TEMA 1: Introduccin

Apuntes - Ingeniera gentica molecular

TEMA 1: Introduccin.

Al principio de los 70 se podan detectar molculas (protenas, genes) pero no se podan capturar ni caracterizar ( Nacimiento del ADN recombinante para poder detecta y aislar las molculas.

En la actualidad es imposible trabajar con el genoma entero; se han de amplificar secuencias.

Electroforesis: Tcnica para separar molculas de diferentes tamaos y cargas, tpicamente DNA protenas. La muestra se pone en una matriz que generalmente es un gel (Ej. acrilamida para protenas; agarosa para RNA y DNA), se somete a la accin de un campo elctrico y las molculas se separan de acuerdo a carga y tamaos. Para molculas de DNA y RNA donde todas tienen igual carga, migran ms rpido aquellas de menor tamao. Electroforesis nativa es aquella donde no se incorpora un agente denaturante en el gel. Por ej. para determinar actividad enzimtica. Electroforesis denaturante es aquella donde se incorpora un agente denaturante al gel. Ej. SDS (sodiododecil sulfato) en geles para protenas, denaturndose las protenas y separandose las cadenas polipeptdicas de acuerdo a sus pesos moleculares.

Nothern Blot: Tcnica que permite la identificacin de molculas especficas de RNA. Bsicamente consiste en la separacin electrofortica de RNA, traspaso a un filtro e hibridizacin con sonda marcada.Southern Blot: Tcnica utilizada para analizar fragmentos de DNA, los cuales son separados mediante electroforesis, transferidos a un filtro e incubados con sonda especfica.Dot Blot: Anlisis basado en ADN que utiliza sondas especficas del patgeno. Las sondas contienen ADN complementario especfico para las regiones conservadas del genoma del patgeno.Slot Blot: similares al Northern con la diferencia de que el ARN no es sometido a electroforesis sino que se sita directamente sobre la membrana. Este tipo de anlisis requiere de un molde asociado a succin con vaco para colocar el ARN que puede producir crculos o puntos (dot blot) o hendiduras (slot blot). Este tipo de prueba es muy til cuando se quieren estudiar gran nmero de muestras, pero tienen la limitante de no ofrecer informacin sobre el tamao de las bandas del ARN hibridado.1. Operaciones bsicas en ingeniera gentica.1. Obtencin del material de partida (futuro inserto)

Bancos de ADN genmico

Bancos de cADN

Fragmentos amplificados por PCR.

Genes sintticos.

2. Ligar el inserto (material) a un vector que es una molcula de ADN capaz de autorreplicarse y que tiene la posibilidad de admitir, dentro de su estructura, ADN forneo.3. Introducir el vector con el inserto dentro de clulas huspedes ( el vector comienza a replicarse y a hacer copias de l mismo.

4. Identificar los clones portadores, es decir, las clulas husped que llevan el vector y el inserto (los clones portadores se pueden capturar).

5. Expresar o modificar un gen:

Determinar la funcin bioqumica del gen.

Determinar las partes de la protena responsables de la funcin.

Mejorar la funcin bioqumica.

6. Modificar el genoma.

La ingeniera gentica naci en 1970 gracias a Cohen/Boyer que aportaron conocimientos de ciencia bsica y clonaron genes del ARN de E. Coli.

2. Electroforesis.

Antes, para determinar fragmentos de ADN se hacan servir gradientes de sacarosa marcados radiactivamente. La electroforesis en gel de agarosa y archilamida permiten determinar fragmentos ms rpidamente que en gradientes de sacarosa y el ADN no tiene que estar marcado. Al aplicar una corriente elctrica los diferentes fragmentos de ADN lineal migran por el gel y se paran segn su peso molecular (ms o menos nmero de nt) en geles de agarosa (en la archilamida porque hay una malla). El ADN migra debido a la carga (-) derivada de sus grupos fosfatos migrando hacia el nodo (+). Si las molculas de ADN son circulares migran segn su topologa y no segn su masa. En el ADN circular tenemos 2 formas topolgicas diferentes:

Crculos de ADN abiertos o nickados (OC).

Crculos de ADN cerrados (CCC /SC) que tienen grados de superenrrollamientos formando molculas cerradas. ADNs de 10 - 200 pb: En los geles de agarosa no quedan suficientemente retenidos ( electroforesis en gel de archilamida ya que es extraordinariamente resolutivo). Los geles de archilamida desnaturalizantes (urea) permiten separar molculas de ADN que difieren en un nucletido (es el fundamento de los geles de secuenciacin). ADNs de 50pb - 25kb: Geles de agarosa estndar. ADNs de 25kb - 315Mb: Geles de agarosa normales no separan ( Electroforesis de campo pulsado (geles de agarosa en el varan el campo elctrico).3. Electroforesis de campo pulsado.

Las molculas de ADN avanzan reorientndose segn el campo elctrico. En lugar de mover el campo elctrico tambin pueden mover el gel (no es tan caro).

Se ha de vigilar al pipetear para que no se rompa el ADN.

Sirve para aislar y detectar molculas de ADN muy grandes.

Dependiendo del % de agarosa se obtienen diferentes tipos de resolucin: Cuanto ms pequea es la molcula ms rpidamente migra en un gel para la misma concentracin de agarosa.

A medida que aumenta la concentracin de agarosa resolvemos molculas ms pequeas.

El bromuro de etidio:

Sirve para detectar ADN dentro de la agarosa.

Se origin como una molcula para tratar la enfermedad del sueo a los animales.

Es una molcula capaz de colocarse como un agente intercalante entre cada una de las bases adyacentes de ADN experimentando as una fluorescencia que se intercala emitiendo luz roja o anaranjada (590 nm) permitiendo la visualizacin del ADN.

til en la purificacin del ADN plasmdico.

Los geles de agarosa tambin sirven para resolver molculas de ARN. ste tiene una gran tendencia a formar zonas de doble cadena al azar ( alteracin de la movilidad electrofortica ( mala resolucin ( desnaturalizar ARN para romper los puentes de H intercatenarios y aadir formaldehdo que interaccionar con las bases desparejadas evitando la formacin de puentes de H (el formaldehdo no es un agente desnaturalizante).

4. Transferencia (tcnicas cualitativas).Son tcnicas en las que se pretende que los cidos nucleicos o protenas se puedan transferir a una superficie slida o a un filtro para detectar la presencia de ADN, ARN o protenas especficas. Se utilizan filtros de nitrocelulosa (no se hace servir mucho) y nylon para c.nucleicos y PVDF (polivinilo) para protenas. Transferencia de ADN (Edwin Southern. Transferencia de ARN ( Northern.

* stas son tcnicas cualitativas. Transferencia de prot. (Western.

4.1 Southern /Northern:

La transferencia es por capilaridad. Se coloca un gel sobre una bandeja con unos depsitos en tampn de transferencia (solucin salina)

Papel de filtro sobre el tampn ( Transferencia de la solucin salina. Colocacin del gel, la membrana de nylon, los 3 papeles de filtro y algo poroso que absorba la solucin salina que pasa a travs de todo.

Se establece una corriente de solucin de transferencia que en momento que pasa por el gel coge los c.nucleicos que quedarn retenidos en la membrana ya que la nitrocelulosa o el nylon tienen una gran afinidad por los c.nucleicos.

Se ha de aadir un peso para asegurar un buen contacto entre los diferentes elementos de la transferencia. El objetivo es detectar secuencias especficas en la membrana ( los c.nucleicos se transfieren desnaturalizados del gel hacia el filtro.

Una vez termina la electroforesis trataremos el gel con NaOH para neutralizar bruscamente con una solucin neutra o parcialmente cida (solucin Trys a pH = 7). Si trabajamos con c.nucleicos e alto PM antes de desnaturalizar trataremos con EtBr + UV ( introducir nicks y as obtendremos piezas pequeas que se transmitirn eficientemente a la membrana (tambin podemos tratarla con HCl diludo que rompe algunos enlaces).

Con neutralizacin o sin ella renaturalizamos las molculas. Una vez el ADN ha quedado fijado a la membrana se ha de hacer una rotura adicional para que no se desenganche.

En nitrocelulosa se rompe con calor a 80C (pero es explosivo ( al calentar se ha de sacar el oxgeno mediante vaco).

En nylon irradiamos con radiacin ultravioleta ( formacin de enlaces covalentes entre los cidos y el gel.

En el Nothern no hay desnaturalizacin. Cuando el Southern se hace a partir de ADN genmico (cortado con enzimas de restriccin) permite detectar el nmero de copias del gen o la secuencia especfica y determina la organizacin de las diferentes copias si hay.

En el Nothern transferimos el ARN total o el ARN poliA (Es un ARN que resulta de la transcripcin de los genes).

El ARN poliA se obtiene pasando el ARN total por una columna de afinidad en la que hay oligonucletidos con T ( quedar retenido por complementariedad mientras que el ARNr y el ARNt pasarn a travs de la columna. Deberemos elur el ARN polA disminuyendo el fuerza inica de golpe.

Informacin que ofrece el Northern: Presencia o ausencia den trascrito.

Tamao del trascrito.

4.2 Hibridacin sobre membranas:

Sonda: Molcula de ARN o ADN complementaria a la secuencia que queremos detectar. Forma puentes de H con la secuencia complementaria del gel. Deteccin de las sondas marcadas con radiactividad (P32) o marcadas no radiactivamente (deteccin por autorradiografas ( bandas). En un Nothern la sonda no puede ser de ARN por las 2 molculas son monocadena (hay sistemas para obtener ARN complementario que son mucho ms eficientes que la sonda).

5. Tcnicas cuantitativas.

5.1 Dot / Slot-Blot:No se realiza electroforesis sino que directamente de la barrera de los c.nucleicos se pone una gota sobre nitrocelulosa o nylon. Haciendo diferentes diluciones y aadiendo gotas (cada una de una dilucin diferente).

Debajo poner diluciones similares de una muestra patrn (conocemos la presencia de cidos nucleicos y su cantidad en cada dilucin). Hibridacin con sonda y deteccin: sirve para conocer la cantidad de c.nucleico en la muestra problema (se comparan las intensidades de las gotas (dot) con las de las muestras problema (slot)) Es mejor el slot porque en un dot la gota puede escamparse perdiendo intensidad ( las diferentes diluciones han de estar concentradas de igual forma ya que las intensidades han de ser equiparables. La nitrocelulosa se ha de neutralizar porque histricamente era muy sensible a pH alcalino ( se tena que neutralizar para que no se deshiciera. Si el ARN es de 6,7 Kb: deberemos romperlo en trocitos pequeos para asegurar la transferencia (rotura con HCl diludo) despus del EF y antes de la transferencia.

5.2 Hibridacin:

En la hibridacin nos aseguramos que slo hibridamos entre s secuencias estrictamente complementarias de la siguiente manera:

La desnaturalizacin (mediante soluciones alcalinas y calor) y la siguiente renaturalizacin (devolviendo las caractersticas anteriores muy lentamente con calor y soluciones cidas) se puede seguir mediante la absorbancia. Absorbancia: Las bases quedan expuestas a la luz y absorben ms (efecto hipercrmico) porque estn separadas.

