UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

FACULDADE DE MEDICINA DA BAHIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

ASPECTOS CLÍNICOS, BACTERIOLÓGICOS E

IMUNOLÓGICOS DA ASSOCIAÇÃO DA INFECÇÃO PELO

HTLV-1 COM A TUBERCULOSE PULMONAR

Maria de Lourdes Santana Bastos

Tese de Doutorado

Salvador (Bahia), 2012.

ii

Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Universitária de Saúde, SIBI - UFBA.

B327 Bastos, Maria de Lourdes Santana

Aspectos clínicos, bacteriológicos e imunológicos da

associação da infecção pelo HTLV-1 com a tuberculose

pulmonar / Maria de Lourdes Santana Bastos. – Salvador, 2012.

126 f.

Orientador: Prof. Dr. Edgar Marcelino de Carvalho Filho

Tese (Doutorado) – Universidade Federal da Bahia.

Instituto de Ciências da Saúde, 2012.

1. Tuberculose. 2. Imunologia. 3. Bacteriologia. I. Carvalho

Filho, Edgar Marcelino de. II. Universidade Federal da Bahia.

III. Título.

CDU: 616-002.5

iii

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

FACULDADE DE MEDICINA DA BAHIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

ASPECTOS CLÍNICOS, BACTERIOLÓGICOS E

IMUNOLÓGICOS DA ASSOCIAÇÃO DA INFECÇÃO PELO

HTLV-1 COM A TUBERCULOSE PULMONAR

Maria de Lourdes Santana Bastos

Professor-Orientador: Edgar Marcelino de Carvalho Filho

Salvador (Bahia), 2012

Tese apresentada ao Colegiado do PROGRAMA DE

PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE, da

Faculdade de Medicina da Universidade Federal da

Bahia, como pré-requisito obrigatório para a obtenção

do grau de Doutor em Ciências da Saúde.

iv

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

FACULDADE DE MEDICINA DA BAHIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

TESE DE DOUTORADO

ASPECTOS CLÍNICOS, BACTERIOLÓGICOS E

IMUNOLÓGICOS DA ASSOCIAÇÃO DA INFECÇÃO PELO

HTLV-1 COM A TUBERCULOSE PULMONAR

COMISSÃO EXAMINADORA

MEMBROS TITULARES

Dr. Alvaro Augusto Souza da Cruz Filho, Doutor em Medicina e Saúde – UFBA,

Professor de Imunologia Clínica do Departamento de Medicina Interna e Apoio

Diagnóstico – UFBA, Professor do PPgCS/FMB/UFBA.

Dr. Bernardo Galvão Castro, Doutor em Patologia Humana, Coordenador do

Programa de Pós-graduação em Medicina da Fundação para o Desenvolvimento das

Ciências, Pesquisador Titular da Fiocruz.

v

Dra. Ceuci de Lima Xavier Nunes, Doutora em Medicina Interna, Professora de

Infectologia da Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública.

Dr. José Roberto Lapa e Silva, Doutor em Imunopatologia Pulmonar, Professor

Titular de Clínica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Dr. Paulo Roberto Machado, Doutor em Medicina, Professor de Dermatologia da

Escola Bahiana de medicina e Saúde Pública, Professor do PPgCS/FMB/UFBA.

vi

v

“Tenha coragem de seguir o seu coração e sua intuição. Eles, de alguma

forma, já sabem o que você realmente quer se tornar”.

Steve Jobs

vii

Aos meus pais, Benedicto (in memoriam) e Maria do Carmo. Ao meu amor e grande companheiro, Edgar.

Aos meus filhos, Rodrigo e Marcela, Victor e Kelly.

A minha Dinda e segunda mãe, Francisca Amado.

Com eterna afeição

viii

AGRADECIMENTOS

___________________________________________________________

- A minha mãe, ao meu companheiro e aos meus filhos que me deram estrutura familiar para

chegar a este momento, por acreditarem e confiarem na minha pessoa.

- Ao Prof. Orientador Dr. Edgar Marcelino de Carvalho Filho, pelos ensinamentos, estímulo,

apoio e auxílio fundamental na concretização deste trabalho.

-Ao Prof. César Augusto de Araújo Neto, grande amigo e colega, pela ajuda e cooperação na parte

radiológica.

-Aos Drs. recém-formados, Iana Bispo, Ohana Bispo, Ingrid Cardoso, Flávia Bastos e Tasso

Barreto, que participaram na aplicação dos questionários e acompanhamento aos pacientes.

- A enfermeira Sra. Nereide Pimentel pela coleta sanguínea.

- A diretora do Hospital Especializado Octávio Mangabeira (HEOM), Sra. Maria Inez Farias, por

permitir a realização deste estudo.

- Ao Núcleo de Pesquisa (NUPEP) do HEOM, em nome do Prof. Dr. Antonio Carlos Moreira

Lemos, pelas sugestões em assuntos relacionados à tuberculose.

-Ao Corpo Docente do curso da Pós Graduação em Ciências da Saúde por sua luta em implantar e

consolidar esta pós-graduação.

- Aos colegas da Pós Graduação pela amizade, estímulo e companheirismo.

- A Srta. Eleonice Santos Silva, secretária do NUPEP do HEOM, pela inestimável ajuda logística

em informática médica.

- Ao Sr. Cristiano Franco, secretário do Serviço de Imunologia do Hospital Universitário Prof.

Edgar Santos -HUPES- (SIM) pela grande colaboração também em informática médica.

ix

- A chefe do Serviço de Arquivo Médico do HEOM, Sra. Jane Aparecida Laranjeiras Borges por

ter sido sempre prestativa e colaborando com estes estudo.

- A todas as instituições participantes, por possibilitarem a realização deste estudo.

- Aos meus amigos, por suas palavras constantes de apoio e estímulo.

- A todas as pessoas não citadas nominalmente, mas que, de forma gentil, concordaram em

participar deste estudo.

- A Deus, um parceiro inseparável na jornada da vida.

x

INSTITUIÇÕES PARTICIPANTES

___________________________________________________________

Universidade Federal da Bahia

- Serviço de Imunologia (SIM)

Hospital Especializado Octávio Mangabeira

Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública

xi

FONTES DE FINANCIAMENTO

___________________________________________________________

Conselho Nacional de Pesquisa (CNPQ)

Instituto Nacional de Ciências e Tecnologia em Doenças Tropicais

(INCTDT)

1

ÍNDICE

Índice de Tabelas 4

Índice de Gráficos 5

Lista de Siglas e Abreviaturas 6

I.RESUMO 8

II.INTRODUÇÃO 10

III.REVISÃO DA LITERATURA 12

III.1.Histórico e epidemiologia da tuberculose 12

III. 2.Imunopatogênese, aspectos clínicos e radiológicos da tuberculose 16

III.3.Epidemiologia da infecção pelo HTLV-1 23

III.4.Imunopatogênese e manifestações clínicas associadas ao HTLV-1 24

III.5. Influência da infecção pelo HTLV-1 na resposta imune e manifestações clínicas da

tuberculose 30

IV.OBJETIVOS 34

V.CASUÍSTICA , MATERIAL E MÉTODOS 35

V.1.Desenho do estudo e métodos 35

V.1.1.Seleção de pacientes e definição de casos 35

V.1.2.Desenho do estudo 36

V.1.3.Testes laboratoriais 37

V.1.4.Baciloscopia 37

V.1.5. Cultura para Micobacterium tuberculosis 37

V.1.6.Teste de reatividade cutânea ao derivado proteico purificado M.tuberculosis (PPD) 37

2

V.1.7.Separação e cultura de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) 38

V.1.8.Dosagem de citocinas por ELISA 38

V.1.9.Determinação de IL-12 por PCR 38

V.1.10.Determinação da capacidade da neutralização da IL-10 e da adição de IL-12 em restaurar a

resposta imune contra o PPD em pacientes com tuberculose coinfectados pelo HTLV-1 39

V.2.ANÁLISE ESTATÍSTICA 39

V.3.ASPECTOS ÉTICOS 39

V.4.REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 40

VI.RESULTADOS 41

VII.DISCUSSÃO 48

VIII.PROPOSTA DO ESTUDO 56

IX.CONCLUSÕES 68

X.SUMMARY 69

XI.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 75

XII.ANEXOS

1.Questionário para coleta de dados 91

2.Termo de consentimento livre e esclarecido 95

3.Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa 97

XIII.ARTIGO PUBLICADO 105

De Lourdes Bastos M, Osterbauer B, Mesquita DL, Carrera CA, Albuquerque MJ, Silva L,

Pereira DN, Riley L, Carvalho EM. Prevalence of human T-cell lymphotropic virus type 1

infection in hospitalized patients with tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis 2009;13(12):1519-23.

XIV.ARTIGO SUBMETIDO 110

3

Bastos ML, Santos S, Souza A, Finkmoore B, Bispo O, Barreto T, Cardoso I, Bispo I, Bastos F,

Pereira D, Riley L, Carvalho EM. Influence of HTLV-1 on the clinical, microbiologic and

immunologic presentation of tuberculosis. BMC Infect Dis.

4

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Características demográficas dos casos (pacientes com TB e infecção pelo 41 HTLV-1) e controles (pacientes com TB sem infecção pelo HTLV-1)

Tabela 2. Análise comparativa baseada nas características clínicas, resposta ao PPD e baciloscopia nos casos (pacientes com TB e infecção pelo HTLV-1) e controles ( pacientes com TB sem infecção pelo HTVL-1)

Tabela 3. Comparação dos RX entre os casos (pacientes com TB e infecção pelo 43 HTLV-1 ) e controles (pacientes com TB sem infecção pelo HTVL-1)

Tabela 4. Freqüência de pacientes com escarro positivo para o bacilo álcool resistente 44 durante a terapia para tuberculose

42

_____________________________________________________________________________________

5

ÍNDICE DE GRÁFICOS

Gráfico 1 - Produção de citocinas ( TNF-α e IFN- ) em culturas de células mononucleares de

pacientes com tuberculose coinfectados ou não com HTLV-I não estimuladas ou estimuladas com

PPD. 46

Gráfico 2 - Expressão de RNA mensageiro de IL-12 em células mononucleares de

controles soronegativos e de pacientes com tuberculose com ou sem coinfecção pelo

HTLV-1 não estimuladas ou estimuladas com PPD e a avaliação da capacidade

da IL-12 em aumentar a produção de INF-γ. 47

_____________________________________________________________________________________

6

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AIDS Síndrome da Imunodeficiência do Adulto

Anti SSA Anticorpo A associado a Síndrome de Sjogren

Anti SSB Anticorpo B associado a Síndrome de Sjogren

ATLL Leucemia/linfoma de células T

BCG Bacilo Calmette – Guerin

CMSP Separação e cultura de células mononucleares do sangue periférico

DNA Ácido dexoribonucleico

DTH Teste de hipersensibilidade tardia

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

GM-CSF Fator estimulador de colônias de granulócitos e monócitos

HAM/TSP Mielopatia associada ao HTLV-I/Paraparesia Espastica Tropical

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana

HLA Antígeno do leucócito humano

HTLV Vírus Linfotrópico Humano de Células T

HTLV- I Vírus Linfotrópico Humano de Células T do tipo I

HTLV-2,3,4 Vírus Linfotrópico Humano de Células do tipo 2,3,4

IgE Imonoglobulina E

IGRA Interferon-gamma Release Assay

IL 1 Interleucina 1

7

IL 3 Interleucina 3

IL 4 Interleucina 4

IL 5 Interleucina 5

IL 6 Interleucina 6

IL-10 Interleucina 10

IL-12 Interleucina 12

IMC Índice de Massa Corpórea

INF-ˠ Interferon – gama

MNTB Micobactérias Não Tuberculosas

Mtb Mycobacterium tuberculosis

OMS Organização Mundial da Saúde

PHA Fitohemaglutinina

PPD Derivado Proteico Purificado

TB Tuberculose

TBL Tuberculose Latente

TGF-β Fator de crescimento tumoral

Th 1, Th 2 Célula T helper do tipo 1, 2

TNFα Fator de Necrose Tumoral- alfa

TT Teste Tuberculínico

UT Unidades de Tuberculina

WB Western blot

_____________________________________________________________________________________

8

RESUMO

Introdução: O vírus linfotrópico de células T do adulto do tipo I (HTLV-1) infecta

predominantemente as células CD4 + e aumenta a susceptibilidade e a gravidade à outras doenças

infecciosas. Com relação a infecção pelo Micobacterium tuberculosis os indivíduos infectados

pelo HTLV-1 tem 2 a 4 vezes mais chance de adquirir a doença , e a coinfecção M. tuberculosis

aumenta a mortalidade na tuberculose. Estudos in vivo tem mostrado uma diminuição da

positividade ao teste com antígeno do derivado proteico purificado do M.tuberculosis (PPD), e in

vitro uma diminuição da resposta linfoproliferativa em culturas estimuladas com antígeno do M.

tuberculosis. Todavia estes estudos foram realizados em indivíduos sem evidência de infecção por

este bacilo e os aspectos clínicos, bacteriológicos e imunológicos em pacientes com HTLV-1 e

tuberculose não foram ainda bem estudados.

Objetivo: Avaliar se o HTLV-1 influencia o curso clínico, bacteriológico e a resposta imune a

tuberculose.

Metodologia: Um estudo de coorte prospectivo envolvendo 13 pacientes com tuberculose

associada ao HTLV-1 (casos) e 25 pacientes com tuberculose sem HTLV-1 (controles) foi

realizado com a finalidade de determinar a gravidade da tuberculose, tendo como desfechos

aspectos clínicos, radiológicos, evolução da carga bacilar e óbito nos dois grupos. Adicionalmente

com base em um estudo de corte transversal foi comparada a resposta imunológica nos dois

grupos de doentes. O estudo foi realizado no Hospital Especializado Octávio Mangabeira, sendo

os pacientes selecionados entre agosto de 2007 à julho de 2009.

9

Resultados: Não houve diferença nos achados demográficos, nas manifestações clínicas e na

resposta in vivo ao PPD. Os achados radiológicos foram semelhantes nos dois grupos e não foram

compatíveis com os observados em indivíduos imuno suprimidos. Não houve diferença

com relação a carga bacilar nos dois grupos mas a baciloscopia tornou-se mais rapidamente

negativa nos casos do que nos controles. Dois óbitos ocorreram no grupo coinfectado. A

produção espontânea de TNF-α e INF-γ foi mais elevada em pacientes com HTLV-1 e tuberculose

do que em pacientes com tuberculose sem HTVL-1. Enquanto em culturas estimuladas com PPD a

produção de INF-γ foi similar nos dois grupos a produção de TNF-α foi menor nos pacientes com

tuberculose e HTLV-1 do que nos pacientes somente com tuberculose.

Conclusão: Enquanto o aumento da susceptibilidade a infecção pelo M.tuberculosis em

indivíduos infectados pelo HTLV-1 pode estar relacionada a uma diminuição da produção de

TNF-α, a gravidade da tuberculose em pacientes coinfectados com o HTLV-1 pode ser devido ao

aumento na resposta inflamatória Th1.

Palavras-chave: 1. Virus linfotropico humano de células T do tipo I; 2-HTLV-I; 3-Tuberculose;

4- Micobacterium tuberculosis; 5-Tuberculose e HTLV-I.

_____________________________________________________________________________________

10

II. INTRODUÇÃO

O vírus linfotrópico humano de células T tipo I (HTLV-1) foi identificado pela primeira

vez em um paciente com leucemia/linfoma de células T (ATLL) 91. A infecção pelo HTLV-1 tem

distribuição mundial, mas é mais freqüente na America Central e do Sul, África Central e sudoeste

do Japão 30. Estima-se que o Brasil tenha o maior número absoluto de casos de HTLV-1 92. As

principais doenças associadas ao HTLV-1 são a mielopatia, também conhecida como paraparesia

espástica tropical (HAM/TSP) e ATLL 87. Todavia, um número grande de indivíduos previamente

considerados como portadores do HTLV-1 tem outras manifestações relacionadas ao vírus sendo

as mais freqüentes síndrome seca, periodontite crônica, uveíte, artropatia e bexiga hiperativa

21,22,79,102. O HTLV-1 infecta predominantemente as células T CD4+ induzindo ativação celular,

proliferação e produção de citocinas pro-inflamatórias pelas células T CD4+ e CD8+ 49,102. A

elevada produção de citocinas pro-inflamatórias tem sido associada com o dano do sistema

nervoso central (CNS) e o desenvolvimento de HAM/TSP 49.

A despeito da infecção pelo HTLV-1 não induzir a morte de células T como na infecção

pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), existem evidências que a infecção causada por este

vírus possa aumentar a susceptibilidade assim como influenciar a gravidade de outras doenças tais

como estrongiloidíase, escabiose e tuberculose 12,38,65,89. A influência do HTLV-1 no curso clínico

destas doenças tem sido melhor esclarecida na estrongiloidíase. Neste caso a exagerada resposta

imune Th1 observada durante a infecção pelo HTLV-1 diminui as IL-3, IL-4, IL-5, como também

o anticorpo IgE específico anti-Strongiloides stercoralis 83,93. Como a resposta imune Th2 tem um

papel fundamental na defesa contra helmintos, a diminuição deste tipo de resposta facilita a

autoinfecção, diminui a morte das larvas invasivas, e contribui para a disseminação do parasito.

Com relação à tuberculose tem sido demonstrado que o indivíduo infectado pelo HTLV-1 tem

11

duas a quatro vezes aumentada a chance de adquirir tuberculose 26,65,118. Adicionalmente em um

estudo retrospectivo foi observado que pacientes com tuberculose e coinfectados com HTLV-1

tinham um pior prognóstico da tuberculose. Enquanto óbito ocorreu em 8% dos pacientes com

tuberculose sem infecção pelo HIV e HTLV-1, óbito foi documentado em 25% dos pacientes com

tuberculose infectados pelo HTLV-1 89. O mecanismo envolvido no aumento da susceptibilidade e

gravidade da tuberculose em indivíduos infectados pelo HTLV-1 não é bem esclarecido. Estudos

realizados no Japão tem demonstrado que a freqüência de respondedores ao teste de

hipersensibilidade tardia (DTH) com o derivado da proteína purificada do Micobacterium

tuberculosis (PPD) é menor entre os indivíduos infectados com HTLV-1 do que nos controles

soronegativos 78,111,121. Existe também evidências in vitro que a resposta linfo proliferativa a

antígenos do M.tuberculosis é inferior em portadores do HTLV-1 do que em indivíduos não

infectados pelo vírus 66,110. É sabido que portadores de HTLV-1 produzem concentrações elevadas

de IL-10 no intuito de modular a resposta imune exagerada observada durante esta infecção viral

20,103, e a produção de citocinas regulatórias pode influenciar a resposta a outros antígenos. In vitro

a diminuição da resposta proliferativa do antígeno do M.tuberculosis em indivíduos infectados

pode ser restaurada parcialmente pela IL-12 110. Estes estudos tem enfatizado que a diminuição da

resposta das células T para os antígenos do M.tuberculosis pode aumentar a susceptibilidade

como também a gravidade da doença. Todavia não há estudos demonstrando que a infecção pelo

HTLV-1 aumente a carga bacilar como também, que a alta mortalidade observada em pacientes

com HTLV-1 e tuberculose, seja devido a uma inabilidade destes pacientes controlarem o

crescimento bacteriano. O objetivo do presente estudo foi comparar as manifestações clínicas,

radiológicas e bacteriológicas em pacientes com tuberculose e HTLV-1 com as observadas em um

grupo controle somente com tuberculose e entender como a infecção pelo HTLV-1 modifica a

resposta imune e as manifestações clínicas nos pacientes com tuberculose.

_____________________________________________________________________________________

12

III. REVISÃO DE LITERATURA

III. 1. HISTÓRICO E EPIDEMIOLOGIA DA TUBERCULOSE

A Tuberculose (TB) é uma doença infecciosa de evolução crônica, cujo agente etiológico é o

Mycobacterium tuberculosis. Os gregos a chamavam de tísica. O termo tuberculose foi pela

primeira vez empregado por Scoenlein na primeira metade do século XIX e deriva do latim

tubercula, diminutivo de tuber, que significa pequeno nó ou tumor. Em 1882 Robert Koch

descobriu o agente etiológico da doença e treze anos após outro alemão, Wilhelm Roentgen

apresentou, sua genial descoberta, a radiação ionizante, que mudaria a abordagem diagnóstica em

medicina. Mesmo após mais de um século dessas duas grandes descobertas, a tuberculose

permanece como um problema de saúde na maioria dos países em desenvolvimento. Conhece-se

detalhes sobre a forma de contágio, particularidades sobre a evolução da lesão nos pulmões e a

tuberculose continua sendo um grande desafio, notadamente no que concerne à esfera diagnóstica

e terapêutica 17.

Embora comprovada na América pré-colombiana, as indicações pelos relatos históricos da

época são de que não havia tuberculose entre os nativos brasileiros antes da chegada dos

portugueses. Assim, a doença parece ter sido introduzida no país pelos colonizadores europeus,

alguns com tuberculose pulmonar, atraídos pelas qualidades climáticas tropicais, na época

consideradas como saudáveis para a cura do mal. Admite-se que foi o que aconteceu com a vinda

dos jesuítas, que, com a missão de catequese, mantinham contato permanente com as

populações indígenas, facilitando desta forma a transmissão 116. A chegada dos negros para o

13

trabalho escravo, desnutridos, extenuados pela longa viagem e alocados em senzalas promíscuas e

insalubres, pode ter facilitado ainda mais a expansão da tuberculose no país 116.

