aus dem institut für humangenetik der universität … · kreislauferkrankungen mit hypertonie,...

Aus dem Institut für Humangenetik

der Universität Würzburg

Vorstand: Professor Dr. med. Holger Höhn

Die altersabhängige Makuladegeneration

Untersuchung zur genetischen Assoziation des Apolipoproteins E

und des Alpha-2-Makroglobulins

Inaugural - Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde der

Medizinischen Fakultät

der

Bayerischen Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg

vorgelegt von

Susanne Ziegler

aus Regensburg

Würzburg, Oktober 2004

Referenten

Referent: Prof. Dr. Bernhard Weber

Koreferent: Prof. Dr. Franz Grehn

Dekan: Prof. Dr. Georg Ertl

Tag der mündlichen Prüfung: 2.November 2005

Die Promovendin ist Ärztin

MEINEN ELTERN

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

1.1 Die altersabhängige Makuladegeneration 2 1.1.1 Allgemeines 2 1.1.2 Morphologie und Klassifikation 3 1.1.3 Pathogenese 4 1.1.4 Ätiologie 7 1.1.5 Klinik und Diagnose 8 1.1.6 Therapeutische Maßnahmen 10 1.2 Die genetische Entschlüsselung komplexer Krankheiten 11 1.3 Problemstellung und Ziel der Arbeit 13 1.3.1 AMD – eine komplexe Krankheit und der schwierige Weg zur Erforschung ihrer

genetischen Komponenten 13 1.3.2 Apolipoprotein E 16 1.3.3 Alpha-2-Makroglobulin 17 1.3.4 Ziel der Arbeit 19

2 Material und Methoden 22

2.1 AMD-Patienten 22 2.2 Kontrollgruppen 22 2.3 DNA-Isolierung aus EDTA-Blut 24 2.4 Amplifizierung von Genbereichen 25 2.5 Primer 27 2.6 DNA-Spaltung mit Restriktionsendonukleasen 28 2.7 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten 29 2.7.1 DNA-Agarose-Gelelektrophorese 30 2.7.2 Überprüfung von PCR-Produkten durch Agarose-Gelelektrophorese 31 2.7.3 Polyacrylamid-Gelelektrophorese 31 2.8 Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) 33 2.9 Denaturierungs-Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) 34 2.9 DNA-Sequenzierung nach der Didesoxymethode 37 2.10 Statistische Auswertung 39 2.11 Puffer und Lösungen 46

3 Ergebnisse 47

3.1 Analyse der Apolipoprotein E Allelhäufigkeiten 47 3.1.1 PCR -Amplifikation des APOE Exons 4 47 3.1.2 DGGE 50 3.1.3 SSCP 55 3.1.4 Enzymatische Restriktionsspaltung 55 3.1.5 Auftrennung der verdauten PCR-Produkte 57 3.1.6 Bestimmung der unterschiedlichen Genotypen 59 3.1.7 Auswertung der Allelhäufigkeiten 60 3.2 Analyse der Alpha-2-Makroglobulin Allelhäufigkeiten 67 3.2.1 PCR-Amplifikation des A2M Polymorphismus 67 3.2.2 Auftrennung der PCR-Produkte auf Polyacrylamidgelen 69

Inhaltsverzeichnis

3.2.3 Bestimmung der unterschiedlichen Genotypen 70 3.2.4 Auswertung der Allelfrequenzen 71

4 Diskussion 75

4.1 Studiendesign 75 4.1.1 Komplexität der AMD – Hinweise auf eine genetische Ursache 75 4.1.2 Genetische Analyse der AMD 76 4.1.3 AMD und Alzheimer- gemeinsame Phänomene? 78 4.2 Methodenauswahl 81 4.2.1 Bestimmung des ApoE-Allelstatus 81 4.2.2 Bestimmung des A2M-Allelstatus 81 4.3 Bewertung der Ergebnisse 82 4.3.1 Assoziation der untersuchten ApoE-Allele mit der AMD 83 4.3.2 Signifikante Unterschiede des ApoE-4-Allels in verschiedenen Altersgruppen 84 4.3.3 Studienvergleich 85 4.3.3.1 Vergleich mit der Klaver-Studie 86 4.3.3.2 Vergleich mit der Souied-Studie 87 4.3.3.3 Vergleich mit der Pang-Studie 88 4.3.3.4 Vergleich mit der Schmidt-Studie 88 4.3.3.5 Vergleich mit der Simonelli-Studie 90 4.3.3.6 Vergleich mit der Schultz-Studie 91 4.3.3.7 Vergleich mit der Baird-Studie 91 4.3.3.8 Vergleich mit der Zareparsi-Studie 93 4.3.3.9 Übersicht Studienvergleich 94 4.3.3.10 Interpretation 96 4.3.4 Assoziation des A2M-1 und A2M-2 mit der AMD 98 4.4 Ausblick 99 4.4.1 Erforschung der AMD als komplexe Krankheit 99 4.4.2 Mögliche Rolle von Umweltfaktoren 99 4.4.3 Möglichkeiten der funktionellen Genetik im Hinblick auf die Erforschung der

AMD-Pathogenese 100

5 Zusammenfassung 102

5.1 Ziel 102 5.2 Voraussetzung 102 5.3 Methoden 103 5.4 Ergebnisse 103 5.5 Interpretation 104

6 Literaturverzeichnis 106

Einleitung 1

1. Einleitung

Die altersabhängige Makuladegeneration (AMD) ist eine degenerative Netz-

hauterkrankung. Sie beginnt nicht vor dem 50. Lebensjahr. Von den über 75-

Jährigen leiden aber ca. 35% unter diesem schleichenden Verlust ihrer Seh-

schärfe (Schick et al., 2001). Europaweit sind somit mehr als 12 Millionen Men-

schen betroffen. Die Ätiologie der AMD ist bis heute unklar. Unsere Vorstellun-

gen altersassoziierter Erkrankungen haben sich in den letzten Jahren erheblich

verändert. Wie Francois et al. 1977 aufzeigen, wird in diversen Publikationen,

bereits aus den dreißiger Jahren des vorigen Jahrhunderts, eine mögliche ge-

netische Ursache der AMD diskutiert. Heute findet dieser Ansatz wieder ver-

stärkt Beachtung. Noch in den achtziger Jahren brachten epidemiologische

Studien in erster Linie Umweltfaktoren, Einflüsse der Lebensweise sowie ande-

re Erkrankungen mit der AMD ursächlich in Verbindung. Heute geht man davon

aus, dass die AMD eine multifaktorielle Erkrankung mit mehreren prädisponie-

renden genetischen Risikokonstellationen und erkrankungspromovierenden

Umweltfaktoren darstellt.

Die Rolle der Gene für komplexe, altersassoziierte Erkrankungen findet zuneh-

mend Beachtung. Durch die Entwicklung neuer Methoden lassen sich geneti-

sche Loci definieren, die mögliche Risikofaktoren einer komplexen Erkrankung

darstellen. Die Untersuchung der genetischen Grundlagen multifaktorieller

Krankheiten wie der AMD steht noch am Anfang.

Neben einer Einführung in die Komplexität der AMD geben die folgenden Kapi-

tel der Einleitung einen Überblick über die Schwierigkeiten, bisherigen Erfolge

und unterschiedlichen Ansätze der Entschlüsselung komplexer Krankheiten

einschließlich der AMD.

Einleitung 2

1.1 Die altersabhängige Makuladegeneration 1.1.1 Allgemeines Bereits 1855 beschrieb der niederländische Augenarzt Frans Donders eine im

höheren Alter auftretende Augenerkrankung, die heute als altersabhängige Ma-

kuladegeneration (AMD) bekannt ist (Krott et al., 1996). Die AMD ist die häu-

figste Form der Netzhautdystrophien. Sie ist durch degenerative Veränderun-

gen der Makula gekennzeichnet, die in vielen Fällen zu einem Verlust des

Farbsinns und der zentralen Sehschärfe führen. Einen Eindruck der degenerati-

ven Veränderung bei der AMD an der Makula geben die Fundusaufnahmen in

Abbildung 1.

Die AMD ist im höheren Alter eine der häufigsten Ursachen für einen partiellen

Sehverlust. Der Ausfall des zentralen Gesichtsfeldes kann bis hin zur Blindheit

führen. Die demographischen Veränderungen innerhalb unserer Gesellschaft

bedeuten einen Anstieg der Inzidenz und Prävalenz altersabhängiger, degene-

rativer Erkrankungen. Mit Veränderung der Alterspyramide in den Industrienati-

onen nimmt somit auch die Prävalenz der AMD zu. Zahlreiche Populationsstu-

dien belegen, dass die Prävalenz der AMD ab dem 50. Lebensjahr zunimmt.

Einleitung 3

Repräsentative Zahlen nennt beispielsweise die in den USA durchgeführte

Beaver Dam Eye Study (Schwartz et al., 1994). In der Gruppe der 65- bis 74-

Jährigen tritt die frühe AMD mit einer Frequenz von 18,0% auf, die Spätformen

der AMD mit einer Frequenz von 1,4%. Bei der Gruppe der über 75-Jährigen

lagen die entsprechenden Zahlen bei 29,7% und 7,1%. Beim Vergleich der bei-

den Geschlechter war die Häufigkeit für die frühe Form der AMD sehr ähnlich,

allerdings trat die späte Form der AMD bei den über 75-Jährigen häufiger bei

Frauen (7,8%) als bei Männern (5,6%) auf (Evans et al., 1996).

Noch immer sind trotz intensiver, weltweiter Forschung die tatsächlichen Ursa-

chen und die genaue Pathogenese der AMD unbekannt. Angesichts der be-

grenzten Therapiemöglichkeiten stellt die AMD in unserer Gesellschaft ein

wachsendes sozioökonomisches Problem dar. AMD-Patienten verlieren nicht

nur ihre Sehkraft, sondern damit auch ihre Unabhängigkeit im alltäglichen Le-

ben. Soziale Beziehungen werden erschwert, ein Zurechtfinden im öffentlichen

Leben ist nur noch mit einer Begleitperson möglich.

1.1.2 Morphologie und Klassifikation

Das morphologische Erscheinungsbild einer AMD ist vielfältig und wird in eine

frühe Form der AMD und eine späte Form eingeteilt. Degenerative Veränderun-

gen im Bereich der Makula sind ein zunehmend häufiger Befund ab dem 50.

Lebensjahr. Doch nicht jede altersbedingte, degenerative Erscheinung der Ma-

kula darf mit einer beginnenden AMD gleichgesetzt werden.

Die Klassifikation nach Bird teilt die AMD nach ihrem klinischen Erscheinungs-

bild in eine frühe AMD und eine fortgeschrittene Form ein (Bird et. al., 1995).

Charakteristische ophthalmologische Läsionen einer frühen AMD sind weißlich-

gelbliche Punkte, so genannte Drusen, und Bereiche verstärkter Pigmentation

oder Atrophie des retinalen Pigmentepithels (RPE). Dies sind die Anfangssta-

dien einer AMD. Isoliert auftretende, harte Drusen dagegen gelten als altersab-

hängige Degenerationserscheinungen ohne pathologischen Wert.

Die Bird-Klassifikation bezeichnet die frühe Form als altersabhängige Makulo-

pathie (age-related maculopathy, ARM). Den Begriff der altersabhängigen Ma-

kuladegeneration (age-related macular degeneration, AMD) reservieren Bird et

Einleitung 4

al. für fortgeschrittenere Stadien, die bereits eine Minderung der Sehstärke be-

dingen.

1.1.3 Pathogenese Im normalen Auge werden täglich die Außensegmente der Photorezeptoren, in

denen sich die photosensitiven Sehpigmente befinden, erneuert. Photorezep-

toraußensegmente werden vom retinalen Pigmentepithel (RPE) phagozytiert, in

Lysosomen verdaut, und durch die Kapillaren der Choroidea gereinigt. Das

RPE wird von der Choriokapillaris durch eine fünfschichtige Basalmembran ge-

trennt, die so genannte Bruchsche Membran. Es ist bekannt, dass sich die

Bruchsche Membran im Laufe des Alters verdickt und es in frühen Stadien der

ARM zu einer Akkumulation von lipidreichen Zellablagerungen kommt. Diese

Ablagerungen bedingen eine progrediente RPE-Insuffizienz und tragen zur Ent-

stehung von Drusen, einem der charakteristischen klinischen Zeichen einer frü-

hen ARM, bei (Pauleikhoff, 1994).

Bei der Frühmanifestation der AMD unterscheidet man zwischen den fokalen,

harten oder weichen Drusen im Gegensatz zu den flächigen, diffusen Drusen.

Harte Drusen haben einen Durchmesser von weniger als 50 µm, weiche Drusen

sind größer und unschärfer begrenzt. Diese fokalen Drusen unterliegen sponta-

nen Veränderungen. Harte Drusen können mit der Zeit zu weichen Drusen kon-

fluieren oder aber auch kalzifizieren (Holz, 2003).

Histologisch unterscheidet man zwischen zwei verschiedenen Formen von Ab-

lagerungen. Basal laminare Ablagerungen setzen sich aus granulärem Material

zusammen, das von weitmaschigem Kollagen durchsetzt ist. Dieses Material ist

zwischen der Plasmamembran und der Basalmembran des RPE lokalisiert. Da-

gegen entstehen die basal linearen Ablagerungen in der inneren Kollagen-

schicht der Bruch’schen Membran und bestehen aus Vesikeln mit oder ohne

Hülle sowie aus Membranbruchstücken (Green, 1999).

Physiologisch bedingen die Ablagerungen nur eine reduzierte Funktion der Re-

tina. Nach diesem Anfangsstadium nimmt die frühe ARM unterschiedliche Ver-

Einleitung 5

laufsformen an, wobei unabhängig von der Art der primären Ablagerungen alle

Formen einer AMD entstehen können (Green, 1999).

RPE-Veränderungen äußern sich als Depigmentation, Hypertrophie, Hyperpla-

sie und Atrophie und werden häufig unter dem Begriff „Pigment-Modellierung“

zusammengefasst. Weiterhin kann es zur Entstehung so genannter weicher

Drusen, einer choroidalen Neovaskularisation und zur Vernarbung kommen.

Abbildung 2 gibt einen Überblick über die unterschiedlichen morphologischen

Erscheinungsformen einer AMD, ihre Abgrenzungen und Wechselbeziehungen

untereinander. Wie aus dem Diagramm ersichtlich wird, sind die Übergänge der

unterschiedlichen Formen der AMD fließend.

Einleitung 6

Die häufig zur morphologischen Einteilung gebrauchten Begriffe trockene (syn.

atrophische) AMD und feuchte (syn. seröse, exsudative, neovaskuläre) AMD

bezeichnen die beiden häufigsten irreversiblen Endstadien einer AMD, zum ei-

nen die Atrophie des RPE und zum anderen die choroidale Gefäßneubildung

(choroidale Neovaskularisation,CNV) mit eventueller Vernarbung. Die CNV

kann einen serösen oder hämorrhagischen Verlauf nehmen (Green, 1999). Ab-

bildungen 3 und 4 geben einen schematischen Einblick in die degenerativen

RPE-Veränderungen.

Einleitung 7

1.1.4 Ätiologie

Die der AMD zugrunde liegenden Ursachen sind noch unbekannt. Der stärkste

Risikofaktor ist sicherlich das Alter. In jungen Jahren tritt eine AMD nicht auf.

Als einzig gesicherter, exogener Risikofaktor gilt das Zigarettenrauchen. Epi-

demiologische Studien ergaben eine positive Korrelation zwischen dem Kon-

sum von Zigaretten und einem erhöhten Risiko für die Entwicklung einer AMD

(Chan et al., 1998; Delcourt et al., 1998). Der Pathomechanismus ist noch un-

klar. Plausibel erscheint eine durch das Rauchen bedingte Reduktion von Se-

rum-Antioxidantien, die die Makula vor Sauerstoff-Radikalen schützen. Herz-

Kreislauferkrankungen mit Hypertonie, Mangelernährung und UV-Belastung

werden zwar als Risikofaktoren diskutiert, eindeutige Zusammenhänge konnten

jedoch noch nicht gezeigt werden (Holz, 2003). Auch die Rolle genetischer Dis-

Einleitung 8

positionen, also endogene Risikofaktoren für die AMD ist bisher nicht geklärt.

Gerade die Erforschung genetischer Ursachen würde aber zum Verständnis der

pathogenetischen Mechanismen beitragen und somit neue Möglichkeiten zur

Entwicklung gezielter Therapieansätze bieten.

1.1.5 Klinik und Diagnose

Unabhängig von den unterschiedlichen Verlaufsformen der AMD führen diese

degenerativen Veränderungen mit der Zeit zu einer Minderung der zentralen

Sehkraft. AMD-Patienten suchen den Arzt auf, weil sie Dinge verschwommen

oder verzerrt sehen, ein Symptom, das man als „Metamorphopsien“ bezeichnet.

Die Minderung der Sehstärke kann sich sowohl langsam über einen längeren

Zeitraum entwickeln als auch sehr plötzlich eintreten. Bereits in der Anamnese

geben ein höheres Lebensalter und die Angabe von Metamorphopsien einen

deutlichen Hinweis auf das Vorliegen einer AMD. Erhärtet wird der Verdacht

durch eine anschließende Prüfung der Sehschärfe, die bei AMD Patienten stark

herabgesetzt sein kann (Visus < 0,1). Auch ein positives Ergebnis beim Test mit

dem Amsler-Quadrat (Abbildung 5) deutet auf eine AMD hin.

Einleitung 9

Frühe Stadien einer AMD, also beginnende RPE-Ablagerungen, sind am Au-

genfundus nicht sichtbar. Erst weitere morphologische Veränderungen ermögli-

chen eine Diagnose in der Ophthalmoskopie.

Der direkten Diagnose dienen die Ophthalmoskopie, die Fluoreszenz-

angiographie und die Indozyanin-Grün-Angiographie. Bei der Ophtalmoskopie

erkennt man am Augenhintergrund bei der trockenen Form der AMD das

atrophierte retinale Pigmentepithel im Bereich der Makula. Die feuchte Form

imponiert als seröse Abhebung von Netzhaut und Pigmentepithel. Im fortge-

schrittenen Stadium erkennt man subretinale Neovaskularisationen und even-

tuell eine zentrale Narbe, Junius-Kuhnt genannt. Mittels der Fluoreszenzangi-

ographie lassen sich durch Darstellung der Gefäße am Augenhintergrund Defi-

zite des retinalen Pigmentepithels sowie eine mögliche subretinale Neovaskula-

risation diagnostizieren (Pauleikhoff et al., 1999). Dies ist besonders im Hinblick

auf die Therapiemöglichkeiten von Bedeutung. Die Indozyanin-Grün-

Angiographie ermöglicht durch den besonderen Farbstoff eine selektive Darstel-

Einleitung 10

lung der Choroideagefäße. Dadurch kann man bereits sehr früh eine beginnen-

de Neovaskularisation diagnostizieren und diese entsprechend frühzeitig und

mit höheren Erfolgschancen therapieren.

Die Klassifikation und Einteilung der AMD wurde durch die vielfältigen Erschei-

nungsformen mit unterschiedlicher Lokalisation, variierender Größe und Läsi-

onstypen erschwert. Über die Jahre hinweg hat sich eine Vielzahl von Definitio-

nen in epidemiologischen Studien ergeben, die einen Vergleich der Studiener-

gebnisse schwierig macht. In der Hoffnung eine einheitliche Klassifikation zu er-

reichen, hat die Studiengruppe des Londoner Retinaspezialisten Alan Bird (The

International Age-related Maculopathy Epidemiological Study Group) ein Sys-

tem zur Einteilung der AMD anhand detaillierter Beurteilungskriterien von Farb-

aufnahmen des Augenfundus vorgeschlagen (Bird et al., 1995), das sich inzwi-

schen international etabliert hat.

1.1.6 Therapeutische Maßnahmen

Eine ursächliche Therapie der AMD gibt es bis heute nicht. Die derzeit einzig

wirksamen Therapien sind die Laserphotokoagulation (Macular Photocoagulati-

on Study Group, 1991), die Photodynamische Therapie (Schmidt-Erfurth et al.,

1999) und die in den USA in großangelegten Studien durchgeführte Supple-

mentierung von Mikronährstoffen (AREDS report no. 9, 2001).

Gegen die trockene Form einer AMD gibt es bis heute keine Therapie. Hier

kann man den Patienten nur stark vergrößernde Sehhilfen zur Verfügung stel-

len. Die Laserphotokoagulation wird nur in Fällen feuchter AMD mit meist nur

vorübergehendem Erfolg angewendet. Eine Indikation zur Laserung besteht nur

bei einer gut abgrenzbaren, subretinalen Neovaskularisation, die nicht innerhalb

der Fovea liegt, was allerdings nur in 5-10% aller Fälle von feuchter AMD gege-

ben ist (Macular Photocoagulation Study Group, 1991). Meist kann die Aus-

schaltung einer solchen Läsion mit dem Laser ein Rezidiv nicht verhindern.

Eine weitere Therapiemöglichkeit stellt die Photodynamische Therapie dar, die

bei subretinalen Membranen die Progredienz der AMD vermindern kann

(Schmidt-Erfurth et al., 1999).

Einleitung 11

Chirurgische Interventionen umfassen die Extraktion subretinaler Membranen

mittels Vitrektomie, die Translokation der Makula über intaktes RPE sowie die

autologe Verlagerung von peripherem RPE oder Irispigmentepithel. All diese

chirurgischen Methoden sind zwar vielversprechend, bisher konnte aber die

Rezidivrate durch die operative Therapie nicht gesenkt werden (Kirchhof, 2003).

Bei der Supplementierung von Mikronährstoffen führt man antioxidativ wirkende

Vitamine, Carotinoide und Spurenelemente zu, die bei rechtzeitigem Beginn ei-

ner AMD vorbeugen und, bei bereits eingetretener Erkrankung, die Progression

des Krankheitsverlaufs verlangsamen oder gar bremsen können. Unter den Ca-

rotinoiden erwiesen sich vor allem Lutein und Zeaxanthin als besonders effek-

tiv. Lutein und Zeaxanthin sind natürliche Bestandteile der Makula und werden

deshalb auch als „makuläre Pigmente“ bezeichnet. Sie finden sich vor allem im

Bereich der Fovea in hoher Konzentration (Landrum et al., 2001). Werden diese

Carotinoide im höheren Alter nicht ausreichend mit der Nahrung zugeführt, sinkt

die Konzentration und damit auch der Schutz vor oxidativen Stoffen, den „freien

Radikalen" in der Makula. Dies scheint das Entstehen bzw. das Fortschreiten

einer AMD zu begünstigen. Durch die exogene Zufuhr von Vitaminen und Spu-

renelementen mit antioxidativer Wirkung, wie Vitamin C und E, β-Karotin und

Zink, mit der Nahrung erreicht man eine Steigerung der Konzentration von anti-

oxidativ wirkenden Stoffen in der Netzhaut. Bereits mehrere Studien belegen

erste Erfolge dieses Therapieansatzes (AREDS report no. 9, 2001; Sackett et

al., 2002 ).

1.2 Die genetische Entschlüsselung komplexer Krankheiten

Unter dem Begriff „komplexe Erkrankungen“ fasst man alle Phänotypen nicht

monogenischer, mendelnder Krankheiten zusammen. Synonym werden auch

die Begriffe „multifaktorielle“ oder „quantitative“ Erkrankung gebraucht. Ur-

sachen einer komplexen Krankheit sind vielgestaltig, vermutlich ein Zusammen-

spiel exogener, also umweltbedingter Faktoren und endogener, genetischer

Faktoren. Diese genetischen Faktoren entsprechen jedoch keinem definierten

Einleitung 12

Phänotyp. Der zugrunde liegende Genotyp kann entweder zufällig sein, oder

aber durch Umweltfaktoren oder Wechselwirkungen mit anderen Genen zu ver-

schiedenen Phänotypen führen. Denkbar ist auch, dass verschiedene Genoty-

pen einen einzelnen Phänotyp bestimmen und diesen quantitativ beeinflussen.

Die genetische Kartierung hat in den letzten Jahren viele Gene, die monogeni-

sche Erbkrankheiten hervorrufen, erfolgreich identifiziert und aufgrund ihrer Po-

sition kloniert. Bei der genetischen Kartierung vergleicht man das Erbmuster der

Erkrankung mit dem Muster der Vererbung chromosomaler Regionen. Anhand

polymorpher genetischer Sequenzen der menschlichen DNA lassen sich solche

Kandidatenregionen weiter eingrenzen und die krankheits-assoziierten Gene

schließlich identifizieren (Lander et al., 1994).

Komplexe Erkrankungen entziehen sich größtenteils dieser Methode, da sich

ein spezifisches Vererbungsmuster innerhalb eines Stammbaums nicht oder

nur schwer erkennen lässt. Oft ist es nicht möglich, einen genetischen Marker

zu finden, der mit der Krankheit vererbt wird (segregiert). Die Gründe hierfür

können vielfältig sein und reichen von unvollständiger Penetranz über geneti-

sche Heterogenität bis hin zu polygenischer Vererbung. Dies alles erschwert die

Suche nach einem Anhaltspunkt für eine genetische Beteiligung an einer kom-

plexen Krankheit.

Um diese Schwierigkeiten zu bewältigen ist es sinnvoll, mögliche genetische

Ursachen einzuengen. In der genetischen Epidemiologie versucht man deshalb,

zuerst die Inzidenz und das Muster, mit denen die Krankheit innerhalb einer

Familie oder Population auftritt, zu ermitteln. Strategien für eine solche Eingren-

zung sind: Zwillingsstudien, die Bestimmung des relativen Risikos mit Ge-

schwisterstudien und die Durchführung von Familien-Segregations-Analysen.

Die Krankheit selbst sollte anhand ihres klinischen Erscheinungsbildes, des Al-

ters bei Auftreten der Erkrankung, der Familiengeschichte und des Schwere-

grads exakt beschrieben werden.

Hat man eine komplexe Erkrankung mittels der genannten Strategien definiert,

gibt es im Prinzip vier verschiedene Ansätze zur genetischen Entschlüsselung

der krankheitsverursachenden Komponenten: Kopplungsanalysen, Allel-

Sharing-Analysen innerhalb von Familien, Assoziationsstudien und Kreuzungs-

Einleitung 13

experimente im Tiermodell. All diese Ansätze haben sowohl Vor- als auch

Nachteile und nicht alle eignen sich für die Erforschung einer bestimmten kom-

plexen Erkrankung. Wegen des hohen Manifestationsalters ist es beispielswei-

se bei der AMD schwierig, eine Familie mit ausreichend vielen Betroffenen für

die Durchführung einer Kopplungsanalyse zu finden. Dies ist sicherlich ein

Grund, warum es nur wenige Familienstudien über die genetischen Ursachen

der AMD gibt.

