ankara Ünİversİtesİ fen bİlİmlerİ …acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/25069/(microsoft...

ANKARA ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

GLUKOZ TAYİNİ İÇİN NİKEL OKSİT MODİFİYE KARBON PASTA

ELEKTROTLARIN HAZIRLANMASI

CEREN ERDEM

KİMYA ANABİLİM DALI

ANKARA

2012

Her hakkı saklıdır

i

ÖZET

Yüksek Lisans Tezi

GLUKOZ TAYİNİ İÇİN NİKEL OKSİT MODİFİYE KARBON PASTA ELEKTROTLARIN HAZIRLANMASI

Ceren ERDEM

Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı

Danışman: Prof. Dr. Şule PEKYARDIMCI

Bu tez çalışmasında, glukozun amperometrik tayini için nikel oksit (NiO) nanopartikülü temelli amperometrik enzim elektrotlar hazırlandı. Bu amaçla, glukoz oksidaz (GOx) enzimi, NiO nanopartikülleri ile hazırlanmış karbon pasta içerisine tutuklama yöntemi ile hapsedildi. Glukoz tayini için uygun olduğu belirlenen NiO modifiye karbon pasta enzim elektrotların (NiO/GOx/CPE) optimizasyon çalışmaları yapıldı. Glukoz tayini, enzimatik olarak oluşan hidrojen peroksitin (H2O2) +0,40 V’da Ag/AgCl’e karşı oksijene (O2) yükseltgenmesine dayanılarak yapıldı. NiO/GOx/CPE için en uygun tampon 0,1 M pH 7,0 fosfat tamponu ve optimum çalışma sıcaklığı 40oC olarak belirlendi. Enzim elektrodun doğrusal çalışma aralığının 1,9×10-3 mM−9,1×10-3 mM ve 1,3 mM−15 mM, gözlenebilme sınırının 1,9×10-3 mM, cevap süresinin 20 s ve raf ömrünün yaklaşık 101 gün olduğu gözlendi. Serumda bulunabilecek ve NiO/GOx/CPE’nin glukoza karşı cevabına girişim yapabilecek çeşitli elektroaktif türlerin etkisi incelendi ve önemli bir etkilerinin olmadığı belirlendi. Serum numunelerinde glukoz analizi NiO/GOx/CPE’u kullanılarak yapıldı. Elde edilen bulgular spektrofotometrik yöntemle bulunan sonuçlarla karşılaştırıldı ve sonuçların birbiri ile uyumlu olduğu görüldü. Haziran 2012, 84 sayfa Anahtar Kelimeler: Amperometri, Biyosensör, Glukoz, Glukoz oksidaz, Enzim elektrot, Nikel oksit nanopartikülleri, Karbon pasta elektrot

ii

ABSTRACT

Master Thesis

THE PREPARATION OF CARBON PASTE ELECTRODES WITH MODIFIED NICKEL OXIDE FOR DETECTION OF GLUCOSE

Ceren ERDEM

Ankara University

Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry

Supervisor: Prof. Dr. Şule PEKYARDIMCI

In this thesis study, nickel oxide (NiO) nanoparticles-based amperometric enzyme electrodes were prepared for amperometric detection of glucose. For this purpose, glucose oxidase (GOx) was entrapped in carbon paste which are prepared with NiO nanoparticles by entrapment method. The optimization studies of NiO carbon paste enzyme elektrodes (NiO/GOx/CPE) that was appropriate for determination of glucose were realised. The determination of glucose was performed via monitoring oxidation current of enzymatically prodeced H2O2 at +0.40 V vs. Ag/AgCl. For NiO/GOx/CPE, the optimum buffer as 0.1 M pH 7.0 phosphate buffer solution and the optimum working temperature as 40oC were determinated. It was observed the respectively linear working range of enzyme electrode as 1,9×10-3 mM−9,1×10-3 mM and 1,3 mM−15 mM, detection limit as 1,9×10-3 mM, response time as 20 s and storage stability as about 101 days. The effects of several electroactive species that present in serum samples and interference the response of NiO/GOx/CPE to glucose were investigated and it was found that there is no significant effect. The detection of glucose in serum samples was practised by NiO/GOx/CPE. The observed verities were compared with results that are found by spectrophotometric method and good correlation was obtained between those results.

June 2012, 84 pages

Key Words: Amperometry, Biosensor, Glucose, Glucose oxidase, Enzyme electrode, NiO nanoparticles, Carbon paste electrode

iii

TEŞEKKÜR

Tez çalışmam ve eğitimim boyunca desteğini ve ilgisini esirgemeyen, değerli

görüşlerini benimle paylaşan bana her konuda öncülük eden danışman hocam Ankara

Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü öğretim üyesi Sayın Prof. Dr. Şule

PEKYARDIMCI’ya,

Çalışmalarımı gerçekleştirebilmem için bana laboratuvarını açan, bilgisini paylaşan

değerli hocam Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü öğretim üyesi Sayın

Prof. Dr. Esma KILIÇ’a,

Bu tezde en az benim kadar emeği olan, büyük bir sabırla bana tüm bildiklerini öğreten,

çalışmamın her aşamasında destek olan, bana hem ablalık hem de hocalık yapan

Dumlupınar Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü öğretim üyesi Sayın

Yard. Doç. Dr. Derya KOYUNCU ZEYBEK’e ve değerli eşi sevgili hocam Dumlupınar

Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü öğretim üyesi Sayın Yard. Doç. Dr.

Bülent ZEYBEK’e,

Çalışmalarım boyunca aynı laboratuvarı paylaştığım sevgili çalışma arkadaşım Ankara

Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü öğretim elemanı Araş. Gör. Gözde

AYDOĞDU’ya,

Hayatım boyunca gösterdikleri maddi manevi desteklerinden ötürü AİLEME sonsuz

teşekkürlerimi sunarım.

Ceren ERDEM

Ankara, Haziran 2012

iv

İÇİNDEKİLER

ÖZET ................................................................................................................................ i

ABSTRACT ..................................................................................................................... ii

TEŞEKKÜR ................................................................................................................... iii

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ............................................................... vii

ÇİZELGELER DİZİNİ ................................................................................................ xii

1. GİRİŞ ........................................................................................................................... 1

1.1 Nanopartikül Modifiye Glukoz Biyosensörleri ile İlgili Kaynak Araştırması ............................................................................................................... 4

2. KURAMSAL TEMELLER ...................................................................................... 16

2.1 Biyosensörler ........................................................................................................... 16

2.1.1 Amperometrik enzim elektrotlar ........................................................................ 20

2.1.2 Nanoteknoloji ....................................................................................................... 24

2.1.3 Nanomateryal temelli amperometrik enzim elektrotlar ................................... 24

2.1.4 Karbon pasta elektrotlar ..................................................................................... 25

2.1.5 İdeal biyosensörün sahip olması gereken özellikler .......................................... 26

2.2 Enzimler ................................................................................................................... 28

2.2.1 Enzimlerin özellikleri ........................................................................................... 29

2.2.1.1 Aktif bölge .......................................................................................................... 29

2.2.1.2 Seçicilik .............................................................................................................. 29

2.2.1.3 Katalitik etki ...................................................................................................... 29

2.2.1.4 Kofaktörler ........................................................................................................ 30

2.2.1.5 Aktivasyon ve inhibisyon .................................................................................. 30

2.2.2 Enzimatik reaksiyonların hızını etkileyen faktörler ......................................... 30

2.2.2.1 Sıcaklık ............................................................................................................... 31

2.2.2.2 Ortam pH’sı ....................................................................................................... 31

2.2.2.3 Substrat derişimi ............................................................................................... 31

2.2.3 İmmobilize enzimler ............................................................................................ 31

2.2.4 Enzim immobilizasyon teknikleri ....................................................................... 32

2.2.5 Glukoz oksidaz enziminin özellikleri .................................................................. 34

2.3 Glukoz Tayinin Önemi ........................................................................................... 35

v

3. MATERYAL ve YÖNTEM ...................................................................................... 36

3.1 Kullanılan Cihazlar ................................................................................................. 36

3.2 Elektrokimyasal Hücre ve Kullanılan Elektrotlar ............................................... 37

3.3 Kullanılan Kimyasallar .......................................................................................... 37

3.3.1 Oksijen gazı .......................................................................................................... 37

3.3.2 Argon gazı ............................................................................................................. 38

3.3.3 Kullanılan enzim .................................................................................................. 38

3.3.4 Diğer kimyasallar ................................................................................................. 38

3.4 Serum Numunesi ..................................................................................................... 40

3.5 Kullanılan Çözeltiler ............................................................................................... 40

3.5.1 Fosfat tamponu ..................................................................................................... 40

3.5.2 TRIS tamponu ...................................................................................................... 41

3.5.3 Enzim çözeltileri ................................................................................................... 41

3.5.4 Glukoz çözeltisi ..................................................................................................... 41

3.5.5 Hidrojen peroksit çözeltisi ................................................................................... 41

3.5.6 Glutaraldehit çözeltisi .......................................................................................... 41

3.5.7 Girişim çalışmalarında kullanılan çözeltiler ..................................................... 42

3.6 NiO Nanopartikül ile Modifiye Edilmiş ve Modifiye Edilmemiş Karbon Pasta Elektrotların Hazırlanması .......................................................... 42

3.6.1 NiO Nanopartikül ile modifiye edilmiş ve modifiye edilmemiş karbon pasta elektrotların H2O2’ ye duyarlığı .................................................. 43

3.7 NiO ile Modifiye Edilmiş Enzimsiz Karbon Pasta Elektrodun Çalışma Potansiyelinin Belirlenmesi ................................................................................... 43

3.8 Glukoz Tayini İçin Karbon Pasta Enzim Elektrotların Hazırlanması .............. 44

3.8.1 Glukoz tayini için hazırlanan enzim elektrotların glukoza duyarlığı ............. 44

3.9 NiO Nanopartikül Modifiye Karbon Pasta Enzim Elektrotların Optimum Çalışma Koşullarının ve Performans Faktörlerinin Belirlenmesi ..................... 45

3.9.1 Tampon cinsinin etkisi ......................................................................................... 45

3.9.2 Tampon derişiminin etkisi ................................................................................... 45

3.9.3 pH’nın etkisi ......................................................................................................... 46

3.9.4 NiO nanopartikül miktarının belirlenmesi ........................................................ 46

3.9.5 Enzim miktarının belirlenmesi ........................................................................... 46

3.9.6 Sıcaklığın etkisi ..................................................................................................... 47

vi

3.9.7 Cevap süresinin belirlenmesi .............................................................................. 47

3.9.8 Glukoz derişiminin etkisi ..................................................................................... 47

3.9.9 Girişim yapan türlerin NiO/GOx/CPE’nin cevabı üzerine etkisi .................... 48

3.9.10 Tekrar kullanılabilirlik ve tekrar üretilebilirlik ............................................. 49

3.9.11 NiO/GOx/CPE’nin raf ömrü ............................................................................. 49

3.9.12 NiO/GOx/CPE ile serumda glukoz tayini ........................................................ 49

4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA........................................................ 51

4.1 Glukoz Tayini için Karbon Pasta Elektrot ........................................................... 51

4.2 Enzimsiz Karbon Pasta Elektrotlar ...................................................................... 53

4.2.1 CPE ve NiO/CPE’nin hidrojen peroksite duyarlığı .......................................... 53

4.2.2 Çalışma potansiyelinin etkisi ............................................................................... 54

4.3 Karbon Pasta Enzim Elektrotlar ........................................................................... 55

4.3.1 GOx/CPE ve NiO/GOx/CPE’nin glukoza duyarlığı ......................................... 55

4.4 NiO/GOx/CPE’nin Optimum Çalışma Koşulları ve Performans Faktörleri ................................................................................................................ 57

4.4.1 Tampon cinsinin etkisi ......................................................................................... 57

4.4.2 Tampon derişiminin etkisi ................................................................................... 58

4.4.3 pH’nın etkisi ......................................................................................................... 59

4.4.4 NiO nanopartikül miktarının belirlenmesi ........................................................ 60

4.4.5 Enzim miktarının belirlenmesi ........................................................................... 61

4.4.6 Sıcaklığın etkisi ..................................................................................................... 62

4.4.7 Cevap süresinin belirlenmesi .............................................................................. 63

4.4.8 Glukoz derişiminin etkisi ..................................................................................... 64

4.4.9 Girişim yapan türlerin NiO/GOx/CPE’nin cevabı üzerine etkisi .................... 66

4.4.10 Tekrar kullanılabilirlik ve tekrar üretilebilirlik ............................................. 67

4.4.11 NiO/GOx/CPE’nin raf ömrü ............................................................................. 68

4.4.12 NiO/GOx/CPE ile serumda glukoz tayini ........................................................ 69

5. SONUÇLAR .............................................................................................................. 74

KAYNAKLAR .............................................................................................................. 78

ÖZGEÇMİŞ ................................................................................................................... 84

vii

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ

µA mikroamper

µM mikromolar

µmol mikromol

µL mikrolitre

Ag Gümüş

AgCl Gümüş klorür

Au Altın

BSA Sığır serum albümin

BSS Bağıl standart sapma

CdS Kadmiyum sülfür

CHIT Kitosan

CPE Karbon pasta elektrot

dL desilitre

DNA Deoksiribonükleik asit

ES Enzim-substrat kompleksi

FAD Flavin adenin dinükleotit

FADH2 İndirgenmiş flavin adenin dinüklotit

Fe3O4 Demir (II, III) oksit

GA Glutaraldehit

GCE Camsı karbon elektrot

viii

GOx Glukoz oksidaz

GOx(ind) İndirgenmiş glukoz oksidaz

GOx(yük) Yükseltgenmiş glukoz oksidaz

H2O2 Hidrojen peroksit

H3PO4 Fosforik asit

HCl Hidroklorik asit

HPLC Yüksek performanslı sıvı kromotografisi

Ir İridyum

ISFET İyon seçici alan etki transistörleri

ITO İndiyum kalay oksit

Li2CO3 Lityum karbonat

M Molar

M Medyatör

mg miligram

M(ind) İndirgenmiş medyatör

mL mililitre

mM milimolar

mmol milimol

mV milivolt

M(yük) Yükseltgenmiş medyatör

MWCNT Çok duvarlı karbon nanotüp

ix

NaOH Sodyum hidroksit

NiO Nikel oksit

nA nanoamper

nm nanometre

O2 Oksijen

PANI Polianilin

pH Hidrojen iyonu derişiminin eksi logaritması

Pt Platin

RNA Ribonükleik asit

s Saniye

SCE Doygun kalomel elektrot

TRIS Tris(hidroksimetil)aminometan

U Enzim ünitesi

UV-VIS Ultraviyole-görünür spektroskopi

V Volt

ZnO Çinko oksit

x

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 2.1 Biyosensörün şematik gösterimi ..................................................................... 16

Şekil 2.2 Farklı nesillerdeki enzim elektrotların şematik gösterimi (M(yük) ve M(ind) yükseltgenmiş ve indirgenmiş medyatör, GOx(yük) ve GOx(ind) yükseltgenmiş ve indirgenmiş glukoz oksidaz) ...................................................................... 23

Şekil 2.3 Glutaraldehitin kimyasal formülü ................................................................... 33

Şekil 2.4 Glukozun mutarotasyonu ................................................................................ 34

Şekil 3.1 IVIUMSTAT elektrokimyasal analiz cihazı ve BAS marka 5 girişli elektrokimyasal hücre standı .......................................................................... 36

Şekil 4.1 Glukoz tayini için hazırlanan enzim elektrodun çalışma prensibi (GOx(yük) ve GOx(ind) enzimin yükseltgenmiş ve indirgenmiş hallerini göstermektedir) ............................................................................................... 52

Şekil 4.2.a. NiO ile modifiye edilmiş karbon pasta elektrodun hidrojen peroksite cevabı, b. NiO ile modifiye edilmemiş karbon pasta elektrodun hidrojen peroksite cevabı (0,1 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,4 V, oda sıcaklığı) ........................ 54

Şekil 4.3.a. Enzimsiz NiO/CPE’nin Ag/AgCl’e karşı +0,70 V’da hidrojen peroksite cevabı, b. Enzimsiz NiO/CPE’nin Ag/AgCl’e karşı +0,40 V’da hidrojen peroksite cevabı (0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, oda sıcaklığı) ................... 55

Şekil 4.4.a.GOx/CPE’nin glukoza cevabı, b. GOx/NiO/CPE’nin glukoza cevabı (0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) ............................... 56

Şekil 4.5 NiO/GOx/CPE’nin glukoza cevabına tampon cinsinin etkisi a. 0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, b. 0,10 M pH 7,0 TRIS tamponu (+0,40 V, oda sıcaklığı) .................................................................................. 58

Şekil 4.6 NiO/GOx/CPE’nin glukoza cevabına tampon derişiminin etkisi (pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) ................................................................... 59

Şekil 4.7 NiO/GOx/CPE’nin glukoza cevabına pH’nın etkisi (0,10 M fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) ................................................................................... 60

Şekil 4.8 NiO/GOx/CPE’nin glukoza cevabına nanopartikül miktarının etkisi (0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) ............................... 61

Şekil 4.9 NiO/GOx/CPE’nin glukoza cevabına enzim miktarının etkisi (0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) ............................................. 62

Şekil 4.10 NiO/GOx/CPE’nin glukoza cevabına sıcaklığın etkisi (0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V) ........................................................................... 63

xi

Şekil 4.11 NiO/GOx/CPE’nin glukoza cevap süresinin belirlenmesi (�: 1,0×10-4 M glukoz, �: 1,0×10-5 M glukoz, 0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) ................................................................................................ 64

Şekil 4.12 NiO/GOx/CPE’nin glukoza cevabına glukoz derişiminin etkisi (0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) .......................................... 65

Şekil 4.13 NiO/GOx/CPE ile farklı glukoz derişim aralığında elde edilen kalibrasyon grafikleri (0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) ............ 65

Şekil 4.14 NiO/GOx/CPE’nin ömrü (0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) ....................................................................................................... 69

Şekil 4.15 Kan serumunda glukoz tayini için yöntemlerin uyumluluğu ........................ 71

xii

ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge 1.1 Nanopartikül modifiyeli glukoz biyosensörlerinin karşılaştırılması............ 8

Çizelge 2.1 Biyosensörlerde kullanılan analitler, biyolojik tanı materyalleri, çeviriciler ve bu çeviricilerin avantajları ile dezavantajları ....................... 19

Çizelge 3.1 Glukoz oksidazın, IUPAC kodu, elde edildiği kaynak ve temin edildiği firma ........................................................................................................... 38

Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan diğer kimyasalların isimleri, temin edildikleri firmalar, saflık dereceleri ve katalog numaraları ....................................... 39

Çizelge 3.3 Girişim yapan türlerin hücre içindeki toplam derişimleri .......................... 48

Çizelge 4.1 Girişim yapan türlerin enzim elektrodun duyarlığına etkisi (0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) ........................................ 67

Çizelge 4.2 NiO/GOx/CPE kullanılarak kan numunelerinde tayin edilen glukoz derişimi (0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı) ............ 70

Çizelge 4.3 Literatürde bulunan bazı glukoz biyosensörlerinin, serum örneklerindeki glukoz tayini için geliştirdikleri yöntemin spektrofotmetrik yöntem ile uyumluluğu ................................................................................................ 72

Çizelge 4.4 NiO/GOx/CPE’ nin elektrot bileşimi, optimum çalışma koşulları ve performans faktörleri ................................................................................. 73

1

1. GİRİŞ

Biyosensörler, tayin edilecek moleküle duyarlı biyolojik tanı materyallerini içeren ve bir

çevirici yardımı ile biyolojik tanı materyali ve analit arasındaki etkileşim sonucu oluşan

biyokimyasal sinyalleri ölçülebilir elektrik sinyallerine dönüştüren, küçük, analitik

cihazlardır. Günümüzde biyosensörler özellikle klinik ve çevresel analizlerde, gıda ve

ilaç sektöründe, ziraat ve biyoloji gibi alanlarda kullanılmaktadır (Zhang vd. 2000).

Amperometri, sabit bir potansiyelde indirgenen ya da yükseltgenen bazı elektroaktif

türlerin akımlarının ölçülmesi esasına dayanır. Genelde iki veya üç elektrotlu

amperometrik bir hücre sistemi oluşturulur. Çalışma elektrodu olarak çoğunlukla metal

veya karbondan yapılan elektrot gövdeleri kullanılır. Referans elektrot, çalışma

elektroduna uygulanan potansiyele karşı sabit bir potansiyel sağlar. Amperometrik

biyosensörler, en verimli ve en çok kullanılan biyosensör çeşitlerinden biridir. Bu

biyosensörler kullanılarak elektrokimyasal hücrede 10-8 M’dan daha düşük derişimlere

sahip analitlerin tayini yapılabilir (Dzyadevych vd. 2008).

Nanoteknoloji, maddelerin atomik ya da moleküler boyutta üretilerek çeşitli alanlarda

kullanılmasına olanak verir. Biyosensörler, nanoteknolojinin en geniş kullanıldığı

alanlardan biridir. Nanomateryallerin kullanımı, biyosensörlerde yeni sinyal iletim

teknolojilerinin tanımlanmasını sağlar (Jianrong vd. 2004). Yarı iletken polimerler,

metaller ve metal oksit nanopartikülleri gibi yapılar yeni biyosensörlerin

geliştirilmesinde kullanılan nanomateryallerdendir. Özellikle metal ve metal oksit

nanopartiküller geniş yüzey alanı, elektronik özellikleri, güçlü adsorplama yetenekleri,

mekanik, katalitik etkileri ve kimyasal dayanımları sayesinde biyosensörlerin

duyarlıklarını ve kararlılıklarını arttırmayı başarırlar (Luo vd. 2005, Siangproh vd.

2011). Son yıllarda nikel oksit (NiO) nanopartiküllerinin birçok alanda kullanılmasına

rağmen biyosensörlerde kullanımı oldukça nadirdir. Fakat NiO nanopartikülleri;

kimyasal kararlılığı, yüksek izoelektrik noktası (10,7), hızlı elektron transferi gibi

birçok avantajından ötürü biyosensör uygulamaları için gelecek vaat etmektedir (Li vd.

2008).

2

Elektrot materyali olarak çoğunlukla karbon nanotüpler, gümüş, altın, platin, indiyum

kalay oksit, camsı karbon ve karbon pasta elektrotlar kullanılmaktadır (Luong vd.

2008). Karbon nanotüpler ve metal nanoyapılar sahip oldukları birçok avantaja rağmen

oldukça pahalı ve çalışılması zor malzemelerdir. Karbon pasta elektrotlar ise düşük

maliyetli, kolay ve hızlı hazırlanabilir olduklarından biyosensör çalışmalarında kullanım

kolaylığı sağlar (Santos vd. 2007).

Glukoz, gelişmiş canlı organizmaların yaşamı için en önemli karbohidratlardan biridir.

