attivitÀ antiossidante ed antiproliferativa, … · conseguenze dell'ipoossigenazione sar. à...
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Dipartimento di Scienze Biomolecolari Sezione di Biochimica Clinica e Biologia Cellulare
Dott.ssa Serena Benedetti
ATTIVITÀ ANTIOSSIDANTE ED ANTIPROLIFERATIVA, MODULAZIONE
FISIOLOGICA DELLA DOMANDA DI OSSIGENO A LIVELLO CELLULARE: DALLA RICERCA UNIVERSITARIA ALLA PRATICA CLINICA
AREE DI RICERCA UNIVERSITARIA: BIOCHIMICA CLINICA DELLO STRESS
OSSIDATIVO
RICERCA DI BASE
Valutazione in vitro delle proprietà antiossidanti ed antitumorali di integratori naturali
RICERCA CLINICA
Valutazione in vivo dello stato ossidativo/antiossidante in diverse condizioni
patologiche
RICERCA IN AMBITO CLINICO
RUOLO DELLO STRESS OSSIDATIVO IN: Insufficienza renale cronica
Rischio cardiovascolare, Diabete
Disturbi dell’umore, Sclerosi multipla
Infertilità di coppia, Menopausa
Osteoartrosi
VALUTAZIONI BIOCHIMICHE: Profilo antiossidante (vitamine A, C, E, carotenoidi, glutatione, tioli
proteici, enzimi antiossidanti).
Profilo ossidativo (marcatori di danno a lipidi, proteine e DNA).
ANTIOSSIDANTI Modulatori fisiologici ad azione regolatoria in grado di prevenire o rallentare i
fenomeni degenerativi legati allo stress ossidativo.
MODULATORI FISIOLOGICI
Sostanze naturali appartenenti a varie entità chimiche che hanno la caratteristica di modulare i processi biologici sia in senso positivo che negativo.
(Cornelli et al. Progress in Nutrition 2010; vol. 12, n. 2)
MODULATORI FISIOLOGICI DELL’OSSIGENO Nuova classe di nutraceutici mirati a modulare l’ossigeno a livello cellulare, in modo da trarre tutti i possibili benefici dall’ossigenazione
cellulare senza intercorrere nei processi ossidativi ad essa legati.
L’ossigeno consente agli equivalenti riducenti estratti dai nutrienti di generare, attraverso l’attività mitocondriale, l’energia necessaria per tutti i processi biologici (ATP).
ELEVATA PRODUZIONE DI RADICALI LIBERI DURANTE LA RESPIRAZIONE MITOCONDRIALE
PER LA SINTESI DI ATP
Se i livelli di radicali liberi eccedono le capacità antiossidanti, i fenomeni ossidativi che ne conseguono a carico dei lipidi e delle proteine possono causare
danni alla membrana con riduzione della funzionalità cellulare.
L'n-DNA invecchia e i telomeri si accorciano QUANDO il mitocondrio non riesce a svolgere le sue normali funzioni che non sono soltanto quelle di produrre ATP ma anche, attraverso i Cluster Fe/S, sintetizzati nel mitocondrio, di riparare il danno dell'n-DNA, formare nuovo n-DNA
e, importante, provvedere al mantenimento della fisiologica
lunghezza dei telomeri.
Per comprendere l'importanza dell'allontanamento fisiologico dei prodotti del catabolismo cellulare sulla salute del corpo, osservo cosa accade IN VIVO nell'Unità Microvascolotessutale (UMVT) dei vari sistemi biologici, se non sono eliminati I DEB, Dispositivi Endoarteriolari di Blocco, neoformati-patologici, tipo I, sotto tipo a) oncologici e b) aspecifici, che caratterizzano i Reali Rischi Congeniti. Il materiale-energia-informazione (sangue) non fluisce fisiologicamente ai capillari nutrizionali, provenendo direttamente dalle piccole arterie ed arteriole, sec. Hammersen o "cuore periferico" di Allegra. Infatti, una parte significativa di m-i-e attraversa le AVA (anastomosi Artero-Venose, Gruppo A e B, sottogruppi I e II, sec. Bucciante) e arriva al versante venoso dell'UMVT causando ipertensione locale, stasi, danno ipertensivo sugli endoteli ed accumulo quindi di H+: Acidosi Tessutale. Tutto questo significa che i mitocondri sono in crisi e i telomeri si accorciano per carenza di sintesi di Cluster Fe/S. In conclusione, eliminare il RRC per riportare il pH istangico nella norma, significa ripristinare il normale allontanamento dei prodotti del catabolismo. Alimentazione corretta! Fisiologica funzione degli emuntori normali! Ma non dimentichiamo la terapia mitocondriale....
