulares durante a infecção

pelos reovírus são necessárias mudanças conformacionais no trímero de µ1 (Liemann

et al., 2002). As substituições encontradas na seqüência da proteína µB podem estar

relacionadas a uma maior estabilidade do trímero de µB, ou mesmo da estrutura

formada por µB3σB3, algo que poderia contribuir negativamente para atingir as

alterações conformacionais necessárias para a penetração da membrana plasmática.

Uma vez que uma amostra viral se encontra no interior de um hospedeiro

susceptível, partes deste vírion que asseguram a resistência ao ambiente deixam de ser

necessárias e muitas vezes são removidas, para dar prosseguimento à patogênese.

Como exemplo a clivagem proteolítica de estruturas do capsídeo, que ao invés de

atenuar uma amostra viral contribuem muitas vezes para um aumento da

infecciosidade (Tyler & Nathanson, 2001).

As mudanças observadas na proteína µB podem ter relação com este fato uma

vez que existem interações importantes entre µB e a proteína do capsídeo externo σB,

a qual é removida pela ação de proteases, ou no meio extracelular ou no interior dos

endossomos, dando origem as ISVPs (Nibert & Schiff, 2001; Olland et al., 2001). A

maior estabilidade da proteína σB de P100 quando comparada com S1133wt já foi

118

descrita (Gouvea et al., 1983), e pode estar associada às interações com µB. A certeza

quanto a essas observações poderá ser obtida com a determinação da seqüência de

σB.

As mutações na seqüência do segmento S1 em P100 foram responsáveis por

sete mudanças de aminoácidos nas três proteínas codificadas por este segmento. As

duas primeiras mudanças observadas aparentemente não têm contribuição para o

caráter avirulento de P100. A substituição V68I na seqüência da proteína p10, produto

da primeira das três ORFs parcialmente sobrepostas e em diferentes fases de leitura,

não reflete uma possível mudança na proteína p10, uma vez que foram mantidas as

principais características do resíduo substituído: ambos são resíduos hidrofóbicos,

neutros e alifáticos (Stryer, 1996). A segunda substituição, observada na seqüência da

proteína p17 também mantém as mesmas características bioquímicas, uma vez que foi

observada uma alteração D136E, onde ambos os resíduos apresentam características

de hidrofilicidade e principalmente ambos podem ser carregados positivamente,

mantendo a proteína com as mesmas características.

As outras cinco mudanças de aminoácidos foram encontradas na proteína-

espícula σC, mais precisamente na região N-terminal entre os resíduos 24 e 135. A

princípio as mudanças mais significativas ficam por conta das alterações T106R,

T113I e T119A, uma vez que na posição 24 a substituição de uma treonina por uma

asparagina mantém as características hidrofílicas e de neutralidade. O mesmo é

observado na posição 135 onde a substituição de uma valina por uma isoleucina

mantém todas as características de hidrofobicidade, neutralidade e de cadeia alifática

(Stryer, 1996).

Por outro lado, as substituições de uma treonina por uma arginina na posição

106, de uma treonina por uma isoleucina na posição 113 e de uma treonina por uma

119

alanina na posição 119 alteram as características da proteína. A substituição T106R é

talvez a mais importante observada nesse contexto, pois a arginina é o aminoácido de

maior hidrofilicidade e maior cadeia lateral, podendo ainda assumir carga negativa

(Stryer, 1996). Todas essas alterações relacionadas ao caráter bioquímico da arginina

na posição 106 já são por si só relevantes, mas tornam-se ainda mais importantes no

contexto onde esta mutação está localizada. A região aproximadamente entre os

aminoácidos 50 e 150 é predita de ser uma superestrutura em coiled-coil (Bassel-

Duby et al., 1985; Chappell et al., 2002; Calvo et al., 2005), um homotrímero

formado pela proteína σC nas amostras aviárias e pela proteína σ1 nas amostras de

reovírus de mamíferos (Strong et al., 1991).

Estruturas em coiled-coil são formadas por duas ou mais alfa-hélices anfipáticas

que se entrelaçam e são mantidas, principalmente, através de interações hidrofóbicas.