Nos dias atuais, a tuberculose permanece como a maior causa de morbidade e mortalidade

entre as doenças infectocontagiosas no mundo. O medo de uma nova pandemia tísica em escala

mundial e a multirresistência acenderam o alerta nos países do Primeiro Mundo. Diferentemente

do que apontam diversos textos, Fiuza sugere que a tuberculose não é reemergente no mundo: é

reemergente nos países ricos e “permanente” nos países pobres, e ela vem se agravando na maioria

deles 33.

Estimativas da Organização Mundial de Saúde (OMS) dão conta de uma incidência de 8,8

milhões de casos de tuberculose globalmente em 2010, com 1,1 milhões de mortes entre

tuberculose com sorologia negativa para HIV e adicionalmente 0,35 milhões de mortes entre

pseeoas com sorologia positiva para HIV. Calcula-se que mais de 1/3 da humanidade foi infectada

pelo bacilo 123.

As diferenças entre as diversas regiões do mundo são aberrantes. Enquanto 20% dos

infectados são contabilizados nos países desenvolvidos, 80% estão nos países pobres e em

desenvolvimento. Outra diferença é que, nos países desenvolvidos, 80% dos infectados situam-se

acima dos 50 anos de idade. Nos países em desenvolvimento, 80% desses encontram-se entre 15 e

59 anos, portanto, na faixa de maior produtividade. Do total de 8 milhões de casos novos, apenas

5% ocorrem nos países avançados, e os outros 95% nos países em desenvolvimento. Os

coeficientes de incidência e de mortalidade nos países em desenvolvimento atingem 171 e 60 por

100 mil, contra 23 e 2 por 100 mil, respectivamente, nos países desenvolvidos. Mais graves e

sérios são os números dos óbitos anuais: cerca de 99% ocorre nos países pobres, o que mostra a

profunda desigualdade do desenvolvimento da tuberculose 123.

14

Atualmente, com base em Caminero-Luna, podemos dividir a situação mundial da tuberculose

em 3 grupos:1- A tuberculose que ocorre em países com escassos recursos e extrema situação de

pobreza, com 65% dos casos. 2- A tuberculose que ocorre em países com recursos médios, com

30% dos casos, o Brasil aqui incluso. 3- A tuberculose que ocorre em países com recursos amplos

e desenvolvidos, com 5% dos casos.

A tuberculose é um significante problema de saúde no Brasil, o qual está entre os vinte países

no mundo com as mais altas taxas de incidência da doença. Em 2009, o Programa Nacional de

Controle da Tuberculose registrou 85.000 casos de tuberculose, aproximadamente 45 casos por

100.000 habitantes 122. Entre 2005 e 2009, a incidência decresceu para 2,9%. Este decréscimo na

taxa de incidência no Brasil foi muito menor do que os 11% que tem sido observado em outros

países com melhor controle de tratamento e mais eficiente controle dos contatos 122. Dados

divulgados pelo Ministério da Saúde indica, que os casos de tuberculose registrados em 2011

caíram 3,54% em relação ao ano anterior, tendo sido notificado, ao todo, 69.245 casos contra

71.790 em 2010. Já a txa de incidência da doença no Brasil, de acordo com este órgão caiu 3,5%

em 2011. Com relação aos óbitos provocados pela doença, houve queda de 23,4% no período de

dez anos na última década. Em 2001 o país registrou 3,1 mortes para cada 1oo mil habitantes

contra 2,4 em 2010 70.

As formas pulmonares alcançam 85%, sendo 53% com baciloscopia direta positiva e 32% sem

confirmação bacteriológica (incluídas aí as formas negativas e as que não realizaram baciloscopia

direta). Entre as formas extrapulmonares, que correspondem a 15% de todas as formas de

tuberculose, as pleurais e ganglionares periféricas são as mais encontradas, seguidas pelas

geniturinárias, ósseas e oculares, em menores percentuais. A incidência da forma de

meningoencefalite tuberculosa foi de 5% e a forma miliar, de 6% entre as formas extra-

pulmonares. A distribuição por faixas etárias evidenciou maior concentração de casos em

indivíduos entre 20 e 49 anos de idade. As taxas de incidência também foram mais elevadas nos

15

grupos acima de 20 anos de idade. Esse perfil se manteve praticamente igual durante as décadas

de 1980 e 1990. Como já referido, tem sido observado um declínio da doença em todas as faixas

etárias, e a maior queda ocorreu na faixa de 0 a 4 anos de idade, estando provavelmente

relacionada com a boa cobertura da vacina BCG em todo o país, além do impacto das ações de

diagnóstico e tratamento. A menor redução relativa foi na faixa dos 60 anos de idade, e pode-se

especular que a reativação endógena tenha um papel determinante 69.

O aumento progressivo de brasileiros em faixas etárias longevas, os imunodeprimidos não

portadores do HIV e a introdução de terapias que reduzem a imunidade celular podem também

ocasionar, em breve, modificações no perfil da doença. Somente com o advento da quimioterapia

anti tuberculosa e seu amplo uso, a mortalidade apresentou uma redução acentuada e caiu

significativamente de cerca de 250 por 100 mil casos na década de 1940 para 85 por 100 mil na de

1950. A mortalidade apresentou de 1977 a 1987, uma redução de quase 50%, com uma queda de

7,4 para 3,8 por 100 mil casos. A partir de 1987 até o início dos anos 2000, manteve-se estável,

sempre com taxas um pouco abaixo de 4 por 100 mil. Mesmo com o impacto da coinfecção TB-

HIV/AIDS, não aconteceu no país qualquer aumento exagerado da taxa de mortalidade 69. Em

2011, entre os casos novos de tuberculose notificados, 10% eram de indivíduos que tinham HIV

71.

Cerca de 5% de todos os indivíduos infectados por M.tuberculosis desenvolverão tuberculose

ativa nos dois primeiros anos após a infecção. Os outros 95% dos indivíduos expostos irão conter

o desenvolvimento da doença através de uma resposta imune celular capaz de controlar a infecção

e continuarão nessa situação, denominada tuberculose latente (TBL) pelo resto da vida, a não ser

que condições de depressão imunológica levem ao desenvolvimento da doença. De forma prática,

a American Thoracic Society define como portador de TBL aquele indivíduo que apresenta um

resultado de teste tuberculínico (TT) positivo, análise bacteriológica negativa (se realizada) e

nenhuma evidência clínica ou radiográfica de tuberculose ativa 27.

16

O risco de infecção tuberculosa atual do Brasil é desconhecido. Ao aplicar, a partir das

estimativas da década de 1970, um percentual de redução pequeno, de 2% a 3%, ele ficaria hoje

em torno de 0,5% 33. Este quadro é completamente diferente quando se avalia o risco de infecção e

desenvolvimento da doença entre familiares residentes no mesmo domicílio de pacientes com

tuberculose. Como a transmissão da doença ocorre por via inalatória, os contactantes tem grande

risco de adquirir a infecção pelo M.tuberculosis. Estudo realizado em Salvador- BA, em 282

comunicantes de TB de 69 pacientes com BAAR positivos, 10 ficaram doentes 59. Outro estudo

realizado também em Salvador - BA observou que a prevalência de tuberculose latente nos

comunicantes de acordo com o TT foi de 55,6%, que equivale a 2,2 vezes maior que a prevalência

estimada de tuberculose latente para a população brasileira 63.

III. 2- IMUNOPATOGENESE, ASPECTOS CLÍNICOS E RADIOLÓGICOS DA

TUBERCULOSE:

As vias aéreas são a principal porta de entrada para o M.tuberculosis. Por ser uma bactéria

aeróbica estrita, o bacilo infecta principalmente os pulmões, onde encontra condições favoráveis

de oxigênio para sua multiplicação, e a ligação do órgão com o meio externo favorece a sua

transmissão. Os bacilos eliminados pela tosse, especialmente de lesões cavitárias, sobrevivem por

algum tempo fora do organismo facilitando assim o contágio 34.

A presença de hipersensibilidade a uma infecção anterior ou pela vacinação com o bacilo de

Calmette-Guérin (BCG) intradérmica não impede a infecção, mas a torna limitada ao local de

entrada. Assim, a vacinação tem um efeito protetor das formas extrapulmonares, principalmente a

meningoencefalite, de alta morbimortalidade nas crianças.

A tuberculose é dividida em primária (primo-infecção) e secundária 16. A tuberculose doença

primária é definida se a lesão inicial provocar sintomas logo após a infecção ou doença pós-

17

primária, se ocorrer sintomas tardios. A forma primária é a que ocorre em indivíduos que ainda

não tiveram contato com o bacilo, sendo, portanto, mais comum em crianças.

A forma secundária desenvolve-se a partir de uma nova infecção (reinfecção exógena) ou

da reativação de bacilos latentes (reinfecção endógena). Na primoinfecção, o M. tuberculosis

inalado atinge os alvéolos, onde ocorre um processo inflamatório inicial mediado por neutrófilos

polimorfonucleares/macrófagos alveolares e há formação de um nódulo exsudativo. Se esse

primeiro mecanismo de defesa não for suficiente para conter o avanço do bacilo, os macrófagos e

as células dendríticas apresentam os antígenos do microorganismo aos linfócitos T no tecido

linfóide associado aos brônquios. Após o aparecimento da resposta imune adaptativa os

macrófagos tornam-se mais ativados e passam a secretar principalmente maiores concentrações de

três tipos de citocinas: quimiotáxicas (p.ex: interleucina 1 e leucotrieno B4), interferons e fator de

crescimento de fibroblastos. Os macrófagos ativados voltam aos alvéolos, aglomeram-se ao redor

dos bacilos, transformando-se em células epitelióides, onde clones de células T formam um

manguito periférico ao redor destas. Terminada a sua função fagocítica, as células epitelióides se

agrupam e originam as células gigantes multinucleadas. Essa reação produtiva constitui o

granuloma cuja função básica é a de barreira à disseminação do bacilo a outros locais do tecido

normal. O conjunto de granulomas formados recebe o nome de nódulo de Ghon. Ao conjunto de

nódulo de Ghon, linfangite e linfadenite dá-se o nome de complexo primário da tuberculose que,

dependendo do número e da virulência dos bacilos e do grau de hipersensibilidade e resistência do

hospedeiro, pode evoluir para a cura ou para doença 10.

A doença primária evolui a partir do foco pulmonar (processo pneumônico parenquimatoso)

ou, com maior freqüência, do foco ganglionar. Esses gânglios podem fistulizar-se para um

brônquio adjacente e determinar a disseminação broncogênica da tuberculose. Com a expansão

das lesões destrutivas, os bacilos atingem os vasos sanguíneos e disseminam-se para o pulmão e

outros órgãos 10.

18

A lesão inicial parenquimatosa ou uma nova infecção originam a necrose central, liquefação e

eliminação do material por um brônquio de drenagem com a formação da cavidade. A partir da

cavidade, os bacilos disseminam-se pelo pulmão por via brônquica (disseminação broncogênica)

e, tal como na forma progressiva da infância, por via hematogênica levando a tuberculose miliar

10.

MANIFESTACÕES CLÍNICAS:

O sintoma clássico mais comum na tuberculose pulmonar é a tosse persistente, com ou sem

expectoração, e ocasionalmente com presença de sangue. Outros sinais e sintomas referidos são

febre, sudorese noturna e emagrecimento. Sendo a tosse o sinal mais evidente de tuberculose

pulmonar e descartada outra doença, todo indivíduo com queixa de tosse por 2 semanas ou mais

deve ser avaliado para tuberculose 101.

Na anamnese, é importante a busca da história de contato prévio com indivíduos portadores de

tuberculose pulmonar ativa, de dados profissionais, de antecedentes de confinamento, de

comorbidades e de hábitos capazes de aumentarem o risco de infecção pelo M.tuberculosis e o

adoecimento. Já foi demonstrado que o risco relativo de os pacientes infectados pelo HIV

adoecerem por tuberculose varia de 22% a 100%, o de portadores de silicose é de 68%, o de

transplantados é de 20% a 74%, o de portadores de insuficiência renal crônica é de 10% a 25%, o

de indivíduos com infecção recente (< 1 ano) pelo M.tuberculosis é de 13% e o de indivíduos com

seqüela radiológica de tuberculose sem história de tratamento anterior é de 2% a 14%. Da mesma

forma, o risco relativo de pacientes com emagrecimento maior do que 15% do peso habitual é de

2% a 6%, os de portadores de diabetes mellitus é de 2% a 4% e o de submetidos a tratamento com

inibidores de TNF-α, de 4%. Mais recentemente, o tabagismo (ativo ou passivo) passou a ser

considerado como um fator capaz de aumentar a infectividade, a morbidade e a mortalidade por

tuberculose. O alcoolismo, principalmente se associado ao tabagismo, também aumenta o risco de

19

adoecimento. A tuberculose atinge mais homens do que mulheres (na proporção de 2:1),

entretanto os fatores biológicos capazes de explicarem esta predominância ainda não foram

elucidados68.

DIAGNÓSTICO:

O diagnóstico da tuberculose pulmonar em nosso meio baseia-se no encontro de duas

baciloscopias diretas positivas no escarro, uma cultura positiva para Mycobacterium tuberculosis

ou ainda imagem radiológica sugestiva ou outros exames complementares que, associados a

achados clínicos, sugiram a doença 69. O adequado conhecimento das imagens compatíveis com

atividade da tuberculose é, portanto, um recurso importante para o diagnóstico precoce e início de

tratamento 10.

A baciloscopia do escarro é o método diagnóstico mais empregado nos Serviços Públicos de

Saúde em razão de sua simplicidade, rapidez e baixo custo. Esse método consiste na visualização

de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) em esfregaços de espécimes clínicos, preparados e

corados com metodologia padronizada (Ziehl-Neelsen ou Auramina). Apesar das vantagens, a

baciloscopia apresenta 3 limitações básicas:1- É negativa em amostras de escarro com menos de 5

mil bactérias por mililitro, (geralmente associadas à tuberculose extrapulmonar e a estágios

iniciais da tuberculose pulmonar); 2- Não permite a identificação da espécie causadora da

infecção; 3- Não permite a diferenciação entre bacilos viáveis e mortos. Além disso, outros

microrganismos causadores de doença pulmonar em pacientes com comprometimento

imunológico podem se corar fracamente pela mesma técnica como Nocardia sp e Rhodococcus

equi 101.

A cultura, em razão da sua elevada acurácia, é considerada padrão de referência

para o diagnóstico da tuberculose e de outras micobactérias. Em geral, a sensibilidade da cultura é

de 70% para pacientes sem a doença cavitária e chega a 96% em pacientes com a lesão cavitária.

Em pacientes com baciloscopia negativa, a sensibilidade da cultura varia de 80% a 85%, com

20

especificidade de aproximadamente de 98%. Adicionalmente a cultura pelo método de

Lowenstein-Jensen, permite a realização de testes de sensibilidade aos tuberculostáticos 88.

O teste tuberculínico (TT), realizado por meio do método de Mantoux, consiste na aplicação de

tuberculina PPD RT 23 por via intradérmica na face anterior do ante-braço esquerdo, na dose de

0,1 ml equivalente a 2 UT (unidades de tuberculina). A leitura é realizada após 72hs às 96hs da

aplicação, por meio da medida do maior diâmetro transverso na área de enduração palpável. O

resultado é registrado em milímetros. O grande desafio na interpretação do TT é identificar o

ponto de corte do resultado, para que se possa definir o risco de acometimento e a indicação para o

tratamento da tuberculose latente (TBL), uma vez que nem todos os indivíduos com TBL

desenvolverão TB doença. O teste é considerado positivo quando a enduração é maior que 5 mm.

O TT é um método de baixo custo e de fácil execução técnica. Sua sensibilidade para o

diagnóstico da tuberculose varia de 75% a 90%, mas pode ter seu desempenho prejudicado por

situações como gravidez, desnutrição, sarcoidose, neoplasias malignas, imunossupressão

relacionada com a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana, entre outras condições. A sua

especificidade de varia de 70 % a 95% mas é afetada pela vacinação prévia recente com o BCG

e/ou por infecção por micobactérias não tuberculosas (MNTB). Em relação à vacinação com

BCG, é importante ressaltar que em países como o Brasil, onde a vacina é obrigatória logo ao

nascer, um TT positivo é esperado nos primeiros 2 anos após a vacinação e que, em adultos,

resultados positivos de TT (mesmo sem história de contato com tuberculose) devem-se

provavelmente à infecção natural pelo M.tuberculosis, e não à vacinação por BCG. Falsa

interpretação do TT pode também ser observada quando ocorre o chamado efeito “booster”,

fenômeno observado quando se

repete o TT em curto espaço de tempo. O efeito booster não pode ser confundido com a viragem

ou a conversão do TT, definida como um aumento da enduração do TT ≥ 10 mm em relação a um

21

TT realizado entre 2 semanas e 2 anos antes, e que sugere fortemente a ocorrência de infecção

recente pelo M.tuberculosis 90.

O teste que avalia a produção de interferon-γ, o Interferon-Gama-Release Assay (IGRA)

surgiu como uma potencial alternativa ao TT para a detecção de TBL. Se baseia na quantificação

in vitro de interferon-γ (IFN-γ) a partir da exposição das células T previamente sensibilizadas no

sangue do indivíduo investigado, reexposto a antígenos específicos (ESAT-6, CFP10 e TB 7.7) do

M.tuberculosis. Estudos que comparam o uso do IGRA e do TT para a detecção de TBL

demonstraram, de uma forma geral, que estes novos testes apresentam elevada especificidade,

principalmente em populações submetidas à vacinação com BCG, porém sensibilidade mais

limitada que o TT 62.

Outro meio para a detecção do M.tuberculosis é através da Polymerase Chain Reaction

(PCR) o qual possui a vantagem de ter uma rápida obtenção dos resultados e ser específico para o

diagnóstico de TB. Vários alvos moleculares tem sido pesquisados para a detecção sendo o alvo

mais utilizado atualmente o elemento de inserção IS6110 uma vez que este é uma seqüência

específica do M.tuberculosis além de estar presente em até 20 vezes no genoma deste. A

sensilbilidade desse teste varia de 79,4-95% quando comparada com a cultura em amostras com

resultado positivo na baciloscopia diminuindo para 40-89% quando são analisadas amostras com

baciloscopia negativa 109 dessa forma não apresentando acuracia suficiente para se utilizar na

rotina diagnóstica 107, além de haver a possibilidade de amplificar material não viável, o grande

risco de contaminação, a necessidade de um profissional capacitado (Soini & Musser 2001).

A radiografia do tórax contribui para o diagnóstico da tuberculose e o adequado

conhecimento das imagens compatíveis com atividade da tuberculose é um importante recurso

para o diagnóstico precoce e início de tratamento. É o método de imagem de escolha na avaliação

inicial e no acompanhamento da tuberculose pulmonar. Na tuberculose primária a radiografia do

tórax pode ser normal, embora pequenos nódulos periféricos possam estar presentes e não ser

22

visualizados. A linfonodomegalia mediastinal é a manifestação radiológica mais freqüente na

forma primária da tuberculose e pode ser documentada em 83% a 96% das crianças 60. A

atelectasia obstrutiva decorrente da compressão extrínseca por linfonodomegalias ocorre em 9% a

30% das crianças com a forma primária 60. A pneumonia caseosa manifesta-se sob a forma de

consolidações segmentares ou lobares, muitas vezes com aspecto semelhante ao da pneumonia

bacteriana típica (padrão homogêneo, com bordas mal definidas e presença de broncograma

aéreo). A tuberculose miliar é caracterizada por opacidades retículo nodulares difusas decorrentes

da disseminação hematogênica do M. tuberculosis pelo parênquima pulmonar. Quando o

complexo primário da tuberculose evolui para cura, pode manifestar-se radiologicamente por um

nódulo pulmonar ou massa, também chamados tuberculomas, associados ou não a pequenos

nódulos satélites e/ou gânglios mediastinais calcificados. O derrame pleural como manifestação da

tuberculose primária ocorre em 6% a 8% dos casos. Quando o derrame está presente, um foco

pulmonar pode coexistir e não ser visualizado na radiografia do tórax 24. A presença de lesões

parenquimatosas de atividade associadas ao derrame pleural auxilia no diagnóstico. O derrame

pleural, geralmente, é unilateral, com volume que varia de pequeno a moderado. Na forma pós-

primária da tuberculose, as cavidades são mais freqüentes nos segmentos ápico-posteriores dos

lobos superiores e secundariamente, no segmento superior dos lobos inferiores que também tem

localização posterior e apresentam-se em 40% a 50% dos casos. No Brasil, esses achados estão

presentes nas radiografias em até 100% dos casos, provavelmente relacionados ao diagnóstico

tardio da doença. As cavidades apresentam-se com paredes espessas durante a sua fase ativa 9.