1.3 Problemstellung und Ziel der Arbeit

Angesichts der zunehmenden Prävalenz und Inzidenz der AMD wird diese Er-

krankung immer mehr Gegenstand intensiver, weltweiter Forschung. Eine Auf-

klärung der Pathogenese würde neue Ansatzpunkte für eine effektive Therapie

bieten.

1.3.1 AMD – eine komplexe Krankheit und der schwierige Weg zur Erfor-schung ihrer genetischen Komponenten

Wie bereits erwähnt handelt es sich bei der AMD um eine ätiologisch komplexe

Augenerkrankung, wobei bisher erst wenige exogene Faktoren als gesichert

gelten. Familien- und Geschwisterstudien haben bewiesen, dass es eine deutli-

che genetische Disposition für die AMD gibt (Seddon et al., 1997; Yates et al.,

2000), die vermutlich in Abhängigkeit von exogenen Faktoren die Entstehung

der Erkrankung begünstigt.

Einen Ansatzpunkt für die Erforschung dieser genetischen Disposition bieten

die bekannten Gene hereditärer Retinadystrophien wie Morbus Best, Morbus

Stargardt, die Sorsby Fundusdystrophie und die Doyne Honeycombsche Reti-

nadystrophie. Sie alle besitzen phänotypische Ähnlichkeit mit dem klinischen

Bild der AMD. Die zugrunde liegenden Krankheitsgene gelten daher auch als

mögliche Kandidatengene für die AMD. Bisher wurden 156 Genorte mit Netz-

hautdystrophien assoziiert, 110 Gene davon kloniert (Stand vom 8.10.2004).

Eine Übersicht bietet hier das Online-Portal RetNet der Universität Houston,

Einleitung 14

Texas (http://www.sph.uth.tmc.edu/Retnet/). Es existieren erste Studien, die ei-

ne Assoziation dieser Kandidatengene mit der AMD untersuchen. Beispielswei-

se wurde das ABCR-Gen, das in mutierter Form für den Morbus Stargardt ver-

antwortlich ist, bereits in mehreren Studien bei AMD-Patienten auf Mutationen

hin analysiert. ABCR codiert für das Rim Protein (RmP), ein Protein des Au-

ßensegments der Zapfen (photoreceptor-specific ATP-binding cassette protein,

ABCR). Allikments et al. (1997) fanden eine erhöhte Prävalenz verschiedener

Varianten des ABCR-Gens unter AMD-Patienten. Nachfolgende Studien zu ei-

ner möglichen Assoziation von ABCR-Varianten mit AMD ergaben sowohl posi-

tive (Lewis et al., 1999; Shroyer et al., 1999) als auch negative Ergebnisse

(Stone et al., 1998; Kuroiwa et al., 1999; De La Paz et al., 1999; Rivera et al.,

2000). Die Hoffnung, durch die Aufklärung der pathogenetischen Zusammenhänge

dieser Erkrankungen einen Einblick in die Entstehung der komplexen AMD zu

gewinnen, ist ein langer und zeitaufwendiger Weg. Die Funktion dieser Krank-

heitsgene ist oft noch unklar und eine mögliche Assoziation mit der AMD wurde

bisher nur im Falle des ABCR-Gens gefunden.

Deshalb gibt es neue Ansätze zur Erforschung der multifaktoriellen AMD. Aus-

gehend von anderen neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzhei-

mer, versucht man Parallen zur Entstehung der AMD zu finden. Wie die AMD

ist die Alzheimer Erkrankung eine von vielen, weitgehend unbekannten Fakto-

ren verursachte Krankheit. Auch bei Morbus Alzheimer bilden Ablagerungen

aus Zellresten den Ausgangspunkt der Pathogenese. Diese Ablagerungen be-

stehen überwiegend aus β-Amyloid. Neueste Studien belegen, dass β-Amyloid

auch ein Bestandteil von Drusen bei AMD-Patienten ist. In der normalen Retina

hingegen ist β-Amyloid nicht nachweisbar. Auch in harten Drusen, die zu den

physiologischen Ablagerungen des RPEs im Alter zählen, findet man β-Amyloid

nicht (Johnson et al., 2002; Dentchev et al., 2003).

Eine Studie aus dem Jahr 1998 von Klaver et al. untersuchte das Gen für das

Apolipoprotein E hinsichtlich einer möglichen Assoziation mit der AMD. Apoli-

poprotein E (ApoE) spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese einiger neuro-

degenerativer Erkrankungen. Das Allel ApoE-ε4 des Apolipoprotein E-Gens

Einleitung 15

(APOE) ist ein erheblicher Risikofaktor für die Alzheimer Erkrankung (Corder et

al., 1993; Strittmatter et al., 1993; Saunders et al., 1993). Klaver et al. (1998)

stellten deshalb die Hypothese auf, dass ApoE aufgrund seiner vielfältigen

Funktionen im neuronalen Gewebe auch mit der AMD assoziiert sein könnte. In

ihrer Studie ermittelten sie die ApoE-Genotypen von 88 AMD-Patienten und 901

Kontrollpersonen und stellten einen signifikanten Unterschied in der Allelhäufig-

keit des ApoE-ε4 fest. Den Ergebnissen von Klaver et al. sowie einer weiteren

Studie von Souied et al. (1998) zufolge besitzt ApoE-ε4 einen protektiven Effekt

bezüglich der AMD. Träger des ApoE-ε2 Allels hingegen scheinen ein erhöhtes

Risiko für AMD zu haben, wobei diese Daten aber keine Signifikanz erreichen.

Inzwischen sind diverse Folgestudien publiziert, die kontroverse Ergebnisse

brachten. Zum einen konnte durch Studien die Assoziation des ApoE-ε4 Allels

mit der AMD im Sinne eines protektiven Faktors bestätigt werden (Schmidt et

al., 2000; Simonelli et al., 2001; Baird et al., 2004; Zareparsi et al., 2004), ande-

re Studien hingegen widerlegen bei gleichem Studiendesign eine Assoziation

des ApoE-ε4 mit der AMD (Pang et al., 2000; Schultz et al., 2003).

Das Studiendesign der vorliegenden Assoziationsstudie wurde 1999 konzipiert.

Ausgehend von den Studien von Klaver et al. (1998) und Souied et al. (1998),

die beide eine Assoziation von ApoE-ε4 mit der AMD nachweisen, sollte der

ApoE-Polymorphismus an einem neuen und weitaus größeren Patientenkollek-

tiv überprüft werden.

In Anlehnung an die Klaver-Studie wurde weiterhin der Ansatz aufgegriffen, von

einer neurodegenerativen Erkrankung wie der Alzheimer Erkrankung ausge-

hend Parallelen zur AMD zu finden. Möglicherweise sind mit der Alzheimer Er-

krankung assoziierte genetische Polymorphismen ebenfalls mit der AMD asso-

ziiert. Hierfür wurden mittels Literaturstudium alle bisher im Zusammenhang mit

der Alzheimer Erkrankung untersuchten Proteine bzw. deren häufige Poly-

morphismen zusammengefasst, insgesamt 7 Proteine. Proteine mit häufig vor-

kommenden Polymorphismen wie bei ApoE wurden in die engere Auswahl auf-

genommen. Erfolgversprechend erschien das Alpha-2-Makroglobulin, da einer

der beiden häufigen Polymorphismen des Alpha-2-Makroglobulin-Gens bereits

Einleitung 16

in einer Studie ebenfalls mit der Alzheimer Erkrankung assoziiert wurde (Bla-

cker et al., 1998).

Die folgenden Abschnitte bieten einen kurzen Überblick über die beiden in die-

ser Assoziationsstudie untersuchten Proteine.

1.3.2 Apolipoprotein E

Apolipoprotein E (ApoE) ist das vorherrschende Apolipoprotein des ZNS mit re-

gulatorischer Funktion im Cholesterin- und Lipidtransport. ApoE scheint eine

wichtige Rolle bei neurodegenerativen Prozessen zu spielen, da es mit einigen

degenerativen Erkrankungen des ZNS, vor allem der Alzheimer Erkrankung,

assoziiert ist. Es konnte in den krankheitsbedingten Läsionen mehrfach nach-

gewiesen werden (Klaver et al., 1998). Darüber hinaus wurde ApoE mit kardio-

vaskulären Erkrankungen assoziiert (Eichner et al., 2002).

Das kodierende Gen APOE ist auf Chromosom 19q13.2 lokalisiert, setzt sich

aus 4 Exonen zusammen und umspannt eine Region von 3,6 Kb. APOE ist po-

lymorph, es existiert in 3 häufigen Isoformen, den Allelen ApoE-ε2, ApoE-ε3

und ApoE-ε4 (Abbildung 6). Dabei stellt ApoE-ε3 das häufigste der 3 Allele dar.

75% der mitteleuropäischen Bevölkerung besitzen das ε3-Allel, hingegen kom-

men ApoE-ε2 und ApoE-ε4 in einer Häufikeit von nur 9% und 16% vor (Klaver

et al., 1998). Das ε3-Allel wurde deshalb in der Literatur bisher auch als das ur-

sprüngliche oder Wildtyp-Allel bezeichnet, ApoE-ε2 und ApoE-ε4 dagegen als

Varianten, die aufgrund von Punktmutationen entstanden sind (Mahley et al.,

1988). Neuere Studien dieser viel untersuchten Isoformen ergaben jedoch,

dass nicht das häufige ApoE-ε3, sondern das ApoE-ε4 am engsten mit dem

APOE des Schimpansen verwandt ist (Fullerton et al., 2000). Fullterton et al.

schlussfolgerten daraus, dass ApoE-ε4 das ursprüngliche Gen ist und ApoE-ε3

lediglich in den letzten 200 000 Jahren gegenüber ApoE-ε4 an Frequenz zuge-

nommen hat.

Bei diesen drei häufigen Isoformen des APOE handelt es sich um Einzelnukleo-

tid-Polymorphismen innerhalb einer kodierenden Region, auch als SNP (single-

nucleotide-polymorphisms) abgekürzt (Abbildung 6).

Einleitung 17

Diesen APOE-Polymorphismen gilt ein großes Interesse im Rahmen der Erfor-

schung neurodegenerativer Erkrankungen. Das ApoE-ε4 Allel ist ein gesicherter

Risikofaktor für die Alzheimer Erkrankung (Corder et al., 1993; Strittmatter et

al., 1993; Saunders et al., 1993).

1.3.3 Alpha-2-Makroglobulin

Alpha-2-Makroglobulin (α-2M) ist ein unspezifischer Proteinase-Hemmer des

humanen Serums, der eine Vielzahl unterschiedlicher Liganden besitzt, bei-

spielsweise entzündungsvermittelnde Zytokine, den Tumor-Nekrose-Faktor–

alpha, Interleukin I-beta und A-beta-Amyloid. Das Protein hat eine tetramere

Struktur, die mehrere Bindungsdomänen und eine inhibitorische Domäne auf-

weist (Roche et al., 1988). Das zugrunde liegende Gen A2M ist auf Chromo-

som 12p13.3-p12.3 lokalisiert, umfasst 36 Exone und erstreckt sich über 48 kb

Einleitung 18

(Matthijs et al., 1992). Aufgrund seiner Fähigkeit A-beta-Amyloid, die Haup-

komponente der Beta-Amyloid-Ablagerungen bei der Alzheimer Erkrankung, zu

binden und anschließend die Endozytose durch Neuronen zu vermitteln, wurde

es mit Alzheimer in Verbindung gebracht. Der α-2M -Rezeptor (LRP) bindet

auch mit ApoE beladene Lipoproteine. Die Proteine scheinen in enger Bezie-

hung zueinander zu stehen und tragen möglicherweise gemeinsam zu patholo-

gischen Veränderungen bei. Diese Überlegung wurde auch in die vorliegende

Arbeit integriert. Eine 1998 von Blacker et al. veröffentlichte Familienstudie be-

legte eine Assoziation eines häufigen Polymorphismus im A2M mit einem er-

höhten Risiko einer Erkrankung an Alzheimer ((Blacker et al. , 1998)). Als

Grundlage ihrer Untersuchungen zogen Blacker et al. die Gene aller bekannten

Liganden des ApoE-bindenden LRP1-Rezeptors als potentielle krankheitsasso-

ziierte Gene für Alzheimer in Betracht. Bei dem von ihnen untersuchten A2M-

Polymorphismus handelt es sich um eine 5bp Insertion/Deletion am 5’-

Spleißende des Exons 18 (-7 bis -3), die 1991 das erste Mal beschrieben wurde

(Matthijs et al., 1991). Blacker et al. (1998) klassifizierten das Allel mit Deletion

als A2M-2, das Allel ohne Deletion als A2M-1 (Abbildung 7). Obwohl es sich um

einen Polymorphismus in einer nicht-kodierenden Region handelt, scheint die

Deletion dennoch einen funktionalen Einfluss auf das Bindungsverhalten des

Plasma- α-2M zu haben: Das Plasma- α-2M von Patienten, die homozygot für

die Deletion sind, zeigt signifikante Änderungen im Bindungsverhalten u.a. für

TGF-1-beta (Hope et al., 2003).

Obwohl bereits im Jahr 2000 drei verschiedene Populationsstudien die Assozia-

tion von A2M mit Alzheimer widerlegten (Halimi et al., 2000; Gibson et al., 2000;

Blennow et al., 2000), bleibt das Gen dennoch ein interessanter Kandidat für

eine potentiell pathogenetische Rolle bei anderen neurodegenerativen Erkran-

kungen. Aufgrund der zentralen Vermittlerrolle, die das α-2M bei endozytoti-

schen Vorgängen im ZNS spielt, könnte es auch an der pathogenetischen Ab-

lagerung von Zellschutt beteiligt sein, die bei der AMD stattfindet. Deshalb wur-

den in dieser Studie an den Patienten- und Kontrollgruppen neben dem ApoE-

Allelstatus auch die Häufigkeitsverteilung der beiden Allele A2M-1 und A2M-2

des A2M untersucht.

Einleitung 19

1.3.4 Ziel der Arbeit Voraussetzung für die vorliegende Arbeit waren zwei Studien, die eine Assozia-

tion der ApoE-Polymorphismen ApoE-ε2, ApoE-ε3 und ApoE-ε4 mit der AMD

untersuchten (Klaver et al, 1998; Souied et al., 1998). Dabei stellten diese Stu-

dien folgende Hypothese auf: Das ApoE-ε4-Allel ist ein Risikofaktor für Morbus

Alzheimer (Corder et al., 1993). AMD ist wie Morbus Alzheimer eine neurode-

generative Erkrankung. Die Vermutung lag nahe, dass einer der ApoE-

Polymorphismen auch mit der AMD assoziiert sein könnte.

Die Ergebnisse beider Studien belegen eine Assoziation des ApoE-ε4-Allels mit

der altersabhängigen Makuladegeneration. Sowohl bei Klaver et al. (1998) als

Einleitung 20

auch bei Souied et al. (1998) trat das ApoE-ε4-Allel in der Gruppe der AMD-

Patienten (bei Klaver et al. n=88 AMD-Patienten, bei Souied et al. n=116 Pati-

enten) in signifikant geringerer Häufigkeit auf als in den Kontrollgruppen (ApoE-

ε4-Allelfrequenz bei Klaver et al. 0,7 in der Patientengruppe vs. 0,16 in der Kon-

trollgruppe, p=0,002; bei Souied et al. 0,7 vs. 0,15, p=0,006). Beide Studien

schlussfolgern daraus, dass ApoE-ε4 einen protektiven Effekt für das Erkran-

kungsrisiko bei AMD hat. Überraschenderweise wirkt das ApoE-ε4-Allel für

AMD protektiv, bei Morbus Alzheimer hingegen erhöht es das Risiko.

In der vorliegenden Studie sollte eine mögliche Assoziation des ApoE-ε4-Allels

mit der AMD an einem neuen, regional begrenzten Patientenkollektiv untersucht

werden. Die Größe der Patientengruppe lag mit einer Anzahl von 400 Proban-

den deutlich über den Gruppenstärken in den beiden Vorgängerstudien. Alle

Patienten waren kaukasischer Abstammung. Auch hinsichtlich der Kontroll-

gruppen zeigte das Studiendesign Unterschiede. Die beiden vorangegangenen

Studien arbeiteten mit Kontrollgruppen, die zwar keine AMD-Zeichen aufwie-

sen, im Durchschnittsalter aber bis zu 10 Jahre unter dem Alter der Patienten-

gruppen lagen (Durchschnittsalter Patienten vs. Kontrollen bei Klaver et al. 82

vs. 72 Jahre, bei Souied et al. 71 vs. 75 Jahre). Diese Kontrollgruppen können

Probanden enthalten, die erst jenseits des 75. Lebensjahres an AMD erkran-

ken. Die vorliegende Studie arbeitete hingegen mit einer altersgemäßen Kon-

trollgruppe (n=153), deren Durchschnittsalter mit 80 Jahren fast an das der Pa-

tientengruppe (Altersdurchschnitt = 82 Jahre) heranreicht. All diese Kontrollper-

sonen wurden auf Zeichen einer AMD untersucht und waren unauffällig. Zusätz-

lich wurde eine die Normalbevölkerung repräsentierende Kontrollgruppe

(n=200, Durchschnittsalter=39 Jahre) unterucht. Eine Assoziation des ApoE-ε4

mit der AMD sollte aufgrund der Größe der Patienten- und Kontrollgruppen so-

wie der Auswahl von altersgemäßen Kontrollen deutlich sichtbar werden.

Außerdem wurde folgende Überlegung angestellt: Auch andere mit Morbus

Alzheimer assoziierte, häufige Polymorphismen könnten genetische Ursachen

der AMD darstellen. Hierfür wurden mittels Literaturstudium alle bisher im Zu-

sammenhang mit Morbus Alzheimer untersuchten Gene bzw. assoziierte Poly-

morphismen zusammengefasst. Gene mit häufig vorkommenden Polymorphis-

Einleitung 21

men wurden in die engere Auswahl aufgenommen. Die Untersuchung des Al-

pha-2-Makroglobulin (A2M), ein unspezifischer Proteinase-Hemmer im mensch-

lichen Serum mit einer Vielzahl von Liganden, erschien erfolgversprechend. Ei-

ner der beiden häufigen Polymorphismen des Gens wurde in einer Studie mit

der Alzheimer Erkrankung assoziiert (Blacker et al., 1998). Studien, die eine

Assoziation von A2M mit AMD untersuchen, wurden noch nicht publiziert. An

den bereits oben genannten Patienten- und Kontrollgruppen wurde deshalb zu-

sätzlich untersucht, ob einer der beiden häufigen A2M-Polymorphismen mit der

AMD assoziiert ist.

Material und Methoden 22

2 Material und Methoden

2.1 AMD-Patienten Insgesamt wurden für diese Arbeit Blutproben von 400 AMD Patienten

kaukasischer Abstammung herangezogen, wobei sowohl Patienten mit feuchter

AMD als auch Fälle von trockener AMD in die Studie eingingen (Alter im

Durchschnitt 82,3 Jahre; n =400; Bereich 60-93 Jahre). Die Herkunft der

Patienten-DNAs teilte sich folgendermaßen auf: 150 AMD-Patienten-DNAs

stammen aus der Augenklinik des Universitätsklinikums Münster, 50 DNAs von

Patienten aus der Universitäts-Augenklinik in Heidelberg, 165 AMD-Patienten-

DNAs aus der Augenklinik der Universität Würzburg und 35 DNAs von

Patienten der Universitäts-Augenklinik Tübingen (Tabelle 1). Alle Patienten

hatten zum Zeitpunkt der Diagnose und Blutentnahme klinisch manifeste

Zeichen einer AMD. Die Patienten-DNAs liegen in anonymisierter Form vor.

2.2 Kontrollgruppen

Die Kontrollgruppe differenziert sich in zwei Untergruppen. Hinsichtlich des

Probandenalters setzt sie sich aus einer Gruppe altersgemäßer Kontrollperso-

nen (Durchschnittsalter 80,3 Jahre; n =153; Bereich 68-102 Jahre) und einer

die Normalbevölkerung repräsentierenden Gruppe (Alter im Durchschnitt 39,8


Jahre; n =200; 1- 90 Jahre) zusammen. Auch die Personen der Kontrollgruppen

sind Kaukasier.

Die Gruppe der Altersgemäßen (n=153) stellt klinisch einwandfreie Kontrollen

dar, die ophthalmologisch untersucht wurden und bei ihrem hohen Alter nach-

weislich keine Anzeichen einer AMD aufwiesen. 92 der altersgemäßen DNA-

Kontrollen stammen aus der Augenklinik der Universität Münster, 61 aus der

Augenklinik der Heidelberger Universität (Tabelle 2).

Die Gruppe "Normalbevölkerung" setzt sich folgendermaßen zusammen: 78

DNA-Proben stammen von Albinismus-Patienten und deren Angehörigen, die

im Rahmen einer Albinismus-Studie am Uniklinikum Homburg an der Saar un-

tersucht wurden (Passmore et al., 1999), 118 DNAs von Personen, die im

Rahmen der Chorea Huntington-Diagnostik am Humangenetischen Institut der

Universität Würzburg untersucht wurden und aus ganz Deutschland stammen,

die restlichen 4 DNA-Kontrollen von Mitarbeitern des Humangenetischen Insti-

tuts der Universität Würzburg (Tabelle 2).

Auch die DNA-Proben aller Personen der Kontrollgruppen liegen in vollständig

anonymisierter Form vor.

Material und Methoden

24

2.3 DNA-Isolierung aus EDTA-Blut

Zur Gewinnung genomischer DNA benötigt man 10 ml EDTA-Blut. In einem 50

ml Falconröhrchen werden die 10 ml EDTA-Blut mit kaltem Lysis-Puffer auf ein

Gesamtvolumen von 40 ml aufgefüllt und anschließend für 15-30 Minuten auf

Eis inkubiert, wobei man das Röhrchen einige Male invertiert. Durch Zentrifugie-

ren (10 min, 2000 UpM, 4 C°) werden die kernhaltigen Leukozyten präzipitiert,

die sich als weißes Pellet an der Wand des Röhrchens anlagern. Man verwirft

den Überstand und löst das Pellet in 5 ml Lysispuffer und zentrifugiert wiederum

(10 min, 2000 UpM, 4 C°). Nachdem man den Überstand erneut abgeschüttet

hat, löst man das Pellet nun in 5 ml SE-Puffer, gibt 250 µl SDS (20%) und 50 µl

Pronase E (10 mg/ml) hinzu und inkubiert über Nacht bei Raumtemperatur oder

für 2-3 Stunden bei 55 C°. Bei diesem Schritt werden die kernhaltigen Leukozy-

ten aufgebrochen und assoziierte Proteine verdaut.

Nach der Proteolyse erfolgt die Salzextraktion. Die nun freigesetzte DNA wird

durch Zugabe von NaCl von Proteinen gereinigt und mit Ethanol gefällt. Man

versetzt hierzu die DNA-Lösung mit 2,5 ml SE-Puffer und 2,1 ml gesättigter

NaCl-Lösung (ca. 6 M) und mischt auf dem Vortex. Um eine Ausflockung des

zugesetzten SDS zu verhindern, erwärmt man die Lösung für 10 Minuten bei 55

C°. Anschließend werden durch Zentrifugation (15 min, 4.000 UpM, RT) die

ausgefällten Proteine und die Zelltrümmer präzipitiert. Den klaren Überstand

füllt man in ein frisches Falconröhrchen und fällt die enthaltende DNA mit 2 Vol

EtOH (100%). Die gefällte DNA, die man als weißes Knäuel sieht, fischt man

mit einem sterilen Glashaken aus der Lösung, wäscht sie mit 70% EtOH und

lässt sie 10-20 Minuten an der Luft trocknen. Anschließend gibt man die DNA in

ein mit 400-800 µl TE-Puffer gefülltes Kryoröhrchen und löst sie über Nacht bei

Raumtemperatur auf einem Heidolph-Schüttler.

Alle in dieser Arbeit verwendeten DNA-Proben wurden anhand der beschriebe-

nen Methode aus EDTA-Blut der Patienten und Kontrollpersonen gewonnen.


25

2.4 Amplifizierung von Genbereichen

Die von Saiki et al. (1985) beschriebene Polymerasekettenreaktion (engl. poly-

merase chain reaction = PCR) ist eine zell-unabhängige Methode der DNA-

Klonierung. Sie basiert auf den Prinzipien der DNA-Replikation und ermöglicht

es, eine spezifische Ziel-DNA-Sequenz aus genomischer DNA in vitro zu ampli-

fizieren. In dieser Arbeit wurde die PCR als Ausgangsbasis für die weiterfüh-

renden Untersuchungen eingesetzt.

Voraussetzung für eine PCR ist die Kenntnis der Sequenzen an den Enden des

ausgewählten Bereichs, da Oligonukleotide synthetisiert werden müssen, die

als so genannte „Primer“ die Zielregion einrahmen. Diese beiden Primer werden

so gewählt, dass sie antiparallel zueinander jeweils an einen der beiden DNA-

Stränge hybridisieren. Eine DNA-Polymerase verlängert dann in Gegenwart von

Desoxynucleosidtriphosphaten (dNTPs) die Primer entlang des DNA-Stranges

und synthetisiert so neue komplementäre DNA-Stränge.

Die heute standardmäßig eingesetzte DNA-Polymerase stammt aus dem ther-

mophilen Bakterium Thermus aquaticus (Taq-Polymerase). Dieses Enzym be-

sitzt ein Temperaturoptimum von über 70°C und ist für kurze Zeit bei Tempera-

turen von bis zu 95°C stabil.

Für den Reaktionsansatz benötigt man neben der DNA-Matrize (Template) zwei

der bereits erwähnten Oligonukleotid-Primer, die spezifisch an die zu amplifizie-

rende Sequenz binden, eine Mischung aller vier Desoxynukleotide (dATP,

dTTP, dGTP, dCTP), Reaktionspuffer und die Taq -Polymerase.

Die PCR-Reaktion besteht aus sich wiederholenden Temperaturzyklen. Jeder

Zyklus beginnt mit der Denaturierungsphase bei 94°C, in der die DNA-

Doppelstränge voneinander getrennt werden und so die Matrize für Primer und

DNA-Polymerase bilden. In der Annealingphase hybridisieren die Primer mit ih-

ren Zielsequenzen, wobei die Temperatur jeweils von der Sequenz der Oligo-

nukleotide abhängt. Sie schwankt je nach Primerpaar im Bereich von 40-65°C.

Schließlich werden in der Elongationsphase bei 72°C die Primer mit den dNTPs

durch die Aktivität der Taq-Polymerase entsprechend der DNA-Matrize in 5’-3’-

Richtung verlängert. Dabei dienen die neu synthetisierten DNA-Stränge in den


folgenden Zyklen als Matrizen für die weitere DNA-Synthese. Durch diese Ket-

tenreaktion entstehen nach etwa 30 Temperaturzyklen zusätzlich zur ursprüng-

lichen DNA ungefähr 105 Kopien der spezifischen DNA-Sequenz. Die abschlie-

ßende Elongationsphase, 5 Minuten bei 72 °C, soll die Ausbeute an PCR-

Produkten voller Länge erhöhen.

