BAB IV

ISOLASI DAN KARAKTERISASI

GEN CHITINASE ASAL 5 KULTIVAR PISANG1

Abstrak

Chitinase adalah enzim katalitik yang dihasilkan oleh tanaman yang mempunyai

peranan sebagai protein pertahanan tanaman terhadap patogen. Dalam penelitian

ini, fragmen gen chitinase diisolasi dan dikarakterisasi dari 5 kultivar pisang

Indonesia, yaitu: Rejang, Klutuk Wulung, Kepok, Ambon Hijau dan Barangan.

Fragmen gen chitinase telah berhasil diisolasi dari DNA genom 5 kultivar pisang

tersebut dan disandi dengan MaChi. Selanjutnya fragmen tersebut dikarakterisasi

dan dianalisis, meliputi analisis BLASTp, pensejajaran dan filogenetik. Fragmen

gen MaChi teridentifikasi mengandung 3 exon (438 pb) dan 2 intron (158 pb), dan

dari 5 produk amplifikasi PCR diperoleh delapan sekuen gen chitinase yang

mempunyai keragaman basa nukleotida di dalamnya. Berdasarkan hasil analisis

sekuen, fragmen MaChi tersebut mengandung daerah terkonservasi yang menjadi

ciri dari glikosida hidrolase famili 19 dan mempunyai identity yang tinggi dengan

gen chitinase kelas I atau II.

Kata kunci: chitinase, isolasi, karakterisasi molekular, pisang

1Bab ini telah dikirim ke Journal of Mathematical and Fundamental Sciences untuk dipublikasi

dengan judul: Chitinase (MaChi) Gene from Indonesian Banana Plant: Isolation, Characterization,

and the Use as Molecular Marker for Disease Resistance

62

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF

CHITINASE GENE FROM 5 BANANA CULTIVARS1

Abstract

Chitinase is a catalytic enzyme produced by plants as defense protein against

pathogens. In this study, fragments of chitinase gene were isolated and

characterized from five Indonesian banana cultivars, e.i: Rejang, Klutuk Wulung,

Kepok, Ambon Hijau and Barangan. The fragments of chitinase gene have been

successfully isolated from genomic DNA and assigned by MaChi. The fragments

were characterized and analyzed, employed BLASTp, multiple alignment and

phylogenetic analysis. Fragments of MaChi gene contained three exons (438 bp)

and two introns (158 bp). From five PCR products represent five banana

cultivars, we obtained eight chitinase gene sequences with nucleotide sequence

variabilities. Based on the result of nucleotide sequence analysis, the MaChi

fragments contained a typical glycoside hydrolase conserved region of chitinase

family 19 and exhibited a high sequence identity to either class I or class II

chitinase.

Keywords: banana, chitinase, isolation, molecular characterization

1This chapter has been submitted to the Journal of Mathematical and Fundamental Sciences,

entitled: Chitinase (MaChi) Gene from Indonesian Banana Plant: Isolation, Characterization, and

the Use as Molecular Marker for Disease Resistance

63

Pendahuluan

Pisang adalah tanaman pangan terpenting keempat di dunia, terutama di

negara-negara yang sedang berkembang dan menjadi makanan pokok bagi 400

juta penduduk di dunia (CTB Trade for Development 2011). Namun demikian,

produksi pisang menghadapi kendala beberapa penyakit serius seperti layu bakteri

dan Fusarium (Molina 2010). Perbaikan kultivar untuk ketahanan terhadap

penyakit bisa dikembangkan baik menggunakan metode pemuliaan konvensional

maupun program rekayasa genetika. Sayangnya sampai saat ini informasi genetik

gen ketahanan tanaman pisang terhadap layu FOC ras 4 tropika masih terbatas (Li

et al. 2012). Namun demikian beberapa penelitian telah menghasilkan tanaman

pisang transgenik yang tahan terhadap layu FOC ras 1, walaupun pengujian masih

dalam taraf rumah kaca (Paul et al. 2011; Mohandas et al. 2013).