Hücrelerin enerji kaynağı olmasının yanı sıra proteinlerin üretiminde ve lipid

metabolizmasında kullanılan 6 karbonlu bir şekerdir. Kandaki glukoz miktarı insülin ve

glukagon hormonları ile belli değerlerde tutulur. Sağlıklı bir insanın kanındaki glukoz

derişimi 4,4-6,6 mM olmalıdır (Li vd. 2009). Özellikle insülin hormonu tarafından

baskılanan glukoz, bu hormonun yeterli miktarda üretilmediği durumlarda olması

gereken derişimin üstüne çıkar. Glukozun kandaki derişiminin yüksek olması

günümüzde sıkça karşılaşılan bir hastalık olan diyabete yol açar. Diyabetli hastalarda

görme bozuklukları, sinir hasarı, kalp yetmezliği, yaraların geç iyileşmesi gibi

rahatsızlıklar gözlenebilir. Bu bozukluk, halk sağlığını yakından ilgilendirdiği ve ileri

dönemlerinde organlarda kalıcı hasarlara hatta ölüme yol açabildiği için kan glukozu

sürekli olarak takip edilmelidir (Comba vd. 2010a). Kromatografik ve spektrofotometrik

yöntemlerle kandaki glukoz tayini mümkün olsa da, glukoza duyarlı biyosensörler,

özellikle diyabetli hastaların kendi glukoz ölçümlerini doğru, güvenilir ve hızlı

yapabilmeleri için kolaylık sağlar (Cash ve Clark 2010).

Günümüze kadar glukozun tayini için birçok yöntem geliştirilmiştir. Bunlardan ilki

Clark ve Lyons tarafından geliştirilen amperometrik glukoz biyosensörüdür ve

literatürde tanımlanan ilk enzim elektrot olma özelliğini taşır. Bu biyosensör, glukozun

oksijen (O2) varlığında glukoz oksidaz (GOx) tarafından glukonik asite yükseltgenmesi

ile elektrokimyasal hücre içinde derişimi azalan O2’nin tayini esasına dayanır (D’Orazio

2003). Glukoz tayini için fluorimetrik (Danielson vd. 1999, Sanz vd. 2002) ve

lüminesans (Chang vd. 2010) gibi optik yöntemler de geliştirilmiştir.

3

Bu tez çalışmasında, klinik açıdan, çevre ve gıda endüstrisi açısından tayini oldukça

önemli olan glukoz derişiminin amperometrik olarak belirlenmesi için NiO nanopartikül

modifiye karbon pasta enzim elektrot geliştirilmesi düşünüldü. Bu amaçla, NiO

nanopartikülleri grafit tozu ile karıştırıldı ve karbon pasta matriks içerisine glukoz

oksidaz enzimi immobilize edildi.

Glukoz oksidaz enzimi (GOx), moleküler oksijen (O2) varlığında, aşağıdaki reaksiyona

göre glukozun glukonik asite dönüşümünü katalizler (Sun vd. 2009):

2β -D -Glukoz +GOx(FAD) -D -Glukonolakton +GOx(FADH )→β

2 2 2 2GOx(FADH ) +O GOx(FAD) +H O→

Glukoz oksidaz enzimi FAD (flavin adenin dinükleotit) koenzimine gereksinim duyar.

FAD elektron akseptörü olarak davranır ve glukozu yükseltger. Daha sonra moleküler

oksijeni indirgeyerek hidrojen perokside dönüştürür, kendisi de tekrar okside haline

döner.

Amperometrik glukoz tayini, enzimatik reaksiyon sonucu oluşan hidrojen peroksidin

(H2O2) sabit potansiyelde yükseltgenmesi sonucunda oluşan anodik akımın ölçülmesine

dayanılarak yapılmaktadır (Sun vd. 2009):

+ -2 2 2H O O + 2H + 2e→

Glukoz miktarı, oluşan hidrojen peroksitle orantılı olduğu için ölçülen anodik akımdan

glukoz derişimi bulunur.

Bu çalışmada glukoz tayini için yeni bir enzim elektrodun hazırlanmasının yanı sıra, bu

elektrodun performans faktörleri ve en uygun çalışma koşulları da incelendi. Hazırlanan

enzim elektrodun cevabına serumda bulunabilecek ve bozucu etki gösterebilecek bazı

4

elektroaktif türlerin etkisi incelendi ve glukoz tayini için geliştirilen enzim elektrodun

serum numunelerinde kullanılabilirliği test edildi.

1.1 Nanopartikül Modifiye Glukoz Biyosensörleri ile İlgili Kaynak Araştırması

Glukoz tayini için HPLC, kapiler elektroforez, gaz-sıvı kromotografisi gibi birçok

yöntem kullanılmaktadır (Benvenuto vd. 2008). Buna rağmen glukoz tayini için

geliştirilen biyosensörler; küçük, taşınabilir, hızlı ve pratik oldukları için gün geçtikçe

yaygınlaşmaktadır (Li vd. 2009). Bu tez çalışmasında nanopartiküllerden yararlanılarak

enzim elektrot geliştirilmesi amaçlandığı için kaynak araştırması da nanopartikül

modifiye glukoz biyosensörleri ile sınırlandırılmıştır.

Glukoz tayini için geliştirilen nanopartikül modifiye enzim elektrotlar çoğunlukla

elektrokimyasal ve optik ölçümlere dayanır.

Optik biyosensörlerde genellikle floresans/fosforesans ve lüminesans/kemilüminesans

gibi ölçüm tekniklerinden yararlanılır. Glukozun elektrokimyasal yöntemler ile

tayininde ise genellikle amperometrik ve voltametrik ölçüm üzerine temelli

biyosensörler üretilmektedir. Özellikle amperometrik ölçümler glukoz tayini için en

yaygın kullanılan tekniklerin başında gelmektedir. Glukoz biyosensörlerinde çoğunlukla

iletken veya yarı iletken metal ve metal oksit nanopartiküller ile en az iki nanoyapıdan

oluşan nanokompozitler kullanılmaktadır:

Metal nanopartiküller ile ilgili çalışmalar

Comba vd. (2010b) tarafından yapılan bir çalışmada, öncelikle, demir nanopartikülleri

ve GOx enzimi, mineral yağ ile karıştırılmış ve sonra içerisine grafit tozu eklenip tekrar

karıştırılarak bir pasta elde edilmiştir. Hazırlanan karışım karbon pasta elektrot

gövdesine doldurulmuş ve Ag/AgCl’e karşı -0,10 V potansiyelde glukoz tayini

yapılmıştır.

5

Shen vd. (2007) çalışmasında iridyum (Ir) nanopartikülü içeren iletken karbon

mürekkebi kullanmıştır. Bu amaçla, Ir nanopartikülleri grafit tozu ile karıştırılmış ve

karışım fosfat tamponu içinde çözülen polietilenimin ve hidroksietil çözeltisi ile

muamele edilmiştir. GOx enzimi glutaraldehit kullanılarak Ir-karbon çalışma elektrodu

içerisinde bulunan polietilenimin ile kovalent olarak bağlanmıştır. Hazırlanan enzim

elektrot Ag/AgCl’e karşı +0,20 V potansiyelde glukoz tayini için kullanılmıştır.

Huang vd. (2005) hazırladığı enzim elektrotta kadmiyum sülfür (CdS) nanopartikülleri

kullanmışlardır. GOx enzim çözeltisi CdS nanopartikülleri ile karıştırılmış ve karışım

bir mikro şırınga yardımı ile pirolitik karbon disk elektrot yüzeyine yayılmıştır.

Hazırlanan enzim elektrot ile dönüşümlü voltametri yöntemi kullanılarak glukoz tayini

yapılmıştır.

Haghighi vd. (2011) tarafından çok duvarlı karbon nanotüplerin (MWCNT) yüzeyi altın

(Au) nanopartikülleri ile kaplanmıştır. Oluşan MWCNT-Au yapısını ve kitosan ile

çapraz bağlanmış glukoz oksidaz enzimi bir camsı karbon elektrot yüzeyine modifiye

edilerek elektrokemilüminesans temelli glukoz elektrodu geliştirilmiştir.

Sun vd. (2009) tarafından yapılan bir çalışmada ise, yarı iletken kadmiyum sülfür (CdS)

nanokristalleri ile modifiye edilmiş platin elektrot üzerine glukoz oksidaz enzimi

immobilize edilmiştir. Mor ötesi ışın altında enzim ve CdS nanokristalleri arasındaki

fotokimyasal etkileşimin ölçülmesi için fotoelektrokimyasal temelli bir biyosensör

hazırlanmıştır.

Metal oksit nanopartiküller ile ilgili çalışmalar

Luo vd. (2009) tarafından yapılan bir çalışmada, kitosan çözeltisi içeren NiFe2O4

nanopartikül modifiye camsı karbon elektrot üzerine GOx enzimi immobilize edilmiş ve

ferrosen karboksilik asit medyatörü kullanılarak glukozun tayini, SCE’ye karşı +0,60 V

potansiyelde amperometrik yöntemle gerçekleştirilmiştir.

6

Li vd. (2008) GOx enzimini, kitosan kullanarak çapraz bağlama tekniği ile NiO boş

nanokürelerin yüzeyine immobilize etmişlerdir. Hazırlanan enzim elektrot ile SCE’ye

karşı +0,35 V’da yapılan glukoz tayini için en düşük tayin limiti 47 µM bulunmuştur.

Salimi vd. (2007) tarafından 1 mM nikel nitrat içeren fosfat tamponu içinde Ag/AgCl’e

karşı –0,80 V potansiyelde camsı karbon elektrot yüzeyinde elektrokaplama yöntemi ile

NiO nanopartikülleri oluşturulmuştur. Hazırlanan NiO modifiye camsı karbon elektrot

GOx çözeltisi içine daldırılmış ve +0,80 V potansiyelde elektroçözünme yöntemi ile

enzimin elektrot yüzeyine immobilizasyonu sağlanmıştır. NiO/GOx/GC elektrodu

ferrosenmetanol medyatörü varlığında, +0,30 V potansiyelde glukozun

yükseltgenmesine karşı üstün elektrokatalitik özellik göstermiştir.

Ren vd. (2009) tarafından platin elektrot üzerine, çinko oksit (ZnO) nanopartikül ile

modifiye GOx enzimi immobilize edilmiş ve enzim elektrot yüzeyindeki yarı iletken

ZnO nanopartiküllerin fotovoltaik etkisinin yorumlanmasını temel alan

fotoelektrokimyasal bir enzim elektrot hazırlanmıştır.

Kong vd. (2009) yaptıkları bir çalışmada altın elektrot yüzeyini ZnO nanotüpleri ile

kaplamış ve glutaraldehit ile çapraz bağlanan GOx enzimi Au-ZnO nanotüp elektrodun

yüzeyine adsorplamıştır. Hazırlanan enzim elektrot ile SCE’ye karşı +0,80 V

potansiyelde glukoz tayini yapılmış ve tayin sınırı 1,0 µM olarak bulunmuştur.

Liu vd. (2009) glukoz biyosensörü geliştirmek için, indiyum kalay oksit (ITO) cam

elektrot yüzeyine dikey hizalanmış ZnO nanoçubuklarını kullanmışlardır. Hazırlanan

elektrot üzerine GOx enzim çözeltisi damlatılarak yüzeye adsorpsiyonu sağlanmış ve

nafyon çözeltisi kullanılarak hazırlanan enzim elektrot yüzeyinde koruyucu polimerik

bir film oluşturulmuştur. ZnO/GOx/Nafyon/ITO enzim elektrodu ile SCE’ye karşı

-0,10 V potansiyelde glukoz tayin edilmiş ve 5,00-300 µM derişim aralığında doğrusal

cevap elde edilmiştir.

7

Nanokompozitler ile ilgili çalışmalar

Xian vd. (2005) tarafında yapılan bir çalışmada Au nanopartikülleri ve polianilin

(PANI) nanofiberleri birleştirilerek bir nanokompozit sentezlenmiştir. Hazırlanan Au-

PANI nanokompoziti camsı karbon elektrot yüzeyine kaplanmıştır. Glutaraldehit ve

sığır serum albümin (BSA) ile karıştırılan GOx enzimi Au/PANI/GC elektrodu

yüzeyine damlatılarak çapraz bağlanması sağlanmıştır ve hazırlanan enzim elektrot ile

SCE’ye karşı +0,60 V potansiyelde glukoz tayini için kullanılmıştır.

Kaushik vd. (2008) kitosan (CHIT) ile birlikte Fe3O4 nanokompozit filmi içeren enzim

elektrot hazırlamıştır. Bu çalışmada kitosan, elektrodun mekanik dayanımı, yüksek su

geçirgenliği, sahip olduğu amino grupları ile hidrofilik bir ortam yaratması ve enzimin

bağlanması için kullanılmıştır. CHIT- Fe3O4 filmi indiyum kalay oksit (ITO) cam

elektrot yüzeyine yayılmıştır. CHIT- Fe3O4/ITO elektrodu yüzeyine immobilize edilen

GOx enzimi ile hazırlanan elektrot dönüşümlü voltametri ve fotometrik yöntemler

kullanılarak glukozun tayini için kullanılmıştır.

Yukarıda kısaca anlatılan bazı nanopartikül modifiye glukoz biyosensörlerini

karşılaştırabilmek için çizelge 1.1 hazırlandı:

8

Çizelge 1.1 Nanopartikül modifiyeli glukoz biyosensörlerinin karşılaştırılması

Referans Çalışma elektrodu/Analiz yöntemi/ Enzim modifikasyonu

Enzim elektrodun hazırlanması

Çalışma potansiyeli

Cevap süresi/ Tekrar kullanılabilirlik

Tampon derişimi, pH’sı ve cinsi /Sıcaklık

Elektrodun duyarlığı/ Gözlenebilme sınırı/Doğrusal derişim aralığı

Numunede glukoz analizi

Raf ömrü

Li vd. 2008 CHIT-NiO-GOx-GCE Amperometrik-Voltametrik Fiziksel adsorpsiyon

NiO nanopartikülü ile modifiye edilen GC elektrodu üzerine önce GOx sonra CHIT çözeltisi damlatılıp kurutulmuş

SCE’ye karşı +0,35 V

8 s/1mM glukoz tayini için 10 kez aynı enzim elektrot kullanılmış ve duyarlıkların bağıl standart sapması (BSS) % 3,5 bulunmuş

pH 6,98 PBS/- 3,43 µA/mM/ 47 µM/ 1,5-7,0 mM

Farklı derişimde 5 serum örneğinde glukoz analizi yapılmış

20 gün sonunda ilk duyarlığın % 85’i korunmuş

Mu vd. 2010

NiO-CPE/ Amperometrik/ Enzim içermiyor

1:9 oranında karıştırılan grafit tozu ve NiO np’leri parafin yağı ile pasta kıvamına getirilmiş. Hazırlanan karışım karbon pasta elektrot gövdesine yerleştirilmiş

Ag/AgCl’e karşı +0,70 V

5 s/1 mM glukoz tayini için aynı elektrot ile 5 kez ölçüm alınmış ve duyarlıkların bağıl standart sapması % 2,3 olarak belirlenmiş.

- 43,9 nA/µM/ 0,16 µM/ 1-110 µM

Seyreltik meyve suyu örneklerinde analizler yapılmış ve BSS % 1,8 bulunmuş

1 ay sonunda elektrodun glukoza cevabında azalma gözlenmemiş

9

Çizelge 1.1 Nanopartikül modifiyeli glukoz biyosensörlerinin karşılaştırılması (devam)








Raf ömrü

Luo vd. 2009

CHIT-NiFe2O4-GOx-GCE/ Amperometrik/ Çapraz bağlama

NiFe2O4 np’leri kitosan (CHIT) çözeltisinde çözülmüş ve karışıma GOx çözeltisi eklenmiş. Hazırlanan çözelti GCE yüzeyine damlatılıp kurutulmuş


4 s/- 0,1 M pH 7 PBS/25 oC

45,6 µA/(mmol L−1 cm−2)/ - / 1,0-8,0 mM

- 30 gün sonunda ilk duyarlığın %90’ından fazlası korunmuş

Fang vd. 2010

Nafyon-ZnO-GOx-GCE/ Amperometrik/ Fiziksel adsorpsiyon

GCE elektrot yüzeyine biriktirilen ZnO ve GOx çözelti karışımı üzerine nafyon damlatılıp kurutulmuş


5 s/ Aynı enzim elektrot ile CV’de 50 döngü alınmış ve ilk duyarlığın % 96,5’i korunmuş

0,1 M pH 7,4 PBS/-

18,61 µA/mM/ 1 µM/ 5×10-3-13,15 mM

Saf su ile seyreltilmiş farklı derişimlerde glukoz çözeltileri hazırlanmış ve BSS’ler % 2’nin altında bulunmuş

20 gün sonunda ilk duyarlığın % 93,0’ü korunmuş

10









Raf ömrü

Usman Ali vd. 2009

Nafyon/ZnO/GOx/ Gümüş elektrot/ Potansiyometrik/ Çapraz bağlama

Gümüş elektrot üzerinde sentezlenen ZnO nanotellerine GOx enzimi glutaraldehit ile çapraz bağlanmış ve nafyon damlatılıp kurutulmuş

Ag/AgCl’e 80-90 mV

Nafyonsuz 1s, nafyonlu 4s/-

0,01 M pH 7,4 PBS/23±2 oC

-/-/ Nafyonsuz 0,5 µM- 1 mM nafyonlu 0,5 µM- 10 mM

- 3 hafta sonunda ilk akımın % 90’ı korunmuş

Xian vd. 2005

Nafyon-Au- PANI- GOx-GCE / Amperometrik/ Çapraz bağlama

BSA ve GA ile karıştırılan GOx çözeltisi GCE yüzeyine kaplanan Au-PANI nanokompoziti üzerine damlatılarak enzimlerin yüzeye çapraz bağlanması sağlanmış ve son olarak nafyon damlatılıp kurutulmuş


5 s/- 0,1 M pH 6,9 PBS/ 25 oC

2,3 mA/M/ 5,0×10-7 M/ 1,0×10-6-8,0×10-4 M

Hazırlanan elektrot ile 5 farklı derişimde glukoz içeren serum örnekleri için birer kez ölçüm alınmış

2 hafta sonunda ilk ölçülen duyarlığın %5’inden daha az bir duyarlık kaybı gözlenmiş

11









Raf ömrü

Huang vd. 2005

CdS-GOx-PGE/ Potansiyometrik/ Fiziksel adsorpsiyon

1:1 oranında karıştırılan CdS ve GOx çözeltisinden 30 µL alınmış ve pirolitik grafit disk elektrot (PGE) üzerine damlatılarak oda sıcaklığında bir gece kurutulmuş

SCE’ye karşı 0-(-)800 mV

-/Hazırlanan elektrot 100 döngü boyunca kararlılığını korumuş

0,1 M pH 6,0 PBS/ 18±2 oC

7,0 µA/mM/ 0,05 mM/ 0,5-11,1 mM

- 20 gün sonunda başlangıç cevabının % 92’si korunmuş

Zhao vd. 2007

Nafyon-GOx-PET-Ti-Au-ZnO:Co elektrodu/ Amperometrik/ Çapraz bağlama

Sırasıyla metal Ti ve Au ince tabakaları implante edilmiş PET düzlemi üzerine ZnO:Co nanoyapısı çöktürülmüş ve elektrot yüzeyine GA-BSA ile karıştırılmış GOx ve nafyon damlatılıp kurutulmuş


8 s/- 0,1 M pH 7,4 PBS/24±2 oC

13,3 µA/mA cm2/ 20 µM/ 0-4 mM

- 2 hafta sonunda ilk duyarlığın % 10’undan daha az bir kayıp gözlenmiş

12









Raf ömrü

Benvenuto vd. 2008

Ti/Au/PB/GOx/TiO2/ Amperometrik/ Çapraz bağlama

Prusya mavisi (PB) ve Au ile modifiye edilmiş sıralı TiO2 nanotüplerinin üzerine GOx enzimi kitosan ile çapraz bağlanmış

Ag/AgCl’e karşı -0,10 V

10s/-

0,1 M pH 6 PBS/25 oC

36 µA/mM/ 5 µM/ 0,015-4,00 mM

- 3 hafta sonunda ilk akımın % 90’ı korunmuş

Ren vd. 2005

Ag-Au-GOx-Pt tel Amperometrik/ Çapraz bağlama

GOx çözeltisine, Ag-Au np’leri içeren çözeltisi eklenmiş ve Pt tel hazırlanan karışıma 1 cm daldırılıp kurutulmuş


-/- pH 6,8 PBS/ 25 oC

19 µA/mM cm2/ -/-

- 1 ay sonunda ilk duyarlığın % 90’nı korunmuş

Shan vd. 2006

CaCO3/GOx/Pt elektrot/ Amperometrik/ Tutuklama

GOx ve CaCO3 nanopartikül karışımı Pt elektrot üzerine dökülmüş ve 1 gece kurutulduktan sonra 15 dakika glutaraldehit içinde bekletilmiş


6 s/- 0,1 M pH 6,5 PBS/25 oC

58,1 mA cm-2 M-1/ 0,1 µM/ 0,001-12 mM

- 120 gün sonunda ilk duyarlığın % 86’sı korunmuş

13









Raf ömrü

Mahadeva ve Kim 2011

GOx/Selüloz-SnO2/ Kondüktometrik/ Fiziksel adsorpsiyon

Selüloz film yüzeyine SnO2 çöktürülmesi ile oluşturulan nanokompozit yüzeyine GOx enzimi fizikel adsorpsiyon ile tutturulmuş

- -/- pH 7,2 PBS/ 25 oC

-/-/ 0,5-12 mM

- Farklı zamanlarda alınan 5 ölçüm arasında % 5-10 hata oranı gözlenmiş

Salimi vd. 2007

NiO-GOx-GCE Amperometrik Fiziksel adsorpsiyon

NiO nanopartikülü ile kaplanmış ITO cam elektrot yüzeyine enzim immobilize edilmiş


< 3 s/- 0,05 M pH 7 PBS/ 20±1 oC

446,2 nA/mM/ 24 µM/ 30 µM-5,0 mM

- -

Milardovic vd. 1997

GOx/Ni/ Amperometrik/ Çapraz bağlama

Ni elektroduna, GA ve BSA ile karıştırılan GOx çapraz bağlama yöntemi ile immobilize edilmiş

Ag/AgCl’e karşı -0,20 V

20s/- 0,1 M pH 7,4 PBS/-

-/- 5 µM-2,9 mM

Farklı derişimde glukoz içeren 10 kan serumunda glukoz analizi yapılmış

30 gün sonunda elektrodun ilk duyarlığının % 30’u azalmış

14









Raf ömrü

Chen vd. 2008

POAP-GOx/BCNT/ GCE/ Amperometrik/ Tutuklama

B2O3 tozu ve CNT arasındaki yer değiştirme reaksiyonu ile sentezlenen BCNT çözeltisi GC elektrot üzerine damlatılıp kurutulmuş, GOx’ın elektroda immobilizasyonu poli(o-aminofenol) ve GOx’ın co-elektropolimerizasyonu ile sağlanmış


6 s/- 0,06 M pH 7,0 PBS/25 oC

2,43 µA mM-1

3,6 µM 8 mM’a kadar geniş bir derişim aralığı bulunmuş

4 farklı glukoz derişimine sahip her bir kan serumunda 3 kez glukoz tayini yapılmış, bulunan sonuçlar hastane sonuçları ile karşılaştırılmış

20 gün sonunda başlangıç akımının % 80’i korunmuş

Shi ve Ma 2010

CHIT/GOx-AgTNPs/Pt/ Amperometrik/ Çapraz bağlama

Üçgensel olarak sentezlenen Ag nanopartikülleri GOx, kitosan ve glutaraldehit ile karıştırılmış, Pt elektrodun karışıma daldırılıp oda sıcaklığında kurutulması ile enzim elektrot hazırlanmış


-/ard arda 50 ölçümden sonra başlangıç akımının % 80’i korunmuş

0,1 M pH 7,0 PBS/35oC

67,17 µA cm-2 mM-1/ 1×10-6 M/ 3×10-6- 3×10-3 M

- 1 ay sonunda başlangıç akımının % 85’inin korunduğu gözlenmiş

15









Raf ömrü

Baby ve Ramaprabhu 2009

GOD/Fe3O4-SiO2/MWNTs/GC/ Amperometrik/ Fiziksel adsorpsiyon

Fe3O4-SiO2/MWNT nanopartikülleri GC elektrot yüzeyine kaplanmış, üzerine GOx çözeltisi ve nafyon çözeltisi damlatılıp kurutulmuş


3-6 sn/- 0,1 M pH 7 PBS/ -

58,9 µA/mM cm-2/ 800 nm/ 1 µM-30 mM

- -

Sheng vd. 2008

GOx/NdPO4/CHIT/ GCE Amperometrik/ Fiziksel adsorpsiyon

Kitosan içinde dağıtılan NdPO4

np’leri üzerine GOx çözeltisi eklenmiş ve 1 gece buzdolabında bekletildikten sonra karışım GCE üzerine damlatılıp kurutulmuş


5 s/- 0,05 M pH 6,8/ 25 oC

1,92 µA mM-1 0,08 mM/ 0,15-10 mM

Farklı derişimde glukoz içeren 3 adet serum numunesinde glukoz analizi yapılmış

30 gün sonunda elektrodun ilk duyarlığının % 90’ının korunduğu belirlenmiş

16

2. KURAMSAL TEMELLER

2.1 Biyosensörler

Biyosensörler; analitlerin tanınmasını sağlayacak olan biyolojik tanı materyalini içeren

ve bir fizikokimyasal çevirici yardımıyla analit ile biyolojik tanı materyali arasındaki

etkileşim sonunda oluşan ürünü ölçülebilir sinyale dönüştürebilen analitik cihazlardır

(Paddle 1996). Günümüzde biyosensörler; gıda endüstrisi, tıp, çevresel analizler, tarım

vb. gibi birçok alanda kullanılmaktadır. Bir biyosensör biyolojik tanı materyali, çevirici

ve dedektör olmak üzere üç temel kısımdan oluşur (Şekil 2.1). Biyosensörler, sahip

oldukları biyolojik tanı materyaline ya da fizikokimyasal çevirici türüne göre

adlandırılırlar.