IMPORTANZA DELL’OSSIGENO · Il corpo umano è costituito dal 62% di ossigeno. · È l’elemento più importante per la salute dell’uomo poiché permette alle nostre cellule di trasformare in energia gli alimenti. · Pur essendo molto attenti alla nostra alimentazione, se la nostra ossigenazione è insufficiente, l’assimilazione e la trasformazione degli alimenti sarà incompleta e porterà ad un accumulo di SCORIE METABOLICHE che saranno difficilmente eliminate
L’ UOMO È COMPOSTO DA PIÙ DI 100.000 MILIARDI DI CELLULE
· INVECCHIAMENTO (a 50 anni l'ossigeno cellulare diminuisce del 50%)
· STRESS (il sistema nervoso è uno dei maggiori consumatori di ossigeno. Il primo organo a subire le conseguenze dell'ipoossigenazione sarà il cervello)
· STILE DI VITA ERRATO: SEDENTARIETA’, CATTIVA ALIMENTAZIONE O ECCESSICA ASSUNZIONE DI CIBO, ALCOOL, LAVORO ECCESSIVO ECC. · TABAGISMO (per un fumatore la riduzione della capacità di trasportare ossigeno da parte dell'emoglobina è stimabile intorno al 20%)
· INQUINAMENTO ATMOSFERICO ( Il monossido di carbonio la capacità di fissarsi sull'emoglobina 250 volte più dell'ossigeno)
· MALATTIE VARIE (Insufficienza respiratoria, insufficienza cardiaca, ecc.) Le malattie in genere provocano un rallentamento dell'assimiliazione di ossigeno · OBESITÀ (Più l'obesità è marcata, meno le cellule sono provviste di ossigeno; inoltre questa mancanza di ossigeno favorisce maggiormente l'obesità)
· INQUINAMENTO ALIMENTARE, INQUINAMENTO DELLE ACQUE (nitrati-nitriti=metaemoglobina=riduzione della capacità del sangue a trasportare O2)
· INQUINAMENTO DOMESTICO (Monossido di carbonio, formaldeide, biociti, metalli pesanti, materiali fibrosi, ecc.)
· RUSSAMENTO E LE APNEE NOTTURNE
· METALLI PESANTI (generano radicali liberi dannosi per la respirazione. Il Mercurio è il solo metallo volatile che riesce a penetrare attraverso i polmoni e la pelle con effetti negativi sul sistema nervoso e il sistema ormonale e sul mitocondrio)
· STATI INFIAMMATORI (mancanza di ossigeno = sofferenza cellulare = malattie in “ite”: cistite, gastrite, prostatite ecc.)
Tutti questi fattori fanno dichiarare ai ricercatori che tutti noi, a livelli diversi, siamo in stato di IPOSSIA
“Alle cellule tumorali viene a mancare
l’informazione per procedere nel loro normale
sviluppo differenziativo. Se forniamo a queste
cellule tumorali le giuste informazioni e i giusti
nutrienti come l’ossigeno vitamine e minerali oltrte
che un ambiante sano, per ritornare a procedere nel
loro regolare sviluppo, vengono risolte le mutazioni
che sono all’origine della malignità, le cellule
tornano a differenziarsi correttamente e di fatto si
normalizzano”. Prof. Pier Mario Biava
DEUTROSULFAZYME (CELLFOODTM) COME MODULATORE FISIOLOGICO
DELL’OSSIGENO
Integratore nutrizionale naturale (dall’alga marina Lithothamnion calcareum) contenente dispersi in forma colloidale amminoacidi, enzimi, oligoelementi e
solfato di deuterio in tracce.
+
Permette di trarre i benefici dell’ossigenazione cellulare senza intercorrere nei processi ossidativi ad essa legati.
Aumento della disponibilità di O2 in soluzione acquosa
Elevata capacità antiossidante
TEST DI LABORATORIO SU DEUTROSULFAZYME
Iorio EL: Hypoxia, free radicals and antioxidants. The “Deutrosulfazyme” paradox. Hypoxia Medical J 2006, 1-2: 32.
EVIDENZE SPERIMENTALI IN VITRO (1)
La somministrazione di CELLFOOD a cellule endoteliali in coltura determina:
del consumo di O2 della produzione di ATP
MIGLIORAMENTO DEL METABOLISMO RESPIRATORIO MITOCONDRIALE
In condizioni di ipossia, CELLFOOD inibisce la generazione di radicali liberi (ROS) promuovendo l’espressione dell’enzima antiossidante mitocondriale
SUPEROSSIDO DISMUTASI (SOD).
La SOD neutralizza l’anione superossido prodotto durante il metabolismo energetico mitocondriale trasformandolo in
perossido di idrogeno (H2O2) (a sua volta decomposto ad H2O dalla catalasi).