Um achado sugestivo de atividade da tuberculose é a “pneumonia cruzada”, que decorre

da disseminação broncogênica do Mycobacterium tuberculosis pelo parênquima pulmonar. A

disseminação broncogênica da tuberculose a partir de uma cavidade ou de um gânglio fistulizado

determina também infiltradas retículo-micro-nodulares distantes como resultado da implantação

dos bacilos em outras localizações do pulmão 9.

23

Apresentações atípicas são comuns em pacientes idosos, diabéticos e em indivíduos

imunocomprometidos pelo HIV 9. Há quatro tipos principais de apresentações radiográficas em

pacientes com tuberculose e HIV: 1- Tuberculose pulmonar evolutiva, que apresenta

adenomegalias hilomediastinais, infiltrado em lobos inferiores e/ou médio sem cavidade, e

derrame pleural; 2- Tuberculose pulmonar pós primária, que apresenta achados em lobos

superiores e/ou segmento superior de lobos inferiores, com disseminação brônquica, retração

atelectasia, sem adenomegalia hilo-mediastinal ou derrame pleural; 3- Tuberculose miliar; 4-

Radiografia de tórax normal com pesquisa direta de BAAR e/ou cultura no escarro positiva 41.

III.3. Epidemiologia da infecção pelo HTLV-1

O vírus linfotrópico para células T humanas (HTLV-1) foi isolado pela primeira vez de um

paciente com diagnóstico de linfoma cutâneo de células T em 1980 91. Posteriormente, foi

identificado o HTLV-2 no Japão 53 e mais recentemente foram identificados o HTLV-3 e o HTLV-

4 na África 14,124. Estima-se que 20 – 30 milhões de pessoas no mundo estão infectados pelo

HTLV-1, sendo as principais áreas endêmicas a África Central, América do Sul (Brasil, Peru,

Bolívia, Colômbia, Chile, Venezuela e Argentina), a América Central principalmente na região

do Caribe, o Oriente Médio e o Japão 30. O HTLV-1 foi identificado pela primeira vez no Brasil

em 1986 em imigrantes japoneses residentes no Mato Grosso 57 e estima-se que 2,5 milhões de

pessoas estejam infectadas pelo HTLV-1 no país 18. Admite-se que o Brasil tenha o maior número

absoluto de casos de HTLV-1 18 e o Sudoeste do Japão é a área com maior prevalência da infecção

no mundo 64. No Sudoeste do Japão uma freqüência acima de 35% de infectados já foi

documentada 71. Em Salvador-Bahia foi documentado em 1998 uma prevalência de 1,8% na

população geral sendo 2% em mulheres e 1,2% em homens, tendo estes percentuais se elevado

para 10% e 12% em mulheres e homens respectivamente com mais de 50 anos 28. A infecção

predomina em indivíduos de baixa renda e com menor grau de escolaridade 28. Em doadores do

24

banco de sangue a soropositividade em Salvador foi de 1,3% 36. Há uma associação entre a

infecção pelo HTLV-1 e o HIV 3.

A transmissão do HTLV-1 ocorre por três vias: 1) Por via vertical principalmente pelo

aleitamento materno; 2) por via sanguínea através de transfusão de sangue ou uso de agulhas ou

seringas contaminadas e 3) pela via sexual. O aleitamento materno ainda é considerada a principal

via de transmissão do HTLV-1, mas a documentação que a prevalência sorológica da infecção

pelo HTLV-1 aumenta com a idade, sugere que atualmente o contacto com sangue contaminado e

a via sexual do vírus sejam as principais vias de transmissão 28. Os principais grupos de risco para

infecção pelo HTLV-1 são os filhos de gestantes infectados pelo HTLV-1, usuários de droga e

parceiros de indivíduos infectados pelo HTLV-1 8,29. A soroprevalência do HTLV-1 em gestantes

varia de 400 a 500 / 10.000 em regiões hiper endêmicas do Japão enquanto em áreas não

endêmicas deste país varia de 10 a 100 / 10.000 35. Em estudo realizado com amostras de 7 países

da Europa Ocidental a soroprevalência para HTLV-1 ou HTLV-2 foi de 4,4 / 10.000 113. A

transmissão materno-infantil ocorre em 20% dos filhos de mães infectadas e tem sido relacionado

à carga pró-viral da mãe, altos títulos de anticorpos e amamentação prolongada 56,117. Constituem-

se fatores predisponentes para a transmissão sexual múltiplos parceiros, tempo de exposição e

ulcerações vaginais 6. Estudos indicam maior eficiência na transmissão homem-mulher do que no

sentido inverso 58,79. A transmissão por componentes celulares de sangue contaminado ocorre com

sangue total contaminado, concentrado de plaquetas e concentrado de hemácias, enquanto não se

tem documentado transmissão por plasma e seus derivados tais como albumina, imunoglobulinas

e fatores da coagulação 81.

III.4 - Imunopatogêneses e Manifestações Clínicas Associadas ao HTLV-1

O HTLV-1 infecta preferencialmente células T CD4+, mas também células T CD8+,

monócitos, células dendríticas, células epiteliais e outros tipos celulares podem também ser

infectados 44. O DNA pró-viral pode ser transmitido de uma célula a outra por proliferação clonal

25

da célula infectada, mas também por um mecanismo de sinapse viral, quando o vírus induz

eventos de proliferação das células e facilita a junção de células infectadas com não infectadas,

permitindo desta forma a passagem viral 5. A infecção viral induz proliferação celular e a proteína

TAX do vírus ativa a transcrição de genes celulares levando não só a proliferação linfocitária

como ativação de células e secreção de várias citocinas tais como IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-6, GM-

CSF 47,55,115. Ênfase mais recentemente tem sido dada ao gene e proteína HBZ, pois enquanto seu

produto induz atividade proliferativa celular, esta proteína tem a capacidade de inibir a expressão

de TAX 106,125. Além das proteínas virais fatores dos hospedeiros como tipo de HLA

e polimorfismos de produtos de genes podem desempenhar papel na patogênese da infecção pelo

HTLV-1. Todavia, não tem sido documentado que polimorfismo se relacione diretamente com o

desfecho clínico da infecção pelo HTLV-1. No Japão foi documentada uma associação entre os

alelos HLA-A*02 e HLA-Cw*08 e proteção ao desenvolvimento de mielopatia enquanto o HLA

B*5401 foi associado a maior susceptibilidade a esta doença 50.

As duas principais doenças associadas ao HTLV-1 são a leucemia de células T de adulto

(ATLL) e a mielopatia associada ao HTLV-1 ou paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). A

ATLL ocorre em cerca de 2,5% dos indivíduos infectados e pode se apresentar do ponto de vista

clínico em 4 subtipos: indolente, crônica, linfoma e aguda. A ATLL do subtipo agudo é a forma

mais freqüente ocorrendo em 65% dos casos 92. Caracteriza-se pela leucocitose com linfocitose e

atipia linfocitária, sendo um achado freqüente as células em forma de flor (flower cells). A

HAM/TSP é uma mileopatia insidiosa progressiva, ocorrendo principalmente após a 3ª ou 4ª

década de vida, e é mais freqüente em mulheres na proporção de 2:1 19. Todavia evolução rápida

para mielopatia em período inferior a 2 anos tem sido relatado39 e mielopatia tem sido observada

em crianças e adolescentes com dermatite infecciosa, uma doença eczematosa cutânea e grave

associada ao HTLV-1 97. As manifestações clínicas da HAM/TSP são caracterizadas por dores

lombares e dores em músculos de membros inferiores, seguido de espasticidade, parestesias e

26

fraqueza muscular. A progressão da doença leva a incapacidade de deambular. No exame físico os

achados mais importantes são hiperreflexia principalmente em membros inferiores, dificuldade

para deambular, espasticidade e sinal de Babisnky. Queixas urinárias como noctúria, urgência

miccional e incontinência urinária são achados freqüentes, ocorrendo em percentual elevado de

casos 23 e em algumas séries em 100% dos casos 86. Entre as queixas urinárias a mais comum e

mais relacionada à HAM/TSP é a urgência miccional ou urge-incontinência caracterizando um

quadro de bexiga hiperativa por definição do International Continency Society 1. Nestes casos o

estudo urodinâmico revela predominantemente uma discinesia do detrusor ou hiperatividade do

detrusor 22. A documentação que indivíduos infectados pelo HTLV-1 apresentam sintomas

freqüentemente observados em pacientes com doenças autoimunes como secura da boca, secura

dos olhos e secura da pele, artralgia, artrite e fraqueza muscular fez com que fosse levantada a

hipótese de que o vírus ao infectar células T humanas, poderia induzir ativação de células auto

reativas e conseqüentemente levasse ao aparecimento de doenças auto-imunes. Estes dados

iniciais levaram a uma série de publicações sobre associação de HTLV-1 com doenças auto-

imunes como a síndrome de Sjogren, artrite reumatóide e poliomiosite 31,67,72,76,84. Esta forte

associação entre HTLV-1 e doenças auto-imunes e conseqüentemente a idéia de que a infecção

causada por este vírus levasse freqüentemente ao desenvolvimento destas doenças tem sido

contestada com base em estudos clínicos e imunopatológicos. Por exemplo, embora os aspectos

patológicos da síndrome seca associado ao HTLV-1 como infiltração de linfócitos e destruição de

glândulas salivares sejam semelhantes aos observados na síndrome de Sjogren a presença de

anticorpos contra auto-antígenos como anti SSA e anti SSB tão freqüentes nesta síndrome não

foram observados em pacientes com síndrome seca 32. A forte associação da infecção pelo HTLV-

1 com artrite reumatóide que foi também previamente relatada em vários trabalhos não foi

comprovada em estudos posteriores 4,7. Ao contrário, evidências vêm sendo acumuladas que as

manifestações articulares em indivíduos infectados pelo HTLV-1 estão relacionadas com uma

27

artropatia associada ao vírus 104. Estes dados apontam para o papel do vírus na indução de uma

resposta imunológica exacerbada do hospedeiro e conseqüente desenvolvimento de doenças

inflamatórias crônicas relacionadas com hipersensibilidade e não em decorrência de reações auto-

imunes. Estudo imunopatológico em pacientes com periodontite crônica associada ao HTLV-1 dá

suporte ao desenvolvimento de uma lesão tecidual por hipersensibilidade, desde que DNA viral

foi documentado em 100% dos indivíduos, ao tempo em que havia um aumento da expressão de

citocinas inflamatórias e diminuição da expressão de células T regulatórias 37.

A resposta imune na infecção pelo HTLV-1 se caracteriza por uma produção exacerbada

de citocinas e quimiocinas 20,42,103. Avaliando indivíduos portadores do HTLV-1 Carvalho et al

observaram que existia um aumento da produção espontânea de citocinas, ou seja, mesmo em

culturas sem adição de estímulos, tanto de citocinas Th1 como Th2 estavam aumentadas, embora a

produção de IFN-γ fosse muito mais elevada que a produção de IL-4, IL-5 e IL-10 20. Foi também

observado que havia uma correlação direta entre a produção de IFN-γ com a produção de IL-5 e

de IL-10 20. Comparando-se a resposta imune de portadores de HTLV-1 com pacientes com

HAM/TSP foi documentado que a produção de TNF-α, IL-1, IL-6 e de IFN-γ era maior em

pacientes com HAM/TSP do que a observada em indivíduos portadores da infecção, tanto no

sobrenadante de células mononucleares, como no soro 102. Todavia a produção das citocinas

inflamatórias TNF-α e IFN-γ em indivíduos infectados pelo HTLV-1 é bastante variável, e um

número elevado de indivíduos considerados portadores do vírus produzem IFN-γ e TNF-α em

concentrações tão elevadas quanto às observadas em pacientes com HAM/TSP 102. A principal

célula produtora de IFN-γ em portadores de HTLV-1 é a célula T CD4+ 20, mas em indivíduos

com HAM/TSP a principal célula é a célula T CD8+, indicando que a mudança de tipo celular

como fonte produtora de IFN-γ, pode ser um biomarcador ligado ao desenvolvimento de

HAM/TSP 102. Esta produção exacerbada de citocinas pró-inflamatórias e conseqüentemente

maior dano tecidual, relaciona-se de um lado com a carga pró-viral, mas também com uma

28

produção ou função diminuída de citocinas moduladoras como a IL-10 e o TGF-beta 103. Nos

pacientes com HAM/TSP a relação entre as citocinas pró-inflamatórias e IL-10 é mais elevada do

que em portadores do vírus 13 e há uma diminuição da capacidade do TGF-beta e da IL-10 de

modular negativamente a resposta imune de pacientes com HAM/TSP 103.

Para a passagem de células do sangue para o sistema nervoso central (SNC) faz-se

necessário a expressão de moléculas de adesão e as quimiocinas tem papel fundamental em atrair

células para o sítio do processo inflamatório. Tem sido observado tanto no soro como no líquor de

pacientes com HAM/TSP concentrações elevadas das citocinas CXCL9 e CXCL10 42. Tanto

CXCL9 como CXCL10 tem uma forte relação com células Th1, desde que tem a capacidade não

só de estimular a produção de IFN-γ por estas células, mas também recrutá-las para o sítio da

lesão100. As quimiocinas CXCL9 e CXCL10 são produzidas principalmente por

monócitos/macrófagos mas também por células T 100. Embora as concentrações de CXCL9 e

CXCL10 sejam maiores nos pacientes com HAM/TSP do que em portadores do vírus, mais de

50% dos portadores apresentam concentrações de quimiocinas semelhante às observadas em

pacientes com HAM/TSP 42. Vale ressaltar que a produção de CXCL10 é maior no sobrenadante

de células mononucleares do que no soro e que no sobrenadante destas células estas moléculas são

bem mais elevadas em pacientes com HAM/TSP do que em indivíduos assintomáticos 61. É

também importante a documentação de que enquanto em portadores de HTLV-1 a principal célula

portadora de CXCL10 é o monócito seguido por células CD4, nos pacientes com HAM/TSP a

principal fonte de CXCL10 são as células T CD8+ 61. No líquor a diferença nas concentrações

destas quimiocinas nas diversas formas clínicas fica mais evidente desde que a produção de

CXCL10 do que de CXCL9 é muito elevada em pacientes com HAM/TSP, e a produção é maior

no líquor do que no plasma 61.Como a celularidade no líquor de pacientes com HAM/TSP é muito

baixa, uma possibilidade é que em adição ao papel das células T a produção elevada destas

quimiocinas no líquido céfalo-raquidiano seja feita por células da glia. Neste contexto uma

29

possibilidade é que inicialmente as células T CD4+ e T CD8+ atravessam a barreira hemato-

encefálica e migram para o sistema nervoso central. Posteriormente o vírus infecta células da glia

e uma produção muito elevada de CXCL10 vai ocorrer, havendo então recrutamento de mais

células T para o sistema nervoso central. Patologicamente a HAM/TSP é caracterizada por um

infiltrado inflamatório mononuclear na substância branca e cinzenta da região torácica da medula

espinhal, resultando em degeneração e fibrose da substância branca 48,126.

Além da resposta imune exagerada e não modulada, um outro fator determinante na

patogênese das doenças associadas ao HTLV-1 é a carga pró-viral.

A leucemia das células T de adulto (ATLL) uma outra importante doença associada ao

HTLV-1 tem sua patogênese relacionada com a capacidade transativadora da Tax, resultando no

descontrole do processo de proliferação celular. Com a proteína Tax estimulando a proliferação

celular continuadamente, algumas alterações em genes responsáveis por manter a apoptose e o

ciclo celular regulador, podem vir a ocorrer. Estas mutações podem converter as células infectadas

em células neoplásicas com alto poder proliferativo e de expansão clonal, levando ao

desenvolvimento da ATLL. A carga pró-viral e a expressão de Tax estão também relacionadas

com ativação celular e produção exacerbada de citocinas pró-inflamatórias, aspecto importante na

patogênese da HAM/TSP 87.

A despeito de ainda continuar sendo divulgado o conceito de que a infecção associada ao

HTLV-1 tem baixa morbidade, desde que a HAM/TSP e a ATLL só ocorrem em menos de 5%

dos indivíduos infectados, existem evidências epidemiológicas, clínicas, imunológicas e

histológicas que a infecção pelo HTLV-1 pode causar várias doenças tais como síndrome seca,

uveíte, periodontite crônica, artropatia e neuropatia periférica 21,72,73. Em um estudo de coorte

transversal Caskey comparou sinais e sintomas observados em 115 indivíduos considerados

portadores do HTLV-1 e 115 soronegativo controles de banco de sangue pareados por idade e

sexo. Os portadores de HTLV-1 apresentaram uma prevalência mais elevada de xerostomia,

30

gengivite, periodontite, artrite, noctúria, urgência miccional, fraqueza em membros inferiores e

parestesias. Adicionalmente, tem sido documentado que um percentual elevado de indivíduos

infectados pelo HTLV-1 que não preenchem os critérios para HAM/TSP apresentam queixas

urinárias de urgência miccional, incontinência urinária e noctúria 23,86. Tem sido mostrado que do

ponto de vista clínico estes indivíduos tem um quadro de bexiga hiperativa, manifestação que

pode ocorrer em 100% dos pacientes com HAM/TSP 86. O estudo urodinâmico de indivíduos com

bexiga hiperativa associado ao HTLV-1 mostra que na maioria destes casos é documentada

hiperatividade com discinesia do detrusor, achado que é também observado em pacientes com

HAM/TSP 22. Dá suporte as evidências clínicas que a bexiga hiperativa associada ao HTLV-1 é

causada por um comprometimento do SNC, a documentação de que a carga pró-viral e a produção

de citocinas pró-inflamatórias nestes indivíduos é similar a observada em pacientes com

HAM/TSP e maior que a observada em indivíduos portadores de HTLV-1 106.

III.5 - Influência da infecção pelo HTLV-1 na resposta imune e manifestações clínicas da

tuberculose

Estudos de natureza clínico epidemiológico e relatos de caso têm mostrado que indivíduos

infectados pelo HTLV-1 tem mais doenças parasitárias, virais e doenças causadas

por bactérias extra e intra celulares do que indivíduos soronegativos para o HTLV-1 12,40,75,80,82,94.

Com relação a tuberculose existem evidências da doença ser mais freqüente em indivíduos

infectados pelo vírus do que em controles soronegativos 26,65. No Peru em uma coorte de

familiares de indivíduos infectados pelo HTLV-1 foi observado que a infecção por este vírus

aumenta em duas vezes a chance de adquirir tuberculose 119. Na cidade de Salvador, onde é

elevada a prevalência da infecção pelo HTLV-1, em um estudo com base populacional foi

observado que a prevalência de sorologia positiva para HTLV-1 em pacientes com tuberculose foi

4 vezes maior do que em indivíduos sem tuberculose pulmonar 65. Em outro estudo realizado no

31

Hospital Especializado Octávio Mangabeira, 607 indivíduos foram estudados com a finalidade de

avaliar e comparar a prevalência da infecção pelo HTLV-1 em pacientes com tuberculose com a

observada em indivíduos com outras patologias pulmonares. Não houve diferença com relação a

idade, sexo, raça e renda familiar entre os 2 grupos. A prevalência de tuberculose foi de 10,8% no

grupo de indivíduos infectados pelo vírus e de 2,3% no grupo com outras doenças pulmonares.

Após análise de regressão logística foi observado que a infecção pelo vírus aumenta em 2 vezes a

chance da infecção pelo M. tuberculosis 26. No Peru Verdonck et al também documentaram que a

infecção pelo HTLV-1 está associada com história pregressa de tuberculose e de tuberculose ativa

entre familiares de indivíduos infectados pelo HTLV-1 119. Esta associação, todavia não foi

observada em um estudo realizado em pacientes hospitalizados no Senegal 54. Neste estudo,

embora não tenha sido documentada a associação de tuberculose com HTLV-1, foi documentado

que em indivíduos soropositivos para HIV a infecção pelo HTLV-1 aumentava o risco de ter

tuberculose 54.

No que concerne a resposta imune in vivo avaliada pelo teste de hipersensibilidade tardia

estudos realizados na década de 80 e 90 no Japão mostraram que a positividade ao PPD era menor

em indivíduos infectados pelo HTLV-1 do que em indivíduos soronegativos 43,78,111, e que também

havia uma interferência de sexo, sendo a positividade do teste tuberculínico menor em mulheres

do que homem 43. Como a tuberculose no Japão foi controlada há mais de 5 décadas, estes

trabalhos foram realizados em uma população de indivíduos idosos, ou seja, naqueles que tinham

convivido durante a idade infantil ou da adolescência com a transmissão ativa da doença nesse

país. Os indivíduos que participaram desse trabalho eram sadios por ocasião do estudo, não há

referência se tiveram ou não tuberculose pulmonar, ou se tinham convivido com indivíduos com

tuberculose pulmonar.

