arome si condimente

ADITIVI ALIMENTARI (LABORATOR 1)

ODORANŢI, AROME, CONDIMENTE. ANALIZĂ CALITATIVĂ ŞI CANTITATIVĂ

- laborator -

Dintre cele cinci simţuri percepute de către om, mirosul este cel care se află în permaneţă “activ” tot timpul vieţii. Cu toate acestea, organul olfactiv (nasul) şi mecanismele de percepţie a mirosului, sunt cel mai puţin înţelese. Mintea, asociată creierului uman, interceptează semnalele nervoase şi secvenţele acestora, probabil prin procese paralele fizice şi chimice. Creierul este necesar, dar nu suficient, pentru realizarea percepţiei. Cu ajutorul creierului se crează o lume a senzaţiilor de miros, a experienţelor de miros sau a imaginaţiilor de miros, deci se poate spune că mintea îşi crează propria lume a senzaţiilor, imaginilor şi imaginaţiilor. Cu alte cuvinte, aceasta înseamnă că orice percepem în timp ce mirosim, gustăm, atingem, auzim sau vedem, este doar un concept uman al acestor stări de fapt. O exemplificare concludentă a acestor afirmaţii este cea din figura de mai jos, care reprezintă un set de puncte neregulate, albe şi negre. Privind imaginea din punct de vedere neutru, semnalele din minte sunt interpretate în creier în funcţie de structura percepută momentan. El poate mai întâi să “vadă” o tânără doamnă sau, dacă structura sa perceptivă este diferită, să “vadă” o doamnă bătrână. Cu alte cuvinte, subiectul îşi crează, în timpul percepţiei, fie imaginea unei tinere, fie a unei bătrâne din setul neregulat de puncte.

Figura 1. Exemplificarea “structurii perceptive” momentane.

Daniel Hădărugă – Aditivi alimentari – Lucrări de laborator 2

Senzaţia de miros apare ca urmare a stimulării unor receptori ai celulelor olfactive cu vectori moleculari numiţi “odoranţi”. Odoranţii sunt substanţe chimice naturale, semisintetice sau sintetice, produse şi utilizate pentru mirosurile lor. Odoranţii naturali sunt obţinuţi din materii prime de origine vegetală sau animală, cei semisintetici sunt compuşi chimici obţinuţi prin modificarea chimică a unor produse naturale, iar odoranţii sintetici sunt compuşi chimici care nu se găsesc în stare naturală, fiind obţinuţi pe cale exclusiv chimică. Aroma este un ansamblu complex de senzaţii gustative şi olfactive percepute la degustarea unui produs alimentar şi detectate de receptorii chimici din regiunea buco-naso-faringiană. Un compus sau un amestec de compuşi naturali sau sintetici care, adăugaţi produselor alimentare, le conferă o aromă specifică, se numesc aromatizanţi. Aroma poate fi naturală, reconstituită şi artificială. Aroma naturală este compusă numai din substanţe aromatizante naturale, în timp ce aroma reconstituită este un amestec de substanţe aromatizante şi / sau identic naturale, a cărui compoziţie corespunde aproximativ aromei naturale, fără alte adaosuri şi în proporţii similare aromei naturale. Aroma artificială este aroma care conţine una sau mai multe componente aromatizante. Condimentele (mirodeniile) sunt substanţe sau produse vegetale aromatizante utilizate pentru asezonarea alimentelor, din care nu au fost îndepărtate nici uleiul volatil şi nici principiile aromatizante. Cea mai importantă clasă de condimente este cea a condimentelor naturale rezultate din diferite părţi ale plantelor: fructe, seminţe, flori, frunze, scoarţă, rizom. O descriere detaliată a mecanismului molecular de percepţie a mirosului este prezentată în figura 2. Transducerea olfactivă (în sensul transferului energetic în sistemul olfactiv) este procesul prin care fenomenele din mediul fizic înconjurător devin reprezentate ca activităţi electrice în celulele nervoase senzoriale. Fotoreceptorii şi celulele receptoare olfactive funcţionează în mod similar, prin acţiunea unui stimul (foton, respectiv odorant) asupra proteinei receptoare de la suprafaţa celulei receptoare. Recunoaşterea odorantului este realizată de către aceste proteine receptoare aflate la suprafaţa membranei celulare. Odoranţii sunt captaţi undeva între cele şapte segmente transmembranare ale proteinei receptor de pe suprafaţa celulei şi determină o modificare conformaţională în acest complex receptor - moleculă, ce determină un lanţ de fenomene moleculare denumit cascadă enzimatică, asemănător fotoreceptorilor care prezintă, de asemenea, şapte segmente transmembranare şi necesită acelaşi tip de cascadă. Receptorul olfactiv determină o modificare în proteina G (figura 2b), de care este legat, cauzând transformarea guanozin-trisfosfatului (GTP) în guanozin-bisfosfat (GDP) în proteina G. În acest stadiu, proteina G activă difuzează de la molecula receptor şi porneşte o secvenţă de ciocniri intermoleculare în membrana celulară. Când are loc contactul cu proteina efector E, aceasta se leagă pentru a forma o proteină activată, E*, adeninil-ciclaza (AC), enzimă ce catalizează sinteza unei molecule mesager citoplasmatice, ciclic adenozin-monofosfatul (cAMP). Modificarea rezultată în concentraţia nucleotidei ciclice din celulă determină creşterea probabilităţii de deschidere a canalelor membranare. Aceste nucleotide ciclice deschizătoare de canale din celulele


receptoare olfactive sunt omoloage structural cu cele găsite în fotoreceptorii din retină, ilustrând astfel un alt aspect comun al mecanismelor celor două sisteme senzoriale. În celulele olfactive se cunoaşte însă şi o cale secundară, separată, de transducere a evenimentului olfactiv, în care proteina G activează o proteină efector diferită, inozitol-trisfosfatul (IP3), determinând eliberarea calciului intracelular din matricea citoplasmatică, ceea ce modulează trecerea prin canalul de ioni. Mecanismele ce implică IP3 sau adeninil-ciclaza sunt caracteristice diferitelor familii de situsuri receptoare de odoranţi din celulele receptoare.