GSH DNA Eritrociti Linfociti
+ Ossidanti:
Perossido di idrogeno - Perossi radicali - Acido ipocloroso
±
Valutazione della protezione di CELLFOOD verso il danno ossidativo
DISEGNO SPERIMENTALE
Biomolecole
Target dell’ossidazione
Cellule
Concentrazioni testate
da 0.2 µl/ml (1 goccia in un bicchiere d’acqua) a a 10 µl/ml (50 gocce in un bicchiere d’acqua)
CELLFOOD (NuScience Corporation, CA, USA)
Posologia: 8 gocce in un bicchiere d’acqua 3 volte al giorno
(1.5 µl/ml = 1.5 ml/l)
OSSIDANTE: PEROSSIDO DI IDROGENO (H2O2)
Azione dannosa dovuta alla sua capacità di attraversare le membrane e di generare il
radicale idrossile (OH.) in presenza di metalli di transizione come ferro e rame.
Reazione di Fenton Fe2+ + H2O2 Fe3+ + HO• + HO-
Sequestro del ferro e del rame per limitarne la disponibilità attraverso:
Proteine di trasporto (transferrina, ceruloplasmina);
Proteine di accumulo (ferritina).
Capacità di indurre reazioni a catena e lipoperossidazione, causando cambiamenti
strutturali e perdita dell’integrità di membrana.
OSSIDANTE: PEROSSI RADICALI (ROO.)
Ruolo fondamentale nella neutralizzazione di patogeni (es. batteri) da parte dei neutrofili.
Ha effetti citotossici in quanto è in grado di penetrare le membrane cellulari e di reagire con una vasta
gamma di molecole bersaglio (lipidi, proteine e DNA) con preferenza per il GSH.
OSSIDANTE: ACIDO IPOCLOROSO (HOCl)
Preservazione delle difese antiossidanti endogene
RISULTATI (1): GLUTATIONE (GSH)
0
50
100
150
200
250
Conc
entra
zion
e (µ
M)
CTR OX 0,2 1 2 10
CELLFOOD (µl/ml)
Glutatione
I tre agenti ossidanti (OX) causano una forte ossidazione del GSH dando luogo ad una significativa riduzione della sua concentrazione nella miscela di reazione. Quando l'ossidazione avviene in presenza di CF si osserva un aumento della concentrazione del GSH in maniera dose-dipendente.
Ossidazione del glutatione da GSH (forma ridotta) a GSSG (forma ossidata) durante la neutralizzazione di radicali liberi.
Preservazione degli acidi nucleici e dell’informazione genetica
RISULTATI (2): DNA
Rottura della doppia elica del DNA in seguito ad ossidazione con perdita dell’integrità di struttura.
0
20
40
60
80
100
Inte
grità
(%)
CTR OX 1 2 4 8
CELLFOOD (µl/ml)
DNA
I tre agenti ossidanti (OX) causano una forte ossidazione del DNA dando luogo ad una significativa perdita della sua integrità di struttura. Al contrario, quando l'ossidazione avviene in presenza di CF si osserva un aumento dose-dipendente della percentuale di DNA integro.
DNA MITOCONDRIALE
Fortemente esposto ai ROS prodotti dalla perdita di elettroni
durante la fosforilazione ossidativa.
Più suscettibile al danno ossidativo rispetto al DNA
nucleare anche a causa della mancanza di istoni e di efficienti
sistemi di riparazione.
Il danno ossidativo al DNA mitocondriale è implicato nel
processo di senescenza fisiologica e in alcune patologie degenerative
(es. neurodegenerazione).
Ricco di acidi grassi polinsaturi (PUFA) facilmente ossidabili (acido arachidonico)
Ridotti livelli di difese antiossidanti (bassa attività enzimi antiossidanti)
Grande consumo di O2 (20% del totale) e produzione di radicali liberi (ROS)
Alto contenuto di ioni ferro (reazione di Fenton)
SISTEMA NERVOSO CENTRALE
IMPORTANZA DI CELLFOOD COME ANTIOSSIDANTE
NELLA PREVENZIONE DELLA
NEURODEGENERAZIONE
DANNO ENDOGENO
Causato dall'attacco di radicali reattivi dell'ossigeno derivanti da sottoprodotti
del normale metabolismo cellulare.
DANNO ESOGENO
Causato da agenti esterni quali radiazioni ultraviolette provenienti
dal sole (UVA e UVB).
Se la velocità del danneggiamento del DNA supera la capacità di riparazione della cellula, l'accumulo di
errori in geni critici può evolvere in senescenza, apoptosi o cancro.
DANNO OSSIDATIVO AL DNA
PROTEZIONE DI CELLFOOD VERSO IL DANNO AL DNA: IMPLICAZIONI
CELLFOOD
IMPORTANZA DI CELLFOOD COME ANTIOSSIDANTE NELLA PREVENZIONE TUMORALE
PROTEZIONE ANTIOSSIDANTE ruolo fondamentale nel contrastare i processi di ossidazione cellulare a livello cutaneo
Riduzione degli antiossidanti dopo esposizione a UV [sia enzimatici (SOD, GPx, CAT) che non enzimatici (GSH, a-tocoferolo, acido
ascorbico)]
Riduzione fisiologica degli antiossidanti con l'età [fino al 70% in meno di GSH, a-tocoferolo e acido ascorbico]
Riduzione della capacità di riparo dal danno ossidativo (soprattutto al DNA) da parte delle cellule cutanee → Fotoinvecchiamento, carcinogenesi.