Şekil 2.1 Biyosensörün şematik gösterimi

Biyolojik tanı materyalleri, tayin edilmesi hedeflenen analitlerle spesifik olarak

tepkimeye giren biyomoleküllerdir. Bu biyomoleküllerin tipi biyosensörün seçiciliğinin

ve spesifikliğinin derecesini belirler (Mello ve Kubota 2001). Sensörler, biyolojik tanı

materyalleri özelliklerine göre biyoaffinite, biyokatalitik ve hibrid sensörler olmak üzere

üç gruba ayrılırlar:

17

Biyokatalitik sensörler

Enzimler, sahip oldukları aktif katalitik bölgeleri sayesinde substratları ile spesifik

olarak etkileşime giren biyomoleküllerdir. Enzimlerin yanı sıra mikroorganizmalar,

hücreler, hücre organelleri, bitki ve hayvan dokuları da substratlarına karşı katalitik

aktivite gösterirler. Bu moleküller katalitik özellikleri nedeni ile biyokatalitik

moleküller, enzim gibi biyokatalitik tanı materyalleri içeren biyosensörler ise enzim

sensörleri olarak adlandırılırlar. Bu tür biyosensörlerde genellikle amperometrik,

potansiyometrik, termal, optik ve piezoelektrik çevirici sistemleri kullanılır (Mello ve

Kubota 2001).

Biyoaffinite sensörleri

Biyoaffinite temelli biyosensörler, antikor ve nükleik asit gibi biyomoleküller içerirler.

Bu biyomoleküller, substratları ile spesifik bir şekilde etkileşmelerini sağlayan

ligandlara sahiplerdir. Antikor, nükleik asit gibi biyospesifik tanı materyallerine sahip

olan sensörler immünosensörler olarak adlandırılırlar. İmmünosensörler genellikle

çeşitli hastalıkların tanısında ve gıda analitlerinin tayininde kullanılmaktadırlar. Bu

biyosensörlerde optik ve piezoelektrik çevirici sistemleri kullanılır (Mello ve Kubota

2001).

Hibrid sensörler

DNA; adenin, guanin, sitozin ve timin bazlarını içeren çift polipeptid zincirli, RNA ise

DNA’dan farklı olarak timin yerine urasil bazı içeren tek polipeptit zincirli

biyomoleküllerdir. DNA’da guanin bazı sitozin, adenin bazı timin ile eşleşir. RNA’ da

ise guanin bazı sitozin ile, adenin bazı urasil ile eşleşir. Bu eşleşmelerden yararlanılarak

baz dizilimi bilinen DNA veya RNA tek polipeptid zincirinin eşleniği olan polipeptid

zinciri biyolojik tanı materyali olarak kullanılır. DNA veya RNA sensörleri genellikle

genetik modifikasyon çalışmalarında ya da gıda endüstrisinde E.Coli, Salmonella gibi

patojenlerin tanısında kullanılır (Mello ve Kubota 2001).

18

Analitler ile etkileşen biyolojik tanı materyallerinin meydana getirdiği ürünler,

biyosensörlerle birleştirilen fizikokimyasal çeviriciler ile okunabilir sinyallere

dönüştürülürler. Biyokimyasal sinyalin türüne göre 4 çeşit fizikokimyasal çevirici

bulunur (Mello ve Kubota 2001):

Elektrokimyasal çeviriciler

Analit ile biyolojik tanı materyali arasında elektron aktarımı, yüklü türlerin difüzyonu

veya iyon transferi olduğu durumlarda elektrokimyasal çeviriciler kullanılır. En yaygın

kullanılan çeviricilerdir. Elektrokimyasal çeviriciler; amperometrik, potansiyometrik,

iyon seçici alan etki transistörleri (ISFET), kondüktometrik ve impedimetrik olarak

sınıflandırılabilirler.

Amperometrik çeviriciler; uygulanan potansiyelde analit ile biyolojik tanı molekülü

arasındaki kimyasal reaksiyon sonucunda ortaya çıkan akımı ölçer. Amperometrik

çeviricileri kullanan sensörlere amperometrik biyosensörler denir.

Potansiyometrik çeviriciler; çalışma elektrodu yüzeyinde meydana gelen elektroaktif

türlerin derişimi ile orantılı olarak değişen potansiyelleri ölçer. Bu tür sensörlere

potansiyometrik sensörler denir. İyon seçici alan etki transistörleri (ISFET) iyon seçici

elektrot üzerine immobilize edilmiş enzim veya antikor gibi biyolojik tanı

materyallerinin substratları ile etkileşmesi ile oluşan potansiyel değişimlerini ölçer.

Kondüktometrik çeviriciler; karbohidratlar gibi yüksüz metabolitlerin ya da laktik asit

gibi ara ürünlerin analit olarak kullanıldığı durumlarda iki metal elektrot arasındaki

iletkenlik değişimini ölçer. Bu tür biyosensörler kondüktometrik sensörler olarak

adlandırılır. Kondüktometrik biyosensörler, zayıf sinyallere sahip oldukları ve analite

karşı spesifiklik göstermedikleri için pek tercih edilmezler.

İmpedimetrik çeviriciler; hem iletkenlik hem de elektriksel kapasite artışına neden olan

ürünlerin impedansındaki azalmayı ölçer. İmpedans, maddenin öz direncidir.

19

Optik çeviriciler

Optik çeviriciler, analit ile biyolojik tanı materyali arasındaki etkileşim sonucunda

ortaya çıkan türlerin UV-VIS absorpsiyonu, lüminesans, floresans/fosforesans, yansıma

ve ışık saçılması gibi yöntemler ile ölçülmesini sağlar.

Termal çeviriciler

Termal çeviriciler, biyolojik tanı materyali ile analit arasında gerçekleşen tepkime

sonucunda meydana gelen ısı değişiminin ölçülmesini temel alır.

Piezoelelektirik çeviriciler

Piezoelektrik çeviriciler, bir piezoelektrik kristali yüzeyine immobilize edilmiş biyolojik

tanı materyalinin analit ile etkileşmesi sonucunda kristalde meydana getirdiği titreşimin

ölçülmesi esasına dayanır.

Biyosensörler hedef analitleri, biyolojik tanı materyalleri, çevirici türleri, avantajları ve

dezavantajlarına göre aşağıdaki çizelge 2.1’de özetlenmiştir (Mello ve Kubota 2001):

Çizelge 2.1 Biyosensörlerde kullanılan analitler, biyolojik tanı materyalleri, çeviriciler ve bu çeviricilerin avantajları ile dezavantajları

Çevirici Analit Biyolojik Tanı Materyali

Avantajı/Dezavantajı

Elektrokimyasal Glukoz Galaktoz Kolesterol Fenolik bileşikler Laktat Histamin vb.

Biyokatalitik moleküller

İndirgenme ve yükseltgenme tepkimelerine duyarlı, basit, minyatürize edilebilir / Çoklu enzim sistemleri için kullanışsız

20

Çizelge 2.1 Biyosensörlerde kullanılan analitler, biyolojik tanı materyalleri, çeviriciler ve bu çeviricilerin avantajları ile dezavantajları (devam)

Çevirici Analit Biyolojik Tanı Materyali

Avantajı/Dezavantajı

Optik Alkoller Karbohidratlar Bakteriler vb.

Biyokatalitik moleküller Biyoaffinite molekülleri Hibrid moleküller

Düşük maliyet, çeşitli uygulama yöntemi (floresans,fosforesans vb.) / Yüksek enerji kaynaklarına ihtiyaç, ortam ışığının girişimi

Piezoelektrik Mikroorganizmalar Lipidler Karbohidratlar vb.

Biyokatalitik moleküller Biyoaffinite molekülleri

Düşük maliyet, hızlı cevap, gaz analitler için uygunluk / Sıvı içinde düşük duyarlık, spesifik olmayan bağlanmaların girişim etkisi

Termal Alkoller Karbohidratlar Lipidler vb.

Biyokatalitik moleküller

Optik yöntemlerde olduğu gibi türbidimetrik ya da renk girişimlerinin olmaması / Düşük seçicilik

2.1.1 Amperometrik enzim elektrotlar

Amperometrik çeviriciler, özellikle klinik tayinler için geliştirilen biyosensörlerde

sıklıkla kullanılmaktadırlar. Amperometrik ölçümler, sabit bir potansiyelde elektrot

yüzeyinde bazı elektroaktif türlerin indirgenme veya yükseltgenme akımlarının

ölçülmesi esasına dayanır. Akım yoğunluğu elektroaktif türlerin derişimi ile doğru

orantılıdır (D’Orazio 2003).

Amperometrik tayinlerde; çalışma elektrodu, referans elektrot ve karşıt elektrot olmak

üzere üç elektrotlu elektrokimyasal hücre sistemleri kullanılır. En yaygın kullanılan

çalışma elektrotları karbon pasta elektrotlar, karbon nanotüpler, camsı karbon

21

elektrotlar, altın, gümüş platin gibi metal elektrotlar ve kompozit elektrotlardır. Çalışma

elektrodu tayin edilecek analite duyarlı biyolojik tanı materyalini içerir. Referans

elektrot olarak genelde Ag/AgCl ve SCE elektrotları, karşıt elektrot olarak ise Pt tel ya

da Pt elektrotlar kullanılır.

Amperometrik enzim elektrotlarda en yaygın kullanılan biyolojik tanı materyalleri

enzimlerdir. Literatürde kayıtlı ilk amperometrik enzim elektrot 1962 yılında Clark ve

Lyons tarafından kanda glukoz tayini için geliştirilen enzim elektrottur (Zang vd. 2000).

Elektroda glukoza duyarlı glukoz oksidaz (GOx) enzimi immobilize edilmiş ve

enzimatik reaksiyon sonucunda oluşan hidrojen peroksitin (H2O2) referans elektroda

karşı +0,7 V potansiyelde O2’ye yükseltgenmesi ile ortaya çıkan elektronların akım

yoğunluğu ölçülerek kandaki glukoz derişimi belirlenmiştir (D’Orazio 2003).

Glukoz oksidaz tarafından katalizlenen reaksiyon aşağıda verilmiştir:

GOx2 2 2Glukoz + O Glukonolakton + H O→

Yukarıdaki eşitlikte görüldüğü gibi, glukoz O2 varlığında glukonik asite dönüşürken, O2

H2O2’ ye indirgenir.

Amperometrik olarak glukoz tayini, +0,7 V’da H2O2’in tekrar O2’ye yükseltgenmesine

dayanılarak yapılmıştır:

+ -2 2 2H O 2H +O + 2e→

Amperometrik enzim elektrotlar elektroaktif tür ile elektrot arasındaki ilişkiye göre 3

sınıfta incelenebilir (Dzyadevych vd. 2008):

22

Birinci nesil enzim elektrotlar

Birinci nesil enzim elektrotlar, analit ile biyolojik tanı materyali arasındaki reaksiyon

sonucu oluşan elektroaktif türlerin hiç bir aracı olmaksızın amperometrik yöntemlerle

doğrudan ölçülmesi esasına dayanır (Şekil 2.2). Birinci nesil enzim elektrotların çalışma

prensibi glukoz üzerinden aşağıdaki eşitliklerde gösterilmiştir (Dzyadevych vd. 2008):

(yük) (ind)Glukoz +GOx GOx +Glukonolakton→

(ind) 2 (yük) 2 2GOx +O GOx +H O→

İkinci nesil enzim elektrotlar

İkinci nesil elektrotlarda analit ve biyolojik tanı materyali arasındaki tepkime sonucu

ortaya çıkan elektroaktif türler bir medyatör aracılığı ile elektroda iletilir (Şekil 2.2).

Yapay veya doğal elektron transfer aracıları olan medyatörler (M) iyon aktarımını

kolaylaştıracağı ve hızlandıracağı için daha düşük potansiyellerde çalışma imkanı sunar

ve bu sayede ortamda girişim yapabilecek türler engellenir (Chaubey ve Malhotra

2001). Medyatörlü enzim elektrodunun çalışma prensibi glukoz üzerinden aşağıdaki

eşitliklerde verilmiştir:

( ) ( )

yük indGlukoz GOx Glukonolakton GOx+ +→

( )

(ind) (yük) (yük ) indGOx 2M GOx 2M 2H+ +→+ +

( )

( yük)ind2M 2M 2e−+→

23

Üçüncü nesil enzim elektrotlar

Üçüncü nesil enzim elektortlarda, analit ve biyolojik tanı materyali arasındaki tepkime

sonucu ortaya çıkan elektroaktif türler ile elektrot yüzeyi arasında herhangi bir e-

taşıyıcı olmaksızın doğrudan elektron transferi gerçekleşir (Şekil 2.2) (Zang ve Li

2003). Bu olay biyoelektrokataliz olarak adlandırılır. Üçüncü nesil enzim elektrotlarda

biyolojik tanı materyali olarak Sitokrom c gibi küçük redoks proteinlerin kullanımında

doğrudan e- transferi sırasında sıkıntı gözlenmez. Fakat; glukoz oksidaz gibi büyük

redoks enzimlerin kalın protein bir kabukla kaplanmış ve aktif bölgesinin enzimin içine

gömülmüş olmasından dolayı bu tür enzimlerde elekrot yüzeyi ile enzimin aktif bölgesi

arasındaki direk elektron transferi zordur. Bu durumu aşmak için elektrot yüzeyi

genellikle tetrasiyanokuinodimetan (TCNQ) ve tetratiyafulvalen (TTF) gibi yüksek

iletkenliğe sahip organometalik tuzlarla kaplanır (Vastarella 2001).

Şekil 2.2 Farklı nesillerdeki enzim elektrotların şematik gösterimi (M(yük) ve M(ind) yükseltgenmiş ve indirgenmiş medyatör, GOx(yük) ve GOx(ind) yükseltgenmiş ve indirgenmiş glukoz oksidaz)

24

2.1.2 Nanoteknoloji

Günümüzde nanoteknoloji; bilgisayar, fizik, kimya, tıp, tekstil, çevre ve elektronik gibi

birçok alanda sıkça karşılaşılan bir terimdir. Nanoteknoloji, maddeleri atomik ve

moleküler boyutta inceleme ve kullanma olanağı sunar. Ayrıca birçok alanda gelişmeye

ve yeniliğe imkan sağlar (Roco 2003).

Nanomateryaller 1-100 nm arasında boyutlara sahip, istenilen ölçü ve şekillerde

sentezlenebilen maddelerdir. Nanomateryallerin yenilik sağladığı en önemli alanlardan

biri kuşkusuz biyosensörlerdir. Bu yapılar, biyosensörlerde genelde nanotüpler,

nanofiberler, nanoçubuklar, nanopartiküller ve ince filmler olarak kullanılırlar (Jianrong

vd. 2004). Karbon nanotüpler ve altın, demir, platin, bakır, zirkonyum oksit, titanyum

oksit, iridyum oksit, demir oksit gibi metal ve metal oksitler biyosensörlerde kullanılan

bazı nanoyapılardır (Salimi vd. 2006). Özellikle yarı iletken metal ve metal oksit

nanopartiküller mekanik, optik, manyetik, kimyasal vb. özellikleri sebebiyle kimyasal

katalizör veya ışık emisyonu yapan kuantum dot olarak kullanılırlar.

2.1.3 Nanomateryal temelli amperometrik enzim elektrotlar

Nanomateryal temelli amperometrik enzim elektrotlar, elektrot yüzeyine veya içine

tutuklanmış nanopartiküllerden ve immobilize enzimden ibarettir.

Biyosensörlerde enzim ve elektrot arasındaki elektron transferinin hızlı ve kolay olması

oldukça önemlidir. Fakat kullanılan biyomoleküllerin karmaşık ve büyük yapıları

elektrot yüzeyi ile biyomolekül arasındaki elektron transferini zorlaştırır.

Nanopartiküller, enzimin aktif bölgesi ile elektrot yüzeyi arasındaki tersinir elektron

transferini kolaylaştırarak hızlı ölçümler alınmasını sağlar ve bu sayede elektron

transferi için medyatör kullanımına ihtiyaç duyulmaz (Salimi vd. 2007).

Nanopartiküller sahip oldukları nano boyutlar sayesinde geniş yüzey alanı ve serbest

yüzey enerjisi sağlayarak elektrodun hızını ve duyarlığını arttırırlar (Li vd. 2008).

25

Yüksek spesifik yüzey alanı, kararlılık ve biyouyumluluk gibi özellikleri sayesinde

metal nanopartiküllerin yanı sıra demir oksit, çinko oksit, zirkonyum oksit, titanyum

oksit gibi metal oksitler de biyosensörlerde kullanılan en yaygın nanopartiküllerdendir

(Liu vd. 2009). Bu nanoyapılar arasında NiO nanopartikülleri son zamanlarda; katalizör,

gaz sensörleri, elektrokromik film gibi uygulamaları sayesinde dikkat çekmiştir. Buna

rağmen NiO nanopartiküllerinin biyosensörlerde kullanılması oldukça nadirdir. 10,7

gibi yüksek izoelektrik noktasına sahip NiO nanopartikülleri, düşük izoelektrik

noktasına sahip enzimlerin adsorpsiyonu için oldukça idealdir. Özellikle yüksek

kimyasal kararlılık, elektrokataliz, hızlı ve direk elektron transferi kabiliyeti sayesinde

biyosensör uygulamaları için gelecek vaad etmektedir (Li vd. 2008).

2.1.4 Karbon pasta elektrotlar

Grafit tozu ve bağlayıcı olarak çeşitli mineral yağlarının karıştırılması ile hazırlanan

karbon pasta elektrotlar çeşitli elektrotların, sensörlerin ve dedektörlerin

hazırlanmasında kullanılan en yaygın elektrot materyallerinden biridir. İlk kez 1958

yılında Ralph Norman Adams ve çalışma grubu tarafından geliştirilmiştir. Karbon pasta

elektrotların en önemli bileşeni yüksek saflıkta ve µm boyutlarında partiküllere sahip

grafit tozudur. Elektrodun diğer bir bileşeni ise inert ve elektroinaktif, yüksek viskosite

ve düşük volatiliteye sahip bir pasta bağlayıcı sıvıdır. Karbon pastaların

hazırlanmasında genellikle parafin, nujol ve uvasol gibi yağlar kullanılır.

Nanoteknolojinin gelişimi ile birlikte karbon pasta elektrotların kullanımı da

yaygınlaşmıştır. Özellikle çeşitli nanoyapıların kolayca modifiye edilmesi için karbon

pasta elektrotlar oldukça uygun matrikslerdir (Švancara vd. 2008).

Son yıllarda önemli ölçüde ilerleme gösteren nanopartikül modifiyeli karbon pasta

elektrotlar aşağıda belirtildiği gibi birçok avantaja sahiptir (Santos vd. 2007):

26

• Hazırlaması oldukça pratik ve hızlıdır

• Pasta yüzeyi kolayca yenilenebilir

• Düşük maliyetlidir

• Birçok biyosensör materyalini bir arada içerebilir

2.1.5 İdeal biyosensörün sahip olması gereken özellikler

İdeal bir biyosensörün sahip olması gereken özellikler aşağıda kısaca verilmiştir:

Seçicilik

Hedef analit dışında ortamda var olan diğer elektroaktif türler biyosensörün cevabını

etkilememelidir. Kullanılan biyolojik tanı materyali, çalışılan potansiyelde sadece

analizlenmesi istenilen türe duyarlık göstermelidir. Bu yüzden ortamda girişim

yapabilecek türlerin girişim yüzdeleri belirlenmeli ve girişimi engelleyecek önlemler

alınmalıdır.

