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Microb. Resour. Syst. June 2015 Vol. 31, No. 1

はじめにAspergillus 属は「麹」として我が国の伝統的発酵

食品である醤油・味噌・清酒などの醸造に用いられており，発酵工業においても有機酸，酵素の製造に用いられ，我々の生活にとって重要な菌である．その一方で，食品の劣化や変質を引き起こし一部の菌ではカビ毒も生産するため，食品危害菌としての一面も有する．また，ヒトの真菌症原因菌としての報告もあり，Aspergillus 属は我々の生活に非常に身近でかつとて

も重要な菌とされている．Aspergillus 属は多くの種が報告されているが，本稿では病原真菌として非常に重要な Aspergillus fumigatus を含む section Fumigatiの系統分類と最近の分類の動向について述べる．

Aseprgillus section Fumigati について現在，Aspergillus 属は 200 種以上報告されており，

分子系統分類および形態学的特徴から 20 の sectionに分けられている（Samson et al., 2014）．その中でもA. fumigatus は世界中に広く分布し，土壌・空気・生活環境などから普遍的に分離される菌の一つであるE-mail: tetsu-m@sun.ac.jp

Aspergillus section Fumigati の系統分類と最近の動向

松澤哲宏

長崎県立大学シーボルト校　〒851-2195　長崎県西彼杵郡長与町まなび野 1-1-1

Aspergillus section Fumigati─ Systematic biology and its recent development ─

Tetsuhiro MatsuzawaUniversity of Nagasaki, Siebold, 1-1-1 Manabino, Nagayo-cho, Nishi-Sonogi-gun, Nagasaki 851-2195, Japan

Aspergillus fumigatus is distributed worldwide in soil, air, foods, feeds, compost, and human habitats. Aspergillus fumigatus and its related species, including the genus Neosartorya, which is a teleomorph of Aspergillus, are the most important causative agents of aspergillosis. These species belong to Aspergillus section Fumigati. Conidiogenesis and conidial ornamentation are important morphological characters for distinguishing Aspergillus species. The teleomorph of Aspergillus has various ascospore ornamentations, and these are characteristic of species discrimination.

Rules for the systematic biology of Aspergillus were suggested in 2007, and since then the partial b-tubulin, calmodulin, actin, and RNA polymerase genes and the internal transcribed spacer (ITS) region have been used for the taxonomy of Aspergillus. The b-tubulin and calmodulin genes, in particular, have been well analyzed in Aspergillus and its related genera.

The correlations among molecular phylogenetics and phenotypic characters have been investigated well in Aspergillus. Molecular phylogenetics has become a useful tool for distinguishing species of Aspergillus and its related genera, and many new species have been discovered and described since 2007.

In section Fumigati, several species (especially A. udagawae and A. viridinutans) show within-species diversity of DNA sequences. Recently, several researchers have reevaluated A. viridinutans by using a mating test. As a result, A.viridinutans has been separated into seven species on the basis of conidial or ascospore morphology. Application of systematic biology has promoted variation in the modern taxonomy of Aspergillus.

Key words: Aspergillus, section Fumigati, mating study, pathogenic fungi, re-evaluation of A. viridinutans spe-cies complex, systematic biology

Microb. Resour. Syst. 31（1）：63 ─ 68, 2015

微生物系統分類学の潮流日本微生物系統分類研究会合流特集

松澤哲宏Aspergillus の系統分類

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（Matsuzawa et al., 2015）．また，A. fumigatus はアスペルギルス症原因菌の中で最も重要な種であり，侵襲性アスペルギルス症の約 90％が A. fumigatus が原因であるとの報告がある（Abad et al., 2010; Xess et al., 2004）．さらに Yaguchi et al.（2007）は千葉大学真菌医学研究センターに保存されている A. fumigatusの再評価を行ったところ，約 5％の株が近縁種であるA. lentulus，A. udagawae および A. viridinutans であり，真菌症原因菌として section Fumigati に属する種が重要であることを明らかにした．さらに，関連テレオモルフ（完全世代）である Neosartorya 属もアナモルフ（不完全世代）は形態学的に section Fumigatiに属し，病原性の報告もあるため，section Fumigatiはアナモルフおよびテレオモルフともに重要な菌となっている．この様に section Fumigati に属する種はアスペルギルス症原因菌の大半を占め，今日においてもその分類学的研究が盛んに行われており，アナモルフでは分生子や分生子形成構造，テレオモルフでは子のう胞子の表面構造が種識別の指標となっている．また，子のう胞子は分生子より多様な形態を示す（図 1）．