Interaksi antara tanaman dan patogen bisa terjadi dalam bentuk reaksi

kompatibel ataupun inkompatibel (Flor 1947). Perwujudan dari reaksi

inkompatibel dari adalah respon ketahanan terhadap penyakit (Agrios 2005).

Respon ketahanan dari tanaman pada umumnya dikendalikan oleh 2 kelas gen, yaitu

gen ketahanan (R-gene) dan gen respon pertahanan (DR-gene) (Yulong 2006).

Reaksi tidak kompatibel antara produk gen ketahanan dari tanaman dan

produk dari gen avirulen (Avr-gene) patogen akan memicu aktivasi respon

pertahanan dari tanaman inang, yang sering termasuk di dalamnya produksi

pathogenesis-related (PR) proteins. Sampai saat ini sebanyak 17 kelompok

protein PR telah ditemukan dan dikarakterisasi (Edreva 2005). Sejumlah

pengujian enzimatik secara in vitro menunjukkan bahwa protein PR-3

menghasilkan aktivitas chitinase. Chitinase adalah enzim yang mempunyai

peranan yang kritis dalam pertumbuhan dan perkembangan cendawan, berperanan

penting dalam pertahanan terhadap cendawan patogen, dan parasitisme serangga

oleh cendawan entomopatogen. Pentingnya chitinase dalam berbagai mekanisme

pertahanan telah banyak dikaji (Graham & Sticklen 1994; Zhang et al. 2013).

Chitinase (EC. 3.2.1.14) merupakan enzim dengan aktivitas glikosida

hidrolase dan mengkatalisis degradasi chitin. Enzim ini terdapat pada berbagai

organisme dan berperanan penting baik secara fisiologi maupun ekologi.

Chitinase menghidrolisis ikatan β-1,4 glycosidic dari chitin (Dahiya et al. 2006),

yang akan menghasilkan pelemahan dinding sel dan menyebabkan sel peka

terhadap tekanan osmosis. Enzim chitinases (PR-3) dan β-1,3-glucanases (PR-2)

dapat bekerja secara sinergis menghambat pertumbuhan cendawan baik secara in

vitro maupun dalam tanaman (Selitrennikoff 2001).

Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi chitinase

dari fragmen DNA genom asal 5 kultivar pisang Indonesia meliputi analisis

BLASTp, pensejajaran dan filogenetik sekuen hasil amplifikasi.

Bahan dan Metode

Waktu dan Tempat

Penelitian dilaksanakan mulai bulan Agustus sampai Desember 2012 di

laboratorium Pemuliaan dan Biologi Molekuler Tanaman, Departemen Agronomi

dan Hortikultura, Fakultas Pertanian IPB.

64

Bahan Penelitian dan isolasi DNA

Kultivar pisang yang digunakan Rejang (AA), Klutuk Wulung (BB),

Ambon Hijau (AAA), Barangan (AAA) dan Kepok (ABB), sedangkan bahan

tanaman yang digunakan adalah daun muda tanaman hasil perbanyakan kultur

jaringan yang telah berumur 2 bulan setelah aklimatisasi. Isolasi DNA

berdasarkan metode CTAB (Doyle & Doyle 1987) yang dimodifikasi oleh Das et

al. (2009). Selanjutnya stok DNA hasil isolasi disimpan dalam lemari pendingin

bersuhu -20°C sampai siap untuk digunakan.

Perancangan Primer dan PCR Sebanyak 2 pasang primer, Chi2-1 dan Chi2-2, didisain berdasarkan

sekuen chitinase kelas II asal Musa spp. (FJ040802 dan FJ222751) yang ada di

pangkalan data GenBank NCBI, menggunakan perangkat lunak Primer3

(http://biotools. umassmed.edu/ bioapps/primer3_www.cgi). Runutan basa

nukleotida primer yang digunakan dalam penelitian ini ditampilkan pada Tabel 9.