32

Estudos in vitro tem também mostrado uma diminuição da resposta imune ao PPD em

indivíduos infectados com o HTLV-1. Analisando a resposta imune in vitro a antígenos de

memória como o tétano toxóide e o PPD foi observado que quando comparados com

soronegativos, indivíduos infectados pelo HTLV-1 apresentavam uma diminuição da proliferação

linfocitária 66. O mecanismo pelo qual a infecção pelo HTLV-1 diminui a resposta imune do tipo 1

a outros antígenos não é estabelecido. Em pelo menos um estudo foi observado que a adição de

IL-12 aumenta in vitro a resposta proliferativa linfocitária de indivíduos infectados pelo HTLV-1

a antígenos de M. tuberculosis 110. Recentemente foi documentado que células dendríticas de

indivíduos infectados pelo HTLV-1 apresentam diminuição da expressão de HLA-DR e de

moléculas coestimulatórias, o que poderia justificar esta supressão da resposta imune a outros

antígenos observados na infecção pelo HTLV-1 52. Adicionalmente, é conhecido que na infecção

pelo HTLV-1 existe ativação, tanto de células Th1 como Th2 e que células destes indivíduos

infectados produzem espontaneamente e em maior concentração IL-10 do que células de

indivíduos soronegativos. Há também uma correlação positiva entre a produção de IFN-γ e de IL-

10 20. Neste contexto é possível também que a produção elevada de IL-10 em indivíduos

infectados pelo HTLV-1 possa modular negativamente a função de células apresentadoras de

antígenos e de células T, e com isto reduzir a resposta linfocitária a outros antígenos. Como tanto

os estudos in vivo como in vitro avaliando a resposta imune a antígenos de M. tuberculosis em

indivíduos infectados pelo HTLV-1 foram realizados sem se ter conhecimento da exposição prévia

à micobactéria, faz-se necessário que a resposta imune ao PPD seja testada em indivíduos com

tuberculose ativa ou com história de exposição a antígenos de M.tuberculosis.

Em adição as evidências epidemiológicas da associação entre HTLV-1 e tuberculose,

estudos clínicos tem mostrado que a tuberculose é mais grave em indivíduos infectados pelo

HTLV-1. Em uma análise retrospectiva dos 378 pacientes hospitalizados para tratamento da

tuberculose em um hospital filantrópico de Salvador-Bahia o prognóstico da doença e a sua

33

associação com infecção retroviral foi avaliada com base no relato de prontuários sobre a causa da

morte e pela freqüência de óbito 89. A mortalidade no grupo sem infecção retroviral foi de 8%

(25/319). Em 32 pacientes coinfectados com HTLV-1/2 a mortalidade foi observada em 8 (25%) .

Em 18 pacientes coinfectados com HIV ocorreram 6 mortes (33,3%). Em 9 pacientes com HTLV-

1/2 e HIV morte por tuberculose foi detectada em 5 (55,6%). A mortalidade foi maior

(P 0.00001) se o paciente tinha tuberculose e uma ou ambas retroviroses quando comparados com

pacientes sem coinfecção com retrovírus (P 0.00001). Dados relativos a causa das mortes foram

encontrados em menos de 64% dos casos não tendo sido especificado as causas de óbito. Todavia

é informado que a maioria teve morte associada à tuberculose 89. No Peru aspectos clínicos,

bacteriológicos e resposta terapêutica foram avaliados em 77 indivíduos coinfectados com o M.

tuberculosis e HTLV-1 e em 218 pacientes com tuberculose, mas sem infecção pelo HTLV-1. Não

houve diferença com relação a duração da tosse, freqüência de hemoptise, dispnéia e perda de

peso entre os dois grupos. Todavia a freqüência de pacientes que apresentaram 3+ no exame de

baciloscopia foi maior 53% no grupo com HTLV-1 do que no grupo sem HTLV-1 (21%). Não

houve diferença entre os grupos com relação a resposta terapêutica, sendo cura da doença em 94%

dos indivíduos coinfectados e 82% dos que apresentavam somente tuberculose 119.

_____________________________________________________________________________________

34

IV- OBJETIV0

IV. 1. Principal:

Avaliar aspectos clínicos e imunológicos da associação entre a infecção pelo HTLV-1 e

Tuberculose Pulmonar.

IV.2. Secundários:

- Avaliar as conseqüências clínicas, microbiológicas e radiológicas da infecção pelo HTLV-1

em pacientes com tuberculose pulmonar.

- Caracterizar a resposta imune em indivíduos com tuberculose coinfectados com HTLV-I

_____________________________________________________________________________________

35

V. CASUÍSTICA, MATERIAL E MÉTODOS

V.1. DESENHO DO ESTUDO E MÉTODOS

V.1.1. Seleção de pacientes e definição de casos

O estudo foi realizado no Hospital Especializado Octávio Mangabeira (HEOM), hospital de

referência para doenças respiratórias em Salvador – Bahia, no período de agosto de 2007 à julho

de 2009. Neste intervalo de tempo foram admitidos neste nosocômio 1787 pacientes com

tuberculose de todas as faixas etárias e 1400 pacientes com idade entre 18 e 60 anos. Foram

excluídos do estudo portadores de HIV, diabetes mellitus e gestantes, condições que modificam o

curso clínico da tuberculose. Foram também excluídos indivíduos com insuficiência renal,

insuficiência hepática e pacientes em uso de drogas imunossupressoras. Em todos os pacientes

com tuberculose com idade variando de 18 a 60 anos que preenchiam os critérios de inclusão no

estudo, (N=147), foi realizado sorologia para a infecção pelo HTLV-1 pela técnica de Elisa

(Ortho-Clinical Diagnosis, Raritan, NJ, USA), sendo a confirmação da infecção viral feita pela

técnica de Western Blot (HTLV Blot2.4, Genelabs, Singapore). Foram detectados 13 casos de

tuberculose associado ao HTLV-1. Participaram do presente estudo estes 13 pacientes, com

tuberculose e infecção pelo HTLV-1 e 25 pacientes somente com tuberculose, de ambos os sexos.

Todos tinham tuberculose pulmonar ativa determinada pela baciloscopia positiva e identificação

do M. tuberculosis pela cultura. Em adição a estes 48 pacientes foram incluídos 6 indivíduos

sadios não infectados pelo M. tuberculosis para a participação no estudo de avaliação imunológica

na qual a expressão de RNA mensageiro para IL-12 foi determinada.

36

V.1.2. Desenho do estudo.

Estudo de coorte prospectivo incluindo 13 pacientes com diagnostico de tuberculose e

infecção pelo HTLV-1 e 25 pacientes que apresentavam somente tuberculose pulmonar. Para cada

paciente com tuberculose e HTLV-1 dois controles somente com tuberculose foram incluídos,

pareados por idade ±5 anos e por gênero. Todavia, para um dos pacientes com tuberculose só foi

encontrado um controle que preenchesse os critérios de inclusão. Nestes pacientes foram

realizados teste intradermico com PPD, exame bacterioscópico do escarro, radiografia de tórax e

um questionário padrão (ANEXO I) contendo informações sobre dados demográficos e clínicos

por ocasião da entrada no estudo. Dois pacientes com HTLV-1 e tuberculose estavam já em uso de

drogas tuberculostáticas por 28 e 35 dias respectivamente. Estes pacientes foram admitidos devido

a intoxicação hepática pelas drogas anti-tuberculosas, tinham baciloscopias positivas antes da

terapia mas, ambos tinham baciloscopia negativas na admissão e durante o período do estudo.

Foram avaliados como desfechos nesta coorte:1- A gravidade da doença mensurada pelas

manifestações clínicas, achados radiológicos e bacteriológicos; 2- Negativação da baciloscopia; 3-

Reações adversas a drogas; 4-Óbito. Um estudo de corte transversal com a participação dos dois

grupos de pacientes da coorte foi realizado para comparar a resposta imunológica. Foram

determinados nestes dois grupos:1) as concentrações de citocinas ( TNF α, IFNγ, IL-10 e IL-12);

2) a capacidade de neutralização da IL-10 e da adição exógena da IL-12 em aumentar a produção

de IFNγ. Além do acompanhamento clínico, realizado pelo período mínimo de 30 dias, os

pacientes realizaram exame bacterioscópico nos dias 10, 20 e 30 após o início do tratamento e

cultura para o M.tuberculosis no tempo 0. O exame radiográfico de tórax foi avaliado por dois

especialistas, um radiologista e um pneumologista sendo computados os achados radiográficos,

segundo o Consenso Brasileiro Ilustrado sobre a terminologia dos descritores e padrões

fundamentais da tomografia computadorizada 108. Neste Consenso, a cavidade ou escavação

representa espaço que contém gás, com ou sem líquido, dentro de um nódulo, massa ou

37

consolidação. Geralmente ocorre pela drenagem de parte necrótica pela via aérea. A destruição

parenquimatosa é a destruição das estruturas do parênquima pulmonar. Um dos investigadores

(MLB) examinou cada paciente e reviu os exames laboratoriais.

V.1.3. Testes laboratoriais

Na admissão cinco mililitros de sangue foram retirados de cada paciente e a presença de

anticorpos para o HTLV-1 foi detectada por ELISA (Murex HTLV-1, Abbot, Dartford, UK).

Amostras positivas foram submetidas a confirmações sorológica pela técnica de Western blot

(HTLV Blot2.4, Genelabs, Singapore), que também discrimina o HTLV-1 do HTLV-2. Amostras

de soro também foram avaliadas para o anticorpo do HIV-1 pela enzime-linked immunosorbent

assay (Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, NJ, USA).

V.1.4. Baciloscopia

A presença de bacilos alcool-ácido resistentes foi feita através do corante com fucsina de Ziehl-

Neelsen concentrada. Após lavagem com solução alcool-ácido a 1%, a lamina foi rapidamente

corada com azul de metileno. A carga bacilar foi classificada em 1+, 2+, 3+ ou negativa.

V.1.5. Cultura para M. Tuberculosis

A cultura para isolamento das micobactérias foi feita pelo meio de cultura Lowerstein- Jansen. As

culturas permaneceram incubadas a 37° C até o período de 45 dias. Foram realizados testes de

sensibilidade as drogas.

V.1.6. Teste de reatividade cutânea ao derivado protéico purificado do M.tuberculosis (PPD)

A caracterização da resposta imune em indivíduos com tuberculose coinfectados ou não pelo

HTLV-1 foi feita in vivo através do teste de hipersensibilidade tardia. A reatividade ao PPD foi

determinada pela enduração após inoculação intradérmica com 0.1 ml de uma concentração de 2

unidades de tuberculina – 2 UT (Tuberculina PPD RT-23). Após 72 horas, o sítio da injeção foi

examinado e a positividade foi determinada com base no diâmetro da enduração. Todos os

pacientes tiveram sua reatividade ao PPD testados antes do início do estudo.

38

V.1.7. Separação e cultura de células mononucleares do sangue periférico (CMSP)

Sangue total heparinizado (30 mililitros) foi obtido de cada paciente e as células mononucleares

foram isoladas, através de um gradiente de centrifugação utilizando o meio de separação de

linfócitos (Ficoll-Hypaque). Após centrifugação as células foram coletadas da interface, lavadas

em salina estéril e ajustadas para uma concentração 3 x 10 6 células/ mL em meio RPMI (Gibco,

Grand Island, NY, USA), suplementado com 10% de soro AB+ humano inativado e adicionado de

penicilina/estreptomicina. As células foram colocadas em placas de 24 orifícios e mantidas sem

estímulo (meio), estimuladas com PHA (diluição final de 1:10) e PPD (1 ug/mL). Posteriormente

estas culturas foram incubadas a 37o C em 5% de CO2 por 72 horas. Os sobrenadantes foram

coletados e estocados a -20o C para posterior dosagem de citocinas.

V.1.8. Dosagem de citocinas por ELISA

IFN-γ, TNF-α e IL-10 foram determinados no sobrenadante de culturas de CMSP estimulados ou

não com PPD (1 ng/mL), utilizando o método de ELISA ¨ sandwich¨. Foram utilizados reagentes

comercialmente disponíveis (Pharmingen, San Diego, CA, USA) e o resultado expresso em

pg/mL, utilizando uma curva padrão construída com citocinas recombinantes.

V.I.9. Determinação de IL-12 por PCR

O RNA foi obtido de lisado de células isolado por Tri Reagent Solon (ambion, Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA). A concentração e pureza do RNA e síntese de DNA foram

realizadas como descrito por Novoa et al (Novoa 2011). Sonda específica para cDNA de IL-12 e o

gen de referência HPRT foram adquiridos da Real Time-Primers.com (Real Time primers, LLC;

Elkins Park, PA,USA). PCR quantitativo relativo foi realizado em um Real-Time PCR system Step

One PlusTH AB Applied Biosystems em placas de microtitulação em 66 orifícios em volume final

de 10 uL usando 0,5 uL de cDNA, 2,5 uL de 2X SYBR Green Master mix (AB Applied

Biosystems, Foster City, CA,USA) e 30 pM da específica sonda. As condições de ciclos e

amplificação foram realizadas como previamente descrito (Novoa 2011). Expressão de RNA para

39

HPRT foi usada para normalização. A concentração da expressão relativa de IL-12 foi obtida pela

media ∆CT do gen usando o programa Step One Plus TM Software v2.0 (AB Applie

Biosystems).

V.1.10. Determinação da capacidade da neutralização da IL-10 e da adição de IL-12 em

restaurar a resposta imune ao PPD em pacientes com tuberculose coinfectados pelo HTLV-1

Em alguns experimentos, culturas de CMSP (3 x 106 células/ mL) cultivadas em RPMI

suplementado com soro AB+ humano foram estimuladas com PPD com adição de IL-12 (50 ng)

ou de anticorpos anti-IL-10 (100 ng/ mL) ou isotipo controle (R & D System, Minneapolis). As

culturas foram mantidas a 37o C em 5% de CO2 por 72 horas e os sobrenadantes foram coletados e

estocados a – 20o C para avaliação da produção de IFNγ.

V.2. Análise estatística

Pacientes hospitalizados com tuberculose e infectados com HTLV-1 foram comparados com

grupo controle de pacientes com tuberculose e sem HTLV-1. O valor de P foi calculado usando o

teste T para variáveis contínuas e o teste x2 de Pearson para variáveis categóricas. O teste exato de

Fisher’s para as hipóteses independentes foi usado quando se comparou grupos pequenos (N < 5).

O teste de Kaplan-Meier foi usado para a análise de sobrevida em pacientes que estavam

eliminando o bacilo álcool resistente após 10 e 20 dias de terapia com tuberculostáticos. A

comparação da produção entre os grupos de TNF-α e INF-γ foi realizada pelo teste de Mann

Whitney. Todas as análises foram feitas usando o software STATA 10.1 (Stata Corp, College

Station, TX, USA).

V.3. Aspectos éticos

O presente estudo foi submetido à avaliação e aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa em seres

humanos - Maternidade Climério de Oliveira – Universidade Federal da Bahia, com

40

parecer/resolução número 059/2006 e 057/2008. Sobre a natureza e a finalidade do estudo em

questão, todos o s participantes receberam informação verbal e escrita, esta através do

documento

de consentimento livre e esclarecido assinado por todos os pacientes. (ANEXO II).

V.4.Revisão bibliográfica e Revisão sistemática

A revisão foi realizada com base em trabalhos científicos que abordaram o tema em questão. A

pesquisa foi feita em base de dados Medline e Lilacs, as palavras chaves foram: “HTLV-1 and

Tuberculosis”, “HTLV-1”, “Tuberculosis”, “Micobacterium tuberculosis”. Termos similares

foram pesquisados em português no banco de dados Scielo. Os trabalhos selecionados foram os

publicados no período de 2000 a 2011. Foram utilizados trabalhos científicos citados nestes

artigos que foram publicados antes de 2000 mas incluídos devido a achados relevantes no que

concerne a coinfecção HTLV-1 e tuberculose. Alguns livros foram consultados.

41

VI- RESULTADOS

___________________________________________________________

As características demográficas dos 13 pacientes com tuberculose e HTLV-1 (casos) e 25

pacientes somente com tuberculose (controles) estão mostrados na tabela 1

Tabela 1. Características demográficas dos casos (pacientes com TB e infecção pelo HTLV-1) e controles (pacientes com TB sem infecção pelo HTLV-1)

Aspectos Demográficos e Hábitos de Vida

Casos (n=13) n (%)

Controles (n=25) n (%)

Valor de P

Idade, anos, média ± DP 46.4 ± 7.2 45.0 ± 7.7 0.61* Sexo masculino 10 (76.9) 20 (80.0) 0.83** Cor da pele 0.38**

Brancos 2 (15.4) 6 (24.0) Não brancos 11 (84.6) 19 (76.0)

0.32** Renda mensal

Nenhuma 4 (30.8) 5 (20.0) <salário mínimo 4 (30.8) 6 (25.0) Salário mínimo 2 (15.4) 6 (25.0) 2-3X salário mínimo 3 (23.1) 8 (32.0)

Estatus nutricional Severamente abaixo do peso 2 (15.6) 7 (28.0) Abaixo do peso 5 (38.4) 9 (36.0) Tabagismo atual 8 (61.5) 15 (60.0) 0.93** Uso de drogas ilícitas 1 (7.7) 3 (12.5) 0.56** Alcoolismo- número de dias/semana, média ± DP

3.8 ± 3.3

3.4 ± 2.8

0.70**

TB= tuberculose; HTLV-1= virus humano linfotrofico tipo 1; DP = desvio padrão *Teste T Student ** Teste de Pearson x2 Com base na cor da pele auto-referida foi observada uma maior tendência de negros entre

os casos (50%) do que no grupo controle (25%) e uma maior tendência a permanência hospitalar

entre os controles do que nos casos, mas não houve diferença significante entre estas variáveis

nestes dois grupos. A freqüência do uso de tabaco, álcool e drogas ilícitas foi similar nos dois

grupos. A freqüência de pacientes abaixo do peso, que foi determinada pelo índice de massa

corpórea (IMC) abaixo de 18.4, foi muito alta em ambos os grupos: 54% nos pacientes

coinfectados e 64% nos pacientes com tuberculose.

42

As manifestações clínicas, a resposta de hipersensibilidade tardia ao PPD e a presença e

quantificação do bacilo álcool ácido resistente no escarro dos casos e controles são mostradas na

tabela 2.

Tabela 2. Características clínicas, resposta ao PPD e baciloscopia nos casos (pacientes com TB e infecção pelo HTLV-1) e controles (pacientes com TB sem infecção pelo HTLV-1)

Características clínicas e laboratoriais

Casos (n=13) n (%)

Controles (n=25) n (%)

Valor de P

Sintomas Febre 11 (84.6) 21 (84.0) 0.67 Astenia 13 (100) 25 (100) - Anorexia 11 (84.6) 21 (84.0) 0.35 Perda de peso 11 (100) 22 (95.7) - Duração de sintomas prévios p/ hospitalização 0.07

<2 meses 3 (30.0) 16 (64.0) > 3 meses 7 (70.0) 9 (36.0)

Hospitalização prévia p/ TB 6 (46.2) 7 (28.0) 0.26 Tratamento prévio p/ TB 7 (53.8) 12 (48.0) 0.21 Historia de abandono de tratamento 6 (66.7) 7 (28.0) 0.45

Exames laboratoriais PPD positivo 10 (76.9) 14 (63.6) 0.71 Média PPD (mm) entre teste PPD positivo t, ± DP 12.9 ± 4.0 10.5 ± 4.8 0.23 Carga bacilar 0 2 (15.4)* 0 (0) 1+ 5 (38.4) 11 (44.0) 2+ 2 (15.4) 3 (12.0) 3+ 4 (30.8) 11 (44.0)

TB= tuberculose; HTLV-1= vírus linfotrofico humano tipo 1; DP = desvio padrão Os dois pacientes estavam sendo tratados para tuberculose por um mês previamente a admissão. A baciloscopia era positiva antes da terapia. Teste de Pearson x2 A presença de febre, astenia, anorexia e perda de peso foi similar nos dois grupos (P>0,05).

Houve uma tendência para uma maior duração dos sintomas entre os casos do que nos controles.

Duração dos sintomas acima de 3 meses foi observado em 70% dos coinfectados e em 36% dos

pacientes somente com tuberculose (P=0,07). A frequência de internações hospitalares e história

de tuberculose prévia foi semelhante nos dois grupos. Nos pacientes com tuberculose e HTLV-1

abandono de tratamento para tuberculose (46,2%) foi maior do que no grupo controle (28%), mas

esta diferença (P=0,45) não foi estatisticamente significante. Embora não tenha sido questionado

as causas relativas ao abandono do tratamento, baseado nos dados do presente estudo o abandono

não se relacionou com efeitos adversos aos tuberculostático, desde que a frequência de reações

43

adversas não foi maior nos indivíduos co infectados pelo HTLV-1 do que nos sem infecção pelo

vírus. Não houve diferença com relação a freqüência de resposta ao PPD como também ao

tamanho da enduração. Em ambos os grupos a maioria dos pacientes apresentaram reação positiva

ao teste tuberculínico. O diagnóstico de tuberculose em todos os pacientes foi feito pela

identificação do bacilo álcool ácido resistente no escarro e pela cultura para M.tuberculosis.

Todavia em dois pacientes com HTLV-1 e tuberculose na data da admissão no HEOM os mesmos

já vinham fazendo uso da terapia anti-tuberculosa por 28 e 36 dias, e ambos nesta época já

apresentavam escarro negativo para o bacilo álcool ácido resistente. Estes 2 pacientes tinham

baciloscopia e cultura positiva antes do início do tratamento e a admissão destes pacientes foi

devida a toxicidade pelas drogas anti-tuberculose. Houve uma tendência para uma maior carga

bacilar nos pacientes com tuberculose sem HTLV-1 do que nos pacientes coinfectados com

M.tuberculosis e HTLV-1.