ALTERAZIONE DEL METABOLISMO ENERGETICO CUTANEO
→ Indebolimento dell'attività mitocondriale con l'età.
→ Riduzione della sintesi di energia attraverso la fosforilazione ossidativa.
→ Glicolisi come principale fonte di ATP a livello cutaneo.
Science 2009;324:1029-33
Con l'invecchiamento la produzione di energia è prevalentemente anaerobica
Riduzione dello stress ossidativo intracellulare
RISULTATI (3): LINFOCITI
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
Fluo
resc
enza
CTR OX 1 2 4 8
CELLFOOD (µl/ml)
Radicali liberi
I tre agenti ossidanti (OX) causano un aumento di radicali liberi intracellulari. Al contrario, quando
l'ossidazione avviene in presenza di CF si osserva una riduzione dose-dipendente dei livelli di radicali
liberi.
Maggiore è la fluorescenza emessa dalla sonda maggiore è la presenza di ROS all’interno della cellula.
Piccole concentrazioni di ROS sono necessarie agli spermatozoi per acquisire la capacità fecondante (capacitazione), per la buona motilità, per la fusione
spermatozoo-ovocita (fertilizzazione).
Tuttavia un’eccessiva produzione di ROS influenza negativamente la qualità spermatica in termini di morfologia, motilità e maturazione degli spermatozoi.
Alti livelli di ROS sono stati riscontrati nel 25-40% dei campioni di liquido seminale di uomini infertili.
PROTEZIONE DELLO SPERMATOZOO DALLO STRESS OSSIDATIVO INTRACELLULARE
Fonti endogene: mitocondri
(grande produzione di ATP per la motilità) leucociti
(neutrofili e macrofagi in caso di infezione)
Fonti esogene:
fattori ambientali (inquinanti)
stile di vita (alcool, fumo)
Spermatozoi mancano di citoplasma ridotta capacità antiossidante intracellulare Difese antiossidanti nel plasma seminale: SOD, GPx, CAT, vitamine C e E, GSH
FONTI DI RADICALI LIBERI
Danno al DNA (nucleare e mitocondriale) ridotta capacità fertilizzante, sviluppo embrionale
ridotto e difetti alla nascita.
Perossidazione lipidica delle membrane (ricche di PUFA) perdita
della fluidità e della motilità, ridotta fusione spermatozoo-oocita.
DANNO OSSIDATIVO
RISULTATI (4): ERITROCITI Preservazione degli eritrociti dall’emolisi ossidativa
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Abs
540
nm
CTR OX 0,25 0,5 1 2 4
CELLFOOD (µl/ml)
Emolisi eritrocitaria
Emolisi eritrocitaria in seguito a danno ossidativo ai lipidi di membrana.
I tre agenti ossidanti (OX) causano una forte lisi cellulare (emolisi eritrocitaria) con perdita del contenuto intracellulare di emoglobina. Al contrario, quando l'ossidazione avviene in presenza di CF si osserva una riduzione dose-dipendente dell’emolisi.
PROTEZIONE DI CELLFOOD VERSO IL DANNO AGLI ERITROCITI: IMPLICAZIONI Grande rilevanza nel caso di ATTIVITÀ FISICA INTENSA E PROLUNGATA.
La supplementazione con CELLFOOD può essere un utile strumento nel contrastare l’ANEMIA DELL’ATLETA spiegando così alcuni degli effetti
positivi che si sono osservati in atleti professionisti.
Durante l’attività fisica aerobica i globuli rossi diventano target dello stress ossidativo
Ossidazione dei lipidi della membrana eritrocitaria ed aumento della permeabilità di membrana
con conseguente lisi cellulare e riduzione del numero di globuli rossi circolanti.
L' “anemia dell'atleta” è abbastanza frequente in chi pratica sport di fondo o chi si allena piuttosto intensamente, come podisti, ciclisti e in tutti gli sport di resistenza.
Aumento del trasporto di ossigeno ai tessuti e iperproduzione di radicali liberi derivanti sia dall’aumentato metabolismo eritrocitario (es. perossiradicali) sia dall’attivazione dei neutrofili (es. acido ipocloroso)
L’ossidazione può favorire l’insorgenza di uno stato anemico
Il muscolo scheletrico è uno dei principali organi bersaglio dello stress ossidativo.
Necessita di un ampio rifornimento di energia per assicurare una efficiente contrazione, di
conseguenza viene esposto a una elevata produzione di ROS durante la respirazione mitocondriale per la sintesi di ATP, soprattutto in presenza di una intensa ATTIVITÀ FISICA
AEROBICA che richiede un aumentato consumo di ossigeno.