(a)

Mucus

Odorant

Cili

Cil

Celulă subtentaculară

Neuronul receptor olfactiv (ORN)

Celula bazală

Axonul

Celula Schwann

Glanda Bowman

Moleculeodorante (b)

Membrană ciliară

Figura 2. (a) Ilustrarea schematică a epiteliului olfactiv, cu principalele tipuri de celule şi glanda Bowman de secreţie a mucusului. În detaliu se prezintă o proteină receptor cu şapte domenii transmembranare (7TM) localizate pe un cil al celulei receptor; (b) Reprezentarea fenomenelor implicate în cele două mecanisme de transducere: unul ce implică activarea de către proteina G a adeninil-ciclazei (AC) ce generează AMP ciclic (cAMP), şi altul ce implică activarea fosfolipazei C (PLC) pentru a genera inozitol-trisfosfatul (IP3). Aceşti mesageri secundari deschid canalele de ioni permiţând ionilor de calciu (Ca2+), sodiu (Na+) şi clor (Cl-) să pătrundă în celulă, conducând astfel la depolarizarea membranei şi apariţia unui potenţial de-a lungul axonului celulei spre bulbul olfactiv de la baza creierului.


Rezultatul final este acelaşi: membrana celulară este depolarizată printr-un schimb de ioni de sodiu, potasiu, calciu şi clor, prin intermediul canalelor. Acest deranjament ionic, dacă este suficient de mare, determină o “descărcare la ţintă” (impuls nervos) la trecerea prin axonul celulei olfactive la prima sinapsă a bulbului olfactiv. În aceşti curenţi de impulsuri nervoase, ce trec din epiteliul nazal în arhitectura neurală complexă a bulbului olfactiv şi mai departe în sistemul nervos central, se găsesc toate informaţiile de bază de care are nevoie sistemul privind concentraţia şi calitatea odoranţilor. În creier, informaţia olfactivă este transformată într-o experienţă senzorială unică, ce creează şi evocă nume, locuri şi sentimente din memorie, asociind experienţa curentă cu experienţele anterioare relativ la această problemă. Putem spune, de exemplu, că “miroase ca şi cafeaua …” sau “îmi aminteşte de bucătăria bunicii …”. Atribuim astfel un nume sau o clasificare setului complex de date olfactive. Obţinerea unei clasificări potrivite într-un sistem artificial necesită viteză şi capacitate eficiente pentru prelucrarea datelor neliniare spaţio - temporale; uneori, arhitectura neurală a omului face acest lucru foarte bine. Alteori, pentru atingerea acestui deziderat este necesară o tehnologie bazată pe reţele neuronale artificiale, sau proiectarea unor noi modele de sisteme neuronale olfactive, ceea ce ne conduce la o nouă modalitate mecanizată complexă de recunoaştere olfactivă. Se cunoaşte că proteinele receptoare olfactive sunt capabile să recunoască un număr foarte mare de odoranţi, probabil peste 10000 la om. Diversitatea genetică a familiei receptorilor olfactivi are potenţialul de a genera un mare set de receptori pentru odoranţi, suficient pentru a recunoaşte fiecare compus odorant la care poate răspunde omul. Nu se cunoaşte încă dacă există un singur receptor pentru fiecare odorant, dar se ştie aproape sigur că există un număr mare (poate 1000) sau chiar foarte mare (poate 10000) de astfel de receptori, care fac posibile răspunsurile la fiecare odorant. Dacă nu există un receptor specific pentru fiecare compus odorant în parte la care apare un răspuns din partea omului sau animalelor, atunci un receptor trebuie să răspundă la mai mulţi odoranţi diferiţi. Receptorii olfactivi şi/sau creierul trebuie atunci să posede mecanisme compensatorii pentru a discerne între un miros şi altul. Codarea informaţiei olfactive în mucoasa nazală de către toate celulele sau aranjamentele celulare, sau prin formele de activitate spaţio - temporală din neuronii bulbului olfactiv, oferă alternative de abordare a posibilităţilor de recunoaştere a domeniului extins acoperit de moleculele odorante, mai comode decât în cazul unui singur receptor pentru fiecare tip de moleculă.

Proteinele de legare a odoranţilor (OBP - Odorant-Binding Proteins). OBP-urile se aseamănă cu proteinele de transport ce se găsesc în ficat şi sunt excretate prin urină, şi fac parte din aceeaşi familie a proteinelor cunoscute sub numele de lipocaine. Ele sunt produse în cantităţi mari de elementele glandulare din cavitatea nazală. Secreţiile acestor glande sunt spălate constant, astfel că mucusul se deplasează din faţă spre spatele nasului. OBP-urile sunt solubile şi au o greutate moleculară mică, iar fiecare moleculă leagă mai multe tipuri de odoranţi. Ele funcţionează pe postul de


transportori ai odoranţilor hidrofobi prin mediul apos către receptori. Ele au fost găsite în concentraţii mari în mucusul nazal al mamiferelor.

Enzimele de degradare a odoranţilor (ODE – Odorant-Degrading Enzimes). ODE-urile reprezintă o altă formă de proteină solubilă ce se găseşte în mucoasa olfactivă. Sistemul olfactiv deţine un mecanism eficient de curăţare a odoranţilor şi feromonilor inhalaţi, mulţi dintre ei fiind toxici în cantităţi mari. Nasul se detoxifică singur în mod continuu, timp în care se pregăteşte pentru identificarea şi cuantificarea unei cantităţi proaspete de odoranţi. Acest lucru se realizează cu ajutorul unor enzime de tipul celor găsite în concentraţii similare în ficat (de exemplu, citocromul P450). Aceste enzime degradează odoranţii şi îi fac ineficienţi ca stimuli chimici, dar nu joacă nici un rol în stimularea receptorilor. ODE-urile pot, de asemenea, să posede proprietăţi de amplificare a intensităţii efective a odoranţilor slabi, prin facilitarea unui drum pentru aceştia spre receptori. Ele pot să atenueze în acelaşi mod efectul odoranţilor puternici, prin reducerea numărului de molecule odorante funcţionale în timpul tranzitului acestora prin mucus spre receptor.

