baltymŲ frakcijŲ, praturtintŲ lektinais, …2204399/2204399.pdf · lietuvos sveikatos mokslŲ...
TRANSCRIPT
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
RASA STARŠELSKYTĖ
BALTYMŲ FRAKCIJŲ, PRATURTINTŲ LEKTINAIS, IŠSKIRTŲ IŠ URTICA DIOICA L.
ŽOLĖS, ANTIMUTAGENINIO, CITOTOKSINIO IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. Nijolė Savickienė
KAUNAS, 2014
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis
Data
BALTYMŲ FRAKCIJŲ, PRATURTINTŲ LEKTINAIS, IŠSKIRTŲ IŠ URTICA DIOICA L. ŽOLĖS, ANTIMUTAGENINIO, CITOTOKSINIO
IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Konsultantės
dr. Annabella Vitalone
prof. Gabriela Mazzanti
dr. Antonella Di Sotto
Data
Recenzentas
Darbo vadovas
Prof. Nijolė Savickienė
Data
Darbą atliko
Magistrantė
Rasa Staršelskytė
Data
Data
KAUNAS, 2014
3
TURINYS
SANTRAUKA ......................................................................................................................................... 5
SUMMARY ............................................................................................................................................. 7
1. SANTRUMPOS ................................................................................................................................ 10
SĄVOKOS ............................................................................................................................................ 11
2. ĮVADAS ............................................................................................................................................. 11
3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ............................................................................................ 12
4. LITERATŪROS APŽVALGA ....................................................................................................... 13
4.1. Biologiškai aktyvių junginių - lektinų, apibūdinimas ..................................................................... 13
4.2. Lektinų paplitimas ir funkcijos augaluose ...................................................................................... 14
4.3. Augalinių lektinų biologinis aktyvumas ......................................................................................... 15
4.3.1. Priešvėžinis aktyvumas ............................................................................................................. 15
4.3.2. Mitogeninis aktyvumas ............................................................................................................. 16
4.3.3. Priešvirusinis aktyvumas .......................................................................................................... 17
4.3.4. Antibakterinis aktyvumas ......................................................................................................... 17
4.3.5. Priešgrybelinis aktyvumas ........................................................................................................ 18
4.4. Lektinų pritaikymas ......................................................................................................................... 18
4.5. Didžiosios dilgėlės (Urtica dioica L.) lektinas (UDA) ................................................................... 19
4.7. Natūralūs antimutagenai .................................................................................................................. 21
5. TYRIMO METODIKA ................................................................................................................... 22
5.1. Tyrimo medžiaga ............................................................................................................................. 22
5.2. Reagentai ......................................................................................................................................... 23
5.3. Įranga ............................................................................................................................................... 23
5.4. Analitiniai metodai .......................................................................................................................... 24
5.4.1. AMES testas (bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymas) ......................................................... 24
5.4.2. MTT dažo redukcijos reakcijos metodas .................................................................................. 28
5.4.3. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ..................................................................................... 29
5.4.4. Statistinė analizė ...................................................................................................................... 30
6. REZULTATAI ................................................................................................................................. 30
6.1. Antimutageninio aktyvumo tyrimo rezultatai ................................................................................. 30
6.2. Citotoksinio aktyvumo tyrimo rezultatai ......................................................................................... 33
4
6.3. Antioksidacinio aktyvumo tyrimo rezultatai ................................................................................... 34
6.3.1. Antioksidacinio aktyvumo testo, naudojant 2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono
rūgšties) (ABTS·+) modelinį radikalą, rezultatai ............................................................................... 34
6.3.2. Antioksidacinio aktyvumo testo, naudojant superoksido anijono modelinį radikalą, rezultatai
............................................................................................................................................................ 35
7. REZULTATŲ APTARIMAS .......................................................................................................... 36
8. IŠVADOS .......................................................................................................................................... 38
9. LITERATŪROS SĄRAŠAS ............................................................................................................ 40
10. PRIEDAI ......................................................................................................................................... 46
5
SANTRAUKA
BALTYMŲ FRAKCIJŲ, PRATURTINTŲ LEKTINAIS, IŠSKIRTŲ IŠ
URTICA DIOICA L. ŽOLĖS, ANTIMUTAGENINIO, CITOTOKSINIO
IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS
R. Staršelskytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė prof. N. Savickienė;
Konsultantės: dr. Annabella Vitalone, prof. Gabriela Mazzanti, dr. Antonella Di Sotto;
Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.
Romos universiteto La Sapienza, Fiziologijos ir farmakologijos katedra. – Roma.
Darbo tikslas: baltymų frakcijų, praturtintų lektinais, išskirtų iš Urtica doica L. žolės,
antimutageninio, citotoksinio ir antioksidacinio aktyvumo įvertinimas.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti Urtica dioica L. baltymų frakcijų įtaką Salmonella typhimurium ir Escherichia coli
kamienų mutageniškumui, naudojant AMES testo metodą.
2. Ištirti Urtica dioica L. baltymų frakcijų citotoksiškumą HepG2 ląstelių proliferacijai, naudojant
MTT dažo redukcijos reakcijos metodą.
3. Ištirti Urtica dioica L. baltymų frakcijų antioksidacinį aktyvumą, naudojant modelinius ABTS
(2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties)) ir superoksido radikalus.
Metodai:
1. Lektinais praturtintų baltymų frakcijų antimutageniškumas tiriamas AMES testo metodu
(grįžtamosios mutacijos modeliu in vitro) su S9 metabolinės aktyvacijos sistema (supernatantu
iš žiurkių (paveiktų fenobarbitalio/β-naftoflavono mišiniu) kepenų lątelių mitochondrijų) ir be
S9 metabolinės aktyvacijos sistemos. Eksperimentui naudojami trys bakterijų kamienai: S.
typhimurium TA98, S. typhimurium TA100 ir E. coli WP2uvrA.
2. Citotoksiškumas nustatomas MTT dažo redukcijos reakcijos metodu, įvertinant lektinų turinčių
baltymų frakcijų poveikį HepG2 proliferacijai.
3. Baltymų frakcijų, praturtintų lektinais, antioksidacinis aktyvumas nustatomas
spektrofotometrijos metodu, inkubuojant su ABTS (2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono
rūgšties) katijono) ir superoksido radikalų tirpalais.
6
Rezultatai:
1. Didžiųjų dilgėlių žolės baltymų frakcijos parodė antimutageninį poveikį prieš mutageną 2-
aminoantraceną (2-AA). Esant didžiausiai koncentracijai (800 µg), antimutageninis poveikis
pasiekė maksimalią 56 proc., 78 proc. ir 61 proc. inhibiciją atitinkamai TA98, TA100 ir
WP2uvrA bakterijų padermėse. Baltymų frakcijos neturėjo antimutageninio poveikio
(maksimali inhibicija < 25 proc.) prieš 2-nitrofluoreną (2-NF), natrio azidą (SA) ir metilmetano
sulfonatą (MMS).
2. Lektinais praturtintos Urtica dioica L. žolės baltymų frakcijos nesumažino HepG2 ląstelių
proliferacijos nei po 24 valandų, nei po 48 valandų veikimo.
3. Naudojant modelinį radikalą ABTS, stebėta koreliacija tarp bendro antiradikalinio aktyvumo ir
koncentracijos. Maksimalus antioksidacinis aktyvumas (apie 93.8 proc.) nustatytas, kai
lektinais praturtintos frakcijos koncentracija buvo 120 µg/ml. Naudojant modelinį superoksido
anijono radikalą, taip pat stebėta koreliacija tarp bendro antiradikalinio aktyvumo ir
koncentracijos. Maksimalus antioksidacinis aktyvumas (apie 90.2 proc.), nustatytas kai
lektinais praturtintos frakcijos koncentracija buvo 400 µg/ml.
Išvados:
1. Atlikus bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymą, Urtica dioica L. žolės lektinais praturtintos
baltymų frakcijos parodė stiprų antimutageninį aktyvumą prieš mutageną 2-aminoantraceną (2-
AA) S. typhimurium TA98, S. typhimurium TA100 ir E. coli WP2uvrA kamienuose.
2. MTT bandymo metu didžiųjų dilgėlių žolės lektinų turinčios baltymų frakcijos neinhibavo
HepG2 ląstelių proliferacijos.
3. Baltymų frakcijos, praturtintos lektinais, parodė stiprų antioksidacinį aktyvumą, naudojant
ABTS ir superoksido modelinius radikalus.
Reikšminiai žodžiai: didžioji dilgėlė, Urtica dioica, lektinai, citotoksiškumas,
antimutageniškumas, antioksidacinis aktyvumas, 2-aminoantracenas, Ames testas, MTT,
superoksido anijonas, ABTS.
7
SUMMARY
INVESTIGATION OF ANTIMUTAGENIC ACTIVITY,
CYTOTOXICITY AND ANTIOXIDANT ACTIVITY IN LECTIN-
ENRICHED PROTEIN FRACTIONS FROM HERB OF URTICA
DIOICA L.
Rasa Staršelskytė master thesis/ Supervisor of the research paper: prof. Nijolė Savickienė1
Consultants: PhD Annabella Vitalone, prof. Gabriela Mazzanti, PhD Antonella Di Sotto2
1Department of Pharmacognosy, Faculty of pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences,
Lithuania 2Department of Physiology and Pharmacology, Sapienza University of Rome, Italy
Objective of work: evaluation of antimutagenicity, cytotoxicity and antioxidant activity of lectin-
enriched protein fractions from herb of Urtica dioica L.
Main tasks:
1. To evaluate antimutagenic activity of lectin-enriched protein fractions by bacterial reverse
mutation assay.
2. To determine cytotoxicity of lectin-enriched protein fraction by the tetrazolium dye (MTT)
colorimetric assay.
3. To evaluate antioxidant activity of lectin-enriched protein fraction against ABTS-free radical
and superoxide-radical.
Methods:
1. The antimutagenicity was studied in a bacterial reverse mutation assay (Ames test), both in the
absence and presence of an exogenous metabolic activator S9 (the liver postmitochondrial
supernatant of rats treated with the mixture phenobarbital/β-naphthoflavone to induce the
hepatic microsomal enzymes). A set of three strains, S. typhimurium TA98, S. typhimurium
TA100 and E. coli WP2uvrA, was used.
2. Cytotoxicity was determined by the tetrazolium dye (MTT) colorimetric assay in HepG2
human hepatoblastoma cell line.
8
3. The antioxidant activity was evaluated by ABTS-free radical scavenging activity test and
superoxide-radical scavenger assay using spectrophotometry.
Results:
1. Lectin-enriched protein fractions from Urtica dioica L. herb showed antimutagenic effect
against 2-AA (2-aminoanthracene), which reached, at the highest concentration (800 µg) tested,
the maximal inhibition of 56%, 78% and 61% in TA98, TA100 and WP2uvrA strains,
respectively. In contrast, lectin-enriched fractions produced no significant antimutagenic
effects (maximal inhibition < 25%) against 2-NF (2-nitrofluorene), SA (sodium azide), MMS
(methyl methanesulfonate).
2. Lectin-enriched protein fractions did not display any significant reduction in the cell viability
of HepG2 cells, neither after 24 h nor after 48 h of treatment.
3. The inhibition of the ABTS radical and the superoxide anion was concentration-dependent and
reached 93.8% scavenger activity at 120 µg/ml, 90.2% scavenger activity at 400 µg/ml,
respectively.
Conclusions:
1. Lectin-enriched fractions exhibited a strong antimutagenic activity against the mutagen 2-AA
in all strains tested.
2. Lectin-enriched protein fractions did not inhibited the cell proliferation in tumour hepatic
HepG2 cells.
3. Lectin-enriched protein fractions exhibited a remarkable scavenger activity against ABTS
radical and superoxide anion.
Key words: nettle, Urtica dioica, lectins, cytotoxicity, antimutagenicity, antioxidant activity, 2-
aminoanthracene, Ames test, MTT, superoxide anion, ABTS.
9
PADĖKA
Dėkoju Romos universiteto La Sapienza Fiziologijos ir farmakologijos katedrai ir
mokslininkams už suteiktą galimybę ir materialinę bazę, vykdant mokslinį - tiriamąjį darbą „Baltymų
frakcijų, praturtintų lektinais, išskirtų iš Urtica dioica L. žolės, antimutageninio, citotoksinio ir
antioksidacinio aktyvumo tyrimas“. Dėkoju prof. N. Savickienei už pagalbą ir konsultacijas.
10
1. SANTRUMPOS
CD4, CD8 – T limfocitų paviršiuje esantys glikoproteinai
TA98 – Salmonella typhimurium kamienas, negalintis sintetinti histidino, esant mutacijai hisD3052
alelyje
TA100 – Salmonella typhimurium kamienas, negalintis sintetinti histidino, esant mutacijai hisG46
alelyje
WP2uvrA – Escherichia coli kamienas, dėl mutacijos trpE65 alelyje negalintis sintetinti triptofano
HepG2 – žmogaus kepenų vėžio ląstelių linija
MTT – 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il-)-2,5-difeniltetrazolio bromidas
2-NF – 2-nitrofluorenas
2-AA – 2-aminoantracenas
SA – natrio azidas
MMS – metilmetano sulfonatas
DMSO – dimetilsulfoksidas
°C – laipsniai Celsijaus
% – procentai
h – valandos
min – minutės
PBS – fosfatinis buferis
SEM – standartinė vidurkio paklaida
IC50 – pusinė maksimali inhibicinė koncentracija
ABTS – 2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis)
NBT – nitro mėlynasis tetrazolis
NADH – redukuotas nikotinamido adenino dinukleotidas
PMS – fenazino metosulfatas
AAPH – 2,2-azobis(2-amidinopropano) hidrochloridas
11
SĄVOKOS
Autofagija – molekulinis mechanizmas, kurio tikslas – suardyti bei perdirbti senus baltymus ir
pažeistas organeles.
Glikokonjugatai – angliavandeniai, kovalentiškai susijungę su kitais junginiais (lipidais, baltymais),
pvz., glikoproteinai, glikopeptidai, glikolipidai.
Mutageniškumas – fizikinio, cheminio arba biologinio veiksnio geba sukelti mutaciją.
Revertantas – organizmas, kuris išsivystė po grįžtamosios mutacijos.
Supernatantas – virš nuosėdinis skystis.
2. ĮVADAS
Augalų lektinai yra neimuninės ir nefermentinės kilmės baltymai, kurie atpažįsta ir jungiasi
prie įvairių angliavandenių struktūrų ir gali sukelti ląstelių agregaciją ir agliutinaciją. Susidomėjimas
šia junginių grupe ypač išaugo dėl jų priešvėžinio veikimo. Naujausi tyrimai parodė, kad lektinai ne tik
atpažįsta vėžines ląsteles, bet ir sukelia jų adheziją, apoptozę ir mitogeninį citotoksiškumą. Be
priešvėžinio poveikio augalų lektinai dar pasižymi mitogeniniu, priešvirusiniu, antibakteriniu,
priešgrybeliniu aktyvumu. Šiuo metu yra išskirta daugiau nei 100 augalinių lektinų, o didelė jų dalis –
nuodugniai ištirta. Didžiųjų dilgėlių lektinų biologinio aktyvumo tyrimų atlikta nedaug. Geriausiai
ištirti lektinai, išskirti iš Urtica dioica L. šaknų, tačiau lektinų, išskirtų iš didžiųjų dilgėlių žolės,
biologinio aktyvumo tyrimų trūksta.