Se i livelli di ROS eccedono le capacità antiossidanti muscolari, i fenomeni ossidativi che ne conseguono a carico dei lipidi e delle proteine possono causare danni alla
membrana cellulare con riduzione della funzionalità muscolare, declino nella performance e più lento recupero.
2 2 32
Durante il lavoro muscolare strenuo quando il metabolismo aerobico non è più in grado di soddisfare le aumentare richieste energetiche, viene attivata una via accessoria per la
produzione di ATP chiamata MECCANISMO ANAEROBICO LATTACIDO.
Tale fenomeno pur sopperendo in parte la CARENZA DI OSSIGENO (ipossia) aumenta la quota di acido lattico prodotta che a sua volta eccede le capacità di neutralizzazione da
parte dell'organismo. Il risultato di questo processo è un brusco incremento della quota di lattato presente nel sangue con la comparsa della cosiddetta FATICA MUSCOLARE.
Aumento dei livelli di cataboliti acidi nel microcircolo (MICROACIDOSI):
abbassamento locale del pH
rilascio di ferro e di rame allo stato libero dalla transferrina e dalla ceruloplasmina
catalizzazione delle reazioni di ossidazione (reazione di Fenton).
Ossidazione della membrana eritrocitaria
(emolisi → anemia)
Ossidazione delle lipoproteine circolanti (LDLox)
(processo aterosclerotico)
Una volta ossidate dai ROS, le LDL si legano al loro recettore presente sulla superficie dei macrofagi e vengono inglobate all’interno dei macrofagi
trasformandoli in cellule schiumose (o foam cells).
LDLox e ATEROSCLEROSI
La formazione di cellule schiumose porta alla produzione di citochine e fattori di crescita
che inducono proliferazione di cellule muscolari lisce e sintesi di
matrice extracellulare a livello dell’endotelio vasale.
AZIONE PROINFIAMMATORIA E
PROTROMBOTICA
IMPORTANZA DI CELLFOOD COME ANTIOSSIDANTE NELLA PREVENZIONE DEL RISCHIO CARDIOVASCOLARE
EVIDENZE SPERIMENTALI IN VIVO (1) I livelli sierici di metaboliti reattivi dell’ossigeno (ROM) sono elevati in
soggetti a rischio di stress ossidativo quali fumatori, atleti e sovrappeso.
L’assunzione di CELLFOOD per 30 giorni (8drpx3/day) riduce i valori di ROM in tutti e tre i gruppi di soggetti.
CELLFOOD HA PROPRIETÀ ANTIOSSIDANTI IN VIVO
EVIDENZE SPERIMENTALI IN VIVO (2)
45 maratoneti (età 20-51, 28 M e 17 F) Studio in doppio cieco con placebo presso l’Università di Pretoria (Sudafrica, 2001)
Supplementazione con Cellfood (25drp/day) per 4 settimane Test di valutazione pre- e post-trattamento
Nei maratoneti trattati con Cellfood si ha: miglioramento del quadro ematochimico (Hb, ferritina, RBC, saturazione Hb) miglioramento delle prestazioni cardio-respiratorie (frequenza cardiaca, VO2 max)
riduzione del lattato sierico (dal 10 al 25%)
CELLFOOD AUMENTA LA DISPONIBILITÀ DI OSSIGENO CON MIGLIORAMENTO DELLE PERFORMANCE FISICHE.
EVIDENZE SPERIMENTALI IN VIVO (3)
16 ciclisti professionisti [8 trattati con Cellfood (12drpx3/day) + 8 con placebo]
5 settimane di allenamento
8 allenamenti/settimana (4 aerobici, 3 misti, 1 anaerobico di velocità)
Valutazioni pre- e post-trattamento
Dopo 5 settimane di supplementazione con Cellfood:
aumento della potenza massima (p<0.01)
aumento della VO2 max (p<0.01)
riduzione del lattato sierico (p<0.01)
CELLFOOD ha un effetto benefico nel processo di adattamento durante il periodo di allenamento migliorando pertanto la performance ciclistica.
1) Assicura ampia disponibilità di ossigeno a cellule e tessuti potenziando così la respirazione mitocondriale per la produzione di energia (ATP) durante l’attività aerobica.
2) Ha una elevata azione antiossidante per ridurre/prevenire i fenomeni ossidativi associati al consumo di ossigeno e alla produzione di ATP.
3) Contrasta l’acidosi generata dall’ipossia riducendo i livelli di lattato e ritardando l’insorgenza della fatica.
4) Migliora le prestazioni cardio-respiratorie.
NUTRACEUTICO UTILE NEL PERIODO DI ALLENAMENTO, NEL GIORNO DELLA PERFORMANCE
E NELLA FASE DI RECUPERO.
BENEFICI DI CELLFOOD NELLO SPORT
La supplementazione con CELLFOOD può avere un ruolo protettivo in tutti quei disordini associati a disfunzioni mitocondriali, come
ad esempio nella FIBROMIALGIA.