Reaksi PCR dilaksanakan dengan volume 25 µl menggunakan KAPA2GTM

PCR Kit (Kapa Biosystems Inc., USA), yang komposisinya terdiri atas 5.0 µl 5 X

buffer PCR (di dalamnya terkandung 1.5 mM Mg2+

), 0.5 µl MgCl2 25 mM, 0.5 µl

dNTPs 10 mM, 1.0 µl masing-masing primer dengan konsentrasi 10 µM (primer

forward dan reverse), 30 ng DNA genom, 0.1 µl Taq DNA polymerase (5 U µl-1

)

dan15.4 µl ddH2O. Proses PCR menggunakan mesin GeneAmp® PCR System

2400 (Perkin Elmer). Denaturasi cetakan DNA pada awal reaksi pada suhu 95 °C

selama 3 menit, diikuti dengan 35 kali siklus 95 °C selama 10 detik, 57 °C selama

10 detik dan 72 °C selama 3 detik, dan diakhiri dengan satu siklus 72 °C selama

10 menit. Produk PCR dipisahkan berdasarkan ukuran dengan menggunakan

elektroforesis gel agarose 1 % pada mesin elektroforesis dengan tegangan 80 V

selama 25 menit. Selanjutnya dilakukan pewarnaan gel menggunakan ethidium

bromide dan visualisasi menggunakan transluminator UV. Produk PCR yang

menghasilkan pita tunggal dan jelas dikirim ke 1stBASE (Malaysia) untuk proses

perunutan basa nukleotida (sequencing).

Analisis sekuen produk PCR

Untuk mengetahui identitas fragmen DNA hasil amplifikasi PCR, dilakukan

analisis dengan cara membandingkan sekuen DNA dan prediksi asam amino

dengan aksesi yang terdeposit pada pangkalan data GenBank NCBI menggunakan

alogaritma BLASTn dan BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Translasi sekuen DNA menjadi asam amino menggunakan perangkat lunak

Tabel 9 Sekuen primer PCR yang digunakan untuk mengamplifikasi gen

chitinase asal fragmen DNA genom pisang dan ukuran produk yang

diharapkan

Primer Sekuen Produk yang

diharapkan (pb)

Chi2-1 (F) 5’-CACGAAGAAGAGGGAGATCG-3’ 447

Chi2-1 (R) 5’-CCGTTGATGGAGTTGGTGAT-3’

Chi2-2 (F) 5’-CACGAAGAAGAGGGAGATCG-3’ 438

Chi2-2 (R) 5’-ATGTTGGTGGTGACACCGTA-3’

65

DNAMAN ver. 4.03 (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada). Analisis pensejajaran

sekuen prediksi asam amino produk PCR dengan 12 sekuen protein chitinase asal

tanaman lain yang terdeposit dalam bank data NCBI, yaitu: Musa AB (ACJ06635),

Rhododendron irroratum (ADF47472), Triticum aestivum (AAX83262), Arachis

hypogaea (ADF87393), Theobroma cacao (EOX95466), Malus domestica

(AAM12890), Elaeis guineensis (AEL89178), Oryza sativa (CAA82850 dan

BAB21377), Gossypium hirsutum (AAD11255), Hevea brasiliensis (CAD24068), dan

Arabidopsis thaliana (NM_191010), menggunakan perangkat lunak GeneDoc ver.

2.7 (Nicholas et al. 1997). Pohon filogenetik didisain berdasarkan metode

Neighbor-Joining menggunakan perangkat lunak MEGA5 (Tamura et al. 2011).

Hasil dan Pembahasan

Amplifikasi PCR Menggunakan Primer Spesifik Chitinase. Produk amplifikasi pita tunggal yang berukuran sekitar ~600 pb diperoleh

dari DNA genom semua kultivar menggunakan pasangan primer Chi21-2

(Gambar 19). Produk dengan ukuran yang sama juga diperoleh dengan

menggunakan pasangan primer Chi2-1. Namun demikian produk hasil amplifikasi

menggunakan pasangan primer Chi2-1 sangat tipis dan tidak jelas (gambar tidak

ditampilkan). Oleh karena itu hanya 5 produk PCR (satu produk PCR mewakili

satu kultivar pisang) hasil amplifikasi PCR menggunakan pasangan primer Chi2-2

yang dikirim ke 1stBASE (Malaysia) untuk diproses runutan basa nukleotidanya.