Esses motivos ocorrem em um grande número de proteínas, incluindo proteínas

estruturais, proteínas motoras, fatores de transcrição e proteínas de fusão de

membrana, tais como a hemaglutinina do vírus da influenza e as proteínas do

envelope do vírus da leucemia murina e o HIV-1. Em todos esses casos acredita-se

que a região em coiled-coil seja responsável pela conexão de proteínas e

macromoléculas como, por exemplo, os microtúbulos (Newman, Wolf & Kim, 2000;

Rose et al., 2005).

Nas estruturas em alfa-hélice resíduos carregados dispostos a uma distância de

quatro aminoácidos (i - i+4) estão em ótimo contexto para interação iônica (Beck et

al., 1997). Isto é observado na seqüência da proteína σC de P100, onde a mutação

para arginina na posição 106 cria um ambiente para interação iônica devido à

presença de um acido aspártico na posição 102, portanto uma carga positiva que

provocaria uma atração com a carga negativa da arginina, além da presença de outra

120

carga negativa também a quatro posições da Arg106, His110 com a qual haveria uma

repulsão de cargas.

Além da possibilidade desta ligação intracadeia, também existe a possibilidade

desta mudança afetar a estabilidade e/ou flexibilidade do trímero como um todo. Esse

tipo de alteração foi observado no trabalho de Beck et al., (1997), onde uma única

mudança de aminoácido alterava o estado de oligomerização de um domínio em

coiled-coil. É importante ressaltar que esta região em coiled-coil é responsável pela

trimerização eficiente, estabilidade do oligômero e incorporação da espícula na

partícula viral no modelo de reovírus de mamíferos (Leone et al., 1991; Leone, Mah

& Lee, 1991); além disso, a trimerização da proteína σ1 induz mudanças

conformacionais necessárias para uma eficiente ligação ao receptor celular (Leone,

Duncan & Lee, 1991).

A estrutura viral evolui de maneira a permitir que determinada amostra viral

possa superar os obstáculos impostos pelo hospedeiro em determinados estágios da

patogênese (Tyler & Nathanson, 2001). As mudanças observadas na seqüência

N-teminal da proteína σC de P100 parecem ir contra esta afirmação. Especulamos a

possibilidade das mudanças observadas nas posições 106, 113 e 119 contribuírem em

um sentido oposto, dificultando a formação do trímero de σC, ou mesmo contribuindo

para uma maior estabilidade que impedisse o papel previsto pra essa região, a qual é

predita de desempenhar papel estrutural na projeção da região C-terminal para além

do vírion durante as etapas iniciais da infecção (Calvo et al., 2005). Dessa forma uma

alteração nesta posição que comprometesse a funcionalidade da estrutura certamente

seria prejudicial ao vírus.

As outras mudanças T113I e T119A convergem para um aumento de

hidrofobicidade nesta região da proteína. Cabe ainda ressaltar que as alterações

121

T106R, T113I e V135I só foram observadas em outras seqüências da proteína σC de

amostras vacinais também oriundas de S1133wt, enquanto que a alteração T119A só é

observada na seqüência de σC da amostra P100.

Infelizmente não foi possível a criação de um modelo tridimensional para esta

região da proteína σC, uma vez que as seqüências que apresentam homologia e para

as quais existem estruturas, até mesmo de reovírus aviário, não contemplam a região

N-terminal de σC. Somente a estrutura da região C-terminal, onde não encontramos

diferenças, foi determinada até o momento (Calvo et al., 2005).

Um modelo bastante parecido ao que encontramos em P100, isto é onde

mutações em mais de segmento genômico contribuem para o fenótipo ts e para a

atenuação viral, foi proposto para produção de vacinas eficazes e seguras para outros

gêneros da família reoviridae, tais como Rotavirus e Orbivirus (Roner et al., 1997).