Bendradarbiaujant Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmakognozijos katedros
mokslininkams ir Lietuvos sodininkystės ir daržininkystės instituto genetikos laboratorijos mokslo
darbuotojams, iš Urtica dioica L. žolės išskirtos baltymų frakcijos, praturtintos lektinais, ir nustatytas
jų specifinis agliutinacinis aktyvumas, baltymų koncentracija ir lektinų kiekis (tirti lektinai priklauso
hololektinų klasei, heveino tipui). Sutikus bendradarbiauti Romos universiteto La Sapienza
Fiziologijos ir farmakologijos katedros mokslininkams, pirmą kartą ištirtas lektinų turinčių baltymų
frakcijų, išskirtų iš Urtica dioica L. žolės, citotoksinis, antimutageninis ir antioksidacinis aktyvumas.
Citotoksiškumo tyrimai atlikti, naudojant kepenų vėžio ląstelių HepG2 liniją, kuri toksikologijoje yra
gerai apibūdintas vėžio modelis in vitro. Lektinais praturtintų baltymų frakcijų, išskirtų iš didžiųjų
dilgėlių žolės, antimutageninis aktyvumas nustatytas, atliekant bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymą
(Ames testą). Bakterijos, skirtingai nei žinduoliai, negali citochromo P450 sistemos pagalba
metabolizuoti neaktyvių cheminių medžiagų, todėl antimutageniniam tyrimui naudota S9 metabolinės
aktyvacijos sistema, kuri padeda nustatyti, ar tiriamoji frakcija gali inhibuoti mutagenų metabolinę
12
aktyvaciją. Antioksidacinis aktyvumas ištirtas, naudojant modelinius ABTS ir superoksido anijono
radikalus, siekiant įvertinti baltymų frakcijų apsauginį veikimo mechanizmą.
3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tyrimo objektas: lektinais praturtintos baltymų frakcijos, išskirtos iš Urtica dioica L. žolės.
Temos aktualumas ir tyrimo problema: atlikta daug augalų lektinų priešvėžinio aktyvumo
in vitro ir in vivo tyrimų, tačiau jų antimutageninis aktyvumas ištirtas labai mažai. Nustatyta, kad
lektinai, išskirti iš didžiųjų dilgėlių šaknų, turi gausybę biologinių savybių, tokių kaip antivirusinių,
priešgrybelinių, antiproliferacinių ir imunomoduliacinių. Tačiau lektinų, išskirtų iš Urtica dioica L.
žolės, biologinis aktyvumas neištirtas. Atlikus šį tyrimą, pirmą kartą nustatytas lektinų turinčių
baltymų frakcijų, išskirtų iš didžiųjų dilgėlių žolės, citotoksinis, antimutageninis ir antioksidacinis
aktyvumas.
Tyrimui paruošta publikacija „A lectin-rich fraction from aerial parts of Urtica dioica L. with
antimutagenic activity” (Antonella Di Sotto, Gabriela Mazzanti, Nijolė Savickienė,
Rasa Staršelskytė, Vaida Bakšenskaitė, Silvia Di Giacomo, Annabella Vitalone) ir atiduota žurnalo
„Pharmaceutical biology” redakcijai. Paruošti pranešimai dviejose Lietuvos sveikatos mokslų
universiteto Studentų mokslinės draugijos (SMD) organizuojamose konferencijose: tarptautinėje
konferencijoje International Health Science Conference 2013, Jaunųjų mokslininkų ir tyrėjų
konferencijoje 2013 (Farmacijos sekcijoje užimta pirmoji vieta ir tezės pristatytos plenarinėje sesijoje).
Taip pat pristatytas stendinis pranešimas tarptautinėje konferencijoje „Отечественные
противоопухолевые препараты 2013”, kuri vyko Minske.
Tikslas: Urtica doica L. žolės baltymų frakcijų, praturtintų lektinais, antimutageninio,
citotoksinio ir antioksidacinio aktyvumo įvertinimas.
Uždaviniai:
1. Įvertinti Urtica dioica L. lektinų turinčių baltymų frakcijų įtaką Salmonella
typhimurium ir Escherichia coli kamienų mutageniškumui, naudojant AMES testo metodą.
2. Ištirti Urtica dioica L. lektinų turinčių baltymų frakcijų citotoksiškumą HepG2
ląstelių proliferacijai, naudojant MTT dažo redukcijos reakcijos metodą.
3. Ištirti Urtica dioica L. lektinų turinčių baltymų frakcijų antioksidacinį
aktyvumą, naudojant modelinius ABTS (2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties))
ir superoksido radikalus.
13
4. LITERATŪROS APŽVALGA
4.1. Biologiškai aktyvių junginių - lektinų, apibūdinimas
Lektinai – tai glikoproteinai, randami įvairiuose organizmuose. Jie buvo aptikti 1888 m., kai
Peter Hermann Stillmark paprastojo ricinmedžio (Ricinus communis L.) sėklų ekstraktuose atrado
hemagliutininą ir pavadino jį ricinu (Sharon et al., 2004). Iš gyvūnų išskirtų lektinų kiekiai paprastai
yra maži, lyginant su augaliniais lektinais. Lektinai turi priešvėžinių, imunomoduliacinių,
priešgrybelinių, inhibuojančių ŽIV-1 atvirkštinę transkriptazę aktyvių savybių, antibakterinį ir
apvaliąsias kirmėles naikinantį poveikį (Lam et al., 2011). Dėl savo biologinio aktyvumo ši unikali
glikoproteinų grupė susilaukė didelio susidomėjimo ir yra naudojama imunologijoje, membranų
struktūros, ląstelių atpažinimo, vėžio tyrimuose ir klinikinėje mikrobiologijoje (Bah et al., 2013).
Lektinai pasižymi specifiškumu angliavandeniams, turi bent vieną tretinės baltymų struktūros
elementą, kuris grįžtamai jungiasi prie specifinių monosacharidų ir oligosacharidų, gali agliutinuoti
eritrocitus.
Lektinai yra apibūdinami kaip baltymai, kurie gali prisijungti prie angliavandenių, tačiau jie
nėra antikūnai ar fermentai. Literatūros šaltiniuose yra nurodomi trys lektinų ypatumai:
1. Lektinas yra glikoproteinas, kuris prisijungia prie agliavandenių. Šiuo apibūdinimu
lektinai yra išskiriami iš kitų junginių grupių, tokių, kaip taninai, tam tikri lipidai,
katijoniniai junginiai ir giminingi angliavandeniai, kurie sukelia angliavandenių
tarpusavio sąveikas (Rüdiger & Gabius, 2001).
2. Lektinai nėra imunoglobulinai (antikūnai). Iš pradžių lektinai dėl savo specifiškumo buvo
apibūdinami kaip medžiagos, kurios yra panašios į antikūnus. Vėliau šio apibrėžimo
atsisakyta, nes imunoglobulinų sintezei reikia antigeninio veiksnio. Visgi yra žinoma, kad
lektinų sintezė gali suintensyvėti dėl išorinio stimulo, pavyzdžiui, augalų lektinų
ekspresija padidėja dėl virusinės infekcijos, sausros ar didelės druskų koncentracijos
(Rüdiger & Gabius, 2001).
3. Lektinai nepakeičia angliavandenių, prie kurių prisijungia, biocheminės struktūros. Šis
ypatumas lektinus atskiria nuo glikoziltransferazių, glikozidazių ir fermentų, kurie į
angliavandenių struktūrą įterpia pakaitą, pavyzdžiui, sulfato grupę. Yra žinomos tam
tikros glikozidazės, kurios agliutinuoja ląsteles žemoje temperatūroje, jeigu jų
prisijungimas prie ląstelės paviršiaus angliavandenių įvyksta greičiau nei glikozidinių
jungčių hidrolizė. Lektinams nėra priskiriami prie angliavandenių prisijungiantys
baltymai, kurie sudaro kompleksinius junginius tik su monosacharidais ir disacharidais,
14
bet nesudaro ryšių su polisacharidais (pvz., kai kurie transportiniai baltymai,
chemotaksyje dalyvaujantys receptoriai) (Rüdiger & Gabius, 2001).
4.2. Lektinų paplitimas ir funkcijos augaluose
Daugiausiai lektinų turi tokios augalų šeimos kaip Leguminosae (pvz., sojos agliutininas),
Gramineae (pvz., kviečių gemalų agliutininas), Solanaceae (pvz., pomidorų lektinas). Lektinai gali
būti paplitę įvairiose augalų dalyse: lapuose, stiebuose, žievėje, šakniagumbiuose, šakniastiebiuose,
šaknyse, vaisiuose, žieduose, floemoje (karnienoje) ir kt. Lektinų kiekis šiose augalų dalyse yra labai
įvairus, kinta priklausomai nuo metų laiko ir dažniausiai yra daug mažesnis nei sėklose, tačiau kartais
gali sudaryti 30 proc. viso augalo dalies baltymų kiekio. Sėklose esantys lektinai randami sėklaskiltėse
arba endosperme ir gali sudaryti iki 10 proc. viso baltymų kiekio (Sharon & Lis, 2007; Bah et al.,
2013).
Daugiausiai augaliniai lektinai yra kaupiami ląstelės vakuolėje, tačiau jie taip pat nustatyti
ląstelės citoplazmoje, branduolyje ir tarpląstelinėje terpėje. Šie glikoproteinai yra sintetinami
šiurkščiajame endoplazminiame tinkle, o vėliau transportuojami per Goldžio aparatą. Skirtingai nei
sekreciniai baltymai, kurie pūslelių pagalba prasiskverbia pro membraną ir išsiskiria iš ląstelės
egzocitozės būdu, lektinai, kaip ir kiti atsarginiai baltymai, patenka į vakuolę (Rüdiger & Gabius,
2001; Peumans & Van Damme, 2005). Lektinai atlieka daug skirtingų ir svarbių funkcijų augaluose. Jie dalyvauja augalo
angliavandenių transporte, ląstelės sienelės ilgėjimo, tarpląstelinių sąveikų, augimo, membranų
receptorių atpažinimo, kryžminio apdulkinimo, simbiozės su bakterijomis procesuose, be to, vykdo
atsarginių baltymų ir fermentų funkcijas (Peumans & Van Damme, 2005). Lektinai apsaugo augalus
nuo vabzdžių ir patogeninių mikroorganizmų, prisijungdami prie jų paviršiuje esančių glikoproteinų ir
veikdami jų dauginimosi, augimo ir vystymosi procesus. Nustačius įvairių lektinų insekticidines
savybes, paaiškėjo, jog baltosios snieguolės (Galanthus nivalis L.) agliutininas (GNA) turi vieną
stipriausių insekticidinį aktyvumą (Michiels et al., 2010). Lektinų dalyvavimas augalų gynyboje nuo
patogeninių mikroorganizmų buvo aprašytas, ištyrus, kad paprastojo kviečio (Triticum aestivum L.)
gemalų lektinas (WGA), valgomojo arachio (Arachis hypogaea L.) agliutininas (PNA) ir gauruotosios
sojos (Glycine max L.) lektinas (SBA) sustabdė Trichoderma viride, Penicilium notatum ir Aspergillus
niger sporų vystymąsi ir augimą (Sharon et al., 2004). Toksiški lektinai, tokie kaip paprastojo
ricinmedžio (Ricinus communis L.) agliutininas (RCA) ir daržinės pupelės (Phaseolus vulgaris L.)
lektinas (PHA), apsaugo augalus nuo gyvūnų (Rüdiger & Gabius, 2001). Lektinai prisijungia prie
glikokonjugatų, esančių žarnyno ląstelių membranų paviršiuje, ir sutrikdo normalią gyvūnų žarnyno
15
funkciją. Dėl šios priežasties gyvūnai turi evoliucijos eigoje susiformavusį instinktą - neėsti šių augalų
(Peumans & Van Damme, 2005).
4.3. Augalinių lektinų biologinis aktyvumas
4.3.1. Priešvėžinis aktyvumas
Augalų lektinai pasižymi dideliu biologiniu aktyvumu. Dauguma lektinų yra rezistentiški
virškinimui. Jie prisijungia prie virškinimo kanalo gleivinės ląstelių ir/arba patenka į kraujo apytaką,
išlaikydami savo biologinį aktyvumą. In vitro ir in vivo bandymų metu buvo atrasti lektinai, turintys
priešvėžinių savybių. Jie jungiasi prie vėžinių ląstelių ar jų receptorių, ir taip išreiškia savo
citototoksiškumą, sukeldami ląstelių apoptozę ar inhibuodami auglio augimą. Svarbu paminėti, kad
lektinai slopina vėžinių ląstelių DNR, RNR ir baltymų sintezę, bet neturi šio poveikio sveikoms
ląstelėms. Šie junginiai gali sukelti vėžinių ląstelių agregaciją ir/arba agliutinaciją. Lektinai paveikia
žarnų sienelių ląsteles taip, kad jos suriša poliaminus, apriboja organizmo poliaminų išteklius ir tokiu
būdu stabdo navikinių ląstelių augimą. Jie taip pat turi poveikį imuninei sistemai, nes keičia įvairių
interleukinų gamybą ir aktyvuoja tam tikras proteinų kinazes. Lektinai gali jungtis prie kelių
angliavandenių, esančių limfocitų paviršiuje, ir yra polikloniniai žmogaus limfocitų aktyvatoriai. Šie
augaliniai junginiai gali jungtis prie ribosomų ir inhibuoti baltymų sintezę, sumažinti telomerazės
aktyvumą ir slopinti angiogenezę. Lektinai kaip priešnavikiniai preparatai turi didelį potencialą, tačiau
yra būtini tolimesni tyrimai. Vieni iš svarbesnių lektinų, kurie turi priešvėžinį aktyvumą, yra
paprastosios pupos (Vicia faba L.) agliutininas (VFA), paprastojo amalo (Viscum album L. )
agliutininas (VAA), uodeguotojo burnočio (Amaranthus caudatus L.) lektinas (ACA), lenktosios
kardapupės (Canavalia ensiformis L.) lektinas (ConA), paprastojo ricinmedžio (Ricinus communis L.)
agliutininas (RCA), paprastojo kviečio (Triticum aestivum L.) gemalų lektinas (WGA), gauruotosios
sojos (Glycine max L.) agliutininas (SBA), daržinės pupelės (Phaseolus vulgaris L.) lektinas (PHA),
didžiosios dilgėlės (Urtica dioica L.) agliutininas (UDA) ir kt. (De Mejía & Prisecaru, 2005; Bah et
al., 2013).
Buvo įrodyta, kad gauruotosios sojos (Glycine max L.) agliutininas (SBA) slopino krūties
vėžio ląstelių MCF7 ir kepenų vėžio ląstelių HepG2 proliferaciją (Lin et al., 2008). Vieno tyrimo
rezultatai parodė, kad paprastojo ricinmedžio (Ricinus communis L.) agliutininas (RCA) suaktyvino
kaspazes ir sukėlė Hodžkino limfomos L540 ląstelių apoptozę (Letizia et al., 2009). Daržinės pupelės
(Phaseolus vulgaris L.) lektino (PHA) įtraukimas į mitybą stipriai sumažino pelių ne Hodžkino
limfomos naviko augimą (Liu et al., 2010). Klinikinių tyrimų metu nustatyta, kad paprastųjų amalų
16
vandeninis ekstraktas, praturtintas Viscum album L. lektinais (ML) buvo saugus ir efektyvus,
pagerinant krūties vėžiu sergančių pacienčių gyvenimo kokybę (Semiglazov et al., 2006). Vieno
tyrimo metu buvo nustatytas priešvėžinis Viscum album L. agliutinino (VAA-1) poveikis, veikiant
vienam ir kartu su chemoterapiniais vaistais (doksorubicinu, cisplatina, taksoliu) žmogaus plaučių
naviko ląstelėse. Stiprus sinergistinis VAA-1 poveikis buvo išreikštas kartu su visais tirtais vaistais
(Siegle et al., 2001). Lenktosios kardapupės (Canavalia ensiformis L.) konkavalinas A (ConA) sukėlė
melanomos ląstelių A375 mirtį, pažeisdamas mitochondrijas, aktyvindmas kaspazes, inicijuodamas
apoptozę (Liu, 2009). A. Merkel vėžinių ląstelių sąveikos su lektinais tyrimai pademonstravo, kad N-
acetilgliukozaminui specifiški UDA (Urtica dioica agliutininas) lektinai stipriai jungiasi prie navikinės
stromos ląstelių (Sames et al., 2001).