Den typischen 25µl-Ansatz einer Standard-PCR zeigt Tabelle 3.

Die Komponenten des PCR-Ansatzes werden in ein 200µl Eppendorff-Cap pi-

pettiert, auf Eis inkubiert und dann in den vorgeheizten PCR-Block gestellt.

Nach Ablauf der PCR-Zyklen und Abkühlen der Proben auf 5 C° werden je 10µl

der PCR-Produkte mit 5µl Ladepuffer vermischt und in die Taschen eines mit

Ethidiumbromid versetzten 1% Agarosegels geladen. Die gelelektrophoretische

Auftrennung erfolgt in der Laufkammer bei 120V für 30 Minuten. Als Längen-

standard lässt man eine DNA-Leiter mitlaufen. Nach der Auftrennung kann das

Gel unter einem UV-Tisch angeschaut werden. Bei gelungener Reaktion impo-

niert das PCR-Produkt als helle Bande auf Höhe der erwarteten Größe der spe-

zifischen DNA-Sequenz.


2.5 Primer

Das Gelingen einer PCR ist von verschiedenen Faktoren abhängig. Wichtig ist

vor allem die Wahl geeigneter Primer. Primer sind ssDNA-Sequenzen, die eine

Länge von etwa 20 bp haben sollten. Für die PCR-Reaktion benötigt man einen

forward- und einen reverse-Primer, die die zu amplifizierende Sequenz von bei-

den Seiten flankieren. Die Primer binden während der PCR-Reaktion bei einer

bestimmten Temperatur, der so genannten annealing Temperatur TA, an die

Einzelstränge der template-DNA. Die TA ist dabei von der spezifischen Sequenz

der Primer abhängig. Sie liegt etwa 5 °C unterhalb der Dissoziationstemperatur

TD der Oligonukleotide und wird nach dem CG- bzw. AT-Gehalt der Sequenz

nach der in Tabelle 4 angegebenen Formel berechnet oder aber mittels speziel-

ler Software ermittelt.

Ein Primerpaar sollte so gestaltet sein, dass die TA des forward- und des rever-

se-Primers in etwa übereinstimmen. Außerdem sollten sich innerhalb des Pri-

mers keine palindromen Sequenzen befinden, da der Primer sonst Sekundär-

strukturen bilden kann, die ein Annealing erschweren. Für dieses Primerdesign

existieren spezielle Computerprogramme, mit deren Hilfe sich geeignete Pri-

merpaare entwerfen lassen. Die in der Arbeit verwendeten Primer wurden alle

mit Generunner© angepaßt und überprüft.

Die empirisch ermittelte TA muss immer in einer Test-PCR überprüft werden.

Sie kann in einigen Fällen vom berechneten Wert abweichen.

Die Sequenzen der in der Arbeit verwendeten Primer und die durch Test-PCRs

ermittelten optimalen TA sind beispielhaft in Abbildung 8 dargestellt.


2.6 DNA-Spaltung mit Restriktionsendonukleasen

Restriktionsendonukleasen sind bakterielle Enzyme, die die DNA an spezifi-

schen Nukleotidsequenzen schneiden. In der Molekularbiologie werden haupt-

sächlich TypII-Restriktionsenzyme verwendet, komplexe Proteine, die sowohl

eine Restriktionsendonuklease- als auch eine Methylasefunktion besitzen. Sie

binden spezifisch an symmetrische Sequenzen aus vier oder mehr palindromi-

schen Nukleotidpaaren und schneiden dort. Dabei entstehen entweder über-

hängende, kohäsive (sticky) oder glatte (blunt) Enden (Kessler et al., 1985; Ro-

berts et al., 1988; Kornberg et al., 1974).

Das in der Arbeit verwendete Enzym Hha I bzw. dessen Isoenzym Cfo I

schneidet spezifisch die Sequenz GCGC und erzeugt dabei glatte Enden. Bei

einer Reaktionstemperatur von 37°C gewährleisten 2U Hha I pro µg DNA eine

vollständige Spaltung. Die Komponenten eines Spaltungsansatzes zeigt Abbil-

dung 9. Zur Kontrolle des Enzymverdaus wird eine Probe der gespaltenen DNA

auf einem Agarosegel aufgetrennt.


2.7 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten

Die Elektrophorese ist ein biochemisches Trennverfahren, bei dem die Wande-

rung von geladenen Molekülen in einem elektrischen Feld zu deren Trennung

ausgenutzt wird.

Nukleinsäuren sind durch ihr Zucker-Phosphat-Rückgrat negativ geladen. Im

elektrischen Feld wandert die DNA von der Kathode zur Anode. Bei der Gele-

lektrophorese wirkt die Gelmatrix aufgrund ihrer Porenstruktur wie ein Moleku-

larsieb: größere Moleküle bewegen sich langsamer durch die Gelporen hin-

durch als kleine Moleküle. Die Porengröße in Agarosegelen wird durch die Aga-

rose-Konzentration bestimmt, wobei die Porengröße mit steigender Konzentra-


30

tion des Gels abnimmt. Bei Polyacrylamidgelen wird die Porengröße entspre-

chend von der Konzentration des Acrylamids sowie vom Vernetzungsgrad des

Gels bestimmt.

Die Wanderungsgeschwindigkeit der DNA-Moleküle wird im Wesentlichen be-

stimmt von Molekülgröße und Gelkonzentration sowie von der Konformation der

DNA (linear, zirkulär, supercoil), der angelegten Spannung und dem verwende-

ten Laufpuffer.

2.7.1 DNA-Agarose-Gelelektrophorese

Mit der horizontalen Agarose-Gelelektrophorese lassen sich DNA-Fragmente

von 70bp bis etwa 50kb Länge schnell und einfach auftrennen. Linear dop-

pelsträngige DNA wandert im elektrophoretischen Feld mit einer Geschwindig-

keit, die umgekehrt proportional zum Logarithmus der Anzahl ihrer Nukleotid-

paare ist. Durch einen Vergleich mit definierten DNA-Längenstandards, die

während der Elektrophorese mitlaufen, lässt sich die Länge eines bestimmten

DNA-Fragments ermitteln. Die Agarose-Konzentration wählt man je nach Ab-

hängigkeit der Länge der aufzutrennenden DNA-Fragmente (0,7 % bis 2 %),

höhere Konzentrationen bei kurzen Fragmenten bzw. niedrige Konzentrationen

bei sehr großen Fragmenten und standardmäßig eine 1%ige Agarosekon-

zentration.

Zur Herstellung eines Agarose-Gels kocht man je nach gewünschter Konzentra-

tion x g (= x%) Agarose in 100ml 1 x TBE-Puffer so lange auf, bis die Lösung

klar ist. Anschließend kühlt man die Gellösung auf Handwärme ab, gibt 2 µl E-

thidiumbromid (10 mg/ml) hinzu, gießt sie in eine Gelkammer und setzt einen

Taschenformer ein. Nach ca. 30 Min ist das Gel polymerisiert und lässt sich be-

laden. Die DNA-Proben werden mit 0,5 Vol 10x Loading-Puffer versetzt und in

die Geltaschen pipettiert.

Die elektrophoretische Auftrennung erfolgt in 1 x TBE-Puffer bei 100 - 120 V in

etwa 20 Min. Während der Elektrophorese interkaliert das Ethidiumbromid im

Agarosegel zwischen den Basenpaaren der DNA. Nach der Auftrennung kann

man die DNA-Banden auf einem UV-Transilluminator anhand der roten Fluo-


31

reszenz des interkalierten Ethidiumbromids lokalisieren und deren Größe durch

einen Vergleich mit dem Längenstandard bestimmen.

2.7.2 Überprüfung von PCR-Produkten durch Agarose-Gelelektrophorese

Die Überprüfung der PCR-Produkte erfolgte durch elektrophoretische Auftren-

nung der Proben auf einem Agarosegel. Entsprechend der zu erwartenden

Größe der PCR-Produkte sowohl des ApoE und als auch des A2M im Bereich

von 100-300 bp wurde eine Agarosekonzentration von 1% gewählt. Als Län-

genstandard diente eine 1kb-Plus-DNA Leiter der Firma Gibco®.

Zu Dokumentationszwecken wurden die Gele nach der Auftrennung auf dem

UV-Transilluminator mit einem Bioprint-System fotografiert.

2.7.3 Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Auftrennung von DNA-Fragmenten auf Agarosegelen ist allerdings be-

grenzt. Längenunterschiede unter 50 Basenpaaren werden nur ungenau darge-

stellt. Um DNA-Fragmente, die sich in ihrer Länge beispielsweise nur um eine

Base unterscheiden, auftrennen zu können, benötigt man höher vernetzte Gele.

Hierfür wurden Polyacrylamid-Gele verwendet, deren Zusammensetzung je

nach gewählter Methode variierte.

Polyacrylamidgele zeichnen sich gegenüber Agarosegelen durch ein genaueres

Auftrennungsvermögen aus. Sie eignen sich zur Auftrennung von DNA-

Fragmenten im Größenbereich von ca. 10bp bis 2000bp, selbst Fragmentunter-

schiede von 1bp sind auf den Gelen detektierbar.

Polyacrylamid entsteht durch Polymerisation von Acrylamid-Polymeren. Die Ge-

le entstehen durch Quervernetzung mit bifunktionalen Verbindungen wie z.B.

N,N‘-Methylenbisacrylamid (Bis), das die Ketten des Acrylamids untereinander

vernetzt und so die dreidimensionale Struktur des Gels herstellt. Gestartet wird

diese Polymerisation durch Ammoniumpersulfat (APS) und N,N,N‘,N‘-


32

Tetramethylethylen-diamin (TEMED). TEMED katalysiert die Bildung freier Ra-

dikale aus dem Persulfat, die wiederum die Polymerisierung initiieren.

In der vorliegenden Arbeit wurden vor allem 6%ige und 20%ige denaturierende

und nicht-denaturierende Gele verwendet. Denaturierende Gele enthalten

Harnstoff in einer Konzentration von 7,5 M. Durch seine Eigenschaft, Wasser-

stoffbrücken zu brechen, verhindert Harnstoff die Bildung von Sekundärstruktu-

ren der DNA. Die Auftrennung der DNA in denaturierenden Gelen wird daher

nur durch die Molekülgröße bestimmt.

Im Allgemeinen benötigt man für große Gele (35x40cm) 70ml Gellösung, für

kleine Gele (20x35) 40ml. Zum Gießen des Gels verwendet man zwei unter-

schiedlich lange Glasplatten, die vorher gründlich mit A.bidest, 70%igem und

100%igem Ethanol gereinigt werden. Die kürzere der beiden Platten wird unter

dem Abzug silanisiert. Hierdurch wird die Oberfläche stärker wasserabweisend,

so dass sich die Platte nach dem Gellauf leichter lösen lässt und das Gel auf

der längeren Glasplatte haftet.

Die Glasplatten werden nun durch dazwischenliegende 0,4mm dicke Spacer

getrennt und mit Klammern fixiert. Nun kann man die Gellösung mit APS und

TEMED versetzen und zügig zwischen die Glasplatten gießen wobei man die

Bildung von Luftblasen vermeiden sollte. An den oberen Rand des Gels werden

Haifischzahnkämme zur Bildung einer Tasche gesteckt. Bei RT ist das Gel nach

einer Stunde auspolymerisiert. Man entfernt die Klammern und steckt nun die

Kämme mit der gezahnten Seite in das Gel und erhält einzelne abgetrennte Ta-

schen.

Die Elektrophorese erfolgt in einer mit 1xTBE-Puffer gefüllten, vertikalen Gel-

kammer. Die Geltaschen werden mit Puffer gespült und dann mit den Proben

beladen (ca. 4µl Probe). Die Leistung beträgt entweder 75W (große Gele) oder

55W (kleinere Gele), die Laufzeit bei Auftrennung von PCR-Produkten 1h, bei

Sequenzierungen für kurze Läufe 1,5h, für lange 5h, bei SSCP-Analysen vari-

iert die Dauer.

Nach Ende der Laufzeit werden die Glasplatten getrennt. Bei der Auftrennung

der Hha I verdauten PCR-Produkte wurden die Gele anschließend für 20 Min in

ein 2%iges Ethidiumbromidbad gelegt und danach unter dem UV-


33

Transilluminator fotografiert. Bei der SSCP-Analyse und der Sequenzierung

hebt man nur die kürzere Glasplatte ab, das Gel bleibt auf der längeren Platte

haften und wird von dort auf Whatman 3MM Filterpapier transferiert. Anschlie-

ßend wird es mit Klarsichtfolie überzogen und für 45 Min bei 80°C in einem Va-

kuum-Geltrockner getrocknet. Die Detektion der DNA-Fragmente erfolgt nun

mittels Autoradiographie.

2.8 Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)

Die SSCP-Methode soll in dieser Arbeit nur kurz dargestellt werden, da sie zwar

zur Bestimmung der ApoE-Genotypen getestet wurde, sich aber nicht als opti-

male Methode herausstellte und deshalb nicht für die Bestimmung der Genoty-

pen aller Proben der Studie verwendet wurde.

Das 1989 erstmals beschriebene Verfahren der Analyse von Einzelstrangpoly-

morphismen (single-strand conformation polymorphisms SSCP) dient zur Dar-

stellung von Sequenzunterschieden in kurzen DNA-Stücken. Grundlage für die-

se Methode ist die Änderung der gelelektrophoretischen Mobilität von Einzel-

strang-DNA aufgrund von Unterschieden in der DNA-Sequenz. Nach Hitze-

Denaturierung doppelsträngiger DNA und schnellem Abkühlen auf Eis nehmen

die Einzelstränge für sie thermodynamisch günstige Strukturen ein, wobei kom-

plementäre Regionen durch Rückfaltungen interne doppelsträngige Helices,

verbunden durch einzelsträngige, schleifenbildende Bereiche (loops) bilden

können. Der Austausch eines Basenpaares kann zu einer veränderten Konfor-

mation führen. Das Resultat ist eine im Vergleich zu einer nichtmutierten Gen-

sequenz verzögerten oder beschleunigten Mobilität der DNA bei der Auftren-

nung in einem Polyacrylamid-Gel. Sequenzunterschiede verschiedener DNA-

Proben erkennt man somit im Gel an ihrer unterschiedlich weiten Laufstrecke

bei gleicher Laufzeit. Je größer der Einfluß einer gegebenen Mutation auf die

Konformation des Einzelstrangs ist, desto deutlicher wird ihr Nachweis.

Für die SSCP-Analyse werden die gewünschten DNA-Sequenzen aus den

DNA-Proben mittels PCR amplifiziert. Hierfür verwendet man unter anderem

das radioaktiv markierte Nukleotid α33-CTP, um später die DNA-Banden im Gel


mittels Autoradiographie detektieren zu können. Die PCR-Produkte werden bei

100°C im Heizblock denaturiert, sofort auf Eis inkubiert und dann bei 4°C

Raumtemperatur auf einem nicht denaturierenden Polyacrylamidgel aufge-

trennt. Nach Ende der Elektrophorese wird das Gel getrocknet und auf einem

Röntgenfilm exponiert. Abbildung 10 stellt die Methode schematisch dar.

2.9 Denaturierungs-Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE)

Auch die Methode der DGGE sei hier in ihren Grundzügen dargestellt, da sie

ebenso wie die SSCP getestet und einige Male variiert wurde, die Ergebnisse


35

aber nicht den Anforderungen einer Analyse an über 700 DNA-Proben genüg-

ten.

Die DGGE ist ebenfalls eine elektrophoretische Methode, mit der man einen

einzelnen Basenaustausch innerhalb eines DNA-Strangs identifizieren kann.

Die der DGGE zugrunde liegende Technik der Auftrennung wurde 1983 erst-

mals von Fischer und Lerman beschrieben (Fischer et al., 1983). Doppelsträn-

gige DNA wird auf einem Acrylamidgel aufgetrennt, das einen Denaturierungs-

Gradienten darstellt. Die doppelsträngigen DNA-Stücke werden dabei einem

zunehmendem denaturierenden Milieu ausgesetzt und denaturieren bzw.

schmelzen schließlich in disrekten Banden, den so genannten “Schmelzdomä-

nen” (melting domains), auf. Die Schmelztemperatur Tm dieser Domänen ist se-

quenzabhängig und spezifisch für eine Sequenz. Wird die Tm der niedrigsten

Schmelzdomäne erreicht, schmilzt die DNA partiell auf und bildet dann eine Art

verzweigtes Molekül. Diese Struktur verringert nun die Mobilität der DNA im Ac-

rylamidgel. Da die Tm einer bestimmten Schmelzdomäne sequenzspezifisch ist,

ändert eine Mutation das Schmelzprofil der DNA verglichen mit dem Wildtyp.

Eine DNA, die Mutationen enthält, zeigt bei der Auftrennung Mobilitätsverschie-

bungen an einer verglichen mit dem Wildtyp anderen Position im Gel. Denatu-

riert das Fragment vollständig, wird die Migration wieder eine Funktion der Grö-

ße.

Bei der DGGE wird das denaturierende Milieu durch die Kombination einer ein-

heitlichen Temperatur in der Gelkammer, typischerweise zwischen 50 und

65°C, und einem linearen denaturierenden Gradienten im Gel, bestehend aus

Harnstoff und Formamid, erzeugt. Gelgradienten stellt man aus zwei verschie-

den denaturierenden Lösungen her, die beim Gießen des Gels so vermischt

werden, dass ein kontinuierlicher Gelgradient entsteht. Eine 100%ige Denatu-

rierungslösung beispielsweise besteht aus 7M Harnstoff und 40% Formamid.

Der Denaturierungsgradient kann sowohl perpendikular als auch parallel zur

Richtung der Elektrophorese angelegt werden. Für ein Perpendikulargel, des-

sen Gradient perpendikular zum elektrischen Feld verläuft, verwendet man

normalerweise einen breiten Denaturierungsgradienten mit einer Spannweite

von 0-100% oder 20-70%. Dieses Gel dient zu Beginn der Bestimmung des op-


36

timalen Denaturierungsbereichs. Zur genaueren Auftrennung verwendet man

danach ein Parallelgel, dessen Denaturierungsgradient parallel zum elektri-

schen Feld verläuft. Hier engt man den Denaturierungsgradienten ein, um eine

bessere Trennung von Fragmenten zu ermöglichen.

Auf einem denaturierenden Gel mit einem Gradienten laufen die Wildtyp DNA-

Fragmente und die mutierten DNA-Fragmente nebeneinander. So lassen sich

Mutationen anhand unterschiedlicher Migration von Wildtyp- und mutierter DNA

feststellen. Die Fragmente werden vorher mit der PCR amplifiziert, um genug

DNA auf das Gel laden zu können. Eine optimale Auflösung erzielt man, wenn

die Moleküle nicht vollständig denaturieren und die zu untersuchende Region in

der niedrigsten Schmelzdomäne liegt. Dies erreicht man durch den Anhang ei-

ner 30-40bp langen Sequenz sich wiederholender GC-Nuklteotide (GC-clamp)

an einen der Primer. Da Sequenzen mit hohem GC-Gehalt einen sehr hohen

Schmelzpunkt haben, entsteht durch den GC-clamp an einem Ende des PCR-

Produkts eine Schmelzdomäne mit sehr großer Tm, die untersuchte Region in-

nerhalb des PCR-Produkts liegt somit in der niedrigsten Schmelzdomäne. Al-

ternativ zum GC-clamp kann man auch ChemiClamp Primer verwenden, die die

beiden DNA-Stränge an einem Ende miteinander verbinden.

Für die Bestimmung der Schmelzdomänen einer Sequenz existieren spezielle

Computerprogramme wie die MacMelt® Software, die das theoretische

Schmelzprofil einer DNA-Sequenz berechnen und graphisch darstellen.

Schmelzprofile zeigen Regionen mit hohen und niedrigen Schmelzdomänen an.

Anhand dieser Programme lassen sich dann auch die Platzierung der Primer

und des GC-clamps theoretisch prüfen und bis hin zum geeignetsten Schmelz-

profil optimieren.

Die bei dieser Methode gebildeten Heteroduplexes tragen dazu bei, Homo-

duplex Mutationen zu detektieren. Typischerweise wendet man dieses Verfah-

ren an, wenn es nicht möglich ist, eine homoduplexe Mutation zu lösen. Die

Analyse heteroduplexer Moleküle kann die Sensitivität der DGGE erhöhen. He-

terodupleces lassen sich erzeugen, wenn man Wildtyp- und mutierte DNA ge-

meinsam als template-DNA in die PCR gibt oder aber separate PCR-Produkte

mischt, denaturiert und wieder renaturieren lässt. Ein Heteroduplex hat eine fal-


37

sche Basenpaarung (mismatch) im Doppelstrang, was zu einer Veränderung

seiner eigentlichen Konformation führt. Dies destabilisiert den Doppelstrang und

führt zu einer Denaturierung bei einer geringeren Denaturierungskonzentration.

Die heteroduplexe Bande wandert im Gel stets langsamer als die korrespondie-

rende homoduplexe Bande unter spezifischen Bedingungen.

2.9 DNA-Sequenzierung nach der Didesoxymethode Die DNA-Sequenzierung nach der Didesoxymethode wurden von Sanger et al.

(1977) entwickelt. Diese Methode der enzymatischen DNA-Sequenzierung ba-

siert auf dem zufälligen Einbau von Didesoxynukleotiden während der Neusyn-

these von DNA, der zu einem Abbruch der Synthese führt. Didesoxynukleotide

(ddNTPs) sind Analoga der dNTPs, von denen sie sich durch eine fehlende

Hydroxylgruppe am 3’-Kohlenstoffatom unterscheiden. Sie werden zwar an die

wachsende Nukleotid-Kette angehängt, können jedoch, da die 3’-

Hydroxylgruppe fehlt, an ihrem 3’-Kohlenstoffatom keine Phosphodiesterbin-

dung ausbilden. Es kommt zum Kettenabbruch. Da der Einbau und damit der

Kettenabbruch zufällig erfolgt, erhält man bei der Reaktion eine statistische Mi-

schung aller Kettenlängen, von der jedoch jede mit dem Nukleotid endet, das

als ddNTP der Reaktion zugegeben wurde. Durch den Reaktionszusatz eines

radioaktiv markierten dNTP, meist handelt es sich hierbei um 35S-dATP, lässt

sich die gesuchte Sequenz nach elektrophoretischer Auftrennung auf einem 6%

PAA-Gel durch Autoradiographie ablesen. Die in dieser Arbeit durchgeführten

Reaktionen wurden mit dem Sequenase™ Version 2.0 DNA Sequencing Kit von

USB, Cleveland (USA), durchgeführt.

Bei der Sequenzierreaktion werden ebenso wie bei der PCR dNTPs sowie kur-

ze Oligonukleotidprimer eingesetzt. Da auch nach der PCR noch dNTPs und

Primer in großen Mengen im Reaktionsansatz vorhanden sind, müssen diese

vor der Sequenzierung eliminiert werden. Eine aus der Garnele stammende al-

kalische Phosphatase (shrimp alkaline phosphatase, SAP) entfernt überschüs-

sige dNTPs durch Abspaltung der 5’-Phosphatreste aus dem Ansatz. Die ver-

bliebenen Primer werden durch die Exonuclease I, einem DNA-Einzelstrang

spaltenden Enzym, gespalten. Beide Enzyme sind im PCR-Puffer aktiv, so dass


38

man den PCR-Ansatz direkt einsetzen kann. Man gibt zu 5 µl PCR-Ansatz 0,5µl

Exonuclease I (1U/µl) und 0,5 µl SAP (1U/µl) und inkubiert die Lösung für 15

Min bei 37°C. Anschließend inaktiviert man die Exonuclease I und die SAP

durch Erhitzen auf 80 °C, 15 Min. Jetzt lässt sich die DNA aus der PCR direkt

für die Sequenzierreaktion einsetzen. Alternativ zu dieser Methode wurde für

manche Sequenzierungen das PCR-Produkt nach Agarosegel-Auftrennung als

Bande aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA mittels eines DNA-

Extraktionskits aus dem Gel extrahiert.

Für die Sequenzierreaktion muss die DNA einsträngig vorliegen. Weiterhin wird

ein Oligonukleotidprimer als Ansatzstelle für die Polymerase benötigt. Dieser ist

meist identisch mit dem PCR-Primer und wird in einer Menge von 10pmol dem

vorbehandelten PCR-Produkt zugegeben und mit ddH2O auf ein Volumen von

10µl aufgefüllt. Man erhitzt den Ansatz für 3 Min bei 100°C und stellt ihn danach

sofort auf Eis. An den sich dabei trennenden DNA-Doppelstrang lagern sich die

Primer an ihre Startstelle an.

Man führt pro zu sequenzierendem PCR-Produkt also parallel vier basenspezi-

fische Reaktionen durch, wobei jeder Reaktionsansatz die vier dNTPs und ei-

nes der vier ddNTPs enthält. Da man im Vergleich zu den dNTPs wesentlich

weniger ddNTP zugibt, kommt es in statistischer Verteilung zum Einbau des

ddNTPs und damit zum Kettenabbruch. Die DNA-Fragmente besitzen ein durch

den Primer definiertes übereinstimmendes 5’-Ende, ihre 3’-Enden sind jedoch

verschieden, da abhängig vom Einbau des jeweiligen ddNTPs die Synthese

zum Erliegen kommt.

Für die Sequenzierungsreaktion legt man je 2,5µl der verschiedenen Terminati-

onsgemische (ddG-, ddA-, ddT-, ddC-Mix) in vier unterschiedlichen Eppendorff-

cabs vor, die der Übersichtlichkeit halber verschiedene Farben haben und mit

dem jeweiligen ddNTP beschriftet werden. Nach 5-minütiger Inkubation des E-

longationsansatzes bei RT gibt man je 3,5µl in die bei 37°C vorgewärmten

Caps mit den Terminationsgemischen und inkubiert wiederum für 8 Min bei

37°C. Durch die Zugabe von je 4µl Stop-Lösung wird die Reaktion beendet.

Nach Denaturierung (1 Min bei 100°C) lädt man je 2µl der Sequenzierungsreak-

tion in die Geltaschen eines 6%igen PAA-Gels in der Reihenfolge A-C-G-T und


39

trennt durch Elektrophorese das Gemisch unterschiedlich langer DNA-

Sequenzen auf. Nach anschließender Autoradiographie lässt sich die Sequenz

in 5’ 3’-Richtung von unten nach oben ablesen. Beginnend mit der Bande des

kleinsten Fragmentes liest man auf dem Röntgenfilm die Sequenz von unten

nach oben und notiert dabei die Nukleotide der entsprechenden Banden. Man

geht Bande für Bande vor und erhält so die 5’ 3’-orientierte Sequenz des neu

synthetisierten DNA-Stranges Die Auswertung, Bearbeitung und Archivierung

der Sequenzen erfolgte anschließend mit Hilfe von Computerprogrammen wie

dem Generunner®.