T, pH: Esta T corresponde ala T de fusin (T en la que tenemos la mitad del ADN desnaturalizado). La T de fusin es caracterstica de cada muestra de ADN concreto.Tm = 81,5 C + (16,6 Log [Na+ ]) + (%GC 0,41) (%MM)

Donde MM es el desparejamiento (ADN con 1000b de las cuales 900 estn apareadas y 100 desparejadas). Podemos conseguir una T en la que se mantengan aparejadas secuencias de ADN que no son completamente complementarias. Si una muestra de ADN est a la Tm sabremos que un 50% de las bases estn aparejadas.

Por encima de la Tm la molcula se desnaturaliza.

Si en el filtro tenemos ADN humano y como sonda un gen determinado que proviene del ratn (es parecido al del ser humano pero no idntico) ( fijaremos unas condiciones de T que permitan la hibridacin ya que la sonda no ser completamente complementaria. Para hibridar nicamente secuencias totalmente complementarias ( formaremos unas condiciones de T o [Na+] para que en estas condiciones las secuencias estn 100% aparejadas. Para hibridar secuencias parecidas pero no idnticas es hacen servir condiciones poco restrictivas).

Restrictividad: Permite hibridar molculas parecidas pero no idnticas (se hacen servir condiciones poro restrictivas como T bajas y altas [Na+]).

Para renaturalizar secuencias parecidas completamente idnticas se usan condiciones muy restrictivas como T altas y bajas concentracin de [Na+].

Generalmente durante una hibridacin se hacen servir condiciones no restrictivas para que sta se de con rapidez; si lo que queremos son condiciones restrictivas se hace un lavado en estas condiciones de forma que lo que no sea idntico se separar.

En un Slot o Dot-blot tenemos una gota con todos los c.nucleicos (las condiciones son casi siempre muy restrictivas ya que al haber una mezcla de c. nucleicos debemos saber exactamente qu gen estamos comparando)

La T a la que realizamos la hibridacin determina la cintica del proceso de hibridacin. T inferiores (10, 15 o 20C) a Tm: ptimas para realizar la hibridacin porque es cuando la reaccin de renaturalizacin es ptima.

T muy superiores o muy inferiores a Tm: Renaturalizacin muy lenta.

Si la secuencia es de 2-25b la Tm se calcula muy fcilmente. Ejemplo: Si la Tm = 8C:

A 8C la secuencia que tenga un nick entre la primera A y la primera G el 50% de las secuencia estar separada.

A ms de 8C la secuencia siempre estar desnaturalizada.

6. Enzimas de restriccin.

6.1 Enzimas de restriccin tipo I:

Formadas por 3 subunidades.

1. Hsd R:Peso de restriccin (corta).

2. Hsd M:Peso de metilacin.

3. Hsd S:Reconoce la secuencia.

* hsd = host specifity DNA /determinante

Para cortar requieren de ATP y para metilar de SAM (S-adenosil metionina). Son enzimas independientes, es decir, la misma enzima corta y metila.

6.1.1 Descubrimiento de las enzimas de restriccin: En una progenie de fagos lambda podan infectar a E.Coli C pero no a E.Coli R ya que se metilan segn el patrn de restriccin de E.Coli C ( podan volver a infectar a E.Coli C pero no a E.Coli R. La subunidad Hds determina la secuencia diferente de la cepa C de la R.

La ER comprueba si existe una determinada secuencia dentro del ADN (la secuencia que determina la subunidad hds) y:

Si la secuencia no est metilada en ninguna cadena: la hds corta las 2 cadenas en una distancia indeterminada de la secuencia reconocida.

Si una de las 2 cadenas est metilada: si la hsd M introduce un grupo metilo a la cadena no metilada sta no corta el ADN (cuando se acaba la replicacin la cadena nueva no est metilada).

Si las 2 cadenas estn metiladas: ER no hace nada.

En el genoma del fago lambda ninguna cadena est metilada ( ER reconocen el ADN forneo y lo cortan. (los primeros fagos se descubrieron accidentalemente).

El primer fago que se descubri fue porque el mismo ya iba correctamente metilado de acuerdo con el patrn de metilacin pero, cmo puede ser que E.Coli no lo destruyera y le incorporara el patrn de metilacin?

El primer fago puedo infectar porque entr en una cepa que era mutante en hsd R-.

Porque la clula de E.Coli que tiene la subunidad M y S pero no la R reconocer el fago pero no lo podr cortar ( al cabo de unas generaciones metilar al fago ( estos fagos podrn infectar otras E.Coli.

Cualquier ADN lineal que aparezca dentro de E.Coli ser degradado por diferentes mecanismos ( los fagos recortados por las ER se vuelven lineales ( sern degradados y posteriormente eliminados. La frecuencia de mutacin en procariotas es relativamente baja, pero en el interior de mamferos se encuentran muchos ( es relativamente fcil que por mutacin espontnea aparezca una cepa M+S+R-.

* Las ER del tipo I no son tiles para el ADN recombinante porque:

1. Cortan a una distancia indeterminada y a menudo larga (1kb) de secuencia de restriccin.

2. Son enzimas primarias, es decir, todo lo hace la misma enzima al igual que las ERs III.3. Requieren de SAM, ATP y Mg.

* Las ER (I) que se utilizan en el ADN recombinante son las cepas de E.Coli que son hsd- (no cortan, ni metilan ya que no reconocen ADN forneo no metilado segn el patrn) o hsd R- (metilando pero no cortando).6.2 Enzimas de restriccin del tipo II:

Son enzimas binarias y habitualmente homodmeros que estn formadas por 2 subunidades idnticas y situadas simtricamente haciendo la misma funcin. Cada subunidad reconoce la secuencia 5 ( 3. Cada subunidad se une a una cadena ( reconociendo secuencias palindrmicas (secuencias simtricas que se leen ingual en sentido 5 ( 3) ( el punto de corte siempre ser simtrico.

Las 2 cadenas se separan debido a que los puentes de H y las fuerzas de stekking son demasiado poco estables a T ambiente para mantenerse unidas.

Los cortes que realizan son nicks porque slo se corta una de las dos cadenas:

Si la secuencia no est metilada en ninguna cadena ( cortan.

Si la secuencia est hemimetilada o las 2 cadenas lo estn ( no cortan.

Corte escalonado: los extremos resultantes son cohesivos (las bases libres de los extremos son complementarias). Con el ADN ligasa se puede volver a unir ( la diana de restriccin se recicla completamente.

Corte no es escalonado: los extremos romos tambin son reversibles pero no tan eficientes. Las ER (II) reconocen secuencias de 4 a 8 bases (si la secuencia tiene 5 o 7 b habitualmente se trata de una palndorma interrumpida.

Ejemplo: Secuencia GATC

ER (II) San 3AI:

Reconoce GATC y metila la C.

ER (II) MboI:

Reconoce GATC y metila la A.

ER (II) DpuI:

Reconoce y corta ADN slo si est metilado o hemimetilado.

Esta secuencia es reconocida por el gen del sistema dam que consiste en:

Si se introduce una mutacin en la cadena hija despus de la replicacin habr una distorsin de la doble cadena.

Para poder eliminar la mutacin hemos de saber cul de las 2 cadenas es la hija.

En la cadena paterna la secuencia GATC siempre est metilada en la A por lo que tenemos que buscar la cadena que tenga esta secuencia sin metilar.

ER (II) MboI nunca la utilizaremos para cortar esta secuencia ya que el ADN ya estar metilado o hemimetilado en la A ( nunca cortar.

Utilizaremos ER (II) San 3AI porque aunque el ADN est metilado no lo est en C. En ADN de procedencia humana muchos GC estn metilados en C por lo que nunca o casi nunca utilizaremos ER (II) San 3AI si no que usaremos ER (II) MboI porque en humanos nunca metilamos la A.

6.2 Enzimas de restriccin del tipo IIs: Cortan a una distancia fija de la diana. Sus dianas no son palindrmicas.

Son binarias ( cada enzima corta o metila pero los dos reconocen la secuencia. (Si tenemos una enzima binaria en un tubo de ensayo podremos metilar un ADN que no lo est en ninguna de las regiones de reconociemiento porque slo ponemos la que metila (la que corta no).

Esto no se puede hacer si tenemos ER (I) y (III) ya que la misma enzima corta y metila.

ER (II) slo necesitan SAM para metilar y Mg para cortar. ER (II) cortan dentro de la secuencia de reconocimiento y las del tipo (II)s fuera de ella pero a una distancia fija determinada (siempre en el mismo sitio) y cercana de la secuencia de reconocimiento.

6.2 Enzimas de restriccin del tipo III:Son enzimas primarias con 2 subunidades (una corta y otra metila) en el que el punto de corte est a una distancia fija de la secuencia de reconocimiento. Necesitan ATP y SAM para poder cortar ( se usan muy poco en el ADN recombinante.7. Nomenclatura:

EcoRI

GneroEspecieCepaTipo Enzima

2 ER son isoquismeras cuando reconocen y cortan la misma secuencia pero provienen de especies diferentes. 2 ER son neoquismeras si son isoquismeras que cortan la secuencia en un punto diferente (provienen de diferentes especies y reconocen la misma secuencia).

8. Mapas de restriccin.Es el uso fundamental de las ERs. A partir de las bandas aparecidas en una EF de ADN digerido con ER asignamos las dianas de restriccin a cada una de las bandas que aparecen. Ahora se utilizan para caracterizar las secuencias que acabamos de clonar.8.1 ADN ligasas:

Las ADN ligasas sirven para introducir ADN cortado con ER en un vector de clonacin. stas son muy eficientes sellando discontinuidades en una de las 2 cadenas y uniendo los extremos cohesivos. ADN ligasa E.Coli:

Requiere NAD. ADN ligasa Fago T4:Requiere ATP (muy eficiente en sellar extremos romos que la otra no)

* La T ptima de trabajo de las 2 enzimas es de 37C.

En el laboratorio se trabaja a unos 4-16 C porque as los extremos no estn muy separados (han de estar unidos) por lo que la T debe ser menor a la Tm. Se usa un ATP pro enlace fosfodister unido.

Las ligasas slo unen extremos cercanos.

Una reaccin de ligase efecta a 4C cuando nos interesa formar concatmeros. Para ligar extremos romos lo hacemos a una T = 20-25C ya que en este extremo no hay bases complementarias.

Si queremos sellar nicks sin que se formen enlaces con otros extremos cohesivos usaremos ADN ligasa de E.coli.

Si queremos unir extremos romos o cohesivos derivados de la digestin con ER usaremos ADN ligasa del fago T4.

8.2 Ligacin de fragmentos de restriccin:Partiendo de una mezcla compleja de fragmentos de ADN ( la presencia de los extremos derivados del corte determinar si la ligasa unir o no (slo las molculas con extremos cohesivos susceptibles son selladas por las ADN ligasas).

ADN ligasa de E.Coli no sella extremos cohesivos con la misma habilidad que la T4 los romos. Para favorecer el proceso de ligacin de muchas molculas diferentes a un mismo vector usamos linkers o adaptadores.8.2.1 Linkers:Son oligonucletidos de ADN habitualmente fosforilados autocomplementarios (pueden formar puentes de H entre s) donde todas las secuencias palindrmicas son autocomplementarias.

Se colocan a altas [] ( pueden formar enlaces fosfodiester fcilmente con una molcula de ADN romo. Para eliminar los linkers que no nos interesan cortaremos con EcoRI.

Los linkers siempre dan lugar a una molcula de ADN roma que para generar extremos cohesivos deben ser cortadas por ERs.

Ejemplo: Tenemos 100.000 molculas y nos interesa 1para el clonaje. Esta molcula tiene una diana de EcoRI.