Interacţiunile dintre miros şi gust pot rezulta ca urmare a unor efecte fizice, fiziologice, cognitive sau psihologice. Efectul compuşilor nevolatili şi a matricii alimentare asupra concentraţiei volatilelor aromatizante a fost foarte mult studiat şi este necesar să se ia în considerare în orice studiu privind interacţia dintre gust şi aromă. Se cunoaşte faptul că sărurile sau acizii măresc concentraţia în volatile nepolare pentru notele de vârf, astfel că este de aşteptat ca intensitatea unor compuşi aromatizanţi selectaţi să crească în condiţiile în care volatilele sunt percepute prin mirosire (percepţia ortonazală). Pe de altă parte, la ingerarea sau mestecarea unor probe alimentare au loc modificări fizice ale stimulilor existenţi, ce afectează viteza de eliberare şi concentraţia compuşilor gustativi şi odoranţi. Cum matricea alimentară este este distrusă, are loc eliberarea celor două tipuri de compuşi şi amestecarea cu saliva. Aceste fenomene perireceptoriale (apar înaintea interacţiunii cu receptorii gustativi) afectează partiţionarea, difuzia şi transportul compuşilor gustativi în mucoasa din cavitatea orală şi distribuţia lor la receptorii gustativi. Similar, la distrugerea matricii alimentare şi interacţiunea cu saliva rezultă eliberarea şi distribuţia volatilelor între cavitatea orală superioară şi salivă. Volatilele din spaţiul superior al gurii pot trece apoi retronazal spre receptorii olfactivi.

Percepţia mirosului şi a aromei, precum şi interacţiunile acestora, sunt influenţate de mai mulţi factori psihologici. Totuşi, distincţia dintre efectele psihologice şi cognitive este greu de făcut, combinaţiile specifice dintre odoranţi şi compuşii gustativi influenţând percepţia stimulilor din alimente. Este periculos însă să se generalizeze prea mult unele observaţii experimentale făcute în direcţia înţelegerii interacţiunilor ce apar între miros şi gust.

Nasul electronic (eNOSE). De-a lungul ultimilor ani un interes deosebit l-a avut folosirea procedeelor electronice pentru sesizarea aromei alimentelor. Se pretinde că acestea operează în manieră similară, în anumite privinţe, cu sistemul olfactiv uman (figura 3).


Descoperirea sistemelor de tip “nas electronic” (electronic NOSE - eNOSE) devenise o necesitate în ultimii ani pentru industria alimentară, deoarece astfel de sisteme permit caracterizarea mirosului a peste zece produse pe oră cu o precizie medie, fără a mai fi nevoie de paneluri senzoriale umane sau de costisitoarele metode analitice sau interpretare a datelor (din punct de vedere temporal). În sistemul de producţie practică, aceasta înseamnă introducerea unei probe în “cutia neagră” - “nasul electronic” - şi obţinerea rapidă a clasificării produsului.

Nasul umanBulbul olfactiv

Nasul electronic

Reţea neuronală

Odorant

Senzori

Recunoaşterea formelor

Plajă de senzori chimici

Celula mitrală

Axoni olfactivi

Receptori olfactivi

Figura 3. Structurile de bază ale nasului mamiferelor şi “electronic”.

Tehnologiile curente ce folosesc eNOSE pot fi definite cel mai corect ca senzori de miros, dar acestea nu trebuie confundate cu gaz-cromatograful sau analiza senzorială. Similar sistemului senzorial uman, aceste sisteme de detecţie a mirosurilor incorporează senzori (conceptual analogi receptorilor olfactivi umani) şi un sistem de procesare a datelor (care simulează creierul uman). Asemănător omului, nu este nevoie să se identifice fiecare constituient al unui miros pentru a-l recunoaşte, astfel că eNOSE operează prin recunoaşterea formei componenţilor.

Gardner şi Bartlett definesc eNOSE ca “un instrument care include o plajă de senzori chimico-electronici cu specificitate parţială şi cu un sistem de recunoaştere a formelor corespunzător, capabil să recunoască mirosuri simple sau complexe”. Totuşi, la ora actuală, sistemele de acest tip nu reuşesc performanţele sistemului uman de percepţie. Din acest motiv s-au folosit, pentru aceste sisteme, şi alte denumiri mai mult sau mai puţin legate de olfacţia umană: senzor de aromă, senzor de miros, senzor de gaz etc. Clasificarea mirosurilor a fost o problemă căreia i s-a dat diverse soluţii de-a lungul timpului, însă fără a se ajunge la un consens. Principiul clasificării cu clase disjuncte este acela al găsirii unor relaţii de echivalenţă între elementele unei clase (o relaţie reflexivă, simetrică, tranzitivă). Relaţia cea mai generală aplicabilă mirosurilor este însă o relaţie de asemănare, căreia îi lipsete tranzitivitatea. O asemenea relaţie nu este adecvată unei clasificări în clase disjuncte. Prima clasificare, neglijându-le pe cele


de importanţă istorică (Aristotel, 350 î.Hr.; Linné, 1756), a fost propusă de Zwaardemaker în 1895 şi era constituită din nouă mirosuri fundamentale:

1. Aromatic (camfor, anason, lămâie, condimente) 2. Eterat (esteri din fructe, miere) 3. Balsamic şi floral (rezine) 4. Ambră, mosc 5. Empireumatic (fum) 6. Usturoi, ceapă, iod 7. Brânză, transpiraţie 8. Respingătoare 9. Greţoase

Crocker şi Henderson au încercat o clasificare pe baza a patru calităţi: floral, acid, pirogenic, caprilic, atribuind fiecărui odorant un număr format din patru cifre între 1 şi 8, corespunzătoare caracterului de miros fundamental ce intră în compoziţie. De exemplu, vanilia era cuantificată prin 7122, iar guaiacolul prin 7584. De largă circulaţie în parfumerie s-a dovedit clasificarea lui Billot în clase şi subclase de mirosuri: 1. Seria florală