2.10 Statistische Auswertung Die Auswertung der Ergebnisse wurde mit dem Statistikprogramm SPSS Versi-

on 8.0 vorgenommen. Alle Ergebnisse dieser Arbeit wurden als SPSS-

Datensätze eingegeben und anschließend statistisch ausgewertet. Um den Ansatzpunkt der statistischen Auswertung zu verdeutlichen, sei noch

einmal die der Studie zugrunde liegende Frage gestellt: Tritt bei AMD-Patienten

einer der untersuchten Polymorphismen des ApoE-Gens oder des A2M-Gens

oder ein bestimmter Genotyp hinsichtlich aller möglichen Allelkombinationen in-

nerhalb eines Individuums in einer signifikant höheren Frequenz als bei den

Kontrollgruppen auf oder ist die Verteilung zufällig und unabhängig von der Er-

krankung? Ergäbe sich ein signifikanter Unterschied in der Häufigkeitsverteilung

in den unterschiedlichen Gruppen, könnte man auf eine Assoziation der AMD

mit einem der untersuchten Polymorphismen schließen.

Vorerst seien hier noch die grundlegenden Begriffe der statistischen Auswer-

tung mit SPSS erklärt. Ergebnisse werden mit SPSS in Form von Datensätzen

erfasst, wobei alle eingehenden Daten bestimmten Variablen zugeordnet wer-

den müssen. Die Variablen können unterschiedlich definierte Werte annehmen.

Als die beiden Variablen der Studie sind die Zugehörigkeit der untersuchten

DNA-Proben bzw. Individuen zu einer Gruppe und das Vorhandensein eines

bestimmten Allels oder Genotyps definiert. Variable 1 wird also von den unter-

suchten Gruppen gebildet (AMD-Patienten, altersgemäße Kontrollen, Kontrollen

aus der Normalbevölkerung), kann also insgesamt drei verschieden definierte


40

Werte annehmen. Variable 2 wird jeweils von den Allelen bzw. Genotypen (A-

poE-ε2, -ε3, -ε4; ApoE 3/3,2/2,4/4,2/3,2/4,3/4 bzw. A2M-1 und -2, A2M-1/A2M-

1, A2M-1/A2M-2, A2M-2/A2M-2) gebildet. Variable 2 kommt also beispielsweise

bei der statistischen Auswertung der absoluten Häufigkeiten der drei untersuch-

ten ApoE-Allele in den verschiedenen Gruppen in drei definierten Werten vor,

nämlich ApoE-ε2, ApoE-ε3 oder ApoE-ε4. Bei der Untersuchung der Frequenz

der Genotypen von ApoE lassen sich hingegen für Variable 2 sechs unter-

schiedliche Werte definieren.

Zur Klärung einer möglichen Assoziation ist es nötig, die Häufikeitsverteilung

der Allele sowie der Genotypen innerhalb der untersuchten Gruppen zu be-

rechnen. Diese Berechnung erfolgte anhand von SPSS-Häufigkeitstabellen. Bei

der Berechnung von Häufigkeiten wird nur eine Variable betrachtet, z.B. kann

man eine Häufigkeitstabelle für die Verteilung der drei ApoE-Allele in der Nor-

malbevölkerung erstellen. Möchte man nun mehrere Variablen in die Betrach-

tung einbeziehen, im genannten Fall neben der Normalbevölkerung noch weite-

re Gruppen, benutzt man in SPSS die Funktion der Kreuztabellen.

Eine Kreuztabelle dient dazu, die kombinierte Häufigkeitsverteilung zweier Vari-

ablen darzustellen. Sie bildet somit das Pendant zu einer Häufigkeitstabelle für

den 2-Variablen-Fall. Erstellt man beispielsweise eine Häufigkeitstabelle für die

Variable ApoE-Allel, gibt die Tabelle an, wie viele ApoE-ε3, ApoE-ε2 und ApoE-

ε4 in der betrachteten Stichprobe enthalten sind. Ebenso kann man eine Häu-

figkeitstabelle für eine Variable Zugehörigkeit zu einer Gruppe erstellen, aus der

hervorgeht, wie viele der Allele aus der Stichprobe jeweils in der Normalbevöl-

kerung, Patientengruppe und Kontrollgruppe vorkommen. Erstellt man nun eine

Kreuztabelle für die beiden Variablen Allel und Gruppenzugehörigkeit, gibt die-

se Tabelle die Anzahl der ApoE-ε2-Allele bzw. ApoE-ε3-Allele und ApoE-ε4-

Allele in der Normalbevölkerung, in der Patientengruppe und der Kontrollgruppe

an. Es werden also Fallgruppen - in diesem Beispiel Personengruppen - be-

trachtet, die durch die Kombination der Merkmale aus den beiden Variablen Al-

lel und Gruppe definiert sind.

Die Prozedur der Kreuztabellen beschränkt sich jedoch nicht nur darauf, die

gemeinsame Verteilung zweier Variablen in einer Tabelle darzustellen, sondern


41

sie bietet auch statistische Tests an, mit denen untersucht werden kann, ob

möglicherweise ein Zusammenhang zwischen den beiden Variablen besteht.

Wenn sich beispielsweise zeigt, daß in einer bestimmten Stichprobe ein Groß-

teil der Probanden entweder Allel ApoE-ε2 oder ApoE-ε4 besitzen, während der

größte Teil der Probanden einer Kontrollgruppe ApoE-ε3 besitzen, läßt dies un-

ter Umständen den Schluß zu, daß in der entsprechenden Grundgesamtheit ein

Zusammenhang zwischen dem Allelstatus und der Erkrankung einer Person

besteht.

Wie bei der Häufigkeitstabelle, in der die Häufigkeitsverteilung einer einzelnen

Variablen dargestellt wird, können auch bei der Kreuztabelle nicht nur die abso-

luten Häufigkeiten, sondern auch verschiedene relative Häufigkeiten und zudem

so genannte erwartete Häufigkeiten angegeben werden. Die Idee von erwarte-

ten Häufigkeiten bildet die Grundlage für einen Signifikanztest zur Untersu-

chung eines möglichen Zusammenhangs zwischen den Variablen.

Der in der Arbeit verwendete Signifikanztest ist der Chi-Quadrat-Test. Er über-

prüft, ob zwei Variablen vollkommen unabhängig voneinander verteilt sind, oder

ob ein Zusammenhang zwischen den Variablen besteht. Bei der Prozedur wer-

den Chi-Quadrat-Tests nach unterschiedlichen Methoden berechnet.

Damit der Chi-Quadrat-Test durchgeführt werden kann, müssen bestimmte An-

forderungen von den Daten erfüllt sein. Eine dieser Anforderungen besteht dar-

in, dass die erwarteten Häufigkeiten in den einzelnen Tabellenfeldern nicht zu

gering sein dürfen. Als Mindestanforderung sollte die erwartete Häufigkeit in

keinem Feld kleiner als fünf sein.


Zur Durchführung des Signifikanztests wird das Prüfmaß Chi-Quadrat nach der

χ2-Formel berechnet:

t Testgröße des Chi-Quadrat-Tests

k Anzahl der Zeilen in den Kreuztabellen

ojl beobachtete („observed“) Häufigkeit der Merkmalsausprägung (j; l); Wert in der j. Zeile und l. Spalte der Kreuztabelle

m Anzahl der Spalten in den Kreuztabellen

ejl erwartete („expected“) Häufigkeit der Merkmalsausprägung (j; l); Wert in der j. Zeile und l. Spalte der Kreuztabelle

Dabei werden für jedes Feld der Tabelle die quadrierten Abweichungen der er-

warteten von den tatsächlichen Häufigkeiten durch die erwarteten Häufigkeiten

dividiert. Die Summe dieser Quotienten über allen Feldern der Kreuztabelle bil-

det den Chi-Quadrat-Wert. Durch das Quadrieren der Differenzen wird erreicht,

dass negative und positive Abweichungen gleichermaßen in das Maß eingehen

und sich nicht gegenseitig aufheben. Die Division durch die erwarteten Häufig-

keiten ist erforderlich, da sich andernfalls bei insgesamt vielen Beobachtungen

auch mehr Abweichungen ergeben würden. Bei 1.000 Beobachtungen wird die

Summe der (quadrierten) Abweichungen unter sonst gleichen Umständen grö-

ßer sein als bei 100 Beobachtungen.

Je größer die Abweichung in einem Feld der Tabelle ist, desto größer wird auch

der Chi-Quadrat-Wert ausfallen. Ein großer Chi-Quadrat-Wert ist also mit gro-

ßen Abweichungen verbunden und deutet auf einen Zusammenhang zwischen

den beiden Variablen hin. Es ist jedoch auch möglich, dass sich die beobachte-

ten Abweichungen zwischen zwei Variablen nur zufällig in der jeweils betrachte-

ten Stichprobe ergeben haben, obwohl in der Grundgesamtheit aller Fälle kein

Zusammenhang zwischen den Variablen besteht. Aus wahrscheinlichkeitstheo-


43

retischen Überlegungen lässt sich eine Verteilung für das Prüfmaß Chi-Quadrat

herleiten, die in Abhängigkeit von der Anzahl der Zeilen und Spalten der Kreuz-

tabelle angibt, mit welcher Wahrscheinlichkeit sich ein bestimmter Chi-Quadrat-

Wert auch dann ergeben kann, wenn die Variablen in der Grundgesamtheit un-

abhängig voneinander verteilt sind. Der Zusammenhang wird mit Hilfe der Frei-

heitsgrade der Kreuztabelle dargestellt: Aus der Zeilen- und Spaltenanzahl wird

die Anzahl der Felder ermittelt, denen bei gegebener Randverteilung beliebige

Häufigkeiten zugeordnet werden können. Handelt es sich zum Beispiel um eine

Tabelle mit 2 x 2 Feldern, so ergeben sich aus der Häufigkeit in einem der Fel-

der bei gegebener Randverteilung unmittelbar die Häufigkeiten aller übrigen

Felder. Weist das Feld links oben in der Tabelle die Häufigkeit 3 auf und ist die

Gesamthäufigkeit der oberen Zeile durch die Randverteilung mit 7 angegeben,

so muss das rechte obere Feld eine Häufigkeit von 4 aufweisen. Auf die gleiche

Weise sind auch die Häufigkeiten der beiden anderen Felder festgelegt. In einer

2 x 2-Tabelle kann also nur die Häufigkeit eines Feldes frei gewählt werden. Die

Tabelle hat daher einen Freiheitsgrad. Allgemein ergibt sich die Zahl der Frei-

heitsgrade einer Kreuztabelle als:

Freiheitsgrade = (Zeilenanzahl - 1) x (Spaltenanzahl - 1)

Mit Hilfe des Wertes Chi-Quadrat und der Anzahl der Freiheitsgrade lässt sich

die Wahrscheinlichkeit bestimmen, mit der sich die vorliegende Abweichung

zwischen beobachteten und erwarteten Häufigkeiten bei gegebener Anzahl an

Freiheitsgraden auch dann ergeben kann, wenn zwischen den Variablen in der

Grundgesamtheit kein Zusammenhang besteht. Dabei gilt, dass bei gegebenem

Zusammenhang zwischen den Variablen die Möglichkeit einer guten statisti-

schen Absicherung des Ergebnisses mit wachsender Felderzahl und damit grö-

ßeren Freiheitsgraden abnimmt. Das Zusammenfassen einzelner Werte einer

Variablen kann daher auch dann sinnvoll sein, wenn die erwarteten Häufigkei-

ten in jedem Tabellenfeld ohnehin größer als fünf sind.

Neben dem üblichen Pearson‘schen Chi-Quadrat-Test führt SPSS automatisch

zwei weitere Tests durch. Der Likelihood-Test basiert auf der Maximum-

Likelihood-Theorie und liefert bei großen Stichproben das gleiche Ergebnis wie

Pearsons Chi-Quadrat-Test.


44

Der als Zusammenhang linear-mit-linear ausgewiesene Test misst den linearen

Zusammenhang zwischen den Variablen und ist damit nur für Variablen geeig-

net, die mindestens Ordinalskalenniveau besitzen. Dieser Test ist auch als

Mantel-Haenszel-Test bekannt.

Für den Pearson’schen Test wird ein Chi-Quadrat-Wert von 37,136 ausgewie-

sen. Der Wert hat bei den vorliegenden zwei Freiheitsgraden eine Signifikanz

von 0,000 (bzw. 0,0%). Wenn kein Zusammenhang zwischen den beiden getes-

teten Variablen besteht, kann sich ein Chi-Quadrat-Wert der Größe 37,136 also

mit einer Wahrscheinlichkeit von 0,0% ergeben. Diese Wahrscheinlichkeit ist so

gering, dass eine Unabhängigkeit der beiden Variablen sehr unwahrscheinlich

ist. Man sagt, die Nullhypothese, derzufolge kein Zusammenhang zwischen den

Variablen besteht, kann zurückgewiesen werden. Wenn man nun diese Null-

hypothese zurückweist und davon ausgeht, es bestehe ein Zusammenhang

zwischen den Variablen, begeht man mit einer sehr geringen Wahrscheinlich-

keit von 0,00000086% einen Irrtum. Diese Wahrscheinlichkeit wird auch als Irr-

tumswahrscheinlichkeit bezeichnet und häufig mit dem im englischen Sprach-

gebrauch üblichen p-value bzw. p-Wert gleichgesetzt. Je geringer diese Irr-

tumswahrscheinlichkeit, desto größer ist umgekehrt die Wahrscheinlichkeit,

dass in der Grundgesamtheit ein Zusammenhang zwischen den Variablen be-

steht. Im Rahmen einer Stichprobenbetrachtung kann jedoch auch mit Hilfe ei-

nes Signifikanztests nie mit Sicherheit geklärt werden, ob ein solcher Zusam-

menhang vorliegt oder nicht. Oft wird als Richtwert angegeben, dass bei einer

Irrtumswahrscheinlichkeit (syn. asymptotische Signifikanz, p-Wert) von 5% und

weniger das Vorliegen eines Zusammenhangs angenommen werden kann.

Dieser Grenzwert besitzt jedoch keine allgemeine Gültigkeit, sondern ist stets

vor dem Hintergrund der untersuchten Fragestellungen sowie der jeweiligen

Datenlage zu bewerten.

Deutet der Signifikanztest darauf hin, dass ein Zusammenhang zwischen den

betrachteten Variablen besteht, lässt dies keine Rückschlüsse auf eine Kausali-

tät zu. Es besagt lediglich, dass bestimmte Werte der einen Variablen tenden-

ziell gemeinsam mit bestimmten Werten der jeweils anderen Variablen auftre-

ten. Die Ursache davon kann allein mit statistischen Verfahren nicht ermittelt


45

werden. Vielmehr sind hierzu entsprechende theoretische Überlegungen erfor-

derlich, die der statistischen Analyse im Allgemeinen vorausgehen. Führen die-

se Überlegungen zu der Hypothese, es bestehe ein Zusammenhang zwischen

den Variablen, kann die Vereinbarkeit dieser Hypothese mit der empirischen

Beobachtung durch statistische Verfahren wie dem Chi-Quadrat-Test unter-

sucht werden.

Der Chi-Quadrat-Test liefert nicht unter allen Bedingungen zuverlässige Ergeb-

nisse. Die folgenden Einschränkungen sind bei der Anwendung des Tests zu

beachten:

Die erwartete Häufigkeit sollte in jedem Feld der Kreuztabelle mindestens fünf

betragen. Andernfalls ist das Testergebnis nicht mehr zuverlässig.

Nach Möglichkeit sollten die Tabellen mehr als fünf Felder umfassen. Bei 2 x 2-

Tabellen mit geringer Fallzahl können sich Einschränkungen in der Zuverlässig-

keit des Tests ergeben. Beinhaltet eine 2 x 2-Tabelle ein Feld mit erwarteter

Häufigkeit unter fünf, berechnet SPSS zusätzlich Fishers exakten Test. Dieser

basiert auf einer hypergeometrischen Verteilung und ist für kleine Stichproben

mit geringen erwarteten Häufigkeiten der genaueste Test. Für alle 2 x 2-

Tabellen wird zum Pearson’schen Test zusätzlich Yates´ Korrektur ausgewie-

sen. Die Korrektur besteht darin, dass bei der Berechnung des Chi-Quadrat-

Wertes vor dem Quadrieren die absoluten Abweichungen der beobachteten von

den erwarteten Häufigkeiten um 0,5 verringert werden. Dadurch ergibt sich ein

kleineres Chi-Quadrat und somit ein schlechteres Signifikanzniveau. Diese Kor-

rektur ist jedoch umstritten.


46

2.11 Puffer und Lösungen

DNA-Auftragspuffer (TAE-Gele)

(10x) 200 µl 50x TAE 500 µl Glycerin (87%) 300 µl ddH2O + 1 Spatelspitze Bromphenolblau/ Xylencyanol

DNA-Auftragspuffer (TBE-Gele)

(10x) 50 % Saccharose 10x TBE 1 M Harnstoff 0,1 % Bromphenolblau 0,1 % Xylencyanol

Ethidiumbromidstammlösung 5 mg/ml in A. bidest. Ethidiumbromidfärbelösung. 1 l Laufpuffer (TAE oder TBE)

400 µl Ethidiumbromidstammlsg 50 x TAE 242,0 g Tris

18,6 g EDTA Dinatriumsalz A. bidest. ad 1000 ml, autoklavieren

10 x TBE 0,9 M Tris 0,9 M Borsäure 0,025 M EDTA pH 8,2-8,5

1 x TE 10 mM Tris/HCl, pH 7,6 1 mM EDTA Dinatriumsalz, autoklavieren

Ergebnisse 47

3 Ergebnisse

3.1 Analyse der Apolipoprotein E Allelhäufigkeiten

Die genomische Sequenz des APOE wurde 1985 von Paik et al. (1985) publi-

ziert. Seither wurden mehrere Einzelnukleotid-Polymorphismen innerhalb der

vier Exone des APOE beschrieben, die drei häufigsten sind die beiden bereits

erwähnten Polymorphismen an Position 112 und 158 im Exon 4.

Die in der Arbeit verwendeten genomischen Sequenzen stammen alle aus der

Online Datenbank für genomische Sequenzen des The National Human Geno-

me Research Institute (http://www.nhgri.nih.gov).

3.1.1 PCR -Amplifikation des APOE Exons 4

Mit Hilfe der PCR wurde das die beiden Einzelnukleotid-Polymorphismen ent-

haltende Exon 4 des APOE amplifiziert. Die gewählten Primer ApoE-Forward

und ApoE-Reverse amplifizieren eine 219 bp große DNA Sequenz, die beide

Polymorphismen beinhaltet. Die Sequenz und die Lage der verwendeten Pri-

mer-Paare zeigt Abbildung 11.

http://www.nhgri.nih.gov/

Ergebnisse 48

Bevor die PCR an den Patienten- und Kontrollgruppen durchgeführt werden

konnte, wurden die optimalen Bedingungen der PCR durch eine Reihe von

Test-PCRs bestimmt. Hierbei wurden die Annealing-Temperatur, die MgCl2 –

Konzentration, die Zugabe von Formamid sowie die Anzahl der Zyklen variiert.

Ausgewählt wurden die Reaktionsbedingungen, bei denen die Produkte in der

Agarose-Gelelektrophorese eine definierte Bande mit einer Größe von 219bp

zeigten. Dies entsprach dem erwarteten PCR-Produkt. Die Test-PCRs ergaben

eine optimale TA von 60 C°, eine MgCl2–Konzentration von 10M, die Zugabe

Ergebnisse 49

von 1µl Formamid und eine Zyklenzahl von 33. Der Ansatz für die PCR des

APOE ist zusammen mit den PCR-Bedingungen in Tabelle 5 dargestellt.

Nach Ermittlung der geeigneten PCR-Bedingungen wurde aus den DNAs der

Patienten und Kontrollenpersonen die Zielsequenz im ApoE Exon 4 amplifiziert.

Bei allen Patienten und Kontrollpersonen ergab sich ein spezifisches Signal in

der erwarteten Größe von 219 bp (Abbildung 12).

Ergebnisse 50

3.1.2 DGGE

Zu Beginn der Studie wurde für die Charakterisierung der ApoE-Genotypen die

DGGE-Methode gewählt, um neben den bekannten häufigen Polymorphismen

zusätzlich mögliche, seltene oder bisher unbekannte Polymorphismen in Exon 4

detektieren zu können. Die hierfür verwendeten Primer unterscheiden sich von

den Primern der herkömmlichen PCR durch eine an das Ende eines Primers

angehängte repetitive GC-Sequenz, den GC-clamp. Aufgrund der Berechnung

des Schmelzprofils erwies sich das 5’-Ende des ApoE-Reverse Primers als das

geeignete Ende für den GC-clamp. Die Lage der Primer ist identisch mit der be-

reits beschriebenen PCR zur Amplifikation des Exon 4, das PCR-Produkt ist al-

lerdings durch das Anhängen des GC-clamps 259bp lang, zeigt also eine um

40bp größere Bande bei der Agarose-Gelelektrophorese. Die Primersequenzen

und die durch Test-PCRs ermittelten Bedingungen der Amplifikation lassen sich

aus der Abbildung 13 entnehmen.

Ergebnisse 51

Ergebnisse 52

Das mit der MacMelt® Software erstellte Schmelzprofil für die amplifizierte

DNA-Sequenz ist in Abbildung 14 zu sehen. Dem Schmelzprofil nach erwartet

man ein Aufschmelzen des Doppelstranges im Bereich von 70°C.

Es wurde zuerst versucht, mit einem 30%-100%igen Perpendikulargel den

Schmelzbereich experimentell zu überprüfen und genau zu bestimmen. Dabei

zeigte sich nur ein undeutliches Aufschmelzen der DNA-Banden (Abb. 15).

Ergebnisse 53

Der Denaturierungsbereich wurde deshalb weiter eingeschränkt. Bei einem de-

naturierenden Milieu von 70-90% ließ sich eine Trennung durch Aufschmelzen

erkennen (Abb.16).

Die anschließenden Versuche, die PCR-Produkte auf einem Travelgel aufzu-

trennen, waren trotz mehrmaliger Variation der verschiedenen Gelkomponenten

(Acrylamidgehalt, Harnstoffgehalt) nicht zufriedenstellend. Es zeigte sich zwar

ein Aufschmelzen der Banden, einzelne Genotypen der sechs möglichen Allel-

kombinationen konnten aber nicht sicher bestimmt werden (Abb.17). Somit

wurde die DGGE als Methode zur Bestimmung des jeweiligen Allelstatus an

den 753 DNA-Proben ausgeschlossen.

Ergebnisse 54

Ergebnisse 55

3.1.3 SSCP

Gleichzeitig zur Erprobung der DGGE wurde auch versucht, die ApoE-

Genotypen mittels SSCP zu bestimmen. Mit den bereits erwähnten Primern

ApoE-forward und Apo-E-reverse wurde eine PCR mit radioaktiv markierten

Nukleotiden durchgeführt. Abbildung 18 zeigt das Ergebnis der SSCP, das eine

eindeutige Unterscheidung der einzelnen Genotypen nicht ausreichend zulässt

und somit für eine schnelle Analyse aller DNA-Proben ungeeignet ist. Deshalb

wurde auf die Bestimmung des Allelstatus mittels SSCP ebenfalls verzichtet.

3.1.4 Enzymatische Restriktionsspaltung

Nachdem die ApoE-Polymorphismen im Exon 4 mittels der erprobten Methoden

DGGE und SSCP nicht zufriedenstellend nachgewiesen werden konnten, wur-

de für die Analyse der Genotypen die Spaltung durch Restriktionsenzyme ge-

wählt. Die untersuchten Polymorphismen stellen Punktmutationen von C nach T

Ergebnisse 56

bzw. T nach C dar und liegen in Codon 112 und 158 an den jeweils ersten Posi-

tionen des Codons (3745 und 3883) (Weisgraber et al., 1988). Durch die Muta-

tion T nach C codieren die Codons anstatt für Cystein (TGC) für Arginin (CGC),

führen also zu einem Aminosäurenaustausch, der aber laut bisheriger Publika-

tionen keine Auswirkung auf die Funktion des Proteins hat. Die Polymorphis-

men werden als Cys112–to-Arg112 und Arg 158-to- Cys bezeichnet. Das am

häufigsten vorkommende Wildtyp-Allel ApoE-ε3 trägt an Position 112 der Poly-

peptidkette ein Cystein und an Position 158 ein Arginin. Dies wird definitions-

gemäß als Cys112-Arg158 angegeben. Je nach Allel befinden sich an den Po-

sitionen 112 oder 158 spezifische Schnittstellen für das Restriktionsenzym CfOI

und dessen Isoenzym HhaI immer dort, wo ein Cystein durch ein Arginin ausge-

tauscht wurde. CfOI und HhaI spalten spezifisch die DNA-Sequenz GC GC.

Beispielsweise schneiden die Enzyme das Wildtyp-Allel ApoE-ε3 an Position

158, nicht aber an Position 112. Abbildung 19 zeigt detailliert diese polymor-

phen Restriktionsschnittstellen der drei Allele.

Verdaut man nun die ApoE PCR-Produkte mit HhaI, entstehen je nach Allel

spezifische Restriktionsfragmente unterschiedlicher Länge. Neben den variab-

len Schnittstellen der drei Allel existieren noch 4 weitere, nicht polymorphe

Schnittstellen, so dass jeder Genotyp nach dem Verdau zwischen 8 und 12

Fragmente aufweist (Abb.20).

Für den Restriktionsverdau wurde ein 25 µl Ansatz aus 10 µl PCR-Produkt, 0,5

µl HhaI, 2,5 µl 10xReaktionspuffer und 12 µl H2O hergestellt und für 3h bei 37

C° inkubiert.

Ergebnisse 57

3.1.5 Auftrennung der verdauten PCR-Produkte

Trennt man die verdauten PCR-Produkte nun auf einem Polyacrylamidgel durch

Gel-Elektrophorese auf, erhält man ein für den jeweiligen Genotyp spezifisches

Muster von Restriktionsfragmenten unterschiedlicher Größe, das in Abbildung

20 schematisch dargestellt wurde. Für die Auftrennung wurden 20%ige Polyac-

rylamidgele verwendet. Von den verdauten Produkten wurden jeweils 4µl mit

1µl Laufpuffer vermischt und in die Geltaschen geladen. Auf einem großen Gel

(40x35 cm) wurden insgesamt 40 verdaute PCR-Produkte aufgetragen. Die

Laufzeit betrug 90 Min. bei 75W. Zur Bestimmung der Größe der DNA-Banden

lief 3µl einer 10bp DNA-Leiter als Längenstandard mit. Anschließend wurde das

Ergebnisse 58

Gel in einem 2%igen Ethidiumbromidbad für 20 Minuten eingefärbt und danach

unter dem UV-Schirm zur Dokumentation fotografiert.