Para facilitar su posterior insercin en el vector (extremos cohesivos) trataremos con metilasa (que metila la diana de nuestra molcula) y aadiremos un linker con el posterior corte de EcoRI ( generacin de extremos cohesivos sin que nuestra molcula tambin sea cortada por la diana.

La ligacin a 4C favorece la formacin de concatmeros (fragmentos de ADN que pueden tener extremos escalonados y que se van uniendo un tras otro favoreciendo la formacin de molculas lineales). A 16C se favorece la formacin de crculos.

En ADN recombinante nunca se ha de trabajar de la misma manera: Con plsmidos (circulares):a 16C.

Con el fago T4:

a 4C.

8.2.2 Adaptadores:

Acostumbran a ser molculas de ADN no autocomplementarias (son necesarios 2 oligonucletidos para formar un adaptador) y dan lugar a una molcula de doble cadena de ADN con un extremo sobresaliente y el otro romo. Se colocan a altas [] ( Forman enlaces fosfodiester fcilmente con una molcula de ADN romo.

Para eliminar los linkers que no nos interesan cortaremos con EcoRI.

Siempre que compremos oligonucletidos pediremos que sean 5P.

Una vez aadidos los oligont en la reaccin de ligacin puede darse que:

Los 2 adaptadores liguen entre s por los extremos romos formando un dmero de adaptador que tendr 2 extremos sobresalientes (por reaccin de ligacin con ADN ligasa T4) ( no podrn ligarse a la molcula con extremos romos ( disminuye la cantidad de adaptador disponible.

Que los dos se liguen a la molcula que tiene extremos romos ( el inserto a partir de ahora pasar a tener extremo cohesivos (estos extremos cohesivos los determinan los adaptadores).* Con los adaptadores no es necesario cortan con ER ya que stos comportan la presencia de extremos cohesivos.

Qu pasa con el extremo cohesivo?:La ligacin del extremo 3-OH y 5-OH es imposible porque las ligasas necesitan un 3-OH y un 5-P. El inserto no puede ligar con s mismo ya que se necesita un extremo 3-OH y uno 5-P ( puede ligar con el vector mediante 2 enlaces ( tendremos 2 nicks y 4 bases aparejadas. La estabilidad trmica de nuestra molcula recombinante es mayor que la de la otra molcula debido a los puentes de H formados por el inserto (como hay ms bases aparejadas ms puentes de H). Su Tm > T ambiente. La otra molcula recombinante conceptualmente es igual que la otra pero entre los 2 nicks slo hay 4 bases desaparejadas ( Tm = 8C ( Tambiente > Tm ( la molcula estar en forma lineal.

Cuando introducimos este vector en la clula husped (ej, E.Coli), la maquinaria de la clula es capaz de convertir los 2 extremos 5-OH en 5-P y con la ligasa sella los nicks (siempre que el vector sea circular al entrar en la clula husped).

El inserto ser el conjunto formado por el inserto inicial + los 2 adapatadores.

* Tanto los linkers como los adaptadores sirven para aumentar la eficiencia de formacin de extremos romos.

8.2.3 Fosfatasa alcalina:

Es una enzima capaz de coger un extremo 5-P y transformalo en 5-OH por lo que pueden usarse para conseguir molculas similares a los adaptadores.

Trabajamos con un plsmido que recircularas muy fcilmente (se trata de un vector que en lugar de ligar con el inserto tiene una gran tendencia a recircularizarse y reestructurarse). Tratamos el vector con fosfatasa alcalina ( extremos 5-P se transforman a 5-OH ( no puede recircularizarse con l mismo. El inserto s tiene extremos 5-P ( el vector puede ligar y recircularizarse con el inserto.

No podemos desfosforilar el vector y el inserto a la vez porque de lo contrario no habra extremos 5-P ( el vector o el inserto deben estar desfosforilados. Aumenta mucho el rendimiento de la ligacin cuando queremos ligar un inserto de un largo determinado con un vector circular.

9. Ligacin o clonaje direccional.

Un vector que est cortado en 2 extremos por ER diferentes (EcoRI ( BamHI) por lo que no obtenemos los mismo extremos cohesivos ( el vector no puede recircularizar nunca ya que los 2 extremos no son compatibles.

El vector, pues, slo podr recircularizar con un inserto que tambin haya sido digerido por las mismas ER aunque el inserto tambin se puede ligar con l mismo formando un concatmero. Pero ste concatmero formado por el inserto unido con l mismo est invertido y repetido (palndromo) ( no se puede ligar todo entero con el vector poque E.Coli no puede replicar el inserto, que es un palndromo con tantas bases, ni el vector que lo contiene. Por lo tanto: Siempre que haya ms de un inserto E.Coli no lo podr replicar. Si tenemos el vector invertido y repetido (2 plsmidos que han ligado entre ellos) E.Coli tampoco lo podr replicar.

Cuando tenemos el plsmido desfosforilado la ligacin es menos eficaz.

Si se puede hacer un clonaje direccional antes de tratar con fosfatasa alcalina realizaremos el clonaje direccional (se dice direccional porque el inserto queda colocado dentro del vector direccionalmente).

La fosfatasa alcalina es ms cara que las ER.

9.1 Polinucletido quinasa T4:Hace el efecto contrario que la fosfatasa alcalina. Se obtiene un extremo 3-OH que puede estar saliente o entrante, y esta enzima es capaz de intercambiar 1-OH por P (se gasta 1 ATP por cada P). Los usos son los siguientes: Reconvierte los extremos 5-OH suministrados por la casa comercial por extremos 5-P (aunque es mejor encargarlos ya fosforilados). Fundamentalmente se usa para marcar extremos de ADN.

9.2 ADN polimerasa:

Posee tres tipos de actividades.

1) Polimerasa 5-3:

La cadena de ADN crece en direccin 5.

Aade nt sobre el extremo 3 existente.1. Primer o cebador (cadena sobre la cual se aaden los nts).2) Exonucleasa 3-5: Contraria al sentido de sntesis.

Es la actividad correctora de pruebas.

Esta actividad correctora est bastante inhibida sobre ADnds.

3) Exonucleasa 5-3:

Elimina nts en la misma direccin en la que los aade.

Es la actividad nick-translation. Esta actividad se puede eliminar por tratamiento con subtilisma ( queda el fragmento Klewnow o pol K (2 otros dominios).9.2 Transcriptasa inversa:

Es una ADN polimerasa capaz de hacer servir como molde una cadena de RNA en lugar de ADN (tambin puede usar ADN como molde pero con una eficiencia menor). Es una enzima bsica para los cADN. Se obtiene en: Virus de la meloblestosis aviar. Virus del meloney murnico leutremia (cepa especial de virus que provoca leucemia a ratones).

Procesamiento de la enzima:

Cuanto ms nts aade la enzima antes de que la polimerasa se desenganche del molde y venga otra polimerasa a suplir su funcin ms procesiva es la enzima. Dependiendo de la actividad de las diferentes polimerasas podemos hacer servir una u otra:

Para reacciones de secuenciacin las molculas que estamos sintetizando deben acabar donde nosotros queremos y no donde la polimerasa se desenganche ( por lo que usaremos polimerasas con una procesividad baja (ej: polimerasa del fago T7).

Hay algunas ADN polimerasas T7 modificadas a las que se les ha eliminado actividades no deseadas.

9.3 Nucleasas:

Cortan cualquier tipo de ADN independientemente de la secuencia (cortan cualquier cosa). Hay varios tipos:

9.3.1 Exonucleasa III:

Proviene de E.Coli y es muy activa. Degrada extremos 3 de una doble cadena de ADN.

Slo es capaz de degradar extremos 3 de ADN sobre cadenas de ADN dobles ( en extremos 3 sobresalientes no hace nada (slo sobre extremos 3 romos y entrantes).

Muchas veces se utiliza con la nucleasa SI.

9.3.2 Endonucleasa SI: Tiene actividad slo sobre ADN o ARN de cadena sencilla. Corta al azar dentro de la cadena.

Corta la cadena complementaria de la cadena que presenta el nick.

Tambin corta los extremos cohesivos sobresalientes.

* La actividad conjunta de la exonucleasa III y la nucleasa SI produce una molcula de extremos romos ms cortos que la anterior molcula de ADN.

9.3.3 Nucleasa Bal 3I:

Presenta las 2 actividades anteriores ( puede cortar los 2 extremos de una molcula de ADN con extremos romos favoreciendo su sntesis en lugares diferentes. Las cadenas quedan paradas en diferentes lugares de la cadena molde pero como que hay muchas molculas de ADN, las otras cadenas puede haber quedado paradas en otros lugares.

9.3.4 Terminal transferasa: Es la nica ADN polimerasa capaz de aadir desoribonts a un extremo 3 en ausencia de la cadena molde. Se purifica a partir de clulas del sistema inmunitario y est disponible comercialmente.

Su mxima actividad se da sobre los extremos 3 de molculas de ADN de cadena sencilla.

Tambin tiene actividad en cadenas dobles pero con menos eficiencia:

Si sus extremos son 3 salientes (Eficiencia intermedia. Si sus extremos son 3 romos (Poca eficiencia.

La eficiencia viene determinada por los nts que hayan en el medio. Si colocamos nicamente C slo se colocar C, si hay C + G los colocar al azar. Aplicacin fundamental:

Construccin de bancos de cADN.

Marcaje de extremos 3 de ADN.

Construccin de colas homopolimricas para facilitar el clonaje de extremos romos. Sobre esta cadena aadimos un encebador complementario a uno de los extremos de ADN para que de lugar a un extremo 3-OH para que la polimerasa pueda polimerizar.Primera fase: Adicin de 4 nts normales (uno de ellos marcado radiactivamente) ( reaccin durante unos segundos o minutos ( la polimerasa aade unos cuantos nts a continuacin del encebador (se hace toda la reaccin en el mismo tubo. Una vez ha progresado un poco esta reaccin tenemos un encebador un poco ms largo y marcado radiactivamente (al hacerse ms largo presentar diversas marcas radiactivas).Segunda fase:

Dividimos el tubo en 4 alcuotas diferentes:

En una aadimos 1 desoxi A + los 4 nts normales.

En una aadimos 1 desoxi C + los 4 nts normales.

En una aadimos 1 desoxi T + los 4 nts normales.

En una aadimos 1 desoxi G + los 4 nts normales.

Los desoxi tienen 1H en la posicin 3 en lugar de un OH. Cuando aadimos un desoxi a la cadena en crecimiento la polimerasa lo coloca en la cadena pero al tener un H en el extremo 3 la polimerasa no puede aadir ms nts.Tercera fase:

Hacemos 4 tubos diferentes en los se dan:

1) Todas las reacciones de secuenciacin acabadas con una A.

2) Todas las reacciones de secuenciacin acabadas con una C.

3) Todas las reacciones de secuenciacin acabadas con una G.

4) Todas las reacciones de secuenciacin acabadas con una T.

Como adems hay nts normales la adicin de los desoxi es al azar y como partimos de muchas molculas de ADN iguales tendremos una sucesin de cadenas que acabar la reaccin. Para reacciones de relleno de fragmentos ( fragmento Klewnow de la ADN pol I o T4 ADNpol ya que en estas 2 enzimas la actividad exonucleasa 5-3 se ha eliminado por lo que los extremos 5 no se degradan.