Os achados das radiografias do tórax nos dois grupos estão mostrados na tabela 3.

Tabela 3. Comparação dos RX entre os casos (pacientes com TB e infecção pelo HTLV-1) e controles (pacientes com TB sem infecção HTLV-1)

Achados radiológicos

Casos (n=13) n (%)

Controles (n=25) n (%)

Valor de P

Fibrose 7 (53.8) 12 (48.0) Atelectasia 7 (53.8) 13 (52.0) Espessamento pleural 5 (38.5) 8 (32.0) Cavidade 9 (69.0) 21 (84.0) Destruição parenquimatosa 2 (15.3) 1 (4.0) Derrame pleural 1 (7.7) 1 (4.0)

> 0.05

Teste de Mann-Whitne

Os achados mais comuns foram fibrose, atelectasias, espessamento pleural e cavidades.

Todos estes achados foram similares em ambos os grupos. A freqüência de pacientes com

cavidades foi de 84% nos pacientes com somente tuberculose enquanto foi de 69% nos pacientes

com HTLV-1 e tuberculose. No entanto, destruição do tecido pulmonar foi 3,5 maior nos casos do

que nos controles.

44

Considerando que 2 pacientes com tuberculose e HTLV-1 já vinham em uso de drogas

tuberculostáticas por ocasião da entrada no presente estudo, a análise estatística relativa aos

aspectos clínicos, bacteriológicos e radiológicos foi também realizada excluindo estes dois casos.

Todavia não foi detectada mudança na significância estatística.

O tratamento para a tuberculose foi similar em ambos os grupos. A maioria dos pacientes

recebeu rifampicina, isoniazida e pirazinamida. Em 33,3% dos casos e em 28% dos controles os

pacientes receberam o etambutol em adição a estas drogas. Drogas alternativas foram dadas para

15,4% dos casos e para 8 % dos controles.

A tabela 4 mostra a freqüência dos pacientes que continuavam eliminando bacilos após 10 e 20

dias após instituída terapia. Enquanto no dia 10 45,5% dos casos ainda tinham bacilo álcool

resistente no escarro, 80% dos controles continuavam eliminando o bacilo. No dia 20 somente

36,4% dos pacientes com HTLV-1 e tuberculose tinham baciloscopia positiva, mas o bacilo ainda

estava presente em 76% dos pacientes com tuberculose (P=0.02).

Tabela 4. Freqüência de pacientes com escarro positivo para o bacilo álcool resistente durante a terapia para tuberculose Dia da Baciloscopia

Número e percentual de pacientes com escarro positivo

HTLV-1 + TB TB Valor de P Dia 0 11 25 - Dia 10 5 (45.5%) 20 (80%) 0.04 Dia 20 4 (36.4%) 19 (76%) 0.02 Teste exato de Fisher

As principais reações adversas observadas durante o tratamento no período da admissão

foram hepatotoxicidade e intolerância gástrica (náuseas, dor abdominal e vômitos) registrados

respectivamente em 38,5% e 23,1% nos casos e em 28% e 36% dos controles (P=0.05). Enquanto

óbito foi observado em 2 (15,4%) dos pacientes com HTLV-1 e tuberculose, nenhum paciente

morreu no grupo que tinha apenas tuberculose durante o período de admissão no hospital. Os

óbitos ocorreram em uma mulher e um homem. Em ambos havia cavidades, fibrose, atelectasia e

perda grande de tecido pulmonar na radiografia do tórax, e o óbito foi em decorrência de

45

insuficiência respiratória em um caso e sepse no outro. Em nenhum destes dois casos foi

documentado hepatite medicamentosa ou outra reação adversa a droga que justificasse o óbito.

A produção de citocinas (TNFα e INFγ) em culturas de células mononucleares dos

pacientes com tuberculose coinfectados ou não com o HTLV-1, não estimuladas ou estimuladas

com o PPD está mostrada na gráfico 1. Nas culturas sem estímulo a mediana e variação da

produção de TNFα foi de 368 pg/mL (128 – 5.527 pg/mL) nos pacientes com tuberculose e

HTLV-1 e de 73 pg/mL (0-738 pg/mL) nos pacientes somente com tuberculose (p=0.004). Nas

culturas estimuladas com PPD a mediana e variação da produção de TNF-α, 0 pg/mL (0-2295

pg/mL), foi menor (p= 0.01) nos pacientes com tuberculose e HTLV-1 do que nos pacientes

somente com tuberculose 386 pg/mL (0-3.847 pg/mL), gráficos 1A e 1B. A produção espontânea

de INFγ nos casos, 732 pg/mL (0-2.677 pg/mL) foi maior (p=0.04) do que em pacientes somente

com tuberculose, 15 pg/mL (0-444 pg/mL).

Não houve diferença na produção de INF-γ em culturas estimuladas com PPD entre os dois

grupos, gráficos 1C e 1D. Não houve diferença (p> 0.05) na produção de IL-10 tanto em culturas

não estimuladas como estimuladas com PPD e a produção destas citocinas não foi detectada na

maioria (70%) dos pacientes coinfectados e em 45% dos pacientes somente com tuberculose.

Também a adição do anticorpo monoclonal anti- IL 10 não aumentou a produção de INF-γ ( dados

não mostrados). Dos 2 pacientes que evoluíram para o óbito, a avaliação da resposta imune só foi

realizada em um dos casos, neste, o padrão da resposta foi similar ao observado nos outros

pacientes com HTLV-1 e tuberculose.

46

Gráfico 1. Produção de citocinas (TNF-α e INF-γ em culturas de células

mononucleares de pacientes com tuberculose coinfectados ou não pelo HTLV-1

não estimuladas ou estimuladas com PPD.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

*p=0.004

TB(n=22)

TB + HTLV-1 (n=11)

Pro

duçã

o es

pont

ânea

de

TNF-

(pg/

ml)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

*p=0.01

TB(n=22)

TB + HTLV-1 (n=11)

Pro

duçã

o de

TN

F- (p

g/m

l)ap

ós e

stím

ulo

com

PP

DA B

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

*p=0.004

TB(n=22)

TB + HTLV-1 (n=11)

Pro

duçã

o es

pont

ânea

de

IFN

- (p

g/m

l)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

*p=0.3

TB(n=22)

TB + HTLV-1 (n=11)

Pro

duçã

o d

e IF

N-

(pg/

ml)

após

est

ímul

o co

m P

PDC D

Teste de Mann Whitney

A expressão de RNA mensageiro de IL-12 e a capacidade da IL-12 de aumentar a produção de

INF-γ e mostrada no gráfico 2

47

Gráfico 2. Expressão de RNA mensageiro de IL-12 em células mononucleares

de controles soronegativos e de pacientes com tuberculose com ou sem

coinfecção pelo HTLV-1 não estimuladas ou estimuladas com PPD e avaliação

da capacidade de IL-12 em aumentar a produção de INF- γ.

0

20

40

60

80

100 Controles

TB

TB + HTLV-1

p=0.055

p=0.04

A

Expres

são de

RNAm

para

IL-12 (U

R)

0

500

1000

1500

2000 TB (n=22)

meio PPD 0,5 g IL-12 + PPD 0,5 g

*p<0.01B

IFN- (p

g/ml)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

TB + HTLV-1 (n=11)

meio PPD 0,5 g IL-12 + PPD 0,5 g

*p<0.05

* Kruskal-Wallis

C

IFN- (p

g/ml)

A expressão de RNA mensageiro da IL-12 em culturas não estimuladas em controle sadios

soronegativos para o HTLV-1 foi maior (p=0.04) do que nos indivíduos com tuberculose e HTLV-

1e também pacientes com tuberculose e HTLV-1 como nos pacientes somente com tuberculose, a

adição de IL-12 aumentou a produção de INF-γ (p=0.05), gráfico 2B e 2C.

48

VII. DISCUSSÃO

___________________________________________________________

A associação entre HTLV-1 e tuberculose é amplamente documentada, mas pouco se sabe

como o HTLV-1 aumenta a susceptibilidade para a infecção pelo M.tuberculosis e como a

infecção viral interfere no curso clínico da tuberculose 26,38,65, tornando a doença mais grave e

associada com alta taxa de mortalidade 89. No presente estudo realizado em um hospital de

referência para doenças respiratórias em Salvador- Bahia, no qual o curso clínico, aspectos

bacteriológicos e imunológicos foram avaliados em pacientes com tuberculose coinfectados ou

não com o HTLV-1 foi confirmado que a gravidade da tuberculose avaliada pela mortalidade no

decorrer do internamento hospitalar foi maior nos pacientes coinfectados pelo HTLV-1 do que nos

casos somente com tuberculose. Adicionalmente, os achados radiológicos, o estudo da resposta

imunológica e a avaliação da intensidade da carga bacilar assim como a negativação da

baciloscopia, contribuíram para melhor entender como a infecção pelo HTLV-1 influencia a

apresentação da tuberculose.

O estudo da coinfecção do HTLV-1 com outros agentes infecciosos é assunto de grande

relevância desde que tem sido observado não só uma maior prevalência de pneumonia, infecções

causadas por fungos, helmintíases e infecção pelo M.tuberculosis, como também tem sido

mostrado que a infecção pelo HTLV-1 aumenta a gravidade da estrongiloidíase, escabiose e

tuberculose 12,25,26,65,83,94. Alternativamente a coinfecção com o HTLV-1 pode atenuar as

manifestações clínicas de outras doenças 95. Embora na maioria destas situações, o mecanismo

pelo qual a infecção pelo HTLV-1 interfere em outras infecções não tenha sido estabelecido,

avanços têm sido alcançados no entendimento desta associação em pacientes com helmintíase.

No caso específico da estrogiloidíase é conhecido que a infecção pelo HTLV-1 reduz a eficácia

49

terapêutica de drogas anti-helmínticas contra o S.estercoralis 94,105, e existe uma diminuição da

resposta imune Th2 em pacientes coinfectados pelo HTLV-1 e o S.estercoralis 82,94. Como a

eliminação de larvas do S.estercolaris no intestino depende da IL-4 e IL-13 que aumentam o

peristaltismo e o fluxo intestinal, a redução da produção destas citocinas favorece a ocorrência da

autoinfecção 20,94. Adicionalmente a diminuição da produção de IL-5 e de IgE específica contra o

S.estercolaris observada nestes casos diminui a capacidade de defesa dos eosinófilos e dos

mastócitos respectivamente, permitindo a disseminação do parasito 20. Esta redução da resposta

Th2 se relaciona com a exagerada resposta imune Th1 observada na infecção pelo HTLV-1 desde

que há uma correlação inversa entre a produção de INF-γ, IgE total e IgE específica contra o

S.estercolaris assim como uma correlação inversa entre as concentrações de INF-γ e IL-5 82,94.

Tem também sido observado nesta coinfecção um aumento de células T regulatórias o que poderia

também contribuir para a redução da resposta imune ao S.estercolaris 74. Se por um lado o HTLV-

1 piora o curso da estrogiloidíase, indivíduos coinfectados pelo HTLV-1 e o Schistosoma mansoni

tem uma doença mais atenuada, desde que estes pacientes apresentam menos fibrose hepática do

que os pacientes somente infectados pelo S.mansoni 95. Como a fibrose hepática é associada com a

produção de IL-4 e IL-13 e a infecção pelo HTLV-1 diminui a produção destas citocinas, a

capacidade da infecção pelo HTLV-1 em atenuar a patologia associada a esquistossomose é

atribuída ao papel da exagerada resposta Th1 em reduzir a produção de IL-4 e IL-13 e

consequentemente reduzir o grau de fibrose hepática 95.

No caso da associação entre o HTLV-1 e o M.tuberculosis enquanto existem muitas evidências

que a infecção pelo HTLV-1 aumenta o risco para a tuberculose 26,38,65 muito pouco se sabe sobre

como é o curso clínico da tuberculose nos pacientes infectados com HTLV-1. Em um estudo

retrospectivo foi mostrado que óbito foi significativamente maior nos pacientes com tuberculose e

50

HTLV-1 do que nos pacientes que tinham somente tuberculose 89. Todavia nenhuma informação

com relação a dados microbiológicos, radiológicos ou clínicos foi registrada, sendo apenas

informado que a causa de óbito nestes casos foi relacionada à tuberculose. No presente estudo

aspectos epidemiológicos, clínicos, radiológicos e imunológicos foram comparados em pacientes

admitidos somente com tuberculose ou com tuberculose associada com HTLV-1. Não houve

diferença entre os dois grupos com relação à cor da pele, renda, história pregressa de tuberculose

ou de abandono ao tratamento da tuberculose. Não houve também diferença com relação ao

consumo de álcool ou ao uso de tabaco, nem nas manifestações clínicas entre os dois grupos. Uma

crítica importante ao presente estudo foi da utilização de pacientes admitidos devido à tuberculose.

O tratamento para tuberculose é usualmente feito nos pacientes em nível ambulatorial, e admissão

destes casos está relacionada a fatores tais como a gravidade da tuberculose, reações adversas

graves as drogas antituberculosas, história de abandono de tratamento e documentação de

multirresistência ao M.tuberculosis 101. Em nosso caso em adição a presença de um ou mais

fatores, uma grande percentagem de pacientes encontrava-se abaixo do peso e muitos deles

estavam desnutridos, o que pode também influenciar o curso clínico da tuberculose. Portanto,

estudos similares devem ser realizados em pacientes acompanhados ambulatoriamente com a

finalidade de comparar manifestações clínicas e radiológicas em pacientes com tuberculose

coinfectados ou não com o HTLV-1, mas sem história prévia de tratamento para tuberculose e sem

desnutrição. Todavia como a freqüência destes fatores que levaram a internação destes pacientes

e que podem tornar a tuberculose mais grave foi similar nos dois grupos, o mais provável é que as

variáveis clínicas diferentes que foram documentadas no presente estudo estejam relacionadas

com a infecção pelo HTLV-1. Destas, o achado mais importante foi a ocorrência de óbito em dois

casos, sendo um devido a insuficiência respiratória e outro a sepse, ambos nos pacientes com

51

HTLV-1 e tuberculose. A mortalidade em indivíduos infectados no presente trabalho foi bem

menor que a anteriormente registrada em pacientes coinfectados pelo HTLV-1 admitidos no

Hospital Santo Antonio 89. Ambos os estudos foram feitos em Salvador, mas é possível que a

população atendida nestes dois hospitais tenham características diferentes com relação ao estado

nutricional e aos hábitos de vida. Também pode ter influenciado esta diferença as facilidades

hospitalares para o tratamento da tuberculose desde que o presente estudo foi realizado mais de

dez anos após o relato pioneiro de mortalidade associada a tuberculose em pacientes infectados

pelo HTLV-1. Estudos prévios têm mostrado que indivíduos infectados com HTLV-1 têm uma

menor resposta imune in vivo e in vitro ao PPD 66,111,121. A principal hipótese para justificar estes

achados é que o HTLV-1 diminuindo a resposta imune ao M. tuberculosis não somente aumenta a

susceptibilidade ao M. tuberculosis mas também torna a tuberculose mais grave. Os resultados

aqui apresentados, não mostraram diferença na frequência dos pacientes que responderam ao PPD

assim como no tamanho da reação quando casos e controles foram comparados. Estes dados

diferem da literatura, mas a população estudada no presente estudo foi muito diferente do que as

analisadas em estudos prévios. Enquanto nos outros estudos os dados foram gerados em

indivíduos infectados pelo HTLV-1 sem tuberculose ativa ou mesmo sem história de tuberculose

ou vacinação com BCG 111.121, aqui todos os pacientes tinham tuberculose ativa. Além disso, os

estudos mostrando uma diminuição da resposta ao PPD in vivo foram predominantemente

realizados no Japão um país que teve a tuberculose controlada há mais de 60 anos. Portanto

dois fatores devem ser considerados na interpretação destes resultados prévios. Primeiro, que a

memória imunológica nunca tenha existido porque a maioria dos indivíduos nunca teve

tuberculose ou até mesmo nunca foi infectada pelo bacilo. Segundo, não se pode excluir que em

pacientes com HTLV-1 e que tenham tido contato com a M.tuberculosis a erradicação

micobactéria foi mais rápida do que nos indivíduos soronegativos e conseqüentemente as células

T

52

de memória tenham desaparecidos desde que novos estímulos não ocorreram desde que a

tuberculose foi erradicada naquele país.

Os achados radiológicos e bacteriológicos do presente estudo também não dão suporte a

hipótese de que a susceptilidade e a gravidade da tuberculose em indivíduos infectados pelo

HTLV-1 seja devido a uma diminuição da resposta imune ao M.tuberculosis. O principal

mecanismo de defesa contra patógenos intracelulares incluindo o M.tuberculosis é a ativação de

macrófagos por INF-γ produzido principalmente pelas células CD4+ e pela toxicidade mediada

por células CD8+ 11,112. Esta resposta inflamatória leva a formação do granuloma e posteriormente

lesão tecidual com desenvolvimento de cavidades e eliminação da micobactéria no esputo. Em

pacientes com tuberculose e infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) há uma

diminuição da resposta TH1 e consequentemente menor formação de granuloma 11. Por esta razão

a radiografia de tórax pode se apresentar com manifestações atípicas e com menor freqüência de

cavidades 41. No presente estudo, os achados radiológicos encontrados em pacientes coinfectados

pelo HTLV-1 e M.tuberculosis foram semelhantes aos encontrados em indivíduos

imunocompetentes. A frequência de cavidades, atelectasias e fibroses pulmonares foram

semelhantes nos dois grupos.

Verdonck et al em um estudo retrospectivo que comparou pacientes com HTLV-1 e

tuberculose com pacientes somente com tuberculose, observaram uma maior carga bacilar nos

pacientes coinfectados 118. No nosso material não houve diferença entre a carga bacilar nos dois

grupos, adicionalmente, a negativação da baciloscopia foi mais rápida nos indivíduos

coinfectados. Estes dados microbiológicos são também contrários a ideia de que a gravidade da

tuberculose em pacientes infectados pelo HTLV-1 seja relacionada a uma diminuição da resposta

imune celular à antígenos do M.tuberculosis. Embora o mecanismo envolvido na mais rápida

negativação da baciloscopia nos pacientes com tuberculose e HTLV-1 não tenha sido motivo do

presente estudo, é possível que a forte resposta inflamatória com grande produção de INF-γ

53

relacionada à infecção pelo HTLV-1, possa contribuir para a destruição da micobactéria por

aumentar a atividade microbicida dos macrófagos.

Estudos in vitro têm apontado para uma diminuição na proliferação de linfócitos e na

secreção de citocinas em culturas estimuladas com antígeno nos indivíduos infectados com

HTLV-1 comparados com controles 66,110. A avaliação da resposta imune para outros antígenos

não é simples na infecção pelo HTLV-1. Como as células T estão sempre ativadas, as culturas sem

estimulação mostram uma alta resposta proliferativa e altos níveis de citocinas 20,102,103. Isto pode

tornar difícil a interpretação dos resultados, quando um antígeno de memória é testado. Todavia

Mascarenhas et al estudando HTLV-1 com baixa resposta espontânea proliferativa mostraram que

há uma diminuição na proliferação de linfócitos a antígenos de memória incluindo aí antígenos de

M.tuberculosis 66. Este estudo também foi realizado em indivíduos sem história prévia ou

atividade de tuberculose. No nosso estudo a proliferação de linfócitos não foi avaliada, mas os

achados com relação a produção de citocinas trouxeram contribuições importantes com relação ao

entendimento da patogênese da coinfecção entre o HTLV-1 e o M. tuberculosis. Foi observada

uma diminuição da expressão da IL-12 nos pacientes com tubérculos e em relação aos controles

não infectados, mas esta alteração ocorreu tanto em pacientes com infecção pelo HTLV-1 como

nos não infectados. Adicionalmente a adição exógena da IL-12 aumentou a produção de IFN-γ de

modo similar nos dois grupos. Com relação a resposta imune adaptativa a produção de INF-γ em

culturas não estimuladas foi maior nos pacientes coinfectados do que nos indivíduos somente com

tuberculose. Este é um achado esperado desde que a produção de citocinas em indivíduos

infectados pelo HTLV-1 em culturas não estimuladas é maior do que em controles soronegativos

20. Com referência a culturas estimuladas com PPD a produção de INF-γ foi similar tanto em

pacientes com tuberculose e HTLV-1 como nos pacientes somente com tuberculose, indicando

que a principal citocina envolvida na ativação de macrófagos e destruição de patógenos

intracelulares 99,114 não estava reduzida. A possibilidade de que uma maior produção de IL-10

54

como já observada em indivíduos infectados pelo HTLV-1 20 pudesse interferir com a produção de

IFN- foi também testada. Além de não documentarmos uma maior produção de IL-10 nos

indivíduos com tuberculose e HTLV-1 a neutralização in vitro de IL-10 não aumentou a produção

de IFN- .