Ergebnisse 59

3.1.6 Bestimmung der unterschiedlichen Genotypen

Abbildung 20 zeigt die Auftrennung mit dem spezifischen Bandenmuster für die

6 möglichen Genotypen. Anhand des Bandenmusters konnten die Genotypen

aller 400 Patienten und 353 Kontrollpersonen bestimmt werden. Bei nicht ein-

deutigen Ergebnissen wurden PCR, Verdau und Gelelektrophorese erneut

durchgeführt. Zur Überprüfung wurden die 6 unterschiedlichen Bandenmuster

noch sequenziert. Die Sequenzierung bestätigte die durch Verdau und Auftren-

nung ermittelten Genotypen.

Insgesamt wurden die Genotypen für APOE an 400 AMD-Patienten und 353

Kontrollpersonen bestimmt. Abbildung 21 gibt ein Beispiel für die Auftrennung

der verdauten PCR-Produkte der DNA-Proben auf einem Polyacrylamidgel.

Ergebnisse 60

3.1.7 Auswertung der Allelhäufigkeiten

Für die APOE-Genotypen und die Häufigkeit der Allele zeigten sich zwischen

Patienten- und Kontrollgruppen nur geringe, nicht signifikante Unterschiede. Es

wurden sowohl die Häufigkeit der einzelnen Genotypen APOE 2/2, 3/3, 4/4, 2/3,

2/4, 3/4 als auch die Frequenz der Allele ApoE-ε2, ApoE-ε3 und ApoE-ε4 in

den unterschiedlichen Gruppen statistisch ausgewertet. Hierfür wurde das Sta-

tistikprogramm SSPS verwendet. Für die Häufigkeit der einzelnen Allele sowie

der Häufigkeit der 6 unterschiedlichen Allelkombinationen innerhalb der Grup-

pen wurde der χ2 –Test, oder auch „Test nach Pearson“, angewendet. Bei sehr

kleinen Werten, beispielsweise beim Genotyp ApoE 2/2 mit sehr geringer Häu-

figkeit, wurde der exakte Test nach Fischer angewendet.

Die Gesamtsumme der Allele und Genotypen, sowie die prozentuale Verteilung

sind in der Tabelle 6 für alle untersuchten Gruppen dargestellt. Die Tabellen 7-

11 zeigen die Ergebnisse der statistischen Auswertungen.

Beim Vergleich der Allelfrequenzen und Häufigkeit der Genotypen zwischen der

Patientengruppe und der Gruppe der altersgemäßen Kontrollen zeigten sich

keinerlei signifikanten Unterschiede (Tabelle 8). Der Vergleich der Patienten-

gruppe mit der die Normalbevölkerung repräsentierenden Kontrollgruppe (Ta-

belle 9) weist signifikante Unterschiede in der Verteilung des Allels ApoE-ε4 auf.

In der Patientengruppe tritt das Allel ApoE-ε4 mit einer Häufigkeit von 0,09 auf,

bei der Normalbevölkerung dagegen beträgt die Häufigkeit des Allels ApoE-ε4

0,16. Hierbei handelt es sich um signifikante Unterschiede: Der χ2 -Wert für den

Vergleich der Häufigkeit des ApoE-ε4 liegt bei 14,3 und ist damit hoch signifi-

kant. Allerdings ergeben sich diese signifikanten Schwankungen in der Häufig-

keit des Allels und des Genotyps ebenfalls, wenn man die Kontrollgruppe der

Altersgemäßen mit der Kontrollgruppe „Normalbevölkerung“ vergleicht (Tabelle

10). Es ließen sich somit keine signifikanten Unterschiede zwischen der Gruppe

der AMD-Patienten und den Kontrollgruppen nachweisen, sondern eigentlich

nur eine signifikant unterschiedliche Verteilung des ApoE-ε4-Allels im Hinblick

auf das Durchschnittsalter der Gruppen. ApoE-ε4 kommt in den Gruppen mit

Ergebnisse 61

hohem Durchschnittsalter deutlich seltener vor als in der Gruppe der Normalbe-

völkerung mit geringerem Altersdurchschnitt.

Ergebnisse 62

Ergebnisse 63

Ergebnisse 64

Ergebnisse 65

Ergebnisse 66

Ergebnisse 67

3.2 Analyse der Alpha-2-Makroglobulin Allelhäufigkeiten

Parallel zur Bestimmung der ApoE-Allelfrequenzen wurden an den untersuch-

ten Gruppen auch die Bestimmung der Häufigkeiten der beiden Allele A2M-1

und A2M-2 des Alpha-2-Makroglobulins durchgeführt.

3.2.1 PCR-Amplifikation des A2M Polymorphismus

Grundlage für die Bestimmung der Allelverteilungen von A2M-1 und A2M-2 war

die Amplifikation des genomischen Abschnitts, der den Deletions-Insertions-

Polymorphismus enthält. Die Lage der Primer wurde in Anlehnung an eine Pub-

likation von Dow et al. (1999) gewählt (Abb.22).

Wie schon für die PCR des ApoE-Polymorphismus beschrieben, wurden auch

bei den Primern A2M-Forward und A2M-Reverse mittels GeneRunner® die La-

ge und Sequenzen hinsichtlich ihrer Eignung (gleiche TA und Ausschluss pa-

lindromer Sequenzen) überprüft und die TA berechnet. Bei der Optimierung in

Test-PCRs ergab sich eine optimale TA von 54 °C, eine Zyklenzahl von 33 und

die Zugabe von 1µl Formamid pro 25µl PCR-Ansatz. Die PCR-Produkte zeigten

bei der Agarose-Gelelektrophorese eine Bande in der zu erwartenden Größe

von 138bp (Abbildung 23).

Ergebnisse 68

Ergebnisse 69

3.2.2 Auftrennung der PCR-Produkte auf Polyacrylamidgelen

Wie bereits erwähnt handelt es sich bei dem untersuchten Polymorphismus des

A2M um einen Insertions-Deletions-Polymorphismus am 5’-Splice-Ende des

Exons 18, also in einer nicht kodierenden Region. Das häufigere Allel A2M-1

enthält die Sequenz 5’-cggag-3’, die dem selteneren Allel A2M-2 fehlt. Folglich

sind PCR-Produkte unterschiedlicher Allele in ihrer Länge verschieden. Dieser

Basenunterschied von 5bp lässt sich sehr einfach durch Auftrennung des PCR-

Produkts auf einem Polyacrylamidgel detektieren.

Hierfür wurden 6%ige, nicht denaturierende Polyacrylamidgele verwendet. Die

Laufzeit betrug 4 h bei 120 V. Nach 1 ½ h wurden erneut PCR-Produkte aufge-

tragen, wodurch das Gel zweimal genutzt wurde und sich somit das Arbeiten ef-

fizienter gestaltete. Insgesamt liefen pro Gel zweimal 19 Proben. Das Gel wur-

de anschließend für 20 Min. in einem 2% Ethidiumbromidbad gefärbt und dann

unter dem UV-Schirm fotografiert (Abbildung 24a).

Ergebnisse 70

3.2.3 Bestimmung der unterschiedlichen Genotypen

Da sich die beiden Allele A2M-1 und A2M-2 durch einen Längenunterschied

von 5bp auszeichnen, lässt sich der Allelstatus einer DNA-Probe leicht nach

Auftrennung des PCR-Produkts anhand der Größe der DNA-Banden ermitteln.

Homozygote Personen für A2M-1 zeigen eine Bande bei 138bp, homozygote

Personen für A2M-2 eine im Gel weiter gelaufene Bande bei 133bp. Bei hetero-

zygoten Personen A2M-1/A2M-2 sieht man nach Auftrennung zwei Banden,

sowohl eine bei 138bp für das Allel A2M-1 als auch eine bei 133bp, die dem Al-

lel A2M-2 entspricht. Die drei unterschiedlichen Genotypen lassen sich Abbil-

dung 24b entnehmen. Bei allen heterozygoten Personen trat eine zusätzliche

Ergebnisse 71

Bande bei ca. 190bp auf, die vermutlich als Artefakt bei der Elektrophorese ent-

steht. Zur Überprüfung wurden die drei Muster der Auftrennung des A2M-PCR-

Produkts sequenziert. Hierbei stimmten die durch Auftrennung ermittelten Ge-

notypen mit der sequenzierten Basensequenz überein.

3.2.4 Auswertung der Allelfrequenzen

Die Analyse der A2M-Allelhäufigkeiten wurde ebenfalls an den beschriebenen

Patienten (n=400) und Kontrollgruppen (n=353) durchgeführt. Wie bereits bei

ApoE handelt es sich auch hier um die Häufigkeit eines Merkmals in unter-

schiedlichen Gruppen. Deshalb wurden die statistischen Auswertungen mit den

bereits beschriebenen Tests der Software SPSS durchgeführt: dem Chi-

Quadrat-Test nach Pearson und bei kleinen Zahlen mit dem exakten Test nach

Fischer.

Wie sich aus den Tabellen 12-14 entnehmen lässt, gab es weder für die Fre-

quenz der einzelnen Allele, noch für die Häufigkeitsverteilung der Genotypen

signifikante Unterschiede zwischen Patienten- und Kontrollgruppen.

Die bei ApoE beschriebenen signifikanten Unterschiede zwischen Personen

aus der Normalbevölkerung und Personen höheren Alters, egal ob AMD-

Patienten oder Nicht-Betroffene, wurden bei A2M nicht beobachtet.

Ergebnisse 72

Ergebnisse 73

Ergebnisse 74

Diskussion 75a,a,

a,b,

4 Diskussion c, a,

4.1 Studiendesign

4.1.1 Komplexität der AMD – Hinweise auf eine genetische Ursache

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung einer möglichen

Assoziation von Varianten im ApoE- und A2M-Gen mit der AMD. Damit soll ein

Beitrag zur Aufklärung der genetischen Ursachen der AMD geleistet werden.

Bereits im einleitenden Kapitel wurde die Schwierigkeit eines solchen Unterfan-

gens kurz angesprochen. Bereits die Annahme, bei AMD handele es sich um

eine komplexe, von unterschiedlichen Pathogenitätsfaktoren beeinflusste Er-

krankung, ist gegenwärtig hypothetisch.

b,

Deshalb soll hier zuerst erörtert werden, welche Anhaltspunkte es überhaupt für

eine genetische Ursache der AMD und damit auch ihrer Komplexität gibt. Ein

erster Anhaltspunkt für eine genetische Ursache ist der Nachweis einer erhöh-

ten Prävalenz bei verwandten Individuen. AMD-Studien zur Prävalenz der Er-

krankung innerhalb einer Population ergaben Unterschiede hinsichtlich ver-

schiedener Rassen und ethnischen Gruppen. So ist beispielsweise ein schwe-

rer Visusverlust häufiger bei Kaukasiern, Asiaten und Grönländern anzutreffen

und seltener bei Afro-Amerikanern (Sommer et al., 1991).

c,

Der erste Bericht über eine familiäre Häufung einer zentralen retinochoroidalen

Erkrankung stammt aus dem Jahre 1876. Hutchinson beschrieb damals den

Fall dreier Schwestern, die eine Erkrankungsfolge von gelbweißen Flecken über

Hämorrhagien bis hin zu einer atrophischen Retinanarbe zeigten. Erst hundert

Jahre später wurde dieser Aspekt einer familiären Häufung wiederentdeckt.

1983 beschreibt Hyman et al. eine erhöhte Prävalenz der AMD bei Verwandten

von Erkrankten im Vergleich zu Verwandten von nicht erkrankten Kontrollper-

sonen. Inzwischen gibt es zahlreiche Hinweise auf eine genetische Komponen-

te: Segregations-Analysen an verschiedenen Populationen wie die Beaver Dam

Studie (Heiba et al., 1994) und die Framingham Studie (Ferris et al. 1983) so-

wie familiäre Aggregationsstudien wie die Rotterdam Eye Studie (Klaver et al.,

Diskussion

76

1998) und die Boston Studie (Seddon et al., 1997). Überzeugend sind auch die

zur genetischen Grundlage der AMD durchgeführten Zwillingsstudien: Klein et

al. (1994) fanden hohe Konkordanzraten bei monozygoten Zwillingen (100%,

wenn CNV bei einem Zwilling und konfluierende Drusen bei dem anderen Zwil-

ling ebenfalls als konkordant betrachtet werden). Interessant ist vor allem die

Tatsache, dass die Konkordanzraten bei monozygoten Zwillingen deutlich über

denen dizygoter Zwillinge liegen. Unklar bei Geschwister- und Zwillingsstudien

ist noch immer der Einfluss von Umweltfaktoren, denen Geschwister meist in

gleicher Weise ausgesetzt sind. Eine erhöhte Prävalenz der AMD bei Ge-

schwistern könnte also durchaus auch durch gemeinsame exogene Risikofakto-

ren erklärt werden. Geht man aber davon aus, dass sowohl die monozygoten

als auch die dizygoten Zwillinge dieser Studie etwa gleichen Umwelteinflüssen

ausgesetzt waren, geben die Unterschiede in der Erkrankungskonkordanz ei-

nen deutlichen Hinweis auf eine genetische Grundlage.

Zwillingsstudien von Meyers et al. (1994; 1995) zeigten ähnliche Ergebnisse mit

variabler Expression und unterschiedlichem Erkrankungsbeginn, wobei hier

verschiedene Stadien der AMD untersucht wurden.

All diese Studien belegen, dass AMD eine Erkrankung mit einer deutlichen,

wenn auch bisher unbekannten genetischen Komponente ist.

4.1.2 Genetische Analyse der AMD Ausgangspunkt einer genetischen Analyse sollten zuverlässig diagnostizierte

Patientengruppen sein. Es ist nicht sicher, ob nicht unterschiedliche Formen der

AMD auch unterschiedliche genetische Faktoren zur Ursache haben. Deshalb

ist es sinnvoll, die Patientengruppe nach diagnostischen Kriterien möglichst

einzugrenzen, beispielsweise nur AMD-Patienten zur Analyse heranziehen, die

an der exsudativen Form der AMD erkrankt sind. Die Kontrollgruppe sollte ide-

alerweise aus Individuen bestehen, die ein möglichst hohes Alter aufweisen und

fundoskopisch keine Anzeichen einer AMD haben. Wegen des späten Krank-

heitsbeginns und einer eventuell unvollständigen Penetranz der AMD ist die

Auswahl einer solchen Kontrollgruppe in der Praxis schwierig.

Diskussion

77

Die folgenden Abschnitte beschreiben die unterschiedlichen Methoden zur Su-

che nach genetischen Ursachen:

Parametrische Kopplungsanalysen (positional cloning approaches) suchen un-

ter Annahme eines Vererbungsmodells nach einem genetischen Marker inner-

halb einer Familie, der mit der Vererbung bzw. Erkrankung korreliert. Sie dienen

somit der Identifikation von Krankheitsloci. Da für die Analyse entsprechend

große Familien benötigt werden, ist diese Methode für die Untersuchung bei der

AMD schwierig.

Nichtparametrische Kopplungsanalysen (allele-sharing-methods) suchen mittels

Mikrosatellitenmarkern nach der gehäuften Vererbung chromosomaler Ab-

schnitte (sog. „sharing“) bei erkrankten Verwandten, um so Rückschlüsse auf

mögliche Genloci ziehen zu können. Hierfür ist kein Vererbungsmodell erforder-

lich und die Methode ist unabhängig von der Penetranz. Es ist jedoch eine gro-

ße Anzahl von Familien und eine entsprechend große Kontrollpopulation not-

wendig. Solche genomweiten, para- und nichtparametrischen Kopplungsanaly-

sen an AMD-Familien wurden bisher von Klein et al. (1998), Weeks et al.

(2001), Majewski et al. (2003) und Iyengar et al. (2004) durchgeführt. Die dabei

gefundenen Krankheitsloci stimmen teilweise miteinander überein, wie es bei-

spielsweise für den Locus 1q25-31 der Fall ist, der von drei Studien identifiziert

wurde (Klein et al. 1998, Weeks et al. 2001, Majewski et al. 2003). Andererseits

fand jede Studie neue Loci, teilsweise spezifisch in nur einer Familie auftretend

– ein Hinweis auf die komplexen, genetischen Ursachen der AMD.

Die Kandidatenkopplungsanalyse (candidate linkage analysis) untersucht, ob

zwischen einem vermuteten Krankheitslocus und der Erkrankung eine Assozia-

tion besteht. Ansatzpunkte bieten hier beispielsweise die Loci erblicher Netz-

hausdegenerationen. Mit hochpolymorphen Mikrosatellitenmarkern, die sich in

der Nähe eines bekannten chromosomalen Locus befinden, wird die Kandida-

tenkopplungsanalyse durchgeführt. Vor allem die Heterogenität der AMD stellt

das Problem bei dieser Methode dar.

Die Kandidatengenanalyse erfordert die Charakterisierung eines spezifischen

Krankheitsgens und vergleicht dann die Sequenz bei Patienten und Kontrollen.

AMD-relevante Gene für die Kandidatenkopplungs- und Kandidatengenanalyse

Diskussion

78

sind die retinaspezifischen Gene ABCR, RPE 65 (Retinal pigment epithelium-

specific protein 65kDa), TIMP-3 (Tissue inhibitor of metalloproteinases-3) und

EFEMP-1 (Epithelium-growth-factor-containing fibulin-like extracellular matrix

protein 1).

Zu den interessanten nicht-retinaspezifischen Genen zählen das ApoE, A2M

und CST3 (Cystatin-3) (OMIM-Datenbank unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Kritische Punkte sind wieder die Heterogenität der AMD und die sorgfältige

Auswahl einer Kontrollgruppe. Selbst eine signifikante Assoziation ist aber bei

dieser Methode noch kein Beweis einer Kausalität.

4.1.3 AMD und Alzheimer- gemeinsame Phänomene? Speziell die sporadische Alzheimer-Erkrankung (AD), die im höheren Lebensal-

ter auftritt (sog. Sporadic late-onset Alzheimer Disease), zeigt im Rahmen der

Suche nach genetischen Ursachen Ähnlichkeiten zur AMD. Diese Parallelen

wurden in Publikationen mehrfach diskutiert (Klaver et al., 1998; Anderson et

al., 2001; Zurdel et al., 2002).

Bei beiden Erkrankungen spielen neurodegenerative Prozesse eine Rolle, his-

tologische Ähnlichkeiten wurden in der Einleitung bereits kurz angesprochen.

Die Schlüsselphänomene bei AD sind senile Plaques und Amyloidangiopathie.

Die erkrankungstypischen Ablagerungen enthalten β-Amyloid, Mikroglia und

Reste untergegangener Neurone, die ihrerseits wiederum zu neuronaler Dys-

funktion und zu weiterem Zelluntergang führen (Giannakopoulos et al., 1997).

Im Frühstadium der AMD lassen sich ebenfalls Ablagerungen in Form von Dru-

sen innerhalb der verdickten Bruchmembran nachweisen, die ihren Ursprung in

unvollständig abgebauten Bestandteilen der Neuroretina haben. Diese Ablage-

rungen führen zu einem Verlust von Photorezeptoren (Curcio et al., 1996). Bei

der exsudativen Form der AMD finden sich Amyloidablagerungen in den subre-

tinalen Neovaskularisationsmembranen. Das Amyloid findet sich im bindege-

webigen Stroma dieser Membranen, steht offenbar nicht in Beziehung zu RPE-

Zellen und deutet somit darauf hin, dass es sich – ähnlich wie bei der Amyloi-

dangiopathie bei der AD – auch bei AMD um Ablagerungen handelt, die im

Diskussion

79

Rahmen einer lokalen Entzündungreaktion entstehen und aus kleinen Gefäßen

dieser CNV-Membranen stammen (Johnson et al., 2002).

Epidemiologische Untersuchungen legen sogar eine Komorbidität zwischen der

Alzheimer Erkrankung und AMD nahe. In einer Studie von Klaver et al. im

Rahmen der Rotterdam Eye Study (Klaver et al., 1999) wurden über 1400 Per-

sonen über 75 Jahre auf Zeichen von AD und AMD untersucht. Personen mit

fortgeschrittener AMD hatten ein erhöhtes Risiko für beginnende AD mit einem

relativen Risiko (odds ratio) von 2,1 (95%, CI 1,1-4,3). Nach Korrektur der Da-

ten hinsichtich der Risikofaktoren Rauchen und Arteriosklerose belief sich das

relative Risiko immerhin noch auf 1,5 (95%, CI 0,6-3,5). Man könnte also ver-

muten, dass Personen, die eine AMD entwickeln, auch anfälliger für weitere

neurodegenerative Erkrankungen sind.

Genetische Daten bei AD und AMD bezüglich des ApoE-ε4-Allels in der Litera-

tur ergeben allerdings ein widersprüchliches Bild. In den Studien von Klaver et

al. sowie Souied et al. scheint das ApoE-ε4 das Risiko, an AMD zu erkranken,

zu senken. In den Gruppen von AMD-Patienten war die Häufigkeit des Allels

signifikant geringer als in den Kontrollgruppen (bei Klaver et al. OD= 0,43, 95%

CI 0,21-0,88; 0,073 vs 0,149, p<0,006 bei Souied et al.). Beide Studien be-

zeichnen deshalb das ApoE-ε4 als eine Art protektiven Faktor für AMD. Für die

Alzheimer Erkrankung dagegen stellt das Allel einen gesicherten Risikofaktor

dar, der sowohl das Risiko zu erkranken erhöht als auch dosisabhängig das Al-

ter bei Erkrankungsbeginn beeinflusst. Homozygote Träger des ApoE-ε4 er-

kranken früher und mit höherer Wahrscheinlichkeit als heterozygote, und diese

wiederum wahrscheinlicher als Nichtträger (Tsai et al. 1994). Angesichts dieser

Ergebnisse scheint es wenig wahrscheinlich, dass der APOE-Genotyp zu einer

Assoziation von AMD und AD beiträgt.

Die Mechanismen jedenfalls, durch die ApoE beide Erkrankungen beeinflussen

soll, sind nicht genau bekannt. Eine ApoE-ε4 dosisabhängige Zunahme von

Amyloidablagerungen bei der AD wurde beschrieben (Rebeck et al., 1993). Bei

AMD nimmt man an, dass die ApoE-Isoformen einen Einfluss auf die Trans-

portmechanismen durch die Bruch-Membran ausüben. ApoE-ε4 zeichnet sich

durch eine geringere Neigung zur Dimerbildung im Vergleich zu den anderen

Diskussion

80

ApoE-Isoformen aus. Somit bilden die an das ApoE-ε4-Protein gebundenen

Cholesterinester und ungesättigten Fettsäuren kleinere Lipidpartikel als die A-

poE-ε2- und ApoE-ε3-Komplexe. Dies könnte beim Transport durch die Bruch-

Membran von Vorteil sein und Ablagerungen epithelialer Zellreste und der Ent-

stehung von Drusen vorbeugen (Souied et al., 1998). Stützend für diese Theo-

rie sind auch die histologischen Nachweise von ApoE in spezifischen AMD-

Ablagerungen im RPE, nämlich den basilar laminären Ablagerungen und den

weichen Drusen. Harte Drusen dagegen, die als normale altersbedingte und

somit AMD-unspezifische Veränderungen gelten, zeigen keine ApoE-

Immunreaktivität (Klaver et al., 1998).

Die Überlegung, dass es aufgrund der Ähnlichkeiten von AD und AMD auch

mögliche gemeinsame genetische Risikofaktoren gibt, bildete die Grundlage für

die vorliegende Assoziationsstudie. Für das Apolipoprotein E existieren mittler-

weile eine ganze Reihe von Studien, die eine Assoziation dieses Risikofaktors

für Alzheimer mit der AMD untersuchen. Die Ergebnisse dieser Studien sind wi-

dersprüchlich. Diese Arbeit konnte die von Klaver et al. 1998 bzw. Souied et al.

1998 veröffentlichten Ergebnisse einer Assoziation mit der AMD nicht reprodu-

zieren. Eine Untersuchung des A2M-Polymorphismus hinsichtlich eines geneti-

schen Risikos für AMD wurde bislang nicht publiziert. Dass der in dieser Arbeit

gewählte Ansatzpunkt theoretisch dennoch erfolgreich sein kann, beweist eine

erst kürzlich erschienene Studie. Zurdel et al. (2002) fanden eine Assoziation

von Allelvarianten des Cystatin C Gens CST3 mit der exsudativen Form der

AMD. Einer der untersuchten Polymorphismen stellt ebenfalls einen Risikofak-

tor für die late-onset AD dar. Auch Zurdel et al. stellten im Vorfeld funktionelle

Überlegungen an. Cystatin C ist ein Cysteinprotease-Inhibitor, der die Aktivität

von Cathepsin S reguliert, einer Protease, die wiederum wichtige regulatorische

Funktionen in Zellen des RPEs innehat.

Die Assoziation des CST3 mit der AD wurde leider erst nach dem Beenden des

experimentellen Teils dieser Arbeit veröffentlicht. CST3-Polymophismen waren

zu Beginn der Arbeit auch noch nicht als AD-Risikofaktoren untersucht worden,

so dass das Gen nicht in die Auswahl der möglichen AMD-Kandidatengene

aufgenommen wurde. Diese neuen Ergebnisse zeigen jedoch, dass die gewähl-

Diskussion

81

te Vorgehensweise, nämlich genetische Risikofaktoren für AD auch bei AMD

Patienten zu untersuchen, gerechtfertigt ist und wie im Falle des CST3 erfolg-

reich sein kann.

4.2 Methodenauswahl

4.2.1 Bestimmung des ApoE-Allelstatus Wie bereits im Ergebnisteil erwähnt, wurden zur Bestimmung des ApoE-

Allelstatus unterschiedliche Methoden getestet. Die zu Beginn der Studie getes-

teten Methoden der DGGE und der SSCP hätten den Vorteil geboten, dass ne-

ben den drei häufigen Polymorphismen ApoE-ε2, ApoE-ε3 und ApoE-ε4 auch

eventuell im untersuchten DNA-Abschnitt liegende seltene Polymorphismen

aufgefallen wären. Da trotz Veränderung sämtlicher Variablen der Methoden die

Auftrennungen der PCR-Produkte nicht zufriedenstellend zu erreichen waren,

wurden sowohl die DGGE als auch die SSCP als Methoden zur Bestimmung

des ApoE-Status als ungeeignet verworfen. In der Literatur finden sich auch

keine Hinweise darauf, dass eine der beiden Methoden bisher zur Feststellung

des ApoE-Allelstatus angewandt wurde. Eine mögliche Erklärung für das Nicht-

gelingen mag der hohe GC-Gehalt der untersuchten Sequenz sein. GC-reiche

Sequenzen besitzen einen höheren Schmelzpunkt als GC-arme Sequenzen.

Dies kann für die unzureichende Auftrennung der PCR-Produkte während der

DGGE und SSCP verantwortlich sein.

Der ApoE-Allelstatus wurde bei allen untersuchten Personen mittels der gängi-

gen Methoden der PCR, dem HhaI-Verdau und anschließender Auftrennung auf

Polyacrylamidgelen bestimmt. Durch diese einfache und schnell durchführbare

Methode konnte der ApoE-Allelstatus der 753 Studienprobanden zuverlässig

festgestellt werden.