Hasil dari proses perunutan basa nukleotida (sequencing) menghasilkan

semua produk PCR berukuran 596 pb. Ukuran fragmen DNA lebih besar dari

produk yang diharapkan yaitu sebesar 438 pb. Karena cetakan DNA yang

digunakan dalam rekasi PCR adalah DNA genom, maka lebih besarnya produk

PCR dari yang diharapkan mengindikasikan adanya intron dalam sekuen produk

PCR tersebut.

Seperti yang telah diduga sebelumnya, terdapat 2 intron yang tersisip

dalam sekuen hasil amplifikasi PCR dari semua kultivar pisang. Sebagai contoh

dari sekuen DNA dan residu prediksi asam amino dari produk PCR yang berasal

dari salah satu kultivar (Rejang) ditampilkan pada Gambar 20.

Gambar 19 Elektroferogram produk amplifikasi PCR yang berasal dari DNA

genom 5 kultivar pisang, menggunakan pasangan primer Chi2-2;

1=DNA ladder 100 pb, 2-6=Secara berurutan merupakan produk PCR

dari Rejang, Klutuk Wulung, Kepok, Ambon Hijau dan Barangan.

1000

500

66

Analisis Sekuen Fragmen DNA Genom yang Teramplifikasi

Analisis pensejajaran sekuen DNA hasil amplifikasi PCR dengan sekuen

chitinase kelas II asal Musa AB, yang tersedia pada pangkalan data GenBank

NCBI (aksesi no. FJ222751), mengidentifikasikan adanya 2 intron yang tersisip di

antara ekson pada posisi nukleotida 57 sampai 126 dan 281 sampai 368 dari

fragmen produk PCR (Gambar 20). Seperti sifat intron pada umumnya, sekuen

intron yang teridentifikasi mengandung basa nukleotida TA yang relatif tinggi,

yaitu 51.4 % dan 50 %, dan sekuen dimulai dengan GT dan diakhiri dengan AG.

Sekuen ekson yang teridentifikasi berukuran 438 pb. Ekson tersebut

menyandi 148 residu asam amino. Bagian pertama dari ekson yang teridentifikasi

dari fragmen genom yang teramplifikasi menyandikan 18 residu asam amino,

mengandung motif SHETT, dan bagian ketiga menyandikan 78 residu asam

amino yang mengandung motif NYNYG. Bagian kedua yang terletak di antara

bagian pertama dan ketiga, yang menyandi 52 residu asam amino, tidak

mengandung motif spesifik.

Motif terkonservasi NYNYG berhubungan dengan situs aktif katalitik

yang sangat penting dan terdapat pada sebagian besar basic chitinase (Collinge et

al. 1993). Motif NYNYG juga terdapat pada chitinase kelas VII yang berasal dari

tanaman kapas (Li & Liu 2003). Adanya motif SHETT dan NYNYG juga

dilaporkan pada protein gen chitinase yang diisolasi dari tanaman stroberi (Khan

2002).

Gambar 20 Contoh sekuen DNA dan prediksi asam amino dari hasil amplifikasi PCR

asal DNA genom pisang Rejang, menggunakan primer spesifik chitinase.

Intron ditandai dengan huruf kecil pada sekuen DNA. Residu asam amino

di dalam kotak adalah sebagian motif terkonservasi dari chitinase.

Huruf kapital di bawah sekuen DNA adalah sekuen prediksi asam amino.

Tanda panah di atas sekuen DNA adalah posisi primer forward (fwd) dan

reverse (rev).

Fwd primer

Rev primer

67

Berdasarkan adanya motif SHETT dalam produk amplifikasi PCR, dapat

disimpulkan bahwa produk amplifikasi tersebut diidentifikasi sebagai fragmen

gen chitinase yang berasal dari Musa spp. Berdasarkan hasil sekuensing dari 5

produk amplifikasi PCR diperoleh delapan sekuen dengan variasi nukleotida di

dalamnya.