Um achado importante no presente estudo foi a documentação de que a produção de TNF-α em

culturas estimuladas com o PPD foi menor em indivíduos com tuberculose e HTLV-1. Ênfase tem

sido dada ao papel da resposta imune inata no controle da M.tuberculosis e quimiocinas assim

como células e citocinas da resposta imune inata participam não só da destruição da micobactéria

e da formação de granuloma como também contribuindo para o desenvolvimento de uma resposta

adaptativa adequada contra o M.tuberculosis 51. Neste contexto o TNF- tem participação

importante na formação do granuloma e também em impedir o aparecimento da tuberculose em

pacientes com tuberculose latente 2. A reação adversa mais grave observada em pacientes em uso

de anticorpo monoclonal anti TNF- para doenças reumáticas sistêmicas foi o desenvolvimento da

tuberculose nestes pacientes 120. Neste contexto é possível que esta diminuição da produção de

TNF- observada em culturas estimuladas com o PPD possa representar um mecanismo

importante da explicação da maior susceptibilidade à M.tuberculosis em indivíduos infectados

pelo HTLV-1.

A diferença mais marcante entre os casos e os controles com relação aos aspectos

microbiológicos e clínicos foi que a negativação da baciloscopia ocorreu mais rápida nos

pacientes com tuberculose coinfectados com HTLV-1 e a ocorrência de óbito só foi observada

entre os pacientes com tuberculose e HTLV-1. A associação entre a baixa carga bacilar e

gravidade da tuberculose tem sido observada em camundongos com deficiência do receptor para

IL-27 46. A IL-27 modula negativamente a resposta imune e animais que tem o gene do receptor

para IL-27 depletados tem uma exagerada resposta inflamatória com forte resposta Th1. Esta

resposta embora controle a multiplicação da bactéria, causa importante dano ao tecido pulmonar,

levando a uma

55

diminuição da sobrevivência dos animais depletados do receptor para IL-27, em comparação com

animais selvagens infectados com M.tuberculosis 46.

A associação entre HTLV-1 e tuberculose é altamente importante do ponto de vista

epidemiológico, clínico e imunológico. Estas são infecções comuns em determinados países e a

infecção pelo HTLV-1 aumenta a prevalência da tuberculose e torna a tuberculose mais grave. Do

ponto de vista imunológico um importante aspecto é o aumento de susceptibilidade a tuberculose e

da gravidade da doença em um ambiente com uma resposta inflamatória exagerada como a

provocada pela infecção pelo HTLV-1. Nossos dados sugerem que a redução da produção de

TNF- em culturas estimuladas com antígeno de M.tuberculosis sinaliza para um aumento da

susceptibilidade a infecção. Por outro lado, a produção elevada de IFN- no curso desta coinfecção

pode contribuir para o desenvolvimento da lesão tecidual mesmo havendo controle da

multiplicação da M.tuberculosis.

56

VIII- PROPOSTA DO ESTUDO

___________________________________________________________

Título: Aspectos clínicos, epidemiológicos e imunológicos da associação entre o HTLV-1 e a

Tuberculose.

Objetivos: 1)Determinar a prevalência da tuberculose em indivíduos infectados pelo HTLV-1

2) Avaliar se a associação com a tuberculose modifica o curso clínico da infecção pelo

HTLV-1

3) Avaliar aspectos da resposta imune inata em pacientes com tuberculose e HTLV-1

Fundamentação teórica:

1) Prevalência da tuberculose em indivíduos infectados pelo HTLV-1

A associação entre a tuberculose e o HTLV-1 é bem documentada tanto em estudos realizados

com base em pacientes admitidos em hospitais com diagnóstico de tuberculose (de Lourdes 2009)

como em estudos de base populacional (Marinho 2005, Verdonk 2007 ). É conhecido, baseado

nestes estudos, que a infecção pelo HTLV-1 aumenta de 2 a 4 vezes a chance de desenvolver

tuberculose (Marinho 2005, Verdonk 2007,de Lourdes 2009). Entretanto, todos estes estudos

foram realizados em indivíduos com ou sem diagnóstico de tuberculose pulmonar nos quais a

sorologia para a infecção para o HTLV-1 foi determinada. Pouco se sabe sobre a prevalência da

tuberculose, assim como da tuberculose latente em indivíduos infectados pelo HTLV-1. A nossa

primeira hipótese é que a prevalência de tuberculose ativa ou pregressa assim como de

tuberculose latente, é mais elevada entre os indivíduos infectados com o HTLV-1 do que na

população geral.

57

2)Influência da tuberculose nas manifestações clínicas da infecção pelo HTLV-1

Não há registro na literatura sobre a capacidade da tuberculose em influenciar as

manifestações clínicas da infecção pelo HTLV-1. Com relação a coinfecção HIV e M.tuberculosis

é bem conhecido que tanto a infecção pelo HIV aumenta a susceptibilidade e a gravidade da

tuberculose (Pedral-Sampaio 1997,Dye 1999, Matos 2007) como a tuberculose acelera o

desenvolvimento de AIDS em indivíduos infectados pelo HIV ( Belo 1996, Dye 1999). Admite-se

que esta progressão deva-se ao fato da infecção pelo M.tuberculosis induzir ativação e

proliferação celular o que favorece a multiplicação viral. As principais doenças associadas a

infecção pelo HTLV-1 são a ATLL (Leucemia/linfoma de células T do adulto) e a

HAM/TSP(Mielopatia associada ao HTLV-1 ou Paraparesia espástica tropical)(Osame 2002,

Yoshida 2010). Todavia como estas doenças só ocorrem em menos de 5% dos indivíduos

infectados pelo vírus e a progressão da infecção para estas patologias é lenta, ocorrendo após

dezenas de anos da infecção pelo vírus, é difícil baseado nestes desfechos, determinar se a

coinfecção pelo M.tuberculosis pode modificar o curso clínico da infecção pelo HTLV-1. Mais

recentemente, tem sido mostrado que diferente do conceito que o HTLV-1 é associado com baixa

morbidade, um grande percentual de indivíduos infectados apresentam sinais e sintomas ou

propriamente doenças que são associadas ao vírus. Em um estudo de coorte transversal Caskey e

colaboradores compararam a frequência de sinais e sintomas em 115 indivíduos portadores de

HTLV-1 com 115 doadores de banco soronegativos pareados por idade ± 5 anos e sexo com o

grupo teste. Foi observado que indivíduos portadores de HTLV-1 apresentavam uma maior

freqüência de boca seca, periodontite crônica, gengivite, noctúria, urgência miccional,

incontinência urinária, disfunção erétil, fraqueza muscular e parestesias de membros inferiores

do que o grupo soronegativo. Com referência ao exame neurológico foi tambémfreqüência mais

elevada de hepereflexia e de sinal de Babinsky nos portadores de HTLV-1 do que nos controles

soronegativos.

58

As queixas urinárias de urgência ou urgeincontinência que caracterizam um quadro de bexiga

hiperativa são observadas em 100% de pacientes que tem HAM/TSP (Oliveira 2010) e podem

preceder o desenvolvimento de HAM/TSP em 10 ou mais anos (Araújo 1995). Bexiga hiperativa

assim como disfunção erétil pode ser observada num percentual elevado em indivíduos infectados

pelo HTLV-1, mas que não preencham os critérios de HAM/TSP (Oliveira 2010). A despeito de

disfunção erétil ser uma queixa freqüente na população e poder estar associado a vários fatores

existem evidências que dão suporte aos achados clínicos de que a disfunção erétil nestes pacientes

está relacionada com a lesão na medula espinhal causada pelo vírus HTLV-1: 1- Disfunção erétil é

documentada em todos os indivíduos que tem diagnóstico de HAM/TSP (Oliveira 2010); 2- Existe

uma forte associação entre queixas urinárias e disfunção erétil (Castro 2007b) e uma forte

associação entre disfunção erétil e bexiga hiperativa (Oliveira 2010); 3- Não foi observada

associação entre disfunção erétil e faixa etária no grupo de indivíduos infectados pelo HTLV-1 e

entre os infectados foi freqüente a ocorrência de disfunção erétil grave (Oliveira 2010). Baseado

no que foi apresentado o comprometimento neurológico na infecção pelo HTLV-1 é variável e

vários desfechos podem ser analisados em pacientes que não apresentam HAM/TSP, tais como

hiperreflexia, sinal de Babinsky, disfunção erétil e bexiga hiperativa. Nossos dados preliminares

obtidos na coorte de 13 pacientes com tuberculose e HTLV-1 mostrou que em 4 (30,7 %) havia

queixa de bexiga hiperativa e em 1 caso havia hiperreflexia e presença do sinal de Babinsky. A

segunda hipótese deste trabalho é que a infecção pela tuberculose acelera a doença

neurológica associada ao HTLV-1.

3) Resposta imune em indivíduos com tuberculose e HTLV-1

Os primeiros estudos que avaliaram a influência da infecção pelo HTLV-1 na resposta imune

da tuberculose foram realizados em japoneses infectados pelo HTLV-1. Estes estudos mostraram

que indivíduos infectados pelo HTLV-1 quando comparados com controle soronegativos

59

apresentavam uma menor freqüência de positividade ao teste tuberculínico assim como uma

menor enduração do que indivíduos controles. Estes estudos conduzidos na década de 80 foram

realizados em indivíduos sexagenários, que supostamente tinham sido expostos ao M.tuberculosis,

desde que a erradicação desta doença no Japão passou a ser documentada a partir de 1925.

Estudos in vitro tem também enfatizado a existência de uma diminuição da resposta imune a

antígenos do M.tuberculosis em indivíduos infectados pelo HTLV-1. Por exemplo, foi observada

uma maior freqüência de resposta linfoproliferativa a antígenos de memória entre os quais o PPD

em indivíduos soronegativos para o HTLV-1 do que em indivíduos portadores desta infecção viral

(Mascarenhas 2006). Esta diminuição de resposta imune ao PPD em indivíduos infectados pelo

HTLV-1 já tinha sido observada por Suzuki em 1999, que também mostrou que a diminuição da

resposta linfoproliferativa ao PPD poderia ser restaurada pela adição exógena de IL-12. Um

aspecto importante na análise destes estudos é o fato de que foram realizados em indivíduos nos

quais não se tinha evidencia de exposição ao M.tuberculosis. Nos estudos realizados no Japão

havia a suposição de exposição à M.tuberculosis mas não havia história pregressa de tuberculose.

No estudo de Mascarenhas et al (2006) os participantes eram brasileiros e como a vacinação com

o bacilo Calmett-Guerin (BCG) é obrigatória admite-se que a população foi exposta ao BCG.

Todavia, não havia relato se estes indivíduos tinham história pregressa de tuberculose e como o

teste tuberculínico não foi realizado a ocorrência de tuberculose latente não foi determinada. No

nosso trabalho não houve diferença nem com relação a positividade ao PPD nem ao tamanho da

reação entre os pacientes com HTLV-1 e tuberculose e os pacientes com tuberculose sem HTLV-1

Neste mesmo trabalho não houve diferença na produção de INF-γ, IL-12 e IL-10 entre os

pacientes com tuberculose e HTLV-1 quando comparados com o grupo com tuberculose sem

HTLV-1 em culturas estimuladas com PPD. A IL-10 é produzida em concentrações elevadas em

indivíduos infectados pelo HTLV-1 (Carvalho 2001). A produção desta citocina tem também sido

implicada na patogênese da tuberculose pela sua capacidade regulatória na resposta imune Th1

60

(Resende 2006). Todavia no nosso estudo a neutralização da IL-10 não aumentou a produção de

INF-γ em ambos os grupos estudados. Também não observamos diferença entre os pacientes com

tuberculose com ou sem HTLV-1 na carga bacilar. Do ponto de vista radiológico as imagens

apresentavam características granulomatosas e no grupo de pacientes com tuberculose e HTLV-1

havia maior destruição do parênquima pulmonar. Como estes achados de imagens granulomatosas

e destruição do parênquima pulmonar não são compatíveis com o que se observa em indivíduos

imunodeprimidos e a produção de INF-γ foi mais elevada em indivíduos com tuberculose e

HTLV-1 do que nos pacientes somente com tuberculose, concluímos que nem a maior

susceptibilidade à tuberculose nem a gravidade da doença em indivíduos infectados pelo HTLV-1

pode ser imputada a uma deficiência da resposta imune celular. A 3ª hipótese deste estudo é que

o aumento da susceptibilidade à infecção pelo M.tuberculosis em indivíduos infectados pelo

HTLV-1 é devido a um defeito na resposta inata.

Metodologia:

1) População do estudo:

Os indivíduos infectados com HTLV-1 participantes do presente estudo fazem parte de

uma coorte, acompanhados no Ambulatório Multidisciplinar de HTLV-1. Este ambulatório

foi criado em 2001 e nele estão matriculados e são acompanhados cerca de 416 indivíduos

infectados pelo HTLV-1. Destes, 89 tem diagnóstico de HAM/TSP, 127 tem algum tipo de

comprometimento neurológico pela Expanded Disability Status Scale (EDSS=1) (Kurtzke

1983) e 200 são considerados portadores da infecção pelo HTLV-1.

2) Metodologia relacionada ao objetivo 1

2.1.Objetivo 1

Determinar a prevalência da tuberculose em indivíduos infectados pelo HTLV-1

2.2.Tipo do estudo

61

Estudo de corte transversal no qual será avaliado a ocorrência de tuberculose ativa ou

pregressa assim como a positividade do teste intradérmico ao PPD entre os indivíduos

infectados pelo HTLV-1.

2.3.Definição de caso

2.3.1.Tuberculose ativa: tosse persistente por 2 ou mais semanas associada a

documentação de bacilo álcool ácido resistente (BAAR) em pelo menos 2 baciloscopias e

achados radiológicos compatíveis com tuberculose pulmonar.

2.3.2.Tuberculose pregressa: indivíduos com história de passado de tuberculose pulmonar

com achados radiológicos compatíveis com seqüela de tuberculose.

2.3.4. Tuberculose latente: indivíduos assintomáticos respiratórios, sem passado de

tuberculose pulmonar e com PPD reator.

2.4.Desenho do estudo

Participarão do estudo indivíduos infectados pelo HTLV-1 que forem atendidos no

Ambulatório Multidisciplinar de HTLV-1 no período de fevereiro de 2011 a fevereiro de

2012. Todos os participantes responderão a um questionário, serão avaliados do ponto de

vista clínico e neurológico, realizarão exame radiológico e teste intradérmico com PPD.

2.5.Métodos

2.5.1.Exame bacteriológico

A baciloscopia será feita através do exame do escarro corado pela técnica de Ziehl-

Neelsen. A cultura de escarro para o M.tuberculosis será feita utilizando-se meio de cultura

de Lowenstein-Jensen.

2.6.Análise estatística

A prevalência de tuberculose pulmonar ativa, pregressa e latente será determinada

calculando-se a proporção de casos em ralação ao numero total de indivíduos avaliados.

62

3)Metodologia relacionada ao objetivo 2

3.1.Objetivo 2

Avaliar se a infecção pela tuberculose acelera a doença neurológica associada a

infecção pelo HTLV-1.

3.2. Tipo de estudo

Estudo de caso controle avaliando a freqüência de tuberculose nos seguinte grupos:1-

Portadores de HTLV-1;2- Pacientes com disfunção erétil ;3- Pacientes com bexiga hiperativa;4-

Pacientes com anormalidade no exame neurológico;5- Pacientes com HAM/TSP.

3.2.Definição de caso

3.2.1.Portadores de HTLV-1: indivíduos infectados pelo HTLV-1 com EDSS e Osame’s

Motor Disability Score (ODMS) = 0 (Izumo 1996).

3.2.2.Disfunção erétil: indivíduos do sexo masculino com pontuação abaixo de 21 pontos

com base no International Index of Erectile Function (IIFS/5).

3.2.3.Bexiga hiperativa: pacientes com urgência miccional tendo como base o critério da

International Society of Incontinence.

3.2.4.HAM/TSP: Pacientes com ODMS˃ 0 e presença de anticorpos anti-HTLV-1 no líquor.

3.3 Desenho do Estudo

Estudo de caso controle no qual a frequência de tuberculose ativa e de tuberculose latente será

avaliada nos seguintes grupos:1- Pacientes sem HAM/TSP mas com achados neurológicos de

hipereflexia em membros inferiores e sinal de Babinsk; 2- Pacientes sem HAM/TSP mas com

bexiga hiperativa associada ao HTLV-; 3- Pacientes com HAM/TSP.

3.4 Análise estatística

A comparação entre os grupos será feita pelo teste Pearson x2 e a significância estatística

determinada quando o P < 0.05.

63

4. Metodologia Relacionada Ao Objetivo 3

4.1. Objetivo 3

Avaliar aspectos da resposta imune inata em pacientes com tuberculose e HTLV-1.

4.2. Tipo de Estudo de corte transversal comparando aspectos da resposta imune inata em 4

grupos:1) Pacientes com tuberculose e HTLV-1;2) Indivíduos com HTLV-1 sem tuberculose; 3)

Pacientes com tuberculose sem HTLV-1;4) Indivíduos sadios não infectados pelo HTLV-1.

4.3.Definição de caso

Grupo 1:Indivíduos infectados pelo HTLV-1 com história pregressa de tuberculose e evidência

radiológica de tuberculose no passado em indivíduos infectados pelo HTLV-1 com tuberculose

latente.

Grupo 2:Indivíduos infectados pelo HTLV-1 sem tuberculose. Indivíduos com evidência de

infecção pelo HTLV-1 sem tuberculose ativa ou pregressa e com PPD reator.

Grupo3: Indivíduos com tuberculose sem HTLV-1. Pacientes com diagnóstico de tuberculose

documentado pela identificação de BAAR em pelo menos 2 exames de escarro corados pelo

método de Ziehl-Neelsen e com sorologia negativa para o HTLV-1.

Grupo 4: Indivíduos sem tuberculose e sem HTLV-1. Indivíduos sadios sem tuberculose ativa

ou história pregressa de tuberculose com sorologia negativa para HTLV-1.

4.4.Desenho do estudo

Neste estudo de corte transversal a concentração de INF-α, IL-1, IL-6, IL-17 e TNF-α será

determinada no sobrenadante de cultura de sangue total sem estímulo ou estimulado pelo PPD.

Será também avaliado por citometria de fluxo a freqüência de células produtoras destas citocinas.

4.5.Métodos

Cultura de células: sangue total heparinizado (2 mL) será cultivado por 72 hs a 37 °C e 5% de

CO2 sem estímulo ou estimulado com PPD 1 mcg/mL. As citocinas serão determinadas no

sobrenadante de cultura pelo método de ELISA.

64

Citometria de fluxo: Resumidamente, 2,5 x 105 CMSP serão cultivados durante 20 horas em

placas de 24 poços contendo RPMI + 10% AB estimuladas ou não com PPD (1 ug/mL).

Brefeldina A será adicionada após 24 hs de cultivo. As células serão colhidas com PBS gelado

contendo azida e marcadas com anticorpos monoclonais específicos (anti-CD4, anti-CD8, anti-

CD14 e anti-CD25/Foxp3). Após fixação com formaldeído, a permeabilização das células será

feita com a solução de saponina e corada por 30 minutos à 4° C usando anticorpos anti-citocinas

(anti-IFN-γ, anti-TNF-α, anti- IL-1, anti-IL-6, anti-IL-17) conjugados PE ou FITC (PharMingen).

As preparações serão lavadas e analisadas. FACScalibur e CELL Quest serão utilizados para

detecção do sinal fluorescente e análise dos dados (Becton-Dickinson).

4.6. Cálculo amostral

Baseado nos nossos dados preliminares a nossa estimativa é que a produção de TNF-

será 3 vezes mais elevada em pacientes com tuberculose sem HTLV-1 do que em pacientes com

tuberculose e infectados pelo HTLV-1. Com o poder de 80% e um alfa de 0.05 serão necessários

um total de 80 indivíduos sendo 20 por grupo para obtermos uma significância estatística.

4.7. Análise estatística

A comparação da produção de citocinas entre 2 grupos de pacientes será feito pelo teste de

Mann-Whitney. A comparação entre os quatro grupos será feita pelo teste de Kruskal-Wallis.

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_____________________________________________________________________________________

68

IX.CONCLUSÕES

- A semelhança entre os achados radiológicos de pacientes com tuberculose e HTLV-1 com os

encontrados em pacientes somente com tuberculose sugere que a patologia da tuberculose em

pacientes coinfectados não está associada com uma supressão da resposta imune celular.

- A ausência de diferença entre a carga bacilar de pacientes com tuberculose e HTLV-1 e em

pacientes somente com tuberculose e a observação de que nos indivíduos coinfectados a

negativação da baciloscopia ocorreu mais rapidamente sugere que a patologia relacionada à

tuberculose nestes indivíduos não se associa com uma incapacidade de controlar a proliferação

bacilar.

- Com base na positividade e no tamanho da reação ao teste tuberculínico e pela produção de

INF-γ em culturas estimuladas com o PPD não existe diminuição da resposta Th1 à antígenos do

M.tuberculosis em pacientes com tuberculose e HTLV-1.

- Enquanto a susceptibilidade ao M.tuberculosis em indivíduos infectados pelo HTLV-1 pode

estar relacionada a uma diminuição da produção de TNF-α em culturas estimuladas com o PPD, a

gravidade da tuberculose nesta coinfecção pode dever-se a uma exagerada resposta inflamatória

devido a infecção pelo HTLV-1.