EVIDENZE SPERIMENTALI IN VIVO (4)
PROTEZIONE ANTIOSSIDANTE (DNA
mitocondriale)
MIGLIORAMENTO ATTIVITA’ MITOCONDRIALE (produzione
di ATP) +
Sindrome caratterizzata da dolore cronico in cui lo stress ossidativo generato da
disfunzioni mitocondriali sembra avere un ruolo eziopatogenetico fondamentale.
Nello studio si è osservato che, rispetto al placebo, dopo 12 settimane di trattamento
con CELLFOOD (12drpx3/day) si attenuano in maniera significativa la
sintomatologia dolorosa, la debolezza muscolare, la stanchezza al risveglio e in generale i disturbi associati alla riduzione
del tono dell’umore.
CELLFOOD E FIBROMIALGIA
EVIDENZE SPERIMENTALI IN VIVO (5)
CELLFOOD (azione antiossidante)
+
SILICIO COLLOIDALE (minerale che favorisce l’accumulo di
calcio e stimola la calcificazione ossea)
=
CELLFOOD SILICA
Condizione che precede l’osteoporosi, è quella fase in cui ha inizio la riduzione della densità minerale ossea. Pazienti con osteoporosi possono andare
incontro a malattie a carico del sistema cardiovascolare, inclusa l’aterosclerosi. Meccanismo
comune nella patogenesi dell’osteoporosi e delle malattie cardiovascolari è lo stress ossidativo.
CELLFOOD E OSTEOPENIA
31 donne osteopeniche trattate con Cellfood Silica per 12 settimane.
Riduzione del riassorbimento minerale osseo mediata dal
biossido di silicio.
Riduzione significativa dei livelli sierici di LDL ossidate (LDLox), marcatori di danno ossidativo alle lipoproteine
circolanti e responsabili della formazione della placca ateromatosa.
Riduzione dei livelli urinari di piridinolina (PYD) e
deossipiridinolina (DPD), due marcatori specifici di
riassorbimento osseo.
Riduzione del rischio cardiovascolare grazie alle
proprietà antiossidanti di Cellfood.
MODULAZIONE FISIOLOGICA DELL’OSSIGENO NELLA CELLULA
TUMORALE
La riduzione della concentrazione di O2 nella cellula tumorale (IPOSSIA) promuove l’espressione del fattore ipossico HIF-1a
FATTORE IPOSSICO HIF-1 NELLA CUTE
Derma: pO2 10% (normossia)
Epidermide: pO2 5-1% (ipossia media)
A mano a mano che si riduce la concentrazione di O2 nell’epidermide aumenta l’espressione di HIF-1.
HIF-1
CHERATINOCITI MELANOCITI
Protezione dell’integrità del DNA e induzione di apoptosi
in seguito a UVB.
Stimolazione della trasformazione maligna in
condizioni di media ipossia.
OMEOSTASI DELL’EPIDERMIDE
TUMORE CUTANEO (MELANOMA)
L’IPOSSIA FAVORISCE LA TRASFORMAZIONE DEI MELANOCITI E LA CRESCITA TUMORALE
ALTERAZIONE DEL METABOLISMO DEL GLUCOSIO NELLA CELLULA TUMORALE (EFFETTO WARBURG)
Spostamento del metabolismo energetico dai mitocondri (fosforilazione ossidativa) al
citoplasma (glicolisi) con elevata produzione di lattato. Soppressione dell’apoptosi (dipendente dalla produzione di energia mitocondriale) e
resistenza alla morte cellulare.
Science 2009;324:1029-33
Ruolo fondamentale del fattore ipossico HIF-1a nel regolare l’espressione dei recettori per il glucosio e l’attività degli enzimi glicolitici.
L’importanza di modulare le vie di segnale intracellulari, l’apoptosi, il fattore ipossico HIF-1 e il metabolismo tumorale
nella prevenzione e nel trattamento del cancro.
La comprensione delle basi metaboliche del cancro ha la possibilità di fornire il fondamento per lo sviluppo di nuovi
approcci in grado di modulare il metabolismo tumorale.
COSA SUCCEDE IN PRESENZA DI CELLFOOD?
Nella cellula tumorale CELLFOOD è in grado di alterare il metabolismo energetico (dalla glicolisi alla fosforilazione ossidativa) rendendo la cellula
suscettibile all’apoptosi?
HIF-1 HIF-1
Nelle cellule sane CELLFOOD attiva il
metabolismo energetico
mitocondriale con aumento della
produzione di ATP.
Effetti antiproliferativi in cellule di carcinoma del colon.
Parte organica e inorganica di CELLFOOD dall’alga marina Lithothamnion calcareum
Effetti antiproliferativi
in modelli animali con
tumore epatico.