Delapan fragmen chitinase yang diisolasi dari DNA genom pisang dalam

penelitian ini disandi dengan MaChi_Rjg yang berasal dari Rejang, MaChi_Klt#1 dan

#2 berasal dari Klutuk Wulung, MaChi_Kpk#1 dan #2 berasal dari Kepok,

MaChi_AH#1 dan #2 berasal dari Ambon Hijau, dan MaChi_Br berasal dari

Barangan. Semua sekuen tersebut (delapan sekuen) telah masuk dalam pangkalan

data GenBank NCBI dengan nomor aksesi JX984595, JX984596, JX984597,

JX984598, JX984599, JX628916, JX628917, dan JX628918.

Sequence Identity Chitinase Asal Pisang

Berdasarkan analisis BLASTp (Altschul et al. 1997) sekuen prediksi asam

amino dari fragmen DNA yang diperoleh dari penelitian ini, terungkap bahwa

fragmen DNA tersebut mempunyai kemiripan residu asam amino yang signifikan

dengan sejumlah prediksi asam amino dari cDNA chitinase yang berasal dari

tanaman. Hal ini terlihat dari persentase identity yang tinggi. Identity asam amino

dari semua aksesi berkisar 50 % sampai 90 % (Tabel 10). Query coverage dan

nilai E dari sekuen yang dianalisis, masing-masing berkisar 79 % sampai 100 %

dan 1e62 – 9e34 (Tabel 10). Berdasarkan hasil analisis BLASTp juga diketahui

bahwa sekuen residu prediksi asam amino dari fragmen DNA genom yang

teramplifikasi dari penelitian ini mempunyai identity 90 % dengan sekuen asam

amino chitinase kelas II yang berasal dari Musa AB (ACJ06635) yang terdeposit

dalam bank data NCBI (Tabel 10).

Tabel 10 Sequence identity residu prediksi asam amino dari fragmen chitinase

yang diisolasi dari pisang Rejang (MaChi_Rjg) dan 12 chitinase yang

berasal dari tanaman lain yang terdeposit dalam pangkalan data

GenBank NCBI. Penentuan nilai E, persentase query coverage dan

identitas sekuen mengunakan alogaritme BLASTp (Altschul et al. 1997)

Aksesi Diskripsi Query

coverage (%)

Nilai

E

Identity

(%)

ACJ06635 Musa AB Group class II chitinase 100 1e-92 90

ADF47472 Rhododendron irroratum class II chitinase 100 4e-80 81

AAX83262 Triticum aestivum class II chitinase 99 8e-77 75

CAD24068 Hevea brasiliensis subsp. brasiliensis class

I chitinase

100 4e-68 72

AMM12890 Malus domestica class II chitinase 93 2e-65 71

CAA82850 Oryza sativa class I chitinase 100 2e-59 71

AAD11255 Gossypium hirsutum class I chitinase 100 5e-68 69

EOX95466 Theobroma cacao class II chitinase 100 1e-66 68

ADF87393 Arachis hypogaea class II chitinase 100 1e-66 67

AEL89178 Elaeis guineensis class II chitinase 100 1e-62 64

NP_191010 Arabidopsis thaliana class IV chitinase 79 9e-34 50

BAB21377 Oryza sativa class IV chitinase 86 2e-39 52

68

Chitinase dikelompokkan dalam glikosida hidrolase famili 18 dan 19

(Henrissat & Bairoch 1993). Anggota dari kedua famili chitinase tersebut dibedakan

berdasarkan residu asam amino, struktur 3 dimensi (3D) (Hart et al. 1995; Hahn et al.

2000; Perrakis et al. 1994) dan mekanisme reaksi katalitik. Anggota dari chitinase

famili 18 secara luas terdistribusi pada berbagai organisme seperti bakteri, cendawan,

virus dan hewan.

Chitinase kelas III dan V yang telah teridentifikasi pada tumbuhan tingkat

tinggi termasuk dalam chitinase famili 18. Di lain pihak, chitinase famili 19 terdiri

dari chitinase kelas I, II dan IV dan sebagian besar terdapat pada tumbuhan. Namun

demikian, hasil penemuan yang terbaru mengungkapkan adanya chitinase kelas IV

pada Streptomyces (Watanabe et al. 1999) dan Actinobacteria (Kawase et al. 2004;

Tsujibo et al. 2003), hal ini mengindikasikan bahwa sebaran yang lebih luas dari

chitinase kelas IV yang termasuk dalam famili 19 tidak terbatas hanya pada

tumbuhan saja, tetapi juga spesies bakteri yang lain.