69

X. SUMMARY

___________________________________________________________

Introdution : The human T cell lymphotropic virus tipe I (HTLV-1) infects predominantly CD4+

cells and raises the susceptibility and severity to others infectious diseases. Regarding tuberculosis

it has been shown that HTLV-1 infected individuals have 2 to for 4 fold increased chance to

acquire tuberculosis. Studies in vivo and in vitro have shown a decreased in positivity to PPD and

a decreased lymphocyte proliferation in cultures stimulated with antigens of M.tuberculosis.

However these studies were performed in individuals without evidence of infection by this

mycobacterium and the clinic, bacteriologic and immunologic features in patients with HTLV-1

and tuberculosis have not been well studied.

Objective: To evaluate how HTLV-1 might influence the clinic, bacteriologic and immunologic

features of tuberculosis.

Methodology: A prospective cohort study enrolled 13 cases of tuberculosis associated with

HTLV-1 (cases) and 25 patients with tuberculosis without HTLV-1 (controls), admitted in the

Hospital Especializado Octávio Mangabeira, Salvador-Ba, in order to determine the clinical out

come, bacillary load and negativation of the bacilarry in sputum as well radiologic features.

Additionally, a cross sectional study compared the immunological response in the two groups.

70

Results: There was no difference in the demographic features, clinical manifestations and in vivo

respond to PPD. The radiologic findings were similar in both groups and they were not

expected with those observed findings in immunosuppressed individuals. There was no difference

in the bacillary load among the two groups and the baciloscopy became negative faster in cases

than in the controls. Death (2) only occurred in co-infected patients. The spontaneous INF-γ and

TNF-α production was higher in patients with HTLV-1 and tuberculosis than in patients with

tuberculosis without HTLV-1. While there was no difference in INF-γ production in PPD

stimulated cultures among the two groups, the TNF-α production in PPD stimulated cultures was

lower in patients with tuberculosis and HTLV-1 than in patients with tuberculosis without HTLV-

1.

Conclusions: While the increased susceptibility to M.tubeculosis in HTLV-1 infected individuals

may be due to a decreasing in TNF-α production, severity of tuberculosis in patients co-infected

with HTLV-1 is due to the enhancement in the Th1 inflammatory response.

Key words: Human T cell lymphotropc virus type I; HTLV-1; Tuberculosis; Micobacterium

tuberculosis; Tuberculosis and HTL

71

XI.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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120-Wallis ND, Heneine W, Carr JK, Garcia AD, Shanmugam V, Tamoufe U, Torimiro JN,

Prosser AT, Lebreton M, Mpoudi-Ngole E, McCutchan FE, Birx DL, Folks TM, Burke DS,

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ANEXO I

Questionário

Projeto “HTLV 1 X Tuberculose”

NOME DO AVALIADOR:

Q1. Número de (ORDEM): _________________ Q2. (REGISTRO): _______________

Identificação:

Q3. (NOME) do paciente:___________________________________________________________________________________

Q4. (ENDEREÇO): ________________________________________________________________________________________

Q5. (BAIRRO):_________________________________________________________Q6.(CIDADE)______________________

Q7. Ponto de referência(PONTOREF):________________________________________________________________________

Q8. (TELEFONE)s:________________________________________________________________________________________

Q9. Renda Familiar:

1. [ ] < 1 Salário mínimo 2. [ ] Salário mínimo 3. [ ] > 1 e< 3 Salários mínimo 4. [ ] > 3 Salários mínimo

Dados clínicos da admissão (ou primeiras 24 horas do internamento)

Q10. (GÊNERO): 1. [ ] masc. 2. [ ]fem. Q11.(IDADE) em anos:_________

Q12.(COR) 1. [ ]branco 2. [ ]mulato 3. [ ]negro 4. [ ] outros

Q13. Data do (INTERNAM)ento:______/______/_______.

Q14. Motivo do Internamento (MOTIVINT): 1. [ ]hemoptise 2. [ ]dispnéia 3.

[ ]falência terapêutica 4. [ ]queda/estado geral 5. [ ]efeito colateral/drogas 6. [ ]cirurgia 7. [ ]social

8. [ ]outros __________________________ 9. [ ]sem informação

Q15. Internamento anterior por TB (INTERANT): 1. [ ]sim 2. [ ]não 3. não sabe

Q16. Tratamento anterior por TB (TRATANT): 1.[ ]sim 2.[ ]não 3.[ ]não sabe 9.[ ]sem informação

Q17. Número de tratamentos anteriores (NUMTRAT): 1. [ ]1 2. [ ]2 3. [ ]3 4. [ ]>3

8. [ ]não se aplica 9. [ ]sem informação

Q18. História de (ABANDONO) de tratamento p/ TB: 1. sim[ ] 2.não[ ]

Q19. Número de vezes de abandono de tratamento:_________________

Q20. Tempo de doença (TEMDOEN): 1.[ ]< 1mês 2. [ ] mês< 3meses 3. [ ]≥3meses<12meses

4. [ ]>12meses 8. [ ]não sabe 9. [ ]sem informação

Q21. Intervalo de tempo entre início dos sintomas e 1ª consulta (INTEMPO): _________________dias.

Q22. (FEBRE): 1. [ ]sim 2. [ ]não 9. [ ]sem informação

Q23. (ASTENIA): 1. [ ]sim 2. [ ]não 9. [ ]sem informação

Q24. (ANOREXIA): 1. [ ]sim 2. [ ]não 9. [ ]sem informação

87

Q25. Perda de peso (PERDAPES): 1. [ ] sim 2. [ ]não 9. [ ]sem informação

Q26. Peso anterior (PESANT): _____________ Kg.

Q27. (TOSSE) 1. [ ]sim 2. [ ]não 9. [ ]sem informação

Q28. (ESCARRO): 0. [ ]ausente 1. [ ]mucóide 2. [ ]muco-purulenta 3. [ ]purulenta

4. [ ]sanguinolenta 5. [ ]piosanguinolenta 9. [ ]sem informação

Q29. Tabagismo (TABACO): 1. [ ]sim 2. [ ]não 9. [ ]sem informação

Q30. Anos/carteira (ANOCART): _____________________________

Q31. Uso de álcool (ALCOOL): 0. [ ]não 1. [ ]1 dia/semana 2. [ ]2dias/semana 3. [ ]3dias/semana

4.[ ]4 dias/semana 5.[ ]5dias/semana 6.[ ]6dias/semana 7.[ ]7dias/semana 9.[ ]sem informação

Q32. Uso de drogas ilícitas (DROGAILI): 0. [ ]não 1. [ ]inalatória 2. [ ]venosa 3. [ ]oral

4. [ ]mais de uma via 9. [ ]sem informação

Q33. Uso de drogas imunussupressoras (IMUNOSSU): 0. [ ]não 1. [ ]corticóide<30dias

2. [ ]corticóide>30dias 3. [ ]outras 9. [ ]sem informação

Q34. Via de administração de corticóide (VIACORT): 1.[ ]sistêmico (oral) e/ou parenteral)

2.[ ]inalatório 3. [ ]inalatório + oral 8. [ ]não se aplica 9. [ ]sem informação

Q35. (DPOC): 1. [ ]sim 2. [ ]não 9. [ ]sem informação

Q36. (ASMA): 1. [ ]sim 2. [ ]não 9. [ ]sem informação

Q37. (CARDIOP):atia 1. [ ]sim 2. [ ]não 9. [ ]sem informação

Q38. (HEPATOPA):atia 1. [ ]sim 2. [ ]não 9. [ ]sem informação

Q39. Peso atual (PESATUAL): _____________________ Q40.(ALTURA): _____________cm.

Q41. índice de massa corpórea (IMC): ____________ Q42. Temperatura axilar na admissão (TEMPAD): ____________ºC

Q43. Linfadenomegalia (LINFONOD): 1. [ ]sim 2. [ ]não

Q44. Nível de consciência (CONSCIEN): 0.[ ]sem alteração 1.[ ]oblinublação 2.[ ]torpor 3. [ ]coma

Q45. Tuberculose Extra-pulmonar (TBEXTRA):

0. [ ]não 1. [ ]pleural 2. [ ]ganglionar 3. [ ]SNC 4. [ ] outro local

Dados de exames laboratoriais e/ou histopatológicos

Q46. Baciloscopia do escarro inicial (BAAR): 0.[ ]negativa 1.[ ]+ 2.[ ]++ 3. [ ]+++

8. [ ] não se aplica 9. não realizada Data:_____/_____/______

Q47. Cultura de Escarro p/ BK (CULTURA): 0.[ ]negativa 1.[ ]+ 2.[ ]++ 3. [ ]+++

8. [ ] não se aplica 9. não realizada Data:_____/_____/______

Q48. Baciloscopia do lavado bronco-alveolar (BAARLBA): 0.[ ]negativa 1.[ ]+ 2.[ ]++

3. [ ]+++ 8. [ ] não se aplica 9. não realizada

Q49. Cultura p/ BK do lavado bronco-alveolar (CULTLBA): 0.[ ]negativa 1.[ ]+ 2.[ ]++

3. [ ]+++ 8. [ ] não se aplica 9. não realizada

Q50. Histopatológico da biópsia (HISTOPAT): 1. [ ] compatível c/TB 2. [ ]não compatível c/TB

88

89

8. [ ]não se aplica 9. [ ]não realizado

Q51. Local da biópsia (LOBIOPS): 1. [ ]pleura 2. [ ]gânglio 3. [ ]pulmão 4. [ ]outros

8. [ ]não se aplica 9. [ ]não realizada

Q52. Cultura de tecido (CULTECID): 0.[ ]neg. 2.[ ]positiva 3.[ ]não se aplica 9.[ ]sem informação

Q53. (PPD): 1. [ ]<5mm 2. [ ]≥5mm<10mm 3. [ ]≥10mm 4. [ ]não realizado

Q54. (PPDQUANT): ________________ Q55. Hemoglobina (HG): ____________

Q56. Hematócrito (HT): _____________ Q57. (GLICEMIA): ________________

Dados de Evolução

Q58. Uso de (O2EVOL): durante o internamento: 1 [ ]sim 2 [ ] não

Q59. Insuficiência respiratória durante a evolução (IREVOL): 1.[ ]sim 2.[ ]não 3. [ ]s/ informação

Q60. Uso de ventilação mecânica (VENTMEC): 1[ ]sim 2.[ ]não 8.[ ]não se aplica 9.[ ]s/informação

Q61. (ÓBITO): 1.[ ]sim 2.[ ]não

Q62. (CAUSAOBT): 1.[ ]Ins. Resp. 2.[ ] Hemoptise 3.[ ]choque 4.[ ]disf./multip órgãos

5.[ ]sepse 6.[ ]doença coexist. 7.[ ]outra__________ 8.[ ]n/aplica 9.[ ]não ident.

Q63. (ALTA): 1.[ ]cura 2.[ ]melhorado 3. [ ]inalterado 4.[ ]outros 8.[ ]não se aplica

Q64. Data do óbito ou alta (DATAFIN): ____/____/_____

Q65. Intervalo de tempo entre o início do tratamento e óbito (INTÓBITO): ______________

Dados radiológicos (na admissão ou primeiras 24 horas após internação)

Q66. Nº de lobos envolvidos (NLOBOS): 1 [ ]1 lobo 2 [ ]2 lobos 3 [ ]3 lobos 4 [ ] ≥4 lobos

Q67. Lateralidade das lesões (LATERAL): 1.[ ]unilateral D 2.[ ]unilateral E 3. [ ]bilateral

Q68. Cavitação (CAVITA): 1[ ]sim 2.[ ]não

Q69. Derrame pleural (DERRAME): 1.[ ]sim 2.[ ]não

Q70. Padrão miliar (MILIAR): 1.[ ]sim 2.[ ] não

Q71. Apresentação radiológica atípica (ATIPICA): 1.[ ]sim 2.[ ]não

Q72. Classificação (NTA): 1. [ ] NTA 1 2. [ ] NTA 2 3. [ ] NTA 3

Dados de Tratamento

Q73. Esquema atual (ESQATUAL): 1 [ ] E1 2 [ ] E1R 3 [ ] E2 4 [ ] Alternativo

FICHA DE ACOMPANHAMENTO

Projeto “HTLV 1 X Tuberculose”

NOME DO AVALIADOR: ____________________________________________________

Peso (Kg):________ ALT:__________ IMC:_________

SINTOMATOLOGIA:

FEBRE 1( )SIM 2( )NÃO

TOSSE 1( )SIM 2( )NÃO

ESCARRO 1( )SIM 2( )NÃO ( )muco-purulento ( )purulento

( )sanguinolento ( )pio-sanguinolento ( )mucóide ( )sem informação

EMAGRECIMENTO 1( )SIM 2( )NÃO

GÂNGLIO 1( )SIM 2( )NÃO

DOR TORÁCICA 1( )SIM 2( )NÃO

Leucograma: Total_________ % de linfócitos_______ nº de linfócitos_______

Glicemia:____________mg

RX TÓRAX: Normal( ) Anormal( ) Se anormal, compatível com TP: Sim( ) não se aplica( )

BAAR: positivo( ) negativo( ) não se aplica( )

Cultura para BK: positiva ( ) negativa( ) não se aplica( )

Esquema atual: (ESQATUAL)

1.( ) E1 2.Anormal( ) E1R 3.( ) E2 Alternativo( )

Efeito adverso / Hepaticidade (HEPATO):

Sim( ) Não( ) 8.Não se aplica( ) 9.( ) Sem informação

Outros efeitos adversos (OUTADV):

Sim( ) Não( ) 8.Não se aplica( ) 9.( ) Sem informação

Resistência a Drogas (RESDRO):Sim( ) Não( ) 8.Não se aplica( )

90

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para participação no estudo que avalia a “Associação entre a Infecção pelo

HTLV-1 e Tuberculose”.

Nome do Projeto: Associação entre HTLV-1 e Tuberculose: Aspectos Clínicos e Imunológicos em Indivíduos co-infectados pelo

M. tuberculosis e o HTLV-1.

Número de Participantes:

Investigador Principal: Edgar M. Carvalho, médico do Hospital Universitário Professor Edgard Santos, Rua João das Botas, S/N

– Canela CEP 40110-160 – Salvador-Bahia.

Nº do Projeto:

Convite e objetivos – Você é convidado a participar de um estudo que tem como objetivo avaliar a associação da tuberculose

pulmonar com a infecção pelo vírus HTLV-1. Participam deste estudo pacientes com tuberculose pulmonar, infectados ou não pelo

HTLV-1. Além das informações aqui prestadas você pode perguntar tudo sobre o estudo ao seu médico. Caso decida participar do

estudo será solicitado a assinar este termo de consentimento.

Participação Voluntária – A sua participação é voluntária. Você pode desistir de participar do estudo a qualquer momento, ou

seja, agora ou durante a resposta ao questionário e ao exame físico. Você tem liberdade de se recusar a responder qualquer pergunta

do questionário que considere invasão de privacidade, causadora de constrangimento e/ou desconforto moral. Caso após aceite

participar, resolva descontinuar a sua participação, este será feito sem qualquer prejuízo para você. Participando ou não do estudo

você receberá todos os cuidados médicos dispensados aos pacientes infectados pelo vírus HTLV-1.

Finalidade – O estudo visa comparar o curso clínico da tuberculose em pacientes infectados com o HTLV-1 com pacientes não

infectados por este vírus.

Procedimento – Caso você concorde em participar do estudo você responderá a um questionário sobre queixas clínicas

relacionadas com esta doença e será examinada por um médico participante do estudo (Dr. Edgard M. Carvalho, Drª Maria de

Lourdes Bastos e Drª Eliana Silva). Além disto você será solicitado a doar 30ml de sangue para realização dos estudos

imunológicos.

Duração do Estudo – Após a assinatura do Termo de Consentimento sua participação no estudo será de 06 meses. Os pacientes

com Tuberculose e HTLV-1 deverão a cada mês comparecer ao Hospital Octávio Mangabeira para a avaliação clínica e exames

radiológicos.

Confidencialidade – Qualquer informação obtida dentro do estudo será de conhecimento da equipe que participa do estudo. Você

e qualquer participante deste estudo não serão identificados por nome nas publicações dos resultados do estudo.

Análise de Riscos e Benefícios - A realização de teste na pele pode raramente ser acompanhada de coceira e dor no local da

injeção. Neste caso uma pomada será utilizada para aliviar os sintomas. Devido as evidências de que quando associada a infecção

pelo HTLV-1 a tuberculose é mais grave, você será acompanhado mais freqüentemente o que permitirá a identificação precoce de

uma falta de resposta ao tratamento ou de complicações, sendo então re-orientado o tratamento da doença.

ANEXO II 91

Retorno de Benefícios para o Sujeito e para a Sociedade – No caso de pacientes com Tuberculose e HTLV-1 a identificação

precoce de complicações ou falta de resposta ao tratamento permitirá que precocemente se faça a reorientação do tratamento. Como

tuberculose e infecção pelo HTLV-1 são freqüentes na Bahia e no Brasil o melhor entendimento desta associação beneficiará no

futuro os pacientes que apresentarem estas doenças.

Custos – Você não terá custos com a participação no estudo.

Esclarecimento - Caso você precise de esclarecimentos preliminares pode contar com os seguintes investigadores pelo telefone

(71) 3237-7353: Dr. Edgard M. Carvalho, Drª Maria de Lourdes Bastos e Drª Eliana Silva.

Consentimento – Se você leu o consentimento informado ou lhe foi explicado e você aceita a participação do estudo, favor assinar

o nome abaixo. A você será entregue uma cópia deste formulário para guardar.

__________Sim, aceito participar do estudo

__________Não, não aceito participar do estudo

__________________________________ ___/____/_____ __________

Assinatura do Participante

__________________________________ ___/____/_____ __________

Assinatura do Pesquisador

__________________________________ ___/____/_____ __________

Assinatura da Testemunha

92

ANEXO III 93

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99

100

XIII.ARTIGO PUBLICADO ___________________________________________________________

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103

104

105

XIV.ARTIGO SUBMETIDO ___________________________________________________________

Influence of HTLV-1 on the clinical, microbiologic and immunologic presentation of

tuberculosis

Maria de Lourdes Bastos1,2,3, Silvane B. Santos1, Anselmo Souza1, Brooke Finkmoore4, Ohana

Bispo1,2, Tasso Barreto1,2, Ingrid Cardoso1,2, Iana Bispo1,2, Flávia Bastos1,2, Daniele Pereira1,2, Lee

Riley4, Edgar M. Carvalho1,2,5

1Serviço de Imunologia do Complexo Hospitalar Universitário Professor Edgard Santos,

Universidade Federal da Bahia, Salvador-BA, Brazil

2Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública, Salvador-BA, Brazil

3Hospital Especializado Octávio Mangabeira, Salvador-BA, Brazil

4University of California at Berkeley, USA

5Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Doenças Tropicais (CNPq/MCT), Salvador-BA,

Brazil

Corresponding author: Edgar M. Carvalho - Serviço de Imunologia, 5o andar, Hospital

Universitário Professor Edgard Santos, Rua João das Botas s/n, Canela, 40110-160, Salvador, BA,

Brazil. Phone (55.71) 3237-7353, Fax: (55.71) 3245-7110, e-mail: edgar@ufba.br and

imuno@ufba.br

Email addresses: Ma. Lourdes Bastos – loudesbastos@ig.com.br; Silvane B. Santos -

silvane@ufba.br; Anselmo Souza - anselmossouza@gmail.com; Brooke Finkmoore -

brooke.finkmoore@gmail.com; Ohana Bispo - ohanacarol@hotmail.com; Tasso Barreto -

imuno@ufba.br; Ingrid Cardoso - ingrid_puig@yahoo.com.br; Iana Bispo -

106

107

ianacarine@hotmail.com; Flávia Bastos - falbastos@gmail.com; Daniele Pereira -

danielenp@gmail.com; Lee Riley - lwriley@berkeley.edu; Edgar M. Carvalho - edgar@ufba.br

Abstract

Background: HTLV-1 is associated with increased susceptibility to Mycobacterium tuberculosis

infection and severity of tuberculosis. Although previous studies have shown that HTLV-1

infected individuals have a low frequency of positive tuberculin skin test (TST)

lymphoproliferative responses compared to HTLV-1 uninfected persons, these studies were not

performed in individuals with history of tuberculosis or evidence of M. tuberculosis infection.

Therefore the reasons why HTLV-1 infection increases susceptibility to infection and severity of

tuberculosis are not understood.

Objective: To evaluate how HTLV-1 may influence the clinical, bacteriologic and immunologic

presentation of tuberculosis.

Design: A prospective cohort study enrolled 13 new cases of tuberculosis associated with HTLV-

1 (cases) and 25 patients with tuberculosis without HTLV-1 infection (controls). Clinical findings,

bacterial load in the sputum, x-rays, immunological response and death were compared in the two

groups.

