antibiotique ou probiotique dans les pathologies...
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Antibiotique ou Probiotique
dans les pathologies
inflammatoires chroniques ?
Prof.Jacques DAELE
CHR Citadelle DPT ORL – CCF
LIEGE BELGIUM
Pathogènes, vous avez dit Pathogène ?
• Corps humain : 10 000 milliards de cellules
humaines et 100 000 milliards de microbes (500
espèces différentes)
• 10 fois plus de bactéries que de cellules humaines
• 90% de notre corps ne nous appartient pas
• Rôle important dans le maintien en bonne santé
Phylogenetic tree of the most important microbial taxa
in the human intestinal tract, along with their relative
contributions.
AberrationMost relevant observations
and potential correlationReferences
Crohn's diseaseDiversity decrease – reduced F.
prausnitzii
Kaser et al. 201051; Sokol et al. 200952; Willing et al.
201053
Ulcerative colitisDiversity decrease – reduced A.
muciniphila
Png et al. 201054; Kaser et al. 201051 ; Lepage et al.
201155
Irritable bowel syndromeGlobal signatures –
increasedDorea and Ruminococcus
Salonen et al. 201036; Saulnier et al. 201156; Rajilić-
Stojanović et al. 201113
Clostridium
difficile infection
Strong diversity decrease –
presence of C. difficileGrehan et al. 201057; Khoruts et al. 201058
Colorectal cancerVariation in Bacteroides spp. –
increased fusobacteria
Sobhani et al. 201159; Wang et al. 201260; Marchesi et al.
201161
Allergy/atopyAltered diversity – specific
signatures
Stsepetova et al. 200762; Bisgaard et al. 201163; Storrø et
al. 201164
Celiac diseaseAltered composition, notably in small
intestine
Nistal et al. 201265; Di Cagno et al. 201166; Kalliomäki et
al. 201267
Type 1 diabetes Signature differences Vaarela 201168; Giongo et al. 201169; Brown et al. 201170
Type 2 diabetes Signature differencesLarssen et al. 201071; Wu et al. 201072; Kootte et al.
201273
ObesitySpecific bacterial ratios
(Bacteroidetes/Firmicutes)
Ley et al. 200674; Turnbaugh et al. 200910; Musso et al.
201175
Intestinal microbiota-associated diseases, syndromes, or other aberrations, with
summaries of multiple studies that support an association between the microbiota and
the indicated aberration.
Disease or aberration Type of support Reference*
Alzheimer's diseaseMicrobiota in a mouse model of
Alzheimer's diseaseKarri et al. 2010103
Atherosclerosis Analysis of plaques in humans Koren et al. 2011104
Autistic spectrum disordersAnalysis of mucosa in children with
autism spectrum disordersWilliams et al. 2011105
Chronic fatigue syndromeCultured microbiota in patients with
chronic fatigue syndromeSheedy et al. 2009106
Colic babiesLongitudinal analysis of colic babies
cohortde Weerth et al. 2012
Cardiovascular diseaseCardiovascular-diseased mice and
microbial metabolismWang et al. 201148
Depression and anxiety Probiotic intervention in stressed mice Bravo et al. 201134
Frailty Analysis of elderly and high frailty scores van Tongeren et al. 2005107
Graft-vs-host diseaseReview of human data on graft-vs-host
diseaseMurphy et al. 2011108
Multiple sclerosisInvolvement of microbiota in mice with
multiple sclerosisBerer et al. 2011109
Nonalcoholic fatty liver disease Effect of choline depletion in humans Spencer et al. 2011101
Parkinson's disease
Role of enteric nervous system and
review of Parkinson's disease
development
Braak et al. 2003110
Rheumatoid arthritisMicrobiota as predisposing factor in
rheumatoid arthritisScher and Abramson 2011111
Retrovirus infectionMouse retrovirus infection relies on
microbiotaKane et al. 2011112
Poliovirus infectionMouse microbiota promotes poliovirus
infectionKuss et al. 2011113
Indications for associations between the microbiota and health aberrations, provided as an alphabetical listing of
the aberrations suggested to be associated with the intestinal microbiota, along with support for such an
association.