Sebagai anggota dari glikosida hidrolase famili 19, 4 daerah terkonservasi

terdapat pada residu prediksi asam amino. Selain itu 2 residu glutamate (E), sebagai

asam amino katalisis, terkonservasi dalam famili glikosida hidrolase tersebut. Residu

serine (S) atau threonine (T), sebagai asam amino hidroksil dan berperanan sebagai

pengikat molekul air, juga terkandung dalam famili glikosida hidrolase tersebut.

Chitinase kelas I mempunyai semua fitur yang merupakan ciri dari hidrolase

glikosida famili 19. Di lain pihak, chitinase kelas II mempunyai fitur yang mirip

dengan kelas I, kecuali tidak adanya chitin binding dan hinge region.

Analisis pensejajaran residu prediksi asam amino dari fragmen genom DNA

yang diisolasi pada penelitian ini dengan 12 protein chitinase asal tanaman lain

menunjukkan adanya domain terkonservasi dari glikosida hidrolase chitinase famili

19 (Gambar 21). Berdasarkan residu asam amino terkonservasi, fragmen DNA

genom yang teramplifikasi pada penelitian ini kemungkinan besar adalah chitinase

kelas I atau kelas II yang berasal dari tanaman pisang.

Hasil analisis filogenetik menggunakan metode Neighbor-Joining

ditampilkan pada Gambar 22. Hasil analisis sekali lagi memperlihatkan sekuen

MaChi yang teridentifikasi pada penelitian ini mempunyai kemiripan residu asam

amino yang tinggi dengan chitinase kelas I dan II. Sekuen MaChi yang teridentifikasi

juga mempunyai hubungan kekerabatan yang dekat dengan gen chitinase yang

diisolasi dari Musa AB (aksesi # ACJ06635). Di lain pihak sekuen MaChi

mempunyai hubungan yang jauh dengan chitinase kelas IV (Gambar 22).

Sebagai anggota dari glycoside hydrolase family 19 chitinase, 4 motif

terkonservasi ditemukan pada semua runutan prediksi asam amino MaChi dari

kultivar pisang, yaitu 2 residu glutamate (E), sebagai asam amino katalis, ditemukan

pada semua sekuen. Residu serine (S) atau threonine (T) sebagai asam amino

hidroksil dan berperan dalam mengikat molekul air. Adanya molekul air sangat

diperlukan dalam reaksi katalisis (Brameld & Goddard, 1998).

Analisis filogenetik digunakan untuk membandingkan delapan runutan asam

amino chitinase pisang yang dikode gen MaChi_Rj, MaChi_Klt#1 dan #2,

MaChi_Kpk#1 dan #2, MaChi_AH#1 dan #2, dan MaChi_Br dengan 12 protein

chitinase dari GenBank NCBI. Pohon filogenetik (Gambar 22) memperlihatkan

bahwa protein dari MaChi mempunyai kemiripan asam amino yang tinggi dengan

kelompok chitinase kelas I dan kelas II, dan khususnya dengan chitinase kelas II dari

Musa AB, tetapi tidak sama dengan chitinase kelas IV.

69

Gambar 21 Hasil analisis pensejajaran sekuen residu asam amino yang diprediksi

dari sekuen fragmen produk yang diamplifikasi dari DNA genom

kultivar pisang Indonesia (MaChi_Rjg, MaChi_Klt#1 dan #2,

MaChi_Kpk#1 dan #2, MaChi_AH#1 dan #2, dan MaChi_Br) dan

yang berasal dari chitinase yang tersedia pada GenBank NCBI.

Domain terkonservasi dari chitinase ditandai dengan C1, C2, C3 dan

C4. Residu aktif ditandai dengan segitiga hitam, dan residu hidroksil

ditandai dengan segitiga putih.