Para degradar extremos 3 sobresalientes y convertirlos en romos ( fragmento klewnow o T4 ADNpol (siempre en presencia de nts). Cuando llega al 5 degrada el primer nt y si en el medio hay nts se volver a unr a despus volver a degradar (es un cliclo ftil). Cuando se acaban los nts del medio sigue degradando la cadena.* La ADNpol I, el fragmento de Klewnow y la T4ADNpol son muy malas para secuenciar porque tienen procesividades muy bajas.9.3.5 DNA pol Taq: Proviene de Thermofilus aquaticus. Tiene una procesividad y una velocidad de polimerizacin alta.

Tiene actividad exonucleasa 5-3 pero no 3-5 ( no tiene actividad correctora de pruebas.

Se usa en la PCR. A veces la actividad correctora es importante ( se hacen servir otras enzimas termoestables que s tienen esta actividad.

Reaccin de secuenciacin:

Se debe disponer de grandes cantidades de molculas de ADN (habitualmente est en forma de doble cadena).

Tenemos un tubo con esta nica molcula de ADN y separamos las 2 cadenas.

TEMA 2: Caractersticas generales de los vectores de clonaje.

Existen 3 tipos de vectores diferentes usados ms ampliamente en el ADN recombinante: Plsmidos. Bacterifago .

Bacterifago M13.

Vector: Es una molcula de ADN autoreplicativa capaz de introducir fragementos de ADN forneo en una clula husped ( permite amplificar indefinidamente el nmero de copias de una secuencia determinada.1. Vectores basados plsmidos.

Se consideran molculas de ADN circulares capaces de replicarse solas. Episoma: Molcula de ADN circular que debe integrarse en el ADN de la clula husped para replicarse.

A menudo los plsmidos dan ventajas a los huspedes como:

Resistencia a Antibiticos.

Resistencia a metales pesados.

Sntesis de toxinas.

Plsmido crptico: Plsmido del cual se desconoce el factor de seleccin que aporta a la clula.

Formas de clasificacin:

Capacidad de propagacin de plsmido a otros huspedes (conjugacin).- Plsmidos conjugativos: Codifican los mecanismos necesarios para la propagacin. A menudo son ms grandes (10,20 kb) que los no conjugativos.

- Plsmidos no conjugativos

Tipo de control:

- Control relajado: no tienen limitado el nmero de molculas por clula. La segregacin de las nuevas copias de los plsmidos dependen de la zona en la que est el plsmido cuando se forme el septo.- Control estricto: Es capaz de autolimitarse l mismo el n de copias de hay dentro de la clula husped (factor F). Habitualmente, al tener un n pequeo de copias en la clula disponen de una maquinaria que asegura una segregacin correcta a las clulas hijas.

Grupo de incompatibilidad:

- Si una clula bacteriana lleva ms de 1 plsmido diferente stos coexisten en la clula y a lo largo de las generaciones pertenecen a grupos de incompatibilidades diferentes.

- 2 plsmidos que pertenezcan a un mismo grupo de incompatibilidad no pueden coexistir dentro de la misma clula.

- 2 plsmidos que pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad son 2 plsmidos que tienen el mismo sistema de replicacin.- Existen 25 grupos descritos.

* En los plsmidos de control estricto esto no pasa porque: Si tenemos una clula que lleva 2 plsmidos F (como mucho pueden haber 2 por clula) y uno de ello lleva un inserto de ADN forneo (los dos pertenecen al mismo grupo de Incompatibilidad).

Como el factor F como mucho limita la replicacin a 2 plsmidos por clula ( cuando la clula se divide una clula hija se lleva el plsmido F con ADN forneo y la otra el F sin el ADN.

La clula se ir replicando varias veces por lo que habrn poblaciones con inserto y poblaciones si l.

* En los plsmidos de control relajado en cambio:

Si tenemos 2 plsmidos PBR (1 con un inserto que se replica hasta 25 copias y el otro sin inserto que se replica hasta 25 tambin) las clulas que reciben plsmidos diferentes acaban dando, al cabo de varias generaciones, bacterias con el mismo plsmido.

Nunca nos encontraremos mezclas de plsmidos al cabo de 6-8 generaciones.Por el azar y cuantas ms generaciones pasan la proporcin de clulas que portan plsmidos con el mismo GI se hacen prcticamente inexistentes.

Puede existir algn mecanismo que regule el nmero de copias de plsmido para la clula aunque no sea muy eficiente.

Existe un balance entre la tasa de divisin (el n de copias del plsmido) y la tasa de divisin de la clula husped.

Los plsmidos son sensibles al cloranfenicol (bloqueador de la sntesis proteica). En plsmidos de control estricto dejan de dividirse cuando la clula deja de crecer. En plsmidos de control relajado ste contina replicndose durante un cierto tiempo dentro de la clula auque esta deje de crecer. Configuracin:- Crculos covalentemente cerrados sin grado de superenrrollamiento interno.

- Crculos covalentemente cerrados con superenrrollamiento (en presencia de ADNgirasa).

- ADN relajado debido a la formacin de nicks por parte de las endonucleasas (en presencia de topoisomerasas vuelven a ser ccc sin superenrrollamiento).1.1 Plsmido PBR-32:

Surgi para responder el siguiente problema:

Se utiliz el plsmido PSC 101 para clonar en su interior genes del ARNribosomal. Se cort al PSC 101 con EcoRI y se le introdujo el ARNr cortado previamente con EcoRI ( ligasa ( lo transformaron sobre E.Coli. Aparecieron una serie de colonias cada una de ellas portadoras del plsmido (ya que este plsmido codifica para un gen resistente a la tetraciclina) por lo que se cultivaron en un medio con tetraciclina.

El problema surgi porque el plsmido recircularizaba con l mismo antes de haberse incorporado el inserto (entonces no se puede saber al cultivarlo si el plsmido contiene el inserto) y vieron que slo 1 plsmido tena el inserto con los genes de codifican para el ARNr. El PBR-32 fue el primer plsmido que permiti saber de una forma simple si un plsmido determinado portaba inserto o no.

Se construyeron unos a base de coger piezas de oros plsmidos mediante ER y ligasas: Trozo del plsmido rSF2124 (

gen de resitencia a la ampicilina.

Trozo del plsmido pMB1 (de E.Coli) ( origen de replicacin.

Trozo del plsmido pSC101 (

gen de resitencia a la tetraciclina.

* Fue el primer ejemplo de construccin modular de plsmidos. Los plsmidos estn formados por mdulos que se pueden pasar de un plsmido a otro como genes de resistencia, origen de replicacin y otros.

Abrimos el plsmido pBR-32 y lo digerimos con Pst (ER) y le insertamos una ADN forneo digerido previamente con Pst. Como el Psr tiene la diana de restriccin en medio del gen de resistencia a Amp ( este gen se corta ( se inactiva y pasa a ser un gen no funcional. Transformamos el plsmido en E.Coli (transformamos 2 cosas diferentes);

Plsmido con inserto.

Plsmido sin inserto (ha recircularizado antes de incorporarlo).

Las clulas que reciben el plsmido sin inserto conservan la resistencia a Amp. Tanto los plmidos con inserto como los que no son del mismo GI ( a lo largo de las generaciones slo habr colonias con el inserto o sin l.

1.1.1 Experimento:

Inicialmente cultivamos E.Coli en tetraciclina ( crecern todas las bacterias que hayan incorporado el plsmido porque los que no lo tienen no sern resistentes a la tetraciclina. Se hace una rplica de las colonias que han sobrevivido (cogemos diferentes colonias de la placa de tetraciclina y las ponemos en una placa diferente en la misma posicin). Nos interesan las bacterias que no crecen en Amp porque llevan el plsmido que ha incorporado el ADN forneo.

En poco tiempo podemos saber si la colonia de bacterias lleva el inserto o no, pero se ha de esperar 24h para que las colonias crezcan en las placas al hacer las rplicas. Si clonramos en la diana BamHI en lugar de la Pst habramos de hacer el experimento y las rplicas al revs.1.1.2 Viere y Massip (Genes reporter):

En el ao 1896 ( Viere y Massip ( Lnea pUC:

Consiguieron eliminar a las 24h de espera y saber si en la placa de la reaccin de ligacin original las bacterias llevaban el plsmido inserto o no.

Se basaba en la incorporacin de un gen reporter (gen chivato).

Los genes chivato codifican para enzimas de las que se dispone de un mtodo colorimtrico (fcil y barato) que nos permite detectar la presencia de la enzima o no ( en lugar de inactivar un gen de resistencia clonamos osbre un gen que codifica para algn producto celular (ej: B-galactosa; este gen hace 3kb, muy grande, y al clonarlo con este gen que ser el gen reporter, el plsmido ser demasiado grande y en E.Coli no replicar. Jacob y Monod:

En los aos 60 descubrieron la alfa-complementacin gnica: La enzima B-Galactosidasa es un tetrmero con cads suunidad de 1000 aa (para ser activo).

Descubrieron que si se rompa el gen que codificaba para esta enzima en 2 trozos (uno pequeo y otro relativamente grande) y cada uno de estos 2 se les colocaban en 2 regiones del genoma, cada uno de los trozo daba lugar a un producto polipeptdico. Si se ponan juntos estos 2 productos polipeptdicosstos son capaces de reconstruir un monmero de la B-Galactosidasa (con 4 monmeros la B-galactosidasa es activa).

Por lo tanto no haca falta que al plsmido se le insertara todo el gen reporter entero ya que funcionaba al introducirse slo un trozo ( en la serie pUC si se introducen 300 bases (codifican para la subunidad alfa de la B-galactosidasa) y ya es suficiente y en el genoma para la subunidad W ( en el citoplasma bacteriano se formar la B-galactosidasa. Se debe trabajar con bacterias que sean Lec- y que lleven un plsmido F con el gen reporter ( previamente se ha debido inactivar el opern Lac.

Si clonamos con ADN forneo sobre el fragmento alfa de la B-Galactosidadsa no se formar B-Galactosidasa ( no habr actividad enzimtica:

Si ponemos X-Gal no se podr degradar (X-Gal es un producto derivado de la lactosa).

Normalmente la X-Gal es incolora y en presencia de B-Galactosidasa se vuelve azul (si es azul significa que no lleva el inserto). El pUC deriva del pBR-322 y conserva la resistencia a Amp y el origen de replicacin ( al cultivar con Amp eliminamos las bacterias que no portan plsmido. Las bacterias de entrada, deben ser Lec Z- y asociada a delecin se debe encontrar otra que de lugar a la subunidad w, es habitual tener una delecin entera del opern Lac en el factor F estable al gen Lec AM15 (subunidad w de la B-Glactosidasa). En algunos casos la delecin Lec AM15 se sustituye en el opern Lac.

1.1.3 Lugar de clonaje mltiple:

Para clonar hacemos servir dianas de restriccin. Estas dianas se deben situar sobre el gen reporter. Desde la diana de restriccin de EcoRI hasta la de Hindi se encuentran formando parte de la regin codificante de la subunidad alfa de la B-Galactosidasa (poco despus del codn de inicio) ( slo es necesario que introduzcamos una ADN forneo en la regin codificante del gen LecZ que es el que codifica para la subunidad alfa. Estas dianas no estn en ninguna otra regin del plsmido y las habituales con las que se trabaja en el laboratorio.

El pBR-322 dispone del gen rho que se encarga de limitar el n de copias del plsmido hasta 25-50 ( es un regulador (-) del inicio de replicacin del plsmido.

En el pUC este gen est mutado ( en lugar de 25-50 copias se obtienen 25-500 ( se puede trabajar con poco cantidad de plsmido (facilita la fabricacin del plsmido).