4.2.2 Bestimmung des A2M-Allelstatus Die parallel durchgeführte Bestimmung des A2M-Allelstatus erfolgte von Beginn

an durch Auftrennung der PCR-Produkte auf Polyacrylamidgelen. Aufgrund der

Diskussion

82

einfachen Detektion dieses Deletions-Insertions-Polymorphismus wurden ande-

re Methoden nicht in Erwägung gezogen. PCR-Primer und Bedingungen wur-

den in Anlehnung an die von Blacker et al. 1998 veröffentlichte Studie etabliert.

4.3 Bewertung der Ergebnisse Ausgangspunkt einer genetischen Studie sollte eine einheitliche Krankheitsdefi-

nition sein. Doch allein die Diagnostik der AMD stellt die ophthalmologische

Forschung vor Probleme. So ist es beispielsweise immer noch fraglich, ob es

überhaupt einen spezifischen Phänotyp einer AMD gibt. Einige Erkrankungen

der Retina haben ähnliche Muster im Endstadium: die Atrophie des RPE sowie

die chorioretinale Vernarbung. Diese Erkrankungen können eine AMD vortäu-

schen und durchaus zu einer Fehldiagnose führen. Somit kann man nicht sicher

davon ausgehen, dass alle als AMD diagnostizierten Fälle tatsächlich AMD-

Fälle sind.

Weiterhin stellt sich die Frage, ob das Bemühen um eine einheitliche Klassifika-

tion in der Diagnose, wie es von Alan Bird (Bird et al., 1995) oder in der ARED-

Studie (Sackett et al., 2002) unternommen wurde, Patientenkollektive hervor-

bringt, die für eine genetische Analyse geeignet sind. Diagnostische Kriterien

mögen für epidemiologische Studien sinnvoll sein, doch eignen sich diese Krite-

rien auch für genetische Analysen? Kann man davon ausgehen, dass der phä-

notypischen Heterogentität der AMD eine genetische Heterogenität zugrund

liegt, und wenn ja, korrelieren diese Heterogenitäten miteinander? Sinnvoll wäre

es, eine Studie auf einen klar definierten Phänotyp zu beschränken, der bei den

Patienten eindeutig diagnostiziert werden kann.

Insofern muss man bei jeder Studie zuerst die Zuverlässigkeit der untersuchten

Patienten- und Kontrollgruppe bewerten, bevor man die eigentlichen Ergebnis-

se diskutiert. Die vorliegende Arbeit verlässt sich auf die Diagnosekriterien der

Augenkliniken in Münster, Würzburg, Tübingen und Heidelberg. Diese Diagno-

sen erhielten jedoch keinen näheren Informationen über das Vorliegen von

Drusen bzw. deren Morphologie. Deshalb konnten die in der Souied-Studie

(1998) veröffentlichten Ergebnisse eines protektiven Effekts des ApoE-ε4 be-

Diskussion

83

züglich drusiger AMD-Formen nicht am Patientenkollektiv nachvollzogen wer-

den.

4.3.1 Assoziation der untersuchten ApoE-Allele mit der AMD Den Ergebnissen der vorliegenden Studie zufolge gibt es zumindest im unter-

suchten Patientenkollektiv keine Assoziation eines der drei häufigen ApoE-

Polymorphismen mit der AMD.

Hinsichtlich einer Assoziation mit speziellen Formen der AMD zeigten die Stu-

dien von Klaver et al. (1998) und Schmidt et al. (2000) keinerlei Unterschiede in

der Allelverteilung. Beide Studien analysierten die Allelverteilung bei Patienten

mit trockener AMD und im Vergleich dazu bei Patienten mit der feuchten Form

der AMD und schlossen anhand der Ergebnisse eine Korrelation zwischen klini-

schem Bild einer AMD und genetischer Ursache zumindest für das ApoE-ε4

aus. Allerdings zeigen die Ergebnisse der Studie von Souied et al. (1998) eine

Assoziation des ApoE-ε4-Allels mit der exsudativen Form der AMD (ApoE-ε4

Frequenz AMD-Gruppe exsudativ vs. Kontrollen: 12,1% vs. 28,6%, p< 0,0009).

Bei der Auswertung der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurde auf eine Dif-

ferenzierung des Patientenkollektivs in feuchte und trockene AMD-Fälle ver-

zichtet, da nicht von allen AMD-Patienten gesicherte Aussagen über das jewei-

lige AMD-Stadium vorlagen. Eine solche Unterteilung ist außerdem recht will-

kürlich: Wie bereits in der Einleitung erwähnt kann sich auch aus den Formen

einer im Anfang trockenen AMD eine exsudative Verlaufsform entwickeln.

Hinzu kommt das bei einer statistischen Auswertung von Ergebnissen auftre-

tende Problem der Mehrfachtestung. Je mehr Tests an ein und derselben

Gruppe von Studienobjekten durchgeführt werden, desto größer ist die Wahr-

scheinlichkeit falsch positiver Ergebnisse. Im Falle einer genetischen Assoziati-

onsstudie würden solche falsch positiven Ergebnisse eine signifikante Assozia-

tion vortäuschen. Streng genommen muss man den p-Wert

(=Irrtumswahrscheinlichkeit) deshalb immer durch die Anzahl der statistischen

Tests teilen (so genannte „Bonferri-Korrektur“). Selbst im einfachsten Betrach-

tungsfall, z.B. Auswertung der Verteilung von ApoE- und A2M-Allelen in den un-

tersuchten Gruppen, muss man die p-Werte bereits halbieren. Bei zusätzlicher

Diskussion

84

Betrachtung der Genotyp-Verteilung und der Differenzierung in unterschiedliche

AMD-Formen erhöht sich die Zahl der durchgeführten statistischen Tests schon

auf sechs.

Rückblickend muss aufgrund der vorliegenden Untersuchungsergebnisse ge-

sagt werden, dass es sinnvoller gewesen wäre, das AMD-Patientenkollektiv en-

ger einzugrenzen. Der Ansatzpunkt der strengen Krankheitsdefinition wurde be-

reits erwähnt. Möglicherweise liegen den unterschiedlichen Formen der AMD

tatsächlich verschiedene genetische Faktoren zugrunde, so dass die klinische

Heterogentität mit einer genetischen Heterogenität korreliert. Hypothetisch wäre

es möglich, dass nur eine bestimmte Form der AMD mit einem der untersuch-

ten ApoE-Polymorphismen assoziiert ist. Eine solche genetische Assoziation

würde aber bei der Untersuchung von Patientenkollektiven mit allen Formen der

AMD unentdeckt bleiben oder erst bei zahlenmäßig sehr großen Untersu-

chungsgruppen auffällig werden.

Deshalb kann trotz der nicht signifikanten Studienergebnisse eine Assoziation

der AMD mit ApoE-ε4 nicht ausgeschlossen werden. Sicherlich ist das ApoE-ε4

bzw. das nicht Vorhandensein des Allels kein AMD-Risikofaktor von großem

Einfluss. Die Isoformen des ApoE beeinflussen aber möglicherweise den Ver-

lauf einer AMD. Erforderlich zur Klärung dieser fraglichen Assoziation wären

künftige Untersuchungen an diagnostisch exakt definierten Patientengruppen

einer spezifischen AMD-Form.

4.3.2 Signifikante Unterschiede des ApoE-4-Allels in verschiedenen Al-tersgruppen

Das einzig signifikante Ergebnis dieser Studie zeigte die Verteilung des ApoE-

ε4-Allels. Sowohl in der Gruppe der AMD-Patienten als auch in der Gruppe der

altersgemäßen Kontrollen war der Anteil der ApoE-ε4-Allelträger bzw. das Vor-

kommen des Allels signifikant geringer als in der Gruppe der Normalbevölke-

rung (Häufigkeit: 0,09 vs. 0,09 vs. 0,16). Das Ergebnis ist mit einem χ2-Wert von

14,316 und einer Irrtumswahrscheinlichkeit (= p-Wert) von 0,001 signifikant.

Hingegen war die Allelverteilung unter AMD-Patienten und altersgemäßen Kon-

trollpersonen nahezu identisch. Möglicherweise besteht eine Korrelation zwi-

Diskussion

85

schen dem Durchschnittsalter der drei untersuchten Gruppen und der jeweiligen

Allelhäufigkeit. Das Durchschnittsalter liegt in der Gruppe der AMD-Patienten

bei 80,3 Jahren, bei den altersgemäßen Kontrollen etwas höher bei 82,3 Jahren

und in der Gruppe der Normalbevölkerung bei 35,7 Jahren.

Erklärungsmöglichkeiten bleiben jedoch rein spekulativ. Denkbar wäre, dass

das ApoE-ε4-Allel nicht nur ein Risikofaktor für die Alzheimer Erkrankung, son-

dern auch für andere degenerative Erkrankungen darstellt. Dies könnte durch-

aus mit einer geringeren Lebenserwartung korrelieren und würde eine Abnah-

me der ApoE-ε4-Allelhäufigkeit in hohen Altersklassen plausibel machen. In der

Literatur findet sich hierzu eine Studie aus dem Jahre 1994, die eine Abnahme

der ApoE-ε4-Frequenz bei gleichzeitiger Zunahme der ApoE-ε2-Frequenz im

höheren Lebensalter beschreibt (Schachter et al., 1994). Trotz der nur geringen

Anzahl von 338 untersuchten Personen sind die Ergebnisse deutlich signifikant

(p=0,001 für die ApoE-ε4-Verteilung und p=0,01 für ApoE-ε2). Auch hier wird

die unterschiedliche Verteilung dahingehend interpretiert, dass die Isoformen

des ApoE einen Einfluss auf die Lebenserwartung haben. Dies deckt sich auch

mit den Ergebnissen zahlreicher Studien, die ApoE-ε4 als Risikofaktor für er-

höhte Serumcholesterinspiegel und koronarer Herzkrankheit identifiziert haben,

beides Faktoren bzw. Erkrankungen die sich durchaus lebensverkürzend aus-

wirken (Smith et al., 2000). Interessant wäre in diesem Zusammenhang eine breit angelegte, epidemiologi-

sche Studie, die die ApoE-ε4-Häufigkeit in unterschiedlichen Altersklassen der

Bevölkerung analysiert.

4.3.3 Studienvergleich In den folgenden Abschnitten werden die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit

mit den bisher publizierten Studien zur AMD-Assoziation der ApoE-

Polymorphismen verglichen und diskutiert.

Diskussion

86

4.3.3.1 Vergleich mit der Klaver-Studie Die 1998 publizierte Studie von Klaver et al. wurde im Rahmen der Rotterdam

Eye Study durchgeführt und bildete den Ausgangspunkt der vorliegenden Ar-

beit. Die Klaver-Studie untersuchte 88 Fälle von AMD, die nach der internatio-

nal anerkannten Bird-Klassifikation (Bird et al., 1995) diagnostiziert wurden. Die

Patientengruppe enthielt sowohl Fälle von geographischer Atrophie als auch

Fälle exsudativer AMD. Es fand also keine Differenzierung in spezielle Formen

der AMD statt. Die Kontrollgruppe setzte sich aus 901 Personen zusammen, die

keine Zeichen einer AMD hatten. Diese Gruppe von Kontrollpersonen lag mit

einem Durchschnittsalter von 69 Jahren 11 Jahre unter dem durchschnittlichen

Alter der in dieser Studie verwendeten Kontrollgruppe und außerdem auch un-

ter dem Durchschnittsalter der Patientengruppe. In einer solchen Kontrollgruppe

können sich durchaus Personen befinden, die erst ab dem 80. Lebensjahr Zei-

chen einer AMD entwickeln.

Die Häufigkeit des ApoE-ε4-Allel in der Gruppe der AMD-Fälle war signifikant

geringer als die Häufigkeit in der Kontrollgruppe (Patienten/Kontrollen: 0,068 vs.

0,156; p=0,002). Klaver et al. fanden außerdem eine erhöhte ApoE-ε2-

Frequenz unter den AMD-Fällen, die allerdings nicht statistisch signifikant war

(Patienten/Kontrollen: 0,125 vs. 0,09; p=0,17) und demnach zu vernachlässigen

ist. Die Schlussfolgerung von Klaver et al., dass es sich bei dieser geringen Er-

höhung möglicherweise um einen Hinweis auf eine Rolle des ApoE-ε2 als AMD-

Risikofaktor handele, ist nach statistischen Bewertungskriterien rein spekulativ

und bei der geringen Größe der Patientengruppe keineswegs nachvollziehbar.

Die in der vorliegenden Arbeit gefundenen Unterschiede der ApoE-ε4-

Verteilung innerhalb unterschiedlicher Altersgruppen traten in der Klaver-Studie

nicht auf. Um einen "selection bias" zu vermeiden, teilten Klaver et al. sowohl

AMD-Fälle als auch Kontrollgruppe in drei Altersklassen ein (Klasse 1: 55-75

Jahre, Klasse 2: 75-85 Jahre, Klasse 3: 85+ Jahre) und fanden keine Unter-

schiede in der ApoE-ε4-Verteilung. Bei den in der vorliegenden Arbeit erhalte-

nen Häufigkeitsverteilungen fand sich dagegen eine deutliche Abnahme der

ApoE-ε4-Frequenz mit zunehmendem Alter. Diese Ergebnisse korrelieren mit

den Resultaten der bereits erwähnten Studie von Schachter et al. (1994), die

Diskussion

87

häufige Polymorphismen an einem Populationskollektiv hinsichtlich einer Asso-

ziation mit der Lebenserwartung untersuchte. Diese Studie berichtet von einer

signifikanten Abnahme der ApoE-ε4-Frequenz und einer deutlichen Zunahme

von ApoE-ε2 bei Personen höheren Alters. Widersprüchlich ist, dass Klaver et

al. die altersabhängige Abnahme von ApoE-ε4 trotz der ingesamt großen Per-

sonengruppe nicht fanden.

4.3.3.2 Vergleich mit der Souied-Studie Ebenfalls 1998 veröffentlichten Souied et al. eine ähnliche Studie. Sie unter-

suchten 116 AMD-Patienten mit unilateraler, exsudativer AMD und harten oder

weichen Drusen am anderen Auge, die ebenfalls nach der Bird Klassifikation

diagnostiziert wurden. Die Kontrollgruppe bestand in der Souied-Studie aus 168

Personen ohne Anzeichen einer AMD. Die Studie zeichnet sich im Vergleich zur

Klaver-Studie durch eine sehr präzise Diagnosestellung aus. Die Durch-

schnittsalter der beiden Gruppen lagen mit 71,0 Jahren bei den AMD-Fällen

und 74,9 Jahren bei den Kontrollpersonen allerdings fast 10 Jahre unter den in

der vorliegenden Studie untersuchten Gruppen und auch unter denen der Kla-

ver-Studie. Auch Souied und seine Mitarbeiter fanden eine signifikant geringere

Häufigkeit des ApoE-ε4-Allels innerhalb der Patientengruppe (0,073 vs. 0,149 in

der Kontrollgruppe, P=0,006) und interpretierten deshalb das Allel ebenfalls als

eine Art protektiven Faktor für die Entwicklung einer AMD. Vor allem in der

Gruppe der Patienten mit weichen Drusen am Partnerauge waren die Ergebnis-

se deutlich signifikant (0,045 in der Patientengruppe vs. 0,149 in der Kontroll-

gruppe, P=0,0009). Interessant ist die beschriebene Erklärungsmöglichkeit der

Assoziation mit ApoE-ε4. Souied et al. diskutieren die Proteinfunktion des A-

poE-ε4, das im Gegensatz zu den zwei weiteren häufigen Isoformen ApoE-ε2

und ApoE-ε3 keine Dimere bildet. Möglicherweise beeinflusst das ApoE-ε4 den

Stoffaustausch zwischen Retina, RPE und Choroidea günstig. Dies könnte pro-

tektiv hinsichtlich einer Ablagerung in Form von Drusen wirken.

Die Ergebnisse dieser Studie belegen somit die Assoziation des ApoE-ε4 mit

einer spezifisch phänotypischen Form der AMD, nämlich der exsudativen AMD

Diskussion

88

und dies insbesondere in Verbindung mit weichen Drusen. Ein Schwachpunkt

dieser Studie ist wiederum das eher geringe Durchschnittsalter der untersuch-

ten Gruppen.

4.3.3.3 Vergleich mit der Pang-Studie

Im Jahr 2000 veröffentlichten Pang et al. (Pang et al., 2000) eine in Hongkong

durchgeführte Studie mit identischem Studiendesign. Sie untersuchten 98 AMD

Patienten auf eine Assoziation mit dem ApoE-ε4-Allel. Pang et al. fanden zwar

eine geringere Häufigkeit des Allels in der Patientengruppe, jedoch ohne statis-

tische Signifikanz (0,11 vs. 0,15 in der Kontrollgruppe, p=0,52). Auch unter den

Patienten mit exsudativer AMD fanden sich keine signifikanten Ergebnisse.

Pang und seine Mitarbeiter führten dies auf die in der chinesischen Population

generell geringere Frequenz des ApoE-ε4 zurück. Somit schließt die Studie ei-

ne Assoziation des ApoE-ε4 als protektiven AMD-Faktor zumindest für die un-

tersuchte, chinesische Population aus.

4.3.3.4 Vergleich mit der Schmidt-Studie Schmidt et al. publizierten 2000 eine weitere Studie zur Assoziation des Apoli-

poprotein E mit der AMD (Schmidt et al., 2000). Auch hier wurden die AMD-

Patienten nach der Bird Klassifikation ausgewählt, wobei sowohl Fälle von geo-

graphischer Atrophie als auch exsudative AMD-Formen in die Studie aufge-

nommen wurden. Die Patientengruppe bestand aus 230 Personen (Alters-

durchschnitt 74,0 Jahre), bei denen AMD entweder sporadisch (n=101) oder

aber familiär (n=129) gehäuft auftrat. Die Kontrollgruppe (n=372) setzte sich

aus Alzheimer-Patienten und gesunden Personen zusammen (durchschnittli-

ches Alter 68,1 Jahre). Auch hier ist das Durchschnittsalter der Kontrollgruppe

deutlich geringer. Außerdem wurden die Personen der Kontrollgruppe zum Teil

nicht ophthalmologisch untersucht, sondern nur befragt, ob eine AMD bei ihnen

bekannt sei - ein gewisser Schwachpunkt, der in der Publikation von Seiten der

Autoren in der Diskussion zugegeben wird.

Schmidt et al. berichten über eine geringere Frequenz des ApoE-ε4-Allels bei

den AMD Patienten, die aber keine statistische Signifikanz aufweist (Patien-

Diskussion

89

ten/Kontrollen: 0,117 vs. 0,146, p=0,35). Auch die Verteilung der Genotypen

zeigte mit einem p-Wert von 0,68 keine Signifikanz. Die Arbeitsgruppe differen-

zierte die AMD-Fälle weiterhin nach Alter und Geschlecht und fand auch hier

keine signifikant unterschiedlichen Allelverteilungen.

Signifikante Ergebnisse allerdings zeigte eine Unterscheidung in sporadische

und familiäre AMD-Fälle. Schmidt et al. belegen, dass es keine Assoziation des

ApoE-ε4 mit den sporadischen AMD-Fällen gibt. Dafür beschreiben sie aber ei-

ne signifikant geringere Frequenz an ApoE-ε4-Trägern in der Gruppe jüngerer

AMD-Patienten (Alter<70) mit familiär gehäuft auftretender AMD (0,0036 bei

Frauen und 0,273 für Männer vs. 0,309 und 0,314 bei weiblichen bzw. männli-

chen Kontrollpersonen, p=0,004). Allerdings wurden die untersuchten AMD-

Gruppen durch eine Differenzierung in sporadische und familiäre Fälle und da-

rüberhinaus in Alter und Geschlecht teilweise sehr klein. Beispielsweise be-

stand die Gruppe der familiären, männlichen AMD-Fälle mit Alter >79 Jahren

nur noch aus 6 Patienten. Hier war die ApoE-ε4-Frequenz sogar höher als in

der Kontrollgruppe. Die Gruppe der AMD-Patienten, in der sich eine signifikant

geringere ApoE-ε4-Frequenz zeigte, umfasste 39 Patienten. Trotz Anwendung

des exakten Tests nach Fischer bei der Auswertung sind solche geringen

Gruppenstärken im Rahmen einer genetischen Assoziationsstudie sicherlich

nicht geeignet, um eine deutlich genetische Komponente aufzudecken.

Schwachpunkt dieser Differenzierung ist außerdem wieder die Fragwürdigkeit

der Diagnose "familiäre AMD", da auch hier nur anhand von Patientenaussagen

verfahren wurde und die angeblich betroffenen Familienmitglieder nicht unter-

sucht wurden.

Der in der Klaver-Studie beschriebene Verdacht, das ApoE-ε2-Allel könnte ein

Risikofaktor für die AMD darstellen, da es häufiger innerhalb der AMD-

Patientengruppe vorkam, wurde in der Schmidt-Studie nicht erhärtet. Auch hier

ist die Frequenz des ApoE-ε2 zwar leicht erhöht, aber nicht signifikant (0,09 vs.

0,08, P=0,97). Die Ergebnisse der Schmidt-Studie decken sich somit weitge-

hend mit den Ergebnissen der vorliegenden Studie. Eine generelle Assoziation

des ApoE-ε4 bzw. ApoE-ε2-Allels mit der AMD konnte nicht bestätigt werden.

Diskussion

90

Schmidt und ihre Mitarbeiter kommen ebenfalls zu dem Schluss, dass Studien

an größeren Patientengruppen nötig sind, um die Assoziation des ApoE-ε4-

Allels mit der AMD weiter zu charakterisieren, vor allem aber, um aussagekräf-

tige Ergebnisse an differenzierten AMD-Untergruppen zu erhalten. Die Schmidt-

Studie legt hierbei mehr Wert auf die Differenzierung in Alter, Geschlecht und

familiäre Anamnese als auf eine Unterscheidung in trockene und exsudative

AMD-Formen.

4.3.3.5 Vergleich mit der Simonelli-Studie Im Jahr 2001 veröffentlichten Simonelli et al. eine Assoziationsstudie mit AMD-

Patienten und Kontrollpersonen italienischer Abstammung. Sie untersuchten 87

AMD-Patienten mit einem Durchschnittsalter von 71,8 Jahren. Die Diagnose

AMD wurde anhand der Bird-Klassifikation gestellt. Die altersgemäße Kontroll-

gruppe umfasste 47 Personen, die im Durchschnitt 70 Jahre alt waren und kei-

ne Anzeichen einer AMD aufwiesen. Als weitere Kontrollgruppe diente eine

1235 Probanden starke Gruppe aus der Allgemeinbevölkerung, die auf AMD

nicht untersucht wurde. Das Durchschnittsalter wird von den Autoren nicht an-

gegeben. Simonelli et al. kommen zu folgenden Ergebnissen: Das ApoE-ε2-

Allel tritt in der Gruppe der AMD-Patienten mit einer signifikant höheren Fre-

quenz auf als in der Gruppe der altersgemäßen Kontrollen (0,098 vs. 0,061,

p=0,031). Die ApoE-ε4-Allel-Frequenz ist in der Gruppe der AMD-Patienten je-

doch nicht signifikant geringer als in den altersgemäßen Kontrollen (p=0,168).

Nur im Vergleich AMD-Patienten vs. Normalbevölkerung ist die ApoE-ε4 signifi-

kant niedriger (0,029 vs. 0,105, p=0,002). Dieses Ergebnis brachte auch die

vorliegende Arbeit. Vergleicht man dieses Ergebnis jedoch mit der Studie von

Schachter et al. (1994), wird offensichtlich, dass es sich hierbei um ein bereits

beschriebenes Verteilungsphämonem des ApoE-ε4 in unterschiedlichen Alters-

gruppen handelt. Die ApoE-ε4-Allel-Frequenz ist in Personengruppen höheren

Alters geringer, unabhängig davon, ob sie an AMD erkrankt sind oder nicht.

Trotz dieses "selection bias" interpretieren die Autoren in der Simonelli-Studie

Diskussion

91

das ApoE-ε4-Allel als protektiven Faktor für die AMD – ein Schluss, der anhand

der Ergebnisse nicht nachvollziehbar ist.

4.3.3.6 Vergleich mit der Schultz-Studie Im Jahr 2003 erschien eine weitere Studie (Schultz et al., 2003) zur Assoziation

des ApoE mit der AMD. Die Autoren untersuchten hier innerhalb einer nord-

amerikanischen Population 56 Familien, in denen AMD gehäuft auftrat. Aus den

Familien gingen 259 AMD-Patienten (Durchschnittsalter 73,2 Jahre) und 207

gesunde Individuen (Durchschnittsalter 59,0 Jahre) in die Studie ein. Als Kon-

trollgruppen dienten außerdem 104 nicht-verwandte AMD-Patienten (Durch-

schnittsalter 78,4 Jahre) und 113 gesunde, nicht-verwandte Kontrollpersonen

(Durchschnittsalter 72,5). Die Diagnose „AMD“ wurde anhand klinischer Unter-

suchungen und Fundusaufnahmen gestellt.

Schultz et al. fanden trotz Anwendung von vier verschiedenen, statistischen

Testverfahren, darunter auch dem Chi-Quadrat-Test, keine signifikanten Unter-

schiede in der Allelfrequenz. Weder das ApoE-ε4-Allel noch ApoE-ε2-Allel zeig-

ten signifikante Verteilungsunterschiede. Allel- und Genotypfrequenzen waren

sowohl in den Familien als auch in der Gruppe der nicht-verwandten AMD-

Patienten im Vergleich mit den Kontrollgruppen (verwandte Individuen ohne

AMD und nicht verwandte, gesunde Kontrollen) nicht signifikant erhöht oder er-

niedrigt. Es ergab sich kein Hinweis auf eine Assoziation eines ApoE-Allels mit

der AMD.

Somit stützt die Studie von Schultz et al. die Ergebnisse der vorliegenden Ar-

beit.

4.3.3.7 Vergleich mit der Baird-Studie

Erst kürzlich wurde eine neue Studie zur Assoziation des Apolipoproteins E mit

der AMD von Baird et al. (2004) veröffentlicht. In die Studie wurden 322 nicht

verwandte AMD-Patienten und 123 Kontrollpersonen aufgenommen. Alle Pro-

banden sind Australier aus der Umgebung von Melbourne mit anglo-keltischem

Diskussion

92

Ursprung. Die Diagnosestellung erfolgte anhand von Fundusaufnahmen, wobei

sowohl atrophische als auch feuchte AMD-Fälle in die Studie eingingen (n=

252, Durchschnittsalter 77,6 Jahre). Die Autoren führen weiterhin eine Populati-

on von Fällen früher AMD auf, die in der Fundoskopie nur weiche Drusen auf-

weisen (n=70, Durchschnittsalter 72 Jahre). Die Analyse erfolgte hinsichtlich

früher und später Formen der AMD, außerdem wurde nach Geschlecht und

zwischen Fällen mit familiärem AMD-Hintergrund und sporadischen AMD-Fällen

unterschieden.