1.1. Trandafir 1.2. Iasomie 1.3. Zambile 1.4. Liliac 1.5. Flori de portocal 1.6. Tuberoze 1.7. Violete 1.8. Reseda

2. Seria lemnoasă 2.1. Mirodenii (piper etc.) 2.2. Santal 2.3. Cuişoare

3. Seria rustică 3.1. Mentă 3.2. Camfor 3.3. Ierbaceu 3.4. Verde 3.5. Licheni 3.6. Legume

4. Seria balsamică

4.1. Vanilie 4.2. Răşină de olibanum 4.3. Răşină de galbanum 4.4. Rezinic

5. Seria fructată 5.1. Aldehide 5.2. Migdale 5.3. Anason 5.4. Fructe (mere, pere) 5.5. Ciocolată

6. Seria animalică 6.1. Mosc 6.2. Castoreum 6.3. Scatol 6.4. Alge (marin) 6.5. Ambră

7. Seria empireumatică

7.1. Fum 7.2. Tutun

8. Seria respingătoare 8.1. Brânză 8.2. Usturoi 8.3. Peşte 8.4. Ouă clocite 8.5. Rânced 8.6. Ţap 8.7. Mucegai 8.8. Piridină 8.9. Mercaptan 8.10. Anilină

9. Seria comestibilă 9.1. Unt 9.2. Pâine


Dezavantajul acestui sistem de clasificare este că el cuprinde elemente arbitrare şi nu reflectă relaţiile dintre diferitele clase (suprapuneri). În unele sisteme se reflectă relaţiile de apropiere, respectiv suprapunerile dintre clase. Larg utilizat este discul mirosurilor, în care se admite că clasele de mirosuri reprezenatte prin cercuri se suprapun, fiind posibile substanţe cu mirosuri combinate din două clase vecine sau chiar depărtate. După Steiner (1980), acest disc arată ca în figura 4a.

picant

floralfructat citric

aldehidic

verde

ierbaceufenolic

animalic

balsamiclicheni

coniferic

lemnos

(a)

eterat

fructat

verde floral

citric

aldehidic

ierbaceu

fenolic mentolat

eucaliptlichenipicantconifere

lemnos

balsamic

animalic (b) Figura 4. Discul mirosurilor (a) şi o hartă a mirosurilor (b). Clasele apropiate grafic sunt apropiate şi din punct de vedere al mirosului. În partea superioară sunt reprezentate notele “luminoase”, iar în partea inferioară notele “grele”. Se apreciază că pentru obţinerea unei aromatizări este necesară amestecarea unor componente din trei direcţii diferite, care să reprezinte un triunghi cât mai apropiat de unul echilateral.


Totuşi, relaţiile dintre clasele de odoranţi sunt mult mai complexe decât cele redate de discul mirosurilor. S-a propus utilizarea unei hărţi a mirosurilor (figura 4b), în care relaţiile dintre clase (note) să fie redate mai complet.

Fundamentele comunicării în câmpul mirosului se bazează pe o terminologie a mirosului mai mult sau mai puţin ştiinţifică. În multe cazuri cercetătorii se găsesc în dificultate atunci când vor să stabilească o codificare pentru miros. Recunoaşterea şi caracterizarea tonalităţilor de miros au o bază psihologică, astfel că există două metode subiective de stabilire a acestora. Descrierea calitativă a profilului unui miros poate fi obţinută prin compararea directă cu o serie de odoranţi cunoscuţi luaţi drept model şi într-un mod semantic. Ambele proceduri conduc la profiluri multidimensionale ale mirosului, ce depind de compuşii de referinţă selecţionaţi sau de descriptori obţinuţi semantic. Utilizând “procedeul referinţei”, un chimist poate avea o imagine moleculară a corelărilor cantitative dintre structură şi miros. Pentru clasificarea unui miros necunoscut compuşii sunt aşezaţi în proximitatea mirosurilor standard într-o hartă multidimensională, după o prelucrare matematică a datelor obţinute. Una dintre metodele cele mai folosite în acest sens este analiza clusterelor (cluster analysis), ce permite identificarea familiilor de miros şi a structurilor chimice corespunzătoare.

Procedeul “semnatic” este preferat îndeosebi de parfumeri, degustători de vin, ceai şi cafea, ca şi de aromaticienii din industria alimentară, când se obţine o bună clasificare a mirosurilor.

Evaluarea cantitativă a percepţiei mirosului şi pragurile de detecţie.

“Lumina poate fi atât de slabă încât să nu poată fi distinsă în întuneric, un sunet aşa de slab încât să nu poată fi auzit, o atingere atât de fină încât să nu o putem simţi. Cu alte cuvinte, este necesară o cantitate finită a unui stimul extern pentru a produce o senzaţie care să-i releve prezenţa. Aceasta se numeşte legea lui Fechner a pragului de detecţie – ceva ce trebuie etapizat ascendent pentru a putea fi perceput mental”

(William James, 1913) The American Society for Testing and Materials (ASTM) propune următoarea

definiţie care să prindă esenţa conceptului de prag de detecţie pentru simţurile chimice: un domeniu de concentraţie sub care mirosul şi gustul unei substanţe nu poate fi detectat în nici o circumstanţă practică, şi peste care orice individ cu simţuri normale pentru miros şi gust va detecta prezenţa substanţei (ASTM Method E – 679 – 79, 1991).