Microbiome
Microorganismes : virus, bactéries, moisissures
Planctonique (1%)
mobile
Biofilm (99%)
Communauté de microorganismes adhérents
Matrice extra-cellulaire polymérique
Métaboliquement inactif (quiescent) : peu de réponse aux AB Bacteries et fungi
Intracellulaire
Biofilms
Biofilms
• Formation du Biofilm1. Implantation
2. Adhérence
3. Agrégation
4. Croissance et maturation
5. Détachement
• Plusieurs structures différentes• Réponse des microorganismes à l’environnement
• Programme génétique bactérien
• Matrice : Extracellular Polymeric Substance (EPS)• Polysaccharides, protéines, nucléotide, AND extracellulaire
• Canaux de transport des fluides et des nutriments (concentration des nutriments, communication inter-cellulaire)
Biofilms
SUPERANTIGEN
Up to 30% of patients’T-
cells may be
nonspecifically stimulated
by superantigen binding
compared with
stimulation of only 0,1%
of T-cell population via
the conventionnal
antigen-specific MHC
restricted activation
SuperantigSuperantigèènesnes
Healthy mucosa (SEM)
Cryofixation SEM : biofilm
Biofilms mediated Infections
Chronic
Rarely resolved by host defences
Resistant to directed antibiotics
Acute exacerbation
Microbial Community is difficult to define
and culture
Require surgical removal to be resolved
Microbiome
Microorganismes : virus, bactéries, moisissures
Planctonique (1%)
mobile
Biofilm (99%)
Communauté de microorganismes adhérents
Matrice extra-cellulaire polymérique
Métaboliquement inactif (quiescent) : peu de réponse aux AB Bacteries et fungi
Intracellulaire
S.A25%-30% permanent carrier in the nostrils/
Intracellular
75% monoclonal
20% Of all human Staph. Inf. are
autogenous
60% intermittent carrier
20% almost never carrier( Compétition)
71% carrier in N. Polyposis
0% SAE IgE in controls
50% SAE IgE in N.Polyposis
Monoclonal S.A. In 75% N=37From Lacroix S.
Same serotypes in healthy and diseased
TO 100%
T10 63%
T3O 70%
T240 73%
Méthodes Culture dépendante
Isolement et Culture avant identification morphologique ,biochimique ou génétique.
99% des MO observable ds la nature ne sont pas cultivables par des techniques standards
Méthodes culture dépendante
• Biais des milieux enrichis ou appauvris
• Absence de croissance si disparition des biofilms ou des relations symbiotiques
Méthodes Culture dépendante
Pourquoi non cultivable?
T°, pH, sources de nutriment, communauté complexe et dynamique de polymicrobisme, biofilms, réaction immunologique de l’hôte
MO à croissance rapide « étouffe « les c. lentes
Techniques moléculaires
• Analyse directe du DNA / RNA bactérien sans culture
• Capable de caractériser les assemblages microbiens complexes
• Détecte le matériel génétique de MO non viables
Méthode non culture dépendante PCR
L'amplification en chaîne par polymérase ou réaction en chaîne par polymérase (PCR polymerase chainreaction) est une méthode de biologie moléculaired'amplification génique in vitro, qui permet de dupliquer en grand nombre (avec un facteur de multiplication de l'ordre du milliard) une séquence d'ADN ou d'ARN connue, à partir d'une faible quantité (de l'ordre de quelques picogrammes) d'acide nucléique (séquence spécifique d’ADN (l’Amplicon)) et d'amorces spécifiques constituées d'oligonucléotides de synthèse de 20 à 25 nucléotides).
DENATURATION
HYBRIDATION
HYBRIDATION
ELONGATION
DENATURATION
HYBRIDATION
DENATURATION
HYBRIDATION
Polymerase Chain Reaction
Pyrosequencing
Fluorescence In Situ Hybridation
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time Of Fly
Universal Biosensor Ibis T 5000
Méthodes
Le pyroséquençage est une technique qui permet d’effectuer un séquençage rapide et à moindre coût. En effet, cette technique ne nécessite pas de clonage (donc gain de temps et d’argent), et permet une lecture directe de la séquence obtenue après le séquençage.
Les nucléotides ne sont pas ajoutés tous ensemble comme dans une réaction de séquençage normale mais l’un après l’autre. Si le nucléotide ajouté dans le milieu réactionnel correspond à celui attendu par la polymérase, il est incorporé dans le brin en cours de synthèse (d’élongation) et libère un pyrophosphate. Une ATP sulfurylase vient alors transformer ce pyrophosphate (PPi) en ATP qui est alors utilisé, couplé à une luciférine, par une luciférase. On a alors production d’oxyluciférine et d’un signal lumineux (une apyrase dégrade les nucléotides en surplus).