Duyarlık

Duyarlık, hedef analitin derişimine bağlı olarak biyosensör cevabındaki doğrusal

değişimin gözlenmesi ile belirlenir. Hazırlanan elektrodun duyarlığı hesaplanırken

glukoz derişimine karşı çizilen akım farkları grafiğinin eğiminden faydalanılır. İdeal bir

biyosensörün analizlenecek maddeye karşı yüksek duyarlık göstermesi istenir.

Doğrusal çalışma aralığı ve gözlenebilme sınırı

Doğrusal çalışma aralığı belirlenirken, hazırlanan elektrot bir tampon çözelti içinde

çalışılan potansiyelde kararlı hal akımları elde edilene kadar bekletilir. Stok substrat

çözeltisinden ard arda belli miktarlarda hücreye eklenir ve elektodun substrata karşı

cevapları okunur. Elde edilen akım farkları substrat derişimlerine karşı grafiğe

27

geçirilerek bir kalibrasyon grafiği elde edilir. Elektrot cevabı ile substrat derişiminin

doğrusal olduğu aralığa “doğrusal derişim aralığı” adı verilir. Bu doğrusal aralığın

başladığı en alt sınır “gözlenebilme sınırı”dır. İdeal bir biyosensörün doğrusal derişim

aralığının geniş, gözlenebilme sınırının düşük olması istenir.

Kararlılık

Biyosensörlerin performansını korumasına biyosensör kararlılığı adı verilir. İdeal bir

biyosensörün uzun süre performansını koruması istenir. Bu sayede analiz maliyetleri

azalır ve kullanım süresi artar.

Tekrarlanabilirlik ve tekrar üretilebilirlik

Substrata karşı aynı enzim elektrot ile ard arda alınan ölçümlerden elde edilen

duyarlıklar o biyosensörün tekrarlanabilirliğinin; aynı koşullarda ve içerikte hazırlanan

farklı enzim elektrotların substrata karşı belirlenen duyarlıkları ise o biyosensörün tekrar

üretilebilirliğinin ölçüsüdür. Her iki durumda da elde edilen duyarlıkların birbirine

yakın değerlerde olması hazırlanan biyosensör ile yapılan analizlerin güvenilirliğinin ve

doğruluğunun anlaşılması için önemlidir.

Cevap süresi

Hedef analitin hücreye eklendiği andan itibaren kararlı hal akımları elde edilen ana

kadar geçen süreye “cevap süresi” denir. İdeal bir biyosensörün analizlenecek maddeye

karşı hızlı cevap vermesi istenir.

Ömür

Bir biyosensörün ömrü, hedef analite olan duyarlığın zaman karşı grafiğe geçirilmesi ile

bulunur. Bu grafik incelendiğinde biyosensörün duyarlığını koruduğu süre biyosensörün

28

ömrü olarak belirlenir. İdeal bir biyosensörün uzun ömürlü olması istenir. Ömrü

etkileyen en önemli faktör enzimin immobilizasyon yöntemi ve elektrodu saklama

koşullarıdır.

2.2 Enzimler

Enzimler, canlılarda kimyasal reaksiyonların hızlı gerçekleşmesini sağlayan ve tepkime

sonunda hiçbir değişikliğe uğramadan kalan biyolojik katalizörlerdir. Enzimler

katıldıkları kimyasal reaksiyonlara göre 6 sınıfta incelenebilirler (Nelson ve Cox 2008):

Oksidoredüktazlar: İndirgenme ve yükseltgenme reaksiyonlarını katalizleyen

enzimlerdir.

Transferazlar: H+ iyonları hariç, bir fonksiyonel grubu bir molekülden diğerine aktaran

enzimlerdir.

Hidrolazlar: Kimyasal bağların hidrolizini katalizleyen enzimlerdir.

Liyazlar: Hidroliz ve yükseltgenme dışındaki yollarla kimyasal bağları kırıp yerine bir

çift bağ ya da halka yapısı oluşumunu katalizleyen enzimlerdir.

İzemorazlar: Optik, geometrik veya yapısal izomerlerin yeniden düzenlenmesini

katalizleyen enzimlerdir.

Ligazlar: Büyük moleküllerin bir kimyasal bağ yardımı ile bağlanmasını katalizleyen

enzimlerdir. Bağlanma esnasında moleküllerden birine ait küçük kimyasal grupların

ayrılması gerçekleşebilir.

29

2.2.1 Enzimlerin özellikleri

Enzimler, bazı katalitik RNA molekülleri dışında, protein yapısında bulunan

biyokatalizörlerdir. Enzimleri diğer protein yapılardan ayıran en önemli özellikler

aşağıda verilmiştir (Harvey ve Champe 2007):

2.2.1.1 Aktif bölge

Enzimler substratlarını bir cep şeklinde bulunan aktif bölgelere bağlarlar. Aktif bölgede,

substrata eşlenik olan amino asitler bulunur. Substrat, eşleniği olan amino asitlere

bağlanarak enzim-substrat (ES) kompleksini oluşturur. Daha sonra substrat ürüne

dönüştürülerek ortama bırakılır. Hiçbir değişikliğe uğramadan kalan enzim ise başka bir

substratı bağlamak için hazır hale gelir.

2.2.1.2 Seçicilik

Enzimler belirli substratlarla etkileşerek hep aynı tip reaksiyonları katalizler. Enzimlerin

seçiciliği, canlı organizmalarda katalizlenen reaksiyonların yanı sıra kimyasal analizler

için de oldukça önemlidir.

2.2.1.3 Katalitik etki

Enzimin, reaksiyonun aktivasyon enerjisini düşürerek, substratı ürüne çevirmesine

katalitik etki denir. Aktivasyon enerjisi, kimyasal bir reaksiyonun gerçekleşebilmesi için

aşılması gereken enerji değeridir. Enzimler tarafından katalizlenen reaksiyonların hızı

katalizlenmeyen reaksiyonlara göre 103- 108 kat daha fazladır. Her enzim molekülü

saniyede 100-1000 arası substrat molekülünü ürüne çevirebilir.

30

2.2.1.4 Kofaktörler

Bazı enzimler katalitik aktivitelerini gerçekleştirmek için organik veya anorganik

moleküllere ihtiyaç duyarlar. Metal iyonları gibi anorganik yapıdaki moleküllere ya da

koenzim adı verilen vitamin türevleri gibi büyük organik moleküllerin tamamına

kofaktör denir. Kofaktörüne bağlanmış enzime haloenzim adı verilir. Apoenzim ise

enzimin hangi madde ile etkileşeceğini belirleyen ve bir kofaktöre bağlanmamış protein

kısmıdır. Apoenzim, kofaktörü olmadan aktivite gösteremez. Kofaktörler genellikle

enzimlere zayıf kuvvetlerle bağlanırlar ve bu sayede diyalizle uzaklaştırılabilirler.

Çeşitli yöntemlerle uzaklaştırılamayan, enzime sıkıca bağlı kofaktörlere ise prostetik

grup adı verilir.

2.2.1.5 Aktivasyon ve inhibisyon

Enzimlerin katalizledikleri reaksiyonlardaki hızları ve aktiviteleri başka moleküller

tarafından kontrol edilebilir. Enzimin aktivitesinin arttırılmasına aktivasyon ve bu olayı

gerçekleştiren moleküllere aktivatör, enzimin aktivitesinin azaltılmasına ya da tamamen

durdurulmasına inhibisyon ve bu olayı gerçekleştiren moleküllere inhibitör adı verilir.

2.2.2 Enzimatik reaksiyonların hızını etkileyen faktörler

Farklı enzimlerin aktiviteleri sıcaklık, pH ve substrat derişimi gibi etkenlerden farklı

şekilde etkilenir. Bu yüzden enzimlerle çalışırken optimum çalışma koşulları

belirlenmelidir.

Enzimlerin hızını etkileyen faktörler aşağıda verilmektedir:

31

2.2.2.1 Sıcaklık

Sıcaklık artışıyla tüm kimyasal reaksiyonların hızı artar. Enzim reaksiyonlarında belli

bir sıcaklığa kadar reaksiyon hızı sıcaklıkla artar, ancak daha sonra yüksek sıcaklıkla

enzim denatüre olabildiği için reaksiyon hızı düşer.

2.2.2.2 Ortam pH’sı

Her enzimin maksimum aktivite gösterdiği optimum pH değeri vardır. Bu değerin

altında ve üstünde enzim aktivitesi düşer. Enzimin substratı ile etkileşime girebilmesi

için aktif bölgedeki iyonlaşabilen grupların pKa’sı önemlidir. Ortamın pH’sı da bu

grupların iyonizasyonunu etkileyen en önemli etmenlerdendir. Uç pH değerlerinde

enzim denatüre olabilmektedir. Bu nedenle ortamın pH’sını belirli bir değerde tutmak

için tampon çözeltiler kullanılır.

2.2.2.3 Substrat derişimi

Enzimatik bir reaksiyonun hızı birim zamanda ürüne dönüştürülen substrat miktarıdır ve

maksimum hıza ulaşana kadar substrat miktarı ile artar. Enzimin tamamı substrat ile

doyduğu zaman ise reaksiyonun hızı sabit kalır. Substrat miktarının çok fazla olduğu ya

da oluşan ürünün ortamda birikmesi durumunda enzim inhibe olur ve reaksiyon hızı

azalır.

2.2.3 İmmobilize enzimler

Enzimlerin, suda çözünmemeleri için matriks adı verilen ve destek görevi gören

materyaller üzerine çeşitli yöntemlerle tutturulmalarına enzim immobilizasyonu adı

verilir. Enzimlerin matrikslere aktif grupları kapanmayacak şekilde immobilizasyonu

gerekir. Aktif gruplar kapanırsa enzim substratı bağlayamaz ve verimi azalır.

32

İmmobilize enzimler, serbest halde bulunan enzimlere göre birçok avantaja sahiptir. Bu

avantajlar aşağıda verilmektedir:

• Enzim, bir matrikse tutturulduğu için pH ya da ısı değişimlerinden daha az etkilenir.

• Oluşan ürünler, çözeltinin pH’ sının ya da iyonik şiddetinin değiştirilmesi gibi

yöntemler ile kolayca ortamdan uzaklaştırılabilirler.

• İmmobilize enzimlerin aktivitesi, serbest enzimlere göre daha kolay kontrol

edilebilir.

• Enzimler tekrar tekrar kullanılabilirler.

• Aynı anda birden fazla reaksiyonu katalizleyebilirler.

• Serbest enzimlere göre daha pratik, hızlı ve ucuz analiz olanağı sağlarlar (Costa vd.

2004, http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/IMMOB/benefits.htm)

2.2.4 Enzim immobilizasyon teknikleri

Biyosensörlerde kullanılan en yaygın enzim immobilizasyon teknikleri tutuklama,

kovalent bağlama, çapraz bağlama ve adsorpsiyon olarak 4 sınıfta incelenebilir

(D’Souza 2001):

Tutuklama

Tutuklama sadece enzimler için değil hücreler için de kullanılan en yaygın

immobilizasyon yöntemlerinden biridir. Bu yöntemde enzim molekülleri

polimerizasyon yardımı ile agar, agaroz gibi doğal ya da poliüretan, poliakrilamit gibi

sentetik polimer matrikslerde hapsedilir. Bu yöntem kolay ve ucuzdur; fakat zamanla

enzimin sızması, yüksek difüzyon sınırı ve sterik engel gibi dezavantajlara sahiptir

(Mello ve Kubota 2001).

Kovalent bağlama

Enzimler sahip oldukları fonksiyonel grupları

yüzeyine kovalent olarak bağlanabilirler. Bu yöntem, enzimin fonksiyonel grupları

(katalitik aktivite göstermeyen)

reaksiyona dayanmaktadır (Mello ve Kubota 2001).

Fiziksel adsorpsiyon

Enzimin fiziksel adsorpsiyonu, van der Waals etkileşimlerine dayalı olan en eski ve en

kolay immobilizasyon yöntemidir. Bu yöntemde enzimler,

geçirgen bir membran üzerine doğrudan adsorbe edilir. Kimyasal bir modifikasyona

ihtiyaç duyulmaz. Yöntem basit ve ucuz olması gibi avantajlarının yanı sıra, ölçümler

esnasında pH, sıcaklık ve iyonik şiddetin değişmesi ile adsorbe edilmiş enzimin kaybı

gibi dezavantajlara da sahiptir (Mello ve Kubota 2001).

Çapraz bağlama

Bu yöntem bifonksiyonel ajanlar sayesinde enzimlerin kovalent şekilde matrikslere

bağlanmasına dayanır. Enzimlerin çapraz bağlanmasında glutaraldehit, karbodiimid gibi

bifonksiyonel ajanlar kullanılabilir. En sık kullanılan bifonksiyonel ajan olan

glutaraldehitin kimyasal

33

Enzimler sahip oldukları fonksiyonel grupları ile bir matrikse ya da doğrudan


ktivite göstermeyen) ile matrikste bulunan reaktif gruplar arasındaki

reaksiyona dayanmaktadır (Mello ve Kubota 2001).


kolay immobilizasyon yöntemidir. Bu yöntemde enzimler, elektrot


ç duyulmaz. Yöntem basit ve ucuz olması gibi avantajlarının yanı sıra, ölçümler


gibi dezavantajlara da sahiptir (Mello ve Kubota 2001).

siyonel ajanlar sayesinde enzimlerin kovalent şekilde matrikslere



utaraldehitin kimyasal formülü şekil 2.3’de verilmektedir (D’Souza 2001):

Şekil 2.3 Glutaraldehitin kimyasal formülü

bir matrikse ya da doğrudan elektrot


reaktif gruplar arasındaki


elektrot üzerine kaplanmış


ç duyulmaz. Yöntem basit ve ucuz olması gibi avantajlarının yanı sıra, ölçümler


siyonel ajanlar sayesinde enzimlerin kovalent şekilde matrikslere



ekil 2.3’de verilmektedir (D’Souza 2001):

Glutaraldehitin kimyasal formülü

34

2.2.5 Glukoz oksidaz enziminin özellikleri

IUPAC kodu EC 1.1.3.4 olan glukoz oksidaz enzimi, oksijen varlığında glukozun

hidrojen peroksit ve glukonik asite dönüşümünü katalizleyen oksidoredüktaz sınıfı bir

enzimdir. Glukoz oksidazın bir katalizör olarak işlev görebilmesi için flavin adenin

dinükleotit (FAD) koenzimine ihtiyacı vardır. Glukoz oksidaz tarafından katalizlenen

indirgeme reaksiyonlarında FAD elektron alıcısı olarak görev alır ve FADH2’ ye

indirgenir. Daha sonra FADH2 moleküler oksijen tarafından tekrar FAD’a yükseltgenir

ve oksijen de hidrojen peroksite indirgenir:

2Glukoz +GOx(FAD) Glukonolakton +GOx(FADH )→

2 2 2 2GOx(FADH ) +O GOx(FAD) +H O→

Glukoz oksidaz, 6 karbonlu bir şeker olan glukozun hemiasetal formu olan β-D-

glukopiranoza bağlanırken α-D-glukopiranoz ile etkileşmez. Bu yüzden D-glukoz

çözeltisi bir süre dinlendirilerek β-D-glukopiranoz ve α-D-glukopiranoz formlarının

dengeye gelmesi sağlanır. Bu olaya mutarotasyon adı verilir (Şekil 2.4). Glukoz oksidaz

dengedeki glukoz çözeltisinde bulunan β-D glukopiranoz ile etkileşir (Vastarella 2001,

http://www.wikipedia.com, 2011).

Şekil 2.4 Glukozun mutarotasyonu

35

Glukoz oksidaz vücut sıvılarında, gıdalarda ve bitkisel ham maddelerde bulunan serbest

glukozun tayini için biyolojik tanı materyali olarak sıklıkla kullanılmaktadır. Özellikle

son yıllarda oldukça artış gösteren diyabet hastalığının en önemli tanı materyalidir

(Wang vd. 2010).

2.3 Glukoz Tayinin Önemi

Halk arasında şeker hastalığı olarak bilinen diyabet, karbohidrat metabolizmasının en

önemli hastalıklarından biridir. Vücudun yeteri kadar insülin üretememesi ya da üretilen

insülinin işlevinde bir bozukluk olması durumunda Tip I diyabet, insülinin etkisine karşı

direnç gelişmesiyle de Tip II diyabet gözlenir (Wang vd. 2007). İnsülin eksikliğinden

dolayı kandaki şeker seviyesi olması gereken değerin üstüne çıkar. Yüksek kan şekeri

(hiperglisemi); görme bozukluklarına, sinir hasarlarına, dolaşım sistemi hastalıklarına

ve kalp yetmezliğine sebep olabilir. Hipoglisemi ise kan şekerinin olması gerekenden

daha düşük olmasıdır. Özellikle Tip I diyabetli hastalar insulin tedavisinden ötürü

haftada bir veya iki kez hipoglisemi atağı geçirirler. Hipoglisemik ataklar, beyindeki

sinir hücrelerinin (nöronların) hasarına ve ölümüne neden olabilir. Bu yüzden gerekli

durumlarda tanı ve tedavi için diyabet hastalarında sık sık ve hızlı bir şekilde serumdaki

şeker miktarının ölçülmesi gerekir (Comba vd. 2010a).

Glukoz, diyabet gibi bazı hastalıkların tanısının yanı sıra gıda endüstrisinde de tayini

yapılan analitlerden biridir. Glukoz tayini, HPLC ve gaz-sıvı kromotografisi gibi

cihazlarla yapılmasına rağmen glukoz biyosensörleri daha ucuz, hızlı ve kolay tayin

imkanı sunar. Özellikle diyabetli hastaların kan şekeri seviyesinin hızlı ve güvenilir bir

şekilde ölçülmesi için glukoz biyosensörlerinden faydalanılır (Cash ve Clark 2010).

36

3. MATERYAL ve YÖNTEM

3.1 Kullanılan Cihazlar

Amperometrik çalışmalarda, bir bilgisayara bağlı şekil 3.1’de gösterilen IVIUMSTAT

elektrokimyasal analiz cihazı ve BAS marka 5 girişli elektrokimyasal hücre standı

kullanıldı.

Şekil 3.1 IVIUMSTAT elektrokimyasal analiz cihazı ve BAS marka 5 girişli elektrokimyasal hücre standı

Deneylerde kullanılan çözeltileri hazırlamak için ELGA Purelab Classic cihazı ile iki

kere damıtılmış ultra saf su kullanıldı.

Deney çözeltilerinin pH’ları ORION marka 912600 numaralı kombine cam pH

elektrodu kullanılarak ORION 720A cihazı ile ayarlandı. Cihazı kalibre etmek için

pH’sı 4,13 olan potasyum hidrojenftalat ve pH’sı 8,20 olan sodyum bikarbonat

çözeltileri kullanıldı.

Çözeltilerin hazırlanmasında ve hücre içine çözelti ilavelerinde Biohit Proline-Pipette

marka mikro pipetler kullanıldı.

Sıcaklık çalışmalarında sabit sıcaklık elde etmek için Grant LTD GG marka

sirkülasyonlu ve termostatlı su banyosu kullanıldı.

37

Deney çözeltilerindeki katıların çözünmesi için Elma LC 30 H marka ultrasonikasyon

cihazından yararlanıldı.

Çözeltilerin karıştırılmasında Chiltern marka MS21S model manyetik karıştırıcı

kullanıldı.

Kan serum numunelerindeki proteinleri ayırmak için Nahita marka 2650 model santrifüj

cihazı kullanıldı.

3.2 Elektrokimyasal Hücre ve Kullanılan Elektrotlar

Amperometrik çalışmalar, çalışma elektrodu, referans elektrot ve karşıt elektrodu içeren

elektrokimyasal hücre sistemi kullanılarak yapıldı. Çalışma elektrodu olarak 3 mm

çapında karbon pasta elektrot gövdeleri; referans elektrot olarak BAS firmasından

alınan Ag/AgCl elektrodu (MF 2052) ve karşıt elektrot olarak da yine BAS firmasından

alınan platin tel elektrot (MW 1034) kullanıldı.

Sıcaklığın amperometrik cevap üzerine etkisinin incelendiği çalışmalarda hücre

çözeltisinin sıcaklığını istenilen sıcaklıkta sabit tutabilmek için su sirkülasyonu sağlayan

çift cidarlı ve termostatlı hücre kullanıldı.

3.3 Kullanılan Kimyasallar

3.3.1 Oksijen gazı

Glukozun, glukoz oksidaz enzimi ile etkileşerek glukonik asite yükseltgenebilmesi

oksijenli ortam gerektirdiğinden, enzim elektrotların kullanıldığı amperometrik

tayinlerde ortamdan % 99,95 saflıkta oksijen gazı geçirildi.

38

3.3.2 Argon gazı

Hazırlanan karbon pasta elektrotların hidrojen perokside duyarlığını belirlemek için

yapılan deneylerde, ortamdaki oksijeni uzaklaştırmak amacıyla sistemden inert %99,999

saflıkta argon gazı geçirildi.

3.3.3 Kullanılan enzim

Çalışmada kullanılan glukoz oksidazın, IUPAC kodu, elde edildiği kaynak ve temin

edildiği firma çizelge 3.1’de verilmiştir.

Çizelge 3.1 Glukoz oksidazın, IUPAC kodu, elde edildiği kaynak ve temin edildiği firma

Enzimin Adı Kodu Kaynağı Firma

Glukoz oksidaz EC 1.1.3.4 Aspergillus niger Sigma

3.3.4 Diğer kimyasallar

Çalışmada kullanılan diğer kimyasalların isimleri, temin edildikleri firmalar, saflık

dereceleri ve katalog numaraları çizelge 3.2’de verilmiştir.

39

Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan diğer kimyasalların isimleri, temin edildikleri firmalar, saflık dereceleri ve katalog numaraları

Kimyasal Madde Firma Adı Saflık Derecesi

β-D-(+)-Glukoz Fluka

≥% 99,5

di-Sodyum monohidrojenfosfat heptahidrat (Na2HPO4.7H2O)

Riedel de Haën >% 99

Etanol

Riedel de Haën % 99,8

Fosforik asit

Pandeac % 85

Glutaraldehit

Sigma, Grade II % 25

Grafit tozu Fluka Yüksek saflıkta

Hidrojen peroksit

Riedel de Haën

% 35

Hidroklorik asit Pandeac % 37,5

Kreatinin

Fluka

≥% 99

L-Askorbik asit

Sigma Ultra saf

L-Aspartik asit

Aldrich

>% 98

Lityum karbonat

Riedel de Haën ≥% 99

NiO nanopartikülleri < 50 nm

Aldrich % 99,8

Parafin yağı Fluka IR spektr. için

Parasetamol Fluka

≥% 98

Sığır serum albümin (BSA) Fluka % 97

Sodyum dihidrojenfosfat dihidrat (NaH2PO4.2H2O)

Riedel de Haën

>% 99

Sodyum hidroksit

Merck

Saf

Trikloroasetik asit

Fluka

≥% 98

40

Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan diğer kimyasalların isimleri, temin edildikleri firmalar, saflık dereceleri ve katalog numaraları (devam)

Kimyasal Madde

Firma Adı Saflık Derecesi

Tris(hidroksimetil)aminometan (TRIS)

Fluka

>% 99,5

Üre

Sigma

≥% 99,5

Ürik asit

Sigma >% 99

3.4 Serum Numunesi

Çalışmalarda kullanılan serum örnekleri Gazi Üniversitesi Biyokimya

Laboratuvarı’ndan temin edilmiştir.