Sensibilitatea faţă de odoranţi la om variază de la individ la individ şi depinde de condiţiile fiziologice, psihologice şi patologice ale acestuia. S-a observat că femeile prezintă o sensibilitate olfactivă mai mare decât bărbaţii, pentru toate vârstele, ambele


sexe atingând cea mai mare sensibilitate după pubertate, sensibilitate ce scade considerabil după 70 de ani şi dramatic după 80. Există unele corelări între percepţia mirosului şi condiţiile endocrinologice ale corpului (estrogenii cresc sensibilitatea la odoranţii moscaţi, în timp ce androgenii o micşorează). O pierdere temporară a percepţiei mirosului poate să apară în timpul gravidităţii. La majoritatea oamenilor (62.4%) poate să apară o pierdere temporară a mirosului ca urmare a frigului sau infecţiei sinusului, iar 1.2% din populaţie prezintă anosmie totală. La stimularea simţurilor un timp mai îndelungat poate să apară un proces de desensibilizare, cunoscut ca adaptare la miros sau “oboseală olfactivă”, a cărei viteză de apariţie depinde de concentraţia şi de structura odorantului. Scăderea specifică a percepţiei mirosului după adăugarea unui al doilea odorant se numeşte adaptare încrucişată (benzaldehida reduce mirosul pentru nitrobenzen şi acetofenonă). Blocarea unui miros specific poate avea consecinţe practice pentru analiza senzorială a amestecurilor de odoranţi. Cea mai mică concentraţie detectabilă a unui odorant este numită valoare de prag (threshold value). Pragul de detecţie absolut reprezintă diferenţa detectabilă a unui compus în soluţie funcţie de solventul pur, în timp ce pragul de recunoaştere corespunde concentraţiei ce permite o identificare a calităţii mirosului pentru un compus şi, de obicei, este mult mai mare decât pragul de detecţie. Valorile măsurate în aer sunt, de obicei, cu câteva ordine de mărime mai mici decât cele obţinute în apă.

Valorile de prag în aer sunt măsurate folosind olfactometrele comerciale sau “sniffing-ul” standardizat pe un gaz cromatograf. Pentru determinarea acestor valori în apă paneliştii testează perechi de probe în recipiente de sticlă. O probă conţine solventul pur (apa), iar cealaltă compusul în concentraţia dată. Concentraţiile se situează în general în jurul minimului perceptibil al stimulului. Este testată fiecare probă relativ la solvent, iar pragul corespunde concentraţiei ce produce o frecvenţă de 50% de alegeri corecte.

Există mai multe metode utilizate pentru determinarea pragudrilor de detecţie: alegerea forţată ascendentă (ascending forced – chioce), procedee alternative (diferenţa relativă, detecţia semnalului), analiza diluţiilor.

La începuturile psihofiziologiei cea mai potrivită metodă pentru măsurarea pragurilor de detecţie a fost metoda limitelor. În acest procedeu, intensitatea stimulului este mărită pentru o serie ascendentă şi apoi micşorată pentru una descendentă pentru a detecta punctul la care răspunsul observatorului se modifică de la unul negativ la unul pozitiv, respectiv de la unul pozitiv la unul negativ, însă această metodă prezintă dezavantajul apariţiei oboselii şi adaptării senzoriale. Elementul de alegere forţată combină metoda limitelor cu testele de discriminare.

Un alt procedeu practic pentru estimarea pragurilor de detecţie este cel ce utilizează scările de diferenţe relative, unde probele ce conţin stimulul ce urmează a fi recunoscut sunt comparate cu anumiţi stimuli de control sau blank (nul).

Analiza diluţiilor reprezintă un grup de metode utile în conceptul pragului de detecţie ce încearcă să determine impactul senzorial al diferitelor materiale odorante şi aromatizante. Un prim grup de metode determină potenţialul olfactiv al compuşilor aromatizanţi olfactivi aşa cum se găsesc ei în alimente şi extracte alimentare. Aceste


metode permit determinarea atât a pragului de miros cât şi a concentraţiei actuale prezente în proba alimentară. Raportul acestor concentraţii (concentraţia actuală faţă de pragul de detecţie) indică, pentru un compus aromatizant dat, contribuţia acestuia la impresia senzorială totală a unui aliment. Această abordare este cunoscută sub denumirea de “unităţi de miros”.

Cea de-a doua metodă este similară principial şi a fost dezvoltată pentru determinarea punctului în care este pentru prima dată detectabilă senzaţia iritantă sau înţepătoare a compuşilor piperaţi la diluări succesive ale probei (procedeul Scoville). Ambele metode utilizează apoi diluarea la pragul de detecţie ca o măsură a impactului senzorial.

Procedee statistice în analiza senzorială.

Cele mai multe metode matematice şi statistice utilizate pentru stabilirea unor relaţii structură - activitate (SAR şi QSAR) au în vedere similarităţile dintre compuşii studiaţi. Prin recunoaşterea formelor (PARC - PAttern ReCognition) se înţelege în mod obişnuit acel ansamblu de metode şi tehnici cu ajutorul cărora se poate realiza o clasificare în cadrul unei mulţimi de obiecte, procese sau fenomene. Scopul recunoaşterii formelor constă în determinarea clasei din care face parte o colecţie de variabile, iar conceptul fundamental al acesteia este: un obiect sau un fenomen variabil, Xj, este descris (caracterizat) printr-un set de n caracteristici, xij (i = 1, n). Toate aceste n caracteristici ale unui obiect alcătuiesc o formă. Mulţimea

ΩX j j mX=

=1, poartă denumirea de spaţiul formelor. Prin urmare, un obiect (formă)

X poate fi reprezentat printr-un punct X(x1, x2, ... , xn) în spaţiul formelor. Pentru o descriere mai simplă vom presupune că pentru fiecare obiect Xj sunt cunoscute doar două caracteristici (măsurători), fie acestea x1j şi x2j. În acest caz obiectul poate fi reprezentat printr-un punct într-un sistem de coordonate Carteziene bidimensional; spaţiul formelor este un plan, caracteristicile reprezintă axele de coordonate, iar valorile numerice ale caracteristicilor sunt utilizate drept coordonate. O reprezentare echivalentă este vectorul Xj, care poartă denumirea de vector de formă (figura 5). În PARC, şi aceasta este valabil pentru absolut toate metodele care constituie acest domeniu, se presupune faptul că obiectele sunt similare - în raport cu o anumită proprietate - deci se grupează împreună în spaţiul formelor, dând naştere unor domenii distincte.

xXj(x1j,x2j)

Xj

x2

x1

x2j

x1j Figura 5. Un obiect caracterizat prin două măsurători x1j şi x2j, reprezentat în spaţiul bidimensional al

formelor printr-un punct Xj de coordonate (x1j, x2j) sau prin vectorul de formă Xj.