C’est le séquenceur ou plus précisément un capteur CCD (Charge-Coupled Device) qui va capter ce signal lumineux et le reproduire sous forme d’un pic sur le pyrogramme. La hauteur de ce pic est fonction de l’intensité du signal lumineux, elle-même proportionnelle au nombre de nucléotides incorporés en même temps.On peut donc déduire la séquence à partir de la taille des pics obtenus. Par ailleurs, en cas de mélange de nucléotides à une même position (polymorphisme de séquence), la taille des pics permet d'avoir une quantification de la proportion de brins porteurs de l'un ou l'autre des nucléotides.
Technique de l'hybridation fluorescente in situ. En A : sonde. B : sonde colorée à l'aide d'un flurochrome C : hybridation avec l'ADN nucléaire. D : apparence du chromosome
métaphasique où la sonde s'est fixée.
Technique d’ identification de pathogènes dans des prélèvement cliniques ou environnementaux.
Ibis T 5000 associe l’amplification en chaine par polymerase (PCR) avec la spectrometrie de masse sur un materiel biologiques ionisés par electrospray et l’analyse des bases puriques ou pyrimidiques. Ce système permet l’identification et la quantification d’un large éventail de pathogènes incluant toutes les bactéries connues, les principaux groupes de moisissures pathogènes ,la plupart des familles virales responsables de maladies chez l’homme ou l’animal ainsi que leur degré de virulence et leur résistance au A.B.
(Dpt de la défense USA TIGER Triangulation Identification for the Genetic Evaluation of
Risks)
Ibis T5000Universal Biosensor
The T.I.G.E.R. concept of operation. In Step #1, nucleic acid extracts from the sample of interest (e.g., air sample, clinical specimen,food product) are extracted and amplified with broad-range PCR primers. Step #2 is mass spectrometry based analysis of PCR derivedamplicons. Signal processing in Step #3 yields unambiguous base composition signatures from multiple genomic regions that arein turn used to identify the microbe(s) in the sample.
IBIS T 5000New approach to the sensitive and specific identification of bacteria, viruses, fungi, and protozoa based on broad-range PCR and high performance mass spectrometry. The Ibis
T5000 is based on technology developed for the Department of Defense known as T.I.G.E.R.
(Triangulation Identification for the Genetic Evaluation of Risks) for pathogen surveillance. The technology uses mass spectrometry derived base composition signatures obtained from PCR amplification of broadly conserved regions of the pathogen genomes to identify most organisms present in a sample. The process of
sample analysis has been automated using a combination of commercially available and custom instrumentation. A software system known as T-Track manages the sample flow, signal analysis, and data interpretation and provides simplified result reports to the user. No specialized expertise is required to use the instrumentation. In addition to pathogen surveillance, the Ibis T5000 is being applied to reducing health care associated infections (HAIs), emerging and pandemic disease surveillance, human forensics analysis, and pharmaceutical product and food safety, and will be used eventually in human infectious disease diagnosis. (JALA 2006;11:341–51)
MALDI-TOFMatrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectometry.
La spectrométrie de masse MALDI-TOF permet l’identification des bactéries par analyse de leurs protéines totales (protéines ribosomales et protéines associées aux membranes). Selon les études, les résultats d’identification obtenus avec la spectrométrie de masse (95 % - 97,4 % d’identifications correctes) sont comparables, voire meilleurs, à ceux des systèmes automatisés utilisant des méthodes conventionnelles (75,2 % - 92,6 %). La qualité de l’identification est fonction de la richesse de la banque de spectres enregistrés. Outre l’identification des micro-organismes, il est possible de réaliser du génotypage de polymorphismes ponctuels (SNPs). La spectrométrie de masse devient une alternative au séquençage standard des gènes 16S rDNA.
Identifying biofilms
Imaging
Scanning Electron Microscopy
Transmission Electron Microscopy
Confocal Laser Scanning Microscopy
Imaging adjuncts (with CLSM)
LIVE/DEAD Stain-BacLight Bacterial
Viability Kit
Fluorescent In Situ Hybridation with
species specific probes
Confocal Scanning-Laser
MicrographBacterial cells
PMN cells
Channels
Microbiome différent dans la CRS?