PARTNERS DELLA RICERCA
Area Medicina Molecolare, Istituto Nazionale Tumori Regina Elena, Roma
Dott.ssa Rossella Galati
Dott.ssa Barbara Nuvoli, Dott.ssa Carlotta Morosetti
Dip.to Scienze Biomolecolari, Sez. Biochimica Clinica e Biologia cellulare
Prof. Franco Canestrari
Dott.ssa Serena Benedetti, Dott.ssa Simona Catalani, Prof.ssa Serafina Battistelli
±
Jurkat: leucemia linfoide acuta U937: leucemia mieloide acuta
K562: leucemia mieloide cronica (tumori di origine ematologica)
SKRB3, MCF7: carcinoma mammella
M14, ME1007: melanoma IM1, IM2, NCI2452, MSTO211, MPP89: mesotelioma
HCT116: carcinoma colon H1650, H1975, H1299: carcinoma polmone
EJ: carcinoma vescica (tumori solidi)
Incubazione delle cellule tumorali in assenza (controllo) e in presenza di CELLFOOD.
PIANO SPERIMENTALE
LINEE CELLULARI TUMORALI
Concentrazione di CELLFOOD: 5 µl/ml (25 gocce in 200 ml)
Tempi di incubazione: 24, 48, 72 ore.
PROLIFERAZIONE CELLULARE (conta al microscopio, vitalità cellulare) APOPTOSI (caspasi-3, frammentazione del DNA, ciclo cellulare, proteine apoptotiche) HIF-1a (fattore ipossico 1 alfa) METABOLISMO CELLULARE (GLUT-1, LDH, lattato)
VALUTAZIONI BIOCHIMICHE
RISULTATI: PROLIFERAZIONE CELLULARE LINEE
LEUCEMICHE
Riduzione della crescita cellulare in presenza di CELLFOOD
(conta al microscopio con trypan blue)
*p<0.05
Riduzione della vitalità cellulare in presenza di CELLFOOD
(attività deidrogenasi mitocondriali)
*p<0.05
RISULTATI: VITALITÀ CELLULARE LINEE
LEUCEMICHE
COSA AVVIENE IN CELLULE NON TUMORALI?
CELLFOOD non riduce la crescita di linfociti sani
Azione specifica verso la cellula tumorale
Estrazione di linfociti da sangue intero
RISULTATI: APOPTOSI CTR NON TRATTATO CELLFOOD ETOPOSIDE
0
20
40
60
80
100
CTR
CELLF
OODCTR
CELLF
OODCTR
CELLF
OOD
Jurkat U937 K562
Ce
ll n
um
be
r (%
)
K562 intact
Jurkat intact
U937 intact
Apoptotic
Colorazione May-Grunwald Giemsa, identificazione al microscopio ottico di cellule apoptotiche in base alle caratteristiche morfologiche.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
Jurkat U937 K562
Casp
ase-
3 re
lativ
e ac
tivity
24 h48 h72 h*
* *
*
*
* *
*
Control
RISULTATI: APOPTOSI LINEE
LEUCEMICHE
CELLFOOD attiva in maniera significativa la proteina pro-apoptotica caspasi-3 rispetto alle
cellule di controllo (non trattate).
*p<0.05
U937 K562 JURKAT
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
RISULTATI: APOPTOSI LINEE
LEUCEMICHE
CELLFOOD promuove la frammentazione del DNA nucleare (laddering).
LEGENDA:
1: DNA standard
2: CTR negativo (cellule non trattate)
3: CF 5 µl/ml
4: CTR positivo (etoposide)
Nelle tre linee leucemiche CELLFOOD induce morte cellulare per apoptosi.
Apoptosi e fattore ipossico HIF-1a
Attivazione di HIF-1a nella cellula tumorale
Induzione di un fenotipo glicolitico (effetto Warburg)
Resistenza della cellula tumorale all’apoptosi (processo dipendente dalla produzione mitocondriale di ATP)
LINEE
LEUCEMICHE
RISULTATI: HIF-1a
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
CTR JURKAT U937 K562
HIF-
1 al
pha
rela
tive
conc
entra
tion
* *
*
*p<0.05
CELLFOOD riduce in maniera significativa la concentrazione di HIF-1a rispetto alle cellule non trattate (CTR).
SUSCETTIBILITA’ ALL’APOPTOSI LEGATA ALLA RIDUZIONE DI HIF-1a
RISULTATI: metabolismo cellulare
LINEE
LEUCEMICHE
HIF-1 promuove l’espressione dei recettori per il glucosio (GLUT).
CELLFOOD riduce l’espressione del recettore GLUT-1 attraverso la deregolazione di HIF-1a.
CELLFOOD riduce l’attività dell’enzima glicolitico lattato deidrogenasi
attraverso la deregolazione di HIF-1a.
RISULTATI: metabolismo cellulare
LDH
LINEE
LEUCEMICHE
-28%-15%-13%
0
20
40
60
80
100
120
CTR Jurkat U937 K562
LDH
activ
ity (%
of c
ontro
l)
* **
HIF-1 promuove l’aumento dell’attività dell’enzima LDH
per la conversione del piruvato in lattato.