Eine signifikant geringere ApoE-ε4-Allelfrequenz wies die Gruppe der späten

AMD-Formen im Vergleich mit den Kontrollpersonen auf (11,5% vs. 17,9%, p-

Wert= 0,037). Eine Differenzierung dieser Gruppe in feuchte und trockene

AMD-Formen zeigte hochsignifikante Ergebnisse für die Gruppe der AMD-

Patienten mit atrophischer AMD, nicht aber für die Gruppe der späten AMD-

Formen mit Neovaskularisation (Gruppe späte, trockene AMD ε4-

Allelfrequenz=8,7%, p-Wert=0,018; Gruppe späte, feuchte AMD ε4-

Allelfrequenz=12,3%, p-Wert=0,091). Der Vergleich der Gruppe „frühe AMD“

mit den Kontrollpersonen erbrachte keinen signifikanten Unterschied in der A-

poE-ε4-Verteilung. Die Differenzierung nach Geschlecht zeigte signifikante Un-

terschiede für männliche Probanden: Die Gruppe männlicher Individuen mit

später AMD wies eine geringere ApoE-ε4-Frequenz im Vergleich mit den Kon-

trollpersonen auf (ApoE-ε4-Frequenz 10,3% vs. 23,6%; p-Wert=0,01). Bei weib-

lichen AMD-Patienten trat dieser Allelunterschied nicht auf. Allerdings wurden

bei diesen Differenzierungen die Probandengruppen relativ klein, so dass der

exakte Test nach Fischer angewendet wurde und die statistische Aussagekraft

damit nur begrenzt ist.

Das ApoE-ε2-Allel wies keine signifikanten Verteilungsunterschiede auf. Die

Studie belegt somit eine Assoziation des ApoE-ε4-Allels mit der späten, atro-

phischen Form der AMD im Sinne eines protektiven Faktors. Dieses Ergebnis

belegt die Hypothese, dass das ApoE-ε4 nur mit bestimmten AMD-Formen as-

soziiert ist, die klinische Heterogenität der Erkrankung also mit einer geneti-

schen Heterogenität korreliert.

Diskussion

93

4.3.3.8 Vergleich mit der Zareparsi-Studie

Zeitgleich mit der Studie von Baird et al. (2004) erschien eine weitere Assoziati-

onsstudie von Zareparsi et al. (2004), die eine Gruppe nicht verwandter Patien-

ten von 632 Individuen und eine Kontrollgruppe von 206 Personen, alle kauka-

sischer Abstammung, umfasst. Dabei lag das Durchschnittsalter der AMD-

Patienten bei 79,2 Jahren, das der Kontrollpersonen bei 74,6 Jahren.

In die Studie gingen sowohl Fälle atrophischer als auch neovaskulärer AMD ein.

Zareparsi et al. differenzierten hinsichtlich verschiedener AMD-Formen, positi-

ver Familienanamnese und Nikotinkonsum.

Das ApoE-ε4-Allel zeigte unter AMD-Patienten im Vergleich mit den Kontrollen

eine signifikant geringere Frequenz (10 % vs. 14 %, p-Wert= 0,02).

Um eine Assoziation zwischen ApoE-Allelen mit einer speziellen Form der AMD

zu untersuchen, wurde in vier verschiedene Gruppen differenziert: Patienten mit

atrophischer AMD, Patienten mit CNV, Patienten mit großen Drusen und sol-

chen mit sowohl atrophischer als auch neovaskulärer AMD. Diese Differenzie-

rung erbrachte für alle Gruppen eine signifikante Erniedrigung der ApoE-ε4-

Allelhäufigkeit (ApoE-ε4-Frequenz in Gruppen 1-4: 11 % vs. 9 % vs. 10 % vs.

10 %; Kontrollen 14 %). Im Gegensatz zur Baird-Studie (2004) ergaben sich

keine hochsignifikanten Ergebnisse für die Gruppe "atrophische AMD".

Eine Unterscheidung zwischen Patienten mit positiver Familienanamnese für

AMD und Patienten ohne betroffene Angehörige, zeigte keine signifikanten Ab-

weichungen der ApoE-ε4-Häufigkeit. Allerdings hatten AMD-Patienten mit posi-

tiver Familienanamnese einen signifikant früheren Erkrankungsbeginn, gemes-

sen am Alter bei Erstdiagnose (ED) der AMD, als Patienten ohne weitere AMD-

Fälle in der Familie (Alter bei ED im Durchschnitt 69,9 Jahre vs. 73,4 Jahre, p-

Wert=0,0001). Interessanterweise war in der Gruppe "AMD mit positiver Famili-

enanamnese" das Alter bei Erstdiagnose unabhängig vom ApoE-Allelstatus.

Weiterhin wurde eine mögliche Assoziation des für AMD nachgewiesenen Risi-

kofaktors "Nikotinabusus" mit dem ApoE-Allelstatus untersucht. Eine Differen-

zierung der AMD-Patienten in "Raucher" und "Nichtraucher" zeigte jedoch keine

Diskussion

94

signifikante Assoziation zu einem bestimmten ApoE-Allelstatus. Die ApoE-ε4-

Allelfrequenz schwankte zwischen diesen beiden Gruppen kaum.

Diese Studie belegt wiederum den protektiven Effekt des ApoE-ε4-Allels hin-

sichtlich des Risikos, an AMD zu erkranken. Außerdem zeigen die Studiener-

gebnisse, dass bei Patienten mit positiver Familienanamnese für AMD unab-

hängig vom ApoE-Allelstatus die Erstdiagnose früher gestellt wird und der Er-

krankungsprozess scheinbar eher beginnt – ein Hinweis darauf, dass bisher un-

identifizierte Gene das Alter bei Beginn der AMD beeinflussen.

4.3.3.9 Übersicht Studienvergleich Tabelle 15 stellt die Ergebnisse sämtlicher Studien zur Assoziation von ApoE-

Polymorphismen mit der AMD im Vergleich dar.

Interessant ist vor allem der Vergleich unter Berücksichtigung von Altersdurch-

schnitt der untersuchten Gruppen sowie Beschränkung auf bestimmte, phäno-

typische AMD-Formen.

Klaver et al. (1998) finden eine Assoziation der AMD mit dem ApoE-ε4-Allel, die

Allelhäufigkeit ist unter den AMD-Patienten signifikant geringer als in der Kon-

trollgruppe. In die Studie gingen Patienten mit sowohl exsudativer als auch at-

rophischer AMD ein. Allerdings haben hier Patienten- und Kontrollgruppe einen

Altersunterschied von 12 Jahren. Souied et al. (1998) belegen ebenfalls eine

Assoziation des ApoE-ε4-Allels mit der AMD und zwar mit der exsudativen

Form. Diese Studie beschränkte sich bei der Auswahl der Patientengruppe auf

diesen genau definierten Phänotyp der AMD. Baird et al. (2004) zeigen in ihrer

Studie ebenfalls eine signifikante Assoziation des ApoE-ε4-Allels mit einer spe-

ziellen AMD-Form, nämlich der späten, atrophischen Form der AMD im Sinne

eines protektiven Faktors. Interessanterweise zeigen die Formen der späten,

exsudativen AMD bei Baird et al. (2004) im Gegensatz zu Souied et al. (1998)

keine Assoziation zum ApoE-ε4-Allel.

Zareparsi et al. (2004) belegen in ihrer Studie ebenfalls eine signifikante Asso-

ziation des ApoE-ε4-Allels mit der AMD und zwar für sowohl atrophische als

auch exsudative AMD-Formen. Hier zeigt sich im Gegensatz zu den Studien

Diskussion

95

von Baird et al. (2004) und Souied et al. (1998) keine Assoziation des ApoE-ε4-

Allels zu einem bestimmten AMD-Phänotyp.

Die übrigen Studien fanden keine Assoziation des ApoE-ε4-Allels mit der AMD.

Zwar beschreiben Simonelli et al. (2001) ihre Ergebnisse der ApoE-ε4-Allel-

Verteilung als signifikant, diese Signifikanz tritt aber nur im Vergleich von Pati-

entengruppen mit der Normalbevölkerung auf, nicht im Vergleich mit den alters-

gemäßen Kontrollen.

Insgesamt lässt sich also festhalten: Vier Studien belegen eine Assoziation des

ApoE-ε4-Allels mit der AMD (Klaver et al., 1998; Souied et al., 1998; Baird et

al., 2004; Zareparsi et al., 2004), hingegen weisen die übrigen Assoziationsstu-

dien (Pang et al., 2000; Schmidt et al., 2000; Simonelli et al., 2001; Schultz et

al., 2003; Ziegler et al., 2000) keine signifikanten Unterschiede in der Häufig-

keitsverteilung des ApoE-ε4-Allels nach.

Diskussion 96

4.3.3.10 Interpretation Der Studienvergleich ergibt ein widersprüchliches Bild. Die beiden der Arbeit

vorausgegangenen Studien von Klaver et al. (1998) und Souied et al. (1998)

belegen eine Assoziation des ApoE-ε4-Allels mit der AMD. Diese Studien bilde-

ten die Grundlage für die vorliegende Arbeit. Doch weder die Ergebnisse dieser

Arbeit noch die der vier nachfolgenden Studien (Pang et al., 2000; Schmidt et

al., 2000; Simonelli et al. 2002; Schultz et al., 2003) konnten eine solche Asso-

ziation reproduzieren. Die beiden zuletzt erschienenen Studien zeigen wieder-

um signifikante Ergebnisse in der ApoE-ε4-Allelverteilung (Baird et al., 2004;

Zareparsi et al., 2004). Wie lassen sich diese Widersprüche erklären?

Diskussion

97

Eine mögliche Erklärung ist folgende: Das ApoE-ε4-Allel stellt zwar einen pro-

tektiven Faktor dar, der Effekt ist aber in verschiedenen Populationen unter-

schiedlich stark ausgeprägt. In Populationen mit schwächerer Ausprägung sind

große Studiengruppen notwendig, um bei einer Assoziationsstudie signifikante

Frequenzunterschiede zu erhalten. Möglicherweise ist der protektive Effekt, den

das ApoE-ε4-Allel hinsichtlich der AMD besitzt, in der hier untersuchten Popula-

tion zu gering, um eine statistische Signifikanz zu erreichen. Für das ApoE-ε4-

Allel gibt es nachweislich populationsspezifische Frequenzunterschiede. In

Westeuropa differiert die ApoE-ε4-Allelfrequenz von Finnland und Schweden

mit 20% bis zu einer Frequenz von 8% in Italien (Lucotte et al., 1997). Weiterhin

könnte die phänotypische Heterogenität der AMD ein Problem bei Assoziati-

onsstudien darstellen. Eventuell sind unterschiedliche Phänotypen der AMD

auch mit unterschiedlichen genetischen Risikokonstellationen assoziiert. Eine

mögliche Assoziation würde in einem großen Patientenkollektiv, das unter-

schiedliche Formen der AMD enthält, statistisch nicht auffallen. Erst Untersu-

chungen an ausgewählten Patientengruppen, die nur einen streng definierten

Phänotyp enthalten, würden den Effekt sichtbar machen. Einen Beleg hierfür

bietet u.a. die Studie von Souied et al. (1998). Die hier nachgewiesene Assozia-

tion des ApoE-ε4-Allels mit der exsudativen Form der AMD ist deutlich signifi-

kant (ApoE-ε4-Allel-Frequenz AMD-Fälle vs. Kontrollen 7,3% vs. 14,9%;

p=0.006). Eine weitere Untergruppierung erbrachte einen Anstieg der Signifi-

kanz: Im Vergleich von Patienten mit exsudativer AMD mit zusätzlichem Vor-

handensein weicher Drusen, im Gegensatz zum Vorhandensein harter Drusen,

zeigte sich folgende Allelverteilung: ApoE-ε4-Allel in der Patientengruppe (ex-

sudative AMD und weiche Drusen) 4,5% vs. Kontrollgruppe 14,9% mit einer Irr-

tumswahrscheinlichkeit (=p-Wert) von 0,0009.

Es ist beim Vergleich der Studien außerdem wichtig, den bereits erwähnten "se-

lection bias", der sich durch die in Populationen altersabhängigen Unterschiede

in der ApoE-Allelfrequenz ergibt (Schachter et al., 1994), zu berücksichtigen.

Die Simonelli-Studie beispielsweise (Simonelli et al., 2001), findet keine signifi-

kanten Ergebnisse im Vergleich der Patientengruppe mit den altersgemäßen

Kontrollpersonen. Nur im Vergleich Patienten vs. Allgemeinbevölkerung mit ei-

Diskussion

98

nem Unterschied im Durchschnittsalter (Alter Patienten vs. Allgemeinbevölke-

rung: 71,8 Jahre vs. ohne genaue Angaben der Autoren) ergibt sich eine signifi-

kant geringere ApoE-ε4-Frequenz in der Patientengruppe. Trotzdem beschrei-

ben Simonelli et al. in der Zusammenfassung ihre Ergebnisse als signifikante

Assoziation und interpretieren das ApoE-ε4-Allel als protektiven Faktor für das

Risiko, an AMD zu erkranken. Doch diese Schlussfolgerung ist fraglich. Würde

tatsächlich ein Zusammenhang bestehen, müsste der signifikante Unterschied

auch im Vergleich der Patienten mit der altersgemäßen, nicht an AMD erkrank-

ten Kontrollgruppe auftreten.

Die von Schachter et al. (1994) beschriebene altersabhängige Abnahme der

ApoE-ε4-Frequenz könnte bei entsprechend unsauberem Studiendesign, das

heißt Kontrollgruppen mit geringerem Altersdurchschnitt, eine Assoziation des

ApoE-ε4 mit der AMD oder jeder beliebigen, anderen Alterserkrankung vortäu-

schen.

4.3.4 Assoziation des A2M-1 und A2M-2 mit der AMD Die Untersuchung der beiden A2M-Polymorphismen gaben keinen Hinweis auf

eine mögliche Assoziation mit der AMD. Es fanden sich weder hinsichtlich der

Allelverteilung (AMD-Fälle vs. Kontrollen gesamt χ2=0,207; p=0,649, df=1) noch

der Verteilung der Genotypen (AMD-Fälle vs. Kontrollen gesamt χ2=4,6; p=0,1,

df=1) Unterschiede. Anhand der eindeutig nicht signifikanten Ergebnisse lässt

sich vermuten, dass selbst eine Untersuchung der A2M-Polymorphismen an

großen Patienten- und Kontrollkollektiven keine Assoziation mit der AMD oder

bestimmten Formen der Erkrankung zeigen würde. Man kann somit davon aus-

gehen, dass die beiden untersuchten Polymorphismen des A2M-Gens keine

genetischen Risikofaktoren für die AMD darstellen. Ähnliche Studien zur Asso-

ziation der beiden A2M-Polymorphismen mit der AMD wurden bisher nicht pub-

liziert.

Diskussion

99

Das Gen bleibt aufgrund seiner wichtigen Funktion im neuronalen Gewebe

dennoch ein interessanter Kandidat für die genetische Forschung an neurode-

generativen Erkrankungen.

4.4 Ausblick

4.4.1 Erforschung der AMD als komplexe Krankheit Möglichkeiten der Erforschung komplexer Erkrankungen wurden sowohl in der

Einleitung als auch in vorherigen Abschnitten der Diskussion besprochen. Im

Falle der AMD scheinen Assoziationsstudien, trotz widersprüchlicher Ergebnis-

se aus bisherigen Studien, einen erfolgversprechenden Ansatzpunkt darzustel-

len. Von Bedeutung werden in Zukunft Assoziationsstudien an diagnostisch

streng eingegrenzten Patientengruppen und ausreichend großen, altersgemä-

ßen Kontrollgruppen sein.

Wichtig ist außerdem der Aspekt der altersbedingten Degeneration: Möglicher-

weise existieren pathogenetische Parallelen zwischen der AMD und anderen

Degenerationsvorgängen, insbesondere an den Basalmembranen des Gefäß-

endothels. Proteine bzw. deren zugrunde liegenden Gene mit zentraler Rolle

bei Ablagerungsprozessen sind eventuell auch an der AMD-Pathogenese betei-

ligt und bieten somit weitere Ansatzpunkte für die Erforschung der komplexen

AMD-Ursachen.

4.4.2 Mögliche Rolle von Umweltfaktoren

Diverse epidemiologische Studien haben Umwelteinflüsse als Risikofaktoren für

AMD beschrieben. Rauchen gilt als gesicherter signifikanter Risikofaktor für

AMD (Seddon et al., 1996; Chan et al., 1998; Delcourt et al., 1998; Vingerling et

al., 1996; Schwartz et al., 1994), verschiedene andere Studien legen einen Ein-

fluss bestimmter Nahrungsstoffe nahe (Mares-Perlmann et al., 1995; Seddon et

al.; 1994).

Diskussion

100

Auch bei der Erforschung möglicher Einflüsse von Umweltfaktoren auf die Ent-

wicklung einer AMD bieten sich Parallelen zur Alzheimer-Forschung an. Für die

Alzheimer-Erkrankung ist bekannt, dass Umweltfaktoren sowohl das Erkran-

kungsrisiko als auch das Alter bei Krankheitsbeginn beeinflussen. Das Risiko,

an Alzheimer zu erkranken, scheint von mindestens vier Umweltfaktoren erhöht

zu werden. Dies ist zum einen wie bei AMD auch der inhalative Zigarettenkon-

sum, darüber hinaus erhöhen die Einnahme nichtsteroidaler Antirheumatika,

antioxidativer Vitamine sowie Hormontherapien die Anfälligkeit für Alzheimer.

Hierfür gibt es eindrucksvolle Studien an Zwillingen und Geschwisterpaaren

(Breitner et al., 1995).

Die Erforschung weiterer exogener Pathogenitätsfaktoren für AMD steht noch

aus. Hinsichtlich einer möglichen Therapie der AMD in Zukunft ist aber sicher-

lich die genetische Forschung unerlässlich. Erst durch die Aufklärung der pa-

thogenetischen Zusammenhänge lässt sich die AMD ursächlich therapieren.

4.4.3 Möglichkeiten der funktionellen Genetik im Hinblick auf die Erfor-schung der AMD-Pathogenese

Die funktionelle Genetik untersucht das Verhalten von Transkription und Ex-

pression in einzelnen Zellen oder auch Geweben in Abhängigkeit von zugrunde

liegenden biologischen Veränderungen. Veränderungen auf Zellebene können

bedingt sein durch: maligne Zellprozesse, pharmakologische Einflüsse oder ge-

netische Änderungen im Sinne von krankheitsverursachenden Mutationen,

Genmanipulation oder einer Infektion. Neue Technologien wie cDNA-Arrays auf

Objektträgern (DeRisi et al, 1996), serielle Analyse der Genexpression (SAGE)

(Lockhart et al., 1996; Cho et al., 1998; Adams et al., 1996) oder "Differential

Displays" (Liang et al., 1992; Bauer et al., 1993) ermöglichen eine Untersu-

chung der zellulären und gewebespezifischen Antwort bei der AMD. Diese Me-

thoden verlassen sich nicht auf die Kopplung bestimmter Genregionen an die

AMD, sondern konzentrieren sich auf die tatsächlich im Gewebe stattfindenden

Muster der Transkription. Ziel ist es, die molekularen Vorgänge, die im Gewebe

bei AMD stattfinden, in verschiedenen Stadien einer AMD bzw. bei phänoty-

pisch unterschiedlichen Formen zu charakterisieren. Einige dieser Arrays ma-

Diskussion

101

chen sich bereits bekannte Transkripte zu nutze, beispielsweise cDNA- und O-

ligonukleotid-Arrays. Andere wiederum, wie SAGE und die "Differential Dis-

plays", bieten die Möglichkeit, neue Gene innerhalb der Retina, des RPEs und

der Choroidea zu entdecken. Kuehn und Hageman haben mittels "Differential

Displays" und Gen-Arrays eine Vielfalt von Molekülen im RPE von AMD-

Spenderaugen entdeckt, die sich in ihrer Expression deutlich von Expressions-

muster im RPE gesunder Spenderaugen unterscheiden. Diese Daten sind al-

lerdings noch nicht publiziert.

All diese Strategien offenbaren neue Gene, die sowohl bei der AMD-

Pathogenese als auch hinsichtlich der normalen Funktion und des Zusammen-

spiels von Retina, RPE und Choroidea eine Rolle spielen. Eine Kausalität stel-

len sie alleine allerdings nicht her.

AMD an sich scheint ein gewöhnlicher Degenerationsvorgang zu sein. Dies wird

in ähnlicher Weise auch für die Alzheimer Erkrankung postuliert. Anhand der

erwähnten funktionellen, genetischen Studien erhofft man sich die Aufklärung

der Interaktionen, die auf Molekularebene diese degenerativen Vorgänge verur-

sachen. Sobald nun AMD-spezifische Gene identifiziert worden sind, kann man

damit beginnen, die komplexen Vorgänge der AMD-Pathogenese zu entschlüs-

seln. Der Einblick in dieses komplizierte Zusammenspiel zellulärer Prozesse

wird dann neue Ansatzpunkte für eine kausale AMD-Therapie eröffnen.

Zusammenfassung

102

5 Zusammenfassung

5.1 Ziel

Die Arbeit dient der Aufklärung genetischer Ursachen der altersabhängigen

Makuladegeneration (AMD) – einer komplexen Erkrankung mit bisher unklarer

Ätiologie. Ziel der Arbeit war die Untersuchung einer möglichen Assoziation der

AMD mit Polymorphismen in den Genen für Apolipoprotein E (ApoE) und Alpha-

2-Makroglobulin.

5.2 Voraussetzung

Voraussetzung für diese Arbeit waren Studien von Klaver et al. (1998) und

Souied et al. (1998). Beide Studien belegen die Assoziation eines ApoE-

Polymorphismus, dem ApoE-ε4-Allel, mit der AMD im Sinne eines protektiven

Faktors: Bei den untersuchten AMD-Patienten war die Häufigkeit des ApoE-ε4-

Allels signifikant geringer als in den Kontrollgruppen. Diese Assoziation sollte in

der vorliegenden Arbeit an einem neuen und größeren Patientenkollektiv unter-

sucht werden.

Das ApoE-ε4-Allel ist ein Risikofaktor für Morbus Alzheimer (Corder et al,

1993). Wie AMD ist die Alzheimer Erkrankung eine neurodegenerative Erkran-

kung des Alters mit komplexer Ätiologie und Pathogenese. Deshalb wurde fol-

gende Hypothese aufgestellt: Wenn das ApoE-ε4-Allel sowohl mit Morbus Alz-

heimer als auch mit der AMD assoziiert ist, sind möglicherweise auch andere,

mit Morbus Alzheimer assoziierte Polymorphismen an den pathogenetischen

Vorgängen der AMD beteiligt. Ausgehend von dieser Überlegung wurden neben

den ApoE-Polymorphismen zwei häufige Polymorphismen des Alpha-2-

Makroglobulins (A2M) untersucht. Einer dieser A2M-Polymorphismen wurde

von Blacker et al. 1998 mit Morbus Alzheimer assoziiert. Die vorliegende Arbeit

untersucht erstmals eine mögliche Assoziation dieser A2M-Polymorphismen mit

der AMD.

Zusammenfassung

103

5.3 Methoden

Die Patientengruppe setzte sich aus 400 AMD-Patienten kaukasischer Ab-

stammung zusammen (Altersdurchschnitt 82,3 Jahre). Als Kontrollgruppen

dienten zum einen eine Gruppe altersgemäßer Personen ohne Zeichen einer

AMD (n=153, Durchschnittsalter 80,3 Jahre) sowie eine weitere, aus der Nor-

malbevölkerung stammende Gruppe (n=200, Durchschnittsalter 39,8 Jahre).

Alle untersuchten Polymorphismen wurden mit der PCR amplifiziert. Bei ApoE

erfolgte die Detektion der Genotypen durch Restriktionsverdau und anschlie-

ßender, elektrophoretischer Auftrennung auf Polyacrylamidgelen. Bei A2M ge-

nügte zur Detektion die Gelelektrophorese der PCR-Produkte auf Polyacryla-

midgelen. Die Häufigkeitsverteilung der Allele und Genotypen wurden anhand

von Kreuztabellen und dem Chi-Quadrat-Test statistisch ausgewertet.

5.4 Ergebnisse

Die in den Studien von Klaver et al. (1998) und Souied et al. (1998) vorbe-

schriebene, signifikant geringere Häufigkeit des ApoE-ε4-Allels bei AMD-

Patienten konnte am vorliegenden Patientenkollektiv nicht nachvollzogen wer-

den. Die ApoE-ε4-Allelfrequenz betrug in der Gruppe der AMD-Patienten 9,5%

und in der Gruppe der altersgemäßen Kontrollpersonen ebenfalls 9,5% (χ2 =

0,005, p=0,998). Auch die beiden anderen ApoE-Polymorphismen ApoE-ε3 und

ApoE-ε2 zeigten keine signifikante Häufigkeitsverteilung.

Ein signifikantes Ergebnis brachte nur der Vergleich der ApoE-ε4-Allelhäufigkeit

bei AMD-Patienten mit der Häufigkeit in der Gruppe „Normalbevölkerung“, die

sich durch ein geringeres Durchschnittsalter auszeichnet (Häufigkeit ApoE-ε4-

Allel AMD-Patienten vs. Kontrollen Normalbevölkerung: 9,5% vs. 16,5%, χ2 =

14.3, p= 0,001; Altersdurchschnitt 82,3 vs. 39,8 Jahre). Hier liegt aber vermut-

lich ein „selection bias“ zugrunde. Eine von Schachter et al. (1994) veröffentlich-

te Studie belegt die generelle Abnahme der Häufigkeit des ApoE-ε4-Allels in

höheren Altersgruppen.

Die Untersuchung der beiden A2M-Polymorphismen ergab keinen Hinweis auf

eine mögliche Assoziation mit der AMD. Weder die A2M-Allelverteilung (AMD-

Fälle vs. Kontrollen gesamt χ2=0,207; p=0,649) noch die Verteilung der Geno-

Zusammenfassung

104

typen (AMD-Fälle vs. Kontrollen gesamt χ2=4,6; p=0,1) zeigte signifikante Un-

terschiede.

5.5 Interpretation

Der Vergleich meiner Ergebnisse mit den bisher publizierten Studien zur Asso-

ziation des ApoE-ε4-Allels mit der AMD ergibt ein widersprüchliches Bild. Ob-

wohl die Studien von Klaver et al. (1998) und Souied et al. (1998) eine Assozia-

tion des ApoE-ε4-Allels mit der AMD nachweisen, ist die Häufigkeitsverteilung

des Allels in vier nachfolgenden Assoziationsstudien (Schmidt et al., 2000;

Pang et al., 2000; Simonelli et al., 2001; Schultz et al. 2003) sowie in der vorlie-

genden Arbeit nicht signifikant. Allerdings belegen auch neuere Studien eindeu-

tig eine Assoziation des Allels mit der AMD (Baird et al., 2004; Zareparsi et al.,

2004).