1.1.4 Aislamiento del plsmido en la bacteria:

Normalmente se hace en 2 estadios:a) Lisis alcalina.

b) Centrifugacin en gradiente de cloruro de cesio (csCl) y bromuro de etidio.

Lisis alcalina: Se basa en 2 factores: Se ha de hacer en presencia de SDS (detergente inico) ( rompimiento de la membrana celular y liberacin del genoma bacteriano y del plsmido al medio y presencia de NaOH (0,2M) y pH = 12 ( el genoma bacterianose desnaturaliza muy fcilmente mientras que los plsmidos quedan en la doble cadena.

Si bajamos el pH = 12 (Posiblemente el genoma no desnaturaliza.

Si subimos el pH = 12 (Posiblemente el genoma s desnaturaliza.

La neutralizacin brusca debe hacerse con c. actico a pH = 4,5 ( el genoma bacteriano intenta renaturalizar y forma entrantes (estructuras de gran PM). Si la neutralizacin no es brusca el genoma renaturaliza fcilmente. Estos entrantes de alto PM despus de la centrifugacin bajan muy fcilmente a bajas g (10.000 g).

Una vez centrifugamos obtenemos un sobrenedante en el que hay plsmidos ( recuperamos el sobrenedante con alcohol ( obtenemos un pelet de plsmidos. Los plsmidos deben ser ccc porque si no, al tratarlos con NaOH pH = 12 se desnaturalizan y al centrifugar sedimentaran juntamente con el genoma bacteriano.

Al realizar la EF siempre nos encontramos una banda correspondiente a plsmdios nickados y otra, ms gruesa, a plsmidos ccc (durante la isis alcalina normalmente se nickan algunos plsmidos.

Para obtener grandes cantidades de plsmido ccc debemos escalar el proceso:

Si partimos de 1-2L de cultivo a veces, durante la lisis alcalina, nos queda ADN bacteriano y una gran cantidad de plsmido nickado alcalino sobrenadante ( debemos separarlo del plsmido ccc con centrifugacin en gradiente de CsCl y BrEt. [CsCl] elevada tienen una densidad muy similar a la del ADN.

Al centrifugar se forma un gradiente de CsCl en el que en cada punto habr una densidad y una [] diferente.

Si colocamos una solucin que contiene ADN las molculas del ADN se situarn en los puntos que corresponden a su densidad.

El BrEt se intercala entre las bases modificando el grado de torsin de la cadena de ADN (la desenrolla un poco).

El ADN ccc se desenrolla sobre l mismo para compensar el desenrollamiento que provoca el EtBr al insertarse en el ADN. El ADN lineal incorpora ms EtBr que una ADNccc ya que sus extremos estn abiertos (no soporta tanta tensin).

El plsmido admite EtBr pero llega un momento en el que se vuelve incapaz de introducir ms porque est demasiado tenso.

Al someter la preparacin contaminada con ADN lineal y nickado como el EtBr es menos denso que el ADN y el lineal capta ms que el circular ( el ADN lineal ver muy disminuida su densidad la haberle incorporado mientras que el ADNccc no tiene.

Con 1 o 2 rondas de purificacin obtenemos un 99,999% de plsmido ccc.

Hace 7 u 8 aos se trataba el cultivo que portaba pBR322 con cloranfenicol ( pasamos de 20-50 plsmidos /cl a 1000 ya que se inhiba la replicacin de la bacteria pero no la del plsmido antes de que el cultivo llegara a la fase estacionaria (si la solucin se vuelve muy viscosa es difcil trabajar con ella) por lo que obtenemos una suspensin mucho menos viscosa a la hora de lisar el cultivo (esta viscosidad se debe al ADN bacteriano).

Ara este tratamiento ya no se hace porque con la lnea pUC ya se obtienen 200-500 copias/cl ( el cultivo se procesa directamente.

El pBR322 como vector normal de clonaje ha pasado a la historia aunque se sigue usando en los casos en los que nos interesa obtener un n pequeo de copias/cl (ej: expresin de protenas recombinantes en E.Coli).

En el plsmido pUC tendremos (P, O y LecZ).

El gen reporter LecZ no slo consta de un promotor sino que tambin tiene un operador ( para que las colonias se vuelvan azules debemos introducir un inductor en el sistema (IPTG). No obstante no es estrictamente necesario ya que al tener unas 500 copias/cl y tener un nivel basal de transcripcin ya obtenemos B-Galactosidasa (el nivel de LecZ es suficientemente importante).

2. Vectores basados en Bacterifago .

Dispone de 2 estrategias para la infeccin de E.Coli. Se fija a la clula a travs del receptor de maltosa ( entra en el ADN lineal de la clula ( se circulariza y la cobertura de la bacteria se desengancha de la clula.2.1 Infeccin por ciclo ltico:

Produce mltiples copias. Se encapsidan.

Provoca la lisis celular y la muerte.

2.2 Infeccin por ciclo lisognico:

El ADN se inserta en el genoma de la cepa husped y se queda un n de generaciones indefinido hasta que las condicones del medio hacen que entre en ciclo ltico.2.3 Establecimiento de ciclo:

Existen 3 protenas diferentes que hacen que el fago entre en un ciclo u otro. Estas protenas son: Represor: Molcula que evita la transcripcin de un determinado gen. Activador:Molcula que estimula la transcripcin de un determinado gen.

Antiterminador:El promotor dirige la sntesis de un policistrn (conjunto de genes que caen dentro de la misma unidad transcripcional). Si colocamos un terminador entre el gen 1 y 2 slo se expresar el gen 1. Cuando la ARNpol va transcribiendo un antiterminador bloquea el loop del ARN haciendo que la polimerasa pasa a travs suyo y siga transcribiendo. Genes que transcriben de forma inmediata:

N ( Antiterminador. La presencia del producto del gen N permite iniciar la transcripcin de los genes medianos: CIII estabiliza la protena CII.

O,PQ: O y P son protenas de replicacin del ADN viral. Q permite transcribir los genes de la cpside y de la lisis de la clula husped.

CII: Activador de la transcripcin. Permite que se active la actividad de la integrasa que en presencia de la secuencia att permite la integracin al cromosoma de la cl husped y la activacin del represor CI.

CI: Inhibe la sntesis de N y Ro y por otro lado tambin inhibe la sntesis de CI. Este represor tambin inhibe la transcripcin de genes O,P y Q.

Si hay mucha CII ( producir mucha CI ( inhibicin de Ro,O,P,Q y N. Los genes que conducen a la bacteria y al fago a un ciclo ltico son bloqueados y como la integrasa est presente ( ciclo lisognico favorecido. Si hay poca CII ( Ciclo ltico. La protena CII es substrato de una proteasa celular llamada Lom: En medio rico la [cAMP] es baja ( alta [Lom] ( degradacin de CII ( favoreciendo que el fago entre en ciclo ltico. En medio pobre la [cAMP] es lata ( baja [Lom] ( CII alta ( Integrasa elevada ( favorece el ciclo lisognico. Un ciclo ltico implica 100 genomas de fago ( 100 cpsides (energticamente es caro). Si la clula no tiene suficientes nutrientes no podr acabar el ciclo ltico ( se integrar en el genoma del husped hasta que lleguen mejores condiciones. El hecho de que el fago entre en lisis o en lisognia depende fundamentalmente del balance entre Ro y CII. El fago lambda aprovecha los niveles de protesas Lom para saber si entra en lisis o lisognia. Lambda tiene un genoma de 48500 bases ( muy largo y tiene numerosas dianas de ER para todas y cada una de las ER ms usadas en el ADN recombinante ( formalmente imposibilita que el fago sea un buen vector de clonacin ya que al digerirlo con ER se fragmenta ( todas estas dianas de restriccin se van eliminando hasta dejar slo una. En una poblacin de 1012 fagos es muy probable que haya mutantes espontneos que presenten mutaciones en estas dianas (en algunos casos estas mutaciones producen individuos inviables). Ro ( Represor.2.3.1 Experimento: Se cogieron muchos fagos infectando a una E.Coli que llevara la diana de restriccin, es decir, el sistema de restriccin que queremos eliminar puesto que E.Coli produce ER ( ER romper el genoma en trozos de lambda (pero en las mutantes que hayan perdido ER y sean viables el fago dar descendencia). En los aos 60 -70 se dieron cuenta que la formacin de la cpside es una reaccin de autoasociacin ( simplemente poniendo todas y cada una de las protenas ya se forma la cpside (todas se transcriben a la vez y no es necesaria una asociacin ordenada) ( este descubrimiento permiti obtener extractos de empaquetamiento (conjunto de protenas capaces de formar una partcula infectiva nueva):1) Lisgeno que slo produce protenas de la cabeza.

2) Lisgeno que slo produce protenas de la cola.

Si los inducimos por separado ninguno de los 2 podr encapsidarse ya que el genoma de lambda debe ser mayor de 37Kb y menor de 53. Por lo tanto, si falta cabeza o cola el genoma ser menor de 37 kb ( los 2 genomas producen las protenas pero el genoma no se puede introducir ( ciclo lisognico. Si aadimos genoma de lambda cuando ya est mezclado los 2 lisgenos y los inducimos conjuntamente (ms de 37Kb) ( se encapsidarn ( ciclo ltico.

Esto es til para transformar genomas grandes ya que el rendimiento de la transformacin es muy bajo y en cambio, por encapsidacin el genoma grande da lugar a nuevas partculas vricas.

Cmo usar estos extractos de empaquetamiento para seguir eliminando dianas de restriccin? (Ej: diana PstI; E.Coli no tiene el ER para esta diana): Se deben coger 1012 fagos y extraerles el ADN genmico y cortarlo con PstI ( ponerlo en contacto con un extracto de empaquetamiento de manera que los nicos fagos que no tengan dianas PstI podrn encapsidarse y dar lugar a partculas capaces de infectar E.Coli (si hay una diana de restriccin el ADN del fago quedar lineal y se podr encapsidar, pero al entrar en E.Coli ser degradado). Si usamos el gen CI como diana de clonaje el fago slo podr hacer un ciclo ltico y prcticamente no lisognico ( Manera de determinar si un fago lambda lleva inserto o no.

Aunque el medio sea rico hay una pequea proporcin de fagos que siguen un ciclo lisognico ( dentro de la calva es habitual encontrar bacterias ( calvas turbias. Si clonamos cobre CI el fafo slo podr seguir un ciclo ltico ( calva clara.

Un fago normal siempre da lugar a calvas turbias.

Un fago con inserto siempre da lugar a calvas claras.2.3.2 Genoma del fago : En la parte izquierda siempre estn agrupados los genes de la cpside (cabeza y cola). En la parte derecha estn los genes de la regulacin y las protenas de replicacin.

En la parte central estn todo los genes implicados en la recombinacin y en la entrada del ciclo lisognico ( esta parte es prescindible para el ciclo ltico ( si la eliminamos y la substitumos por un inserto slo se producir el ciclo ltico. Cmo dejar una diana de restriccin eliminando todo el resto?

Eliminado todas las dianas que estn repetidas y nos fijamos en dianas de ER nicas.