4.3.2. Mitogeninis aktyvumas
Vienas iš svarbiausių tyrimų lektinų istorijoje buvo atliktas 1960 m., kai Peter C. Nowell
nustatė, kad daržinės pupelės (Phaseolus vulgaris L.) lektinas (PHA) stimuliuoja limfocitų mitozę.
Vėliau buvo atrasti ir kiti lektinai, turintys mitogeninį aktyvumą. Mitogeniniai lektinai veikia panašiai
kaip antigenai, tačiau lektinai aktyvina 70-80 proc. limfocitų, o antigenai stimuliuoja tik specifinius
klonus, kurie sudaro nedidelę dalį limfocitų. Dėl šios savybės lektinai yra priskiriami polikloniniams
mitogenams. Lenktosios kardapupės (Canavalia ensiformis L.) konkavalinas A (ConA) yra svarbus
mitogenas, nes skirtingai nei PHA, jį gali inhibuoti mažos monosacharidų, pavyzdžiui, manozės
koncentracijos. Šis atradimas įrodė, kad lektinų mitogeninio aktyvumo priežastis yra jų jungimasis prie
limfocitų paviršiuje esančių angliavandenių. Manoma, kad lektinai sąveikauja su specifiniais
membranų komponentais, kurie veikia kaip stimuliuojantys mitozę receptoriai, o nemitogeniniai
lektinai prie šių komponentų neprisijungia. Dėl šios ypatybės lektinai, turintys mitogeninį aktyvumą,
yra naudojami signalo perdavimo ląstelėje ir aktyvuotų limfocitų biocheminių procesų tyrimuose in
vitro (Sharon & Lis, 2004; Bah et al., 2013).
Dauguma lektinų aktyvina tik T ląstelių mitozę, o kitus limfocitus inhibuoja arba jų neveikia.
Buvo nustatyta, kad stiprų žmogaus limfocitų proliferaciją stimuliuojantį poveikį turi didžiosios
ugniažolės (Chelidonium majus L.) lektinai (CMI). Atlikus tyrimus paaiškėjo, kad valgomojo lęšio
(Lens culinaris L.) lektinas (LCA) stimuliuoja ne tik žmogaus T ląstelių, bet ir B ląstelių proliferaciją
(Ashraf & Khan, 2003). Mitogeninį aktyvumą turintys lektinai – geltonžiedžio žingio (Arisaema
flavum L.) lektinas (AFL), stambiojo duonmedžio (Artocarpus heterophyllus L.) agliutininas,
paprastojo kviečio (Triticum aestivum L.) gemalų lektinas (WGA), juoduogio šeivamedžio (Sambucus
nigra L.) agliutininas (SNA), valgomojo arachio (Arachis hypogaea L.) agliutininas (PNA), didžiosios
17
dilgėlės (Urtica dioica L.) agliutininas (UDA) ir kt. (Ashraf & Khan, 2003; Bah et al., 2013).
4.3.3. Priešvirusinis aktyvumas
Lektinų priešvirusinis aktyvumas priklauso nuo jų specifiškumo angliavandeniams ir gali būti
paaiškinamas keliais veikimo mechanizmais. Retrovirusų, pavyzdžiui, žmogaus imunodeficito viruso
(ŽIV) paviršius yra padengtas užkoduotais glikoproteinais. ŽIV paviršiuje esantys glikoproteinai
gp120 ir gp41 yra stipriai glikozilinti (gp120 angliavandenių dalis sudaro daugiau nei 50 proc.
molekulinės masės). Prie angliavandenių prisijungiantys baltymai gali sudaryti ryšius su viruso
paviršiuje esančiais glikanais ir taip sutrikdyti viruso sąveiką su šeimininko ląstelėmis. Kitas lektinų
veikimo mechanizmas yra ŽIV atvirkštinės transkriptazės, pagrindinio viruso cikle dalyvaujančio
fermento, slopinimas. Dauguma augalinių lektinų, inhibuojančių žmogaus imunodeficito virusą, yra
kilę iš vienaskilčių augalų šeimų, pavyzdžiui, Amaryllidaceae, Orchidaceae, Alliaceae, ir dviskilčių
augalų šeimų, tokių kaip Fabaceae, Moraceae, Urticaceae and Cecropiaceae (Bah et al., 2013).
Tyrimai parodė, kad lektinai gali būti potencialūs koronavirusų inhibitoriai, nes sutrikdo
viruso replikacijos ciklą. Pirmasis lektinų taikinys buvo nustatytas ankstyvajame replikacijos cikle, o
antrasis – ciklo pabaigoje. Ištirta, kad itin veiksmingi prieš koronavirusus yra manozei specifiški
lektinai, pavyzdžiui, daržinio poro (Allium porrum L.) agliutininas (APA). Taip pat įrodyta, kad
lektinai gali užkirsti kelią viruso įsiskverbimui į šeimininko ląstelę. Dėl šios savybės jie yra tinkami
išoriniam vartojimui, ir yra mažiau toksiški nei daugelis dabartinių priešvirusinių vaistų (Bah et al.,
2013).
4.3.4. Antibakterinis aktyvumas
Lektinai yra veiksmingi prieš Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis ir Klebsiella sp. Augalų lektinai negali pakeisti bakterijos
membranos struktūros ir/ar pralaidumo arba sutrikdyti normalius bakterijos viduląstelinius procesus.
Visgi, lektinai atlieka svarbų vaidmenį augalų apsaugoje nuo bakterijų, todėl, manoma, kad jie veikia
bakterijas netiesiogiai, sąveikaudami su ląstelės sienelės angliavandeniais ar ekstraląsteliniais
glikanais. Nustatyta, kad lektinai jungiasi su bakterijų sienelėje esančiais peptidoglikanais,
lipopolisacharidais ir teicho rūgštimis ir taip neigiamai veikia gram–teigiamas ir gram–neigiamas
bakterijas. Antibakterinį poveikį turi vienažiedės eugenijos (Eugenia uniflora L.) lektinas (EUL),
18
aliejinės moringos (Moringa oleifera L.) agliutininas (MOL), mimozinio senmedžio (Archidendron
jiringa Jack, I.C. Nielsen) lektinas (AJL) ir kt. (Paiva et al., 2010; Bah et al., 2013).
4.3.5. Priešgrybelinis aktyvumas
Lektinai slopina grybelių augimą netiesiogiai, prisijungdami prie ląstelės sienelės
angliavandenių. Kaip ir bakterijų atveju, lektinai negali prisijungti prie membranos glikokonjugatų,
patekti į citoplazmą ar pakeisti membranos struktūrą ir/arba pralaidumą. Manoma, kad lektinai
specifiškai prisijungia prie tam tikrų grybelio sienelės angliavandenių ir taip pakeičia jos aktyvumą bei
gyvybingumą. Dauguma lektinų atpažįsta N-acetilneuramino rūgštį, N-acetilgliukozaminą, N-
acetilgalaktozaminą, galaktozę, manozę ir fukozę. Lektinų prisijungimas prie grybelių hifų sutrikdo
maistinių medžiagų absorbciją ir sporų augimą (Paiva et al., 2010; Bah et al., 2013).
Atlikus tyrimus, buvo nustatytas ir kitas lektinų priešgrybelinio veikimo mechanizmas, susijęs
su chitinu. Šis pagrindinis grybelio ląstelės sienelės komponentas yra sudarytas iš modifikuotų
gliukozės vienetų (N-acetilgliukozamino). Lektinai gali atpažinti N-acetilgliukozaminą kaip gliukozę
ir taip imituoti sąveiką su angliavandeniais. Prisijungiant prie chitino, lektinai suardo ląstelės sienelę,
pasižymi didesniu toksiškumu. Priešgrybeliniai lektinai yra sėjamojo žirnio (Pisum sativum L.)
lektinas (PSL), krūminės paprikos (Capsicum frutescens L.) (CFL) lektinas, daržinės pupelės
(Phaseolus vulgaris L.) lektinas (RKBL), soforos (Sophora alopecuroides L.) lektinas (SAL),
dygliuotojo kapario (Capparis spinosa L.) lektinas (CSL) ir kt. Ištirta, kad lektinai yra veiksmingi
prieš Aspergillus flavus, Trichoderma viride, Fusarium oxysporum, Fusarium moniliforme, Coprinus
comatus, Rhizoctonia olani, Penicillium digitatum, Alternaria alternata, Valsa mali grybelius (Paiva et
al., 2010; Bah et al., 2013).
4.4. Lektinų pritaikymas
Lektinai yra plačiai naudojami įvairiuose moksliniuose tyrimuose, bet daugiausiai –
susijusiuose su angliavandenių aptikimu, identifikavimu ir funkciniu įvertinimu. Lektinai turi nemažai
privalumų, tokių, kaip paplitimas, skirtingas specifiškumas ir geras stabilumas. Specifinė medžiagos ar
ląstelės sąveika su lektinu gali būti laikoma įrodymu, kad jos turi angliavandenių. Todėl lektinų
jungimasis su angliavandeniais buvo dažnai naudojamas, norint įrodyti, kad daugelio hormonų,
augimo faktorių, neurotransmiterių ir toksinų receptoriai yra glikokonjugatai. Be to, lektinai yra
19
bandomi kaip vaistų, fermentų, nukleino rūgščių, genų ir kitų ląstelinių medžiagų taikiniai (Sharon &
Lis, 2007).
Daugiausiai lektinai yra naudojami glikoproteinų identifikavimui, išskyrimui, struktūros
tyrimams; angliavandenių, esančių ant ląstelių ir subląstelinių organoidų, tyrimams; histochemijai ir
citochemijai; baltymų glikozilinimo tyrimams; neuronų žemėlapių sudarymui; ląstelių identifikavimui
ir atskyrimui; mitogeninei limfocitų stimuliacijai; diagnozei ir kaip taikiniai; lektinams atsparių
mutantų selekcijai. Skirtingai nei moksliniuose tyrimuose, lektinų pritaikymas klinikinėje praktikoje
yra siauresnis. Jie yra panaudojami kraujo grupės nustatymui, kariotipavimui, kaulų čiulpų išvalymui,
paciento imuniteto būklės nustatymui ir Gošė ligos gydymui (Sharon & Lis, 2007).
Vis daugiau yra išskiriama naujų lektinų ir atliekama jų biologinio aktyvumo tyrimų, todėl
lektinų gamyba gali būti tobulinama ir atrandamos naujos jų pritaikymo galimybės. Lektinai galėtų
būti naudojami kaip naujos kartos vaistai, jei būtų iki galo suprastas jų veikimas. Reikia daugiau
mokslinių tyrimų, kad lektinai būtų patvirtinti kaip priešvėžinės, antimikrobinės priemonės ir vaistų
nešikliai. Norint žinoti lektinų biologinio aktyvumo pagrindą, reikia tęsti jų tyrimus molekuliniame
lygmenyje (Bah et al., 2013).
4.5. Didžiosios dilgėlės (Urtica dioica L.) lektinas (UDA)
Didžiosios dilgėlės (Urtica dioica L.) agliutininas (UDA) yra monomerinis baltymas, kurio
molekulinė masė yra 8.5 kDa. Nuo kitų augalų lektinų jis skiriasi molekuline struktūra ir itin mažu
specifiniu agliutinacijos aktyvumu. Atlikus tyrimus, buvo identifikuoti genai, koduojantys septynis
UDA izolektinus su 79-99 proc. aminorūgščių sekų homologija. Cheminės sudėties analizė parodė,
kad IV UDA izolektiną sudarantys du domenai yra sujungti tetrapeptidine grandine ir susideda
atitinkamai iš 42 ir 43 aminorūgščių su 42 proc. sekų homologija. Domenai yra sudaryti iš
nelygiagrečių β klosčių. Kiekvienas Urtica dioica agliutinino domenas turi angliavandenius
prijungiančią sritį, tačiau skiriasi savo trauka ligandams. Angliavandenius prijungiančios sritys yra
išsidėsčiusios molekulės paviršiuje. UDA, kaip ir paprastojo kviečio (Triticum aestivum L.) gemalų
lektinas (WGA), yra specifiškas β-1,4-glikozidiniu ryšiu susijungusiems N-acetilgliukozamino
oligomerams (Sharon & Lis, 2007; Galelli et al., 1993).
Daugiausia biologinio aktyvumo tyrimų atlikta su lektinais, išgautais iš didžiosios dilgėlės
(Urtica dioica L.) šaknų. Buvo ištirta, kad Urtica dioica agliutininas slopina epiderminio augimo
faktoriaus (EAF) prisijungimą prie jo receptoriaus (EAF-R) epidermoidinės karcinomos A431 linijos
ląstelėse. Kiti lektinai, tokie kaip paprastojo kviečio (Triticum aestivum L.) gemalų lektinas (WGA),
kuris turi tą patį specifiškumą angliavandeniams kaip ir UDA lektinas, ir manozei specifiškas
20
lenktosios kardapupės (Canavalia ensiformis L.) konkavalinas A (Con A), buvo mažiau aktyvūs nei
didžiosios dilgėlės agliutininas. Inhibicinis Urtica dioica agliutinino poveikis buvo panaikintas su N-
acetilgliukozamino trimeru. Manoma, kad UDA lektinas gali būti pagrindinis didžiųjų dilgėlių
vaistinės žaliavos – šaknų, junginys, kuris nulemia prostatą gydantį poveikį, nes blokuoja epiderminio
augimo faktoriaus receptorius prostatos audinyje (Wagner et al., 1995).
Nustatyta, kad chitiną prisijungiantis Urtica dioica agliutininas inhibuoja chitino sintezę
ir/arba nusėdimą ir taip sustabdo grybelio augimą. Didžiųjų dilgėlių vaistinės žaliavos – šaknų, lektino
poveikis grybelio ląstelės sienelei ir hifų morfologijai parodė, kad šis agliutininas reguliuoja šaknų
endotrofinę mikorizę (Lam et al., 2011). Antimikrobinio aktyvumo tyrimai įvertino, kad N-
acetilgliukozaminui (GlcNAc) specifiški didžiųjų dilgėlių šaknų lektinai yra aktyvūs prieš tokius
mikroorganizmus kaip Botrytis cinerea, Colletotrichum lindemuthianum, Phoma betae, Phycomyces
blakesleeanus, Septoria nodorum, Trichoderma hamatum ir Trichoderma viride (Paiva et al., 2010).
Iš specifiškų N-acetilgliukozaminui (GlcNAc) lektinų tik Urtica dioica agliutininas parodė
stiprų veikimą prieš žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV) (Wu & Bao, 2013). UDA lektinas inhibavo
Simian imunodeficito virusą (SIV) ir du žmogaus imunodeficito viruso tipus (ŽIV-1, ŽIV-2) (Francois
et al., 2008). Buvo ištirtas inhibicinis UDA lektino poveikis ūmaus kvėpavimo takų sindromo (SARS)
sukelėjui koronavirusui mirtinai užkrėstuose BALB/c pelių modeliuose. Urtica dioica agliutininas
sumažino plaučių patologiją ir apsaugojo peles nuo svorio mažėjimo bei mirties. Vėliau buvo
nustatyta, kad šį terapinį efektą pelėms UDA lektinas sukelia, inhibuodamas ankstyvąsias
koronaviruso replikacijos stadijas: adsorbciją ir infiltraciją. Didžiųjų dilgėlių vaistinės žaliavos lektinas
prisijungia prie N-acetilgliukozamino liekanų, esančių glikozilintame baltyminiame apvalkale, ir
neleidžia koronavirusui prisijungti prie ląstelės (Kumaki et al., 2011).
