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Aula de Bioquímica I
Tema:
Exemplos de Mecanismos de Catálise Enzimática
Prof. Dr. Júlio César Borges
Depto. de Química e Física Molecular – DQFM
Instituto de Química de São Carlos – IQSC
Universidade de São Paulo – USP
E-mail: [email protected]
Enzimas Proteolíticas: Proteases
Renovação de proteínas
- Reciclagem de Aminoácidos novas proteínas
- Energia Livre a partir de aminoácidos
- Digestão
Regulação celular
- Desenvolvimento - Coagulação sanguínea - Inflamação
Hidrólise de ligações peptídicas
- Adição de uma molécula de água
- t1/2 para hidrólise em pH neutro 10 a 1000 anos
Ressonância
Carbono da Carbonila é menos eletrófilo
Menor suscetibilidade a ataque nucleófilo
SERINA-PROTEASES
Mecanismo envolve a participação de uma Ser particularmente reativa
- Funciona como um poderoso nucleófilo para atacar o C da Carbonila da ligação peptídica
- Catálise covalente formação de um intermediário ligado à Enzima
SERINA-PROTEASES
Quimotripsina
- Cliva ligações Peptídicas do lado carboxílico de aminoácidos hidrófobos volumosos
Nomenclatura de especificidade para
interações Proteases-substrato
Pn= posição dos radicais Amino-cidível
Pn’= posição dos radicais Carboxi-cidível
Sn= Local na enzima para o radical Amino
Sn’= Local na enzima para o radical Carboxi
Sequência substrato da Quimotripsina
Marcação covalente com DIFP
(diisopropylphosphofluoridate)
Apenas a Ser reativa ligou ao DIFP
- 1 de 20 Ser na Quimotripsina
Estudos de Cinética enzimática
Uso de substrato cromogênico: Clivagem de uma ligação Éster libera produto amarelo
SERINA-PROTEASES
Identificação do sítio ativo
SERINA-PROTEASES
Identificação do sítio ativo
Estudos de Cinética enzimática
Stopeed-flow (fluxo interropido)
Reação em 2 fases
SERINA-PROTEASES
Identificação do sítio ativo
Reação em 2 fases
Reação em duas etapas
1º) Acilação Formação de
Acil-Enzima
2º) Desacilação Saída do
grupo abandonador
SERINA-PROTEASES
Quimotripsina
Quimotripsinogênio produzido no pâncreas e
ativado no estômago Ativação proteolítica
SERINA-PROTEASES
Sítio ativo é formado pela Tríade catalítica
- Asp, His e Ser forma rede de H-bound que reduz pKa da Ser catalítica
Hiper-polarização da OH da Ser
- Formação de um íon alcóxido
reativo poderoso nucleófilo
SERINA-PROTEASES
Quimotripsina Estrutura protéica
SERINA-PROTEASES
Quimotripsina Estrutura protéica
Mecanismo envolve:
- Catálise ácido-base
- Catálise nucleofílica
+
SERINA-PROTEASES
SERINA-PROTEASES
Sistema de revezamento de cargas
SERINA-PROTEASES
Mecanismo envolve:
- Catálise eletrostática
- Catálise por tensionamento ajuda a formar a estrutura tetraédrica
- Intermediário tetraédrico é estabilizado pelo “Buraco Oxi-ânion”
1
Subtilisina
Carboxipeptidase II
SERINA-PROTEASES
Tríade catalítica
- Importância foi estudada por mutagênese sítio específica
- Atividade analisada por Cinética Enzimática
Subtilisina
Mutantes S221A, H64A e D32A e Triplo Mutante Menor atividade catalítica em 106 x
Mantém KM constante Afinidade E + S inalterada
Triplo mutante é ainda 103 vezes mais ativo do que Tampão
Explicação O mecanismo de catálise por tensionamento é mantida.