În practică este necesar un spaţiu al formelor cu mai mult de două dimensiuni (n > 2). Gruparea formelor în domenii distincte într-un hiperspaţiu n-dimensional nu mai este reprezentabilă grafic şi este mai dificil de imaginat. În acest caz tehnicile PARC se dovedesc deosebit de utile. Raportul dintre numărul de forme (obiecte) luate în considerare, m, şi numărul de dimensiuni (caracteristici) al spaţiului formelor, n, trebuie să fie mai mare decât 10 în aplicaţiile concrete ale tehnicilor PARC. În cazul în care numărul de forme este apropiat de numărul de caracteristici, atunci discriminarea dintre forme şi atribuirea lor la diferitele clase posibile este un proces pur aleator. Pentru rezolvarea problemelor PARC au fost propuse şi utilizate o mare varietate de tehnici matematice din teoria informaţiei, statistică matematică, teoria deciziei, geometrie etc. Acest ansamblu de metode matematice poate fi împărţit în două categorii, din punct de vedere al modului de abordare: - abordare statistică (decizional - teoretică); - abordare sintactică (lingvistică). În primul caz există două tipuri de recunoaştere a formelor: recunoaşterea controlată - care presupune un set de forme a căror apartenenţă la clase este cunoscută şi care este împărţită în setul de formare şi setul de predicţie - şi recunoaşterea necontrolată - care nu necesită o cunoaştere prealabilă a apartenenţei formelor la clase, ci dezvoltă algoritmi (tehnici de grupare) care, în cursul execuţiei, permit construirea claselor pe măsură ce formele analizate sunt luate în considerare. Datele dintr-o problemă PARC sunt organizate în una sau două matrici (figura 6): - matricea X, care concare conţine variabilele independente ce caracterizează structura obiectelor (compuşilor); - matricea Y, ce conţine variabilele dependente (activitatea biologică). Într-o primă fază, metodele PARC caută reguli de clasificare a compuşilor (ce rezultă din setul de formare). În cea de-a doua fază regulile obţinute sunt utilizate pentru clasificarea de noi compuşi, predicţia de proprietăţi biologice pentru compuşi daţi etc.

::

::

1 2 ......... k ............... p12:::i:::n

1:::g:::G

::

::

1 2 ... m ...... q12:::i:::n

Matricea X Clasa Matricea Y

Set de formare +Set de predictie

Set test

Figura 6. Datele dintr-o problemă generală PARC.


Analiza discriminant liniară şi maşina care învaţă. Analiza discriminant liniară (LDA - Linear Discriminant Analysis) şi maşina care învaţă (LLM - Linear Learning Machine) sunt utilizate, de regulă, pentru clasificări binare (agonist - antagonist, activ - inactiv). Formele dintr-un hiperspaţiu n-dimensional sunt separate printr-un hiperplan de dimensiune n-1. Funcţia discriminant este pozitivă pentru membrii unai clase şi negativă pentru membrii celeilate clase (figura 7).

x3

x2

x1

+

-+ +

++

+

++

++ +

+

+

++

---

---- - -

--

-- - - - -

Figura 7. Metoda LDA pentru un spaţiu tridimensional.

Cei mai apropiaţi k-vecini. Cei mai apropiaţi k-vecini (KNN - K-Nearest Neighbour) este o metodă PARC ce se bazează pe evaluarea apartenenţei formelor la clasele respective din care fac parte în funcţie de distanţa dintre aceştia şi cei mai apropiaţi k-vecini (de obicei k = 1,3). Constituie o dezvoltare a variantei mai simple conform căreia o formă se consideră că aparţine acelei clase în care există vecinul cel mai apropiat al formei necunoscute (figura 8).

x3

x2

x1

+

-+ +

++

+

++

++ +

+

+++

---

---- - -

--

-- - - - -

.

Figura 8. Exemplificarea metodei KNN pentru spaţiul tridimensional.

Metodele Bayes. În metodele Bayes se calculează pentru fiecare clasă o funcţie de densitate de probabilitate din care se calculează apoi domeniile de confidenţă pentru fiecare clasă de care ar trebui să apaţină formele necunoscute. De regulă se asociază noua formă clasei cu probabilitatea cea mai mare. Un exemplu de reprezentare tridimensională (trei caracteristici independente ale formelor, x1, x2, x3) al metodelor Bayes este prezentat în figura 9.


x3

x2

x1

+

++ +++ +

++

++

--

---

--

- ---

--

Figura 9. Metoda Bayes pentru un spaţiu 3D.

Metoda SIMCA. Metoda SIMCA presupune construirea unui model pentru fiecare clasă din setul de formare. În exemplul din figura 10 pentru fiecare clasă din setul de formare s-a obţinut câte o dreptă în jurul căreia s-a construit o regiune de toleranţă pe baza împrăştierii punctelor din setul de formare. Noii compuşi sunt clasificaţi prin evaluarea distanţelor la clasele respective. Metoda prezintă avantajul că este aplicabilă pentru matrici X şi Y de orice dimensiuni.

x3

x2

x1

+

+++ ++ +

+++

+

--

--

--

-- -

--

--

Figura 10. Exemplificarea metodei SIMCA pentru spaţiul tridimensional.

