aplicação de rna seq em biologia molecular
TRANSCRIPT
Karina MeloTalita Fernanda
Belém-PA2012
Universidade Federal do ParáMestrado em Genética e Biologia Molecular
RNA seq
Uma abordagem desenvolvida para transcriptoma usando tecnologias de
sequenciamento “next generation”
Medição dos níveis de transcritos
Determinar a estrutura funcional
dos genes
Permite
O termo RNA-seq tem sido usado para representar o transciptoma revelado por sequenciamento de cDNA por NGS (sequenciadorres de segunda geração);
Permite a quantificação dos níveis de expressão gênica, mesmo em transcritos que possuem níveis mais baixos de expressão devido a sua alta sensibilidade;
Útil para descobrir novas transcrições, identificação de mutaçoes, indels, splicing alternativos;
RNA seq
MetodologiaRNA seq
Fonte: Snyder et al, 2009.
Sequenciamento:
Ilumina IG.
Applied Biosystems SOLiD.
Roche 454 Life Science systems
Biosystems HeliScope™ Single Molecule Sequencer.
Pacific Biosystems PACBIO RS.
RNA seq
Tabela 1: Principais características técnicas das plataformas 454 GS-FLX, ILLUMINA E SOLID
Fonte: Adaptado de: Metzker 2010; Carvalho & Silva 2010.
Após o sequenciamento os resultados são alinhados num genoma de referência ou montados de novo.
RNA seq
Genoma de referência
Montados de novo
“Ab initio”
Preferencialmente o método “Ab initio”;
Quando não se possui genoma de referência pode ser utilizado na montagem o genoma de um organismo filogenéticamente próximo;
Combinando as duas estratégias: mesmo que se possua o genoma de referência, é recomendado alinhar novamente usando o alinhamento gerado “de novo”;
Método “de novo” é mais efetivo quando utilizado em genomas de procariontes; pois esta abordagem está mais suscetível a erros de sequenciamento, gera transcritos mais fragmentados, além de um volume de dados computacionais muito maior.
Quantificação do nível de expressão gênica
Análise dos dados apóso Sequenciamento:
Fonte: Marthin & Whang 2011
Aplicação RNAseq.RNA seq
Ambiente Normal
Estresse térmico
Estresse osmótico
CDS 1 CDS 2
CDS 1 CDS 2
CDS 1 CDS 2
Vantagens.
- Permite detectar transcritos mesmo sem a presença de um genoma de referência;
- Pode detectar variações nas sequencias genômicas;
- Possuem pouco ruído de fundo, podendo ser mapeado sem ambiguidade em regiões distintas do genoma;
- Requer uma quantidade muito menor de amostras de RNA;
- Já revelou várias regiões de transcrição e isoformas de splicing novas de genes conhecidos;
- Capaz de rastrear com acurácia as mudanças na expressão gênica durante diferentes estágios da diferenciação de células e do desenvolvimento de alguns organismos.
RNA seq
Fonte: Wang et al. 2009
Desvantagens.
- Moléculas de RNA necessitam ser fragmentadas para que possam se adequar às tecnologias de sequenciamento de nova geração, podendo em cada processo de fragmentação influenciar no resultado produzido;
- Por usar sequenciamento de larga escala, enfrenta desafios durante o armazenamento, recuperação e processamento das grandes quantidades de dados gerados;
- Permite maior cobertura e por isso requer mais sequenciamento que, por sua vez, aumenta o custo;
- Para sua validação é exigido o uso de triplicatas para cada experimento;
- Sujeito a erros de sequenciamento devido ao grande volume de dados gerados, sendo necessário dedicar maior tempo na análise pós-montagem para resolvê-los
RNA seq
Perspectivas
Embora o RNA-seq ainda seja um método pouco utilizado devido a seu recente desenvolvimento, ele possui muitas vantagens em relação a outros métodos, como o microarray podendo vir a substitui-lo;
Os próximos desafios a esta metodologia é ser amplamente utilizada em genomas mais complexos para identificar níveis de expressão de transcritos raros;
O uso de novas tecnologias (sequenciamento pair-end e strand specif) podem vir a facilitar esta meta permitindo uma maior cobertura genômica com o uso de sequencias longas (reads);
RNA seq
Ampla utilização em mais organismos, como plantas poliplóides, comunidades de microorganismos (metatranscriptômica);
Avanços nos sistemas computacionais e nos próprios computadores, permitindo um maior rapidez na análise dos dados;
Futuro da “montagem” transcriptômica: “Não será necessário montar” (Martin & Wang 2009).
RNA seq
Aplicações no estudo de doenças genéticas.RNA seq
Aplicações no estudo de doenças genéticas.
- Detecta alterações na molécula de RNA em células cancerosas;
- Permite identificar níveis de expressão e de novos transcritos;
- Identifica mecanismos de splicing alternativo e fusões gênicas;
- Detecta mutações, entre elas rearranjos cromossômicos, que levam a transcritos quiméricos;
RNA seq
Obrigada!!