Diseando un adaptador que lleve en el extremo sobresaliente Nha y en medio del adaptador meterle una secuencia GAATTC (diana de restriccin de EcoRI) ( incubarlo con fago lambda ( ligasa ( obtendremos una genoma de lambda con una nica diana de restriccin EcoRI (aunque la diana de restriccin Nha quedar doble).2.3.3 Desarrollo de vectores basados en el fago :

Existen 2 estrategias para desarrolarlos: Vectores de insercin: -gt 10:

Tiene una nica regin EcoRI en el gen CI. En genoma de Lambda tiene unos 48502 pb (una vez eliminadas las dianas) ( el fafo admitir como mucho un inserto de 3,5kb (ya que si no el genoma hara ms de 52kb). Para aumentar la longitud del ADN o clonar eliminaremos otros trozos del genoma prescindibles para el ciclo ltico ( -gt 10 presenta una delecin de 3kb al lado de su regin att ( esto dificulta pero no impide que el fago entre en lisogenia ( obtenemos un fago de 45.500pb ( con este fago podemos clonar de forma normal un inserto de hasta 6,5kb. ste se usa principalmente para clonar cADN ( para crear bancos de cADN. Teniendo cepas de E.Coli con una mutacin en el gen Hfl (alta frecuencia de lisogenizacin) cuando son infectadas por el fago ste siempre sigue un ciclo lisognico porque; el gen tiene la misma diana que la proteasa Lom (es decir, el gen CII es tambin su diana), el fago, normalmente, incrementa los niveles de CII ya que la proteasa Lom siempre est presente en E.Coli (se protege frente a E.Coli), si tenemos una cepa Hfl- la proteasa Hfl no est presente y aunque haya proteasa Lom habr mucha cantidad de CII ( el fago siempre seguir un ciclo lisognico.* Esto nos proporciona una manera fcil de permitir que slo aparezcan fagos recombinantes ( evitamos as que nos aparezcan fagos sin inserto:

1) En E.Coli normal:

CI sin inserto ( ciclo ltico o lisognico segn las condiciones del medio.

CI con inserto ( CI no ser funcional ( siempre ciclo ltico.

2) En E.Coli Hfl-:

CI con inserto ( CI no ser funcional ( siempre ciclo ltico.

CI sin inserto ( [CII] es alta ( [CI] tambin ( siempre ciclo lisognico.

* Si la reaccin de ligacin la hacemos sobre una cepa de E.Coli Hfl- aquellas calvas claras que aparezcan se debern siempre a los fagos que hayan incorporado el inserto.

-gt 11 o bancos de expresin:

Tiene una nica diana EcoRI sobre el gen LecZ (muy similar al del pUC) situado en la regin central que es prescindible para el ciclo ltico (aunque pongamos un inserto en el LecZ el fago podr llevar a trmino un ciclo ltico).

El lugar de clonaje de EcoRI en este gen LecZ est situado a unas 53 bases del extremo 3 del gen ( crecern todos pero los que no lleven el inserto darn lugar a colonias azules.

Esta proximidad de 53 pb permite conseguir protenas de fusin entre el trozo 5 del LecZ y el polipptido del gen (codificado por el ADN forneo) que hemos clonado si el marco de lectura es favorable. Esto se debe a que en mucho casos este trozo de LecZ estabiliza mucho el polipptido que viene a continuacin en una misma cadena. Tenemos 6 posibilidades diferentes de clonar a EcoRI y slo 1 da lugar a un marco de lectura favorable (los marcos de lectura vienen por 3 nts). Si tenemos Ac contra el polipptido podremos detectar el gen que codifica para el polipptido (insertos que se encuentran).

Ni -gt 10 ni -gt 11permiten la escisin in vivo de ADN clonado (para sacarlo se ha de cortar con EcoRI). Vectores de sustitucin: Cortan toda la parte central (antes de clonar) dedicada al ciclo lisognico (13-15kb) del fago lambda y los substituyen por ADN forneo.

Estos vectores permiten insertos mucho ms largos que los vectores de insercin.

Siempre realizan un ciclo ltico.3. Vectores basados en Bacterifagos filamentosos (M13, Fd y F1).

Estos fagos son un 97% homlogos y extraordinariamente parecidos. Reciben este nombre porque sus cpsides son muy alargadas y tienen apariencia de filamento. Contienen una molcula de ssADN de 6,4kb. Ventaja: No lisan la clula que infectan si no que:

Inyectan el ssADn en el citoplasma ( se convierte en dsADN que se replica como si fuera un plsmido hasta obtener 100 copias/cl. Una vez han obtenido estas 100 copias modifican su replicacin (de replicacin bidireccional a replicacin en forma de crculo rodante) ( obtenemos una serie de concatmeros de cadena sencilla.

El producto codificado por el gen 2 va cortando y circularizando las diversas subunidades que forman el concatmero ( las subunidades se encapsidan en las membranas de la clula (no en el citoplasma) y conforme van a travesando la membrana se van encapsidando ( en el citoplasma celular nunca hay partculas fgicas ( E.Coli nunca se lisa. Si hacemos una extraccin del ADN circular en E.Coli podremos obtener el genoma del fago en forma de dsADN como si fuera un plsmido mientras que en el sobrenedante hayaremos los fagos filamentosos (los que son de ssADN).

Precipitando el sobrenedante con polietilenglicol recuperaremos los fagos filamentosos.

Adems no existe una limitacin a la hora de empaquetar un inserto ya que su cubierta puede ser muy grande. El problema es que a la hora de replicarse son relativamente sensibles ala medida del inserto introducido porque se inestabiliza mucho con insertos largos ( no se hacen servir.

Los fagnidos tienen caractersticas de los fagos filamentosos pero se les ha introducido genes nuevos para mejorar el M13. Fago M13 HP18:

Tiene LecZ clonado justo en la parte 3 (upstream) de la regin intergnica de este fago. Esta regin determina el inicio y el final de cada uno de los concatmeros de cadena sencilla y adems contiene un terminador Rho independiente que es donde acaban todos los transcritos iniciados a partir de los diferentes genes del fago.

El gen LecZ se coloca con el multicloning site porque el pUC y el M13 son totalmente intercambiables.

TEMA 3: Construccin y rastreo de bancos de cADN.

Un banco de cADn es una coleccin lo ms cuidadosa y representativa posible de los diferentes transcritos dentro de una clula o tejidos en las que est pesados los ADN complementarios para poder ser clonados dentro de un vector de clonaje.Una clula de mamfero contiene entre 10.000 y 30.000 transcritos diferentes. Si todos estos trasncritos estuviesen representados de la misma manera, planificar un banco de cADN sera muy fcil pero esto no es as porque hay genes que tienen muchos transcritos de ARN que acostumbran a ser muy estables (transcripcin constitutiva) y otros genes que tienen pocos transcritos de ARN ( esto genera un problema porque si queremos obtener un banco representativo lo debemos de tener en cuanta ya que la probabilidad de que aparezcan transcritos de n bajo de copias es menor que la que aparezcan transcritos de n alto de copias.Si el ARN pertenece a los transcritos de 15 copias/cl de los 33.333 mARN total de la clula slo 1 ser el que nos interesa ( el nmero de clones que necesitaramos para tener una probabilidad fija de obtener los genes clonados sera:

Donde: u = recproco.

p = probabilidad.

Si p = 0,99 ( N = 1,5105 ( los bancos de cADN, para ser representativos, acostumbran a tener un nmero grande de clones (cuantos ms clones ms representativa ser la genoteca).Clones independientes:

Son clones que aparecen inmediatamente despus de hacer todos los pasos necesarios para la realizacin de un banco de cADN. Si el n de clones independientes que obtenemos no es muy alto (104): Si infectamos E.Coli con estos clones como mnimo obtendremos 106 clones que sern fotocopias de los 104 clones (lo que no haba en los primeros no lo estar en los segundos) ( por lo tanto los 106 no son clones independientes. Lo que nos interesa es el n de clones independientes iniciales.

A la hora de hacer un banco de cADN debemos afinar muy bien el tejido del cual queremos obtener los genes (si los genes que nos interesan son muy abundantes en el cerebro y pocos en el hgado realizaremos el banco a partir del cerebro para que el n de clones independientes sea el mayor posible.1. Realizacin de un banco de cADN.

Extraccin del ARN total mediante un sistema de fibras de borosilicato que permiten capturar los c.nucleicos con rapidez y eficiencia. Purificacin del mARN mediante columnas de afinidad (con poliT que es donde se enganchan las colas de poliA de los mARNs). Los genes de las histonas no estn poliadenilados ( nunca los encontraremos en estos bancos. Pueden hacerse mediante 2 estrategias; por el mtodo de autoprimado (ms simple) o por el mtodo de primado por homopolmero.

1.1 Mtodo de autoprimado (ms simple):

De forma inherente se pierden frecuentemente la parte 5 de los transcritos. Va un oligonucletido T que puede llevar o no un adaptador unido, ste anilla e hibrida con la cola poliA del mARN obteniendo un extremo 3 donde la transcriptasa inversa puede hacer la cadena complementaria. Esto es un hbrido ARN - ADN que no se puede clonar ( tratarlo con RNasa que hace cortes en el esqueleto fosfodister del hbrido ADN-ARN (la RNasa se inactiva en dplex de ADN o de ARN) en lla cadena de ARN. Sobre este nick aadimos ADN polI que mediante su actividad polimerizadota y exonucleasa 5-3 extiende la molcula de ADN.

Hemos perdido una parte del extremo 5 del ARN (corresponde a la cabeza) ya que corresponde al primer de la ADNpolI ( Nos queda un pequeo trozo de hbrido de ADN-ARN. Tratamos con T4-ADNpol ( molcula de ADN doble con extremos romos.

Para facilitar el clonaje es mejor partir de una diana NotI despus de la cola poliT al ADN (al extremo 3). Aadimos adaptadores EcoRI y digerimos con NotI ( molcula de ADN con un extremo con la diana de EcoRI y en el otro extremo la diana NotI.

Obtenemos un inserto apto para realizar un clonaje direccional.

La prdida de la cabeza puede ser un problema si nos interesa el extremo 5 del mARN, no no (si nos interesa la regin leader del mARN no utilizaremos este mtodo).1.2 Mtodo primado por homopolmero:

Permite obtener transcritos completos. Se realiza mediante: Adicin de un homopolmero al extremo 3 del cADN. El oligonucletido poliT se utiliza como primer para la transcriptasa inversa.

Tratamos con una solucin relativamente alcalina que desnaturaliza el ARN pero no el ADN ( tenemos una nica cadena de ADN.

Aadimos una cola al extremo 3 del cADN de G con la Terminal transferasa ( tenemos el cADN con un extremo 3 con una ristra de G (la longitud de estas G depende del tiempo de trabajo de la Terminal transferasa.

Hacemos la segunda cadena ( necesitamos un oligonucletido que contenga C ( dar lugar a un extremo 3 que mediante el fragmento Klenowhar la cadena complementaria ( tendremos una molcula de cADn romo con un extremo poliA y otro poliC. Para facilitar el clonaje al poliT le aadiremos una secuencia que codifique para una diana de restriccin y a la cola de poliC tambin (puede ser la misma diana o diferente).

Estas dianas tambin se copian en la cadena complementaria. Cortamos con las ER ( queda clonable.

El problema es que la secuencia intermedia puede ser desconocida ( dentro puede haber dianas de restriccin ( para evitar que el transcrito se corte debemos tratar previamente con la metilasa correspondiente con los ER de esta diana. Pero no podemos mutilar si posteriormente debemos cortar los extremos (simplemente dejamos los extremo romos, tratamos con metilasa y aadimos linker). Si nos queremos ahorrar el tratamiento con metilasa pero queremos metilar el ADN igualmente existen A y C como nts disponibles comercialmente previamente metilados en la posicin 5 (posicin de metilacin de las ER) ( al hacer la segunda cadena aadimos A o C metiladas ( asta estar metilada y entonces la doble cadena estar hemimetilada ( la ER no cortar. Otra opcin es colocar a los extremos dianas de restriccin poco probables (ej: SalI y NotI). Ahora ya debemos clonar los cADNs.