3.5 Kullanılan Çözeltiler

3.5.1 Fosfat tamponu

0,10 M fosfat tamponu hazırlamak için hesaplanan miktarlarda sodyum dihidrojenfosfat

dihidrat ve disodyum monohidrojenfosfat heptahitrat tartılarak saf suda çözüldü.

Hazırlanan fosfat çözeltilerini istenilen pH’lara ayarlarken 0,10 M NaOH ve 0,10 M

H3PO4 çözeltileri kullanıldı. pH çalışmalarında kullanılmak üzere sırasıyla 0,10 M

derişimde 5,0; 6,0; 7,0; 7,5; 8,0; 9,0 pH’ larda fosfat tamponları ve tampon derişimi

çalışmalarında kullanılmak üzere pH 7,0‘de sırasıyla 0,05 M; 0,10 M; 0,15 M; 0,20 M

fosfat tampon çözeltileri hazırlandı. Hazırlanan çözeltiler kullanılmadıkları zaman

buzdolabında +4oC’de muhafaza edildi.

41

3.5.2 TRIS tamponu

0,10 M TRIS tamponu hazırlamak için hesaplanan miktarlarda

tris(hidroksimetil)aminometan tartıldı ve 0,10 M HCl çözeltisi kullanılarak istenilen pH

değerine ayarlandı. Hazırlanan çözelti buzdolabında +4oC’de saklandı.

3.5.3 Enzim çözeltileri

Glukoz oksidaz enzimi (GOx) 5,04 mg tartılıp 0,5 mL fosfat tamponunda çözülerek 100

µL‘lik porsiyonlara ayrıldı ve buzdolabında -20oC’de muhafaza edildi. Kullanılacağı

zaman istenilen miktarda enzim çözeltisi alınarak karbon pasta enzim elektrot

karışımına ilave edildi.

3.5.4 Glukoz çözeltisi

Çalışmalarda kullanılan 1,0×10-3 M glukoz çözeltisi, ilgili katının gerekli miktarlarda

tartılıp saf suda çözülmesiyle hazırlandı. Glukoz çözeltisi, kullanılmadan önce, 24 saat

glukozun mutorotasyonu için buzdolabında +4oC’de bekletildi. Farklı derişimlerdeki

glukoz çözeltileri de benzer şekilde hazırlandı.

3.5.5 Hidrojen peroksit çözeltisi

1,0×10-3 M hidrojen peroksit çözeltisini hazırlamak için % 35’lik hidrojen peroksit

çözeltisinden hesaplanan miktarda alındı ve saf su ile seyreltildi. H2O2, kolay

bozunduğu için çalışmalardan hemen önce taze olarak hazırlandı. Bozunmasını

geciktirmek için ısı ve ışıktan korundu.

3.5.6 Glutaraldehit çözeltisi

% 1,25’lik glutaraldehit çözeltisi hazırlamak için % 25’lik glutaraldehit çözeltisinden

hesaplanan miktarda alındı ve saf su ile seyreltildi.

42

3.5.7 Girişim çalışmalarında kullanılan çözeltiler

Serumda bulunan bazı türlerin enzim elektrotların cevabına etkisinin araştırılması için

bu türlerin stok çözeltileri hazırlanıp hücreye eklendi. Bu çözeltiler aşağıda verildiği

şekilde hazırlandı:

Kreatinin, L- askorbik asit, parasetamol, üre ve L-aspartik asit stok çözeltileri her

birinin derişimleri 1,0×10–2 M olacak şekilde ilgili katılarının tartılıp saf suda çözülmesi

ile hazırlandı.

Ürik asit stok çözeltisi ise derişimi 1,0x10-2 M olacak şekilde uygun miktarda tartılıp

% 0,45 (k/h)’lik Li2CO3 çözeltisinde çözülerek hazırlandı.

Girişim çalışmalarında verilen maddelerin fizyolojik derişimleri, stok çözeltilerinin

belirli miktarlarının elektrokimyasal hücreye katılmasıyla elde edildi.

3.6 NiO Nanopartikül ile Modifiye Edilmiş ve Modifiye Edilmemiş Karbon Pasta Elektrotların Hazırlanması

NiO nanopartikül ile modifiye edilmiş ve edilmemiş karbon pasta elektrotların

karşılaştırılması için iki farklı elektrot aşağıdaki gibi hazırlandı:

Modifiye edilmemiş karbon pasta elektrotların (CPE) hazırlanması için 40 mg grafit

tozu tartıldı ve üzerine 15 µL parafin yağı konularak cam bir petri kabında yaklaşık 10

dakika karıştırıldı. Hazırlanan karışım karbon pasta elektrot gövdesi içine yerleştirildi

ve yüzeyi pürüzsüzleştirildi.

NiO nanopartikül ile modifiye karbon pasta elektrotların hazırlanması için grafit tozu ve

ticari NiO nanopartikülleri karışımdaki miktarları 3:1 oranında olacak şekilde tartıldı.

30 mg grafit tozu ve 10 mg NiO nanopartikülü cam bir petri kabında homojen bir

dağılım elde edilene kadar karıştırıldı. Buna 15 µL parafin yağı eklendi ve yaklaşık 20

43

dakika spatül yardımıyla karıştırılmaya devam edildi. Hazırlanan pasta karbon pasta

elektrot gövdesi içine yerleştirildi ve elektrot yüzeyi pürüzsüz bir yüzeyde düzleştirildi.

3.6.1 NiO Nanopartikül ile modifiye edilmiş ve modifiye edilmemiş karbon pasta elektrotların H2O2’ ye duyarlığı

Bölüm 3.6’da anlatıldığı şekilde hazırlanan NiO içeren elektrot 0,10 M pH 7,0 fosfat

tamponu içerisine daldırılarak Ag/AgCl’e karşı +0,4 V potansiyelde kararlı hal akımları

elde edilene kadar bekletildi. Taze hazırlanan stok hidrojen peroksit çözeltisinden

hesaplanan miktarlarda hücreye eklendi. Hücreden argon gazı geçirildikten sonra

çözeltinin karışması sağlandı ve +0,4 V’da amperometrik ölçümler alındı. Hidrojen

peroksit derişimine karşı akım farkları grafiğe geçirildi. Elde edilen kalibrasyon

grafiğinin eğiminden yararlanarak hazırlanan elektrodun bu potansiyelde hidrojen

peroksite karşı duyarlığı belirlendi. Aynı işlemler Ag/AgCl’e karşı +0,7 V’da da

tekrarlandı.

NiO nanopartikül içermeyen karbon pasta elektrotların hidrojen perokside cevabı da

yukarıda anlatıldığı şekilde yapıldı. İki farklı elektrot için çalışılan potansiyellerde elde

edilen duyarlıklar karşılaştırıldı.

3.7 NiO ile Modifiye Edilmiş Enzimsiz Karbon Pasta Elektrodun Çalışma Potansiyelinin Belirlenmesi

NiO/CPE’nin optimum çalışma potansiyelinin belirlenmesi için hazırlanan elektrot

0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu içine daldırıldı ve Ag/AgCl’a karşı +0,4 V potansiyelde

kararlı hal akımları elde edilene kadar bekletildi. 1,0×10-3 M hidrojen peroksit

çözeltisinden hesaplanan miktarlarda hücreye eklendi, argon gazı geçirildi ve

+0,4 V’da amperometrik ölçümler alındı. Elde edilen akım farkları hidrojen peroksit

derişimine karşı grafiğe geçirildi ve çizilen grafiğin eğiminden elektrodun hidrojen

peroksite karşı duyarlığı hesaplandı. Aynı işlemler +0,7 V potansiyelde de tekrarlandı.

Farklı çalışma potansiyellerinde bulunan duyarlıklar karşılaştırıldı ve en uygun çalışma

44

potansiyeli belirlendi. Enzimli ve enzimsiz elektrotlar ile yapılan tüm çalışmalar

belirlenen potansiyelde gerçekleştirildi.

3.8 Glukoz Tayini İçin Karbon Pasta Enzim Elektrotların Hazırlanması

Glukoz tayini için sırasıyla NiO nanopartikül içeren ve içermeyen karbon pasta enzim

elektrotlar aşağıdaki şekilde hazırlandı:

NiO nanopartikül içermeyen karbon pasta enzim elektrotların (GOx/CPE) hazırlanması

için 40 mg grafit tozu tartıldı. Enzimlerin çapraz bağlanmasını sağlamak için 10 µL

glutaraldehit ve 1,5 mg sığır serum albümin (BSA) tartılarak bir ependorf tübü içerisine

konuldu ve üzerine Bölüm 3.5.3’de anlatıldığı gibi hazırlanan glukoz oksidaz enzim

çözeltisinden uygun miktarda eklendi. Enzimlerin çapraz bağlanabilmesi için birkaç

dakika beklendikten sonra enzim çözeltisi karışımı grafit tozu üzerine eklendi ve

yaklaşık 15 dakika karıştırıldı. Hazırlanan karışıma 15 µL parafin yağı ilave edildi ve

homojen bir pasta elde edilene kadar karıştırılmaya devam edildi. Hazırlanan pasta

karbon pasta elektrot gövdesine yerleştirildi ve elektrot yüzeyi pürüzsüzleştirildi.

NiO nanopartikül içeren karbon pasta enzim elektrotların (NiO/GOx/CPE) hazırlanması

için belli oranlarda grafit tozu ve NiO nanopartikülü cam bir petri kabında homojen hale

gelene kadar karıştırıldı. Yukarıdaki gibi hazırlanan glutaraldehit-glukoz oksidaz-BSA

karışımı petri kabına eklendi ve yaklaşık 15 dakika karıştırıldı. Karışım üzerine 15 µL

parafin yağı ilave edilerek karıştırılmaya devam edildi. Hazırlanan pasta karbon pasta

elektrot gövdesine yerleştirildi ve yüzeyi pürüzsüz bir yüzeyde düzleştirildi.

3.8.1 Glukoz tayini için hazırlanan enzim elektrotların glukoza duyarlığı

Bölüm 3.8’deki gibi hazırlanan NiO nanopartikül içeren karbon pasta enzim elektrot

0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu içine daldırılarak Ag/AgCl’e karşı +0,4 V potansiyelde

kararlı hal akımları elde edilene kadar bekletildi. 1,0×10-3 M stok glukoz çözeltisinden

uygun miktarlarda hücreye eklendi, ortamdan oksijen gazı geçirildi ve bu potansiyelde

45

amperometrik ölçümler alındı. Elde edilen akım farkları glukoz derişimine karşı grafiğe

geçirildi ve grafiğin eğiminden yararlanılarak glukoza karşı duyarlık hesaplandı.

NiO içermeyen enzim elektrodun da glukoza duyarlığı, yukarıda anlatıldığı şekilde,

belirlendi ve iki farklı elektrot için bulunan duyarlıklar karşılaştırıldı.

3.9 NiO Nanopartikül Modifiye Karbon Pasta Enzim Elektrotların Optimum Çalışma Koşullarının ve Performans Faktörlerinin Belirlenmesi

3.9.1 Tampon cinsinin etkisi

Hazırlanan NiO/GOx/CPE’nin glukoza karşı cevabına tampon cinsinin etkisini

belirlemek amacı ile Bölüm 3.5.1’de ve Bölüm 3.5.2’de anlatıldığı gibi hazırlanan

0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu ve 0,10 M pH 7,0 TRIS tamponu içinde ayrı ayrı

daldırılan enzim elektrot Ag/AgCl’e karşı +0,4 V potansiyelde kararlı hal akımı elde

edilene kadar bekletildi. Stok glukoz çözeltisinden ilaveler yapılarak amperometrik

ölçümler alındı. Elde edilen akım farkları glukoz derişimine karşı grafiğe geçirildi ve

belirlenen duyarlıklar her iki tampon cinsi için karşılaştırıldı.

3.9.2 Tampon derişiminin etkisi

Tampon derişiminin enzim elektrodun duyarlığına etkisini incelemek için Bölüm 3.5.1’

de açıklandığı şekilde pH’sı 7,0 olan 0,05; 0,10; 0,15 ve 0,20 M’lık fosfat tamponları

hazırlandı. NiO/GOx/CPE sırası ile bu tamponlara daldırıldı ve Ag/AgCl’a karşı +0,4 V

potansiyelde kararlı hal akımları elde edilene kadar beklendi. Stok glukoz çözeltisinden

ilaveler yapıldı ve amperometrik cevaplar kaydedildi. Glukoz derişimlerine karşı akım

farkları grafiğe geçirildi ve yukarıda verilen farklı derişimlerdeki fosfat tamponları için

bulunan duyarlıklar karşılaştırıldı.

46

3.9.3 pH’nın etkisi

pH’nın amperometrik cevap üzerine etkisini belirlemek amacıyla NiO/GOx/CPE,

Bölüm 3.5.1’de anlatıldığı gibi hazırlanan 0,10 M derişimde farklı pH’lardaki fosfat

tamponları içinde Ag/AgCl’e karşı +0,4 V potansiyelde kararlı hal akımları elde edilene

kadar bekletildi. Glukoz çözeltisinden eklemeler yapılarak çalışılan tamponda

duyarlıklar belirlendi. Elde edilen duyarlık değerleri pH’ya karşı grafiğe geçirildi ve en

yüksek duyarlığın elde edildiği tampon pH’sı optimum pH olarak seçildi.

3.9.4 NiO nanopartikül miktarının belirlenmesi

NiO nanopartikül miktarının enzim elektrodunun duyarlığına etkisini incelemek için

grafit ve nanopartikül miktarları arasındaki oranlar 3:0,5; 3:1; 3:1,5 ve 3:2 olacak

şekilde grafit tozu ve nanopartikül tartıldı. Bölüm 3.8’de anlatıldığı gibi enzim

elektrotlar hazırlandı ve 0,10 M pH 7,0 fosfat tampon içerisinde daldırıldı, Ag/AgCl’e

karşı + 0,4 V’da dengeye gelene kadar bekletildi. 1,0×10-3 M stok glukoz çözeltisinden

hücreye ilaveler yapıldı ve amperometrik cevaplar alındı. Elde edilen akım farkları

glukoz derişimine karşı grafiğe geçirilerek duyarlıklar hesaplandı. Bulunan duyarlıklar

karşılaştırıldı ve en uygun NiO nanopartikül miktarı belirlendi.

3.9.5 Enzim miktarının belirlenmesi

Enzim miktarının etkisini incelemek amacı ile 5; 8; 10; 12; 15 U GOx içeren enzim

elektrotlar Bölüm 3.8’de anlatıldığı gibi hazırlandı. Her bir elektrot 0,10 M pH 7,0

fosfat tamponu içerisinde +0,4 V potansiyelde kararlı hal akımları elde edilene kadar

bekletildi. Glukoz çözeltisinden hesaplanan miktarlarda hücreye eklendi, oksijen gazı

geçirildikten sonra amperometrik ölçümler alındı. Akım farkları glukoz derişimlerine

karşı grafiğe geçirildi ve farklı miktarda enzim içeren elektrotlar için duyarlıklar

karşılaştırılarak en uygun enzim miktarı belirlendi.

47

3.9.6 Sıcaklığın etkisi

NiO/GOx/CPE için optimum sıcaklığının belirlenmesi amacı ile çift cidarlı

elektrokimyasal hücreye sahip termostatlı su banyosu kullanıldı. Su banyosunun

sıcaklığı sırası ile 15, 20, 25, 30, 35 ve 40oC‘ye ayarlandı. Enzim elektrot 0,10 M pH

7,0 fosfat tamponu içerisine daldırıldı ve +0,4 V potansiyelde kararlı hal akımları elde

edilene kadar bekletildi. Glukoz çözeltisinden hesaplanan miktarlarda hücreye eklendi,

oksijen gazı geçirildi ve karıştırma sonrası amperometrik ölçümler alındı. Akım

farklarına karşı glukoz derişimleri grafiğe geçirildi ve çizilen kalibrasyon grafiğinin

eğiminden enzim elektrodun glukoza karşı duyarlığı hesaplandı. Farklı sıcaklıklarda

elde edilen duyarlıklar sıcaklığa karşı grafiğe geçirildi ve en uygun çalışma sıcaklığı

belirlendi.

3.9.7 Cevap süresinin belirlenmesi

NiO/GOx/CPE’nin cevap süresini belirlemek için enzim elektrot 0,10 M pH 7,0 fosfat

tamponuna daldırıldı ve +0,4 V potansiyelde kararlı hal akımları elde edene kadar

bekletildi. Glukoz derişimi 1,0×10-5 M olacak şekilde elektrokimyasal hücreye stok

glukoz çözeltisinden eklendi ve oksijen gazı geçirildikten sonra belli süre boyunca

amperometrik cevaplar kaydedildi. Akım farkları zamana karşı grafiğe geçirildi ve akım

farkının hemen hemen sabit kaldığı süre elektrodun cevap süresi olarak belirlendi. Aynı

işlemler hücreye 1,0×10-6 M glukoz eklenerek de tekrarlandı.

3.9.8 Glukoz derişiminin etkisi

Glukoz derişiminin enzim elektrodun cevabına etkisini incelemek için farklı

derişimlerde glukoz çözeltileri hazırlandı. Enzim elektrot çalışma tamponu içinde +0,4

V’da dengeye getirildikten sonra farklı derişimlerdeki glukoz çözeltilerinin uygun

miktarları hücreye ilave edildi ve amperometrik ölçümler alındı. Akım farkları glukoz

derişimlerine karşı grafiğe geçirildi. Çizilen grafikten yararlanılarak gözlenebilme sınırı

ve doğrusal çalışma aralığı belirlendi.

48

3.9.9 Girişim yapan türlerin NiO/GOx/CPE’nin cevabı üzerine etkisi

NiO/GOx/CPE’un cevabına serumda bulunabilecek ve cevap üzerine bozucu etki

yapabilecek bazı türlerin etkisini incelemek için L-aspartik asit, L-askorbik asit,

kreatinin, parasetamol, üre ve ürik asit çözeltileri Bölüm 3.5.7’de anlatıldığı şekilde

hazırlandı. Bunun için, ilk olarak enzim elektrot 0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu içine

daldırıldı ve +0,4 V potansiyelde kararlı hal akımları elde edilene kadar bekletildi.

Hücredeki derişimi 1,0×10-4 M olacak şekilde stok glukoz çözeltisinden uygun miktarda

eklendi ve akım farkı belirlendi. Elde edilen akım farkı I0 olarak adlandırıldı. Daha

sonra, 1,0×10-4 M glukoz içeren hücreye, çizelge 3.3’de verilen derişimlerde ilgili

bozucu türün ilave edilmesiyle Ix olarak adlandırılan akım farkı belirlendi. Her bir tür

için girişim yüzdeleri ayrı ayrı aşağıdaki eşitliğe göre hesaplandı:

% ��ş��

� %100

Çizelge 3.3 Girişim yapan türlerin hücre içindeki toplam derişimleri

Girişim Yapan Tür Hücredeki Derişimi (M)

L- Aspartik asit 1,0×10-4

L- Askorbik asit 1,0×10-4

Kreatinin 1,0×10-4

Parasetamol 1,0×10-4

Üre 8,0×10-4

Ürik asit 5,0×10-4

49

3.9.10 Tekrar kullanılabilirlik ve tekrar üretilebilirlik

NiO/GOx/CPE’nin tekrar kullanılabilirliğini incelemek için, hazırlanan enzim

elektrodun ard arda 3 kez glukoz derişimine karşı kalibrasyon grafiği çizildi ve elde

edilen duyarlıkların bağıl standart sapması hesaplandı.

Enzim elektrodun tekrar üretilebilirliği de 5 ayrı enzim elektrodun glukoza karşı

duyarlıklarının belirlenmesi ile çalışıldı. Bu amaçla her bir elektrot için elde edilen

duyarlıkların bağıl standart sapma değeri hesaplandı.

3.9.11 NiO/GOx/CPE’nin raf ömrü

NiO/GOx/CPE’ nin ömrünü belirlemek amacı ile hazırlanan enzim elektrot 0,10 M pH

7,0 fosfat tamponu içinde +0,4 V potansiyelde bekletildi. 1,0×10-3 M stok glukoz

çözeltisinden hesaplanan miktarlarda ortama ilaveler yapıldı ve amperometrik cevaplar

kaydedildi. Akım farkları glukoz derişimine karşı grafiğe geçirilerek duyarlık belirlendi

Aynı enzim elektrot ile belli periyotlarla farklı günlerde yukarıda anlatıldığı gibi

amperometrik ölçümler alındı. Bulunan duyarlıklar güne karşı grafiğe geçirildi ve

elektrodun duyarlığının zamanla nasıl değiştiği incelenerek elektrot ömrü belirlendi.

3.9.12 NiO/GOx/CPE ile serumda glukoz tayini

NiO/GOx/CPE ile serumda glukoz tayini yapmak için Gazi Üniversitesi Biyokimya

Laboratuvarı’ndan farklı derişimlerde glukoz içeren 4 adet serum örneği temin edildi.

Serum örnekleri iki şekilde kullanıldı: İlkinde %10’luk trikloroasetik asit çözeltisi

serum örneğine ilave edilerek serumda bulunan proteinler çöktürüldü. İkinci olarak ise

serum örnekleri herhangi bir ön işlemden geçirilmeden doğrudan analiz için kullanıldı.

NiO/GOx/CPE ile proteinli ve proteinsiz serum örneklerinde glukoz tayini standart

katma yöntemi kullanılarak yapıldı. Bunun için, hazırlanan enzim elektrot, 5,0 mL 0,10

M pH 7,0 fosfat tamponu içerisine daldırıldı ve Ag/AgCl’e karşı +0,4 V’da kararlı hal

akımları elde edilene kadar bekletildi. Serum örneğinden 25 µL hücreye eklendi,

50

ortamdan oksijen gazı geçirildikten sonra +0,4 V’da amperometrik ölçüm alındı.

Ardından aynı hücreye belli derişimde glukoz çözeltisinden ilaveler yapıldı ve her bir

ekleme sonrası oksijen gazı geçirildi. Hesaplanan akım farkları glukoz derişimine karşı

grafiğe geçirildi. Çizilen standart katma eğrisinden yararlanılarak serumdaki glukoz

derişimi hesaplandı. Hazırlanan enzim elektrot kullanılarak elde edilen sonuçlar hastane

sonuçları ile “veri çifti t testi” analizi yapılarak karşılaştırıldı. Her bir serum örneği için

en az 3 tane ölçüm alındı ve bu ölçümlerin standart sapma değerleri hesaplandı.