C2 C3

C1

C4

70

Gambar 22 Dendogram hasil analisis filogenetik sekuen residu prediksi asam

amino chitinase yang berasal dari tanaman pisang dan 11 tanaman lain

berdasarkan analisis pensejajaran menggunakan ClustalW2 dan dibuat

berdasarkan metode Neighbor-Joining. Angka pada sumbu

percabangan adalah nilai bootstrap (1000 ulangan). Skala yang ada di

bawah pohon mewakili panjang cabang yang setara dengan rataan

substitusi asam amino per situs.

Berdasarkan hasil pensejajaran sekuen prediksi asam amino (Gambar 21),

terlihat adanya perbedaan residu antar sekuen MaChi, seperti terlihat pada residu asam

amino nomor 22, 36, 37, 39, 43, dan seterusnya. Perbedaan residu tersebut disebabkan

oleh perbedaan basa nukleotida penyusun kodon. Hal ini mengindikasikan adanya

substitusi basa nukleotida (SNP) antar sekuen MaChi tersebut. Keberadaan SNP

tersebut berpotensi untuk dapat dikembangkan sebagai marka molekuler.

Simpulan

Dalam penelitian ini telah berhasil diisolasi fragmen produk amplifikasi

PCR dari DNA genom 5 kultivar pisang. Fragmen MaChi tersebut berukuran 596

pb dan terdiri atas 2 intron (158 pb) dan 3 exon yang berukuran 438 pb, dan

menyandi 148 residu asam amino.

Berdasarkan hasil proses perunutan basa nukleotida dan analisis prediksi

asam amino, dari 5 produk amplifikasi PCR yang mewakili 5 kultivar pisang,

diperoleh delapan sekuen MaChi yang mengandung daerah terkonservasi glikosida

hidrolase famili 19 dan teridentifikasi sebagai gen chitinase kelas I atau II.

Chi_II_ACJ06635

MaChi_AH#1

MaChi_Br

MaChi_AH#2

MaChi_Kpk#2

MaChi_Klt#2

MaChi_Klt#1

MaChi_Kpk#1

MaChi_Rjg

Chi_II_ADF47472

Chi_I_CAA82850

Chi_II_AAM12890

Chi_II_AAX83262

Chi_I_AAD11255

Chi_I_CAD24068

Chi_II_ADF87393

Chi_II_EL89178

Chi_II_EOX95466

Chi_IV_NP_191010

Chi_IV_BAB21377100

85

100

59

97

24

14

30

69

86

62

80

53

45

25

30

84

0.05

71

Daftar Pustaka

Agrios GN. 2005. Plant Pathology. Ed ke-5. Burlington: Elsevier Academic Pr.

hlm 125-174.

Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ.

1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein

database search programs. Nuc Acids Res 25:3389-3402.

Brameld KA, Goddard WA III. 1998. The role of enzyme distortion in the single

displacement mechanism of family 19 chitinases. Proc NatL Acad Sci

USA95:4276–4281,.

Collinge DB, Kragh KM, Mikkelsen JD, Nielsen KK, Rasmussen U, Vad K.

1993. Plant chitinases. Plant J 3:31-40.

CTB Trade for Development. 2011. La Banane, un Fruit en Sursis, Agence Belge

de Développement, Bruxelles.

Dahiya N, Tewari R, Tiwari RP, Hoondal GS. 2006. Biochemical aspects of

chitinolytic enzymes: A review. App Microbiol Biotech 71:773–782.

Das BK, Jena RC, Samal KC. 2009. Optimization of DNA isolation and PCR

protocol for RAPD analysis of banana/plantain (Musa spp.). Int J Agricul

Sci 1(2):21-25.

Doyle JJ, Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities

of fresh leaf tissue. Phytochem Bull 19:11-15.

Edreva A. 2005. Pathogenesis-related proteins: research progress in the last 15

years. Gen Appl Plant Physiol 31:105-124.

Flor HH. 1947. Current status of the gene-for-gene concept. Annu Rev

Phytopathol 9:275-296.

Graham LS, Sticklen MB. 1994. Plant Chitinases. Can J Bot 72:1057–1083.