Aspergillus 属の系統分類の変遷分子生物学的手法を用いて真菌の系統分類や同定を

行う場合，一般的に 28S リボソーム DNA や internal transcribed spacers（ITS）領域が用いられている

（White et al., 1990）．これらの領域の増幅にはユニバーサルプライマーが用いられており，真菌の種類に左右されず安定的な結果が得られるため，非常に有用な遺伝子領域として現在でも用いられている．しかし，Aspergillus 属においては，種間の遺伝子の塩基配列の相同性が非常に高いため，系統樹の各分岐のBootstrap 値が低くなり，系統分類に用いるには適していない（Geiser et al., 2007）．そのため，塩基配列により差異のある b-tubulin や hydrophobin 遺伝子などの機能遺伝子が系統分類に用いられるようになった

（Geiser et al . , 1998; Glass & Donaldson, 1995; Yaguchi et al., 2007）．さらに Samson et al.（2007）によって Aspergillus の新種記載を行う場合，ITS 領域，b -tubulin，calmodulin，actin および RNA polymerase 遺伝子を用いて系統分類を行う多遺伝子解析が提唱され，現在は上記の 5 遺伝子のうち 3 つの遺伝子を用いて系統解析を行うことが主流となっている．特に b-tubulin，calmodulin 遺伝子はどの sectionの Aspergillus でも解析が行われ，DDBJ などの配列データベースにデータが豊富に蓄積されており，

section Fumigati および Neosartorya においても詳細な系統関係が明らかになっている（図 2）．actin 遺伝子は section Fumigati の系統分類を行う場合は有用であるが，他の section の Aspergillus においてはプライマーが適していないため用いられていない．最近はRNA polymerase 遺伝子の解析が盛んに行われており，データベースへの登録数も増加している．また，ITS 領域は単独で用いるには Aspergillus 属の系統分類に適していないため，新種記載の際に用いられていない，もしくは他の遺伝子とともに補助的に使用されている（Hubka et al., 2013; Matsuzawa et al., 2014, 2015; Varga et al., 2011）．

Aspergillus 属の系統分類の限界と新手法Aspergillus 属の系統分類手法が確立された 2007 年

以降，従来の形態学的知見に基づく分類から，遺伝子

図 1　 Aspergillus section Fumigatiおよび Neosar-torya属の形態学的特徴．a, b： A. arcoverdensis, c： N. fumigata, d： N. fischeri, e： N. hiratsukae, f： N. glabra．a：分生子形成構造，b：分生子

（SEM），c-f：子のう胞子

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Microb. Resour. Syst. June 2015 Vol. 31, No. 1

の塩基配列を用いた系統分類が主流になり，形態学的な差異がほとんど認められなくても塩基配列の違いに基づいて新種を記載する報告もなされるようになった

（Hong et al., 2005）． そ の 一 方 で， こ れ ま で のAspergillus 属の系統分類研究は主に基準株（type strain）同士の比較で行われており，種内での塩基配列の多様性に関する検討が行われていなかったため，系統学的には異なっているが形態学的には差異が認められず同定が困難な株が増加し問題となっている．例えば section Fumigati においては A. fumigatus はb-tubulin，calmodulin，actin 遺伝子で株間にほとんど塩基配列の差は認められないのに対して，A. udagawae や A. viridinutans においては種内で塩基配列に差があり，系統学的に多様であるとされていた（図3A）（Hong et al., 2005; Sugui et al., 2010; Varga et al., 2000; Yaguchi et al., 2007）．

この問題の解決の糸口となったのが，Horn et al.（2009a, 2009b）による A. flavus，A. parasiticusおよび O’Gorman et al.（2009）による A. fumigatusのテレオモルフの発見である．これらの種はこれまでアナモルフのみが確認されており，MAT1-1 および