Urtica dioica lektinas yra T ląstelių mitogenas, tačiau iš kitų mitogeniškų lektinų išsiskiria
savo savybe neveikti CD4+ ir CD8+ T ląstelių, specifiniu T limfocitų aktyvinimo būdu ir citokinų
gamyba. Urtica dioica agliutinino molekulinis T limfocitų aktyvinimo mechanizmas yra panašus į
struktūriškai nesusijusių bakterinių ir retrovirusinių superantigenų, T ląsteles aktyvuojančių baltymų,
veikimo mechanizmą, todėl UDA lektinas yra priskiriamas superantigenams (Galelli et al., 1993).
Tyrimai parodė, kad didžiųjų dilgėlių vaistinės žaliavos – šaknų lektinas neleidžia progresuoti
eksperimentinėse pelėse dirbtinai sukeltai sisteminei raudonajai vilkligei. UDA lektinu gydytoms
pelėms neišsivystė akivaizdūs šios autoimuninės ligos klinikiniai požymiai ir nefritas. Be to, Urtica
dioica agliutininas sumažino antikūnų gamybą tik moteriškos lyties pelėse (Musette et al., 1996).
N. Savickienė ir kt. (2012) išskyrė lektinais praturtintas baltymų frakcijas iš žolės (šviežios ir
džiovintos) bei sausojo dilgėlių ekstrakto, nustatė jose baltymų, lektinų kiekį ir agliutinacinį aktyvumą,
naudojant tripsinu paveiktus triušio eritrocitus. Baltymų kiekis šviežioje ir džiovintoje Urtica dioica L.
žolėje, lyginant pirmąją frakciją (pirminio ekstrakto, prisotinto iki 40 proc. amonio sulfato tirpalu,
21
nuosėdos) su antra (pirminio ekstrakto, prisotinto iki 80 proc. amonio sulfato tirpalu, nuosėdos),
didesnis buvo antrojoje. Šviežios Urtica dioica L. žolės baltymų ekstraktas pasižymėjo specifiniu
agliutinaciniu aktyvumu prieš tripsinu paveiktus triušio eritrocitus. Šviežios Urtica dioica L. žolės
antrojoje frakcijoje (pirminio ekstrakto, prisotinto iki 80 proc. amonio sulfato tirpalu, centrifūgate)
stebėtas didžiausias agliutinacinis aktyvumas. Didžiausias lektinų kiekis (0.02 – 0.33 proc.) buvo
baltymų frakcijose, iškirtose iš sausojo Urtica dioica L ekstrakto.
4.7. Natūralūs antimutagenai
Mutagenai dalyvauja ne tik genotoksiškumo ir kancerogenezės procesuose, bet ir lėtinių ligų,
pavyzdžiui, kepenų, neurodegeneracinių, širdies ir kraujagyslių ligų, diabeto, artrito, lėtinio uždegimo,
pradžioje ir patogenezėje. Vienas iš būdų, mažinant mutagenų žalingą poveikį, yra natūralių
antimutagenų vartojimas. Mokslinių tyrimų metu atrandama ir išskiriama vis daugiau natūralių
antimutagenų, kurie apsaugo nuo kai kurių toksinių cheminių medžiagų. Jiems yra priskiriami
flavonoidai, kumarinai, karotenoidai, antrachinonai, taninai, saponinai ir kiti junginiai (Bhattacharya,
2011).
Atliekami įvairūs bandymai su prokariotinėmis ir eukariotinėmis ląstelėmis, nustatant
aplinkos mutagenus ir kancerogenus, juos pritaikant antimutageniniam potencialui ir veikimo
mechanizmui ištirti. Populiarūs neilgai trunkantys ir nereikalaujantys didelių sąnaudų antimutageniniai
tyrimai yra testai su bakterijomis. Jie suteikia preliminarią, tačiau svarbią informaciją apie
antimutagenezės metu vykstančius ląstelinius procesus. Panaudojus žinduolių fermentus,
antimutageninio aktyvumo tyrimai su bakterijomis gali suteikti informaciją apie junginio metabolinę
aktyvaciją arba detoksikaciją, kurios galėtų įvykti in vivo. Po kelis dešimtmečius trukusių tyrimų su
bakterijų ir žinduolių ląstelėmis buvo išsamiai ištirtas įvairių augalinių junginių antimutageninis
poveikis (Nikolić et al., 2012).
Antimutagenai pagal savo veikimo mechanizmą yra skirstomi į desmutagenus ir
bioantimutagenus. Desmutagenai yra medžiagos, kurios fermentinės arba cheminės sąveikos metu
dalinai arba visiškai inaktyvuoja mutagenus. Šie antimutagenai veikia, dar neįvykus mutageno sąveikai
su DNR. Bioantimutagenai slopina mutacijos procesą jau po įvykusio genų pažeidimo. Jie gali
teigiamai veikti mutageno paveiktos DNR taisymo ir replikacijos procesus (Bhattacharya, 2011). In
vitro ir in vivo tyrimų metu atrasti įvairūs augaliniai antimutagenai, turintys skirtingus veikimo
mechanizmus. Terpenoidų frakcija, išskirta iš vaistinio šalavijo (Salvia officinalis L.), žymiai
sumažino chromosomų struktūros pakitimų skaičių pelėse, paveiktose mitomicinu C (Vujosevic &
Blagojevic, 2004). Vieno palyginamojo tyrimo metu buvo nustatyta, kad vaistinio šalavijo (Salvia
22
officinalis L.), kvapiojo baziliko (Ocimum basilicum L.) monoterpenais praturtinti ekstraktai ir
monoterpenų frakcijos veikė kaip desmutagenai ir bioantimutagenai (Nikolić et al., 2012). Kvapiojo
mairūno (Origanum majorana L.) ekstraktai parodė antimutageninį poveikį prieš netiesioginio
veikimo mutagenus, todėl, manoma, kad slopino citochromo CYP 1A2 izofermento aktyvumą (Khan
et al., 2012). Sieros junginiai, išskirti iš vaistinės pikulės (Sisymbrium officinale L.) sausojo
vandeninio ekstrakto, sumažino tiesioginių ir netiesioginių mutagenų aktyvumą ir manoma, kad veikė
specifinius mechanizmus, pavyzdžiui, DNR nukleotidų iškerpamąją pataisą (ekscizinę reparaciją) (Di
Sotto et al., 2012). Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit lektino antimutageninis aktyvumas ištirtas
bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymu (Ames testu), naudojant S. typhimurium TA98 kamieną.
Tyrimo rezultatai parodė, kad šis lektinas turi stiprų antimutageninį poveikį prieš mutageną Trp-P-1
(3-Amino-1,4-dimetil-5H-pirido[4,3-b]indolą) (Inglum et al., 2011). Atlikus Ames testą, paprastojo
amalo (Viscum album L. var. coloratum) agliutininas (VCA) parodė nestiprų antimutageninį poveikį
prieš tiesioginio veikimo mutagenus natrio azidą (SA) ir furilfuramidą (AF-2) ir buvo veiksmingesnis
prieš netiesioginio veikimo mutageną 2-aminoantraceną (2-AA) (Hong & Lyu, 2012). Juoduogio
šeivamedžio (Sambucus nigra L.) lektinai Kinijos žiurkėno ląstelėse sumažino nikelio chlorido (NiCl2)
sukeltą DNR pažaidą. Manoma, kad apsauginis Sambucus nigra L. lektinų veikimo mechanizmas yra
DNR reparacijos aktyvinimas, nikelio pasisavinimo mažinimas ir nespecifinis nikelio jonų jungimasis
su baltymų molekulėmis (Macewicz et al., 2005).
5. TYRIMO METODIKA
5.1. Tyrimo medžiaga
Šviežios Urtica dioica L. žolės lektinais praturtintos baltymų frakcijos, paruoštos LSMU
farmakognozijos katedroje, bendradarbiaujant su Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro
sodininkystės ir daržininkystės institutu (Babtai, Lietuva). Baltymų frakcijos, praturtintos lektinais,
buvo išskirtos iš Urtica dioica L. žolės, išsūdant 80 proc. amonio sulfato tirpalu. Frakcijų dalelių dydis
(120 kDA ir 30 kDA) nustatytas SDS-PAGE elektroforezės metodu. 1ml Urtica dioica L. žolės
lektinais praturtintų baltymų frakcijų, ištirpintų fosfatiniame buferyje be natrio chlorido, yra 8,922 mg
baltymų ir 3,46 mM amonio sulfato (Savickienė ir kt., 2012).
23
5.2. Reagentai
2-nitrofluorenas (2-NF) 98 proc., CAS numeris 607-57-8, Sigma-Aldrich Co®, Saint Luisas, JAV
2-aminoantracenas (2-AA) 96 proc., CAS numeris 613-13-8, Sigma-Aldrich Co®, Saint Luisas, JAV
Natrio azidas (SA) > 99.5 proc., CAS numeris 26628-22-8, Sigma-Aldrich Co®, Saint Luisas, JAV
Metilmetano sulfonatas (MMS) 99 proc., CAS numeris 66-27-3, Sigma-Aldrich Co®, Saint Luisas,
JAV
Dimetilsulfoksidas (DMSO) >99.5 proc., CAS numeris 67-68-5, Sigma-Aldrich Co®, Saint Luisas,
JAV
S9 metabolinės aktyvacijos sistema, Moltox®, Molecular Toxicology, Boone, JAV
Salmonella typhimurium TA98 (hisD3052galbiochl1008rfa1001 ΔuvrBpKM101) kamienas, Research
Toxicological Centre, Roma, Italija
Salmonella typhimurium TA100 (hisG56galbiochl1005rfa1004ΔuvrB pKM101) kamienas, Research
Toxicological Centre, Roma, Italija
Escherichia coli WP2uvrA (trpE65ΔuvrA) kamienas, Research Toxicological Centre, Roma, Italija
Žmogaus kepenų vėžio HepG2 ląstelių linija, ATCC® 77400TM, American Type Culture Collection,
Milanas, Italija
Mitybos terpė, Oxoid®, Basingstoke, Didžioji Britanija
Mitybos agaras, Sigma-Aldrich Co®, Saint Luisas, JAV
Bakteriologinis agaras, Sigma-Aldrich Co®, Saint Luisas, JAV
5.3. Įranga
Mikroplokštelių spektrofotometras, BioTeK®, Winooski, JAV
Inkubatorius, Jouan®, Ramsey, JAV
Laminarinė traukos spinta, Steril®, Milanas, Italija
Vandens vonia 750, Asal®, Milanas, Italija
24
5.4. Analitiniai metodai
5.4.1. AMES testas (bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymas)
5.4.1.1. Reagentų paruošimas
Lektinais praturtintos Urtica dioica L. žolės baltymų frakcijos ištirpintos steriliame
dejonizuotame vandenyje ir praskiestos serijiniu būdu (praskiedimo santykis 1:2). Mutagenai: 2-
nitrofluorenas (2-NF) ir 2-aminoantracenas (2-AA), ištirpinti dimetilsulfokside, o natrio azidas (SA) ir
metilmetano sulfonatas (MMS) – dejonizuotame vandenyje. S9 metabolinės aktyvacijos sistema
(supernatantas iš žiurkių (paveiktų fenobarbitalio/β-naftoflavono mišiniu) kepenų lątelių
mitochondrijų) paruošta prieš pat naudojimą, sumaišius 500 µl fosfatinio buferio (0.2 M), 130 µl
dejonizuoto vandens, 100 µl KCl (0.33 M), 80 µl MgCl2 (0.1 M), 100 µl S9 frakcijos, 50 µl gliukozės-
6-fosfato (0.1 M) ir 40 µl NADP (0.1 M). Tyrimo metu mišinys laikomas ant ledo.
5.4.1.2. Bakterijų kamienai
AMES testui naudojami trys bakterijų kamienai: Salmonella typhimurium TA98
(hisD3052galbiochl1008rfa1001 ΔuvrBpKM101), Salmonella typhimurium TA100
(hisG56galbiochl1005rfa1004ΔuvrB pKM101), Escherichia coli WP2uvrA (trpE65ΔuvrA).
Kiekvienas iš šių kamienų turi būdingą genotipą, todėl bakterijų kamienai yra jautrūs skirtingiems
mutacijų tipams. Dėl mutacijos S. typhimurium TA98, TA100 ir E. coli WP2uvrA negali sintetinti
pagrindinės aminorūgšties, tačiau bandymo metu mutagenas pakeičia šių kamienų mutacijas ir
sugrąžina jiems funkcinį gebėjimą sintetinti aminorūgštį, t.y. paverčia kamieną į laukinį tipą. S.
typhimurium TA98 ir TA100 negali sintetinti aminorūgšties histidino, nes yra mutacija hisG gene,
atitinkamai, hisD3052 ir hisG46 aleliuose. Mutagenai, kurie sukelia „rėmelio poslinkio” mutaciją
(geno kodonų skaitymo pasislinkimą dėl nukleotidų iškritų (delecijų) ir intarpų (insercijų)), paverčia
hisD3052 alelį į laukinį tipą. hisG46 alelio mutacija įvyksta dėl aminorūgšties leucino (GAG/CTC)
pakeitimo aminorūgštimi prolinu (GGG/CCC). Mutagenai, kurie sužadina nukleotido pakaito mutaciją
GC bazių poroje, gali S. typhimurium TA100 kamieną paversti į laukinį tipą (Levin & Ames, 1986;
DeMarini, 2000). S. typhimurium TA98 ir TA100 kamienai yra netinkami, nustatant oksiduojančius
mutagenus, pavyzdžiui, laisvųjų radikalų generatorius, kurie veikia adenozino ir timino nukleotidų
poras. Tokios oksiduojančios medžiagos gali būti nustatomos, tiriant E. coli WP2uvrA kamieną
(OECD, 1997). E. coli WP2uvrA yra priklausoma nuo triptofano dėl pakaitos trpE65 alelyje. Ši
25
mutacija atsiranda, įvykus klaidingam pažaidų taisymui arba replikacijai adenino ir timino sekoje.
Mutagenai, kurie indukuoja nukleotido pakaito mutaciją, gali paversti kamieną į laukinį tipą (Brusick
et al., 1980; Ohta et al., 2002). Atsižvelgiant į galimą reaktyvių deguonies formų (ROS) įtaką
genotoksinių procesų indukcijai, tyrime naudota E. coli WP2uvrA padidina bakterijų kamienų
jautrumą skirtingoms genotoksinėms žaloms (Wilcox et al., 1990).
Prieš pradedant tyrimą, eksperimentinės bakterijų kultūros, kurios paruošiamos iš užšaldytų
pradinių bakterijų kultūrų, inkubuojamos per naktį (16 h, 37 °C), kol pasiekiamas tankis 1×109
bakterijų mililitre. Pagal Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų
tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 471 metodą (1997) gyvybingų bakterijų
skaičius nustatomas kiekvieno eksperimento metu. Bakterijų kamienų TA98, TA100 ir WP2uvrA
gyvybingumas buvo atitinkamai: 240.0 ± 13.10, 209.0 ± 9.49 ir 371.5 ± 12.87 gyvybingų ląstelių
lėkštelėje.