Proceduri de grupare ierarhică. Procedurile de grupare ierarhică (HCA - Hierarchial Cluster Analysis) acţionează asupra matricii triunghiulare de distanţe dintre perechile de forme, Xi şi Xj, considerate ca puncte din spaţiul formelor. Se caută cea mai mică distanţă dintre două forme după care acestea se unesc într-o nouă formă situată la jumătatea distanţei dintre formele iniţiale (în centrul de greutate al perechii de forme care a generat-o). Rezultatul procesului de grupare se prezintă, de obicei, printr-o dendogramă în care se prezintă conectarea punctelor corespunzătoare formelor, ca şi distanţa minimă gasită (pe ordonată) pentru fiecare pas de grupare (figura 11).


x2

x1

*

**

**

1

23

4

5

Spatiulspatiul

h1

h2

h3h4

a0a1

a2

a3

a4

R+

1 2 3 4 5 Figura 11. Exemplu de grupare ierarhică a cinci faze dintr-un spaţiu

bidimensional (hi - elementele ierarhiei; ai - proiecţia lui hi pe segmentul R+).

Reţele neuronale. Utilizarea reţelelor neuronale în clasificarea moleculelor bioactive (relaţii structură - activitate) este de dată recentă. Reţelele neuronale (NN - Neural Networks) sunt sisteme artificiale ce simulează funcţionarea creierului uman şi care conţin un număr foarte mare de neuroni interconectaţi care prelucrează informaţia. Aceste sisteme pot rezolva probleme ce implică date imprecise sau cu zgomot mare, ca şi probleme cu un înalt grad de complexitate sau neliniare. Reţelele neuronale pot identifica şi învăţa formele corelaţionale dintre seturile de date de intrare şi valorile ţintă corespunzătoare. O reţea neuronală trebuie antrenată prin introducerea repetată a datelor de intrare şi a valorilor de ieşire corespunzătoare. După acest proces, reţeaua neuronală este iniţiată pentru recunoaşterea relaţiei dintre datele de intrare şi de ieşire şi crearea unui model intern care să guverneze procesarea datelor. Astfel, reţeaua neuronală poate folosi acest model intern pentru predicţia de noi compuşi.

Aspectul matematic al problemei este mult prea complicat şi nu-şi are locul în această prezentare. El presupune aspecte de neurodinamică, optimizare combinatorială, sisteme cu autoorganizare pentru învăţare supervizată şi nesupervizată, etc.

Schema generală a unei reţele neuronale artificiale cu propagare în urmă (BANN - Back Propagation Artificial Neural Network) cuprinde (figura 12):

• INPUT LAYER, In[i], (stratul de intrare), este obţinut din variabilele de

intrare pentru fiecare formă, i = 1, l ; • W[i,j], matricea cantităţilor dintre straturile de intrare (INPUT) şi ascuns

(HIDDEN); • HIDDEN LAYER, H[j], (stratul ascuns), reprezintă variabilele calculate

pornind direct de la In[i] la matricea W[i,j], j m= 1, ; • W[j,k], matricea cantităţilor dintre straturile de ieşire (OUTPUT) şi ascuns

(HIDDEN); • OUTPUT LAYER, O[k], (stratul de ieşire), este realizat din variabilele de

ieşire pentru fiecare formă, k m= 1, ;


BIAS 1 BIAS 2

INPUTLAYER

W[i,j] HIDDENLAYER

W[j,k] OUTPUTLAYER

Figura 12. Schema generală a unei reţele neuronale artificiale cu propagare în urmă (BANN).

Analiza componentelor principale (PCA). Analiza componentelor principale

(PCA - Principal Component Analysis) formează baza pentru analiza multivariată a datelor. PCA presupune o aproximare a tabelului de date, matricea de date X, printr-un produs de două matrici de dimensiuni mai reduse, T şi P, ce reţin doar informaţia utilă din X. Reprezentarea grafică a coloanelor lui T dă o imagine privind “formele obiectului” pentru X şi, în mod analog, reprezentarea liniilor matricii P conduce la “formele variabilelor”.

Această metodă de analiză lucrează în modul următor: • se caută o direcţie în spaţiul proprietăţilor după care datele au varianţă

maximă; direcţia respectivă se numeşte prima componentă principală (PC1) şi fiecare formă se proiectează pe această direcţie, rezultănd astfel o reprezentare monodimensională a datelor (figura 13).

xx

x

x xx

xx

x

xx

xx

.ti1

(i)

var 1

var 2

var 3PC1

Figura 13. Matricea X(N,K) a datelor, cu N puncte în spaţiul K-dimensional.


În figură se prezintă un spaţiu tridimensional şi prima componentă principală (PC1). “Scorul” unui obiect, (ti), este proiecţia sa ortogonală pe această direcţie, iar coeficienţii direcţionali ai liniei formează vectorul “loading”, pk.

• se poate căuta şi o a doua componentă principală (PC2), a cărei direcţie este perpendiculară pe prima şi respectă condiţia de varianţă maximă.

Dacă se introduc în analiză şi valorile y ale variabilelor dependente, se poate

realiza aşa numita regresie cu componente principale (PCR - Principal Component Regression) care utilizează componentele principale semnificative obţinute din X într-un model regresional obişnuit.

Proiecţia în structuri latente (PLS). Metoda proiecţiei în structuri latente (PLS - Projections to Latent Structure, Partial Least Squares) este similara metodei PCA deoarece ambele folosesc variabilele latente. Deosebirea constă în faptul că vectorii latenţi ai matricii X (t-urile) în PLS sunt construţi implicând şi informaţii din variabilele răspuns sau dependente, y. Condiţia de ortogonalitate între axele componentelor principale rămâne.

Scopul lucrării. Lucrarea privind analiza calitativă şi cantitativă în clasa odoranţilor – aromelor – condimentelor este împărţită în trei părţi:

• Analiza senzorială a unor seturi de produse odorante (20 de compuşi), concentrate

de parfumuri (12), uleiuri volatile (27), concentrate de arome (83) şi condimente (36), furnizate de către diverse firme din domeniu;

• Determinarea pragurilor de detecţie în apă pentru unii compuşi odoranţi; • Analiza statistică a datelor obţinute prin metode de clasificare (cluster analysis,

principal component analysis - PCA).