Results: There were no differences in the demographic, clinical and TST response between the

two study groups. IFN- and TNF- production was higher in unstimulated cultures of

mononuclear cells of HTLV-1 patients with tuberculosis than in controls (p < 0.01). While there

was no difference in IFN- production in PPD stimulated cultures, TNF- levels were lower in

patients with tuberculosis and HTLV-1 than in controls (p = 0.01). There was no difference in the

bacterial load among the groups but sputum microscopy became negative faster in cases than in

controls. Death only occurred in two co-infected patients.

108

Conclusion: While the increased susceptibility for tuberculosis infection in HTLV-1 infected

subjects may be related to impairment in TNF- production, the severity of tuberculosis in

patients co-infected with tuberculosis may be due to the enhancement in the Th1 inflammatory

response, rather than in their decreased ability to control bacterial growth.

Key words: HTLV-1; tuberculosis; Mycobacterium tuberculosis

109

Background

The human T cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) has a worldwide distribution; it is

most prevalent in Central and South America, Central Africa and southwestern Japan [1]. HTLV-1

infects predominantly CD4 T cells inducing cell activation and proliferation of both CD4 and CD8

T cells [2, 3]. Moreover, the high production of pro-inflammatory cytokines (TNF-α and IFN-γ)

has been associated with central nervous system (CNS) damage and the development of HTLV-1

associated myelopathy (HAM) [2, 3].

There is evidence that HTLV-1 infection increases susceptibility to and the severity of

strongyloidiasis, scabies and tuberculosis [4-9]. In patients co-infected with HTLV-1 and

Strongyloides stercoralis the exaggerated Th1 immune response and increased regulatory T cell

response decrease the Th2 immune response, which plays a pivotal role in host defense against

helminthes [9-12]. HTLV-1 infected individuals have two to four-fold increased chance to acquire

tuberculosis [6, 13-15]. Additionally, in one retrospective study it was observed that HTLV-1

increased the mortality rate of tuberculosis [8]. Since the frequency of responders to tuberculin

skin test (TST) [16-18] and in vitro lymphocyte proliferation stimulated by protein purified

derivate (PPD) tuberculosis is lower among HTLV-1 infected individuals with tuberculosis than in

HTLV-1 uninfected persons [19], it has been proposed that a decrease in type 1 immune response

to mycobacterial antigen may increase tuberculosis susceptibility and severity. In this study the

clinical, radiologic, immunologic, and bacteriologic features of patients with tuberculosis and

HTLV-1 were compared with those who had only tuberculosis infection.

Results

There was no significant difference in the demographic characteristics (age, gender,

ethnicity, monthly income and nutritional status) between the 13 patients with tuberculosis and

110

HTLV-1 and 25 patients with only tuberculosis. A large proportion of case (54%) and control

patients (64%) were underweight (body mass index < 18.4) and the use of alcohol was also similar

in both groups. The clinical manifestations, response to TST and the presence and quantification

of AFB in the sputum in the two groups are shown on Table 1. The presence of fever, asthenia,

anorexia and weight loss were similar in the two groups (p > 0.05). In both groups the frequency

of hospitalization for tuberculosis, previous tuberculosis and treatment abandonment for

tuberculosis was high. There was no difference regarding the frequency of responders to the TST

as well as the size of induration. In two patients with HTLV-1 and tuberculosis at the time of

admission, they were already receiving therapy for tuberculosis for 28 and 35 days, respectively;

in both of them, the sputum was negative. However, previous to the therapy both had AFB in the

sputum and a positive culture for M. tuberculosis. They were admitted because of toxicity to anti-

tuberculosis drugs. No difference in the bacillary load was observed in the two groups at

admission. The findings of the chest x-rays were similar in the 2 groups. Cavitation was observed

in more than 60% of the patients with or without HTLV-1 infection. Fibrosis and atelectasis

occurred in about 50% of the cases and controls. Parenchymal destruction was higher (15.3%) in

patients with HTLV-1 and tuberculosis than in patients with only tuberculosis. The radiologic

findings in patients with HTLV-1 and tuberculosis were not compatible with those observed in

patients with an impairment in the T cell response. The most common findings were fibrosis,

atelectasis, pleural thickening and cavitation. All of them were similar in the two groups but

parenchymal lesion was 3.5 fold higher in patients with HTLV-1 and tuberculosis than in patients

only with tuberculosis.

The therapy for tuberculosis was similar in both groups. The majority of the patients

received rifampicin, isoniazid and pyrazinamide. In 33.3% of the cases and in 28% of the controls

111

patients also received etambutol. Alternative drugs were given to 15.4% of the cases and to 8% of

controls.

Figure 1 shows the survival analysis of patients that remained eliminating bacilli after 10

and 20 days of therapy. As previously stated, two patients with HTLV-1 and tuberculosis were

already on therapy and the sputum was negative. On day 10, 50% of the patients with tuberculosis

and HTLV-1 still had AFB in the sputum and almost 90% of the controls remained eliminating

bacilli. At day 20, 50% of the patients with HTLV-1 and tuberculosis had positive bacilloscopy

but AFB was still present in 75% of the patients with tuberculosis without HTLV-1. The Kaplan-

Meier survival estimates didn’t find a statistical difference (p = 0.07), but clearly the negativation

of the sputum was faster in patients with HTLV-1 and tuberculosis.

The main side effects observed were hepatotoxicity and gastric intolerance (nausea,

abdominal pain and vomit) observed in, respectively, 38.5% and 23.1% in the cases and in 28%

and 36% in the controls (p > 0.05). While death was observed in 2 (15.4%) of the patients with

HTLV-1 and tuberculosis, none of the patients died in the group only with tuberculosis. Death

occurred in one woman and one man. They both had cavitary lung disease, fibrosis, atelectasis and

tissue destruction on chest x-rays. Death was due to acute respiratory insufficiency in one case and

sepsis in the other.

The spontaneous and PPD induced TNF-α and INF-γ production in supernatants of PBMC

are shown in Figure 2. In cultures without stimulus the median TNF-α level among the HTLV-1

and tuberculosis groups (368 pg/mL) ranging from 128 to 5527 pg/mL was higher (p = 0.004)

than that observed in patients with only tuberculosis (73 pg/mL) ranging from 0 to 738 pg/mL

(Figure 2A). In cultures stimulated with PPD the median and range of TNF- production level in

the co-infected patients, 0 pg/mL (0 – 2295 pg/mL), was lower (p < 0.01) than in patients with

112

only tuberculosis 386 pg/mL (0 – 3847 pg/mL) (Figure 2B). The production of IFN- in

unstimulated cultures in patients with HTLV-1 and tuberculosis 732 pg/mL (0 – 2677 pg/mL) was

higher (p = 0.004) than in patients with only tuberculosis 15 pg/mL (0 – 444 pg/mL) (Figure 2C).

There was no difference between the groups in the production of IFN- in PPD stimulated cultures

(Figure 2D). There was no difference (p > 0.05) in the production of IL-10 in both unstimulated

and PPD stimulated cultures and the majority of the co-infected patients (60%) and 45% of

patients with tuberculosis without HTLV-1 had no detectable IL-10 production (data not shown).

Addition of monoclonal antibodies anti-IL-10 also did not enhance IFN- production (p > 0.05) in

both groups (data not shown).

The expression of mRNA for IL-12 in unstimulated cultures and the production of IFN-

in PBMC cultures stimulated with PPD and in cultures with PPD plus exogenous addition of IL-

12 are shown in Figure 3. The expression of mRNA for IL-12 in unstimulated cultures was lower

in tuberculosis patients with or without co-infection with HTLV-1 than in seronegative controls

(Figure 3A). Exogenous addition of IL-12 in cultures stimulated with PPD enhanced IFN-

production in similar way in both groups (Figures 3, B and C).

Discussion

The association between HTLV-1 and tuberculosis is widely documented, but little is known

about the influence of HTLV-1 on the outcome of tuberculosis infection [6, 13-15]. In the present

study the two deaths occurred among cases but no impairment in the T cell response to PPD was

observed in vivo and in vitro. However, while there was decrease in TNF- production in PPD

stimulated cultures, the INF-γ production in unstimulated cultures was higher in patients co-

infected with HTLV-1 and tuberculosis than in patient only with tuberculosis. These data together

with the observation that the sputum smear conversion was faster in the cases compared to

113

controls, suggests that an impairment in the innate immune response may contribute to acquisition

of tuberculosis, and severity of the disease may be due to exaggerated inflammatory response

observed in patients with both tuberculosis and HTLV-1 infection.

One important limitation of the present study was the characteristics of patients with

tuberculosis. The admission for tuberculosis patients is usually due to severity of disease, severe

adverse reactions to anti-tuberculosis drugs, history of treatment abandonment and documentation

of multidrug-resistant M. tuberculosis [21]. In our case, in addition to the presence of one or more

of these factors, a large percentage of the patients were underweight and malnourished, which may

have also influenced the clinical course of tuberculosis. Therefore similar type of the study should

be performed in out-patients with less severe tuberculosis manifestations to determine if the viral

infection may change the symptoms and x-rays findings of tuberculosis. Nevertheless, since the

frequency of these factors was similar in tuberculosis patients co-infected or not with HTLV-1,

this study gives support to the previous observation that HTLV-1 worsens the course of

tuberculosis [8].

While there is good evidence that HTLV-1 infection increases the risk for tuberculosis [6,

13-15], very little is known about the clinical course of tuberculosis in such patients. In a

retrospective study, it was shown that death was significantly more frequent in patients with

tuberculosis and HTLV-1 infection than in patients who had only tuberculosis [8, 14]. However no

information regarding microbiological, radiological or clinical data was provided to determine

how HTLV-1 can exacerbate the clinical course of tuberculosis. As previous studies have shown

that subjects infected with HTLV-1 have a decreased immune response “in vivo” and “in vitro” to

PPD [17-19, 22], one possibility is that HTLV-1, by decreasing the immune response to M.

tuberculosis, not only increases susceptibility but also makes tuberculosis more severe. The results

presented here did not show any difference in the frequency of patients who respond to the TST as

114

well as in the size of the induration when the two groups were compared. These data differ from

the literature, but the population studied here was quite different from those included in previous

studies. In the other studies, data were generated from HTLV-1 infected subjects without

documented active tuberculosis or even without history of tuberculosis or vaccination with BCG

[16-18]. Here all patients had active tuberculosis.

In vitro studies showed decrease in lymphocyte proliferation and secretion of cytokines

upon stimulation with M. tuberculosis antigen in HTLV-1 infected subjects compared to controls

[18, 22]. Similar to the in vivo observations, the in vitro studies were also performed in HTLV-1

infected patients without history of tuberculosis. However, it is known that abnormalities in T cell

or in antigen present cell function occur in HTLV-1 infection [22-24]. Therefore an impairment in

the Th1 type of immune response to mycobacterial antigens may increase susceptibility to

tuberculosis. However, our clinical radiologic, microbiologic and immunologic data did not show

any evidence of impairment in the T cell immune response to mycobacterial antigens in patients

with tuberculosis and HTLV-1. For instance patients with HIV have impairment in granuloma

formation, x-rays without classic picture of tuberculosis, slower time to bacterial conversion [25].

Here all patients had AFB in the sputum, the majority had cavitation and fibrosis, and

parenchymal destruction was more frequent in patients with tuberculosis and HTLV-1. These are

findings observed in immunocompetent patients with tuberculosis. Moreover, there was no

difference in the positivity as well as in the size of the TST and there was no difference in IFN-

production in the two groups in PPD stimulated cultures. Others have found increase in bacillary

load in patients with HTLV-1 and tuberculosis [14]. In this study we did not find any difference in

the bacillary load, and the sputum became negative faster in patients with tuberculosis co-infected

with HTLV-1. Thus, the exaggerated inflammation with HTLV-1 infection may have contributed

to the rapid sputum smear conversion and to the severity of tuberculosis. For instance mice

115

lacking IL-27 receptors and mice infected with a M. tuberculosis mce1 operon mutant cannot

modulate immune response and mount an exaggerated inflammatory response associated with

control of bacteria multiplication, but survival is decreased due to severe damage of the lung [26,

27].

Compared to seronegative controls expression of IL-12 was lower in both groups and

exogenous addition of IL-12 enhanced IFN- production in a similar way in tuberculosis patients

co-infected with HTLV-1 and in patients with tuberculosis. However, while there was no

difference in IFN- production among the groups, in PPD stimulated cultures, TNF- was lower

in PPD stimulated cultures of patients co-infected with M. tuberculosis and HTLV-1. TNF- plays

a key role in the protection against M. tuberculosis [28, 29]. Actually emphasis has been given for

the important role of innate immune response in the control of M. tuberculosis infection [30, 31].

In such case the increased susceptibility of HTLV-1 infected individuals to M. tuberculosis may

be due to an impairment in TNF- synthesis after exposure to M. tuberculosis, as well as in other

component of the immune response not yet determined. However, as IFN- production is

produced in high levels in HTLV-1 infection and a type 1 immune response to M. tuberculosis

antigens is not suppressed, granuloma formation is observed and bacterial growth is controlled.

Additionally, as HTLV-1 is associated with an exaggerated inflammatory response, there is more

tissue damage making the tuberculosis more severe in HTLV-1 infected subjects.

Conclusions

While the increased susceptibility of HTLV-1 infected patients to acquire tuberculosis may

be due to an impairment in TNF- production, the severity of tuberculosis in HTLV-1 infected

individuals may be related to an increased inflammatory response.

116

Methods

The study participants included 13 patients with diagnosis of tuberculosis and HTLV-1

infection and 25 patients who had tuberculosis without HTLV-1. All patients with tuberculosis

consecutively admitted at the Hospital Especializado Octávio Mangabeira (HEOM), Salvador,

Brazil, from August 2007 to July 2009 were tested for HTLV-1 by ELISA and those who tested

positive underwent confirmation by a Western blot test. The inclusion criteria were age between

18 to 60 years, diagnosis of tuberculosis with documentation of acid-fast bacilli (AFB) by

microscopy in the sputum and serologic test for HTLV-1. Exclusion criteria included pregnant

women, patients with diabetes, kidney failure, HIV infection and use of immunosuppressive

drugs. For each patient with tuberculosis and HTLV-1, two controls with only tuberculosis

matched by gender and age plus or minus five years of age were included. A case was defined as a

patient with two sputum tests positive for AFB by microscopy and a positive ELISA test for

HTLV-1 confirmed by Western blot. A standardized questionnaire soliciting demographic and

clinical information was completed for each participant at the time of enrolment into the study. A

pulmonary specialist (MLB) examined each patient and reviewed laboratory test and the x-ray

results. The patients were evaluated at entrance into the study, and at 10, 20 and 30 days after

admission. An informed consent was obtained from all participants and the study was approved by

the Ethical Committee of the HEOM.

Laboratory tests

The TST was performed by trained nursing staff at HEOM with 0.1 ml of PPD RT23 (2

tuberculin unit [TU], Statens Serum Institute, Copenhagen, Denmark). The reaction was read 72h

later. The cut-off point for a positive reaction was > 5mm

117

Serum samples were screened for antibodies to HTLV-1 by ELISA (Murex HTLV-1,

Abbot, Dartford, UK) and confirmed by a Western blot analysis (HTLV Blot2.4, Genelabs,

Singapore). Samples were also screened for antibodies to HIV-1 by ELISA (Ortho-Clinical

Diagnostics, Raritan, NJ, USA). Sputum of each patient was examined by the Ziehl-Neelsen

staining method and the bacillary load was classified as 1+, 2+, 3+ or negative. Culture of the

sputum was also performed in Lowenstein-Jensen culture media.

Immunological studies

Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were obtained from heparinized venous blood

by density gradient centrifugation using ficoll-hypaque (Sigma Chemical Co, St. Louis, MD,

USA). After washing with saline, the cells were adjusted to 3x106ml and cultured in RPMI 1640

(GIBCO Grand Island, NY, USA) plus 5% heat inactivated human AB serum supplemented with

gentamicin and glutamine. Cells were incubated only with medium or stimulated with PPD at

concentration of 1 g/ml for 72 hours at 37ºC in 5% CO2. Determination of TNF-α, IFN- and IL-

10 was performed by ELISA with monoclonal anti cytokine antibodies [3]. The mRNA for IL-12

was performed by real time PCR and in addition of the two groups HTLV-1 seronegative

individuals were used as controls. RNA from cell lysates was isolated in Tri Reagent Solution

(Ambion, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). The concentration and purity of RNA as

well as DNA Synthesis were performed as previously described [20]. For relative quantitative

Real Time PCR cDNA specific primers for IL-12 and reference gene HPRT were purchased from

real time PCR system Step OnePLUS AB Applied Biosystems in a 96-well microtiter plate and a

final volume of 10 µL using 0-5 µL of cDNA, 2-5 µL of 2X SYBR Green Master mix (AB

Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) and 30 pM specific primer mix. The cycling

conditions were as follows: 10 min polymerase activation at 95oC followed by 50 cycles of 15 s at

95oC and 1 min at 60oC. All samples were amplified in duplicate, and two negative controls per

118

primer pair were included in each run. Melting curve analysis was performed immediately after

amplifications. HPRT mRNA expression was used for normalization. Relative expression levels

were obtained as mean CT for each gene using the software Step OnePLUSTMSoftware v2.0 (AB

Applied Biosystems). Data for stimulated cultures represent the production of cytokine obtained in

culture stimulated with PPD minus the production detected in unstimulated cultures. In some

experiments IL-12 and anti-IL-10 were added to the cultures and IFN- was measured in

supernatants.

Statistical Analysis

Hospitalized pulmonary TB patients with HTLV-1 were compared to control patients

without HTLV-1 by Student t-test for continuous variables and Pearson x2 test for categorical

variables. Fisher’s exact test of the independence hypothesis was used when one the comparison

groups had an expected frequency of five or less. Kaplan-Meier test was used to survival analysis

in patients who eliminated acid-fast bacilli after 10 and 20 days of therapy to tuberculosis.

Comparison of TNF- and IFN- production between the groups was performed by the Mann

Whitney U Test. All analysis was performed with statistical software STATA 10.1 (Stata Corp,

College Station, TX, USA).

Competing interests

The author(s) declare that they have no competing interests.

Author’s contribution

MLB was responsible for the clinical evaluation of the patients, X-ray analysis, data

analysis and preparation of the manuscript. OB, TB, IC, IB, FB and DP assisted MLB in the

clinical evaluation and followed the patients during hospitalization. BF and LR performed the

statistical analysis and review of the manuscript. SS, AS and EMC were responsible for

119

immunological studies. MLB, EMC and LR also participated of the study design, data analysis

and in the preparation of the manuscript.

Acknowledgements

The authors thank Elbe Silva for secretarial assistance in the preparation of the manuscript

and the nurse N. Pimentel who collected the blood of the patients.

This study was supported by NIH grant # R01 AI079238. EMC is a senior investigator of

CNPq.

References 120

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Figure legends 124

Figure 1. Survival analysis of positive sputum for acid-fast bacilli during therapy for

tuberculosis. Frequency of patients that remained eliminating acid-fast bacilli (AFB) after 10 and

20 days of therapy for tuberculosis was evaluated with Kaplan-Meier survival estimates.

Figure 2. TNF- and IFN- production with or without stimulus with PPD. TNF- and IFN-

production were determined by ELISA in supernatants of PBMC culture from patients co-infected

with HTLV-1 and tuberculosis and patients with tuberculosis in unstimulated (A and C) or

stimulated with PPD (B and D). Results of PPD stimulated cultures represent value subtracted

from the IFN- production in unstimulated cultures.

Figure 3. Expression of mRNA for IL-12 and IFN- production after exogenous addition

of PPD plus IL-12. mRNA for IL-12 was determined by RT-PCR in unstimulated cultures of

PBMC from seronegative healthy subjects, patients with tuberculosis and co-infected with HTLV-

1 and tuberculosis (A). IFN- production was evaluated by ELISA in supernatants of PBMC

cultures unstimulated or stimulated with PPD and PPD plus IL-12 in the concentration of 50µg/ml

(B and C).

125

Table 1. Clinical and microbiologic characteristics of tuberculosis patients with or without

HTLV-1 infection.

Characteristic

TB with HTLV-1

(n=13)

n (%)

TB without

HTLV-1

(n=25)

n (%)

p-value

Symptoms

Fever 11 (84.6) 21 (84.0) 0.67

Asthenia 13 (100) 25 (100) -

Anorexia 11 (84.6) 21 (84.0) 0.35

Weight loss 11 (100) 22 (95.7) -

Prior hospitalization for TB 6 (46.2) 7 (28.0) 0.26

Prior treatment for TB 7 (53.8) 12 (48.0) 0.21

History of treatment

abandonment

6 (46.2) 7 (28.0) 0.45

Clinical examinations

Helminth infections 2 (15.4) 3 (12) 0.63

PPD positive 10 (76.9) 14 (63.6) 0.71

Mean PPD (mm) among PPD

positive tests, ± SD

12.9 ± 4.0 10.5 ± 4.8 0.23

Bacillary load

0 2 (15.4)* 0 (0)

1+ 5 (38.4) 11 (44.0)

2+ 2 (15.4) 3 (12.0)

3+ 4 (30.8) 11 (44.0)

TB = tuberculosis; HTLV-1 = human lymphotropic virus type 1; SD = standard deviation

The two patients had already been treated for tuberculosis for one month previous to the

admission. Before therapy the bacilloscopy was positive.

126