5.4.1.3. Citotoksiškumo nustatymas
Didžiųjų dilgėlių žolės baltymų frakcijų citotoksiškumas įvertinamas, nustatant revertantų
(organizmų, kurie išsivysto po grįžtamosios mutacijos) kolonijų skaičiaus sumažėjimą, lyginant su
kontroliniais bandiniais (Maron & Ames, 1983). Šiam tikslui lektinais praturtinta baltymų frakcija
(800 µg, 1000 µg, 1200 µg, 1500 µg) įlašinama į per naktį inkubuotas bakterijų kultūras (100 µl) ir S9
metabolinės aktyvacijos sistemos mišinį arba 500 µl fosfatinį buferį (0.1 M). Mėgintuvėliai su
mišiniais purtomi kratytuvo pagalba ir inkubuojami (37 °C, 30 min). Pasibaigus išankstinei
inkubacijai, TA98 ir TA100 kamienai padengiami agaru (2 ml), turinčiu 10 proc. histidino/biotino (0.5
mM), o WP2uvrA kamienas – agaru, turinčiu 10 proc. triptofano (0.5 mM). Galiausiai šie mišiniai
užpilami ant minimalaus agaro, turinčio minimalios Vogel-Bonner terpės ir gliukozės. Po inkubacijos
(37 °C, 48 h) skaičiuojamos revertantų kolonijos, galinčios sintetinti histidiną arba triptofaną.
5.4.1.4. Mutageninio aktyvumo nustatymas
Ištyrus citotoksiškumą, nustatyta didžiausia netoksiška didžiųjų dilgėlių žolės baltymų
frakcijos koncentracija (800 µg lėkštelėje). Pradedant nuo šios koncentracijos, Urtica dioica L. žolės
baltymų frakcijos praskiestos serijiniu būdu (praskiedimo santykis 1:2), ir tyrimui naudotos
koncentracijos: 50 µg, 100 µg, 200 µg, 400 µg ir 800 µg. Atsižvelgiant į Ekonominio
bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) gaires (1997), įvertinamas lektinais praturtintos
26
Urtica dioica L. žolės baltymų frakcijos tirpumas galutiniame veikimo mišinyje. Netirpumas gali būti
nustatomas atliekant bandymą ir stebint precipitato susidarymą galutiniame veikimo mišinyje.
Didžiųjų dilgėlių žolės baltymų frakcijos mutageniškumas tiriamas, naudojant išankstinės
inkubacijos būdą (Green & Muriel, 1976; Maron & Ames, 1983). Kaip etaloninės medžiagos (teigiami
kontroliniai mėginiai) naudojami šie mutagenai: 2-nitrofluorenas (2-NF) (2 µg/lėkštelėje su S.
typhimurium TA98 ir be S9 metabolinės aktyvacijos sistemos), 2-aminoantracenas (2-AA) (1
µg/lėkštelėje su S. typhimurium TA98 ir S9 metabolinės aktyvacijos sistema; 1 µg/lėkštelėje su S.
typhimurium TA100 ir S9 metabolinės aktyvacijos sistema; 10 µg/lėkštelėje su E. coli WP2uvrA ir S9
metabolinės aktyvacijos sistema); natrio azidas (SA) (1 µg/lėkštelėje su S. typhimurium TA100 ir be
S9 metabolinės aktyvacijos sistemos), metilmetano sulfonatas (MMS) (500 µg/lėkštelėje su E. coli
WP2uvrA ir be S9 metabolinės aktyvacijos sistemos). Tirpiklis (dimetilsulfoksidas) naudojamas kaip
neigiamas kontrolinis mėginys.
Per naktį inkubuotos bakterijų kultūros (100 µl) įdedamos į didžiųjų dilgėlių žolės baltymų
frakciją arba į mutagenų tirpalus (50 µl), o po to – į S9 metabolinės aktyvacijos sistemos mišinį arba
500 µl fosfatinį buferį (0.1 M). Mišiniai keletą kartų iš lėto pavartomi steriliuose mėgintuvėliuose, po
to purtomi kratytuvo pagalba ir inkubuojami (37 °C, 30 min). Pasibaigus išankstinei inkubacijai, TA98
ir TA100 kamienai padengiami agaru (2 ml), turinčiu 10 proc. histidino/biotino (0.5 mM), o WP2uvrA
kamienas – agaru, turinčiu 10 proc. triptofano (0.5 mM). Mišiniai iš lėto pavartomi ir užpilami ant
minimalaus agaro, turinčio minimalios Vogel-Bonner terpės ir gliukozės. Lėkštelės inkubuojamos (37
°C, 72 h) ir skaičiuojamos revertantų kolonijos, galinčios sintetinti histidiną arba triptofaną.
Eksperimentai kartojami du kartus, o kiekviena koncentracija tiriama trijuose
mėgintuvėliuose. Mutageninio tyrimo teigiamas atsakas apibūdinamas kaip nuo histidino ir triptofano
nepriklausomų revertantų kolonijų skaičiaus padidėjimas (bent du kartus didesnis už neigiamą
kontrolinį bandymą) kiekviename bakterijų kamiene (Ames et al., 1975).
5.4.1.5. Antimutagenininio aktyvumo nustatymas
Antimutageniškumas nustatomas, naudojant tokias pačias baltymų frakcijų koncentracijas
kaip ir mutageniškumo tyrime (50 µg, 100 µg, 200 µg, 400 µg, 800 µg). Lektinais praturtintų baltymų
frakcijų antimutageniškumas tiriamas išankstinės inkubacijos būdu (Edenharder & Tang, 1997).
Lektinais praturtintos Urtica dioica L. žolės baltymų frakcijos antimutageninis aktyvumas nustatomas
prieš mutagenus: 2-nitrofluoreną (2-NF) (6 µg/lėkštelėje su S. typhimurium TA98 ir be S9 metabolinės
aktyvacijos sistemos), 2-aminoantraceną (2-AA) (5 µg/lėkštelėje su S. typhimurium TA98 ir S9
metabolinės aktyvacijos sistema; 5 µg/lėkštelėje su S. typhimurium TA100 ir S9 metabolinės
27
aktyvacijos sistema; 25 µg/lėkštelėje su E. coli WP2uvrA ir S9 metabolinės aktyvacijos sistema),
natrio azidą (SA) (5 µg/lėkštelėje su S. typhimurium TA100 ir be S9 metabolinės aktyvacijos
sistemos), metilmetano sulfonatą (MMS) (1700 µg/lėkštelėje su E. coli WP2uvrA ir be S9 metabolinės
aktyvacijos sistemos) (1 lentelė). Šios mutagenų koncentracijos pasirinktos dėl to, kad sukelia
submaksimalų (mažesnį nei maksimalų – 70 proc.) mutageninį poveikį. Lėkštelės su mutagenais (100
proc. mutageninis aktyvumas) arba tirpikliu (DMSO 2 proc. v/v; be mutageninio aktyvumo) taip pat
įtraukiamos į tyrimą. Ištiriamos ir lėkštelės su bakterijų kamienais bei lektinais praturtinta didžiųjų
dilgėlių baltymų frakcija, nes revertantų kolonijų skaičius gali sumažėti ir dėl citotoksinio poveikio.
Lentelė Nr. 1. Mutagenai, naudoti baltymų frakcijos, praturtintos lektinais, išskirtos iš Urtica dioica
L. žolės, antimutageninio aktyvumo tyrime.
Mutagenas [µg/Petri
lėkštelė] TA98 TA100 WP2uvrA S9 frakcija PBS
2-NF [6] + +
2-AA [5] + +
[5] + +
[25] + +
SA [5] + +
MMS [1700] + +
Per naktį inkubuotos bakterijų kultūros (100 µl), mutagenai, didžiųjų dilgėlių žolės baltymų
frakcija, praturtinta lektinais, ir S9 metabolinės aktyvacijos sistemos mišinys arba fosfatinis buferis 0.1
M (500 µl) purtomi kratytuvo pagalba ir po to inkubuojami (37 °C, 30 min). Pasibaigus išankstinei
inkubacijai, TA98 ir TA100 kamienai padengiami agaru (2 ml), turinčiu 10 proc. histidino/biotino (0.5
mM), o WP2uvrA kamienas – agaru, turinčiu 10 proc. triptofano (0.5 mM). Mišiniai iš lėto pavartomi
ir užpilami ant minimalaus agaro, turinčio minimalios Vogel-Bonner terpės ir gliukozės. Lėkštelės
inkubuojamos (37 °C, 72 h) ir skaičiuojamos revertantų kolonijos, galinčios sintetinti histidiną arba
triptofaną.
Kiekvienos lektinais praturtintos baltymų frakcijos koncentracijos bandinys tiriamas trijose
lėkštelėse ir kiekvienas eksperimentas pakartojamas du kartus. Antimutageniškumas apskaičiuojamas
kaip mutageninio poveikio slopinimo procentinis santykis (1 formulė).
28
Inhibicija % = 100 –𝑇𝑀 × 100
1 formulė
Kur T – revertantų kolonijų skaičius lėkštelėje su mutagenu ir tiriamąja medžiaga, M –
revertantų kolonijų skaičius lėkštelėje tik su mutagenu.
Pagal Negi ir kt. (2003) antimutageninis poveikis yra stiprus, kai inhibicija didesnė nei 40
proc., o vidutinis – kai inhibicija 25-40 proc.. Mažesnė nei 25 proc. inhibicija laikoma silpna.
5.4.2. MTT dažo redukcijos reakcijos metodas
5.4.2.1. HepG2 ląstelių linija
Tyrimui pasirinkta žmogaus kepenų vėžio HepG2 ląstelių linija, nes ji išsaugo gerai
diferencijuotų hepatocitų savybes ir turi stiprų metabolinį citochromo P450 aktyvumą (Silvers et al.,
1997). HepG2 ląstelės laikomos standartinėse sąlygose (37°C, 5 proc. CO2, 95 proc. drėgmė),
auginamos DMEM-Ham’s F12 terpėje, pridedant 5 proc. jaučio vaisiaus serumo, 100 U/ml penicilino
ir 100 µg/ml streptomicino 75 cm2 flakonuose. Ląstelės subkultivuojamos (periodiškai kultivuojamos)
kas 4 dienas. Auginimo terpė atnaujinama kas 2-3 dienas.
5.4.2.2. Citotoksinio aktyvumo nustatymas
Citotoksiškumas nustatomas MTT dažo redukcijos reakcijos metodu, įvertinant didžiųjų
dilgėlių žolės lektinų poveikį mitochondrijų funkcijai (ląstelės gyvybingumo rodikliui) (Vitalone et al.,
2011). Metodas yra paremtas mitochondrijos dehidrogenazės vykdoma tetrazolio druskos konversija į
netirpų violetinės spalvos formazaną. MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il-)-2,5-difeniltetrazolio bromidas)
ištirpinamas fosfatinio buferio druskos tirpale (PBS) (5 mg/ml). Atliekant bandymą, HepG2 ląstelės
užnešamos ant 24 duobučių plokštelių (5 x 104 ląstelių vienoje duobutėje). Po 48 valandų ląstelės
paveikiamos Urtica dioica L. žolės baltymų frakcijų serijiniais praskiedimais (0.06 – 2 mg/ml, 1:2
praskiedimo santykis). Šios koncentracijos pasirinktos, atsižvelgiant į literatūros šaltiniuose nurodytas
ankstesniuose tyrimuose naudotas lektinų koncentracijas (Wong et al., 2003). Po 24 valandų veikimo, į
kiekvieną duobutę įpilama po 30 µl MTT tirpalo ir inkubuojama. Pasibaigus inkubacijai (80 min,
37°C), terpė atsargiai pašalinama. Į kiekvieną duobutę įpilama po 250 µl dimetilsulfoksido ir 24
29
duobučių plokštelės kratomos 5 minutes, kol ištirpsta formazanas. Violetinės spalvos absorbcija
išmatuojama mikroplokštelių analizatoriumi (bangos ilgis 595 nm). Kiekvienos baltymų frakcijos
koncentracijos bandinys ištirtas trijose duobutėse ir kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas bent du
kartus.
5.4.3. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas
Urtica dioica L. žolės lektinais praturtintų baltymų frakcijų antioksidacinio aktyvumo
nustatymo testai atliekami 96 duobučių plokštelėse toliau nuo tiesioginių saulės spindulių.
Antioksidacinis aktyvumas tiriamas kaip frakcijos gebėjimas surišti radikalus ir apskaičiuojamas pagal
neigiamą kontrolinį bandymą kaip procentinė inhibicija. Kiekviena frakcijos koncentracija tiriama
trijose duobutėse ir kiekvienas eksperimentas pakartojamas du kartus. Absorbcijos pokytis
išmatuojamas mikroplokštelių spektrofotometru. Tyrimui pripildomos ir duobutės tik su Urtica dioica
L. frakcija, kad būtų nustatyta jos galima absorbcija.
5.4.3.1. Antioksidacinio aktyvumo tyrimas, naudojant 2,2-azino-bis-(3-
etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) (ABTS·+) modelinį radikalą
ABTS·+ radikalo sujungimo testas atliekamas pagal Kim ir kt. (2002). Vienodi ABTS (5
mM) ir radikalinio iniciatoriaus AAPH (2 mM) tirpalų kiekiai sumaišomi ir inkubuojami (68 °C, 45
min.), norint paruošti ABTS·+ radikalo tirpalą. Gautas tirpalas praskiedžiamas su fosfatinio buferio
druskos tirpalu (PBS) (0.1 M; pH = 7.0). Skirtingų koncentracijų (0.1 – 640 µg/ml) lektinų turinčios
Urtica dioica L. frakcijos tirpalai (20 µl) įpilami į ABTS·+ radikalo tirpalą (180 µl) ir inkubuojami (37
°C, 10 min). Teigiamam kontroliniam mėginiui naudojamas troloksas, o neigiamam kontroliniam
mėginiui – ABTS·+ radikalo tirpalas. Po inkubacijos absorbcijos pokytis išmatuojamas
spektrofotometru (bangos ilgis 734 nm).
5.4.3.2. Antioksidacinio aktyvumo tyrimas, naudojant superoksido anijono
modelinį radikalą
Superoksido anijono radikalų sujungimo testas atliekamas pagal Verma ir kt. (2008). 50 µl
nitro mėlynojo tetrazolio tirpalo (NBT, 0.27 mM) įpilama į vienodą kiekį nikotinamido adenino
30
dinukleotido tirpalą (NADH, 0.84 mM). Mišinys sumaišomas su skirtingų koncentracijų (4 – 1200
µg/ml) didžiųjų dilgėlių lektinais praturtintų baltymų frakcijų tirpalais (90 µl). Reakcijos pradžioje į
mišinį įpilama 10 µl fenazino metosulfato tirpalo (PMS, 60.0 µM). Susidaręs mišinys inkubuojamas 5
minutes 25 °C temperatūroje. Neigiamam kontroliniam mėginiui naudojamas NBT/NADH/PMS
mišinys, o teigiamam kontroliniam mėginiui – troloksas su NBT/NADH/PMS mišiniu. Po inkubacijos
absorbcijos pokytis išmatuojamas spektrofotometru (bangos ilgis 560 nm).
5.4.4. Statistinė analizė
Statistinė analizė atlikta su GraphPad Prism™ 4.00 programine įranga (GraphPad Software,
Inc., San Diegas, Kalifornija, JAV). Rezultatai išreikšti kaip vidurkiai ± SEM. Vienos krypties
variacinė analizė (vienos krypties ANOVA, Dunnett’s Multiple Comparison Post Test) naudojama,
įrodant teigiamo atsako reikšmingumą. Kai P<0.05, rezultatai laikomi statistiškai reikšmingi.
6. REZULTATAI
6.1. Antimutageninio aktyvumo tyrimo rezultatai
Lektinais praturtintos Urtica dioica L. žolės baltymų frakcijos lėkštelėje nuosėdų nesudarė,
kol buvo pasiekta 800 µg koncentracija, taip pat neturėjo ir citotoksinio poveikio. Taigi, mutageninio
aktyvumo tyrimui ši koncentracija pasirinkta kaip didžiausia koncentracija.