51

4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA

Bu tez çalışmasında, glukozun amperometrik tayini için NiO nanopartikülü içeren

karbon pasta enzim elektrotların geliştirilmesi amaçlandı. Bunun için NiO

nanopartikülleri grafit tozu ile karıştırıldı ve bu karışıma glukoz oksidaz enzimi ilave

edildi. Hazırlanan enzim elektrodun optimum çalışma koşulları ve performans faktörleri

belirlendi. Elde edilen sonuçlar ve yorumlar aşağıda sunuldu.

4.1 Glukoz Tayini için Karbon Pasta Elektrot

Bu çalışmada glukozun amperometrik tayini için karbon pasta enzim elektrotlar

hazırlandı. Bu amaçla NiO nanopartikülleri, grafit tozu, parafin yağı ve enzim

çözeltisinin belirli miktarları karıştırılarak NiO ile modifiye edilmiş karbon pasta enzim

elektrotlar elde edildi.

Biyosensörlerde electron transferinin ve duyarlığın artırılması için genellikle iletken

veya yarı iletken metal nanopartiküllerden yararlanılmaktadır (Jianrong vd. 2004).

Nanopartiküller sahip oldukları nano boyutlar sayesinde enzimin aktif bölgesi ile

elektrot arasındaki mesafeyi azaltarak e- aktarımını kolaylaştırır ve daha düşük

potansiyellerde çalışma olanağı sunarak girişim yapan elektroaktif türlerin bozucu

etkisini önler (Murphy 2006). Literatür araştırması sonucunda NiO nanopartikülü içeren

enzim elektrotlarla ilgili çok fazla çalışma bulunmadığı belirlenmiştir. Yapılan bazı

çalışmalarda ise seçilen yöntemin, kullanılan elektrotların ve tayin edilen türün farklı

olduğu görülmüştür. Şimdiye kadar yapılan çalışmalarda çalışma elektrodu olarak

genellikle GCE ve ITO cam elektrotlar tercih edilmiştir (Salimi vd. 2007, Li vd. 2008,

Luo vd. 2009). Bu çalışmada ise maliyeti düşük ve hazırlanması kolay olduğu için

karbon pasta elektrot kullanılmıştır. Ayrıca NiO nanopartikülleri ile geliştirilen

biyosensörlerin bir kısmı enzimatik olmayan reaksiyonlara dayanmaktadır (Watanabe

ve Einaga 2009, Mu vd. 2010, Wang vd. 2010). Bu çalışmada ise GOx enziminin, O2

varlığında, glukozu glukonikasite katalizleme reaksiyonu esas alınmıştır:

52

GOx2 2 2Glukoz +O Glukonolakton +H O→

Bu reaksiyonda harcanan O2 ve oluşan H2O2 derişimi glukoz derişimi ile orantılıdır.

Bundan yararlanarak O2 derişimindeki azalma veya H2O2 derişimindeki artmanın

incelenmesi ile glukoz tayin edilebilir (Fang vd. 2003).

Amperometrik tayin, yukarıdaki reaksiyon sonucu oluşan H2O2’nin elektrot yüzeyinde

belli bir potansiyelde moleküler O2’ye yükseltgenmesine dayanmaktadır (Heller 1996):

+ -2 2 2H O O + 2H + 2e→

Glukoz tayini için hazırlanan karbon pasta enzim elektrodun çalışma prensibi şekil

4.1’de verilmektedir:

Şekil 4.1 Glukoz tayini için hazırlanan enzim elektrodun çalışma prensibi (GOx(yük) ve GOx(ind) enzimin yükseltgenmiş ve indirgenmiş hallerini göstermektedir)

Hazırlanan enzim elektrodun glukoza olan duyarlığını birçok parametre etkileyebilir. Bu

amaçla cevap üzerine pH’nın, sıcaklığın, tampon cinsi ve derişiminin, nanopartikül

miktarının, enzim miktarının, glukozderişiminin etkisi çalışıldı. Ayrıca enzim

elektrodun ömrü, tekrar kullanılabilirliği ve üretilebilirliği, cevap süresi gibi performans

faktörleri belirlendi. Optimum çalışma koşulları belirlendikten sonra, serumda

bulunabilecek ve cevap üzerine bozucu etki yapabilecek bazı türlerin etkisi incelendi.

Son olarak hazırlanan enzim elektrodun serum numunelerinde glukoz tayini için

kullanılıp kullanılamayacağı araştırıldı. Elde edilen sonuçlar ve yorumlar aşağıda

verilmiştir.

53

4.2 Enzimsiz Karbon Pasta Elektrotlar

Modifiye edilmemiş enzimsiz karbon pasta elektrot (CPE) ve NiO ile modifiye edilmiş

enzimsiz karbon pasta elektrodun (NiO/CPE) hidrojen peroksite duyarlığı ve çalışma

potansiyelinin cevap üzerine etkisi belirlendi. Her iki elektrot için de elde edilen

sonuçlar aşağıda verilmiştir.

4.2.1 CPE ve NiO/CPE’nin hidrojen peroksite duyarlığı

NiO nanopartiküllerinin, karbon pasta elektrodunhidrojen peroksite duyarlığını

belirlemek için NiO içermeyen ve içeren karbon pasta elektrotlar Bölüm 3.6‘da

anlatıldığı şekilde hazırlandı. Her iki elektrot için de Ag/AgCl’e karşı +0,4 V’da

amperometrik ölçümler alındı ve elde edilen akım farkları hidrojen peroksit

derişimlerine karşı grafiğe geçirildi (Şekil 4.2). Şekiller incelendiğinde, CPE’nin

hidrojen peroksite olan duyarlığı 0,012 µA iken, NiO/CPE’nin hidrojen peroksite

duyarlığının 2,5 µA olduğu görüldü. Duyarlıklar karşılaştırıldığında NiO

nanopartiküllerinin CPE’nin hidrojen peroksite duyarlığını yaklaşık 208 kat arttırdığı

gözlendi. Bu da NiO nanopartiküllerinin sahip oldukları nano boyutlar sayesinde yüzey

alanını genişlettiği ve böylece elektroaktif tür ile elektrot arasındaki e- transferini

kolaylaştırdığı yani iletkenliği arttırdığı şeklinde yorumlanabilir (Li vd. 2008).

54

Şekil 4.2.a. NiO ile modifiye edilmiş karbon pasta elektrodun hidrojen peroksite cevabı, b. NiO ile modifiye edilmemiş karbon pasta elektrodun hidrojen peroksite cevabı (0,1 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,4 V, oda sıcaklığı)

4.2.2 Çalışma potansiyelinin etkisi

NiO modifiye karbon pasta elektrot için en uygun çalışma potansiyelinin belirlenmesi

amacıyla Bölüm 3.7’de belirtildiği gibi Ag/AgCl’e karşı +0,7 V ve +0,4 V olmak üzere

iki farklı çalışma potansiyelinde NiO/CPE’nin hidrojen peroksite cevabı incelendi. Her

bir çalışma potansiyelinde elde edilen akımlar H2O2 derişimlerine karşı grafiğe geçirildi

ve belirlenen duyarlıklar karşılaştırıldı (Şekil 4.3). NiO/CPE ile +0,7 V’da yapılan

çalışmada bulunan duyarlık, +0,4 V’da bulunan duyarlığın yaklaşık 2,5 katıdır ve her iki

potansiyelde de doğrusal aralık oldukça geniştir. Yapılan literatür araştırmaları

neticesinde düşük potansiyellerde çalışmanın, bazı elektroaktif türlerin girişim etkisini

azalttığı için daha uygun olacağı belirtilmiştir (Jia vd. 2008). Bu yüzden duyarlıklar

arasında çok büyük bir fark olmadığı için daha sonraki çalışmaların +0,4 V’da

yapılmasına karar verildi.

y(b)= 0,012x + 0,8101R² = 0,9846

y(a) = 2,5044x + 0,0443R² = 0,9953

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,00 0,05 0,10 0,15

Akım farkı, µA

(a)

(b)

Hidrojen peroksit derişimi, mM

55

Şekil 4.3.a. Enzimsiz NiO/CPE’nin Ag/AgCl’e karşı +0,70 V’da hidrojen peroksite cevabı, b. Enzimsiz NiO/CPE’nin Ag/AgCl’e karşı +0,40 V’da hidrojen peroksite cevabı (0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, oda sıcaklığı)

4.3 Karbon Pasta Enzim Elektrotlar

NiO ile modifiye edilmiş ve edilmemiş karbon pasta enzim elektrotların glukoza

duyarlıkları karşılaştırıldı ve NiO modifiye enzim elektrodun optimum çalışma koşulları

belirlendi. Ayrıca enzim elektrodun performans faktörleri incelendi ve sonuçlar aşağıda

sunuldu.

4.3.1 GOx/CPE ve NiO/GOx/CPE’nin glukoza duyarlığı

İmmobilizasyon yöntemlerinden en çok kullanılanları, enzimin kuru halde karbon

pastaya ilavesiyle ve glutaraldehit gibi çapraz bağlayıcı bir reaktifle

immobilizasyonudur. Bu çalışmada GOx enzimi once glutaraldehit ve BSA kullanarak

çapraz bağlandı daha sonra karbon pastayla karıştırılarak immobilize edildi. Burada

glutaraldehidin karbonil grupları BSA’nın amino gruplarına bağlanır, böylece enzimin

aktif merkezi bloke edilmemiş olur. Glutaraldehidin iki fonksiyonel grubu

bulunduğundan bir ucuna enzim, diğer ucuna albumin bağlanarak suda çözünmeyen bir

y(a) = 6,06x + 74,37R² = 0,9973

y(b)= 2,35x + 44,319R² = 0,9909

0

0,3

0,6

0,9

1,2

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20

(a)

(b)

Akım farkı, µA

Hidrojen peroksit derişimi, mM

56

jel oluşturur. Oluşan bu yapı enzimlerin matrikse tutunarak çözeltiye geçmesini

engeller. NiO ile modifiye edilmiş ve edilmemiş karbon pasta enzim elektrotların

glukoza olan duyarlıklarını karşılaştırmak için Bölüm 3.8’de anlatıldığı şekilde enzim

elektrotlar hazırlandı. Her iki enzim elektrot da 5 mL 0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu

içinde kararlı hal akımları elde edilene kadar bekletildi. Stok glukoz çözeltilerinin

hesaplanan miktarları hücrelere eklendi ve Ag/AgCl’e karşı +0,40 V’da ölçümler alındı.

Elde edilen akımlar glukoz derişimlerine karşı grafiğe geçirildi ve hesaplanan

duyarlıklar karşılaştırıldı (Şekil 4.4). NiO içermeyen karbon pasta enzim elektrodun

glukoza duyarlığı 0,08 µA, NiO içeren karbon pasta enzim elektrodunun duyarlığı ise

12,43 µA bulundu. NiO modifiye enzim elekrodun duyarlığının modifiye edilmemiş

enzim elektroda göre yaklaşık 153 kat daha yüksek olduğu ve NiO nanopartiküllerinin

enzimin aktif bölgesi ile elektrot yüzeyi arasındaki e- transferini kolaylaştırarak

duyarlığını arttırdığı söylenebilir (Li vd. 2008).

Şekil 4.4.a. GOx/CPE’nin glukoza cevabı, b. GOx/NiO/CPE’nin glukoza cevabı (0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı)

y(a) = 0,0812x + 0,0207R² = 0,9892

y(b)= 12,428x + 5,3559R² = 0,9939

0

2

4

6

8

10

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4

(b)

(a)

Akım farkı, µA

Glukoz derişimi, mM

57

4.4 NiO/GOx/CPE’nin Optimum Çalışma Koşulları ve Performans Faktörleri

4.4.1 Tampon cinsinin etkisi

NiO/GOx/CPE’nin glukoza cevabına tampon cinsinin etkisini incelemek amacıyla

Bölüm 3.5.1 ve Bölüm 3.5.2’de anlatıldığı şekilde 0,10 M pH 7,0 fosfat ve TRIS

tamponları hazırlandı. Enzim elektrot sırasıyla iki tamponda da +0,40 V’da kararlı hal

akımları elde edilene kadar bekletildi. Stok glukoz çözeltisinden eklendi ve her iki

tampon içinde de Ag/AgCl’e karşı +0,40 V potansiyelde amperometrik ölçümler alındı.

Elde edilen akım farkları grafiğe geçirildi (Şekil 4.5). Şekil incelendiğinde fosfat

tamponunda elde edilen duyarlığın TRIS tamponunda elde edilene göre nispeten daha

yüksek olduğu görüldü. Bununla beraber fosfat tamponunda daha geniş bir doğrusal

çalışma aralığı elde edildi. Bu sebepten daha sonraki çalışmalarda fosfat tamponu

kullanılmasının daha uygun olacağı düşünüldü.

TRIS tamponu fosfat tamponuna göre daha kararlı ve enzimatik reaksiyonlarda inert

olmasına rağmen bazı dezavantajlara da sahiptir. Örneğin TRIS’in tamponlama gücü

sıcaklığa oldukça duyarlıdır. Ayrıca yapısında primer amin grubu bulunduğundan

reaktif bir bileşiktir ve serumdaki bazı türlerle etkileşebilir. Fosfat tamponu ise sıcaklık

değişimlerinden kolay kolay etkilenmez ve reaktif gruplara sahip değildir. Yapılan

literatür çalışmalarında da glukoz tayini için geliştirilen enzim elektrotlarda çoğunlukla

fosfat tamponunun kullanıldığı gözlendi (Xu vd. 2005, Salimi vd. 2007, Li vd. 2008,

Luo vd. 2009).

58

Şekil 4.5 NiO/GOx/CPE’nin glukoza cevabına tampon cinsinin etkisi a. 0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu (+0,40 V, oda sıcaklığı) b. 0,10 M pH 7,0 TRIS tamponu (+0,40 V, oda sıcaklığı) 4.4.2 Tampon derişiminin etkisi

Tampon derişiminin NiO/GOx/CPE’nin glukoza cevabına etkisini incelemek için

Bölüm 3.5.1’de anlatıldığı gibi sırasıyla pH’sı 7,0 olan 0,05 M; 0,1 M; 0,15 M ve 0,2 M

derişimlerde fosfat tamponları hazırlandı. Farklı derişimlerde fosfat tamponu içeren

elektrokimyasal hücrelere stok glukoz çözeltisinden ilaveler yapıldı ve amperometrik

ölçümler alındı. Çizilen kalibrasyon grafiklerinin eğimlerinden, elektrodun glukoza

duyarlıkları belirlendi. Bulunan duyarlıklar tampon derişimlerine karşı grafiğe geçirildi

(Şekil 4.6). Grafikten de görüldüğü gibi en yüksek duyarlık 0,10 M fosfat tamponu

içinde elde edildi. Daha yüksek tampon derişimlerinde duyarlığın azaldığı görüldü. 0,20

M’dan yüksek derişimlerin karbon pastanın yapısını bozabileceği ve 0,05 M’dan düşük

tampon derişimlerinin ise az tamponlama kapasitesine sahip olacağı için çalışılmadı. Bu

yüzden çalışmaların 0,10 M derişimdeki fosfat tamponunda yapılmasına karar verildi.

Ayrıca literatürdeki pek çok çalışmanın da 0,10 M derişimdeki fosfat tamponunda

yapıldığı tespit edildi (Xu vd. 2005, Zhao vd. 2007, Luo vd. 2009).

y(a) = 12,43x + 5,35R² = 0,9939

y(b)= 8,28x + 6,7797R² = 0,9776

4

6

8

10

0 0,1 0,2 0,3


Akım farkı, µA

(a)

(b)

59

Şekil 4.6 NiO/GOx/CPE’nin glukoza cevabına tampon derişiminin etkisi (pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı)

4.4.3 pH’nın etkisi

pH enzimin aktivitesini etkileyen en önemli unsurlardan biri olduğu için enzim gibi

biyolojik materyal içeren elektrotlarda ortamın pH’sı oldukça önemlidir. Aynı canlı

organizma içinde farklı pH’larda faaliyet gösteren bir çok enzim vardır. Bu yüzden her

enzimin maksimum aktivite gösterdiği bir pH aralığı bulunur. Enzim elektrodun

cevabına pH’nın etkisini belirlemek amacıyla Bölüm 3.5.1’de anlatıldığı şekilde

hazırlanan 5,0; 6,0; 7,0; 7,5; 8,0; 9,0 pH değerlerine sahip 0,10 M fosfat tamponları

kullanıldı. NiO/GOx/CPE’nin her bir pH değerinde glukoza karşı amperometrik cevabı

belirlendi ve glukoz derişimlerine karşı grafiklere geçirildi. Grafiklerin eğiminden

bulunan duyarlıklar da pH değerlerine karşı grafiğe geçirilerek optimum pH değeri

belirlendi (Şekil 4.7). Şekil incelendiğinde pH artışı ile duyarlığın da arttığı, ancak pH

7,5’tan sonra duyarlık değerlerinin azaldığı görüldü. En yüksek duyarlık pH 7,5’ta elde

edilmesine rağmen pH 7,0’de elde edilen kalibrasyon grafiğinin çalışma aralığının daha

geniş olduğu belirlendi. Bu sebepten daha sonraki çalışmaların pH 7,0 fosfat

tamponunda yapılmasına karar verildi. Literatürde de glukoz tayini için geliştirilen pek

çok biyosensörde optimum pH değeri 7,0 olarak belirlenmiştir (Xu vd. 2005, Salimi vd.

10,4

10,9

11,4

11,9

12,4

12,9

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Duyarlık, µA/mM

Tampon derişimi, M

60

2007). Ayrıca 6,8 (Li vd. 2008, Ren vd. 2009) ve 7,4 (Comba vd. 2010) gibi farklı pH

değerlerinde de çalışmalar bulunmaktadır.

Şekil 4.7 NiO/GOx/CPE’nin glukoza cevabına pH’nın etkisi (0,10 M fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı)

4.4.4 NiO nanopartikül miktarının belirlenmesi

NiO nanopartikülü miktarının NiO/GOx/CPE’nin glukoza cevabına etkisini incelemek

için Bölüm 3.9.4’de anlatıldığı şekilde farklı oranlarda NiO ve grafit tozu içeren 4

enzim elektrot hazırlandı. Her bir elektrot için bulunan duyarlıklar karşılaştırıldı (Şekil

4.8). Grafikler incelendiğinde nanopartikül miktarının artışı ile duyarlıkların arttığı

görüldü. Bu durum, NiO miktarının artışı ile e- transferinin daha hızlı ve kolay bir

şekilde gerçekleştiği şeklinde yorumlanabilir. Ancak grafit tozu ve nanopartikül oranı

3:1,5 ve 3:2 olan elektrotlar ile elde edilen duyarlıklar, 3:1 oranında nanopartikül içeren

elektroda göre yüksek olmasına rağmen çalışma aralıklarının oldukça dar ve regresyon

katsayılarının düşük olduğu görüldü. 3:0,5 oranında grafit tozu ve NiO içeren

elektrodun ise hem duyarlığının oldukça düşük hem de çalışma aralığının dar olduğu

belirlendi. Bu yüzden daha geniş çalışma aralığının elde edildiği, 3:1 oranında grafit

tozu ve NiO içeren enzim elektrotların kullanılmasına karar verildi. Literatür araştırması

2

5

8

11

14

4 5 6 7 8 9

Duyarlık, µA/mM

pH

61

yapıldığında birçok çalışmada nanopartikül miktarının optimize edilmediği

gözlenmiştir.

Şekil 4.8 NiO/GOx/CPE’nin glukoza cevabına nanopartikül miktarının etkisi (0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı)

4.4.5 Enzim miktarının belirlenmesi

NiO/GOx/CPE’nin glukoza duyarlığına GOx miktarının etkisini incelemek için Bölüm

3.8‘de anlatıldığı şekilde 5, 8, 10, 12 ve 15 U enzim içeren 5 elektrot hazırlandı. Her bir

elektrodun Ag/AgCl’e karşı +0,40 V’da glukoza amperometrik cevabı belirlendi ve

bulunan duyarlıklar enzim miktarlarına karşı grafiğe geçirildi (Şekil 4.9). Şekil

incelendiğinde enzim miktarı arttıkça duyarlığın da arttığı görüldü. Ancak en geniş

çalışma aralığı ve en iyi regresyon katsayısı 12 U enzim kullanılarak hazırlanan

elektrotla gözlendi. Enzim miktarının artmasıyla duyarlıkta gözlenen bu artış, enzimin

aktif merkeziyle daha fazla substratın reaksiyona girerek oluşan ürünü arttırması

şeklinde yorumlanabilir. Ayrıca enzimler pahalı moleküller olduğundan daha az

miktarda enzim kullanılarak maliyetin azaltılacağı düşünüldü. Bu yüzden çalışmada,

12 U GOx enzimi içeren elektrotlar kullanıldı. Literatürde 6 U (Ren vd. 2005), 10 U

♦ y(3:0,5) = 3,49x + 0,78R² = 0,9653

∆ y(3:2) = 13,57x + 1,25R² = 0,8963

● y(3:1,5) = 13,18x + 4,67R² = 0,9606

□ y(3:1) = 12,43x + 5,35R² = 0,9939

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

0,00 0,08 0,16 0,24 0,32 0,40


Akım farkı, µA

62

(Sungur ve Günendi 2006) ve 12 U (Ren vd. 2009) enzim içeren glukoz biyosensörleri

bulunmaktadır.

Şekil 4.9 NiO/GOx/CPE’nin glukoza cevabına enzim miktarının etkisi (0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı)

4.4.6 Sıcaklığın etkisi

Enzimin aktivitesi için kullanılan tamponun pH’sı kadar çalışılan ortamın sıcaklığı da

oldukça önemlidir. Sıcaklık artışı enzimlerin hızını belli bir değere kadar arttırabilir.

Ancak yüksek sıcaklıklarda enzimler denatüre olacağından enzim aktivitesi azalır. Çok

düşük sıcaklıklarda da enzim substratı ürüne dönüştürecek enerjiyi sağlayamaz ve

inaktive olur (Champe vd. 2007). Bu nedenle enzimin optimum sıcaklığının

belirlenmesi gerekir. Bunun için enzim elektrot Bölüm 3.9.6’de anlatıldığı şekilde

sırasıyla 10, 15, 20, 25, 30, 35 ve 40oC sıcaklıklara ayarlanan termostatlı hücrede kararlı

hal akımları elde edilene kadar bekletildi. Stok glukoz çözeltisinden eklendi ve

Ag/AgCl’e karşı +0,40 V’da amperometrik ölçümler alındı. Farklı sıcaklıklarda bulunan

duyarlıkları karşılaştırmak için duyarlıklar sıcaklık değerlerine karşı grafiğe geçirildi

(Şekil 4.10). Şekil incelendiğinde duyarlığın sıcaklıkla birlikte arttığı görüldü. Ancak

25oC dışındaki sıcaklık değerlerinde bulunan çalışma aralıklarının dar ve regresyon

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20

Duyarlık, µA/mM

Enzim miktarı, U

63

katsayılarının düşük olduğu belirlendi. Literatürdeki benzer çalışmalarda da hem pratik

olduğundan hem de yüksek sıcaklıklarda çözelti buharlaşacağından ve enzim inaktive

olabileceğinden dolayı oda sıcaklığında (23±2oC) çalışılmıştır (Salimi vd. 2007, Kong

vd. 2009). Bu yüzden çalışmaların 23±2oC’de gerçekleştirilmesine karar verildi.