RISULTATI: metabolismo cellulare
LINEE
LEUCEMICHE
-37%
-18%-11%
0
20
40
60
80
100
120
CTR Jurkat U937 K562
Lact
ate
rele
ase
(%of
con
trol)
**
In presenza di CELLFOOD si ha una riduzione della produzione
intracellulare di lattato.
Nella cellula tumorale si ha una elevata produzione di lattato ad opera della LDH.
CONCLUSIONI LINEE LEUCEMICHE CF è in grado di inibire la crescita di cellule leucemiche in coltura attraverso l’induzione di apoptosi e l’alterazione del metabolismo
cellulare.
RISULTATI: proliferazione cellulare
Linee cellulari con crescita in adesione (tumori solidi): MSTO, NCI, Ist-Mes1, MPP89, Ist-Mes2: mesotelioma
M14: melanoma H1650, H1975: carcinoma polmone
SKRB3: carcinoma mammella HCT116: carcinoma colon
Dopo 24 e 48 ore di incubazione con CELLFOOD (5 µl/ml) si riduce la crescita cellulare in tutte linee tumorali; le linee più
sensibili risultano MSTO e HCT-116.
LINEE IN
ADESIONE
CF 1:200
0
60
120
MSTO NCI Ist-Mes1 MPP89 Ist-Mes2 M14 H1650 H1975 SKBR3 HCT-116
% in
hibi
tion
of p
rolif
erat
ion
vs
CNTR
L (%
)
24 48
ISTITUTO NAZIONALE TUMORI REGINA ELENA
RISULTATI: formazione colonie La capacità delle cellule tumorali di formare colonie in presenza di
CELLFOOD è stata valutata su 4 linee di mesotelioma (Ist-Mes1, Ist-Mes2, MSTO e NCI) e una linea di carcinoma del colon (HCT-116).
Nessuna linea trattata con CF produce colonie rispetto al controllo (CNTR).
LINEE IN
ADESIONE
L’analisi al citofluorimetro del ciclo cellulare nella linea di mesotelioma MSTO evidenzia un aumento della fase sub-G1 (cellule apoptotiche) sia a
24 che a 48h di incubazione con CELLFOOD mentre la fase G1 diminuisce.
RISULTATI: ciclo cellulare LINEE IN
ADESIONE
Controllo Cellfood 24h Cellfood 48h
Nella linea MSTO l’analisi dell’espressione delle proteine coinvolte nel processo apoptotico conferma la morte cellulare per apoptosi.
Dopo 24 e 48h di trattamento con CELLFOOD si evidenziano l’attivazione della Caspasi-3, il cleavage di PARP e l’aumento di p21 e p27 rispetto al Controllo (C).
RISULTATI: apoptosi LINEE IN
ADESIONE
Western Blot di proteine coinvolte nella regolazione dell’apoptosi e del ciclo cellulare.
Caspasi 3: enzima proteolitico attivato nelle fasi iniziali dell’apoptosi responsabile del taglio della proteina PARP.
PARP (Poli ADP-ribosio polimerasi): enzima nucleare coinvolto nella riparazione del DNA.
p21 e p27: proteine nucleari che promuovono l’arresto del ciclo cellulare in fase G1.
I risultati fino ad oggi ottenuti in vitro sulle linee tumorali in coltura suggeriscono che CELLFOOD, grazie alle sue
proprietà pro-apoptotiche, può essere un nutraceutico di grande utilità clinica sia come supporto al trattamento
antineoplastico che come chemopreventivo.
CONCLUSIONI
Essendo CELLFOOD un supplemento nutrizionale contenente diversi principi attivi (solfato di deuterio, minerali, aminoacidi ed
enzimi), gli effetti pro-apoptotici sembrano dipendere maggiormente dall’intera formula piuttosto che da uno o più
componenti specifici.
Modulando HIF-1 e il metabolismo del glucosio aumenta l’efficacia della radioterapia in quanto il tumore si sensibilizza
all’irradiazione.
IMPORTANZA DI CELLFOOD COME COADIUVANTE ALLA RADIOTERAPIA
RIASSUMENDO
CELLFOOD è indicato in tutte le situazioni fisiopatologiche legate
allo stress ossidativo, dall’invecchiamento cellulare al rischio cardiovascolare e alla
neurodegenerazione.
CELLFOOD è particolarmente utile in caso di attività fisica intensa e
prolungata in cui si ha un incremento del consumo di
ossigeno e una iperproduzione di radicali liberi.
CELLFOOD riduce la crescita di cellule tumorali in coltura inducendo apoptosi, ne deriva un uso potenziale come supporto al trattamento
antineoplastico e/o come chemopreventivo.
FUTURO DELLA RICERCA
Applicazioni in campo clinico oncologico.
AZIONE ANTIOSSIDANTE
ATTIVITA’ ANTIPROLIFERATIVA