SERINA-PROTEASES
Quimotripsina, Tripsina, Elastase e TEV Evolução Divergente
Apresentam ~ 40% de identidade na seqüência
Estrutura terciária similar
Mecanismo de catálise similar
Diferem na especificidade por substratos
Superposição da
Quimotripsina e Tripsina
Alta similaridade estrutural
SERINA-PROTEASES
Quimotripsina, Tripsina e Elastase Evolução Divergente
Bolsão S1
Principal fator de
especificidade destas
enzimas
SERINA-PROTEASES
Tripsina Bovina
- Tríade catalítica
- Substrato Arg no bolsão
- Asp enterrado no cerne da Estrutura
- 5 Pontes dissulfeto
SERINA-PROTEASES
- Quimotripsina – Subtilisina – Carboxipeptidase
II e ClpP protease
Sem correlação na estrutura primária e terciária
Evolução convergente
A Natureza parece ter descoberto de maneira
independente o mesmo mecanismo catalítico pelo
menos Quatro vezes
Outras PROTEASES
1- Ativação do nucleófilo 2- Polarização da lig. Peptídica
3- estabilização do intermediário tetraédrico
Cisteino-proteasesSerino-proteases
Metalo-proteasesAspartato-proteases
INIBIDORES DE PROTEASES
Muitos medicamentos são inibidores de proteases
Ex: Captopril:
Inibidores da Enzima Conversora de Angiotensina: antihipertensivos
INIBIDORES DE PROTEASES
Muitos medicamentos são inibidores de proteases
Aspartato proteases
INIBIDORES DE PROTEASES
Muitos medicamentos são inibidores de proteases
Inibidores da aspartil protease do HIV
ANIDRASE CARBÔNICA
“Tornando mais rápida uma reação rápida”
Não-catalisada V = 1,3 x 10-1 (s-1)
Catalisada V = 1,0 x 10+6 (s-1)
Catálise depende da
presença de 1 íon Zn2+,
coordenado por 3 His,
localizado no fundo do
Sítio Ativo à 15 Angstrons
da superfície da enzima
ANIDRASE CARBÔNICA
Catálise por Zn2+ ocasiona a ativação de uma molécula de H2O
Dependência da V em função do pH
- Catálise Básica
Zn2+ reduz o pKa da H2O de 15,7
para 7,0
- Aumento da [HO—] local mesmo em
pH = 7,0
- Íon HO— é um nucleófilo mais
poderoso do que a H2O
15,7Efeito do pH na Atividade da
Anidrase carbônica
ANIDRASE CARBÔNICA
Catálise ocorre em 4 etapas
- Catálise por Orientação - Catálise base geral
Próton liberado é captado pela His64
ANIDRASE CARBÔNICA
Mecanismo de Catálise apoiado pelo Análogo sintético de coordenação do Zn2+
- Em pH 9,2, o complexo sintético mostra V hidratação do CO2 100 x maior
O Análogo sintético reduz o pKa da H2O = 8,7
ANIDRASE CARBÔNICA
Regeneração da Enzima depende da liberação do próton passo limitante
V da hidratação do CO2
= 1,3 x 10+6 (s-1)
-1-111
1
-1-1-11 sM10sM10 é H do difusão a Se
k
)sM(1x10M)1x10(M1x10 1-1-117-
1
7-
1
1
kk
kK
?