A análise filogenética das proteínas µA, µB, µNS, p10, p17, σC e σA das

amostras S1133wt e P100 frente a outras seqüências de reovírus aviários depositadas

no GenBank demonstrou que as proteínas µA, p10 e σA estão entre as mais

conservadas nesse estudo. A variação entre a maior e a menor identidade observada

frente a S1133wt ou P100 para essas proteínas ficou entre 100 e 97,2% para µA, 100 e

95,8% para p10 e 100 e 97,3% para σA. Também para essas proteínas foi observado o

maior número de regiões conservadas: 17 para µA e 11 para σA. Na análise da

proteína p10 foi observada uma única região conservada, porém p10 é uma proteína

relativamente pequena (98 aminoácidos) se comparada com as outras duas, µA possui

732 aminoácidos e σA 416. A região conservada em p10 corresponde a

aproximadamente 40% do tamanho da proteína.

Para a proteína p17 encontramos um resultado peculiar, enquanto que em um

dos ramos da árvore filogenética encontramos 13 seqüências variando em menos de

122

1%, no outro ramo estavam agrupadas seqüências com até 20,6% de divergência em

relação ao primeiro grupo, onde estavam as amostra S1133wt e P100.

O maior número de diferenças foi encontrado na comparação das seqüências das

proteínas µB, µNS e σC, cujas identidades em relação às amostras S1133wt ou P100

variaram entre 99,3 e 83,6%, 99,8 e 89,4% e 100 e 28%, respectivamente. A procura

por regiões conservadas também refletiu esta variação. Foram encontradas seis

regiões conservadas em µB e sete em µNS, um número inferior aquele observado, por

exemplo, para µA e σA, e nenhuma em σC, mesmo quando utilizadas somente as 17

amostras analisadas para µB e µNS.

Outro dado importante retirado da análise filogenética foi que em todas as

árvores, com exceção de µA e σA, a amostra P100 sempre esteve agrupada com

outras amostras vacinais: com S1133B nas árvores de µB, µNS, p10 e p17 e com

S1133S, S1133B e S1133G na árvore de σC. Ao mesmo tempo a amostra S1133wt

foi encontrada agrupada com outras amostras patogênicas nas árvores das proteínas

µNS, p10, p17, σC e σA.

A segunda parte desta tese foi a expressão da proteína p17 em um sistema

heterólogo. Foi escolhida a expressão em Escherichia Coli, um sistema bastante

estudado, o qual não deveria apresentar dificuldades. O primeiro passo nesse sentido

foi a escolha do vetor a ser utilizado para a clonagem e expressão da segunda ORF do

segmento genômico S1, a qual codifica para a proteína p17 (Bodelón et al., 2001).

Decidimos utilizar um vetor que pudesse ser utilizado tanto para clonagem

quanto para expressão, evitando assim a necessidade de uma etapa de subclonagem.

Foi utilizado o kit pCR T7 / NT-TOPO da Invitrogen, o qual permite a utilização do

mesmo vetor nas etapas de clonagem e expressão, além do vetor se utilizar de uma

característica encontrada nos amplicons gerados pela enzima Taq polimerase, qual

123

seja a adição de uma base de adenina na extremidade 3´ da fita de DNA (Brownstein,

Carpten & Smith, 1996). Essa característica permite que o amplicon gerado com Taq

polimerase seja diretamente utilizado para clonagem em um vetor com uma base de

timidina a mais na fita 3´ (T/A cloning), sem que haja a necessidade da utilização de

enzimas de restrição (Zhou & Gomez-Sanchez, 2000). Esse tipo de estratégia permitiu

que fossem desenhados os iniciadores P17S e P17AS (Tabela 3), sem a inclusão de

sítios de restrição, observando apenas que os iniciadores deveriam flanquear a ORF-

p17 em correta fase de leitura com o vetor, mas com a colocação do códon de

terminação da ORF-p17 na extremidade 5´ do iniciador P17AS, afim de que a

proteína expressa nesse sistema tivesse apenas a cauda de histidina N-terminal (Terpe,

2003). A ligação do inserto no vetor foi realizada pela enzima topoisomerase I

(Shuman, 1994), ligada covalentemente nas extremidades do vetor (Wasden &

Goldberg, 2001).

