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PCR Polymerase Chain ReactionAdila Trubat
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Síntese de DNA
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Síntese de DNA
Ligações químicas que mantêm a estrutura do DNA
Ligações covalentes – unem os átomos; Forças hidrofóbicas – forçam as bases a se
esconderem dentro da dupla hélice; Forças de Van der Walls – entre os anéis
aromáticos de bases adjacentes (ao lado); Pontes de hidrogênio – entre as bases
adjacentes.
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Síntese de DNA
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Duplicação do DNA
A informação genética é estocada no DNA por meio de um código (o código genético) no qual a seqüência de bases adjacentes determina a seqüência de aminoácidos no polipeptídeo codificado.
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Síntese de DNA O empacotamento do DNA acontece entorno das histonas
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Origens de duplicação
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Síntese de DNA
A síntese do DNA ocorre no sentido 5' → 3'
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Síntese de DNA – enzimas de duplicação
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Síntese de DNA – enzimas de duplicação
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Síntese de DNA – enzimas de duplicação
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DNA Polimerase III Sentido 5’ → 3’ Nucleotídeos 3P
são adicionados Liberação de
Pirofosfato
Síntese de DNA – enzimas de duplicação
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DNA RNA
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Duplicação do DNA
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Duplicação do DNA
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Duplicação do DNA
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Duplicação do DNA
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Duplicação do DNA
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Duplicação do DNA
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PCR
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PCR
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PCR
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PCR
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PCR
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PCR – primer • Sintetizados quimicamente;• 15 a 25 bases ;• Define limites alvo a amplificar – marcadores genéticos• Serve como ponto de início para a replicação;• Permite a cópia das 2 cadeias simultaneamente nas duas
direções (para frente e para trás);• Banco de Dados International Nucleotide Sequence Database
(www.insdc.org)• GenBank (NCBI, NIH) European Molecular Biology Laborstory
(EMBL) DNA DataBank of Japan (DDBJ)
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Marcador Molecular
Um marcador genético é qualquer variação na sequência do DNA de um ser vivo que o diferencie de outro indivíduo - ou grupo de indivíduos - ou que permita a identificação de uma característica específica inerente a ele. Podem ser utilizados com diversas aplicabilidades, como a caracterização de doenças genéticas e novos medicamentos, e também para a identificação de indivíduos, com grande utilidade para a genética forense e testes de paternidade.
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Marcador Molecular
A matéria-prima da variabilidade genética é a ocorrência de mutações. Estas, ao se perpetuarem com frequência acima de 1% na população, passam a ser reconhecidas como polimorfismos genéticos. Alguns polimorfismos podem ser utilizados como marcadores e os STR (short tandem repeat), ou microssatélites, são os mais comumente aplicados em testes de paternidade por DNA
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Marcador Molecular
Os STR são formados por pequenos motivos (de 1 a 8 nucleotídeos) repetidos sequencialmente e são encontrados em regiões não codificantes por todo o genoma. Estes marcadores apresentam alta variabilidade, determinada tanto pelo motivo a ser repetido quanto pela quantidade de vezes em que aparece.
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Marcador Molecular
Como cada indivíduo recebe um alelo do pai e o outro da mãe, a comparação entre loci hipervariáveis da pessoa analisada com os do suposto pai e confirmados com os herdados da mãe, é uma forma altamente discriminatória de determinar se há vínculo genético entre eles ou não.
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Marcador Molecular
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Marcador Molecular
Centenas de loci STR já foram identificados e, atualmente, utilizam-se sistemas comerciais formados por conjuntos de marcadores (CODIS, NGM, IDENTIFILER, entre outros) específicos para identificação humana que apresentam um alto grau de certeza.
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Marcador Molecular
Uso de primers para regiões flanqueantes
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PCR
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PCR
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Duplicação do DNA
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PCR
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Duplicação do DNA
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PCR
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PCR em tempo real
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PCR em tempo real
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PCR em tempo real
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PCR em tempo real
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PCR em tempo real
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PCR em tempo real
Permite a quantificação de DNA presente na amostra – proporcional ao número de ciclos no qual aparece a fluorescência
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PCR tradicional X PCR em tempo real
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Teste de Paternidade
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Marcador Molecular
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Cálculo do IPC
Para alcançar um resultado confiável, é necessário realizar uma análise estatística. O índice de paternidade (IP) resume a informação fornecida pelo exame. Nesse índice, é calculada a probabilidade do suposto pai ser o pai biológico da criança, contra a probabilidade de qualquer outro indivíduo ser o pai.
O cálculo do IP deve ser realizado para cada um dos loci utilizados individualmente. O produto dos IPs estudados irá gerar o Índice de Paternidade Cumulativo (IPC). O IPC indica se a hipótese de que o suposto pai é o pai biológico está mais próxima de ser verdade do que a hipótese de que qualquer outro homem o seja.
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Cromossomo Y
Os STRs do cromossomo Y também são bastante utilizados em identificação humana por DNA, pois têm características especiais que os tornam muito importantes,principalmente na investigação de paternidade. Por não haver recombinação durante a meiose, devido à falta de cromossomos homólogos, todos os membros do sexo masculino de uma mesma família possuem os mesmos alelos, que são herdados em blocos; a esse tipo de herança chamamos de herança haplotípica, e ao conjunto de alelos, chamamos haplótipos. Dessa forma, os STRs do cromossomo Y de um filho (do sexo masculino) será sempre igual à de seu pai, avô e tios.
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Banco de dados de DNA
O primeiro banco de dados de DNA foi criado na Inglaterra nos anos 1990. No entanto, nos últimos anos, a grande expansão da biologia molecular e da bioinformática tem contribuído para o desenvolvimento de inúmeros bancos de dados de DNA no mundo todo. A criação desses bancos, atualmente, é uma tendência mundial. A princípio, a criação dos bancos se deu principalmente para contribuir com a polícia no esclarecimento de crimes cometidos, uma vez que evidências de DNA podem acusar ou inocentar um indivíduo de ter cometido um crime, tornando-se, assim, uma ferramenta utilizada nos tribunais.