MAT1-2 の異なる交配遺伝子型を持つ株同士を人工的に交配させることで初めてテレオモルフが確認され，ヘテロタリック種であることが明らかとなった．この発見により，これまでアナモルフのみ報告されているAspergillus 属の種は全てヘテロタリック種である可能性が示唆された．この交配によるテレオモルフの形成を分類学に応用し，A. viridinutans の再評価が行われ，これまで系統学的に多様であるとされていたA. viridinutans が 7 つの種に分かれることが明らかとなった（Barrs et al., 2013; Matsuzawa et al., 2015; Nováková et al., 2014; Sugui et al., 2014）．すなわち，まず Barrs et al.（2013）は，A. viridinutans の Clade II（図 3A）の株が交配試験によりテレオモルフを形成し，これらの株は A. viridinutans とは交配しなかったことから A. felis を報告した．その後，Nováková et al.（2014）によって A. viridinutans の Clade III（図3A）の株のテレオモルフが確認され，A. felis の子のう胞子と形態を比較することによって別種であることが明らかにされ，A. wyomingensis と命名された（図3B）．また，Matsuzawa et al.（2015）は Clade I（図3A）の株において交配試験を行ったがテレオモルフ

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0.02

A. clavatus CBS 514.65 (AB489851) N. pseudofischeri CBS 208.92T (AY870743)

A. duricaulis CBS 481.65T (AF057313)A. brevipes CBS 118.53T (AF057311)

N. quadricincta CBS 135.52T (AF057326)N. tsurutae IFM 56811T (AB488760)

A. unilateralis CBS 126.56T (AB248301)A. felis CMF ISB 2162 (HF933350)

N. aureola CBS 105.55T (AF057319)N. udagawae IFM 46972T (AB248302)

A. siamensis KUFC 6349T (AB646989)A. wyomingensis CMF ISB 2494T (HF933359)

A. arcoverdensis IFM 61334T (AB818845)A. viridinutans CBS 127.56T (AF134779)

A. fumigatiaffinis IBT 12703T (DQ094885)A. novofumigatus IBT 16806T (DQ094886)

A. fumisynnematus IFM 42277T (AB248076)A. lentulus FH5T (AY738513)

N. fischeri CBS 544.65T (AF057322)A. fumigatus CBS 545.65 (AY685151)

N. coreana KACC 41659T (AY870758) N. takakii IFM 53599T (AB787221) N. paulistensis IFM 46585T (AB488758)

N. spinosa CBS 483.65T (AF057329)N. denticulata CBS 652.73T (DQ114125)

N. sublevispora IFM 53598T (AB488759)A. huiyaniae IFM 57847T (AB787219)

N. fennelliae CBS 598.74T (DQ114127)N. hiratsukae IFM 47035T (AF057324)

N. australensis CBS 112.55T (AY870739)N. glabra CBS 111.55T (AY870734)

N. aurata CBS 466.65T (AF057318)N. stramenia CBS 498 65T (AY870766)

N. assulata KACC 41691T (DQ114123)A. turcosus KACC 42091T (DQ534143)

N. nishimurae CBS 116047 (DQ534075)A. waksmanii NRRL 179T (EF669794)

A. marvanovae CCM 8003T (HE974387)N. tatenoi IFM 42278T (DQ114130)

A. caatingaensis IFM 61335T (AB743854)A. pernambucoensis IFM 61342T (AB743856)

A. unilateralis CBS 126.56T (AB248301)N. warcupii NRRL 35723T (EU220283)

N. papuensis CBS 841.96T (AY870738)N. multiplicata IFM 46955T (DQ114129)

N. tsunodae IFM 57609T (AB488755)N. shendaweii IFM 57611T (AB488754)

N. galapagensis CBS 117522T DQ534145)

図 2　Aspergillus section Fumigatiおよび Neosartorya属の系統関係系統樹は b-tubulin 遺伝子を用いて NJ 法で作成し，bootstrap 値は 50 以上を示した．

松澤哲宏Aspergillus の系統分類

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は形成されなかった．しかし，分生子の形態の再評価を行ったところ，A. viridinutans，A. wyomingensisおよびA. felisの分生子の表面が粗面であるのに対し，Clade I の株は分生子の表面が滑面であり，アナモルフの形態が明瞭に異なることから A. arcoverdensis と命名した（図 3B）．さらに，Sugui et al.（2014）は，Barrs et al.（2013）によって A. felis とされた Clade II の再検討を行い，テレオモルフもしくはアナモルフの 形 態 の 違 い か ら， 新 た に A. pseudofelis，A. parafelis，A. pseudoviridinutans の 3 種を提唱した（図3B）．これらの結果から，真菌症原因菌として重要なA. viridinutans 関連菌は，狭義の A. viridinutans が基準株のみであり，分離源もウサギの糞であることから病原真菌ではないことが明らかとなった．同様にA. wyomingensis も臨床からの分離例はなく，病原真