Lentelė Nr. 2. Urtica dioica L. lektinų turinčios baltymų frakcijos citototoksinis poveikis revertantų kolonijoms Salmonella typhimurium TA98 ir TA100, Escherichia coli WP2uvrA kamienuose (n=6,
(± SEM ), (p < 0.05)).
[µg/Petri lėkštelė]
Revertantų kolonijų skaičius
TA98 TA100 WP2uvrA
Urtica dioica
L. žolės
baltymų
frakcija
1000 80.7 ± 3.1 322.4 ± 8.3 99.1 ± 1.9
1200 64.3 ± 1.4 303.1 ± 9.4 87.0 ± 2.1
1500 43.1 ± 0.5 270.4 ± 4.2 71.9 ± 1.1
31
Urtica dioica L. žolės baltymų (lektinų) frakcija (koncentracijos 50 µg, 100 µg, 200 µg, 400
µg, 800 µg) nesukėlė reikšmingo revertantų kolonijų skaičiaus padidėjimo visuose tirtuose bakterijų
kamienuose su ar be S9 metabolinės aktyvacijos sistemos. Galime teigti, kad didžiųjų dilgėlių žolės
baltymų (lektinų) frakcija neturėjo mutageninio poveikio. Šie rezultatai leido toliau tirti frakcijos
gebėjimą slopinti mutagenų (2-NF, SA, MMS ir 2-AA) poveikį.
Antimutageninis aktyvumas įvertintas kaip didžiųjų dilgėlių žolės baltymų frakcijos geba
inhibuoti 2-nitrofluoreno (2-NF), 2-aminoantraceno (2-AA), natrio azido (SA) ir metilmetano
sulfonato (MMS) mutageninį poveikį. Lektinais praturtinta baltymų frakcija parodė statistiškai
reikšmingą ir nuo koncentracijos priklausantį antimutageninį poveikį prieš mutageną 2-
aminoantraceną (2-AA) visuose tirtuose bakterijų kamienuose (1 pav.).
1 pav. Urtica dioica L. žolės baltymų frakcijos, praturtintos lektinais, poveikis 2-aminoantraceno (2-AA) indukuotų revertantų kolonijų skaičiui Salmonella typhimurium TA98, TA100 ir Escherichia coli WP2uvrA kamienuose su S9 metabolinės aktyvacijos sistema (n=6,
(± SEM ), (p < 0.05)). Stiprus: inhibicija > 40 proc.; vidutinis: inhibicija 25 – 40 proc.; silpnas: inhibicija < 25 proc.. Koncentracijos ir atsako priklausomybės kreivė sudaryta, naudojant Hill
lygtį: E = Emax / [1 + (1050LogEC/A)HillSlope], kur E yra poveikis, esant tam tikrai agonisto
32
(medžiagos, sukeliančios atsaką; agonistas – Urtica dioica L. baltymų frakcija ) koncentracijai, Emax yra maksimalus poveikis, EC50 yra koncentracija, kuri sukelia 50 proc. atsaką, A yra
molinė agonisto koncentracija, HillSlope yra agonisto kreivės nuolydis. Remiantis Negi ir kt. (2003), Urtica dioica L. žolės baltymų frakcijos, praturtintos lektinais,
antimutageninis poveikis prieš mutageną 2-aminoantraceną gali būti laikomas stipriu. Esant didžiausiai
didžiųjų dilgėlių žolės baltymų frakcijos koncentracijai (800 µg), antimutageninis poveikis pasiekė
maksimalią 56 proc., 78 proc. ir 61 proc. inhibiciją atitinkamai – TA98, TA100 ir WP2uvrA
kamienuose. Lektinais praturtina baltymų frakcija neturėjo antimutageninio poveikio (maksimali
inhibicija < 25 proc.) prieš 2-nitrofluoreną (2-NF), natrio azidą (SA) ir metilmetano sulfonatą (MMS)
(3 lentelė).
Lentelė Nr. 3. Urtica dioica L. lektinų turinčios baltymų frakcijos poveikis mutageno indukuotų revertantų kolonijų skaičiui Salmonella typhimurium TA98 ir TA100, Escherichia coli WP2uvrA
kamienuose be S9 metabolinės aktyvacijos sistemos (n=6, (± SEM ), (p < 0.05)).
[µg/Petri lėkštelė]
Revertantų kolonijų skaičius
TA98 TA100 WP2uvrA
-S9 -S9 -S9
Urtica dioica
L. žolės
baltymų
frakcija
50 117.8 ± 1.5 617.6 ± 10.9 135.5 ± 5.7
100 119.7 ± 2.9 619.8 ± 18.2 131.1 ± 1.9
200 118.4 ± 3.2 529.8 ± 6.5 133.7 ± 3.9 400 119.4 ± 1.1 531.4 ± 9.5 148.3 ± 5.2
800 119.1 ± 1.2 576.0 ± 9.2 139.3 ± 8.6 Tirpiklis 44.7 ± 1.3a§ 123.0 ± 4.3b§ 37.3 ± 1.1b§
Mutagenas 149.4 ± 2.3c 683.9 ± 24.2d 148.7 ± 2.2e aDMSO 50 µl; bH2O 25 µl + DMSO 25 µl. c2-nitrofluorenas (6 µg/Petri lėkštelė); dnatrio azidas (5 µg/Petri lėkštelė); emetilmetano sulfonatas (1700 µg/Petri lėkštelė). §reikšmingas skirtumas tarp mutageno ir tirpiklio (p < 0.01; Anova + Dunnett's Multiple Comparison Post Test).
33
6.2. Citotoksinio aktyvumo tyrimo rezultatai
Lektinais praturtintos Urtica dioica L. žolės baltymų frakcijos nesumažino HepG2 ląstelių
gyvybingumo nei po 24 valandų (2 pav.), nei po 48 valandų (3 pav.) veikimo. IC50 vertė buvo didesnė
nei tirta aukščiausia koncentracija (> 2 mg/ml).
2 pav. Urtica dioica L. lektinų turinčios baltymų frakcijos poveikis HepG2 ląstelių proliferacijai po 24 valandų poveikio (n=6, (±SEM), (p < 0.05). Koncentracijos ir atsako
priklausomybės kreivė sudaryta, naudojant Hill lygtį: E = Emax/ [1 + (1050LogEC/A)HillSlope], kur
E yra poveikis, esant tam tikrai agonisto (medžiagos, sukeliančios atsaką) koncentracijai, Emax yra maksimalus poveikis, EC50 yra koncentracija, kuri sukelia 50 proc. atsaką, A yra
molinė agonisto koncentracija, HillSlope yra agonisto kreivės nuolydis.
34
3 pav. Urtica dioica L. lektinų turinčios baltymų frakcijos poveikis HepG2 ląstelių proliferacijai po 48 valandų poveikio (n=6, (±SEM), (p < 0.05)). Koncentracijos ir atsako
priklausomybės kreivė sudaryta, naudojant Hill lygtį: E = Emax/ [1 + (1050LogEC/A)HillSlope], kur
E yra poveikis, esant tam tikrai agonisto (medžiagos, sukeliančios atsaką) koncentracijai, Emax yra maksimalus poveikis, EC50 yra koncentracija, kuri sukelia 50 proc. atsaką, A yra
molinė agonisto koncentracija, HillSlope yra agonisto kreivės nuolydis.
6.3. Antioksidacinio aktyvumo tyrimo rezultatai
6.3.1. Antioksidacinio aktyvumo testo, naudojant 2,2-azino-bis-(3-
etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) (ABTS·+) modelinį radikalą, rezultatai
Stebėta ABTS radikalo inhibicijos tiesioginė priklausomybė nuo koncentracijos, kuri pasiekė
maksimumą (apie 93.8 proc. antioksidacinį aktyvumą), kai lektinais praturtintos frakcijos
35
koncentracija buvo 120 ± 1.1 µg/ml (4 pav.). IC50 vertė, gauta pagal tiesinės regresijos analizę, buvo
19.9 ± 1.0 µg/ml (Nuolydis = 1.45 ± 0.14; R2 = 0.998) ir atitiko 2.46 ± 0.2 µg/ml trolokso ekvivalentų.
4 pav. ABTS radikalo inhibicijos tiesioginė priklausomybė nuo Urtica dioica L. lektinų turinčios baltymų frakcijos koncentracijos (Nuolydis = 1.45 ± 0.14; R2 = 0.998; n=6; (± SEM); (p < 0.05)).
Koncentracijos ir atsako priklausomybės kreivė sudaryta, naudojant Hill lygtį: E = Emax/ [1 + (1050
LogEC/A)HillSlope], kur E yra poveikis, esant tam tikrai agonisto (medžiagos, sukeliančios atsaką) koncentracijai, Emax yra maksimalus poveikis, EC50 yra koncentracija, kuri sukelia 50 proc. atsaką,
A yra molinė agonisto koncentracija, HillSlope yra agonisto kreivės nuolydis.
6.3.2. Antioksidacinio aktyvumo testo, naudojant superoksido anijono
modelinį radikalą, rezultatai
Superoksido anijono inhibicija taip pat priklausė nuo koncentracijos ir pasiekė maksimumą
(apie 90.2 proc. antioksidacinį aktyvumą), kai lektinais praturtintos frakcijos koncentracija buvo 400 ±
36
1.2 µg/ml (5 pav.). IC50 vertė, gauta pagal tiesinės regresijos analizę, buvo 75.3 ± 0.9 µg/ml (Nuolydis
= 2.69 ± 0.11; R2 = 0.999) ir atitiko 309.6 ± 6.1 µg/ml trolokso ekvivalentų.
5 pav. Superoksido anijono inhibicijos tiesioginė priklausomybė nuo Urtica dioica L. lektinų
turinčios baltymų frakcijos koncentracijos (Nuolydis = 2.69 ± 0.11; R2 = 0.999; n=6; (± SEM); (p < 0.05). Koncentracijos ir atsako priklausomybės kreivė sudaryta, naudojant Hill lygtį: E =
Emax/ [1 + (1050LogEC/A)HillSlope], kur E yra poveikis, esant tam tikrai agonisto (medžiagos,
sukeliančios atsaką) koncentracijai, Emax yra maksimalus poveikis, EC50 yra koncentracija, kuri sukelia 50 proc. atsaką, A yra molinė agonisto koncentracija, HillSlope yra agonisto
kreivės nuolydis.
7. REZULTATŲ APTARIMAS
AMES testas (grįžtamosios mutacijos modelis in vitro) yra greitas būdas ištirti medžiagos
antikancerogeninį potencialą. Tyrimui naudoti mutaciją turintys Salmonella typhimurium TA98,
TA100 ir Escherichia coli WP2uvrA kamienai. Veikiant mutagenams, bakterijų kamienai sugrąžinami
į būklę, kai gali sintetinti pagrindinę aminorūgštį ir sudaryti kolonijas terpėje be histidino arba
triptofano. Mutagenai gali būti tiesioginio veikimo (2-NF, SA, MMS) arba reikalauti metabolinės
37
aktyvacijos (2-AA). Pridedant antimutageninių medžiagų, žymiai sumažėja mutagenų vykdomos
grįžtamosios mutacijos galimybė. Antimutagenai gali apsaugoti nuo mutageninės medžiagos virtimo į
aktyvią jos formą, inaktyvuoti mutageną arba neleisti įvykti reakcijai tarp mutageno ir DNR (Firdous
et al., 2010; Bhattacharya, 2011). Mutagenai dalyvauja vėžio ir kitų ligų iniciacijos stadijoje ir
patogenezėje, dėl to naujų augalinių junginių, turinčių antimutageninių savybių, atradimas turi didelę
svarbą. Nors ir įrodytos augalinių lektinų, ypač kaip priešvėžinių junginių, sukeliančių apoptozę ir
autofagiją, chemoprevencinės savybės, tačiau atlikti tik keli jų antimutageninio aktyvumo tyrimai
(Bhattacharya, 2011; Liu et al., 2010; Hong & Lyu, 2012).
Lektinų turinčios didžiųjų dilgėlių žolės baltymų frakcijos antimutageninio tyrimo rezultatai
atitinka anksčiau atliktų tyrimų rezultatus, kuriuose Viscum album L. lektinas taip pat turėjo
antimutageninį poveikį prieš 2-aminoantraceną (2-AA) (Kovalenko & Lukash, 2007; Inglum et al.,
2011; Hong & Lyu, 2012). 2-aminoantracenas (2-AA) yra kancerogenas, kuris dažnai susidaro
aukštoje temperatūroje, verdant ir kepant mėsą, žuvį arba nepilno organinių junginių sudegimo metu.
Šis mutagenas yra pripažintas vienu iš pagrindinių kancerogeninių pavojų sveikatai, susijusių su darbo
aplinka ir maisto vartojimu (Diggs et al., 2011). 2-aminoantracenui (2-AA) reikia CYP450 ir kitų
mikrosominių fermentų vykdomos metabolinės aktyvacijos, kad jis pavirstų į aktyvią kancerogeninę
formą (De Flora et al., 1994; Oda et al., 2001). Jo pagrindinis reaktyvus darinys yra N-
hidroksiarilaminas, kuris įsiterpia į DNR ir skatina DNR pažaidų formavimąsi (Sabbioni & Jones,
2002). Atsižvelgiant į šias 2-aminoantraceno (2-AA) savybes ir į tai, kad lektinais praturtintos Urtica
dioica L. žolės frakcijos parodė panašaus stiprumo ir nuo koncentracijos priklausančią inhibiciją
visuose tirtuose bakterijų kamienuose, galima pateikti hipotezę, kad didžiųjų dilgėlių baltymų frakcijos
inhibavo CYP450 izofermentus, kurie yra atsakingi už 2-aminoantraceno (2-AA) bioaktyvaciją.
Kancerogenų metabolizmo keitimas yra vienas iš veiksmingiausių ir gerai žinomų ląstelių
apsaugojimo nuo kancerogeninių medžiagų būdų (Talalay, 2000).
Tyrime naudotos bakterijos yra prokariotinės ląstelės, kurios skiriasi nuo žinduolių ląstelių
savo metabolizmu, medžiagų transportu į ląstelę, chromosomų struktūra ir DNR pažaidų atstatymo
procesais. S9 metabolinės aktyvacijos sistema nėra identiška žinduolių metabolinės aktyvacijos
sąlygoms in vivo (OECD, 1997). Taigi, bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymu gauti rezultatai
paskatina atlikti tolimesius tyrimus, kad lektinais praturtintos Urtica dioica L. žolės baltymų frakcijų
antimutageniškumas būtų nustatytas žinduolių ląstelėse.
Urtica dioica L. žolės baltymų frakcijos neveikė citotoksiškai HepG2 ląstelių. Priešingai,
Urtica dioica L. lapų vandeninis ekstraktas turėjo slopinamąjį poveikį žmogaus krūties vėžio MCF-7
ląstelių proliferacijai (Fattahi et al., 2013), o 20 proc. metanolinis šaknų ekstraktas slopino prostatos
vėžio ląstelių augimą (Konrad et al., 2000). Šie rezultatai gali neatitikti dėl skirtingos lektinais
praturtintų baltymų frakcijų sudėties arba vėžinių ląstelių jautrumo. Atlikto MTT metodo metu
38
tetrazolio druska pavirto į netirpų violetinės spalvos formazaną, nes HepG2 ląstelių mitochondrijų
funkcija buvo nepažeista. Didžiųjų dilgėlių žolės baltymų frakcijų citotoksiškumui apibūdinti
reikalingi tolimesni tyrimai. Rekomenduojama ištirti galimą citotoksiškumą kitais in vitro metodais,
kuriais nustatomi skirtingose ląstelės vietose, pavyzdžiui, membranoje, branduolyje, vykstantys
apoptozės procesai (Jurišić & Bumbaširević, 2008).