Şekil 4.10 NiO/GOx/CPE’nin glukoza cevabına sıcaklığın etkisi (0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V)

4.4.7 Cevap süresinin belirlenmesi

NiO/GOx/CPE’nin glukoza cevap süresini belirlemek amacıyla Bölüm 3.9.7’de

anlatıldığı gibi, 1,0×10-5 ve 1,0×10-4 M olan iki farklı glukoz derişiminde amperometrik

ölçümler alındı. Her iki derişim için hesaplanan akım farkları zamana karşı grafiğe

geçirildi ve eğrilerin birbirine paralel olduğu gözlendi (Şekil 4.11). Cevap süresi olarak,

iki farklı glukoz derişimi için bulunan akımların hemen hemen sabit kaldığı 20 saniyelik

sürenin alınmasına karar verildi. Buna rağmen bütün okumalar uygun kalibrasyon

eğrilerinin elde edildiği 50 saniye süre sonunda yapıldı. Literatürdeki çalışmalar

incelendiğinde 3 saniye (Kong vd. 2009), 5 saniye (Kaushik vd. 2008), 8 saniye (Li vd.

2008, Zhao vd. 2007) gibi daha kısa cevap süreli biyosensörlerin yanı sıra 20 saniye

(Wu vd. 2000), 60 saniye (Zhu vd. 2002, Sungur ve Günendi 2006), 25 saniye (Sun vd.

2010) gibi benzer ya da daha uzun cevap süreli olan çalışmalar da bulunmaktadır. Bu

0

10

20

30

40

0 10 20 30 40 50

Duyarlık, µA/mM

Sıcaklık, oC

64

çalışmada belirlenen cevap süresinin bir biyosensör için oldukça uygun olduğu

düşünüldü.

Şekil 4.11 NiO/GOx/CPE’nin glukoza cevap süresinin belirlenmesi (�: 1,0×10-4 M glukoz,�: 1,0×10-5 M glukoz, 0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı)

4.4.8 Glukoz derişiminin etkisi

Geliştirilen enzim elektrodun kullanılacağı derişim aralığı, analizi yapılacak

numunedeki glukozun derişim aralığı ile aynı olması gerektiğinden NiO/GOx/CPE’nin

doğrusal derişim aralığının belirlenmesi önemlidir. Bu amaçla Bölüm 3.9.8’de

anlatıldığı gibi belli glukoz derişimlerinde ölçülen akım farkları, hücreye ilave edilen

glukoz derişimlerine karşı grafiğe geçirildi ve gözlenebilme sınırı 1,9×10-3 mM, üst

tayin sınırı ise 15 mM olarak belirlendi (Şekil 4.12). Çizilen grafik incelendiğinde 2

farklı derişim aralığı gözlendi ve her ikisi için de ayrı ayrı kalibrasyon grafiği çizildi

(Şekil 4.13). Şekiller incelendiğinde enzim elektrodun 1,9×10-3 mM−9,1×10-3 mM ve

1,3 mM−15 mM derişim aralıklarında glukoza doğrusal cevap verdiği belirlendi.

0

10

20

30

0 100 200 300

Akım farkı, µA

Süre, s

65

Şekil 4.12 NiO/GOx/CPE’nin glukoza cevabına glukoz derişiminin etkisi (0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı)

Şekil 4.13 NiO/GOx/CPE ile farklı glukoz derişim aralığında elde edilen kalibrasyon grafikleri (0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı)

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20

y = 367,13x + 13,052R² = 0,9661

6

9

12

15

18

0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01

y = 0,1519x + 18,799R² = 0,9706

18

19

20

21

0 5 10 15 20

Akım farkı, µA


Akım farkı, µA

Akım farkı, µA



(a)

(b)

66

Yapılan literatür araştırması sonucunda daha yüksek gözlenebilme sınırlarına ve daha

dar derişim aralıklarına sahip glukoz biyosensörleri olduğu görüldü. Dai vd. (2008)

tarafından yapılan çalışmada gözlenebilme sınırı 0,01 mM, derişim aralığı 0,05-8,20

mM olarak belirlenmiştir. Salimi vd. (2007) tarafından geliştirilen glukoz

biyosensörünün gözlenebilme sınırı 0,024 mM, derişim aralığı ise 0,03-5,00 mM olarak

bulunmuştur.

Bu çalışmada belirlenen derişim aralıkları serumda bulunabilecek glukoz derişimi

aralığı olan 4,4-6,6 mM aralığını kapsadığı için hazırlanan biyosensörle serum

numunelerindeki glukozun doğru bir şekilde tayin edilebileceği düşünüldü.

4.4.9 Girişim yapan türlerin NiO/GOx/CPE’nin cevabı üzerine etkisi

Bir amperometrik biyosensör için en önemli analitik faktörlerden biri sensörün hedef

analite olan seçiciliğidir (Fang vd. 2010). Hazırlanan enzim elektrodunglukoza cevabına

L-askorbik asit, kreatinin, parasetamol, üre, L-aspartik asit ve ürik asit gibi serumda

bulunabilecek bazı elektroaktif türler bozucu etki yapabilir. Bu türlerin girişim yapıp

yapmadığı Bölüm 3.9.9’da anlatıldığı şekilde araştırıldı. Glukoz derişimi 1,0×10-4 M

olan hücre ortamına, sırasıyla ilgili türlerin çözeltilerinden eklendi ve Ag/AgCl’e karşı

+0,40 V’da amperometrik ölçümler alındı. Hücreye eklenen türlerin derişimleri,

serumda bulunabilecek yaklaşık maksimum derişimleri temel alınarak hazırlandı. Her

bir tür için bulunan girişimler % olarak çizelge 4.1’de verildi. Çizelge incelendiğinde,

L-aspartik asit, kreatinin ve ürenin girişim etkisinin yok denecek kadar az olduğu

görülmektedir. Ürik asit, parasetamol ve L-askorbik asitin ise girişim etkisi % 10’un

üzerinde belirlenmiştir. Ancak yapılan çalışmalar sonucunda, serumda glukoz tayini

yapılırken numune seyreltildiğinden girişim etkilerinin tamamen ortadan kaldırıldığı

görüldü.

67

Çizelge 4.1 Girişim yapan türlerin enzim elektrodun duyarlığına etkisi (0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı)

Girişim yapan elektroaktif tür

Derişima (M) Girişim b (%)

L-Askorbik asit 1×10-4 16,22

L-Aspartik asit 1×10-4 -3,92

Kreatinin 1×10-4 5,51

Parasetamol 1×10-4 11,36

Üre 8×10-4 -0,04

Ürik asit 5×10-4 13,31

a Girişim yapan elektroaktif türlerin hücredeki derişimleri b % girişim= (Ix-I0)/I0×100; I0: 1×10

-4 M glukoz çözeltisinin amperometrik cevabı, Ix: 1×10-4 M glukoz

çözeltisi içindeki girişim yapan elektroaktif türün amperometrik cevabı

Literatürde glukoz tayini için geliştirilen nanopartikül modifiyeli biyosensörler

incelendiğinde, Kong vd. (2009) tarafından yapılan bir çalışmada +0,80 V’da L-

sisteinin % 2,1 ve askorbik asidin % 9,0 oranında girişim yaptığı, Xu vd. (2005)

tarafından +0,65 V’da, asetaminofenol, oksalik asit ve etanolün, Liu vd. (2009)

tarafından -0,10V’da askorbik asit ve ürik asidin önemli bir girişimi olmadığı, Li vd.

(2008) tarafından ise +0,35 V’da askorbik asidin % 1,9 ve ürik asidin % 3,2 oranında

girişim yaptığı görülmektedir.

4.4.10 Tekrar kullanılabilirlik ve tekrar üretilebilirlik

Enzimler oldukça pahalı maddeler olduğundan ve kolayca temin edilemediklerinden

serbest enzim varlığındaki analizler yerini immobilize enzimler ile yapılan analizlere

bırakmıştır (Hooda vd.2009). Enzim immobilizasyonu ile hazırlanan enzim elektrotların

çok sayıda analiz için kullanılması önemlidir. İmmobilize enzimlerin denatürasyonu,

sızıntısı, inaktivasyonu enzim elektrotların tekrar kullanılabilirliğini etkiler.

NiO/GOx/CPE’nin tekrar kullanılabilirliğinin araştırılması için, Bölüm 3.9.10’da

68

anlatıldığı şekilde aynı enzim elektrot ile üç kere ard arda glukoza karşı amperometrik

ölçümler alındı ve kalibrasyon grafikleri çizildi. Hesaplanan duyarlıkların bağıl standart

sapması (BSS) % 12,7 olarak bulundu. Literatür incelendiğinde % BSS değerleri % 4,2

(Dai vd. 2008), % 3,5 (Li vd. 2008), % 10,9 (Comba vd. 2010b) ve % 5,4 (Comba vd.

2010a) olarak belirlenen çalışmalar gözlenmiştir.

Aynı koşullarda hazırlanan her NiO/GOx/CPE’nin glukoza karşı aynı cevabı vermesi,

elektrodun güvenirliği için önemlidir. Enzim elektrodun tekrar üretilebilirliğini

araştırmak için Bölüm 3.9.10’da anlatıldığı gibi hazırlanan 5 farklı enzim elektrodun

glukoza cevabı belirlendi ve çizilen kalibrasyon grafiklerinin eğiminden duyarlıklar

hesaplandı. Bulunan duyarlıkların bağıl standart sapması % 4,3 olarak belirlendi.

Literatürde tekrar üretilebilirlikler karşılaştırıldığında % BSS değerleri % 4,8 (Xian vd.

2005),% 5,3 (Li vd. 2008), % 8,2 (Kong vd. 2009), % 4,9 (Mu vd. 2010) ve % 6,4

(Comba vd. 2010b) olan çalışmalar olduğu görülmektedir.

4.4.11 NiO/GOx/CPE’nin raf ömrü

Hazırlanan enzim elektrodun ömrünü belirlemek amacı ile Bölüm 3.9.11’de anlatıldığı

şekilde aynı elektrot ile 3,5 ay boyunca farklı günlerde glukoza karşı amperometrik

ölçümler alındı. Her bir ölçüm için bulunan duyarlıklar zamana karşı grafiğe geçirildi

(Şekil 4.14). Şekil incelendiğinde, NiO/GOx/CPE’nin 101 gün sonunda başlangıçtaki

duyarlığının yaklaşık % 75’inin harcandığı gözlendi. Modifiye elektrodun yüksek

kararlığının nedeninin, GOx’ın immobilizasyonu için kullanılan ve mikro çevre

oluşturarak enzimin aktivitesini korumasını sağlayan NiO nanopartikülleri olduğu

düşünüldü (Salimi vd. 2007). Enzim elektrodun duyarlığındaki kaybın sebebinin ise

immobilize enzimlerin tampon çözelti içine sızması, zamanla elektrot yüzeyinin

bozulması veya sıcaklık gibi etkenlerden kaynaklanabileceği düşünüldü. Literatür

araştırmasında Wu vd. (2009) tarafından geliştirilen glukoz biyosensörünün 2 haftanın

sonunda amperometrik cevabının % 75’inin koruduğu görülmüştür. Xu vd. (2005) ve

Kong vd. (2009) tarafından yapılan çalışmalarda ise 60 gün sonunda başlangıçtaki

duyarlıkların % 70’inin korunduğu belirtilmiştir. Ayrıca literatürde ömrü 2 hafta (Xian

69

vd. 2005), 20 gün (Li vd. 2008), 30 gün (Liu vd. 2009), 3 hafta (UsmanAli vd. 2009),

28 gün (Wang vd. 2011) olan glukoz biyosensörleri de bulunmaktadır.

Geliştirilen biyosensörlerin ömürlerinin birbirinden farklılık göstermesinin,

immobilizasyon yöntemi ve matriks yapısı ile ilgili olduğu söylenebilir.

Şekil 4.14 NiO/GOx/CPE’nin ömrü (0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı)

4.4.12 NiO/GOx/CPE ile serumda glukoz tayini

Hazırlanan enzim elektrot ile serumda glukoz tayini Bölüm 3.9.12’de anlatıldığı gibi,

standart katma yöntemi ile yapıldı. Bu amaçla 4 farklı derişimde glukoz içeren serum

numunesi için 3 paralel deney yapıldı ve elde edilen bulgular, spektrofotometrik

yöntemle bulunan hastane sonuçları ile birlikte çizelge 4.2’de verildi.

0

5

10

15

20

0 20 40 60 80 100

Duyarlık, µA/mM

Süre, gün

70

Çizelge 4.2 NiO/GOx/CPE kullanılarak kan numunelerinde tayin edilen glukoz derişimi (0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu, +0,40 V, oda sıcaklığı)

Kan

numunesi

Glukoz derişimi (mM)

Spektrofotometrik Enzim elektrot*

I 3,61 3,50 ± 0,6

II 4,61 4,93 ± 0,9

III 5,00 5,14 ± 0,4

IV 7,44 7,53 ± 0,1

*Sonuçlar üç ölçümün ortalaması olarak verilmiştir.

Bu çalışmada geliştirilen enzim elektrot ile bulunan ölçümler, hastaneden temin edilen

kan serumlarının spektrofotometrik ölçümleri ile “veri çifti t testi” uygulanarak

kıyaslandı. Bu amaçla, her iki yöntemle bulunan sonuçların (Çizelge 4.2) farkı (d) alındı

ve dört serum numunesi için bu farkların ortalaması ( d ) hesaplandı. Farkların standart

sapması (sd) da hesaplanarak test istatistiği değeri ( )/( / )o dt d s N= −∆ eşitliğinden

1,01 olarak belirlendi. % 95 güven seviyesinde, serbestlik derecesi 3 için tkritik değeri

3,18’dir. Buna göre t<tkritik olduğu için “sıfır hipotezi” geçerlidir. Yani her iki yöntemle

elde edilen sonuçlar arasında % 95 güven seviyesinde anlamlı bir fark yoktur (Skoog

vd. 2004).

71

Şekil 4.15 Kan serumunda glukoz tayini için yöntemlerin uyumluluğu

Hazırlanan NiO modifiye glukoz enzim elektrodu kullanılarak standart katma yöntemi

ile bulunan glukoz değerleri, spektrofotometrik yöntemle tayin edilen glukoz

değerlerine karşı grafiğe geçirildi (Şekil 4.15). Grafiğin eğiminin 0,9679 ve regresyon

katsayısının 0,9893 olması, her iki yöntemle bulunan sonuçların birbiriyle uyumlu

olduğunu göstermektedir.

Literatür incelendiğinde, glukoz için geliştirilen çoğu biyosensörle gerçek numunelerde

glukoz tayini yapılmadığı görülmüştür (Salimi vd. 2007, Yang vd. 2009, Ren vd. 2009,

Kong vd. 2009, Liu vd. 2009).

Aşağıdaki çizelgede, literatürde bulunan bazı glukoz biyosensörlerinin serum

örneklerindeki glukoz tayini için geliştirdikleri yöntemin spektrofotometrik yöntem ile

uyumluluğu verilmiştir:

y = 0,9679x + 0,0594R² = 0,9893

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

2,0 4,0 6,0 8,0

Glukoz, mM

(spektrofotometrik)

Glukoz, mM (NiO/GOx/CPE)

72

Çizelge 4.3 Literatürde bulunan bazı glukoz biyosensörlerinin, serum örneklerindeki glukoz tayini için geliştirdikleri yöntemin spektrofotometrik yöntem ile uyumluluğu

Referans adı Numune sayısı

Spektrofotometrik sonuçlar (mM)

*Geliştirilen yöntemle bulunan sonuçlar (mM)

Milardović vd. (1997) 1

2

3

1,20

3,00

4,40

0,80

2,63

4,30

Xu vd. (2005) 1

2

3

9,20

4,40

3,50

9,56

4,13

3,72

Chen vd. (2008) 1

2

3

5,66

5,85

6,10

5,92 ± 0,05

6,03 ± 0,09

6,19 ± 0,06

Wang vd. (2008) 1

2

3

4

5,51

4,72

4,85

4,90

5,35 ± 0,06

4,90 ± 0,05

5,05 ± 0,1

4,74 ± 0,06

*Sonuçlar üç ölçümün ortalaması olarak verilmiştir.

Sonuç olarak bu çalışmada; NiO modifiye karbon pasta enzim elektrodu ile serumda

bulanabilecek girişim yapan maddelerin etkisi olmaksızın glukoz tayininin başarılı bir

şekilde yapılabileceği gösterildi.

Glukoz tayini için hazırlanan NiO/GOx/CPE’nin elektrot bileşimi, optimum çalışma

koşulları ve performans faktörleri çizelge 4.4’de özetlenmiştir:

73

Çizelge 4.4 NiO/GOx/CPE’nin elektrot bileşimi, optimum çalışma koşulları ve performans faktörleri

Elektrot Bileşimi

Çalışma Koşulları

Grafit tozu

30 mg Çalışma potansiyeli +0,40 V

Nanopartikül

10 mg Tampon Fosfat

Enzim

12 U pH 7,0

Parafin yağı

15 µL Tampon derişimi 0,10 M

BSA

1,5 mg Sıcaklık 40oC

Glutaraldehit

10 µL

Performans Faktörleri Çalışma aralığı I. 1,9×10-3-9,1×10-3 mM

II. 1,3-15 mM

Gözlenebilme sınırı

1,9×10-3 mM

Tekrar kullanılabilirlik

BSS % 12,7 (n=3)

Tekrar üretilebilirlik

BSS % 4,3 (5 elektrot)

Cevap süresi

20 s

Raf ömrü 101 gün

74

5. SONUÇLAR

Bu tez çalışmasında, glukozun tayini için NiO nanopartikül ile modifiye edilmiş

amperometrik enzim elektrot geliştirildi. Bu amaçla, öncelikle NiO nanopartikülleri

grafit tozu ile karıştırıldı ve daha sonra hazırlanan karışıma GOx enzimi immobilize

edilerek karbon pasta elektrot gövdesi içine yerleştirildi. Hazırlanan enzim elektrot ile

elde edilen sonuçlar aşağıda sunuldu.

♣ Öncelikle NiO nanopartiküllerinin, karbon pasta elektrodun hidrojen peroksite

duyarlığını arttırıp arttırmadığını incelemek amacı ile NiO modifiye edilmiş ve

modifiye edilmemiş elektrotlar kullanılarak hidrojen peroksitin amperometrik tayini

yapıldı. Elde edilen duyarlıklar karşılaştırıldığında NiO nanopartiküllerinin karbon

pasta elektrotlarının duyarlığını yaklaşık 208 kat arttırdığı gözlendi. Bu sonuca göre

NiO nanopartikülleri ile modifiye edilmiş elektrotların glukoz tayini için daha uygun

olduğuna karar verildi.

♣ NiO/CPE’nin çalışma potansiyelinin belirlenmesi amacı ile +0,70 V ve +0,40 V

potansiyellerde hidrojen peroksite karşı amperometrik ölçümler alındı. Her iki

potansiyelde bulunan duyarlıklar arasında çok büyük bir fark olmadığı için ve düşük

potansiyellerde çalışmanın bozucu türlerin girişimini önlemesinden ötürü çalışma

potansiyeli +0,40 V olarak seçildi.

♣ NiO/CPE’ye GOx enzimi immobilize edilerek hazırlanan enzim elektrodun glukoza

duyarlı olup olmadığı araştırıldı ve duyarlık 12,43 µA/mM olarak belirlendi. Ayrıca

NiO nanopartiküllerinin enzim elektrodun duyarlığını arttırıp arttırmadığı incelendi

ve duyarlığı yaklaşık 155 kat arttırdığı gözlendi. Literatürdeki bazı benzer

çalışmalarda glukoz için hesaplanan duyarlıklar 7,0 µA/mM (Huang vd. 2005), 2,3

µA/mM (Xian vd. 2005), 446,2 nA/mM (Salimi vd. 2007), 1,92 µA/mM (Sheng vd.

2008), 3,43 µA/mM (Li vd. 2008), 8,8±0,5 µA/M (Comba vd. 2010b), 4 µA/mM

(Sun vd. 2010) olarak bulunmuştur. Bunun sonucunda NiO/GOx/CPE’nin glukoza

karşı duyarlığının benzer birçok biyosensöre göre daha yüksek olduğu söylenebilir.

75

♣ NiO/GOx/CPE’nin optimum çalışma koşullarının belirlenmesi için yapılan

çalışmalar sonucunda en uygun tamponun 0,10 M pH 7,0 fosfat tamponu olduğu

görüldü.

♣ NiO/GOx/CPE’nin en uygun grafit tozu, nanopartikül ve enzim miktarlarının

sırasıyla 30 mg, 10 mg ve 12 U olduğu belirlendi.

♣ NiO/GOx/CPE’nin optimum çalışma sıcaklığı 40oC olarak bulundu. Fakat yapılan

çalışmaların daha pratik olması için çalışmalar oda sıcaklığında sürdürüldü.

♣ NiO/GOx/CPE’nin cevap süresinin yaklaşık 20 saniye olduğu görüldü. Literatür

incelendiğinde 20 saniye (Wu vd. 2000), 60 saniye (Zhu vd. 2002, Sungur ve

Günendi 2006), 25 saniye (Sun vd. 2010) gibi benzer ya da daha uzun cevap süreli

glukoz biyosensörlerinin olduğu görülmüştür. Bu çalışmada da belirlenen cevap

süresinin bir biyosensör için makul olduğu düşünüldü. Fakat literatürde 3 saniye

(Pang vd. 2008, Kong vd. 2009), 5 saniye (Xian vd. 2005, Sheng vd. 2008, Kaushik

vd. 2008), 8 saniye (Zhao vd. 2007, Li vd. 2008) gibi daha kısa cevap süreli

biyosensörler de mevcuttur.

♣ NiO/GOx/CPE’nin glukoz için çalışma aralığı 1,9×10-3 mM−9,1×10-3 mM ve 1,3

mM−15 mM, gözlenebilme sınırı ise 1,9×10-3 mM olarak belirlendi. Bu çalışmada

bulunan derişim aralıklarıglukozun serumdaki klinik tayin aralığı olan 4,4-6,6 mM’ı

kapsamaktadır (Li vd. 2009). Hatta daha düşük glukoz derişimlerinde bile çalışma

imkanı sunmaktadır. Bu bulgular neticesinde NiO/GOx/CPE ile kan serumunda

glukoz tayinini yüksek doğrulukla yapılabileceği söylenebilir.