-14
1 s1x10k
- A liberação do H+ é fator limitante para a Velocidade da Reação
O meio celular é tamponado!!!! buffer com pKa = 7.0
- A Keq será = 1
ANIDRASE CARBÔNICA
A Velocidade da reação depende da presença de um tampão para receber os prótons
liberados da H2O para formar o nucleófilo OH—
-1-19
11 sM10 a' e' limita meio do difusãoA
kk
’.[B]kpor dada será prótons de retirada de A taxa 1
-163-1-19
1 s10)10(*)sM(10 ]'.[ MBk
Concentração de Tampão da ordem de mM
(1.10-3 M) são suficientes para alcançar
Velocidades de 1.10+6 s-1
ANIDRASE CARBÔNICA
O Zn2+ está a 15 Å de profundidade da superfície da enzima
Sem contato com o meio externo
O transporte de H+ do sítio ativo para o tampão depende de um mecanismo especial
His64 “LANÇADEIRA DE PRÓTONS”
na estrutura da proteína
ANIDRASE CARBÔNICA
O Zn2+ está a 15 Å de profundidade da superfície da enzima
Sem contato com o meio externo
O transporte de H+ do sítio ativo para o tampão depende de um mecanismo especial
ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
Enzimas de Restrição
Enzimas Especializadas em degradar DNA exógeno em bactérias
- Mecanismo de defesa contra infecção viral
Endonucleases de Restrição tipo II
Clivam dentro da seqüência de
reconhecimento
Grande importância na
Engenharia Genética, Biologia
Molecular e Biotecnologia
Permitem a construção de
moléculas de DNA específicas
- Clonagem de DNA
Emprego em testes de
paternidade
ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
Especificidade das Enzimas de Restrição: Altíssima
- Atuar somente na sequência de reconhecimento e NÃO devem degradar o DNA endógeno
Reconhecem sequências específicas – Sítios de restrição
- Seqüência palindrômica = permite a mesma leitura em ambos os sentidos
Reconhecem apenas o DNA Exógeno
Metilases
Enzimas específicas que modificam o DNA endógeno no mesmo sítio de reconhecimento
Para cada Enzima de Restrição existe uma Metilase correspondente
- Enzima de Restrição + Metilase: Sistema de restrição-modificação
ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
Mecanismo da Hidrólise
Presença de Intermediários ligados à enzima?
Mecanismo 1 Catálise covalente
2 Passos sem inversão da configuração do P.
Mecanismo 2 Hidrólise direta
1 Passo Inversão da configuração do P.
ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
Mecanismo da Hidrólise
1 Passo com inversão da configuração do P
Sem intermediários reacionais
Sem catálise covalente
Envolve hidrólise direta
Uso de fosfotiatos marcador de
estereoisomeria
EcoRV
Dependência de Magnésio – Co-fator
- Mecanismo em Deslocamento Sequencial Ordenado
1º DNA
2º H20
Íon Magnésio (Co-fator)
Coordenado por 6 ligantes
- 3 H2O
- 2 Asp
- 1 O do Pi
Ativa uma H2O para Ataque
Nucleofílico no grupo fosfato
Catálise por íon Metálico
- Posicionamento
- Catálise Eletrostática
- Catálise ácido-baseOrdem de ligação à EcoRV
1º: DNA
2º: Co-fator Mg2+
3º: H20 reativa
EcoRV
Interação EcoRV-DNA ocorre por simetria Bilateral
Sequência de reconhecimento é uma
sequência invertida
Enzima dimérica age nas duas fitas do DNA
Interação EcoRV-DNA
A Enzima envolve o DNA
Metilação no DNA endógeno
EcoRV
Afinidade EcoRV-DNA Inespecífico e específico é similar
- Distorção do DNA só ocorre com interações produtivas com DNA específico
EcoRV
Afinidade EcoRV-DNA Inespecífico e específico é similar
- Distorção do DNA só ocorre com interações produtivas com DNA específico
Distorção do DNA tem um grande custo entrópico
que é compensado pelas interações produtivas
com DNA específico
Catálise por tencionamento
Distorção do DNA ajuda a posicionar o Pi
próximos aos grupos Asp reativos
EcoRV
Complexo catalítico é montado somente após ser garantida a
especificidade da interação Enzima-DNA Distorção do DNA
- Reação só progride se a especificidade for garantida
- Mecanismo em Deslocamento Sequencial Ordenado
A Enzima usa a Energia livre de ligação
com o DNA para deformar o Substrato e
preparar o complexo catalítico para a
reação.
Mg2+ é coordenado pelo Pi a ser clivado e
Asp posicionados próximos na conformação
distorcida
DNA cognato = específico
DNA não-cognato = inespecífico
ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO TIPO II
Sem identidade Sequencial
Com identidade Estrutural
São proteínas homólogas transferência gênica horizontal
O gene foi disseminado por um plasmídio após a divergência evolutiva das bactérias