Möglicherweise stellt das ApoE-ε4-Allel einen protektiven Faktor dar, der Effekt

ist aber in verschiedenen Populationen unterschiedlich stark ausgeprägt. Für

Populationen mit schwächerer Ausprägung sind vermutlich große Studien-

gruppen notwendig, um bei einer Assoziationsstudie signifikante Frequenzun-

terschiede zu erhalten.

Weiterhin könnte die Heterogenität der AMD ein Problem bei Assoziations-

studien darstellen. Denkbar wäre, dass unterschiedliche Formen der AMD auch

mit unterschiedlichen genetischen Risikokonstellationen assoziiert sind. Eine

mögliche Assoziation mit einem Polymorphismus würde in einem großen Pati-

entenkollektiv, das unterschiedliche Formen der AMD enthält, statistisch nicht

auffallen. Erst Untersuchungen an ausgewählten Patientengruppen, die nur ei-

nen streng definierten Phänotyp enthalten, würden den Effekt sichtbar machen.

Einen Beleg hierfür bietet die Studie von Souied et al. (1998), die sich auf die

exsudative Form der AMD beschränkt und eine deutlich signifikante Assoziation

dieses Phänotyps mit dem ApoE-ε4-Allel nachweist.

Der Aussagewert der bisher durchgeführten Studien zur Assoziation des ApoE-

ε4-Allels mit der AMD ist noch begrenzt. Dennoch können Assoziationsstudien

dazu beitragen, die genetischen Ursachen der AMD zu entschlüsseln und damit

Zusammenfassung

105

die Grundlage für neue Therapieansätze schaffen. Eine erfolgversprechende

Strategie für zukünftige Assoziationsstudien ist sicherlich die Untersuchung an

zahlenmäßig adäquaten und klinisch klar definierten Patientengruppen sowie

einwandfreien, altersgemäßen Kontrollpersonen.

Literaturverzeichnis 106

6 Literaturverzeichnis

1. Subfoveal neovascular lesions in age-related macular degeneration.

Guidelines for evaluation and treatment in the macular photocoagulation study. Macular Photocoagulation Study Group. Arch Ophthalmol, 1991. 109(9): p. 1242-57.

2. A randomized, placebo-controlled, clinical trial of high-dose supplemen-tation with vitamins C and E and beta carotene for age-related cataract and vision loss: AREDS report no. 9. Arch Ophthalmol, 2001. 119(10): p. 1439-52.

3. Adams, M.D., Serial analysis of gene expression: ESTs get smaller. Bio-essays, 1996. 18(4): p. 261-2.

4. Allikmets, R., Molecular genetics of age-related macular degeneration: current status. Eur J Ophthalmol, 1999. 9(4): p. 255-65.

5. Allikmets, R., et al., Mutation of the Stargardt disease gene (ABCR) in age-related macular degeneration. Science, 1997. 277(5333): p. 1805-7.

6. Anderson, D.H., et al., Local cellular sources of apolipoprotein E in the human retina and retinal pigmented epithelium: implications for the proc-ess of drusen formation. Am J Ophthalmol, 2001. 131(6): p. 767-81.

7. Baird, P.N., et al., The epsilon2 and epsilon4 alleles of the apolipoprotein gene are associated with age-related macular degeneration. Invest Oph-thalmol Vis Sci, 2004. 45(5): p. 1311-5.

8. Bauer, D., et al., Identification of differentially expressed mRNA species by an improved display technique (DDRT-PCR). Nucleic Acids Res, 1993. 21(18): p. 4272-80.

9. Bird, A., Age-related macular disease. Br J Ophthalmol, 1996. 80(1): p. 2-3.

10. Bird, A.C., What is the future of research in age-related macular dis-ease? Arch Ophthalmol, 1997. 115(10): p. 1311-3.

11. Bird, A.C., et al., An international classification and grading system for age-related maculopathy and age-related macular degeneration. The In-ternational ARM Epidemiological Study Group. Surv Ophthalmol, 1995. 39(5): p. 367-74.

12. Blacker, D., et al., Alpha-2 macroglobulin is genetically associated with Alzheimer disease. Nat Genet, 1998. 19(4): p. 357-60.


13. Blennow, K., et al., No association between the alpha2-macroglobulin (A2M) deletion and Alzheimer's disease, and no change in A2M mRNA, protein, or protein expression. J Neural Transm, 2000. 107(8-9): p. 1065-79.

14. Breitner, J.C., et al., Alzheimer's disease in the National Academy of Sci-ences-National Research Council Registry of Aging Twin Veterans. III. Detection of cases, longitudinal results, and observations on twin con-cordance. Arch Neurol, 1995. 52(8): p. 763-71.

15. Chan, D., Cigarette smoking and age-related macular degeneration. Op-tom Vis Sci, 1998. 75(7): p. 476-84.

16. Cho, R.J., et al., Parallel analysis of genetic selections using whole ge-nome oligonucleotide arrays. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95(7): p. 3752-7.

17. Chong, N.H. and A.C. Bird, Alternative therapies in exudative age related macular degeneration. Br J Ophthalmol, 1998. 82(12): p. 1441-3.

18. Corder, E.H., et al., Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families. Science, 1993. 261(5123): p. 921-3.

19. Curcio, C.A., N.E. Medeiros, and C.L. Millican, Photoreceptor loss in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1996. 37(7): p. 1236-49.

20. De Jong, P.T., et al., Age-related maculopathy: its genetic basis. Eye, 2001. 15(Pt 3): p. 396-400.

21. De Jong, P.T., et al., Familial aggregation of age-related maculopathy. Am J Ophthalmol, 1997. 124(6): p. 862-3.

22. De La Paz, M.A., et al., Analysis of the Stargardt disease gene (ABCR) in age-related macular degeneration. Ophthalmology, 1999. 106(8): p. 1531-6.

23. Delcourt, C., et al., Smoking and age-related macular degeneration. The POLA Study. Pathologies Oculaires Liees a l'Age. Arch Ophthalmol, 1998. 116(8): p. 1031-5.

24. Dentchev, T., et al., Amyloid-beta is found in drusen from some age-related macular degeneration retinas, but not in drusen from normal reti-nas. Mol Vis, 2003. 9: p. 184-90.

25. DeRisi, J., et al., Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer. Nat Genet, 1996. 14(4): p. 457-60.


26. Dow, D.J., et al., Alpha-2 macroglobulin polymorphism and Alzheimer disease risk in the UK. Nat Genet, 1999. 22(1): p. 16-7; author reply 21-2.

27. Eichner, J.E., et al., Apolipoprotein E polymorphism and cardiovascular disease: a HuGE review. Am J Epidemiol, 2002. 155(6): p. 487-95.

28. Evans, J. and R. Wormald, Is the incidence of registrable age-related macular degeneration increasing? Br J Ophthalmol, 1996. 80(1): p. 9-14.

29. Ferris, F.L., 3rd, Senile macular degeneration: review of epidemiologic features. Am J Epidemiol, 1983. 118(2): p. 132-51.

30. Fischer, S.G. and L.S. Lerman, DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels: correspon-dence with melting theory. Proc Natl Acad Sci U S A, 1983. 80(6): p. 1579-83.

31. Francois, J., The inheritance of senile macule degeneration. Ophthal-mologica, 1977. 175(2): p. 67-72.

32. Fullerton, S.M., et al., Apolipoprotein E variation at the sequence haplo-type level: implications for the origin and maintenance of a major human polymorphism. Am J Hum Genet, 2000. 67(4): p. 881-900.

33. Giannakopoulos, P., et al., Cerebral cortex pathology in aging and Alz-heimer's disease: a quantitative survey of large hospital-based geriatric and psychiatric cohorts. Brain Res Brain Res Rev, 1997. 25(2): p. 217-45.

34. Gibson, A.M., et al., Lack of association of the alpha2-macroglobulin lo-cus on chromosome 12 in AD. Neurology, 2000. 54(2): p. 433-8.

35. Gorin, M.B., et al., The genetics of age-related macular degeneration. Mol Vis, 1999. 5: p. 29.

36. Green, W.R., Histopathology of age-related macular degeneration. Mol Vis, 1999. 5: p. 27.

37. Halimi, G., et al., Association of APOE promoter but not A2M polymor-phisms with risk of developing Alzheimer's disease. Neuroreport, 2000. 11(16): p. 3599-601.

38. Hawkins, B.S., et al., Epidemiology of age-related macular degeneration. Mol Vis, 1999. 5: p. 26.

39. Heiba, I.M., et al., Sibling correlations and segregation analysis of age-related maculopathy: the Beaver Dam Eye Study. Genet Epidemiol, 1994. 11(1): p. 51-67.


40. Holz, F.G., Die altersabhängige Makuladegeneration - AMD. medgen, 2003. 2: p. 105-110.

41. Hope, C., et al., Functional analysis of plasma alpha(2)-macroglobulin from Alzheimer's disease patients with the A2M intronic deletion. Neuro-biol Dis, 2003. 14(3): p. 504-12.

42. Hutchinson, J., Symmetrial central choroido-retinal disease occuring in senile persons. R Lond Ophthalmic Hosp Rep, 1876. 8: p. 231-244.

43. Hyman, L.G., et al., Senile macular degeneration: a case-control study. Am J Epidemiol, 1983. 118(2): p. 213-27.

44. Iyengar, S.K., et al., Dissection of genomewide-scan data in extended families reveals a major locus and oligogenic susceptibility for age-related macular degeneration. Am J Hum Genet, 2004. 74(1): p. 20-39. Epub 2003 Dec 19.

45. Johnson, L.V., et al., The Alzheimer's A beta -peptide is deposited at sites of complement activation in pathologic deposits associated with ag-ing and age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(18): p. 11830-5.

46. Kessler, C., P.S. Neumaier, and W. Wolf, Recognition sequences of re-striction endonucleases and methylases--a review. Gene, 1985. 33(1): p. 1-102.

47. Kirchhof, B., Chirurgische Interventionsmöglichkeiten bei der altersab-hängigen Makuladegeneration (AMD). medgen, 2003. 2: p. 157-160.

48. Klaver, C.C., et al., Incidence and progression rates of age-related macu-lopathy: the Rotterdam Study. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2001. 42(10): p. 2237-41.

49. Klaver, C.C., et al., Smoking is also associated with age-related macular degeneration in persons aged 85 years and older: The Rotterdam Study. Arch Ophthalmol, 1997. 115(7): p. 945.

50. Klaver, C.C., et al., Genetic association of apolipoprotein E with age-related macular degeneration. Am J Hum Genet, 1998. 63(1): p. 200-6.

51. Klaver, C.C., et al., Is age-related maculopathy associated with Alz-heimer's Disease? The Rotterdam Study. Am J Epidemiol, 1999. 150(9): p. 963-8.

52. Klaver, C.C., et al., Genetic risk of age-related maculopathy. Population-based familial aggregation study. Arch Ophthalmol, 1998. 116(12): p. 1646-51.


53. Klein, M.L., W.M. Mauldin, and V.D. Stoumbos, Heredity and age-related macular degeneration. Observations in monozygotic twins. Arch Oph-thalmol, 1994. 112(7): p. 932-7.

54. Klein, M.L., et al., Age-related macular degeneration. Clinical features in a large family and linkage to chromosome 1q. Arch Ophthalmol, 1998. 116(8): p. 1082-8.

55. Kornberg, T., A. Lockwood, and A. Worcel, Replication of the Escherichia coli chromosome with a soluble enzyme system. Proc Natl Acad Sci U S A, 1974. 71(8): p. 3189-93.

56. Kramer, F., et al., Mutations in the VMD2 gene are associated with juve-nile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelli-form macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet, 2000. 8(4): p. 286-92.

57. Krott, R. and K. Heimann, Altersabhängige Makuladegeneration. Dt Ärz-tebl, 1996. 93: p. 1039-1042.

58. Kuroiwa, S., et al., ATP binding cassette transporter retina genotypes and age related macular degeneration: an analysis on exudative non-familial Japanese patients. Br J Ophthalmol, 1999. 83(5): p. 613-5.

59. Lalazar, A., et al., Site-specific mutagenesis of human apolipoprotein E. Receptor binding activity of variants with single amino acid substitutions. J Biol Chem, 1988. 263(8): p. 3542-5.

60. Lander, E.S. and N.J. Schork, Genetic dissection of complex traits. Sci-ence, 1994. 265(5181): p. 2037-48.

61. Landrum, J.T. and R.A. Bone, Lutein, zeaxanthin, and the macular pig-ment. Arch Biochem Biophys, 2001. 385(1): p. 28-40.

62. Lewis, R.A., et al., Genotype/Phenotype analysis of a photoreceptor-specific ATP-binding cassette transporter gene, ABCR, in Stargardt dis-ease. Am J Hum Genet, 1999. 64(2): p. 422-34.

63. Liang, P. and A.B. Pardee, Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 1992. 257(5072): p. 967-71.

64. Lockhart, D.J., et al., Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays. Nat Biotechnol, 1996. 14(13): p. 1675-80.

65. Lucotte, G., F. Loirat, and S. Hazout, Pattern of gradient of apolipopro-tein E allele *4 frequencies in western Europe. Hum Biol, 1997. 69(2): p. 253-62.


66. Mahley, R.W., Apolipoprotein E: cholesterol transport protein with ex-panding role in cell biology. Science, 1988. 240(4852): p. 622-30.

67. Majewski, J., et al., Age-related macular degeneration--a genome scan in extended families. Am J Hum Genet, 2003. 73(3): p. 540-50. Epub 2003 Jul 25.

68. Mares-Perlman, J.A., et al., Serum antioxidants and age-related macular degeneration in a population- based case-control study. Arch Ophthal-mol, 1995. 113(12): p. 1518-23.

69. Mares-Perlman, J.A., et al., Dietary fat and age-related maculopathy. Arch Ophthalmol, 1995. 113(6): p. 743-8.

70. Matthijs, G., et al., Structure of the human alpha-2 macroglobulin gene and its promotor. Biochem Biophys Res Commun, 1992. 184(2): p. 596-603.

71. Matthijs, G. and P. Marynen, A deletion polymorphism in the human al-pha-2-macroglobulin (A2M) gene. Nucleic Acids Res, 1991. 19(18): p. 5102.

72. Meyers, S.M., A twin study on age-related macular degeneration. Trans Am Ophthalmol Soc, 1994. 92: p. 775-843.

73. Meyers, S.M., T. Greene, and F.A. Gutman, A twin study of age-related macular degeneration. Am J Ophthalmol, 1995. 120(6): p. 757-66.

74. Paik, Y.K., et al., Nucleotide sequence and structure of the human apoli-poprotein E gene. Proc Natl Acad Sci U S A, 1985. 82(10): p. 3445-9.

75. Pang, C.P., et al., The apolipoprotein E epsilon4 allele is unlikely to be a major risk factor of age-related macular degeneration in Chinese. Oph-thalmologica, 2000. 214(4): p. 289-91.

76. Passmore, L.A., B. Kaesmann-Kellner, and B.H. Weber, Novel and re-current mutations in the tyrosinase gene and the P gene in the German albino population. Hum Genet, 1999. 105(3): p. 200-10.

77. Pauleikhoff, D., et al., Drusen as risk factors in age-related macular dis-ease. Am J Ophthalmol, 1990. 109(1): p. 38-43.

78. Pauleikhoff, D. and J.M. Koch, Prevalence of age-related macular de-generation. Curr Opin Ophthalmol, 1995. 6(3): p. 51-6.

79. Pauleikhoff, D., et al., Biochemical and histochemical analysis of age re-lated lipid deposits in Bruch's membrane. Ophthalmologe, 1994. 91(6): p. 730-4.


80. Pauleikhoff, D., et al., A fluorescein and indocyanine green angiographic study of choriocapillaris in age-related macular disease. Arch Ophthal-mol, 1999. 117(10): p. 1353-8.

81. Rebeck, G.W., et al., Apolipoprotein E in sporadic Alzheimer's disease: allelic variation and receptor interactions. Neuron, 1993. 11(4): p. 575-80.

82. Rivera, A., et al., A comprehensive survey of sequence variation in the ABCA4 (ABCR) gene in Stargardt disease and age-related macular de-generation. Am J Hum Genet, 2000. 67(4): p. 800-13.

83. Roberts, R.J., Restriction enzymes and their isoschizomers. Nucleic Ac-ids Res, 1988. 16 Suppl: p. r271-313.

84. Roche, P.A., G.S. Salvesen, and S.V. Pizzo, Symmetry of the inhibitory unit of human alpha 2-macroglobulin. Biochemistry, 1988. 27(20): p. 7876-81.

85. Sackett, C.S. and S. Schenning, The age-related eye disease study: the results of the clinical trial. Insight, 2002. 27(1): p. 5-7.

86. Saiki, R.K., et al., Enzymatic amplification of beta-globin genomic se-quences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 1985. 230(4732): p. 1350-4.

87. Sanger, F., S. Nicklen, and A.R. Coulson, DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A, 1977. 74(12): p. 5463-7.

88. Saunders, A.M., et al., Association of apolipoprotein E allele epsilon 4 with late-onset familial and sporadic Alzheimer's disease. Neurology, 1993. 43(8): p. 1467-72.

89. Schachter, F., et al., Genetic associations with human longevity at the APOE and ACE loci. Nat Genet, 1994. 6(1): p. 29-32.

90. Schick, J.H., et al., The genetic epidemiology of age-related maculopa-thy. IJGH, 2001. 1: p. 11-24.

91. Schmidt, S., et al., A pooled case-control study of the apolipoprotein E (APOE) gene in age-related maculopathy. Ophthalmic Genet, 2002. 23(4): p. 209-23.

92. Schmidt, S., et al., Association of the apolipoprotein E gene with age-related macular degeneration: possible effect modification by family his-tory, age, and gender. Mol Vis, 2000. 6: p. 287-93.

93. Schmidt-Erfurth, U., et al., Photodynamic therapy with verteporfin for choroidal neovascularization caused by age-related macular degenera-tion: results of retreatments in a phase 1 and 2 study. Arch Ophthalmol, 1999. 117(9): p. 1177-87.


94. Schultz, D.W., et al., Lack of an association of apolipoprotein E gene polymorphisms with familial age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol, 2003. 121(5): p. 679-83.

95. Schwartz, D., The Beaver Dam Eye Study: the relation of age-related maculopathy to smoking. Surv Ophthalmol, 1994. 39(1): p. 84-5.

96. Seddon, J.M., U.A. Ajani, and B.D. Mitchell, Familial aggregation of age-related maculopathy. Am J Ophthalmol, 1997. 123(2): p. 199-206.

97. Seddon, J.M., et al., Dietary carotenoids, vitamins A, C, and E, and ad-vanced age-related macular degeneration. Eye Disease Case-Control Study Group. Jama, 1994. 272(18): p. 1413-20.

98. Seddon, J.M., et al., A prospective study of cigarette smoking and age-related macular degeneration in women. Jama, 1996. 276(14): p. 1141-6.

99. Shroyer, N.F., et al., The rod photoreceptor ATP-binding cassette trans-porter gene, ABCR, and retinal disease: from monogenic to multifactorial. Vision Res, 1999. 39(15): p. 2537-44.

100. Simonelli, F., et al., Apolipoprotein E polymorphisms in age-related macular degeneration in an Italian population. Ophthalmic Res, 2001. 33(6): p. 325-8.

101. Smith, J.D., Apolipoprotein E4: an allele associated with many diseases. Ann Med, 2000. 32(2): p. 118-27.

102. Smith, W., et al., Risk factors for age-related macular degeneration: Pooled findings from three continents. Ophthalmology, 2001. 108(4): p. 697-704.

103. Smith, W., P. Mitchell, and C. Rochester, Serum beta carotene, alpha to-copherol, and age-related maculopathy: the Blue Mountains Eye Study. Am J Ophthalmol, 1997. 124(6): p. 838-40.

104. Snow, K.K. and J.M. Seddon, Do age-related macular degeneration and cardiovascular disease share common antecedents? Ophthalmic Epide-miol, 1999. 6(2): p. 125-43.

105. Snow, K.K. and J.M. Seddon, Age-related eye diseases: impact of hor-mone replacement therapy, and reproductive and other risk factors. Int J Fertil Womens Med, 2000. 45(5): p. 301-13.

106. Sommer, A., et al., Racial differences in the cause-specific prevalence of blindness in east Baltimore. N Engl J Med, 1991. 325(20): p. 1412-7.

107. Souied, E.H., et al., The epsilon4 allele of the apolipoprotein E gene as a potential protective factor for exudative age-related macular degenera-tion. Am J Ophthalmol, 1998. 125(3): p. 353-9.


108. Stone, E.M., et al., Allelic variation in ABCR associated with Stargardt disease but not age- related macular degeneration. Nat Genet, 1998. 20(4): p. 328-9.

109. Strittmatter, W.J., et al., Binding of human apolipoprotein E to synthetic amyloid beta peptide: isoform-specific effects and implications for late-onset Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(17): p. 8098-102.

110. Tsai, M.S., et al., Apolipoprotein E: risk factor for Alzheimer disease. Am J Hum Genet, 1994. 54(4): p. 643-9.

111. Vingerling, J.R., et al., Age-related macular degeneration and smoking. The Rotterdam Study. Arch Ophthalmol, 1996. 114(10): p. 1193-6.

112. Weeks, D.E., et al., Age-related maculopathy: an expanded genome-wide scan with evidence of susceptibility loci within the 1q31 and 17q25 regions. Am J Ophthalmol, 2001. 132(5): p. 682-92.

113. Weisgraber, K.H., Y.M. Newhouse, and R.W. Mahley, Apolipoprotein E genotyping using the polymerase chain reaction and allele-specific oli-gonucleotide probes. Biochem Biophys Res Commun, 1988. 157(3): p. 1212-7.

114. Yates, J.R. and A.T. Moore, Genetic susceptibility to age related macular degeneration. J Med Genet, 2000. 37(2): p. 83-7.

115. Zareparsi, S., et al., Association of apolipoprotein E alleles with suscepti-bility to age-related macular degeneration in a large cohort from a single center. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2004. 45(5): p. 1306-10.

116. Ziegler, S., et al., Analysis of genetic association of apolipoprotein E and alpha-2 macroglobulin with age-related macular degeneration. Medgen, 2000. 12 (1): p.99.

117. Zurdel, J., et al., CST3 genotype associated with exudative age related macular degeneration. Br J Ophthalmol, 2002. 86(2): p. 214-9.

118. Zurdel, J. and G. Richard, Genetic studies of age related macular degen-eration. Ophthalmologe, 2002. 99(8): p. 636-41.

Abbildungsverzeichnis 115

1, Fundusaufnahmen mit freundlicher Genehmigung von Dr. Claudia Keil-

hauer, Universitäts-Augenklinik Würzburg

2, in Anlehnung an eine Abbildung von Prof. Weber, Institut für Humange-

netik , Universität Würzburg

Alle übrigen Abbildungen wurden selbständig entworfen und umgesetzt.

Danksagung

Mein Dank gilt vor allem meinem Doktorvater Prof. Bernhard Weber, der meine

Arbeit hervorragend betreute, stets den Überblick bewahrte, meine Fragen auf

den Punkt brachte, verständlich beantwortete und während der langen Promoti-

onsphase viel Geduld an den Tag legte.

Danken möchte ich auch allen Mitarbeitern der „Arbeitsgruppe Weber“ am Insti-

tut für Humangenetik für die ständige Hilfsbereitschaft, die geduldigen Erklärun-

gen und Einweisungen in die Laborgeheimnisse und die nette Atmosphäre, die

mir in guter Erinnerung geblieben ist.

Mein Dank gilt auch Herrn Prof. Grehn für die unkomplizierte Übernahme des

Koreferats dieser Arbeit.

Zuletzt möchte ich Frau Dr. Keilhauer und Herrn PD Dr.Schrader für Ihre spon-

tane Hilfsbereitschaft danken.

Erklärung

Hiermit erkläre ich ehrenwörtlich, dass ich diese Dissertation selbständig ange-

fertigt und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel

benutzt habe.

Ich habe diese Dissertation nicht, weder vollständig noch teilweise, an einer an-

deren Fakultät mit dem Ziel, einen akademischen Grad zu erwerben, vorgelegt.

Ich erkläre, dass ich keine früheren akademischen Grade erworben habe und

dies auch nicht versucht habe. Mir wurde außerdem kein akademischer Grad

entzogen.

Ein strafrechtliches Ermittlungsverfahren oder ein Disziplinarverfahren wurde

noch nie gegen mich eingeleitet. Regensburg, den 24.Oktober 2004

Lebenslauf

ZUR PERSON

AUSBILDUNG

• 1982-1986 Grundschule Volkach

• 1986-1995 Gymnasium Frankenlandschulheim Schloß Gaibach

• 1995-1996 Studium der Kunstgeschichte, Philosophie und Germanistik an der der Julius Maximilians Universität Würzburg

• 1996-2003 Studium der Humanmedizin an der Julius Maximilians Uni-

versität Würzburg

FAMULATUREN

• Allgemeinchirurgie im Kreiskrankenhaus Gerolzhofen, April 2000

• Institut für Rechtsmedizin der Charité, Humboldt Universität Berlin, August 2000

• Praxis für Allgemeinmedizin Dr.Kircher/Dr.Reiche, Prichsenstadt, März 2001

• Moorfields Eye Hospital, London, August 2001

• Psychiatrische Klinik Bamberg, September 2001

• Geboren am 29. Februar 1976 in Schweinfurt

• Eltern: Ursula Ziegler, Volksschullehrerin

Dr.rer.nat. Rolf Ziegler, Studiendirektor

• Familienstand: ledig

Lebenslauf

PRAKTISCHES JAHR

• Chirurgische Universitätsklinik Würzburg • Augenklinik der Universität Würzburg • Zürcher Höhenklinik Wald, Schweiz

ÄRZTIN IM PRAKTIKUM

• 08-12/2003 Klinik und Poliklinik für Chirurgie der Ludwig-Maximilians-

Universität München, Innenstadt

• 01-09/2004 Klinik und Poliklinik für Herz-Thorax- und herznahe Ge-fäßchirurgie der Universität Regensburg

ASSISTENZZEIT

seit 10/2004 Assistenzärztin an der Klinik und Poliklinik für Herz-Thorax- und herznahe Gefäßchirurgie der Universität Regensburg

PUBLIKATION

Die vorliegende Arbeit wurde als Posterpräsentation auf der Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik mit dem Titel:

„Analysis of genetic association of apolipoprotein E and alpha-2-macroglo-bulin with age-related macular degeneration”

im März 2000 in Lübeck vorgestellt.

aus dem institut für humangenetik der universität … · kreislauferkrankungen mit hypertonie,...

Documents