• Méthodes de détection
• Culture
• Observation directe
• Microscopie optique / colorations
• Microscopie électronique
• Détection de l’ADN ou de l’ARN bactérien
• après amplification (PCR)
• détection directe (FISH)
• Screening (pyroséquençage, PCR couplée
à spectrométrie de masse)
spécificité
sensibilité
Microbiome différent dans la CRS?Auteur, année Sujets
CRS/N
Prélèvement Technique
1 Ramakrishnan 2013 0/28 Ecou. MM qPCR 16S/rRNA/pyrosequencing
2 Aurora 2013 30/12 Lavage MM 16S rRNA pyrosequencing
3 Boase 2013 38/6 Ecou. MM Culture Ibis T5000
4 Abreu 2012 10/10 Bross.Sinus Max PhyloChip analysis
5 Feazel 2012 15/5 Ecou.MM culture 16S rRNA,
Pyrosequencing
6 Stressmann 2011 43/0 Biops. Inf T/Poly 16S rRNA/pyrosequenc/ T-RFLP
7 Frank 2010 26/16/5 Ecou. Narine 16S rRNA pyrosequencing
8 Stephenson 2010 18/9 Biop.Muqueuse 16S rRNA pyrosequencing
9 Healy 2008 11/3 Biop.Muqueuse FISH DNA probes (HI,SP,SA,PA)
10 Sanderson 2006 18/5 Biop.Muqueuse FISH DNA probes (HI,SP,SA,PA)
11 Lina 2003 0/216 Ecou.Vestibule N Culture
12 Rasmussen 2000 0/10 Lavage nasal Culture/Capillary sequencing
13 Choi 2014 8/3 Lavage nasal Pyrosequencing
Microbiome différent dans la CRS?N N
1 Aureobacterium 15 Helicobacter
2 Alicycliphilus 16 Lachnospira
3 Burkholderia 17 Lactobacillus
4 Carnobacterium 18 Micrcoccus
5 Citrobacter 19 Moraxella
6 Cloacibacterium 20 Mycobacterium
7 Corynebacterium 21 Neisseria
8 Curtobacterium 22 Pediococcus
9 Cyanobacterium 23 Peptoniphilus
10 Diaphorobacter 24 Propionebacterium
11 Enterobacter 25 Pseudomonas
12 Enterococcus 26 Rhodococcus
13 Fusobacterium 27 Staphylococcus
14 Haemophilus 28 Stenotrophomonas
29 Steptococcus
Microbiome différent dans la CRS?N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1
011
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
1 X X X x x x x x x x
2 x X X X X
3 x x
4 x x X X x x x x x x
5 X
6 x x x x x
7 x X X x x
8 X x x
9 x x x x
10
11 X x x x
12 X x x
13 x x
• Sujets sains
• Actinobactéries (Propionibacterium, Corynebacterium)
• Firmicutes (Staphylocoque), Proteobacteria
(Enterobacter)
• Patients CRS
• Plusieurs microbiomes différents
• Diminution de la diversité
• Staphylococcus aureus
Microbiome différent dans la CRS?
Exemple: Choi et al. 2014
Allergy. 2014 Apr;69(4):517-26
Exemple: Abreu et al. 2012
Sci Transl Med. 2012 Sep 12;4(151)
Analyse comparative de la communauté bactérienne
Nicole A. Abreu et al., Sci Transl Med 2012;4:151ra124
Published by AAAS
14 sujets
7 Controles 7 CRS
10 Controles/ 10 CRS
Exemple: Abreu et al. 2012
Sci Transl Med. 2012 Sep 12;4(151)
Corynebacterium Tuberculostearicum
+
Lactobacillus Sakei
Exemple: Aurora et al. 2013
JAMA Otolaryngol. 2013 Dec;139(12):1328-38.
DYSBIOSE
• ABONDANCE
• DIVERSITE
• STAPH AUREUS
• BACTERIES « Acide Lactique »
• PROPIONE BACTERIUM ACNES
• CORYNEBACTERIUM TUBERCULOSTEARICUM
• LACTOBACILLUS SAKEI
• Prevotella
Antibiotique ?
Antibiotique ?