3. Mtodos de screening. Hasta los aos 80 se usaban vectores basados en plsmidos pero conllevaban problemas:

Era relativamente difcil rastrear la genoteca obtenida.

Era relativamente difcil conservar la genoteca obtenida (paso del clon independiente).

Era relativamente difcil transformar la genoteca obtenida (paso del clon dependiente).

Despus se usaron vectores basados en lambda (serie gt):El rastreo era mucho ms fcil porque en una calva, cuando un fago lisaba rompa la bacteria y dejaba libre una gran cantidad de c.nucleicos no encapsidados (90%) del fago por lo que facilitaba el rastreo y adems la concentracin de c.nucleicos no encapsidados era muy alta.La conservacin del banco tambin era mucho ms sencilla (slo haca falta meter una gots de cloroformo en la calva y mantenerla a una T = -80C).

3.1 Mtodo de screening ms comn:

Sobre las calvas blancas se aplica una redonda de nitrocelulosa del mismo dimetro de la placa de petri ( el ADN sin encapsidar queda adsorbido. En la nitrocelulosa tenemos una rplica de los c.nucleicos que podran haber en la placa. Por otro lado preparamos la sonda (con el gen del cual queremos detectar su presencia en el banco) con la que hibridaremos a la nitrocelulosa ( slo quedarn detectados los fagos que porten un cADN que sean homlogos a la sonda que utilicemos (autoradiografa). Para capturar el cADN que nos interesa volveremos a la placa de petri donde an hay c.nucleicos en las diferentes calvas.

Si no tenemos ningn gen homlogo del gen que nos interesa la obtencin de la sonda ser problemtica por lo que existen diferentes estrategias:

1) Construir un oligont que acte como sonda: Es un sistema que permite determinar la secuencia N-terminal de una protena (mtodo Edman) de forma automatizada ( podremos obtener rpidamente la secuencia correspondiente a los 20 aa del N-terminal ( mediante el cdigo gentico podremos obtener la secuencia: Si el primer aa es una Met ( ATG.

Escoger la parte de la secuencia que sea ms rica en Met y Pro (slo tienen un codn).

Mirar la presencia de Asn, Asp, Glu, His, Lys, Phe, Tyr (slo determinados por 2 codones)

E ir hacindolo as hasta obtener 60 nts pero con 20 o 30 nts ya es suficiente.

Debemos de conseguir unas condiciones de hibridacin en las cuales, en el caso de que nos hayamos equivocado en algunos nts, las posiciones fijas puedan hibridar igualemente ( condiciones poco restrictivas.

Tambin pueden realizarse todos los olints posibles pero si hay muchas indeterminaciones diferentes la sonda efectiva que detectaremos ser muy baja.

Si hay pocas indeterminaciones es mejor hacer todas las secuencias posibles.

2) Obtener anticuerpos especficos para la protena.

3.1.1Reaccin de marcacin de la sonda:

Si es un oligont ( Terminal transferasa marca el extremo 5.

Si la sonda es un clon existente de ADN ( la sonda se ha de marcar por nick-translation o random primed.

Nick-translation:

ADNpol I + 4dNTPs (uno de ellos marcado con P32).

La ADNpolI detecta los nicks y se coloca comenzando a aadir nts; al mismo tiempo que va aadiendo va degradando el resto de ADN.

La ADNasa I introduce nicks al ADN que queremos marcar.

Es un mtodo muy irreproducible. Random primed o primado al azar: Desnaturalizamos el molde de ADN que debemos marcar y aadimos olignts de 6 o 10 bases hechos al azar.

Si la [oligonts] es baja ( la probabilidad de que alguno oalgunos hibriden es relativamente elevada ( obtenemos una ADN marcado extraordinariamente bien.

Como mnima da lugar a sondas marcadas una unidad ms que la nick-translation.

Marcaje no radiactivo: Dioxigenina:No da problemas de fondo porque slo se encuentra en digitalis purpure.

Existe un Ac que detecta este grupo con mucha diferencia.

La dioxigenina se incorpora a un nt por sntesis qumica (normalmente T) y no existe ningn problema para incorporarla en el ADn ya que la ADNpol la puede polimerizar.

Detectamos la presencia de la sonda hbrida con un Ac especfico contra la dioxigenina.Este anticuerpo estar marcado con una enzima como la fosfatasa alcalina.

Se lleva a cabo una reaccin para detectar la enzima aadiendo un sustrato incolor que la enzima transformar en un producto con color (azul oscuro).

4. Rastreo de un banco de cADN.

La genoteca debe ser adecuada. Sobre la placa de petri se hace una transfeencia a la nitrocelulosa ( los .n y alguna protena que produce el fago lambda al lisarse la clula se transferirn. Detectaremos la protena en lugar de los c.n mediante Ac contra esta protena.

Los c.n que codifican estas protenas los capturaremos ms adelante.

Se usan membranas de PVDF en lugar de nitrocelulosa.

Se hace la rplica sobre la placa de Petri y la incubamos directamente con el AC (srum policlonal o monoclonal que hemos obtenido) para estas protenas ( los Ac se enganchan. Detectamos la presencia de este Ac contra la membrana de PVDF:

Usando un segundo Ac que habitualmente es una IgG de una especie heterloga conjugada con enzimas (peroxidasa o fosfatasa alcalina).

Incubando la membrsana con sustratos de la enzima que hayamos utilizado.

Con un palillo picamos sobre la colonia obteniendo el fago que contiene el gen que codifica para la protena de inters. En un banco de cADN adems de detectar y coger genes que codifican para una protena determinada tambin puede verse cmo estn regulados los genes.

4.1 Expresin diferencial de genes:

Se trata de buscar genes que se expresen en un determinado teidos o en una etapa de desarrollo.

Preparamos un banco de ADN marcado con un mARN de gstrula; preparamos 2 o 3 (2 obligatoriamente) rplicas del banco de cADN que en la misma posicin de la placa de petri tienen el mismo clon.

Hibridamos con un ADN marcado con un mARN de gstrula o de la fase huevo (marcar la primera cadena ( suministra un nt marcado a la trascriptasa inversa al hacer la primera cadena de cADN; con el mARN de la fase de gstrula hacemos lo mismo). Con el mARN marcado hibridamos una placa de Petri y con el otro la otra placa:

Con el mARN de la fase gstrula no se hibridan todos los clones porque:

Todos los clones provienen de la fase gstrula.

Para que una sonda sea efectiva ha de haber una cantidad mnima (entre 1-0,01 g) ( cuando hacemos la reaccin de marcaje hacemos una extraccin de mARN total de la fase gstrula (hay genes que tienen muchas copias y otros pocas) ( si ponemos 1 g de sonda marcada estamos poniendo sondas correspondientes a genes de alto o mediano n de copias pero no de los genes de bajo n de copias. En la fase huevo, los genes que se estn expresando de forma abundante en la fase gstrula, a la fase huevo se expresan menos (genes fundamentales para que se de el paso de una fase a otra o genes muy importantes). Para detectar genes que se expresan de forma poco abundante pero diferencial entre diferentes tejidos o entre diferentes etapas embrionarias hacemos lo siguiente: Cogemos las clulas que pueden estar expresando el mARN de inters.

Por otra parte debemos extraer otro poliA que no est en la misma fase embrionaria o que no est tratado con un medicamento (son las clulas de referencia).

Cogemos las primeras clulas y va transcriptasa inversa hacemos una cadena de cADN ( se elimina el ARN por calor o con NaOH diludo de modo que slo quedar la secuencia complementaria.

Juntamos estos sADNs con los mARNs de la clula de referencia ( los mARNs que se estn expresando en los 2 caso se podrn hibridar.

Si un mARN ni estuviera en las clulas de referencia ste no hibridar.

Lo pasamos por una columna de de hidroxi-apetita (es capaz de retener doles cadenas respecto a cadenas sencillas de forma diferencial) a una [] determinada de tampn fosfato ( slo sale el cADN no hibridado (el que se expresa slo en las clulas tratadas con el medicamento) y lo hacemos varias veces ( el 99% de los cADNs que obtendremos provendrn slo de clulas tratadas. Clonaremos este ADN.

5. Arrays.

Disponemos de 107-8 clones de cADN pero a la hora de hacer arrays queremos ver la expresin diferencial de un gen en condiciones determinadas (slo se pondrn genes diferentes). Seleccionamos diferentes genes dentro del banco de cADN ( ESTs (expressed sequence Taqs). Se secuencian los primeros 100-400 nts de cada uno de los clones del banco de cADN.

La secuencia nos indica si el clon es diferente del resto de clones que y tenemos ( si el clon es diferente entra a formar parte de la base de datos del EST ( podremos determinar todos los clones diferentes de estos 107-8.

Va PCR hacemos una extraccin de ADN directo ( obtenemos una gran cantidad (1,2 g) de cada uno de los clones diferentes ( pondremos una cantidad relativamente pequea (nanogota) sobre una porta de vidrio tratada con poliLys (da cargas +) mediante robots o impresoras de chorro de tinta ( tendremos una porta en la que hay gotas de cada uno de los cADNs diferentes que haba en el banco. Obtendremos un ARN de las clulas tratadas con el medicamento y de las de referencia.

Usaremos nts marcados con fluorforos diferentes (cuando se iluminan con luz azul emiten luz roja o verde) y:

Cy5 ( color rojo.

Cy3 ( color verde.

Cuando hacemo sla primera cadena ponemos nts + 1 nt marcado con fluorfor verde (clula tratada) o roja (clula de referencia) + transcriptasa inversa ( lo mezclamos y lo ponemos a hibridar en el porta en el que estn las cadenas complementarias. Slo podemos hibridar con las cadenas del porta; entre ellos no pueden hibridar ya que son de cadena sencilla (no hay ninguna cadena complementaria) Color rojo: mARN que slo se expresa en clulas de referencia.

Color verde: mARN que slo se expresa en clulas tratadas.

Color amarillo plido o marronoso: Genes que se expresan en las dos clulas.

Para que el ADN pueda hibridar ha de estar desnaturalizado. Con esta tcnica no se pueden detectar transcritos poco frecuentes en los arrays ya que tienen limitaciones importantes ( el spot de ADN, una vez hecha la hibridacin, no es uniforme y la lectura se hace con un liser ( puede ser que no detecte la fluorescencia donde debera haberla. Como el segundo spot no es homogneo al atravesarlo el lser no lo detectar correctamente.6. RT-PCR.Es una variante de la PCR que se hace a partir de la cadena de cADN obtenida con transcriptasa inversa (partiendo de un mARN). Con la primera cadena (no son necesarias las 2) y con un par de oligonts especficos se puede hacer por PCR.* Esto se realiza porque ninguna termopolimerasa copia ARN.

Ejemplo: Deteccin del gen de la hidroxalato reductasa y sus opciones:

a) Banco de cADN + hibridacin con una sonda heterloga.

b) Si disponemos previamente de la secuencia d la hidroxalato reductasa lo podemos amplificar por RT-PCR:

Se tarda mucho menos tiempo pero es imprescindible conocer la secuencia que queremos amplificar (con alguna excepcin).