Após a etapa de clonagem, as colônias crescidas na placas de ágar seletivo

foram analisadas quanto à presença e correta orientação do inserto em uma única

reação. A utilização de uma estratégia de PCR, utilizando os iniciadores T7 forward e

o iniciador P17AS, permitiu ter a certeza de quais colônias apresentavam o inserto em

correta orientação, uma vez que, na orientação invertida não haveria a amplificação

com esse par de iniciadores. De maneira a caracterizar completamente a construção

foi realizado o seqüenciamento do clone selecionado.

Esse clone foi seqüenciado com os iniciadores T7 forward e T7 reverse, o que

demonstrou que a construção era perfeita, com a correta inserção da ORF-p17 em fase

com o restante do vetor. Uma vez que o clone foi totalmente caracterizado, foi

iniciada a fase de expressão da proteína His-p17. Como dito anteriormente, não foi

necessária uma etapa de subclonagem, porém como a etapa de clonagem foi realizada

124

em células TOP10F’, se fez necessária a purificação da construção e transformação de

células capazes de promover a expressão da proteína His-P17.

As células TOP10F’, não possuem a enzima T7 RNA polimerase, portanto não

poderiam ser utilizadas para expressão uma vez que o vetor utilizado estava sob o

controle de um forte promotor viral T7 (Davanloo et al., 1984). Mesmo a expressão

basal da T7 RNA polimerase pode ser prejudicial nas etapas de caracterização da

construção, uma vez que se a proteína recombinante for tóxica para a célula, a

tendência é de que as células morram ou não mantenham essa construção estável,

prosseguindo para a cura (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989). Por esse motivo,

seguindo as recomendações do fabricante do kit as etapas iniciais, incluindo a

propagação, caracterização e estocagem do plasmídeo TOPO-p17 foram todas

realizadas em células TOP10F’.

Para a expressão da proteína p17 foram utilizadas células BL21(DE3)pLysS, as

quais carreiam o bacteriófago DE3 em lisogenia. Esse fago contém o gene lacI; o

gene da T7 RNA polimerase sob o controle de um promotor lacUV5 e uma pequena

porção do gene lacZ. Nesse sistema a expressão da T7 RNA polimerase é reprimida

até que haja a adição do indutor (IPTG) que se liga ao repressor codificado pelo gene

lacI, permitindo a expressão da T7 RNA polimerase o que, conseqüentemente, leva à

expressão da proteína sob o controle do promotor T7, no caso a proteína His-p17.

Verificamos que havia ocorrido a expressão da proteína His-p17 quando foram

solubilizados os precipitados das induções com IPTG, o fato de uma proteína

superexpressa não ser encontrada solúvel é bastante comum, uma vez que esse grande

acúmulo protéico forma estruturas bastante densas denominadas de corpos de inclusão

(Singh & Panda, 2005).

125

Nesta fase, como haviam sido previamente removidas as proteínas em solução,

a proteína His-p17 foi encontrada parcialmente purificada, com um tamanho

compatível com o previsto para a proteína fusionada, em torno de 22 kDa (Figura 32).

Através da técnica de western-blotting, utilizando anticorpos monoclonais anti-His

confirmamos que a proteína encontrada nos géis de SDS-PAGE era His-p17 (Figura

33).

Os experimentos com a expressão de proteínas virais recombinantes foram

iniciados no Laboratório de Virologia Molecular e Tropical (LVMT) em um estudo

anterior (Favacho et al., 2006), o qual contou com a valiosa colaboração da professora

Eleonora Kurtenbach do Instituto de Bioquímica Médica da UFRJ, durante algumas

etapas do seu desenvolvimento. Por outro lado, o estudo envolvendo a clonagem e

expressão da proteína His-p17, com exceção do seqüenciamento do clone, foi

totalmente realizado no LVMT, iniciando uma nova fase de experimentos realizados

no Departamento de Virologia do Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes.

Recentemente foram publicados dois estudos sobre a proteína p17, os quais

mostraram que esta proteína induz um retardo no crescimento de células transfectadas

(Liu et al., 2005) e que p17 possui uma seqüência sinal para localização nuclear

(Costas et al., 2005). As repercussões dessas descobertas no ciclo replicativo viral

ainda são incertas. Novos estudos com essa proteína têm o potencial de decifrar

mecanismos envolvidos na propagação de amostras de reovírus aviários e

possivelmente de outros agentes virais. Nesse contexto a obtenção da proteína p17

recombinante, será de grande valor em futuros trabalhos relacionados à determinação

de sua atividade biológica.