Acest set de analize are ca scop familiarizarea studenţilor cu tipurile de miros şi cunoaşterea principalelor produse aromatizante şi condimentare, înşirea metodelor de analiză senzorială folosite în acest domeniu şi de prelucrare matematică şi interpretare a rezultatelor obţinute. Mod de lucru 1) Analiza senzorială. Pentru primele patru seturi de produse (O – odoranţi, CP – concentrate de parfumuri, UV – uleiuri volatile, AR – concentrate de arome) se vor pregăti un număr corespunzător de eprubete numerotate, ce vor conţine aproximativ 0.5 ml soluţie alcoolică apoasă diluată (5%). Cu ajutorul unor pipete Pasteur se vor transvaza volume de aproximativ 0.01 ml (o picătură mică) din produsul supus analizei


în fiecare eprubetă. Eprubetele cu probe se vor închide ermetic, după care se va trece la analiza senzorială propriuzisă. Subiecţii (membrii panelului) vor fi antrenaţi în prealabil pe probe cunoscute, iar analiza se va face în camere individuale de analiză senzorială special amenajate (condiţii optime de luminozitate, aerisire, umiditate etc.). Fiecare subiect va primi o probă pentru analiză şi un formular de analiză aferent pe care se vor trece rezultatele analizei. Se va lua o probă din eprubeta cu produsul diluat cu ajutorul unei fâşii de hârtie de filtru şi se va analiza din punct de vedere olfactiv prin mirosire directă (ortonazal). Se va evalua calitativ mirosul, iar rezultatul se va trece în cea de-a doua coloană a tabelului. Pentru evaluarea semicantitativă se va bifa un “x” în căsuţa corespunzătoare mirosului preponderent, a intensităţii acestuia şi a acceptabilităţii produsului (schema 1). Rezultatele analizei senzoriale vor fi centaralizate de către conducătorul grupei de panelişti şi vor fi prelucrate matematic conform procedeelor specifice. Condimentele vor fi analizate doar calitativ în modul următor: o cantitate mică din fiecare condiment va fi presărată pe o bucată paralelipipedică de pâine (1x1x0.5 cm3) unsă cu un strat subţire de margarină nearomatizată. Pentru fiecare probă se va descrie mirosul perceput ortonazal, aroma rezultată la mestecarea probei şi gradul de condimentare (gradul de iute sau similar). Rezultatele vor fi trecute în fişa de analiză corespunzătoare.

Miros perceput 1 – floral (trandafir, iasomie, zambile, liliac, violete etc.) 2 – lemnos (mirodenii, santal, cuişoare etc.) 3 – rustic (mentă, camfor, ierbos, verde, licheni, legume etc.) 4 – balsamic (vanilie, rezinic etc.) 5 – fructat (aldehidic, migdale, anason, fructe, ciocolată etc.) 6 – animalic (mosc, castoreum, scatol, alge marine, ambră etc.) 7 – empireumatic (fum, tutun etc.) 8 – respingător (brânză, usturoi, peşte, ouă clocite, rânced, mucegai etc.) 9 – comestibil (unt, pâine etc.)

Intensitate

1 – foarte intens 2 – intens 3 – mediu intens 4 – slab 5 – foarte slab

Acceptabilitate

1 – extrem de plăcut 2 – foarte plăcut 3 – destul de plăcut 4 – relativ plăcut 5 – nici plăcut, nici neplăcut 6 – uşor neplăcut 7 – destul de neplăcut 8 – foarte neplăcut 9 – extrem de neplăcut

Schema 1. Cuantificarea caracteristicilor produselor supuse analizei


2) Determinarea pragurilor de detecţie. În cea de-a doua parte a lucrării se vor determina pragurile de miros în apă pentru câteva produse odorante (1,8-cineol, diacetil, limonen, linalool, vanilină etc.). În acest scop se va utiliza metoda de alegere forţată ascendentă (Ascending Forced – Choice, ASTM, E – 679 – 79), ce înlătură problemele de oboseală şi adaptare senzorială care pot să apară în cazul metodelor tradiţionale a limitelor. Se estimează mai întâi, de către conducătorul grupului de panelişti, un domeniu aproximativ al pragurilor de detecţie, după care se setează un o serie de trepte de concentraţie alese în progresie geometrică (cu un factor de 2 sau 3). Solventul ales va fi unul potrivit, de preferat apa distilată sau soluţia alcoolic – apoasă diluată (probele vor fi introduse în recipienţi de sticlă închişi ermetic). Se va proceda apoi la estimarea populaţiei de praguri de detecţie pentru miros de către grupul de panelişti; fiecare probă va fi analizată relativ la un blank, ce va conţine doar solvent, prin teste de discriminare (A – nonA etc.), notându-se cu “0” probele ce nu prezintă diferenţă de miros faţă de blank, respectiv cu “+” probele ce prezintă diferenţe de miros faţă de blank. Rezultatele vor fi trecute în fişa de analiză corespunzătoare, centralizate, iar pragul de detecţie va fi calculat prin metodele clasice (schema 2). PRAG DE DETECŢIE Nr. probă: Concentraţie (µg/l): Log(concentraţie): Subiect 1: Subiect 2: : Subiect n: Calculul pragului de detecţie Subiect Nr. probă Concentraţie log(concentraţie) 1 2 : n Medie(log(concentraţie)): Antilog(medie(log(concentraţie))) = pragul de detecţie: Schema 2. Modul de calcul al pragului de detecţie


În final se va proceda la analiza statistică a datelor obţinute la analiza senzorială a produselor. Pentru aceasta se va utiliza metoda de Analiză a Componentelor Principale (PCA), realizată cu programul Unscrambler 6.1. Pentru fiecare set de produse se va alcătui setul de date al variabilelor independente (miros, intensitate, acceptabilitate) care se va introduce în analiză. “Loading”-urile (înregistrările) vor indica impactul fiecărei variabile la clasificarea probelor din setul de produse, iar “scores” (scorurile, rezultelele) vor indica modul de grupare al probelor din set. Se vor analiza critic rezultatele analizei senzoriale şi statistice şi se vor trasa concluziile principale.

arome si condimente

Documents