Hahn M, Hennig M, Schlesier B, Hõhne W. 2000. Structure of jack bean

chitinase. Acta Crystal Sect D Biol Crystal 56:1096–1099.

Hart PJ, Pfluger HD, Monzingo AF, Hollis T, Robertus JD. 1995. The refined

crystal structure of an endochitinase from Hordeum vulgare L. seeds at

1.8 Å resolution. J Mol Biol 248:402–413.

Henrissat B, Bairoch A. 1993. New families in the classification of glycosyl

hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem J 293:781–

788.

Kawase T, Saito A, Sato T, Kanai R, Fujii T, Nikaidou N, Miyashita K, Watanabe

T. 2004. Distribution and phylogenetic analysis of family 19 chitinases in

Actinobacteria. App Environ Microbiol 70:1135–1144.

Khan AA. 2002. Characteriazation of Chitinase Activities, and Cloning,

Analysis, And Expression Of Genes Encoding Pathogenesis Related

Proteins In Strawberry [disertasi]. Lousiana (US): Louisiana State

University.

Li J. Liu J-Y. 2003. A novel cotton gene encoding a new class of chitinase. Acta

Bot Sin 45:1489-1496.

Li CY, Deng GM, Yang J, Viljoen A, Jin Y, Kuang RB, Zuo CW, Lv ZC, Yang

QS, Sheng O et al. 2012. Transcriptome profiling of resistant and

susceptible Cavendish banana roots following inoculation with Fusarium

oxysporum f.sp. cubense tropical race 4. BMC Genomics 13:374

(http://www.biomedcentral.com/ 1471-2164/13/374).

72

Mohandas S, Sowmya HD, Saxena AK, Meenakshia S, Rania RT, Mahmood R.

2013. Transgenic banana cv. Rasthali (AAB, Silk gp) harboring Ace-

AMP1 gene imparts enhanced resistance to Fusarium oxysporum f.sp.

cubense race 1. Sci Hort 164:392–399.

Molina AB, Williams RC, Hermanto C, Suwanda, Komolog B, Kokoa, P. 2010.

Mitigating the threat of banana Fusarium wilt: understanding the

agroecological distribution of pathogenic forms and developing disease

management strategies. Australia: ACIAR 76 hlm.

Nicholas KB, Nicholas HB Jr, Deerfield DW II. 1997. GeneDoc: analysis and

visualization of genetic variation. EmbNet News 4:1–4.

Paul JY, Becker DK, Dickman MB, Harding RM, Khanna HK, Dale JL. 2011.

Apoptosis-related genes confer resistance to Fusarium wilt in transgenic

‘Lady Finger’ bananas. Plant Biotechnol J 9(9):1141-1148.

Perrakis A, Tews I, Dauter Z, Oppenheim AB, Chet I, Wilson KS, Vorgias CE.

1994. Crystal structure of a bacterial chitinase at 2.3 Å resolution.

Structure 2:1169–1180.

Selitrennikoff CP. 2001. Antifungal proteins. Appl Env Microbiol 67:2883-2894.

Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. 2011. MEGA5:

molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,

evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol

28:2731-2739.

Tsujibo H, Kubota T, Yamamoto M, Miyamoto K, Inamori Y. 2003.

Characterization of chitinase genes from an alkaliphilic Actinomycete,

Nocardiopsis prasina OPC-131. App Env Microbiol 69:894–900.

Watanabe T, Kanai R, Kawase T, Tanabe T, Mitsutomi M, Sakuda M, Miyashita

K. 1999. Family 19 chitinases of Streptomyces species: characterization

and distribution. Microbiol 145:3353–3363.

Yulong GAO, Wangzhen GUO, Lei W, Tianzhen Z. 2006. Isolation and

characterization of resistance and defense gene analogs in cotton

(Gossypium barbadense L.). Sci China Ser C: Life Sci 49(6):530-542.

Zhang J, Kopparapu NK, Yan Q, Yang S, Jiang Z. 2013. Purification and

characterisation of a novel chitinase from persimmon (Diospyros kaki)

with antifungal activity. Food Chem 138:1225–1232.