Nos basamos en una faena previa de bancos de cADN y determinacin de secuencia.Realmente slo sera necesario conocer el extremo 5 del cADN para hibridar un oligont ya que en 3 el mARN tiene la cola poliA. Aunque lo normal es tener toda la secuencia.

TEMA 4: Bancos de ADN genmico.

En un banco de cADN pero ste no contiene intrones ni promotores Slo secuencias codificadas por los genes, no elementos reguladores ni intronesPara obtener estas secuencias moduladoras de la actividad gentica debemos poseer un banco de ADN genmico que contiene las secuencias que hayaramos en un banco de cADN ms las secuencias reguladoras ( secuencia del genoma entero o completo.Para obtener la secuencia de un genoma ste debe ser cortado en fragmentos de cmo mximo 1Kb (porque es lo mximo que se puede secuenciar).

1. Estrategias para la obtencin de bancos de ADN genmico. Debe cogerse el genoma y cortarlo al azar en fragmentos de 1Mb, clonar los plsmidos y secuenciar directamente. Con genomas simples se puede hacer, pero en genomas eucariotas existe ADN repetitivo que es difcil de empalmar a la secuencia obtenida. Si obtenemos una secuencia repetitiva que se encuentra en diversos cromosomas no sabremos a cul de ellos pertenece; por ello sera necesario tener fragmentos muy largos.

En lugar de tener clones con cADn de transcritos de la clula o de tejidos determinados tendremos cADN correspondiente a fragmentos de un genoma.

Banco de cADN:

Habitualmente partimos de un tejido.

Banco de ADNgen: No es necesario partir de un tejido concreto (los tejidos, en general, contienen la misma informacin gentica).

2. Representatividad los los bancos genmicos.

2.1 Probabilidad de hallar un clon con la secuencia deseada:

Fijando una probabilidad del 99% y aislando n (

Donde:L = Longitud media de los fragmentos clonados (en kb)

M = Medida del genoma (en kb).

n = nmero de clones independientes de la genoteca.

* Cuanto mayor sea un genoma, ms clones deberemos obtener para que sea ms representativo. Cuanto ms grandes son los fragmentos que clonamos menos clones sern necesarios para obtener una elevada representatividad. El n de clones disminuye a medida que aumenta la longitud de los insertos y el n de clones independientes aumenta a medida que aumenta la longitud del genoma. Debemos tener en cuenta las caractersticas de los vectores que usaremos.PlsmidosFago CsmidosBACs / YACs

Difcil clonar + de 10kbClonaje de hasta 22 kbClonaje de hasta 40 kbClonaje de hasta 2 Mb

Difcil obtener n grande de transformantes de ADN forneo.Fcil obtener + de 107 transformantes de ADN forneo.Fcil obtener + de 107 transformantes de ADN forneo.Difcil obtener n grande de transformantes de ADN forneo.

Fcil extraccin y manipulacinExtraccin y manipulacin no difcilExtraccin y manipulacin no difcilExtraccin y manipulacin difcil

2.2 Plsmidos: Son poco usado sen bancos de ADNgen porque son difciles de conservar. El rendimiento para clonar insertos en su interior es bajo.

Los sistemas para evitar la aparicin de colonias sin inserto no son muy eficientes (est ms desarrolado en fagos lambda que en csmicos) Sirven para clonajes rutinarios pero no para clonajes genmicos.2.3 Fago :

Para poder realizar vectores de sustitucin necesitamos conocer su replicacin. En el interior de la cpside poseen el genoma lineal (50 kb) con 2 extremos cohesivos (cuerpo) consigo mismos. Se circularas y comienza 1 o ms ciclos de replicacin bidireccional.

Se separan gracias a enzimas del husped o a partir del producto del gen Rad del fago.

Posteriormente se da un cambio en la forma de replicacin y pasamos a realizar una replicacin en forma de crculo rodante (unidireccional) en el que se forman concatmeros del genoma del fago y se genera un extremo lineal libre.

E.Coli dispone del sistema recBCD capaz de degradar estos extremos (acta una exonucleasa) pero el fago labda, gracias a su propio gen gam inhibe directamente el sistema recBCD.

Se cortan los genomas encapsidados y se encapsidan.

Reaccin de empaquetamiento:

La protena A es una prot. especfica del fago que reconoce 2 secuencias cuerpo y entra en el genoma del fago (est en medio del cuerpo) ( dentro de la cpside previamente formada. La protA espera concatmeros ( si situamos un genoma del fago previamente cortado por la secuencia cos, la protA no la puede encapsidar.

Para que la reaccin de encapsidacin sea efectiva es necesario que el ADN se haya replicado en forma de concatmeros.

Los genomas circulares con un nico extremo cos son incapaces de encapsidarse.

3. Vectores de sustitucin.

En los vectores de sustitucin se sustituye la regin no esencial (compuesta por genes) por un inserto de ADN de inters. 3.1 Fago :

En ausencia de estos genes el fago lambda replica de forma diferente ( realiza la replicacin bidireccional y no la unidireccional (crculo rodante) como si fuera un plsmido. El producto de una replicacin bidireccional no se puede encapsidar.Gen red: Participa en la recombinacin general del fago (recombinacin muy eficiente) y tambin est implicado en la separacin de los crculos.

Gen gam:Inhibe el sistema recBCD.

* Por tanto el fago aprovecha la maquinaria de recombinacin general del husped (recA, recBCD de E.coli)

recBCD:Protena que corta alrededor de la secuencia chi y desplaza una de las 2 cadenas de ADN (tiene actividad helicasa y tambin es una endonulceasa de doble cadena).recA:Protena (terminasa) que reconoce la secuencia desplazada por recBCD y desplaza la secuencia similar en la otra doble cadena del dsADN.

* recBCD y recA son imprescindibles para que haya recombinacin en E.Coli. Si el fago posee una secuencia chi puede haber recombinacin entre 2 genomas de lambda entonces encontramos, almenos, 2 secuencias cuerpo en un concatmero circular ( esto ya se puede encapsidar. El fago lambda podr replicarse de forma normal en ausencia de red y de gam y adems proporcionar un mecanismo extra para seleccionar slo a fagos recombinantes. Al sustituirse la protena control por ADN forneo pasa a ser red- gam- ( en ausencia del gen gam la clula es recBCD+ ya que gam inhibe recBCD ( gam- = recBCD+. El gen red en el fago y el gen recA y recBCD de E.COli seran grupos diferentes de genes implicados en la recombinacin:

Si el fago es gam- (E.Coli es recBCD+. Si el fago es gam+ (E.COli es recBCD-.3.1.1 Obtencin de banco genmico en el fago :

Sustituimos la regin central con un inserto cortado con BamHI. Digerimos con BamHI y EcoRi (tambin tiene dianas SalI y EcoRI) simultneamente en la regin obtenemos 2 brazos y un stuffer central. Precipitamos con EtOH (el ADN precipita con ste dependiendo de su largo; hasta 15 oligonts unidos entre ellos son solubles en EtOH).

Los 2 oligonts de 12 bases no precipitan pero el resto s. En el precipitado del tubo estn los 2 brazos y el stuffer.

Eliminamos el sobrenedante y nos quedamos con el precipitado del fondo del tubo.

El stuffer ya no puede ligar con los brazos porque falta la pieza pequea que permite restaurar el fragmento original.

Debemos partir de un ADN genmico de alto PM y hacer una digestin parcial con Sam3AI porque: El objetivo principal para conseguir un banco genmico es obtener la secuencia del gen.

Por solapamiento de los diferentes fragmentos podemos reconstruir el genoma ( nunca partiremos de un solo genoma si de muchas clulas de un tejido para tener ms de un genoma; adems, cada genoma diferente est digerido con una ER diferente ( podremos solapar los diferentes fragmentos (contiguos) que obtenemos. El proceso de solapamiento recibe el nombre de walking.

Por lo que haciendo la digestin con Sam3AI hacemos posible la posterior reconstruccin de la informacin.

Los extremos derivados de la digestin son compatibles con los de BamHI. Si tenemos un cromosoma de 10Mb y Sam3AI tiene una frecuencia de corte una vez cada 256 bases cortar muchas veces. Si hacemos una digestin completa con SamAI obtendremos fragmentos de 256 bases por lo que deberemos realizar digestiones parciales para que slo corte 1 diana cada 100 dianas (dejamos menos tiempo) ( cada cromosoma quedar cortado de forma diferente porque los cortes de Sam3AI se hacen al azar. Cada genoma estar cortado por una diana diferente. El genoma debe ser de alto PM porque: Si despus de hacer la extraccin obtenemos fragmentos de 20kb (el fago admite fragmentos de hasta 20kb) con extremos romos ( estos no son clonables en el vector. Como que a estos fragmentos hemos de realizarles una digestin parcial con Sam3AI obtendremos fragmentos de 3kb (para hacer bancos de ADNgen queremos fragmentos de ADN largo) ( deberemos evitar pues los pasos que rompan el ADN y a partir de elevadas cantidades (mg) de ADN genmico.

Digestin parcial: Debemos aadir entre 10 y 100 unidades menos de Sam3AI que en ADN de partida que tenamos.

Realizaremos una calibracin ( tiempo de digestin respecto al tamao de los fragmentos. Trataremos el inserto con fosfatasa alcalina para que no se religuen con ellos mismos por que de lo contrario podran ser que los pequeos fragmentos derivados de la digestin que antes no estaba unidos liguen entre ellos ( cada uno de los fragmentos que obtenemos proviene de una nica digestin parcial.

Los brazos ya los tenemos preparados (previamente hemos digerido con BamHI y EcoRI) y el stuffer tambin. Adjuntamos los fragmentos obtenidos de la digestin parcial con los brazos del fago: Estos brazos tienen extremos BamHI y pueden ligar entre s aunque no dan descendencia. Al medir 32kb no encapsidan ya que como mnimo son necesarios 37kb.

El stuffer es incapaz de ligar con brazos o con el inserto, slo liga con l mismo y como no dispone de secuencias cuerpo no puede encapsidarse (el fago lambda slo se encapsida si posee secuencias cos adyacentes). El nico que puede encapsidarse es el brazo derecho con un inserto y un brazo izquierdo. Si ligan brazo D + D + inserto faltarn los genes que determinan la cabeza y la cola ( no podr encapsidarse. Si ligamos 2 brazos I + inserto slo tendremos genes para la cabeza y la cola pero no para la replicacin ( no podr encapsidar. El lambda que usamos como vector es un genoma lineal que tiene 2 extremos cuerpo en forma de cadena sencilla. Uno de estos extremos est en el extremo derecho y el otro en el izquierdo ( al hacer la reaccin de ligacin anterior los diferentes brazos + el inserto podrn seguir unindose entre ellos porque tienen secuencias cuerpo en los extremos (es favorable porque no tenemos muchos concatmeros pero esto prcticamente no puede encapsidarse ya que para hacerlo las regiones cuerpo deben ser de doble cadena). Hacemos una reaccin de ligacin en condiciones que favorezcan la formacin de largos concatmeros (T = 4C y alta [ADN]) ( ms inserto flanqueado por extremos cuerpo de doble cadena. Una vez obtenidos estos largos concatmeros deberemos encapsidar in Vitro (es ms eficiente comprar extractos de empaquetamiento que hacerlos).3.2 Fago P2:

Es capaz de infectar a E.Coli y con una alta eficiencia en