Lektinų turinčios didžiųjų dilgėlių žolės baltymų frakcijos parodė stiprų antiradikalinį
aktyvumą prieš ABTS radikalą ir superoksido anijoną. Šis aktyvumas buvo ypač stiprus prieš
superoksido anijoną, nes lektinų turinčios Urtica dioica L. frakcijos pusinė maksimali inhibicinė
koncentracija (IC50) buvo net keturis kartus mažesnė už etaloninės medžiagos trolokso IC50.
Superoksido anijonas susidaro ląstelės metabolizmo metu ir yra vienas iš reaktyvaus deguonies rūšių
(ROS). Sutrikus ląstelės metabolizmui, reaktyvių deguonies junginių gali susidaryti daugiau ir gali
nepakakti fiziologinio antioksidacinio mechanizmo, šiuos radikalus nukenksminant. Tokiu atveju
pažeidžiami ląstelės DNR, baltymai ir lipidai (Ames et al., 1993). Norint išlaikyti ląstelės redokso
homeostazę, galima vartoti natūralius antioksidantus, kurie sumažina ROS sukeliamą žalą ir palaiko
fiziologines organizmo funkcijas.
Antiradikalinis lektinų turinčių didžiųjų dilgėlių žolės baltymų frakcijų aktyvumas gali būti
vienas iš jos desmutageninio veikimo mechanizmų, nes 2-aminoantracenas, sukeldamas genotoksinę
žalą, taip pat skatina ROS rūšių susidarymą (Murata & Kawanishi, 2011). Struktūriniu požiūriu už
lektinų turinčių Urtica dioica L. frakcijų antioksidacinį aktyvumą gali būti atsakinga lektinų
aminorūgščių struktūra (Hou et al., 2001; Yagi et al., 2003; Carrasco-Castilla et al., 2012). Nors Urtica
dioica L. lektinais praturtintų frakcijų baltymų seka dar nėra apibrėžta, yra žinoma, kad nukleofilinį
sieros atomą turintys cisteinas (Cys) ir metioninas (Met), aromatinių aminorūgščių triptofano (Trp),
tirozino (Tyr) ir fenilalanino (Phe) liekanos gali lengvai atiduoti vandenilio atomus ir todėl manoma,
kad šios aminorūgštys yra atsakingos už antioksidacinį aktyvumą (Chen et al., 1996).
8. IŠVADOS
1. Atlikus bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymą, Urtica dioica L. žolės lektinais
praturtintos baltymų frakcijos parodė stiprų antimutageninį aktyvumą prieš mutageną 2-
aminoantraceną (2-AA) S. typhimurium TA98, S. typhimurium TA100 ir E. coli WP2uvrA
kamienuose.
2. MTT bandymo metu didžiųjų dilgėlių žolės lektinų turinčios baltymų frakcijos neinhibavo
HepG2 ląstelių proliferacijos.
39
3. Baltymų frakcijos, praturtintos lektinais, parodė stiprų antioksidacinį aktyvumą prieš ABTS
ir superoksido radikalus.
40
9. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Savickienė N, Baniulis D, Bendokas V, Balčiūnaitė G, Drakšienė, Pečiūra R, Šernienė L. Research
update: Lectin enriched fractions of herb and dry extract of Urtica dioica L.. Journal of Medicinal
Plants Research 2012;6(5):888-892.
2. Ames BN, Mc Cann J, Yamasaki E. Methods for detecting carcinogens and mutagens with the
Salmonella/mammalian-microsome mutagenicity test. Mutat Res 1975;31:347-364.
3. Ames BN, Shigenaga MK, Hagen TM. Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of
aging. Proc Natl Acad Sci 1993;90:7915-7922.
4. Ashraf MT, Khan RH. Mitogenic lectins. Med Sci Monit 2003;9(11):265-269.
5. Bah SF, Fang EF, Ng TB. Medicinal applications of plant lectins. In: Fang EF, Ng TB. Antitumor
potential and other emerging medicinal properties of natural compounds. Dordrecht: Springer;
2013. p. 55-74.
6. Bhattacharya S. Natural Antimutagens: A Review. Research Journal of Medicinal Plant
2011;5:116-126.
7. Biro-Sandor Z. Assesment report on Urtica dioica L., Urtica urens L., their hybrids or theirs
mixtures, radix. London: European Medicines agency; 2012.
8. Biro-Sandor Z. Assessment report on Urtica dioica L., and Urtica urens L., herba. London:
European Medicines Agency; 2008.
9. Brusick DJ, Simmon VF, Rosenkranz HS, Ray VA, Stafford RS. An evaluation of the Escherichia
coli WP2 and WP2 uvrA reverse mutation assay. Mutation Research 1980;76:169-190.
10. Capasso F, Grandolini G, Izzo AA. Fitoterapia: impiego razionale delle droghe vegetali. Milano:
Springer-Verlag Italia; 2006. p. 664-666.
11. Carrasco-Castilla J, Hernández-Álvarez AJ, Jiménez-Martínez C, Jacinto-Hernández C, Alaiz M,
Girón-Calle J, Vioque J, Dávila-Ortiz G. Antioxidant and metal chelating activities of peptide
fractions from phaseolin and bean protein hydrolysates. Food Chem 2012;135(3):1789-95.
12. Chen HM, Muramoto K, Yamauchi F, Nokihara K. Antioxidant activity of designed peptides based
on the antioxidative peptide isolated from digests of a soybean protein. Journal of Agricultural and
Food Chemistry 1996;44(9):2619-2623.
13. Chrubasik JE, Roufogalis BD, Wagner H, Chrubasik SA. A comprehensive review on nettle effect
and efficacy profiles, Part I: Herba urticae. Phytomedicine 2007; 14(6):423-435.
14. Dar SA, Ganai FA, Yousuf AR, Balkhi MU, Bhat TM, Sharma P. Pharmacological and
toxicological evaluation of Urtica dioica. Pharm Biol 2013;51(2):170-80.
15. De Flora S, Bennicelli C, D'Agostmi F, Izzotti A, Camoirano A. Cytosolic activation of aromatic
and heterocyclic amines. Inhibition by dicoumarol and enhancement in viral hepatitis B.
41
Environmental Health Perspectives 1994;102:69-74.
16. De Mejía EG, Prisecaru VI. Lectins as Bioactive Plant Proteins: A Potential in Cancer Treatment.
Critical Reviews in Food Science and Nutrition 2005;45:6, 425-445.
17. De Marini DM. Influence of DNA repair on mutation spectra in Salmonella. Mutation Research
2000;450:5-17.
18. Di Sotto A, Di Giacomo S, Vitalone A, Nicoletti M, Mazzanti G. Antimutagenic Thio Compounds
from Sisymbrium officinale. Journal of Natural Products 2012;75(12):2062-2068.
19. Diggs DL, Huderson AC, Harris KL, Myers JN, Banks LD, Rekhadevi PV, Niaz MS, Ramesh A.
Polycyclic aromatic hydrocarbons and digestive tract cancers: A perspective. Journal of
Environmental Science and Health 2011;29:324-357. 20. Edenharder R, Tang X. Inhibition of the mutagenicity of 2-nitrofluorene, 3- nitrofluoranthene and
1-nitropyrene by flavonoids, coumarins, quinones and other phenolic compounds. Food Chem
Toxicol 1997;35:357-372.
21. Fattahi S, Ardekani AM, Zabihi E, Abedian Z, Mostafazadeh A, Pourbagher R, Akhavan-Niaki H.
Antioxidant and apoptotic effects of an aqueous extract of Urtica dioica on the MCF-7 human
breast cancer cell line. Asian Pac J Cancer Prev 2013;14(9):5317-23.
22. Firdous AP, Sindhu ER, Ramnath V, Kuttan R. Antimutagenic and anti-carcinogenic potential of
the carotenoid mesozeaxanthin. Asian Pac J Cancer Prev 2010;6:1795-1800.
23. Francois KO, Auwerx J, Schols D, Balzarini J. Simian immunodeficiency virus is susceptible to
inhibition by carbohydrate-binding agents in a manner similar to that of HIV: implications for
further preclinical drug development. Mol Pharmacol 2008;74:330-337.
24. Galelli A, Truffa-Bachi P. Urtica dioica agglutinin. A superantigenic lectin from stinging nettle
rhizome. J Immunol 1993;151(4):1821-31.
25. Green MH, Muriel WJ. Mutagen testing using TRP+ reversion in Escherichia coli. Mutat Res
1976;38:3-32.
26. Gülçin I, Küfrevioǧlu OI, Oktay M, Büyükokuroǧluc ME. Antioxidant, antimicrobial, antiulcer
and analgesic activities of nettle (Urtica dioica L.). Journal of Ethnopharmacology 2004;90(2-
3):205-15.
27. Hong CE, Lyu SY. The antimutagenic effect of mistletoe lectin (Viscum album L. var. coloratum
agglutinin). Phytother Res 2012;26(5):787-90.
28. Hou WC, Lee MH, Chen HJ, Liang WL, Han CH, Liu YW, Lin YH. Antioxidant activities of
dioscorin, the storage protein of yam (Dioscorea batatas Decne) tuber. J Agric Food Chem
2001;49(10):4956-60.
29. Inglum P, Roytrakul S, Wetprasit N, Saengprakai J, Ratanapo S. Leucocephalin, a new lectin with
antimutagenicity from seed of Leucaena leucocephala. In: Proceedings of the 49th Kasetsart
42
University Annual Conference. Volume 1. Subject: Plants 2011. p. 496-505.
30. Jurišić V, Bumbaširević V. In vitro assays for cell death determination. Arch Oncol 2008;16(3-
4):49-54.
31. Khan JA, Jalal JA, Ioanndes C, Moselhy SS. Assessment of the antimutagenic effect of Doash tea
extract fractions. Toxicol Ind Health November 2012;28:867-875.
32. Kim DO, Lee KW, Lee HJ, Lee CY. Vitamin C equivalent antioxidant capacity (VCEAC) of
phenolic phytochemicals. J Agric Food Chem 2002;50(13):3713-7.
33. Konrad L, Müller HH, Lenz C, Laubinger H, Aumüller G, Lichius JJ. Antiproliferative effect on
human prostate cancer cells by a stinging nettle root (Urtica dioica) Extract. Planta Med
2000;66(1): 44-47.
34. Kovalenko OO, Lukash LL. The antimutagenic effect of lectin and N-methyl- N'-nitro-N-
nitrosoguanidine on induced mutagenesis in mammalian cells in vitro. Cytology and Genetics
2007; 41(6):62-66. 35. Kumaki Y, Wandersee MK, Smith AJ, Zhou Y, Simmons G, Nelson NM, Bailey KW, Vest ZG, Li
JK, Kay-Sheung Chan P, Smee DF, Barnard DL. Inhibition of severe acute respiratory syndrome
coronavirus replication in a lethal SARS-CoV BALB/c mouse model by stinging nettle lectin,
Urtica dioica agglutinin. Antiviral Research 2011;90(1):22-32.
36. Lei Wu, Jin-ku Bao. Anti-tumor and anti-viral activities of Galanthus nivalis agglutinin (GNA)-
related lectins. Glycoconj J 2013;30:269-279.
37. Letizia P, Massimo B, Valentina F, Maria GB, Luigi B, Andrea B. Saporin induces multiple death
pathways in lymphoma cells with different intensity and timing as compared to ricin. Int J
Biochem Cell Biol 2009;41:1055-1061.
38. Levin DE, Ames BN. Classifying mutagens as to their specificity in causing the six possible
transitions and transversions: a simple analysis using the Salmonella mutagenicity assay.
Environmental Mutagenesis 1986;8:9-28.
39. Lin P, Ye X, Ng T. Purification of melibiose-binding lectins from two cultivars of Chinese black
soybeans. Acta Biochim Biophys Sin 2008;40:1029-1038.
40. Liu B, Bian HJ, Bao JK. Plant lectins: potential antineoplastic drugs from bench to clinic. Cancer
Lett 2010;287(1):1-12.
41. Liu B, Li CY, Bian HJ, Min MW, Chen LF, Bao JK. Antiproliferative activity and apoptosis-
inducing mechanism of Concanavalin A on human melanoma A375 cells. Arch Biochem Biophys
2009;482:1-6.
42. Macewicz LL, Suchorada OM, Lyubov LL. Influence of Sambucus nigra bark lectin on cell DNA
under different in vitro conditions. Cell Biology International 2005;29(1):29-32.
43. Maron DM, Ames BN. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutat Res
43
1983;113:173-215.
44. Michiels K, Van Damme EJM, Smagghe G. Plant – insect interactions: what can we learn from
plant lectins? Archives of insect Biochemistry and Physiology 2010;73(4):193-212.
45. Murata M, Kawanishi S. Mechanism of oxidative damage induced by carcinogenic arylamines.
Frontiers in Bioscience 2011;16:1132-1143.
46. Musette P, Galelli A, Chabre H, Callard P, Peumans W, Truffa-Bachi P, Kourilsky P, Gachelin G.
Urtica dioica agglutinin, a V beta 8.3-specific superantigen, prevents the development of the
systemic lupus erythematosus-like pathology of MRL lpr/lpr mice. Eur J Immunol 1996;26:1707-
1711.
47. Negi PS, Jayaprakasha GK, Jena BS. Antioxidant and antimutagenic activities of pomegranate peel
extracts. Food Chemistry 2003;80:393-397.
48. Nikolić B, Mitić-Ćulafić D, Vuković-Gačić B, Knežević-Vukčević J. Molecular Mechanisms of
Action of Antimutagens from Sage (Salvia officinalis) and Basil (Ocimum basilicum). In: Mishra
R. Mutagenesis. InTech; 2012.
49. Oda, Y, Aryal P, Terashita T, Gillam EM, Guengerich FP, Shimada T. Metabolic activation of
heterocyclic amines and other procarcinogens in Salmonella typhimurium tester strains expressing
human cytochrome P4501A1, 1A2, 1B1, 2C9, 2D6, 2E1, and 3A4 and human NADPH-P450
reductase and bacterial O-acetyltransferase. Mutation Research 2001;492:81-90.
50. OECD (Organisation for Economic Cooperation and Development). Guideline for the testing of
chemicals: bacteria reverse mutation test, Guideline 471, 1997.
51. Ohta T, Tokishita S, Tsunoi R, Ohmae S, Yamagata H. Characterization of Trp(+) reversions in
Escherichia coli strain WP2uvrA. Mutagenesis 2002;17(4):313-6.
52. Paiva PMG, Gomes FS, Napoleao TH, Sa RA, Correia MTS, Coelho LCBB. Antimicrobial activity
of secondary metabolites and lectins from plants. In: Mendez – Vilas A. Current Research,
Technology and education topics in Applied microbiology and Microbial Biotechnology. Bajadoz:
Formatex Research Center; 2010. p. 396-406.
53. Peumans WJ, Van Damme EJM. Lectins as plant defense proteins. In: Pusztai A, Bardocz S.
Lectins – biomedical perspectives. CRC Press; 2005. p. 1-18.
54. Rüdiger H, Gabius HJ. Plant lectins: Occurrence, biochemistry, functions and applications.
Glycoconj J 2001;18(8):589-613.
55. Sabbioni G, Jones CR. Biomonitoring of arylamines and nitroarenes. Biomarkers 2002;7:347-421.
56. Safarinejad MR. Urtica dioica for treatment of benign prostatic hyperplasia. Journal of Herbal
Pharmacotherapy 2005;5(4):1-11.
44
57. Sames K, Schumacher U, Halata Z, Van Damme EJ, Peumans WJ, Asmus B, Moll R, Moll I.
Lectin and proteoglycan histochemistry of Merkel cell carcinomas. Exp Dermatol 2001;10(2):100-
9.