♣ NiO/GOx/CPE’nin glukoza karşı cevabına serumda bulunabilecek çeşitli

elektroaktif türlerin etkisi incelendi. L-aspartik asit, kreatinin ve ürenin enzim

elektrodun cevabına girişim etkisinin yok denecek kadar az olduğu, L-askorbik asit,

parasetamol ve ürik asidin ise % 10’un üzerinde girişim yaptığı bulunmuş, bunun da

kan serumunun seyreltilerek analiz edilmesi ile üstesinden gelineceği

düşünülmüştür. Literatürdeki benzer çalışmalarda da çeşitli elektroaktif türlerin

76

girişim etkisi incelenmiş ve önemli bir etkilerinin olmadığı gözlenmiştir (Zhao vd.

2007, Li vd. 2008, Sheng vd. 2008, Liu vd. 2009, Fang vd. 2010). Ancak, bütün

çalışmalarda elektrot yüzeyinde girişim yapabilecek türleri önlemek amacı ile

nafyon membran kullanılmıştır ve çoğu bizim çalışma potansiyelimizden daha

düşük potansiyellerde çalışmıştır. Düşük potansiyellerde de girişim etkisinin önemli

ölçüde azaldığı bilinmektedir. Buna rağmen Shan vd. (2006) tarafından yapılan bir

çalışmada ürik asidin girişimi % 39 olarak bulunmuştur.

♣ NiO/GOx/CPE’nin tekrar kullanılabilirliğini belirlemek için aynı enzim elektrotla

ard arda 3 ölçüm alındı ve ölçümlerin BSS değeri % 12,7 olarak bulundu.

Literatürde % BSS değerleri % 4,2 (Dai vd. 2008), % 3,5 (Li vd. 2008) ve % 10,9

(Comba vd. 2010b) olarak belirlenen çalışmalar mevcuttur. Tekrar üretilebilirliğin

değerlendirilmesi için ise 5 farklı enzim elektrodunglukoza cevabı belirlendi ve

bulunan duyarlıkların bağıl standart sapması % 4,3 olarak belirlendi. Literatürde

tekrar üretilebilirlik için % BSS değerleri % 4,8 (Xian vd. 2005), % 5,3 (Li vd.

2008), % 8,2 (Kong vd. 2009), % 4,9 (Mu vd. 2010) ve % 6,4 (Comba vd. 2010b)

olan çalışmalar olduğu görülmektedir. Diğer pek çok çalışma ile kıyaslandığında

NiO/GOx/CPE’nin tekrar üretilebilirliğinin oldukça iyi olduğu söylenebilir.

♣ NiO/GOx/CPE’nin ömrünün yaklaşık 101 gün olduğu görüldü. Enzim elektrodun

101 gün sonunda başlangıçtaki duyarlığın % 75’ini kaybettiği belirlendi. Literatürde

ömrü 2 hafta (Xian vd. 2005), 20 gün (Li vd. 2008), 3 hafta (Benvenuto vd. 2008), 8

hafta (Kaushik vd. 2008, Usman Ali vd. 2009), 30 gün (Liu vd. 2009, 28 gün (Wang

vd. 2011) olan glukoz biyosensörleri de bulunmaktadır. Wang vd. (2011) tarafından

yapılan bir çalışmada 28 gün sonunda başlangıçtaki akımın % 40’ının korunduğu

belirlenmiştir. Ayrıca Wu vd. (2009) tarafından geliştirilen glukoz biyosensörünün 2

hafta sonunda amperometrik cevabın % 75’ini, Xu vd. (2005) ve Kong vd. (2009)

tarafından geliştirilen biyosensörlerin ise 60 gün sonunda başlangıçtaki duyarlıkların

% 70’ini koruduğu belirtilmiştir.

77

♣ NiO/GOx/CPE ile kan serumunda glukoz tayini yapıldı ve elde edilen sonuçların

yapılan “veri çifti t testi” analizi ile spektrofotometrik yöntemle belirlenen

sonuçlarla arasında, % 95 güven seviyesinde, anlamlı bir fark bulunmadığı

belirlendi. Bu da NiO/GOx/CPE ile gerçek numunelerdeki glukozun yüksek

doğrulukla tayininin yapılabileceğini göstermektedir. Literatür araştırmasında pek

çok glukozbiyosensörünün gerçek numunelerde kullanımının araştırılmadığı

görüldü (Fang vd. 2003, Wang vd. 2003, Shan vd. 2006, Zhaoa vd. 2007, Salimi vd.

2007, Pang vd. 2008, Luo vd. 2009, Yang vd. 2009, Ren vd. 2009, Kong vd. 2009,

Liu vd. 2009). Bazı çalışmalarda serum örneklerinde standart katma yöntemi

kullanılarak glukoz tayini yapılmıştır (Milardović vd. 1997, Xu vd. 2005, Chen vd.

2008, Wang vd. 2008). Xian vd. (2005) tarafından yapılan bir çalışmada Au

nanopartikülleri ve iletken polianilin nanokompoziti kullanılarak hazırlanmış glukoz

biyosensörü ile 5 farklı serum numunesinde glukoz analizi yapılmış ve sonuçların

birbiriyle uyumlu olduğu görülmüştür. Gang vd. (2010) yaptığı çalışmada ise

serumda glukoz analizi için Fe3O4 nanopartikül modifiyeli karbon pasta enzim

elektrodu kullanılmış ve enzim elektrot ile bulunan sonuçların spektrofotometrik

sonuçlara yakın olduğu belirlenmiştir.

78

KAYNAKLAR

Anonymous. 2011. Web Sitesi: http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/IMMOB/benefits.htm, Erişim Tarihi: 04.06.2011 Anonymous. 2011. Web Sitesi: http://www.wikipedia.com, Erişim Tarihi: 12.06.2011

Baby, T.T. and Ramaprabhu, S. 2009. SiO2 coated Fe3O4 magnetic nanoparticle dispersed multiwalled carbon nanotubes based amperometric glucose biosensor. Talanta, Vol. 80; pp. 2016-2022.

Benvenuto, P., Kafi, A.K.M. and Chen, A. 2008. High performance glucose biosensor based on the immobilization of glucose oxidase onto modified titania nanotube arrays. Journal of Electroanalytical Chemistry, Vol. 627; pp. 76-81.

Cash, K.J. and Clark, H.A. 2010. Trends in Molecular Medicine, Vol. 16; pp. 584-593.

Chang, G., Tatsu, Y., Goto, T., Imaishi, H. and Morigaki, K. 2010. Glucose concentration determination based on silica sol–gel encapsulated glucose oxidase optical biosensor arrays. Talanta, Vol. 83; pp. 61-65.

Chaubey, A. and Malhotra, B.D. 2001. Mediated biosensors. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 17; pp. 441-456.

Chen, X., Chen, J., Deng, C., Xiao, C., Yang, Y., Nie, Z. and Yao, S. 2008. Amperometric glucose biosensor based on boron-doped carbon nanotubes modified electrode. Talanta, Vol. 76; pp. 763-767.

Comba, F.N., Rubianes, M.D., Herrasti, P. and Rivas, G.A. 2010. Glucose biosensing at carbon paste electrodes containing iron nanoparticles. Sensors and Actuators B, Vol. 149; pp. 306-309.

Costa, S.A., Azevedo, H.S. and Reis, R.L. 2004. Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. CRC Press, 592 p.

Danielson, N.D., Heenan, C.A., Haddadian, F. and Numan, A. 1999. Fluorometric determination of fructose, glucose, and sucrose using zirconyl chloride. Microchemical Journal, Vol. 63; pp. 405-414.

Dai, Z., Shao, G., Hong, J., Bao, J. and Shen, J. 2008. Immobilization and direct electrochemistry of glucose oxidase on a tetragonal pyramid-shaped porous ZnO nanostructure for a glucose biosensor. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 24; pp. 1286-1291.

D’Orazio, P. 2003. Biosensors in clinical chemistry. Clinica Chimica Acta, pp. 41-69.

Dzyadevych, S.V., Arkhypova, V.N., Soldatkin, A.P., El’skaya, A.V., Martelet, C. and Jaffrezic-Renault, N. 2008. Amperometric enzyme biosensors: Past, present and future. ITBM-RBM, Vol. 29; pp. 171-180.

79

Fang, B., Zhang, C., Wang, G., Wang, M. and Ji, Y. 2010. A glucose oxidase immobilization platform for glucose biosensor using ZnO hollow nanospheres. Sensors and Actuators: B, Vol. 155; pp. 304-310.

Fang, A., Ng, H.T. and Li, S.F.Y. 2003. A high-performance glucose biosensor based on monomolecular layer of glucose oxidase covalently immobilised on indium-tin oxide surface. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 19; pp. 43-49.

Gang, X.Z., Ping, L.J., Li, T. and Qiang, C.Z. 2010. A novel electrochemiluminescence biosensor based on glucose oxidase immobilized on magnetic nanoparticles. Chinese Journal of Analytical Chemistry, Vol. 38; pp. 800-804.

Haghighi, B., Bozorgzadeh, S. and Gorton, L. 2011. Fabrication of a novel electrochemiluminescence glucose biosensor using Au nanoparticles decorated multiwalled carbon nanotubes. Sensors and Actuators B, Vol. 155; pp. 577-583.

Harvey, R.A., Champe, P.C. and Ferrier, D.R. 2007. (Çeviri editörü: Ulukaya, E.) Biyokimya, 3. Baskı, Nobel Tıp Kitabevleri, 509 p.

Heller, A. 1996. Amperometric biosensors. Current Opinion in Biotechnology, Vol. 7; pp. 50-54.

Huang, Y., Zhang, W., Xiao, H. and Li, G. 2005. An electrochemical investigation of glucose oxidase at a CdS nanoparticles modified electrode. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 22; pp. 817-821.

Hooda, V., Gahlaut, A. Kumar, H. and Pundir, C.S. 2009. Biosensors based on enzyme coupled PVC reaction cell for electrochemical measurement of serum total cholesterol. Sensors and Actuators B, Vol. 136; pp. 235-241.

Jia, W., Guo, M., Zheng, Z., Yu, T., Rodriguez, E.G., Wang, Y. and Lei, Y. 2008. Electrocatalytic oxidation and reduction of H2O2 on vertically aligned Co3O4 nanowalls electrode: Toward H2O2 detection. Journal of Electroanalytical Chemistry, Vol. 625; pp. 27-32.

Jianrong, C., Yuqing, M., Nongyue, H., Xiaohua, W. and Sijiao, L. 2004. Nanotechnology and biosensors. Biotechnology Advances, Vol. 22; pp. 505-518.

Kaushik, A., Khan, R., Solanki, P.R., Pandey, P., Alam, J., Ahmad, S. and Malhotra, B.D. 2008. Iron oxide nanoparticles–chitosan composite based glucose biosensor. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 24; pp. 676-683.

Kong, T., Chen, Y., Ye, Y., Zhang, K., Wang, Z. and Wang, X. 2009. An amperometric glucose biosensor based on the immobilization of glucose oxidase on the ZnO nanotubes. Sensors and Actuators B, Vol. 138; pp. 344-350.

Li, C., Liu, Y., Li, L., Du, Z., Xu, S., Zhang, M., Yin, X. and Wang, T. 2008. A novel amperometric biosensor based on NiO hollow nanospheres for biosensing glucose. Talanta, Vol. 77; pp. 455-459.

80

Li, Y., Liu, X., Yuan, H. and Xiao D. 2009. Glucose biosensor based on the room-temperature phosphorescence of TiO2/SiO2 nanocomposite. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 24; pp. 3706-3710.

Liu, X., Hu, Q., Wu, Q., Zhang, W., Fang, Z. and Xie, Q. 2009. Aligned ZnO nanorods: A useful film to fabricate amperometric glucose biosensor. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, Vol. 74; pp. 154-158.

Luo, L., Li, Q., Xu, Y., Ding, Y., Wang, X., Deng, D. and Xu, Y. 2010. Amperometric glucose biosensor based on NiFe2O4 nanoparticles and chitosan. Sensors and Actuators B, Vol. 145; pp. 293-298.

Luo, X., Morrin, A., Killard, A.J. and Smyth, M.R. 2005. Application of nanoparticles in electrochemical sensors and biosensors. Electroanalysis, Vol. 18; pp. 319-326.

Luong, J.H.T., Male, K.B. and Glennon, J.D. 2008. Biosensor technology: Technology push versus market pull. Biotechnology Advances, Vol. 26; pp. 492-500.

Mahadeva, S.K. and Kim, J. 2011. Conductometric glucose biosensor made with cellulose and tin oxide hybrid nanocomposite. Sensors and Actuators B, Vol. 157; pp. 177-182.

Mello, L.D. and Kubota L.T. 2001. Review of the use of biosensors as analytical tools in the food and drink industries. Food Chemistry, Vol. 77; pp. 237-256.

Milardovic, S., Kruhak, I., Ivekovic, D., Rumenjak, V., Tkalcec, M. and Grabaric, B.S. 1997. Glucose determination in blood samples using flow injection analysis and an amperometric biosensor based on glucose oxidase immobilized on hexacyanoferrate modified nickel electrode. Analytica Chimica Acta, Vol. 350; pp. 91-96.

Mu, Y., Jia, D., He, Y., Miao, Y., Wu, H.L. 2010. Nano nickel oxide modified non-enzymatic glucose sensors with enhanced sensitivity through an electrochemical process strategy at high potential. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 26; pp. 2948-2952.

Murphy, L. 2006. Biosensors and bioelectrochemistry. Current Opinion in Chemical Biology, Vol. 10; pp. 177-184.

Nelson, D.L. and Cox, M.M. 2008. Lehninger Principles of Biochemistry, 5. Baskı, W.H. Freeman and Company, 1100 p.

Paddle, B.M. 1996. Biosensors for chemical and biological agents of defence interest. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 11; pp. 1079-1113.

Pang, X., He, D., Luo, S. and Cai, Q. 2008. An amperometric glucose biosensor fabricated with Pt nanoparticle-decorated carbon nanotubes/TiO2 nanotube arrays composite. Sensors and Actuators B, Vol. 137; pp. 134-138.

81

Ren, X., Meng, X. and Tang, F. 2005. Preparation of Ag–Au nanoparticle and its application to glucose biosensor. Sensors and Actuators B, Vol. 110; pp. 358-363.

Ren, X., Chen, D., Meng, X., Tang, F., Hou, X., Han, D. and Zhang, L. 2009. Zinc oxide nanoparticles/glucose oxidase photoelectrochemical system for the fabrication of biosensor. Journal of Colloid and Interface Science, Vol. 334; pp. 183-187.

Salimi, A., Sharifi E., Noorbakhsh A. and Soltanian, S. 2007. Immobilization of glucose oxidase on electrodeposited nickel oxide nanoparticles: Direct electron transfer and electrocatalytic activity. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 22; pp. 3146-3153.

Santos, P.M., Sandrino, B., Moreira, T.F., Wohnrath, K., Nagata, N. and Pessoa, C.A. 2007. Simultaneous voltammetric determination of dopamine and ascorbic acid using multivariate calibration methodology performed on a carbon paste electrode modified by a mer-[RuCl3(dppb)(4-pic)] complex. Journal of the Brazilian Chemical Society, Vol. 18; pp. 93-99.

Sanz, V., Galban, J., de Marcos, S., Castillo, J.R. 2003. Fluorometric sensors based on chemically modified enzymes glucose determination in drinks. Talanta, Vol. 60; pp. 415-423.

Shan, D., Zhu, M., Xue, H. and Cosnier, S. 2006. Development of amperometric biosensor for glucose based on a novel attractive enzyme immobilization matrix: Calcium carbonatenanoparticles. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 22; pp. 1612-1617.

Shen, J., Dudik, L. and Liu, C.C. 2007. An iridium nanoparticles dispersed carbon based thick film electrochemical biosensor and its application for a single use, disposable glucose biosensor. Sensors and Actuators B, Vol. 125; pp. 106-113.

Sheng, Q., Luo, K., Li, L. and Zheng, J. 2008. Direct electrochemistry of glucose oxidase immobilized on NdPO4 nanoparticles/chitosan composite film on glassy carbon electrodes and its biosensing application. Bioelectrochemistry, Vol. 74; pp. 246-253.

Shi, W. and Ma, Z. 2010. Amperometric glucose biosensor based on a triangular silver nanoprisms/chitosan composite film as immobilization matrix. Biosensors and

Bioelectronics, Vol 26; pp. 1098-1103.

Skoog, D.A., West, D.M., Holler, F.J. and Crouch, S.R. 2004. (Çeviri editörleri: Kılıç, E. and Yılmaz, H.) Analitik Kimya Temel ilkeler I, 8. Baskı, Bilim Yayıncılık, 706 p., Ankara-Türkiye.

Siangproh, W., Dungchai, W., Rattanarat, P. and Chailapakul, O. 2011. Nanoparticle-based electrochemical detection in conventional and miniaturized systems and their bioanalytical applications. Analytica Chimica Acta, Vol. 690; pp. 10-25.

82

Sun, J., Zhu, Y., Yang, X. and Li, C. 2009. Photoelectrochemical glucose biosensor incorporating CdS nanoparticles. Particuology, Vol. 7; pp. 347-352.

Sun, T.P., Shieh, H.L., Ching, C.T.S., Yao, Y.D., Huang, S.H., Liu, C.M., Liu, W.H. and Chen, C.Y. 2010. Carbon nanotube composites for glucose biosensor incorporated with reverse iontophoresis function for noninvasive glucose monitoring. International Journal of Nanomedicine, Vol. 5; pp. 343-349.

Sungur, S. and Günendi, G. 2006. A New Amperometric glucose biosensor based on pectin coating. Polymer-Plastics Technology and Engineering, Vol. 45; pp. 527-531.

Svancara, I., Vytras, K., Kalcher, K., Walcarius, A. and Wang, J. 2008. Carbon paste electrodes in facts, numbers, and notes: A review on the occasion of the 50-years jubilee of carbon paste in electrochemistry and electroanalysis. Electroanalysis, Vol. 21; pp. 7-28.

Usman Ali, S.M., Nur, O., Willander, M. and Danielsson, B. 2010. A fast and sensitive potentiometric glucose microsensor based on glucose oxidase coated ZnO nanowires grown on a thin silver wire. Sensors and Actuators B, Vol. 145; pp. 869-874.

Vastarella, W. 2001. Enzyme Modified Electrodes in Amperometric Biosensors. Universita Degli Studi Di Bari Facolta Di Scienze Matematiche Fisiche Naturali Dipartimento Di Chimica, 135 p.

Wang, H., Huang, J., Wang, C., Li, D., Ding, L. and Han, Y. 2011. Immobilization of

glucose oxidase using CoFe2O4/SiO2 nanoparticles as carrier. Applied Surface Science, Vol. 257; pp. 5739-5745.

Wang, S.G., Zhang, Q., Wang, R. and Yoon, S.F. 2003. A novel multi-walled carbon nanotube-based biosensor for glucose detection. Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 311; pp. 572–576.

Wang, X., Zhang, Y., Banks, C.E., Chen, Q. and Ji, X. 2010. Non-enzymatic amperometric glucose biosensor based on nickel hexacyanoferrate nanoparticle film modified electrodes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, Vol. 78; pp. 363-366.

Wang, X.D., Zhou, T.Y., Chen, X., Wong, K.Y. and Wang, X.R. 2007. An optical biosensor for the rapid determination of glucose in human serum. Sensors and Actuators B, Vol. 129; pp. 866-873.

Watanabe, T. and Einaga, Y. 2009. Design and fabrication of nickel microdisk-arrayed diamond electrodes for a non-enzymatic glucose sensor based on control of diffusion profiles. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 24; pp. 2684-2689.

Wu, H., Wang, J., Kang, X., Wang, C., Wang, D., Liu, J., Aksay, I.A. and Lin, Y. Glucose biosensor based on immobilization of glucose oxidase in platinum nanoparticles/graphene/chitosan nanocomposite film. Talanta, Vol. 80; pp. 403-406.

83

Wu, Z., Wang, B., Dong, S. and Wang, E. 2000. Amperometric glucose biosensor based on lipid film. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 15; pp. 143-147.

Xian, Y., Hu, Y., Liu, F., Xian, Y., Wang, H. and Jin, L. 2005. Glucose biosensor based on Au nanoparticles–conductive polyaniline nanocomposite. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21; pp. 1996-2000.

Xu, Q., Zhao, Y., Xu, J.Z. and Zhu, J.J. 2005. Preparation of functionalized copper nanoparticles and fabrication of a glucose sensor. Sensors and Actuators B, Vol. 114; pp. 379-386.

Yang, K., She, G.W., Wang, H., Ou, X.M., Zhang, X.H., Lee, C.S. and Lee, S.T. 2009. ZnO nanotube arrays as biosensors for glucose. J. Phys. Chem. C, Vol. 113; pp. 20169-20172.

Zhang, S., Wright, G. and Yang, Y. 2000. Materials and techniques for electrochemical biosensor design and construction. Biosensors and Bioelectronics, pp. 273-282.

Zhao, Z.W., Chen, X.J., Tay, B.K., Chen, J.S., Han, Z.J. and Khor, K.A. 2007. A novel amperometric biosensor based on ZnO:Co nanoclusters for biosensing glucose. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 23; pp. 135-139.

Zhu, J., Zhu, Z., Lai, Z., Wang, R., Guo, X., Wu, X., Zhang, G., Zhang, Z., Wang, Y. and Chen, Z. 2002. Planar amperometric glucose sensor based on glucose oxidase immobilized by chitosan film on prussian blue layer. Sensors, Vol. 2; pp. 127-136.

84

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı : Ceren ERDEM

Doğum Yeri : Ankara

Doğum Tarihi : 09.02.1987

Medeni Hali : Bekar

Yabancı Dili : İngilizce

Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl)

Lise : Ankara Kocatepe Mimar Kemal Anadolu Lisesi, 2005

Lisans : Ankara Üniversitesi, Fen Fakültesi, Kimya Bölümü, 2009

Yüksek Lisans : Ankara Üniversitesi Fen bilimleri Enstitüsü Kimya Bölümü Biyokimya

Anabilim Dalı (Eylül 2009-Haziran 2012)

Katıldığı Seminerler/Kurslar

PROTIST 2010: Novel Approaches in Protein Engineering Sabancı Üniversitesi, 23-25.04.2010, 18 saat

Metabolomik Lisansüstü Yaz Okulu Ege Üniversitesi, 04-10.07.2010, 30 saat

Protein Analitiği Lisansüstü Yaz Okulu

Ege Üniversitesi, 20-26.09.2009, 30 saat

ankara Ünİversİtesİ fen bİlİmlerİ …acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/25069/(microsoft...

Documents