• Liu et al., 2013
• 6 patients
• Prélèvement maxillaire, analyse ADN (pyroséquençage) avant et arpès traitement médical maximal (4 semaines, cefuroxime, moxifloxacine)
• Amélioration endoscopique
• Réduction de la diversité du microbiome.
Int Forum Allergy Rhinol. 2013 Oct; 3(10): 775–
781.
Probiotique
• Traitements probiotiques utilisés pour réduire le
nombre d’infections des voies aériennes
supérieures
• Effet positif validé chez les patients sensibles par
une revue Cochrane, puis chez les volontaires sains
(West et al. 2013 ; Bifidobacterium lactis)
Probiotique
Auteur, année Méthode Probiotique Résultat
Abreu, 2012 Souris, CorynebacteriumTuberculostearicum
Lactobacillus Sakei
c. Caliciformes (inflammation)
Cleland, 2014 Souris,Staph. Aureus
Staph. Epidermitis
c. Caliciformes (inflammation)
Probiotique
Auteur, année Méthode Probiotique Résultat
Abreu, 2012 Souris, CorynebacteriumTuberculostearicum
Lactobacillus Sakei
c. Caliciformes (inflammation)
Cleland, 2014 Souris,Staph. Aureus
Staph. Epidermitis
c. Caliciformes (inflammation)
Auteur, année sujets Probiotique Résultat
Mukerji, 2009 77 CRS Lactobacillus Rhamnosus p.o.
Pas d’amélioration du SNOT-20
Modification du Milieu
• Eradication du biofilm in vitro
• Antibiotiques
• Soda cafféiné sucré
• Peptides salivaires
• Probiotiques
• Traitements physiques (lavages, flux d’air, lumière, laser)
• Antiseptiques
• Mucolytiques
• Surfactants
• Lait fermenté
• Furosémide
• Acide citrique
• Dexamethasone
• Bleu de méthylène
• Violet de gentiane
• Citrate d’ammonium
• Miel
Modification du Milieu
• Eradication du biofilm chez l’animal
• Antibiotiques
• Acide citrique
• Surfactant
• Hydrodebrider
• Nitrate de Gallium
Modification du Milieu
• Eradication du biofilm chez l’homme
• Antibiotiques
• Irrigation de mupirocine et doxycycline
• Irrigation de surfactant « baby shampoo »
• Injection IM thiamphenicol glycinate acetylcysteinate
Interaction Hôte-
Microorganismes
Hôte
Composition du Mucus
Anomalies ciliaires
Déficit de l’im. Humorale
Anomalies de l’im. Innée
Allergie
Déficits enzymatiques
Microorganismes
Diversité Quantité
Biofilms
Staphylocoques aureus
Pseudomonas
Moisissures
Modification de l’Immunité
• Anticorps monoclonaux
• anti-interleukin-5 (Mepolizumab)
• anti-immunoglobulin E (Omalizumab)
• anti-interleukine 4 et 13 (Dupilumab)
En Conclusion
1. Le microbiome est différent selon la pathologie
• Quantité
• Diversité
2. Le microbiome a une impact clinique
3. La réponse immunitaire locale est altérée
4. Stratégie thérapeutique ?
• Antibiotique / Probiotique
• Modification du Milieu / de l’Immunité (cytokines)
Probiotique
• Dysbiose
• Microbiome très différent selon les patients
• Abondance
• Diversité
• Staphylococcus aureus, Proteobacteria (Enterobacter)
• Actinobactéries (Propionibacterium, Corynebacterium)
• Compétition
• Staphylococcus epidermitis <> Staphylococcus Aureus
• Lactobacillus Sakei <> Corynebacterium Tuberculostearicum
Probiotique in CRSAuthors A N Method Result Bact
S.S Mukerji 2009 77 CRS QoL No improvement L.Rhamnosus
E.J.Cleland 2014 Mouse ModelS.Aureus
+ S. Epidermidis
L.Q. Swandt 2011 18 ENT biofilms
Beneficials effects on eradicing Biofilm
Biofilm
Q.Hoa(ReviewCochrane)
2011 Rev. URTI Episodes infectieux / AB ds URTI
L.Casei
N.P. West 2013 464 URTIEpisodes infectieux
B.lactis
N.A. Abreu 2012 Mouse Model Protectif v/ CorynebacteriumTuberculostearicum
L. sakei