58. SemiglazovVF, Stepula VV, Dudov A, Schnitker J, Mengs U. Quality of Life is Improved in
Breast Cancer Patients by Standardised Mistletoe Extract PS76A2 during Chemotherapy and
Follow-up: A Randomised, Placebo-controlled, Double-blind, Multicentre Clinical Trial.
Anticancer Res 2006;26(2B):1519-1529.
59. Sharon N, Lis H. History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules.
Glycobiology 2004;14(11).
60. Sharon N, Lis H. Lectins. Dordrecht: Springer; 2007.
61. Siegle I, Fritz P, McClellan M, Gutzeit S, Murdter TE. Combined cytotoxic action of Viscum
album agglutinin-1 and anticancer agents against human A549 lung cancer cells. Anticancer Res
2001;21(4A):2687–2691.
62. Silvers KJ, Couch LH, Rorke EA, Howard PC. Role of nitroreductases but not cytochromes P450
in the metabolic activation of 1-nitropyrene in the HepG2 human hepatoblastoma cell line.
Biochem Pharmacol 1997;54(8):927-36.
63. Sze Kwan Lam, Tzi Bun Ng. Lectins: production and practical applications. Appl. Microbiol.
Biotechnol 2011;89:45-55.
64. Tahri A, Yamani S, Legssyer A, Aziz M, Mekhfi H, Bnouham M, Ziyyat A. Acute diuretic,
natriuretic and hypotensive effects of a continuous perfusion of aqueous extract of Urtica dioica in
the rat. Journal of Ethnopharmacology 2000;73(1-2):95-100.
65. Talalay P. Chemoprotection against cancer by induction of phase 2 enzymes. Biofactors
2000;12:5-11.
66. Verma N, Behera BC, Makhija U. Antioxidant and hepatoprotective activity of a lichen Usnea
ghattensis in vitro. Appl Biochem Biotechnol 2008;151(2-3):167-81.
67. Vitalone A, Di Giacomo S, Di Sotto A, Franchitto A, Mammola CL, Mariani P, Mastrangelo S,
Mazzanti G. Cassia angustifolia extract is not hepatotoxic in an in vitro and in vivo study.
Pharmacology. 2011;88(5-6):252-9.
68. Vujosevic M, Blagojevic J. Antimutagenic effects of extracts from sage (Salvia officinalis) in
mammalian system in vivo. Acta Veterinaria Hungarica 2004;52(4):439-443.
69. Wagner H, Geiger WN, Boos G, Samtleben R. Studies on the binding of Urtica dioica agglutinin
(UDA) and other lectins in an in vitro epidermal growth factor receptor test. Phytomedicine
1995;1(4):287-90.
70. Wilcox P, Naidoo A, Wedd DJ, Gatehouse DG. Comparison of Salmonella typhimurium TA102
with Escherichia coli WP2 tester strains. Mutagenesis 1990;5:285-291.
45
71. Wong BW, Luk JM, Ng IO, Hu MY, Liu KD, Fan ST. Identification of liver-intestine cadherin in
hepatocellular carcinoma--a potential disease marker. Biochem Biophys Res Commun
2003;311(3):618-24.
72. Yagi A, Kabash A, Mizuno K, Moustafa SM, Khalifa TI, Tsuji H. Radical scavenging glycoprotein
inhibiting cyclooxygenase-2 and thromboxane A2 synthase from aloe vera gel. Planta Med
2003;69(3):269-71.
46
10. PRIEDAI
10.1. Publikacija, atiduota žurnalo „Pharmaceutical biology” redakcijai
Antimutagenic activity of a lectin-enriched fraction from Urtica dioica L.
Annabella Vitalone a, Gabriela Mazzanti a, Rasa Staršelskytė b, Savickiene Nijole b, Antonella Di Sotto
a*, Baksenskaitė Vaida b, Silvia Di Giacomo a
aDepartment of Physiology and Pharmacology, Sapienza University of Rome, P.le Aldo Moro 5,
00185 Rome, Italy.
bDepartment of Pharmacognosy, Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences,
Lithuania.
Corresponding author. Tel.: +39 06 4991 2904; fax: +39 06 4991 2480.
E-mail address: [email protected] (A. Di Sotto).
ABSTRACT
Ethnopharmacological relevance. Urtica dioica L., or stinging nettle, has been traditionally employed
as a folklore remedy for a wide spectrum of ailments, particularly inflammation, prostatic hyperplasia
and urine retention. In Turkey, this plant has been also used extensively for cancer treatment. The
present study was aimed at evaluating the potential chemopreventive properties of a lectin-rich fraction
from Urtica dioica herb (labelled as UDHL30).
Materials and methods. UDHL30 has been tested for the cytotoxicity on human hepatoma HepG2 cells
and for the antimutagenicity in the Ames test. Moreover, the radical-scavenger activity was assayed as
a potential protective mechanism.
Results. UDHL30 was not cytotoxic on HepG2 cells, conversely, it exhibited a strong antimutagenic
activity against the mutagen 2-aminoantracene (2-AA) in all strains tested. In addition, a remarkable
scavenging activity was produced. Being 2-AA a pro-carcinogenic agent, we hypothesize that the
47
antimutagenicity of UDHL30 can be due to the inhibition of CYP450-isoenzymes, involved in the
mutagen bioactivation. The radical scavenger ability could contribute to this antimutagenicity.
Conclusions. UDHL30 possesses antimutagenic and radical scavenging properties which encourage
further studies in order to better define its potential usefulness in chemoprevention.
48
10.2. Tezės, pristatytos Jaunųjų mokslininkų ir tyrėjų konferencijoje 2013
(Farmacijos sekcijoje užimta pirmoji vieta ir tezės pristatytos plenarinėje sesijoje)
BALTYMŲ FRAKCIJŲ, PRATURTINTŲ LEKTINAIS, IŠ URTICA DIOICA L.
ŽOLĖS ANTIMUTAGENINIS IR ANTIOKSIDACINIS AKTYVUMAS
Rasa Staršelskytė
Farmakognozijos katedra, Lietuvos Sveikatos mokslų universitetas
Fiziologijos ir farmakologijos institutas, Romos universitetas La Sapienza
Vadovai: Prof. Nijole Savickiene , Dr. Annabella Vitalone, Prof. Gabriela Mazzanti, Dr. Antonella Di
Sotto
Augalų lektinai yra unikali glikoproteinų grupė, turinti didelį biologinį aktyvumą. Jie atpažįsta ir
jungiasi prie įvairių angliavandenių struktūrų. Šie junginiai gali sukelti ląstelių agregaciją ir/arba
agliutinaciją. In vitro ir in vivo bandymų metu buvo atrasti lektinai, turintys priešvėžinių savybių. Jie
jungiasi prie vėžinių ląstelių ar jų receptorių, ir taip išreiškia savo citototoksiškumą, sukelia apoptozę
ar inhibuoja auglio augimą.
Darbo tikslas:
Baltymų frakcijos, praturtintos lektinais, iš Urtica doica L. žolės antimutageninio ir antioksidacinio
aktyvumo įvertinimas.
Uždaviniai:
1. Įvertinti Urtica dioica L. lektinų turinčios frakcijos baltymų antimutageninį aktyvumą AMES testo
metodu (grįžtamosios mutacijos modeliu in vitro).
2. Ištirti Urtica dioica L. lektinų turinčios baltymų frakcijos antioksidacinį aktyvumą prieš ABTS (2,2-
azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties)) ir superoksido radikalus.
49
Darbo metodika:
1. Baltymų frakcijų, praturtintų lektinais, išskyrimas iš Urtica doica L. žolės, išsūdant amonio sulfato
tirpalu, frakcionavimui pritaikant 2D PAGE elektroforezės metodą .
2. Lektinais praturtintos baltymų frakcijos antimutageniškumas tiriamas AMES testo metodu
(grįžtamosios mutacijos modeliu in vitro) su S9 metabolinės aktyvacijos sistema (supernatantu iš
žiurkių, prieš tai paveiktų fenobarbitalio/β-naftoflavono mišiniu, kepenų lątelių mitochondrijų) ir be S9
metabolinės aktyvacijos sistemos. Eksperimentui naudojamos trys bakterijų padermės: S. typhimurium
TA98 (hisD3052galbiochl1008rfa1001 ΔuvrBpKM101), S.typhimurium TA100
(hisG56galbiochl1005rfa1004ΔuvrB pKM101) ir E. coli WP2uvrA (trpE65ΔuvrA).
3. Baltymų frakcijos, praturtintos lektinais, antioksidacinis aktyvumas nustatomas, inkubuojant su
ABTS (2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) katijono) radikalo ir superoksido radikalo
tirpalais.
Rezultatai:
1. Lektinais praturtinta frakcija parodė antimutageninį poveikį prieš mutageną 2-aminoantraceną (2-
AA). Esant didžiausiai koncentracijai, antimutageninis poveikis pasiekė maksimalią 56%, 78% ir 61%
inhibiciją atitinkamai TA98, TA100 ir WP2uvrA bakterijų padermėse. Lektinais praturtinta baltymų
frakcija neturėjo antimutageninio poveikio (maksimali inhibicija < 25%) prieš 2-nitrofluoreną (2-NF),
natrio azidą (SA) ir metilmetano sulfonatą (MMS).
2. Antiradikalinis aktyvumas tirtas spektrofotometrijos metodu, naudojant 2,2-azino-bis-(3-
etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) (ABTS•+) radikalo sujungimo testą. Stebėta ABTS radikalo
inhibicijos tiesioginė priklausomybė nuo koncentracijos, kuri pasiekė maksimumą (apie 93.8%
antioksidacinį aktyvumą), kai lektinais praturtintos frakcijos koncentracija buvo 120 µg/ml.
Superoksido anijono inhibicija taip pat priklausė nuo koncentracijos ir pasiekė maksimumą (apie
90.2% antioksidacinį aktyvumą), kai lektinais praturtintos frakcijos koncentracija buvo 400 µg/ml.
Išvados:
1. Lektinais praturtinta frakcija turėjo stiprų antimutageninį aktyvumą prieš mutageną 2-
aminoantraceną (2-AA) visose tirtose bakterijų padermėse.
2. Baltymų frakcija, praturtinta lektinais, parodė stiprų antioksidacinį aktyvumą prieš ABTS ir
superoksido radikalus.
50
10.3. Tezės, pristatytos tarptautinėje konferencijoje International Health Science
Conference 2013
CYTOTOXICITY AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF LECTIN-ENRICHED
PROTEIN FRACTION FROM HERB OF URTICA DIOICA L.
Rasa Staršelskytė
Department of Pharmacognosy, Medical Academy, Lithuanian University of Health Sciences
Department of Physiology and Pharmacology, Sapienza University of Rome���
Supervisors of the abstract: Prof. Nijolė Savickienė, PhD Annabella Vitalone, Prof. Gabriela Mazzanti,
PhD Antonella Di Sotto
INTRODUCTION
Plant lectins are non-enzymic and non-immune origin proteins that specifically recognize and bind to
various sugar structures and possess the activity to agglutinate cells and/or precipitate polysaccharides
and glycoconjugates. The emerging evidences showed that plant lectins contribute not only to tumour
cell recognition but also to cell adhesion and localization, to signal transduction, to mitogenic
cytotoxicity and apoptosis.
AIM
Evaluation of cytotoxicity and antioxidant activity of lectin-enriched protein fraction from Urtica
dioica L. herb.
OBJECTIVES
1. To determine cytotoxicity of lectin-enriched protein fraction by the tetrazolium dye (MTT)
colorimetric assay.
2. To evaluate antioxidant activity of lectin-enriched protein fraction against ABTS free radical and
superoxide radical.
METHODS
1. Lectin-enriched protein fraction was obtained from the herb of Urtica dioica L by using
homogenisation with fluid nitrogen, extraction in 0.01 M phosphate-buffer saline (PBS), concentrating,
salting and precipitation.
51
2. Cytotoxicity was determined by the tetrazolium dye (MTT) colorimetric assay in HepG2 human
hepatoblastoma cell line.
3. The antioxidant activity was evaluated by ABTS-free radical scavenging activity test and
superoxide-radical scavenger assay.
RESULTS
1. Lectin-enriched protein fraction did not display any significant reduction in the cell viability of
HepG2 cells, neither after 24 h nor after 48 h of treatment.
2. The inhibition of the ABTS radical and the superoxide anion was concentration-dependent and
reached 93.8% scavenger activity at 120 µg/ml, 90.2% scavenger activity at 400 µg/ml, respectively.
CONCLUSIONS
1. Lectin-enriched protein fraction did not inhibited the cell proliferation in tumour hepatic HepG2
cells.
2. Lectin-enriched protein fraction exhibited a remarkable scavenger activity against ABTS radical and
superoxide anion.
52
10.4. Tezės, pristatytos tarptautinėje konferencijoje Minske „Отечественные
противоопухолевые препараты 2013”
Annabella Vitalone 1, Gabriela Mazzanti 1, Rasa Staršelskytė 2, Nijolė Savickienė 2, Antonella Di
Sotto 1, Jurga Bernatoniene 3, Gailute Draksiene 3, Arunas Savickas 3
Antimutagenic activity of proteins (lectins) fraction from herb of Nettle
1Department of Physiology and Pharmacology, Sapienza University of Rome, Italy; 2Department of
Pharmacognosy, Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences, Lithuania;
3Department of Drug Technology and Pharmaceutical Management, Lithuanian University of Health
Sciences, Lithuania;
Plant lectins are non-enzymic and non-immune origin proteins that specifically recognize and bind to
various sugar structures and possess the activity to agglutinate cells and/or precipitate polysaccharides
and glycoconjugates. The emerging evidences showed that plant lectins contribute not only to tumour
cell recognition but also to cell adhesion and localization, to signal transduction, to mitogenic
cytotoxicity and apoptosis.
The aim of experiment: Evaluation of antimutagenicity and cytotoxicity of a lectin-enriched protein
fraction from Nettle herb.
Material and methods:
1. Lectin-enriched protein fraction was obtained from the herb of Urtica dioica L.
2. The antimutagenicity was studied in a bacterial reverse mutation assay (Ames test), both in the
absence and presence of an exogenous metabolic activator S9 (the liver postmitochondrial supernatant
of rats treated with the mixture phenobarbital/β-naphthoflavone to induce the hepatic microsomal
enzymes). A set of three strains, S. typhimurium TA98 (hisD3052galbiochl1008rfa1001
ΔuvrBpKM101), S. typhimurium TA100 (hisG56galbiochl1005rfa1004ΔuvrB pKM101) and E. coli
WP2uvrA (trpE65ΔuvrA), was used.
3. Cytotoxicity was determined by the tetrazolium dye (MTT) colorimetric assay in HepG2 human
hepatoblastoma cell line.
53
Results:
1. Lectin-enriched protein fraction did not display any significant reduction in the cell viability of
HepG2 cells, neither after 24 h nor after 48 h of treatment.
2. Lectin-enriched protein fraction showed antimutagenic effect against 2-AA (2-aminoanthracene),
which reached, at the highest concentration tested, the maximal inhibition of 56%, 78% and 61% in
TA98, TA100 and WP2uvrA strains, respectively. In contrast, lectin-enriched fraction produced no
significant antimutagenic effects (maximal inhibition < 25%) against 2-NF (2-nitrofluorene), SA
(sodium azide), MMS (methyl methanesulfonate).
Conclusions:
1. Lectin-enriched protein fraction did not inhibited the cell proliferation in tumour hepatic HepG2
cells.
2. Lectin-enriched fraction exhibited a strong antimutagenic activity against the mutagen 2-AA in all
strains tested.