菌として重要な種は A. felis およびその関連菌であることも明らかとなった．

交配試験による種の定義と今後の課題交配試験によってテレオモルフを確認し，子のう胞

子の形態を比較する手法は，アナモルフの形態および分子系統の比較のみでは同定が困難であった未同定株の整理に大きく貢献し，その結果，多くの新種が報告された．交配試験を用いて系統学的な種の範囲の定義を行うことは有効な方法だと考えられるが，実は大きな課題も残されている．Sugui et al.（2014）によって報告された A. parafelis は交配能がとても強く，系統的にも形態学的にも大きく異なっている A. fumigatusとも交配し，子のう胞子を形成することが確認されている．また，他の section の Apergillus 属であり，カ

A. fumigatus IAM 13869TCCF 4417CCF 4416

CCF 4412

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CMF ISB 1977NRRL 6106

NIHAV1CM 5623CM 3147

CBS 130250CM 4518CM 6087

CBS 130245

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IFM 61338IFM 61337IFM 61334

A. viridinutans CBS 127.56T

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Clade I

Clade II

Clade III

A. viridinutans

A. fumigatus IAM 13869T (AB248059e)CCF 4417T (HF933359c)CCF 4416 (HF933358c)

CCF 4412 (HF933352c)

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CMF ISB 1977 (HE578077c)NRRL 6106 (KJ914689d)

NIHAV1T (KJ914690d)CM 5623 (KJ914693d)CM 3147T (KJ914692d)

CBS 130250 (JX021712a)CM 4518 (KJ914696d)CM 6087T (KJ914697d)

CBS 130245T (JX021700a)

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CBS 130246 (JX021704a)

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CBS 130247 (JX021706a)

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CBS 130249 (JX021711a)

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IFM 61338 (AB818847b)IFM 61337 (AB818846b)IFM 61334T (AB818845b)

A. viridinutans CBS 127.56T (AB248298e)

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0.01A. viridinutans

A. pseudofelis

A. arcoverdensis

A. felis

A. parafelis

A. wyomingensis

A. pseudoviridinutans

A. viridinutansspecies complex

A

B

図 3　A. viridinutans species complexの変遷系統樹は b-tubulin 遺伝子を用いて NJ 法で作成し，bootstrap 値は 50 以上を示した．A：2013 年までの分類体系，B：2013年以降の分類体系（a: Barrs et al. (2013), b: Matsuzawa et al. (2015), c: Nováková et al. (2014), d: Sugui et al. (2014), e: Yaguchi et al. (2007)）

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Microb. Resour. Syst. June 2015 Vol. 31, No. 1

ビ毒（マイコトキシン）産生菌として非常に重要な種である A. flavus と A. parasiticus においても種間で交配が成立し，子のう胞子が形成され，F1 世代ではカビ毒産生能が高まることが報告されている（Olarte et al., 2015）．この様に交配能の強い株は別種とも交配が成立してしまうため，交配試験を用いて未同定株の検証を行う際は，子のう胞子の形成を確認するだけでは同種か別種かの区別がつかない場合があり注意が必要である．この問題を解決するには，走査電子顕微鏡（SEM）を用いて子のう胞子の表面構造を詳細に検討し既知種と比較を行うことや，子のう胞子の加熱処理を行って発芽誘導を行い，F1 世代に発芽能力があるかを確認するなどの追加試験を行うことが挙げられる．いずれにせよ交配試験を用いた手法は近年導入された新手法であるため，分類学に応用するにはデータの蓄積が必要不可欠であることが最新の研究で判明した．

おわりに2007 年に Aspergillus 属の系統分類手法が確立され

て以降，遺伝子の塩基配列を用いた分子系統解析は種の分類・同定に非常に有用なツールとなった．その一方で，形態学的特徴に基づいた伝統的な分類学は，技術の習得に長い時間を必要とし，熟練を要することから習熟した研究者が減少し続けている．今後，技術の進歩に伴って分類学にも画期的な手法が導入される可能性はあるが，現在の分類学は最終的には形態学的特徴に回帰せざるを得ず，加えて系統分類や交配試験を用いた総合的な種の識別を行う必要がある．そのため，伝統的な分類学を継承しつつ新しい手法を身に着けた研究者が今後増えることを切に願っている．私もその一員として微生物資源の有効利用や発展に貢献できればと考えている．

文　献Abad, A., Fernández-Molina, J.V. , Bikandi, J. ,

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松澤哲宏Aspergillus の系統分類

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