O crescente aumento de estruturas protéicas determinadas em alta resolução por

cristalografia de raios-X ou ressonância magnética nuclear reflete o potencial dessas

126

técnicas para o entendimento do enovelamento e conseqüentemente das funções

biológicas assumidas por cada proteína. Para se chegar a esse estágio é necessária a

obtenção da proteína em estudo em grande quantidade e com certa pureza. Por isso,

na maioria das vezes são utilizados sistemas de expressão heteróloga, tal qual o

utilizado nesta tese.

A utilização de uma tecnologia recombinante nos permite obter grande

quantidade da proteína His-p17, além da facilidade de purificação através da

cromatografia de afinidade por íons metálicos. Nossa idéia futura é justamente utilizar

a proteína p17 nesse tipo de ensaio e assim aumentar o conhecimento dessa proteína

por homologia estrutural de função.

127

6. Conclusões

No presente trabalho foram determinadas as seqüências de cinco segmentos

genômicos e a seqüência deduzida de sete proteínas de duas amostras de reovírus

aviários. Em pelo menos duas proteínas, µB e σC, foram encontradas diferenças

significativas entre as duas amostras.

Na proteína µB, cinco principais diferenças foram verificadas em função da

análise da estrutura primária. O posicionamento dos aminoácidos substituídos na

seqüência da amostra P100 foi determinado através da construção de um modelo

tridimensional baseado nas coordenadas atômicas da estrutura resolvida para a

proteína análoga das amostras de reovírus de mamíferos µ1.

Somente com a geração desse modelo foi possível verificar que as substituições

T325I e T616I encontram-se em um mesmo plano voltado para o interior do trímero

de µB. Essas alterações para aminoácidos hidrofóbicos podem estar contribuindo para

um aumento da estabilidade do complexo e, uma vez que foram localizadas apenas na

amostra vacinal, cujos títulos no hospedeiro são bastante reduzidos, podemos

especular que essas mudanças contribuem negativamente para uma eficiente

propagação da amostra viral. Outras três mudanças também observadas em µB estão

localizadas próximas entre si e em uma região importante para a penetração de

membranas celulares. Duas dessas mudanças Q388K e N482D fizeram surgir a

possibilidade de uma interação iônica o que corrobora para uma maior estabilidade

nesta região, e tal como descrito anteriormente pode estar impedindo as alterações

conformacionais no trímero de µB necessárias ao eficiente processo de infecção viral.

Também não deve ser descartado que estas alterações podem estar envolvidas na

128

interação com a proteína σB, responsável pela proteção do vírion e que necessita ser

removida nos eventos iniciais de interação com a célula hospedeira.

Em relação a proteína σC também foram encontradas cinco alterações de

aminoácidos em relação a amostra S1133wt. Três alterações (T106R, T113I e T119A)

ganharam mais destaque em função da complexidade das mudanças observadas. Em

especial a alteração T106R cria um ambiente favorável para a formação de uma ponte

salina com o resíduo de aspártico 102. Este tipo de interação só é possível nas

amostras vacinais derivadas de S1133wt cujas seqüências também foram analisadas

nesse estudo. Em todas as outras 31 seqüências não existe a possibilidade de uma

interação como esta, pelo menos na mesma posição. Da mesma maneira que para a

proteína µB este tipo de interação entre os aminoácidos nos leva a acreditar que

novamente estejam sendo criadas contribuições negativas ao processo infeccioso

viral. Nesse caso afetando uma eficiente trimerização da espícula viral responsável

pelo primeiro contato com os receptores celulares.

A obtenção de um clone expressando a proteína His-p17 foi alcançada com

sucesso. Esse clone foi caracterizado por seqüenciamento e provou ser funcional nos

experimentos de expressão realizados nesta tese. O próximo passo nesse sentido será a

produção em maior escala da proteína His-p17, a purificação da mesma e sua

utilização em experimentos para determinação estrutural.

129

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